JP2017530152A - インタクトな細菌由来のベシクルへの低分子化合物の充填の向上 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年10月3日に出願された米国仮特許出願第62/059,466号からの優先権を主張する。本出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
特に定義されていない限り、本説明において使用されている技術用語及び科学用語はすべて、当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。
明記される通り、本発明者らは、蛍光それ自体が、インタクトな非生存細菌ベシクルへの低分子化合物の充填率を大幅に高めることを発見した。例えば、以下の実施例は、下記のどちらもミニ細胞と共インキュベートすることにより、非修飾パクリタキセルはミニ細胞に封入されて、ミニ細胞あたり2,115個のコピー(copy)(分子)濃度に到達することができる(実施例9)一方、パクリタキセルの水溶性誘導体であるTF.Pacは、ミニ細胞あたり50,000個のコピー(実施例10)に到達することができることを示している。対照的に、パクリタキセルの2つの蛍光誘導体である、FLUTAX-1及びFITC-コンジュゲートされているパクリタキセル(FCP)のどちらも、ミニ細胞に充填され、ミニ細胞あたり270,000個のコピー(実施例2)及び230,000個のコピー(実施例4)という高い濃度に到達することができる。これらの濃度は、非修飾(非誘導化)、非蛍光化合物によって到達されるものと比べて、それぞれ127倍及び109倍、高い。
したがって、蛍光を示す化合物を封入するインタクトな非生存細菌ベシクルを含む組成物が提供される。この蛍光は、(A)内在性(自家蛍光)又は(B)外因性の、すなわち予め化学的に導入された、以下に定義されている、エネルギー移動部分による蛍光のいずれかである。
D-L-F、
である「修飾化合物」又はそれらのその塩を形成することを企図しており、
Dは、化合物又はその活性な構成物であり、
Lはリンカーであり、
Fは蛍光部分である。
「インタクトな細菌由来のベシクル」及び「インタクトな非生存細菌ベシクル」という言い回しは、複製することができず、かつ哺乳動物細胞への侵入を能動的に開始することができない死滅細菌細胞及び細菌ミニ細胞を含めた、細菌細胞のベシクル誘導体を同義的に指す。この文脈では、「インタクトな」は、細胞外被すなわち原形質膜及び周囲の細胞壁における規則正しい連続性及び構造的完全性を暗示したものであり、この細胞壁は、多層(グラム陽性細菌細胞に由来するベシクルの場合)、又は単層の細胞壁周辺の二層の外側膜(グラム陰性細菌細胞に由来するベシクルの場合)を含む。BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BIOLOGY、第2版(Springer、2012年)を参照されたい。
明記されている通り、本開示は、蛍光性である低分子化合物をインタクトな非生存細菌ベシクルに充填する方法を提供する。低分子化合物は、内在的に蛍光性(自家蛍光性)とすることができるか、又は外因性蛍光性、すなわち、非蛍光化合物に蛍光部分を付与することにより蛍光性とすることができ、そうして、修飾化合物はインタクトな非生存細菌ベシクルに充填される。
式中、
R1は、H、-OH、C1〜4アルコキシ、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、置換C1〜4アルコキシ、-O-C(O)-(置換C1〜4アルキル)、-O-CH2-O-P(O)(OH)2、-O-CH2-O-(C1〜4アルキル)、-O-CH2-S-(C1〜4アルキル)、又はR3と一緒になって形成した-CH2-、若しくはR4と一緒になった二重結合、ORe又はReであり、
R2は、H、-OH、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、置換C1〜4アルコキシ、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、-O-C(O)-(置換C1〜4アルキル)、-O-CH2-O-(C1〜4アルキル)、-S-CH2-O-(C1〜4アルキル)、-O-C(O)-Re又は-Reであり、
R3は、H、C1〜4アルキル、又はR1と一緒になって形成した-CH2-であり、
R4は、H又はハロゲン、又はR1と一緒になった二重結合であり、
R5は、H、C1〜4アシル、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシメチル、(C1〜4アルキル)チオメチル、-C(O)-(C1〜4アルキル)、-C(O)-(置換C1〜4アルキル)、-C(O)-O(C1〜4アルキル)、-C(O)-O(置換C1〜4アルキル)、-C(O)-NH(C1〜4アルキル)、-C(O)-NH(置換C1〜4アルキル)又はReであり、
R6は、フェニル又は置換フェニルであり、
R7は、H、-OH、-CO-(C1〜4アルキル)、-CO-(置換C1〜4アルキル)、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、(C1〜4アルコキシ)メチル若しくは(C1〜4アルキル)チオメチル、又はR8 、及びR7とR8が結合している炭素原子と一緒になった5員若しくは6員の非芳香族複素環式環であり、
R8は、H、-CH3、又はR7 、及びR7とR8が結合している炭素原子と一緒になった5員若しくは6員の非芳香族複素環式環であり、
R9は、H、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、-CO-(C1〜4アルキル)、-CO-(置換C1〜4アルキル)又はReであり、
R10は、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、アリール又は置換アリールであり、
R11は、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、フェニル、置換フェニル、-SR12、-NHR12又は-OR12であり、
R12は、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、フェニル又は置換フェニルであるが、
ただし、R1、R2、R5及びR9のうちの少なくとも1つはReであり、Reは、Lへの結合点であることを条件とする。
R1は、H、OH、-CH2SCH3、-CH2-O-P(O)(OH)2、ORe又はReであり、
R2は、H、-OH、-OCO-CH3、-CO-CH3又は-(CH2)2-N-モルホリノであり、
R3は、メチルであるか、又はR3とR4が一緒になって、-CH2-などのアルキレンとなり、
R4は、H又は-Fであり、
R5は、-CO-CH3であり、
R6はフェニルであり、
R7は、H若しくはOHであり、
R8は、Hであるか、
又はR7とR8は一緒になって、-O-CO-O-であり、
R9は、H、-C(O)-CHBr-(CH2)13-CH3、-C(O)-(CH2)2-NH2、-C(O)-(CH2)14-CH3、-C(O)-CH2-CH(OH)-COOH、-C(O)-CH2-O-C(O)-CH2CH(NH2)-CONH2、-C(O)-CH2-O-CH2CH2OCH3、-C(O)-O-C(O)-CH2CH3又は-Reであり、
R10は、フェニル、(CH3)2CHCH2-、-2-フラニル、シクロプロピル又はパラ-トルイルであり、
R11は、フェニル、tert-ブトキシ、-S-CH2-CH-(CH3)2、-S-CH(CH3)3、-S-(CH2)3CH3、-O-CH(CH3)3、-NH-CH(CH3)3、-CH=C(CH3)2又はパラ-クロロフェニルであるが、
ただし、R1及びR9のうちの少なくとも1つはReであることを条件とする。
であり、
式中、
蛍光部分は、当分野において周知である。一部の態様では、蛍光部分は、760nmの励起の極大波長、及び/又は770nmの発光の極大波長を有する。一部の態様では、蛍光部分は、600nmの励起の極大波長、及び/又は600nmの発光の極大波長を有する。一部の態様では、蛍光部分は、500nmの励起の極大波長、及び/又は550nmの発光の極大波長を有する。一部の実施形態では、蛍光部分は、380〜450nm、450〜495nm、495〜570nm、570〜590nm、590〜620nm、620〜650nm、650〜700nm又は700〜760nmから選択される励起波長を有する。一部の実施形態では、蛍光部分は、380〜450nm、450〜495nm、495〜570nm、570〜590nm、590〜620nm、620〜650nm、650〜700nm又は700〜770nmから選択される発光波長を有する。
式中、
Xは、O又はNR20であり、
R20は、H又はC1〜4アルキルであり、
R21は、H、C1〜4アルキル、ハロ、-OH、-COOH、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(C1〜4アルキル)、C1〜4アルコキシ、ハロ、-NO2、-SO2Cl、-SO3 -又はRfであり、
R22は、H、ハロ、-OH、-COOH、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、置換C1〜4アルコキシ、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、-O-C(O)-(置換C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(置換C1〜4アルキル)、-O-CH2-O-(C1〜4アルキル)、-S-CH2-O-(C1〜4アルキル)、-NO2、-SO2Cl、-SO3 -又はRfであり、
R23、R24、R25、R26、R27、R28及びR29はそれぞれ、独立して、H、ハロ、-OH、-NO2、-CH3若しくはRfであるか、
又はR23とR24は一緒に結合して、5、6若しくは7員環を形成し、かつ/又はR24とR25は一緒に結合して、5、6若しくは7員環を形成し、かつ/又はR27とXは一緒に結合して、5、6若しくは7員環を形成し、かつ/又はR28とXは一緒に結合して、5、6若しくは7員環を形成するが、
ただし、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28及びR29のうちの少なくとも1つ及び2つ以下は、Rfであり、RfはLへの結合点であることを条件とする。
式中、R21は、Lへの結合点である。
式中、R30はそれぞれ、独立して、水素、C1〜4アルキル又は置換C1〜4アルキルであり、A1及びA2は、独立して、ヘテロアリールを含有する場合により置換されている窒素であり、nは、1〜10から選択される整数である。一部の実施形態では、ヘテロアリールは、ピロール、イミダゾール、チアゾール、ピリジン、キノリン、インドール、ベンゾオキサゾール又はベンゾチアゾールである。
式中、R40の一方はR30であり、もう一方はRf、L40-Rf、L40-ORf、L40-NHRfであり、L40は、(CH2)mであり、1つ又は2つのCH2基は、O、S、SO、SO2、C(O)O、OC(O)、C(O)NH、NHC(O)、NH、又は場合により置換されているフェニルにより場合により置き換えられており、Rfは、Lへの結合点である。
式中、
R31及びR32は、独立して、H、-OH、C1〜4アルキル、C1〜4ハロアルキル、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(C1〜4アルキル)、C1〜4アルコキシ、ハロ又はRfであり、
R34及びR35は、独立して、H、ハロ、-OH、-COOH、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(C1〜4アルキル)、-O-CH2-O-(C1〜4アルキル)、-S-CH2-O-(C1〜4アルキル)又はRfであり、
R33及びR36はそれぞれ独立して、H、ハロ、-OH、-CH3又はRfであり、
R37、R38及びR39はそれぞれ独立して、ハロ、-OH、-CH3又はRfであり、
各m、n及びpは独立して、0、1、2、3又は4であるが、
ただし、R31、R32、R34、R34、R35、R36、R37、R38及びR39のうちの少なくとも1つ及び2つ以下は、Rfであり、RfはLへの結合点であることを条件とする。
式中、R32は、Lへの結合点である。
本開示のリンカー(L)は、低分子化合物に蛍光部分又はフルオロフォアを結合する。特定の態様では、リンカーは結合であり、すなわち蛍光部分は、低分子化合物に直接、連結されている。
式中、X5は、O又はNHであり、Rの構造は、第482号の出願公開に詳述されている。
式中、x、y、zは、独立して、0、1、2、3、4又は5であるが、ただし、x、y及びzのうちの少なくとも1つは0ではない条件とする。一部の実施形態では、x、y及びzは、独立して1、2、3、4又は5である。
この開示のさらなる態様によれば、上記の組成物である、化合物が充填されているインタクトな非生存細菌ベシクルは、リガンドを介して哺乳動物の腫瘍細胞を標的とするよう指向化される。一部の実施形態では、リガンドは、「二重特異性」である。すなわち、リガンドは、ミニ細胞と哺乳動物(腫瘍)細胞の構成成分のどちらにも特異性を示し、そうしてリガンドにより所与のベシクルが標的細胞に結合し、それにより標的細胞がベシクルを取り込む。ミニ細胞が腫瘍細胞を標的とするための二重特異性リガンドの使用は、WO05/056749及びWO05/079854にさらに記載されており、死滅細菌細胞が腫瘍細胞を標的とするための二重特異性リガンドの使用は、米国特許第8,591,862号にさらに記載されており、それらの全内容のそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている。こうしたリガンドが一旦、ベシクルに結合すると、リガンドの非独占特異性(「単一特異性」)は、そのリガンドが標的(腫瘍)哺乳動物細胞と相互作用するまで関わる。
本開示の組成物の製剤は、例えば、アンプル若しくはバイアル中の単位剤形で、又は保存剤を添加若しくは無添加の多回用量容器で提供することができる。製剤は油性又は水性ビヒクル中の溶液剤、懸濁剤又はエマルション剤とすることができ、懸濁化剤、安定化剤及び/又は分散剤などの製剤用作用剤を含むことができる。好適な溶液剤はレシピエントの血液と等張であり、生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液により例示される。或いは、製剤は、好適なビヒクル、例えば、無菌の発熱性物質不含水又は生理食塩水により復元するための凍結乾燥散剤の形態とすることができる。製剤はまた、デポ調製剤の形態とすることができる。こうした長期作用製剤は、埋込み(例えば、皮下又は筋肉内)によって又は筋肉内注射によって投与することができる。
この実施例は、細菌由来のミニ細胞の細胞質への、ビンブラスチンの蛍光コンジュゲートの封入を実証している。ビンブラスチンは、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、乳がん、頭頚部がん及び睾丸がんを含めた、ある種のがんを処置するために従来から使用されている、抗微小管薬である。
この実施例は、パクリタキセルの蛍光コンジュゲートのインタクトな細菌由来のベシクルの細胞質への封入を実証している。パクリタキセルは、微小管を安定させるタキサンであり、その結果、細胞分裂中に、微小管の正常な分解を妨害する。パクリタキセルは、肺、卵巣及び乳がん、頭頚部のがん、並びに進行形態のカポジ肉腫を処置するための化学療法において、有糸分裂阻害剤として使用されている。
この実施例は、別の蛍光パクリタキセルコンジュゲートであり、「FLUTAX-2」としても知られるパクリタキセルOregon Green(登録商標)-488が、インタクトな細菌由来のベシクルの細胞質に封入され得ることを実証している。この誘導体に関しては、フッ素化フルオレセイン部分であるOregon Green(登録商標)-488は、ベータ-アラニンリンカーを介してパクリタキセルのC7にコンジュゲートされている。このフッ素化フルオレセイン部分は、蛍光(励起約495nm、発光約525nm、緑色蛍光)及び誘導体分子に対する水溶解度の改善をもたらす。
この実施例は、パクリタキセルのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)誘導体(頭文字「FCP」)のインタクトな細菌由来のベシクルの細胞質への効果的な封入を実証している。FLUTAX-1において見いだされたものと同一のフルオレセイン基は、5-オキソ-5-((6-チオウレイドヘキシル)アミノ)ペンタン酸リンカー(すなわち、比較的長いリンカードメイン)を介して、FLUTAX-1及びパクリタキセルOregon Green(登録商標)-488と同様に、パクリタキセル分子上のC7位ではなくC'2位にコンジュゲートされている。ここでもまた、フルオレセイン基は、誘導体分子(励起:495nm、発光:519nm)に蛍光をもたらし、リンカーを用いることにより、その水溶解度が向上している。
この実施例は、細菌染色剤BacLight(商標)Greenが、インタクトな細菌由来のベシクル中に容易に封入され得ることを実証している。緑色蛍光色素(それぞれ、吸収/発光約480/516nm及び約581/644nm)であるBacLight(商標)Greenは市販されており、Life Technologies(Thermo Fisher Scientific)、Molecular Probes(登録商標)ブランドからこの実施例のために得た。その化学構造は、以下に図示されている。
この実施例は、両親媒性の自家蛍光細胞毒素は、細菌由来のベシクルの細胞質に効率的に封入され得ることを実証している。細胞毒素のアントラサイクリン構造であるドキソルビシンが以下に示されている。ドキソルビシンは、がん化学療法において使用され、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の細菌から半化学合成により誘導され、商業的に入手可能である。
SYTO(登録商標)9は、緑色の蛍光(励起約485/6nm、発光約498/501nm)である、核酸結合細菌染色剤である。この実施例のために、SYTO(登録商標)9をLife Technologies(Thermo Fisher Scientific)、Molecular Probes(登録商標)のブランドから得た。
この実施例は、塩酸塩水和物化合物として、蛍光色素9-アミノアクリジンを、インタクトな細菌由来のベシクルの細胞質に封入することができることを実証している。化合物の9-アミノアクリジン塩酸塩水和物(9-AAHH)は、Sigma-Aldrich(St. Louis、MO)から入手可能であり、以下に示されている構造を有する。
この実施例は、疎水性の非蛍光細胞毒性薬物であるパクリタキセル(以下の構造を参照されたい)は、インタクトな細菌由来のベシクルの細胞質に、パクリタキセルの蛍光誘導体ほど効率的に充填されないことを実証している。
この実施例は、パクリタキセルの水溶性類似体である、2'-β-アラニルタキソールギ酸塩又は「TF.Pac」(以下の構造を参照されたい)の充填率が、パクリタキセル自体と比べて、ほんのわずかだけ向上したことを実証している。
この実施例は、蛍光化合物の蛍光を消光すると、蛍光化合物がインタクトな細菌由来のベシクルにそれほど効率的に充填されないかどうかを決定する。この場合では、化合物は、自家蛍光性薬物であるドキソルビシン(Dox)であり、消光物質は葉酸(FA)とした。Husseini、Adv. Sci. Lett. 7巻:726頁(2012年)(FA quenches Dox fluorescence)を参照されたい。
PBS(100μg/ml)中のドキソルビシンを、様々な濃度、つまり0μg/ml、50μg/ml及び400μg/mlのFAと混合した。この溶液を室温で一晩、インキュベートし、次に、0.1μmフィルターによってろ過し、溶液を滅菌して、いかなる微粒子も除去した。
1.ミニ細胞を遠心分離にかけた。16,000gで7分間。
2.上澄み液(SN)を廃棄し、1mlのPBS緩衝液(pH7.4)中でペレットを再懸濁した。
3.ミニ細胞を遠心分離にかけた。16,000gで7分間。
4.SNを廃棄し、0.5mlのPBS緩衝液中でペレットを再懸濁した。
5.0.8μmフィルターにミニ細胞懸濁液を通した。
6.上記のフィルターをさらに0.5mlのPBSにより洗浄し、ミニ細胞と一緒にした。
7.ミニ細胞を遠心分離にかけた。16,000gで7分間。
8.SNを廃棄し、1mlのPBS緩衝液中でペレットを再懸濁した。
9.ミニ細胞を遠心分離にかけた。16,000gで7分間。
10.SNを廃棄し、1mlのPBS緩衝液中でペレットを再懸濁した。
11.ミニ細胞を遠心分離にかけた。16,000gで7分間。
12.SNを廃棄し、最後に350μlのPBS緩衝液中でペレットを再懸濁した。
a. ナノ粒子トラッキング分析(Malvern Instruments、英国)をするために、Nanosight技法を使用して、ミニ細胞の定量を行うために、ミニ細胞を20μlとなる一定分量を採取した。
b. 抽出及びHPLC分析用にミニ細胞40μlをペレットにした(16,000gで15分間、SNを廃棄し、-20℃でペレットを保管した)。
比色アッセイの測定はDox蛍光とは無関係なので、ミニ細胞試料の各々に関するDox含有量を決定するため、HPLCの使用に加えて、比色アッセイを使用してドキソルビシン含有量を測定した。
遊離ドキソルビシンの標準曲線を生成した。バイオフォトメータにより、490nmにおいて、PBS中のドキソルビシンの吸光度を様々な濃度で、二連で測定した。
線形回帰を平均データに対して行い、これにより、式y=0.019x(式中、yは、吸光度(Abs490nm)であり、xはドキソルビシンのμg/mlである)が得られた(図17)。したがって、測定されたミニ細胞Dox試料の場合、
μg/mlドキソルビシン=Abs490nm/0.019
であった。
各ミニ細胞Dox試料からのミニ細胞を上記の表に従い、キュベット中、PBS緩衝液(pH7.4)で200μlにした。空のミニ細胞を含有している「ブランク」試料も、キュベット中、PBS(pH7.4)200μl中で作製した。ブランクのミニ細胞試料及びミニ細胞Dox試料のすべての吸光度を490nmで測定した。
上のMacDiarmidら(2007年)により記載されているHPLCによる分析を行うため、ミニ細胞のペレットを処理した。各試料中のDoxは、UV250nm検出と相対蛍光(RF)検出の両方を使用して定量した。
この実施例は、「ミトザントロン」としても知られている、内在的に蛍光性の細胞毒性薬である、ミトキサントロン二塩酸塩(MTX)のインタクトな細菌由来のベシクルへの充填が向上したことを例示している。アントラセンジオン抗新生物剤MTXは、タイプIIのトポイソメラーゼ阻害剤として作用し、転移性乳がん、急性骨髄性白血病及び非ホジキンリンパ腫などのがんを処置するために使用されてきた。
2時間:6.24×1010/ml
4時間:5.77×1010/ml
一晩:5.93×1010/ml
この実施例は、イオンの存在により、最初の実施例によって証明された、ベシクルへの充填の、蛍光を媒介とする向上が強められることを示している。したがって、ベシクル媒体中の、塩の解離に由来するイオンは、細菌由来のベシクル(ここでは、ミニ細胞)のインタクトな膜中のチャネルと相互作用し、その結果、化合物とチャネル中又はチャネルに並ぶ分子との間のエネルギー移動が、膜貫通チャネルを介した蛍光化合物の移動に及ぼす上記で論じた効果が賦活されると考えられる。
本実施例は、MacDiarmidら(2007年)との関連で、上で論じた小スケールプロトコルと本発明の大スケール方法を対比する。実施例が実証している通り、本発明の方法により、インタクトな細菌由来のベシクルを含有する組成物が、驚くほど優れた濃度と純度で得られた。これは、本発明の大スケール方法により、エンドトキシンレベルだけではなく、ベシクルの外部に捕捉されたペイロード化合物もかなり低減されるからである。
インタクトなミニ細胞を調製し、ミニ細胞が標的となるいずれの二重特異性リガンドも有しておらず、したがって、標的化宿主細胞によって取り込まれないことを除外すると、MacDiarmidら(2007年)の方法に実質的に従って、ドキソルビシンを充填した。回転しながら、37℃で薬物(約1ml/mg)と一晩、インキュベートして、充填されたミニ細胞に、5回、遠心分離(13,200rpm、10分間)を必要とする洗浄工程、及び得られたペレットの1ml BGS緩衝液(pH7.4)中での再懸濁を施した。
ドキソルビシンを封入したミニ細胞のバッチを独立して5つ調製し、EGFRに結合する二重特異性リガンドを用いて標的化した(MacDiarmidら(2007年)の443頁の「実験手順」の第2段落を参照されたい)。大スケール方法に準拠し、ドキソルビシンを充填しており、かつEGFRを標的とするミニ細胞に、大型のクロスフローフィルター上で、PBS緩衝液を用いて、5回、連続の洗浄(1回の洗浄あたり約20リットル)を施した。
Claims (23)
- ドキソルビシン、イリノテカン、ビスアントレン、トポテカン、エピルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、Oregon Green(登録商標)488-コンジュゲートされているパクリタキセル又はBODIPY(登録商標)FL-コンジュゲートされているビンブラスチンではない、蛍光低分子薬を封入するインタクトな非生存細菌ベシクルを含む組成物。
- ベシクルが、インタクトな細菌由来のミニ細胞である、請求項1に記載の組成物。
- ミニ細胞が、少なくとも約500,000個の分子の低分子薬を封入する、請求項1又は2に記載の組成物。
- ベシクルが死滅細菌細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
- 低分子薬が、
(a)生物活性である、かつ/又は
(b)細胞毒性がある、かつ/又は
(c)インビボで活性化される
請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。 - 低分子薬がモルホリニルアントラサイクリン誘導体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- 低分子薬がPNU-159682である、請求項6に記載の組成物。
- 式D-L-Fの化合物又はその塩を封入するインタクトな非生存細菌ビシクルを含む組成物であって、Dが低分子薬の残基であり、Lがリンカーであり、Fが蛍光部分である、組成物。
- リンカーが、約6時間〜約24時間の間の半減期を有する、請求項8に記載の組成物。
- リンカーが哺乳動物細胞のエンドソームにおいて分解される、請求項8又は9に記載の組成物。
- (a) リンカーが、結合、-OC(O)-(CHR40)qNR41C(O)-及び-OC(O)-(CHR40)qC(O)NR41-(CHR42)u-NH-C(S)-NH-からなる群から選択され、R40、R41及びR42が、独立して-H若しくはC1〜4アルキルであり、q及びuが、独立して、1、2、3、4、5、6若しくは7であるか、又は
(b) リンカーが、-O-C(O)-(CH2)NHC(O)-及び-O-C(O)-(CH2)3C(O)NH-(CH2)6-NH-C(S)-NH-からなる群から選択される、
請求項8から10のいずれか一項に記載の組成物。 - 蛍光部分が、
R21は、-H、-OH、-COOH、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(C1〜4アルキル)、C1〜4アルコキシ、ハロ又は-Rdであり、
R22は、-H、-OH、-COOH、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、置換C1〜4アルコキシ、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、-O-C(O)-(置換C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(置換C1〜4アルキル)、-O-CH2-O-(C1〜4アルキル)、-S-CH2-O-(C1〜4アルキル)又は-Rdであり、
R23、R24、R25、R26、R27、R28及びR29はそれぞれ、独立して、-H、ハロ、-OH、-CH3又は-Rdであるが、
ただし、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28及びR29のうちの少なくとも1つは、-Rdであり、Rdはリンカーへの結合点であることを条件とする)である、請求項8から11のいずれか一項に記載の組成物。 - 蛍光部分が、
- 蛍光部分が、
R31及びR32は、独立して、-H、-OH、C1〜4アルキル、C1〜4ハロアルキル、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(C1〜4アルキル)、C1〜4アルコキシ、ハロ又は-Rdであり、
R34及びR35は、独立して、-H、ハロ、-OH、-COOH、C1〜4アルキル、置換C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、-O-C(O)-(C1〜4アルキル)、-C(O)-O-(C1〜4アルキル)、-O-CH2-O-(C1〜4アルキル)、-S-CH2-O-(C1〜4アルキル)又は-Rdであり、
R33及びR36はそれぞれ独立して、-H、ハロ、-OH、-CH3又は-Rdであり、
R37、R38及びR39はそれぞれ独立して、ハロ、-OH、-CH3又は-Rdであり、
m、n及びpはそれぞれ独立して、0、1、2、3又は4であるが、
ただし、R31、R32、R34、R34、R35、R36、R37、R38及びR39のうちの少なくとも1つは、-Rdであり、Rdはリンカーへの結合点であることを条件とする)である、請求項8から11のいずれか一項に記載の組成物。 - 蛍光部分が、
- リンカーを介してエネルギー移動部分に結合されている活性剤を含む化合物を封入するインタクトな細菌由来の細菌ベシクルを含む組成物であって、前記活性剤が、Oregon Green(登録商標)488-コンジュゲートされているパクリタキセル及びBODIPY(登録商標)FL-コンジュゲートされているビンブラスチン以外である、組成物。
- エネルギー移動部分が、
(a) 発光部分である、
(b) 共役パイ系を含む、かつ/又は、
(c) アクリジニル部分、ザンテニル部分若しくはベンゾイミダゾリル部分を含む
請求項16に記載の組成物。 - 遠心分離を用いることなく、所望の化合物を複数のミニ細胞に充填する方法であって、
(a)緩衝液体中、前記化合物のある量のインキュベート用溶液を複数回、インキュベートするステップであって、前記量が約100ml程度以上となる、ステップ、次に
(b)洗浄工程を複数から多数回、施すステップであって、それぞれが数リットル程度である、ある量の緩衝液体によるミニ細胞のクロスフローろ過を含み、洗浄工程のいずれもミニ細胞の遠心分離を使用しない、ステップ
を含む方法。 - 所望の化合物とは異なる二元イオン化合物を、約200mM程度以上の濃度までインキュベート用溶液に溶解する、請求項18に記載の方法。
- (a) 工程(b)が、3〜5回の洗浄工程を含む、かつ/又は
(b) 所望の化合物が蛍光性である、かつ/又は
(c) インキュベートが、約4時間以上の期間である、かつ/又は
(d) 所望の化合物が生物活性である、かつ/又は
(e) 所望の化合物が、約1500ダルトン以下の低分子薬である、かつ/又は
(f) 低分子薬に細胞毒性がある、かつ/又は
(g) 低分子薬がインビボで活性化される
請求項18又は19に記載の方法。 - 所望の化合物が、式D-L-F又はその塩であり、Dが低分子薬の残基であり、Lがリンカーであり、Fが蛍光部分である、請求項18から20のいずれか一項に記載の方法。
- (a) リンカーが、約6時間〜約24間の半減期を有する、かつ/又は
(b) リンカーが、哺乳動物細胞のエンドソーム中で分解する
請求項21に記載の方法。 - それを必要としている患者においてがんを処置するための医薬における、化合物に細胞毒性がある、請求項1から17のいずれか一項に記載の組成物の有効量の使用。
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