CN106459980B - Tlr-4特异性适配体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有特异性结合并抑制TLR‑4的能力的核酸适配体、包括该适配体和功能性基团的复合物、及其药物组合物。本发明还涉及检测TLR‑4的应用和方法以及抑制TLR‑4的应用和方法。最后，本发明还涉及用于制备治疗以TLR4表达增加和/或TLR‑4激活增加为特征的病理的药物的适配体。

Description

TLR-4特异性适配体及其应用

技术领域

本发明提供具有特异性结合并抑制TLR-4的能力的核酸适配体及其应用。

发明背景

当前已知，中枢神经系统(CNS)响应细菌感染和脑损伤，并且具有组织非常良好的先天免疫反应。先天免疫系统可通过toll样受体(TLR)等识别高度保守的分子模式。

TLR4是在哺乳动物中表征的第一个TLR。这种TLR的外源配体已被描述，如革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸(LTA)、或合胞体呼吸道病毒的F蛋白。此外，最重要的内源配体是HMBG1、内源或源自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的HSP-60、HPS-70、纤连蛋白、纤维蛋白原、透明质酸等，其全部源自组织损伤、细胞损伤和/或宿主血管。TLR4涉及多种高度普遍的病理，如中风或脑血管疾病、急性心肌梗塞、脓毒症、动脉粥样硬化、多发性硬化、类风湿关节炎、视网膜变性疾病、和药物成瘾等。

先天免疫性和具体地TLR在多种病理中的涉及在这些受体的激动剂和拮抗剂的研发中引起了越来越多的关注。激动剂因此已被研发用于可能的癌症治疗、过敏性疾病、感染和作为疫苗辅佐剂(vaccine coadyuvants)。另外，脓毒症、动脉粥样硬化、慢性疼痛和结肠炎中的TLR拮抗剂正在被研究；事实上，这些病理中有几种拮抗剂——依立托仑(eritoran)(III期)、异丁地特(ibudilast)(Av411；II期)和NI-0101抗体(临床前阶段)——正在被研究。

专利文件WO 2006/138681描述了一种通过给予TLR-4抑制剂来抑制肝内激活的T细胞缺失的方法，其中提及了TLR-4特异性适配体。

Roger等(Roger等，2009，Proc Natl Acad Sci USA 106:2348-52)描述了TLR4胞外结构域的特异性抗体。这些抗体在小鼠内提供抵抗革兰氏阴性菌的致命脓毒症的保护。这些抗TLR4抗体的治疗有用性也被启示——鉴于在暴露于内毒素后上至4h和在大肠杆菌(Escherichia coli)导致的感染发作后上至13h给予抗体时治疗有效。

因此，本领域需要具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且可用作治疗剂的新型分子。

发明内容

第一方面，本发明涉及具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体。

另一方面，本发明涉及包括本发明的适配体和功能性基团的复合物。

另一方面，本发明涉及本发明的适配体或本发明的复合物用于检测TLR-4的应用。

另一方面，本发明涉及本发明的适配体或本发明的复合物用于抑制TLR-4的体外应用。

另一方面，本发明涉及检测样本中的TLR-4的体外方法，包括

i)使所述样本与根据本发明的适配体、或根据本发明的复合物接触，

ii)分离未结合TLR-4的适配体或复合物，和

iii)检测与样本中存在的TLR-4结合的适配体或复合物的存在。

另一方面，本发明涉及抑制样本中的TLR-4的体外方法，包括使包括TLR-4的样本与根据本发明的适配体、或根据本发明的复合物在适于抑制TLR-4的条件下接触。

另一方面，本发明涉及用于治疗以TLR4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的本发明适配体。

另一方面，本发明涉及包括至少一种根据本发明的适配体或至少一种根据本发明的复合物，任选地组合一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或溶剂的药物组合物。

附图说明

图1.通过ELONA选择的适配体识别TLR-4蛋白。将人重组TLR-4蛋白(6xHIS-TLR-4)以100ng/孔的浓度在96孔微量滴定板中培养并在4℃下培养16h。随后，将20pmol以地高辛标记的各适配体加入每个孔，并将板在37℃下温育1h。最后，将板与过氧化物酶缀合的抗地高辛抗体一起温育，并利用ABTS显色。抗Li H2A DNA适配体用作阳性对照(Martín等，2013，PLoS ONE 8：e78886)。所有实验进行三次。

图2.利用mFold程序预测的适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ IDNO：4)的二级结构。通过QGRS Mapper程序鸟嘌呤(可能是预测的G-四结构的部分)显示在框(boxes)中。

图3.适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)与重组hTLR-4(A)和与细胞中表达的TLR-4蛋白(B)的结合。所有实验进行三次。

图4.适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)对HEK-BluehTLR4细胞和拮抗剂LPS-RS-UP(2ng/μl；20ng)作为对照的拮抗效果。适配体以0.2、2、20和200nM的最终浓度施用,或拮抗剂对照LPS-RS-UP(2ng/μl；20ng)。激动剂LPS-EK-UP(0.02ng/μl)(A)或HEK293细胞的溶解产物(损伤相关分子模式；DAMP)(B)用作激动剂对照，并且在24h后在630nm下利用QUANTI-Blue^TM底物测量分泌的碱性磷酸酶(SEAP)活性。数据表示为相对于对照细胞的SEAP活性百分比。所有实验进行三次，并且7-9个不同实验的平均值显示在图中。统计学显著(*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001)。

图5.适配体TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)对在500ng/ml LPS存在下刺激的巨噬细胞的效果。在24h适配体成瘾时通过Griess反应研究硝酸盐释放。样本试验三次。通过单程ANOVA然后Bonferroni检验分析差异。结果是三次实验双重检验的平均值。统计学显著(***P<0.001)。说明：38x(AG)是序列SEQ ID NO：7的寡核苷酸，其是非特异性序列，不能采用任何二级结构；Inh：夏罗草酮(hispanolone)衍生化合物11(Girón等，2008，Toxicol Appl Pharmacol 228:179-89)。

图6.利用mFold程序预测的适配体TLRApt#1R-T(SEQ ID NO：1)和TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)的二级结构。鸟嘌呤(可能是预测的G-四结构的部分)通过QGRS Mapper程序显示在框中。

图7.腹膜内注射1nmol适配体TLRApt#1R-T(SEQ ID NO：1)，TLRApt#4F-T(SEQ IDNO：2)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)或38x(AG)(SEQ ID NO：7)或媒介(PBS+1mM Mg²⁺)在实验所用动物梗塞面积减少中的效果。通过结扎阻塞脑中动脉，从而使成年雄性小鼠C57BL/10ScSn(WT；正常)和C57BL/10ScNJ(KO，缺乏功能性TLR4)诱发灶性脑缺血。用异氟烷麻醉小鼠，并在MCAO后24小时，通过MRI评价梗塞尺寸。在4.7T下运行的BIOSPEC BMT 47/40(Bruker-Medical，Ettlingen，Germany；MRI Unit，Instituto Pluridisciplinar，UCM)中获得了在T2(T2WI)中突出的图像，并且通过Image J1.41(NIH，Bethesda，Washington)定量损伤面积。统计学显著(*P<0.05)。Keys：1RT，TLRApt#1R-T；4FT，TLRApt#4F-T；4F，TLRApt#4F。

图8：剂量响应曲线。腹膜内注射不同量适配体TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)或媒介(PBS+1mM Mg2+)在实验所用动物梗塞面积减少中的效果。通过结扎阻塞脑中动脉，从而使成年雄性小鼠C57BL/10ScSn(WT；正常)诱发灶性脑缺血。用异氟烷麻醉小鼠，并在MCAO后24小时，通过MRI评价梗塞尺寸。在4.7T下运行的BIOSPEC BMT47/40(Bruker-Medical，Ettlingen，Germany；MRI Unit，Instituto Pluridisciplinar，UCM)中获得了在T2(T2WI)中突出的图像，并通过Image J 1.41(NIH，Bethesda，Washington)定量损伤面积。统计学显著(*P<0.05)。

图9：流式细胞术试验。(A)人HEK293(左图)和293-hTLR4A(右图)细胞系与20nMAlexa fluor 488-标记的适配体一起在室温下温育30min。细胞用2ml PBS洗涤并重悬浮于1mL PBS以进行分析。在各图中，纵坐标表示事件频率(或细胞数目)，而横坐标表示荧光强度(FL1)。黑色区，自发荧光；黑线，适配体TLRApt#1R-T(SEQ ID NO：31)；灰线，适配体TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：42)。(B)人293-hTLR4A细胞系用LPS-EK-UP活化，然后与20nMAlexa Fluor 488标记的适配体一起在室温下温育30min。细胞用2ml PBS洗涤并重悬浮于1mL PBS以进行分析。在各图中，纵坐标表示事件频率(或细胞数目)，而横坐标表示荧光强度(FL1)。黑色区，自发荧光；黑线，适配体TLRApt#1R-T(SEQ ID NO：31)；灰线，适配体TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：42)。

图10：适配体半衰期体外分析。300ng折叠适配体与2单位的λ核酸外切酶或DNA酶I一起在37℃下温育若干时间段。然后，样本在3％琼脂糖凝胶上解决，并且带通过GelRed可视化并利用Image Studio Digits V3.1软件定量。

具体实施方式

本发明的作者选择并表征了两种分子，该分子因其序列可在特定pH、温度和盐浓度条件下形成三维结构，赋予其特异性识别TLR-4蛋白并调控其活性的能力。这些分子可抑制体内受体TLR-4介导的细胞响应，并且可减少缺血性中风动物模型的脑梗塞尺寸，赋予其潜在的治疗作用。

TLR-4特异性适配体

第一方面，本发明涉及具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ IDNO：1(CCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCAGGTCGACACC)和SEQ ID NO：2

(GGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCGGTTGGCCCTAAATACG AG)的序列的核酸适配体——在下文中被称为“本发明的适配体”——或其功能等同变体。

术语“适配体”在本发明环境中指代这样的单链核酸链：具有具体三级结构，该具体三级结构允许其通过常规Watson-Crick碱基配对之外的相互作用以与单克隆抗体相当的高特异性和亲和性结合至分子目标。

术语“核酸”在本发明环境中指代任何类型的核酸如DNA和RNA，及其变体如肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、及其组合，其修饰，包括修饰核苷酸等。术语“核酸”和“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本发明环境中可互换使用。核酸可从天然来源纯化，利用重组表达系统生成和任选地纯化，化学合成等。适当时，例如，在化学合成分子的情况下，核酸可包括核苷类似物，如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。核酸序列以5’-3’方向表示，除非另外指明。

术语“TLR-4”在本发明环境中指代膜受体toll样受体4。受体TLR-4也可被称为ARMD10、CD284、TLR4或hTOLL。人的受体TLR-4于2014年5月27日以登录号O00206.2被登记在GenBank中，并且其由TLR4基因编码。其由839个氨基酸构成，其中残基1-23构成信号序列，残基24-631构成胞外结构域，残基632-652构成跨膜结构域，并且残基653-839构成细胞质结构域。

在具体实施方式中，适配体可特异性结合TLR-4的胞外结构域(氨基酸24-631)。

本发明考虑包括选自SEQ ID NO：1

(CCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCAGGTCGACACC)和SEQ ID NO：2

(GGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCGGTTGGCCCTAAATACG AG)的序列的适配体或其功能等同变体。

本发明还考虑这样的本发明适配体：由核酸如DNA和RNA构成、以及由核酸变体和类似物和其组合、其修饰，非限制地包括，修饰核酸骨架、取代键、修饰核苷酸、和核糖或脱氧核糖类似物、修饰核苷酸等构成，其特异性结合并抑制TLR-4的能力为序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的适配体的特异性地结合和抑制TLR-4的能力的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％。核酸变体和类似物的非限制性实例非限制地包括，PNA、LNA和TNA。

术语“核酸变体”或“核酸类似物”在本发明环境中指代核酸变体和类似物，非限制地包括，修饰核酸骨架、取代键、修饰核苷酸、和核糖或脱氧核糖类似物。例如，根据本发明的核酸变体可包括具有一般磷酸二酯骨架的类似物合成骨架的结构。这些非限制地包括，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3'-硫缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)、3'-N-氨基甲酸酯、吗啉氨基甲酸酯和肽核酸(PNA)、甲基磷酸酯键或交替甲基磷酸酯和磷酸二酯和苄基磷酸酯。

核酸变体还可包含本领域一般理解的一种或多种“取代”键。这些取代键中的一些是非极性的并且有助于提供具有跨膜扩散能力的适配体。这些“取代”键在本文中被定义为常规的可选键，如硫代磷酸酯或氨基磷酸酯，并且按照常用文献所述合成。可选的结合基团以非限制性方式包括如下实施方式：其中式P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、P(O)NR'₂、P(O)R'、P(O)OR⁶、CO、或CONR'₂的部分——其中R'是H(或盐)或1-12个碳原子的烷基并且R⁶是1-9个碳原子的烷基，通过-S-或-O-结合相邻核苷酸。二硫代酯键被描述于美国专利申请248517。本发明还考虑使用包括不基于磷的核苷酸间键的取代键，如3'-硫代甲缩醛,(-S-CH₂-O-)、甲缩醛(-O-CH₂-O-)和3'-胺核苷酸间键(-NH-CH₂-CH₂-)——被描述于美国专利申请690786和763130。一种或多种取代键可用于本发明的适配体，目的是进一步促进与TLR-4的结合或增加适配体抗核酸酶的稳定性，以及提供渗透能力。同一适配体中不是所有键都必须是相同的，因此本发明考虑所有键相同的适配体以及其键组成相异的适配体。

同样，根据本发明的核酸变体还可包含本领域公知的核糖或脱氧核糖类似物形式，非限制地包括2’位取代糖，如2'-O-甲基-核糖、2'-氟-核糖或2'-叠氮-核糖、糖碳环类似物、α-异头糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖。核酸还可包含苏糖核酸(TNA，也被称为α-苏呋喃糖基寡核苷酸)(参见，例如，Schong等，Science2000，November 17，290(5495)：1347-1351)。具体地，呋喃糖残基的2'位取代对于核酸酶稳定性提高尤其重要。

术语“核苷酸”在本发明环境中指代构成核酸的单体。核苷酸由戊糖、含氮碱基和磷酸酯基团形成，并且通过磷酸二酯键结合。核苷酸——DNA和RNA的部分——区别于戊糖，其分别是脱氧核糖和核糖。含氮碱基进而分成嘌呤含氮碱基——为腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶含氮碱基——为胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。胸腺嘧啶仅出现在DNA中，而尿嘧啶仅出现在RNA中。本发明考虑本发明的适配体中使用修饰核苷酸。术语“修饰核 苷酸”在本发明环境中指代具有类似或提高的结合性质的已知天然核苷酸类似物。嘌呤和嘧啶的类似物形式在本领域公知，并且非限制地包括，氮丙定基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N₆-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N₆-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基keosine、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N-6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、keosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、和2,6-二氨基嘌呤。除前述修饰核苷酸外，本发明还可包括缺乏嘌呤或嘧啶的核苷酸残基。

除前述变体外，本发明包括的核酸变体还包括PNA、LNA和5’-5’或3’-3’链。术语“肽核酸”或“PNA”在本发明环境中指代这样的寡核苷酸：其骨架由通过肽键结合的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸重复单元构成，其中不同含氮碱基通过亚甲基键(-CH₂-)和羰基(-(C＝O)-)结合于主链。术语“锁定核酸”或“LNA”在本发明环境中指代修饰RNA核苷酸，其核糖部分被连接2’位的氧与4’位的碳的另一键修饰，将核糖锁定在3'-内构象。术语“5’-5’链”或“3’-3’链”在本发明环境中指代这样的寡核苷酸：其中3’或5’端的核苷酸分别颠倒。

如本文所用，术语“功能等同变体”指代具有基本上类似于SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的序列、保持特异性地结合和抑制TLR-4的能力的适配体。本发明适配体的功能等同变体可以是衍生自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的包括一种或多种核苷酸的添加、取代或修饰的核酸序列。作为示例，本发明适配体的功能等同变体包括这样的序列：在序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的5’端包含添加的1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、200个核苷酸、至少500个核苷酸、至少1000个核苷酸或更多个核苷酸，和/或在序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的3’端包含添加的1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、200个核苷酸、至少500个核苷酸、至少1000个核苷酸或更多个核苷酸，并且保持特异性地结合和抑制TLR-4的能力在特异性地结合和抑制TLR-4的能力的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％。

本发明还包括这样的适配体：其包括的核苷酸序列与序列SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且保持特异性地结合和抑制TLR-4的能力在特异性地结合和抑制TLR-4的能力的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％。

术语“同一性”、"同一"或“同一性百分比"在两种或更多种核酸的环境下指代两种或更多种序列或子序列在比较和对齐(如需，引入空位)得到最大限度对应时相同或具有指定的相同核苷酸或氨基酸残基百分比——不将任何保守氨基酸取代认为是序列同一性的部分。同一性百分比可利用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。多种算法和软件在本领域已知可用于实现氨基酸或核苷酸序列对齐。这种序列对齐算法的一个非限制性实例是Karlin等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：2264-8描述的Karlin等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：5873-7改进的算法，并且被并入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等，1991，Nucleic Acids Res.，25：3389-402)。在某些实施方式中，可采用Altschul等，1997，Nucleic Acids Res。25：3389-402描述的Gapped BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等，1996，Methods in Enzymology，266：460-80)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech，South San Francisco，California)或Megalign(DNASTAR)是可用于对齐序列的另外的公众可获得的软件程序。在某些实施方式中，两核苷酸序列之间的同一性百分比利用GCG软件中的GAP程序来确定(例如，利用NWSgapdna.CMP矩阵，以及40、50、60、70、或90的空位权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重)。在某些可选实施方式中，GCG软件包中合并Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-53(1970))的算法的GAP程序可用于确定两氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，利用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6、或4的空位权重和1、2、3、4、5的长度权重)。可选地，在某些实施方式中，核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比利用Myers和Miller(CABIOS，4：11-7(1989))的算法来确定。例如，同一性百分比可利用ALIGN程序(2.0版)和利用PAM120(带有残基表、空位长度罚分12和空位罚分4)来确定。通过具体对齐软件进行最大限度对齐的适宜参数可由本领域技术人员确定。在某些实施方式中，采用对齐软件的默认参数。在某些实施方式中，第一氨基酸序列相对于第二序列氨基酸的百分比同一性"X"以100x(Y/Z)计算，其中Y是第一和第二序列对齐(通过目视检查或具体序列对齐程序对齐)中记为同一性匹配的氨基酸残基数，并且Z是第二序列中的残基总数。如果第二序列长于第一序列，则可仅确定在所述第一和第二序列之间的重叠区域中的同一性百分比。在这种情况下，可使用上述相同公式，但采用其中第一和第二序列重叠的区域的长度作为Z值，所述区域的长度基本上与第一序列的长度相同。

作为非限制性实例，在某些实施方式中，任何具体多核苷酸是否与参考序列具有某一百分比序列同一性(例如，至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，和在一些实施方式中，至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性)可利用Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，8版，Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)来确定。Bestfit利用Smith和Waterman，Advancesin Applied Mathematics 2：482-9(1981)的局部同源性算法找到两序列之间的最佳同源性节段。当利用Bestfit或任何其它序列对齐程序来确定具体序列是否与根据本发明的参考序列具有例如95％同一性时，设定参数从而计算在参考核苷酸序列全长上的同一性百分比并且允许参考序列中有核苷酸总数的上至5％的同源性空位。

在一些实施方式中，本发明的两个核酸基本上相同，意味着当比较和对齐以最大限度对应时其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、和在一些实施方式中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性——利用序列比较算法或通过目视检查测量。在至少约10、约20、约40-60个残基长度或其间任何整数值的序列区域上可存在同一性，在长于60-80个残基(例如，至少约90-100残基)的区域上可存在同一性，并且在一些实施方式中，序列在比较的对照序列全长上是基本上同一的，如例如核苷酸序列的编码区域。

术语“特异性结合”或“特异性结合TLR-4”在本发明环境中指代两分子——本发明的适配体和受体TLR-4——之间的非共价物理缔合。认为本发明适配体与受体TLR-4之间的结合具有特异性的条件是两者之间的结合强度是比本发明适配体与不相关分子之间的结合强度大至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍或至少100倍。如果在所用条件(例如，生理条件，细胞培养条件或允许细胞存活的条件)下平衡解离常数Kd为10^-3M或更小、10^-4M或更小、10^-5M或更小、10^-6M或更小、10^-7M或更小、10^-8M或更小、10^-9M或更小、10^-10M或更小、10^-11M或更小、或10^-12M或更小，则也认为本发明适配体与受体TLR-4之间的结合具有特异性。

本发明适配体特异性结合TLR-4的能力可通过多种本领域可用的试验来确定。优选地，本发明适配体特异性结合TLR-4的能力通过如下确定：体外结合试验如酶联寡核苷酸试验(ELONA)、酶联适配体吸附剂试验(ELASA)、沉淀和定量PCR(qPCR)，或荧光技术如适配体组织化学(aptahistochemistry)、适配体细胞化学(aptacytochemistry)、荧光显微术或流式细胞术。同样，特异性结合TLR-4的能力和适配体对TLR-4的亲和性均可通过本领域技术人员公知的技术来确定，如凝胶迁移率变动试验、表面等离子体共振(SPR)、动力学毛细管电泳和荧光结合试验。简言之，荧光结合试验由下列组成：将涂覆有TLR-4的磁球与不同浓度(例如，0至100nM)的带标记(例如，用羧基荧光素，FAM标记)的本发明适配体一起温育，然后洗脱和检测结合的适配体；通过非线性拟合分析计算解离常数(Kd)。

术语“抑制TLR-4”在本发明环境中指代阻断或降低TLR-4的活性，即，受体TLR-4介导的信号的转导。当其活性是存在其天然激动剂LPS时TLR-4活性的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％、至少45％、至少40％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、至少15％、至少10％、至少5％、至少1％、或更小时，认为TLR-4的活性被抑制剂或拮抗剂抑制。

本发明适配体抑制TLR-4的能力可通过本领域可用的多种试验来确定。优选地，本发明适配体抑制TLR-4的能力通过体外试验确定——利用表达重组TLR-4和报告基因的细胞，其的表达与重组TLR-4的激活相关。本领域技术人员会理解这种方法根据所用细胞和重组基因而有多种变型。本发明的实施例包含了这种试验的实例(关于“材料和方法”和实施例2的部分)。其它可利用的技术包括确定表达TLR-4的细胞释放的炎性细胞因子如IL-1、IL-8、TNF-α和IL-12的水平。

在具体实施方式中，本发明的适配体由30和200个之间的核苷酸组成，优选35和150个之间的核苷酸，更优选40和100个之间的核苷酸，还更优选45和80个之间的核苷酸。

在另一具体实施方式中，本发明的适配体包括选自SEQ ID NO：3(GTTGCTCGTATTTAGGGCCACCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCA GGTCGACACCAGTCTTCATCCGC)和SEQ IDNO：4(GCGGATGAAGAC TGGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCGGTTGGCCCTAAATACGAGCAAC)的序列。序列SEQ ID NO：3是SEQ ID NO：1的功能等同变体，序列SEQ ID NO：4是SEQID NO：2的功能等同变体。

在具体实施方式中，核酸是DNA。在另一具体实施方式中，核酸是RNA。在另一具体实施方式中，核酸是PNA。在另一具体实施方式中，核酸是LNA。在另一具体实施方式中，核酸是TNA。

在另一具体实施方式中，TLR-4是选自小鼠、大鼠、兔、猪、猫、狗、马、灵长类和人TLR-4的TLR-4。在优选实施方式中，TLR-4是人TLR-4。

本发明适配体的生产可按照本领域的常规方法进行。适配体生产技术的非限制性实例包括酶促技术，如转录、重组表达系统和标准固相(或溶液相)化学合成——全部都商业可得。适当时，例如，在本发明的适配体包括诸如上述那些的核酸变体、核苷酸类似物如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物的情况下，将通过化学合成生产本发明的适配体。可选地，在所述适配体的长度为200个核苷酸或更多时，表达是生产适配体的优选技术。通过前述技术或前述技术的任一种生产的适配体可任选地通过本领域公知的方法纯化。

本发明的复合物

本领域技术人员将理解，本发明适配体的小尺寸、稳定性和易生产特点能够使所述适配体呈现结合第二分子。这在第二分子是功能性基团时尤其有益。本发明适配体和功能性基团结合的结果是呈现两者功能组合的复合物，即，具有特异性结合和抑制TLR-4能力和功能性基团相关活性的复合物。

因此，另一方面，本发明涉及复合物，在下文中被称为“本发明的复合物”，其包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力的、包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团。

术语“适配体”已被关联定义详细描述，而TLR-4特异性适配体(上文)及其定义和特性同样适用于在本发明环境中的复合物。

术语“功能性基团”在本发明环境中指代适于执行至少一种功能的化合物。所述功能非限制地包括，特异性结合TLR-4或其它受体TLR的能力、抑制TLR-4或其它受体TLR的能力、直接和间接可检测的能力、诱导细胞死亡的能力、携载治疗有效载荷的能力等。本领域技术人员会理解，功能性基团可关联一种或多种功能。功能性基团的非限制性实例包括可检测试剂和药物。这些功能性基团作用如成像剂、药物等。

因此，在具体实施方式中，功能性基团选自可检测试剂、药物和纳米颗粒。

在另一具体实施方式中，功能性基团是可检测试剂。术语“可检测试剂”、“成像剂”和“对比剂”在本文中可互换使用，指代生物相容性化合物，用其通过增加图像那些不同区域之间的"对比度"来促进图像不同部分的区分。术语"对比剂"因而包括用于增加图像质量的试剂，但图像可在不存在这种试剂的情况下生成(例如MRI是这种情况)，以及作为图像生成的先决条件的试剂(例如核成像是这种情况)。适当的对比剂非限制地包括，用于放射性核素成像、用于计算机断层摄影术(CT)、用于拉曼光谱、用于磁共振成像(MRI)和用于光学成像的对比剂。

放射性核素成像的可检测试剂包括放射性药物，其常用正电子发射体如¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、⁸²Rb、⁶²Cu、⁶⁴Cu和⁶⁸Ga、⁸⁶Y、¹²⁴I、²¹³Bi和²¹¹At标记。SPECT放射性药物常用正电子发射体如⁹⁴mTc，²⁰¹Tl和⁶⁷Ga标记。放射性核素成像模式(正电子发射断层摄影术(PET)；单光子发射计算机断层摄影术(SPECT))是描绘放射性核素标记的放射性示踪剂的位置和浓度的诊断性剖面成像技术。PET和SPECT通过测量代谢活性可用于定位和表征放射性核素。PET和SPECT提供细胞水平信息如细胞活力相关的信息。在PET中，正电子发射体被给予患者，其可随着物质贯穿身体移动而被监测。在本发明的某些实施方式中，根据本发明的复合物用于体内PET或SPECT成像。与PET密切关联的是单光子发射计算机断层摄影术、或SPECT。两者之间的主要差异是SPECT利用发射低能光子的放射性示踪剂代替正电子发射物质。放射性核素的其它非限制性实例包括γ发射同位素如⁹⁹mTc、¹²³I和¹¹¹In——其可用于利用γ照相机的放射性闪烁显像术或计算机单光子发射断层摄影术，以及β发射剂如¹³¹I、⁹⁰Y、⁹⁹mTc、¹⁷⁷Lu和⁶⁷Cu”。本领域技术人员将理解，放射性核素也可用于治疗目的。

用于CT成像的可检测试剂包括，例如，碘化或溴化对比介质。这些试剂的实例包括碘酞酸盐、iohexyl、泛影酸盐、碘帕醇、乙碘油和碘番酸盐。钆剂已被报道用作CT对比剂。例如，钆喷酸剂(gadopentate agents)已被用作CT对比剂。计算机断层摄影术(CT)被考虑作为在本发明环境中的成像模式。通过采用不同角度的一系列X射线(有时超过一千种)，然后利用计算机将其组合，CT可以构建身体任何部位的三维图像。计算机经编程显示任何角度和任何深度的二维切片。在CT中，当最初CT扫描诊断不出时，静脉内注射诸如本文描述那些的辐射不透对比剂可协助识别和描绘软组织团。

光学成像的可检测试剂包括，例如，荧光素、荧光素衍生物、靛青绿、Oregon绿、Oregon绿衍生物、罗丹明绿、罗丹明绿衍生物、曙红、赤藓红、Texas红、Texas红衍生物、孔雀石绿、纳米金磺基琥珀酰亚胺酯、级联蓝、香豆素衍生物、萘、吡啶基

唑衍生物、级联黄染料、dapoxyl染料、以及各种其它荧光化合物，如Cy3、Cy2、Cy5、Alexa

荧光标记家族(Molecular Probes，Inc.)、羧基荧光素(FAM)和异硫氰酸荧光素(FITC)。

在另一优选实施方式中，可检测试剂是蛋白质。术语“蛋白质”在本发明环境中指代由一个或多个氨基酸链组成的大分子。蛋白质基于其特异性结合其它分子的能力，负责执行多种细胞功能。蛋白质可结合其它蛋白质以及小底物分子。适于本发明目的的蛋白质的非限制性实例非限制地包括，酶、荧光蛋白、发光蛋白和抗原。

在还更优选的实施方式中，蛋白质是酶。术语“酶”在本发明环境中指代充当高选择性催化剂、促进其特异性代谢反应的速度和特异性的蛋白质。适于本发明的酶的非限制性实例非限制地包括，辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶。本领域技术人员将理解，适用于本发明的酶是间接可检测的，因为其能够催化修饰通过比色法、化学发光或荧光测定法可检测的化合物中的底物。适当底物的实例非限制地包括磷酸对硝基苯酯(PNPP)、2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸](ABTS)、o-苯二胺(OPD)、和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。

生物发光蛋白或光蛋白是能够无需在先激发而进行其特定辅基的化学反应导致发光的氧化酶的特例。生物发光蛋白的非限制性实例包括萤火虫荧光素酶、Renilla荧光素酶和水母发光蛋白。

在另一还更优选的实施方式中，蛋白质是荧光蛋白。术语“荧光蛋白”在本发明环境中指代具有在以激发适宜波长激发时发光的能力的蛋白质。可用于本发明复合物的荧光蛋白的非限制性实例非限制地包括，GFP、GFPuv、BFP、CFP、YFP、EBFP2、mCerulean、mCerulean3、mVenus、mTurquoise、T-Sapphire、citrine、amFP486、zFP506、zFP538、drFP、DsRed、mCherry、dTomate、mTFP1、TagRFP-T、mKO2、mRuby、mKate、mAmetrine、REACh、R-藻红蛋白(R-PE)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)。

在另一还更优选的实施方式中，蛋白质是发光蛋白。术语“发光蛋白”在本发明环境中指代能够在以激发适宜波长激发时发光的蛋白质。可用于本发明复合物的荧光蛋白的非限制性实例非限制地包括表1中包括的蛋白质以及其相应激发和发射波长。

在另一还更优选的实施方式中，蛋白质是抗原。术语“抗原”在本发明环境中指代诱导身体免疫响应的分子。因此，抗原可用于生成识别其并且特异性结合其的抗体。抗原的非限制性实例包括肿瘤抗原如癌胚抗原(CEA)、HER2、前列腺特异性抗原(PSA)和组织纤溶酶原激活剂和其重组变体如

以及细菌抗原、过敏原等及其它。本领域技术人员将理解，适用于本发明的抗原是间接可检测的，因为其能够被抗体特异性识别。

在另一优选实施方式中，可检测试剂是半抗原。术语“半抗原”在本发明环境中指代具有小分子尺寸(<10,000Da)，具有抗原性，但自身不能诱导特异性免疫反应的一类化学上的化合物。半抗原与大免疫原性蛋白(被称为载体)的化学偶联产生半抗原-免疫原性载体缀合物，其能够诱导特异性免疫反应。维生素的非限制性实例包括生物素(维生素B7)、地高辛、二硝基苯酚(DNP)和硝基碘苯酚(NIP)。在更优选的实施方式中，维生素是生物素。术语“生物素”在本发明环境中指代水溶性和醇溶性的热稳定维生素，也被称为维生素H和维生素B7，其特征在于以至今描述的最高亲和力Kd＝10^-15M特异性结合亲和素。本领域技术人员将理解，生物素是间接可检测的，因为它能够被亲和素或其变体如抗生蛋白链菌素和中性链亲和素(neutravidin)特异性地识别。

在另一具体实施方式中，功能性基团是药物。术语“药物”在本发明环境中指代用于治疗、治愈或预防疾病或病症(如以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理)的化学物质。术语“以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理”在本发明的医疗应用的上下文中得到描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。

本领域技术人员将立即知道具体哪些药剂被指示用于治疗疾病。几乎所有被指示用于治疗以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的药剂都可被包含在本发明的复合物中，尽管TLR-4拮抗剂和抗炎剂特别优选。虽然多种药物可用于本发明环境中，但在优选实施方式中，本发明考虑药物选自下列：非限制地包括，TLR-4拮抗剂，如纳洛酮(naloxone)、纳曲酮(naltrexone)、LPS、异丁地特(ibudilast)、丙戊茶碱(propentofylline)、阿米替林(amitriptyline)、酮替芬(ketotifen)、环苯扎林(cyclobenzaprine)、米安色林(mianserin)和丙咪嗪(imipramine)；抗血小板药物，如阿司匹林和氯吡格雷(clopidogrel)；抗凝结剂，如肝素、醋硝香豆素、华法林(warfarin)、达比加群(dabigatran)和利伐沙班(rivaroxaban)；和抗氧化剂，如依达拉奉(edaravone)。虽然在可检测试剂上下文中已t提及，但组织纤溶酶原激活剂及其重组变体可同样被考虑作为药物——因其溶栓作用。

本发明考虑药物是核酸。因此，在优选实施方式中，药物是核酸。在本发明复合物环境中适合作为药物的核酸包括具有沉默以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理所涉及的基因(非限制地包括NFKB1、RIPK3、IFNB1、LY96(MD-2)、IRF3、TLR3、TIRAP(Mal)、TICAM1(TRIF)、RIPK1、TRAF6、CD14、TRAM、IKBKG(IKK-γ)、IFNA1和TLR4基因)的表达的能力的反义RNA、反义DNA和小干扰RNA。术语“反义RNA”在本发明环境中指代单链RNA，其核苷酸序列与目标信使RNA互补，从而干扰相应基因的表达。术语“反义DNA”在本发明环境中指代单链DNA，其核苷酸序列与目标信使RNA互补，从而干扰或沉默相应基因的表达。术语“小干扰RNA”或“siRNA”在本发明环境中指代双链RNA，其长度为20至25个核苷酸，对其目标信使RNA的核苷酸序列具有高度特异性，从而干扰相应基因的表达。

本发明考虑药物是肽。因此，在优选实施方式中，药物是肽。术语“肽”在本发明环境中指代通过肽键结合的氨基酸短链。肽将包括至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、或至少70个氨基酸。适于本发明目的的是具有结合目标并且诱导或抑制细胞信号传导的能力的肽等。术语“目标结合肽”在本发明环境中指代包括目标结合区域的肽。术语“信号传导肽”在本发明环境中指代具有引起细胞信号传导的能力的肽，如细胞受体激动肽。适于目标分子结合的氨基酸序列包括本领域公知的分子识别共有序列。

在另一具体实施方式中，功能性基团是纳米颗粒。术语“纳米颗粒”在本发明环境中指代这样的胶体系统：球型、杆型、多面体型等、或类似形状，具有小于1微米(μm)的尺寸，被单独发现或被发现形成有组织的结构(二聚体、三聚体、四面体等)，分散在流体(水溶液)中。在具体实施方式中，适于本发明实践的纳米颗粒的尺寸小于1μm，通常被包括在1和999纳米(nm)之间，一般5和500nm之间，优选约10和150nm之间。在具体实施方式中，本发明的纳米颗粒一般具有2至50nm范围内的平均粒径，优选5至20nm，更优选13nm。平均粒径是最大平均颗粒尺寸，并且理解颗粒不一定是球形。所述纳米颗粒的形状可广泛变化；有利地，所述纳米颗粒将采用任何光学有效的形状，如球、杆、星、立方体、多面体或任何其它变型以及若干颗粒的复杂缔合；在具体实施方式中，用于本发明实践的纳米颗粒形状是球形或基本上球形。形状可适当地通过常规光或通过电子显微技术来评价。

适用于本发明的纳米颗粒包括聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒和金属纳米颗粒。

聚合物纳米颗粒通过聚合物基质附接至适配体而形成。可用于根据本发明的聚合物纳米颗粒的生物相容性聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚丙富马酸酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、或多胺、聚谷氨酸酯、葡聚糖、聚酐、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯或聚氰基丙烯酸酯、聚二

烷酮(PDO)、聚羟基烷酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(癸二酸甘油酯)、聚乙交酯、聚丙交酯、PLGA、聚己内酯或其组合。

可选地，本发明的纳米颗粒可以是脂质纳米颗粒，如脂质体或胶束。胶束和脂质体由例如囊泡形成脂质形成在本领域已知。囊泡形成脂质指代在其凝胶-液晶相变温度范围以上自发形成脂质双层的脂质。这种脂质一般具有允许自发双层形成的特定特征，如其疏水和亲水部分接近相同的横截面积允许封装成层状相。能够稳定并入脂质双层的脂质，如胆固醇及其各种类似物，可在双层形成过程中被并入脂质双层。囊泡形成脂质优选是具有两条烃链(一般是酰基链)和头部基团(极性或非极性)的脂质。存在多种合成囊泡形成脂质和天然存在的囊泡形成脂质，包括磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中两烃链的长度一般在约14-22个碳原子之间，并且是饱和的或具有不同的不饱和度。酰基链具有不同饱和度的上述脂质和磷脂可购得或按照公开的方法制得。其它适当的脂质包括磷脂、鞘脂、糖脂和甾醇，如胆固醇。

术语"脂质体"指代由一个或多个同心排列的脂质双层组成的封装水相的囊泡。水相一般包含将要递送至目标位点的化合物。在到达目标位点后，脂质体与目标细胞(即，表达TLR-4的细胞)的质膜融合，从而将化合物释放到胞质溶胶中。可选地，脂质体作为运输囊泡的内含物(例如，内体或吞噬体)被目标细胞内吞或以其他方式摄取。一旦在运输囊泡中，脂质体降解或与囊泡膜融合，并释放其内含物。多种技术人员已知的方法可用于制备脂质体，如声处理、挤出、高压/均质化、微流化、洗涤剂透析、小脂质体媒介的钙诱导融合和任一融合方法，其全部是本领域公知的。

聚合物和脂质纳米颗粒可另外还包括两亲性化合物包衣，其包围聚合物材料，形成颗粒壳或可使颗粒避免被免疫系统组分识别和增加颗粒循环半衰期的隐形材料。

可选地，本发明的纳米颗粒可以是金属纳米颗粒。术语“金属纳米颗粒”指代这样的纳米颗粒：包括金属并且显示被称为表面等离子现象的光学性质，即等离子金属。这种现象由下列组成：金属表面的电子集体振动，在所述电子中发生共振条件的波长下产生位于紫外-可见光谱(金属和纳米颗粒尺寸典型的)的吸收带。金属的表面等离子可通过现有技术已知的任何光谱技术来确定，如表面等离子体共振(SPR)光谱(其中金属原子经历电磁束)或表面等离子体共振荧光光谱(SPFS)(基于金属原子在经历光子束时的折射率变化的检测)。如本文限定，“等离子金属”是如下特征的金属：显示被称为表面等离子现象的光学性质。等离子响应的变化在若干纳米颗粒彼此靠近定位时尤其显著——因为这导致其各自的近场偶联，生成新的表面等离子。在优选实施方式中，所述金属选自金、银、铜、铝、铂、铁、钴、钯和其组合。

金属纳米颗粒的优选实施方式是核-壳纳米颗粒，其包含金属核和多孔壳。核-壳金属纳米颗粒的实例包括本领域公知的磁性介孔二氧化硅纳米颗粒。因此，在特别优选的实施方式中，纳米颗粒是磁性介孔二氧化硅纳米颗粒。

纳米颗粒可通过在其表面上添加包衣而被功能化。对于生物应用，表面包衣应具有极性，以提供高水溶性和防止纳米颗粒聚集。在血清中或在细胞表面上，高电荷包衣促进非特异性结合，而连接至末端羟基或甲氧基的聚乙二醇抵制非特异性相互作用。

适配体可理想地通过共价连接而连接至纳米颗粒，优选连接在纳米颗粒表面上。优选地，每个纳米颗粒的适配体应以受控数量存在。

用于生成本发明复合物的本发明适配体和功能性基团之间的结合可通过本领域技术人员公知的缀合技术进行。结果是本发明的适配体和功能性基团之间的共价键。缀合可涉及在适配体化学合成过程中本发明适配体的3’或5’端伯胺与功能性基团结合。可选地，缀合可通过常规交联反应进行，其优点是伯烷基-胺标记的化学反应性相对于核苷酸自身的芳基胺要大得多。缀合方法在本领域公知，并且基于交联试剂的使用。交联试剂包含靶向待缀合分子中诸如伯胺、巯基、醛、羧基、羟基、叠氮等的基团的至少两个反应性基团。交联剂的区别在于其化学特异性、间隔臂长度、间隔臂组成、裂解间隔臂、和结构。例如，根据本发明的复合物的缀合可直接进行，或通过连接部分，通过适配体中的一种或多种非功能性基团和/或功能性基团如胺基、羧基、苯基、硫醇或羟基进行。可通过异双功能连接体的使用来实现选择性更高的键。可以利用常规连接体，如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二酰亚胺、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛及类似物、或肼和酰肼，如4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼(MPBH)。

另一方法由下列组成：在合成过程中通过PCR利用例如荧光团标记的引物标记适配体。为此，有多种商品成品可供本领域技术人员使用。

另外，在其中功能性基团是放射性核素的具体实施方式中，根据本发明的适配体与放射性核素之间的结合可通过化学配位进行，其中结合涉及的适配体原子供电子给放射性核素。配位反应在本领域公知，并且取决于放射性核素和适配体中涉及的反应性基团。

本发明的体外应用

A.检测TLR-4的体外应用

本发明还考虑具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体以及包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物用于检测TLR-4的体外应用。

因此，另一方面，本发明涉及具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体用于检测TLR-4的体外应用。

因此，根据本发明的适配体特异性结合TLR-4的能力可用于通过根据本发明的适配体间接检测TLR-4。为此，本领域技术人员将理解，需要随后检测所述适配体。适配体检测技术在本领域公知，并且包括，例如，适配体特异性抗体或探针的使用。因此，在根据本发明的适配体结合TLR-4后，可应用适配体特异性抗体或探针，其进而可被可检测试剂标记、或可通过二级抗体或探针间接检测。用于检测TLR-4的技术则将取决于可检测试剂的类型，可以是基于例如荧光测定法，比色法或放射性的技术。

术语“探针”或“杂交探针”在本发明环境中指代不同长度的DNA或RNA片段，通常长度在10和1000个碱基之间，用于检测与探针中的序列互补的单链核酸(DNA或RNA)的存在。探针与目标单链核酸杂交，其碱基序列允许探针和目标核酸之间的互补性导致的碱基配对。为检测探针与其目标序列的杂交，探针用可检测试剂如放射性核素、荧光团或地高辛等标记。

利用本发明适配体的TLR-4检测可通过体外结合试验进行，如酶联寡核苷酸试验(ELONA)、酶联适配体吸附剂试验(ELASA)、沉淀和定量PCR(qPCR)、凝胶迁移率变动试验、蛋白质印迹、表面等离子体共振(SPR)、动力学毛细管电泳、荧光结合试验、适配体组织化学、适配体细胞化学、荧光显微术或流式细胞术。

在本发明的体外应用的另一具体实施方式中，TLR-4检测通过选自ELONA、适配体细胞化学、适配体组织化学和流式细胞术的方法进行。

术语“ELONA”或“酶联寡核苷酸试验”在本发明环境中指代类似于酶联免疫吸附剂试验(ELISA)的技术，其中用于检测目的分子(在本例中，TLR-4)的抗体换成所述分子的特异性检测适配体。ELISA试验基于带标记(例如，用酶标记)抗原或抗体的使用，从而目标抗原和带标记抗体之间形成的复合物是酶活性复合物。由于其中一种组分(在本例中，抗原)固定在载体中，抗原：抗体复合物被固定于载体，并且因此可通过添加酶特异性底物来检测。在ELONA的情况下，检测适配体可共价结合于酶，或其本身可通过与酶缀合的适配体的特异性二级抗体来检测。所述酶催化特异性底物转化，以产生可视信号。这种技术可改为将酶换成另一可检测试剂，如荧光团。术语ELONA和ELASA或酶联适配体吸附剂试验在本文中可互换使用。在优选实施方式中，TLR-4检测通过ELONA进行。

以类似方式，术语“适配体细胞化学”和“适配体组织化学”在本发明环境中分别指代类似于用于检测细胞和组织学切片上的TLR-4的免疫细胞化学和免疫组织化学的技术，其中用于检测目的分子的抗体(在本例中，TLR-4)换成所述分子的特异性适配体。检测适配体可共价结合于酶，或其本身可通过与酶缀合的适配体的特异性二级抗体来检测。所述酶催化特异性底物转化，以产生可视信号。这种技术可改为将酶换成另一可检测试剂，如荧光团。在优选实施方式中，TLR-4检测通过适配体细胞化学进行。在另一优选实施方式中，TLR-4检测通过适配体组织化学进行。

可选地，本领域技术人员将理解，这些技术(ELONA、适配体细胞化学、适配体组织化学)可适合将检测抗体换成适配体的特异性探针。

术语“流式细胞术”在本发明环境中指代细胞分析技术，涉及测量细胞在穿过光射线时具有的荧光和光分散特征。除光分散外，如果在分析前细胞被置于存在经荧光分子标记的适配体的情况，则还可以评价哪些细胞具有与所用适配体互补的抗原。荧光检测通过流式细胞荧光计(被称为“细胞计”或“FACS”(荧光激活细胞分类器))进行。这种技术，同前述技术，最初研发用于荧光标记抗体，但可容易适用于本发明的适配体。

本领域技术人员将理解，包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和可检测试剂的复合物特别有利于检测TLR-4，因为所述可检测试剂在其结合于TLR-4时能够检测复合物包括的适配体。用于检测TLR-4的技术将取决于可检测试剂的类型，可以是基于例如荧光测定法、比色法或放射性的技术。

因此，另一方面，本发明涉及用于检测TLR-4的、包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物。

在具体实施方式中，该功能性基团是可检测试剂。

在本发明的体外应用的另一具体实施方式中，TLR-4检测通过选自ELONA、适配体细胞化学、适配体组织化学和流式细胞术的方法进行。

术语“适配体”、“TLR-4”、“功能等同变体”、“复合物”、“功能性基团”、“可检测试剂”、“ELONA”、“适配体细胞化学”、“适配体组织化学”和“流式细胞术”在上文已被详细描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。

由于ELISA、免疫细胞化学、免疫组织化学和流式细胞术技术在本领域公知，本领域技术人员可做出将抗体换成根据本发明的适配体或复合物所需的改动，而无需进行过多实验。

B.抑制TLR-4的体外应用

如上所述，具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体可抑制TLR-4的活性，降低因其激活而释放的促炎性细胞因子水平。本发明还考虑具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体、和包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团复合物用于抑制TLR-4的体外应用。

因此，另一方面，本发明涉及具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体用于抑制TLR-4的体外应用。

另一方面，本发明涉及包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物用于抑制TLR-4的体外应用。

本发明的体外方法

A.体外TLR-4检测方法

另一方面，本发明涉及体外检测样本中的TLR-4方法，下称“本发明的第一体外 TLR-4检测方法”，包括

i)使所述样本与具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体接触，

ii)分离未结合TLR-4的适配体，和

iii)检测与样本中存在的TLR-4结合的适配体的存在。

第一步，本发明的第一体外检测方法包括使所述样本与具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体接触。

术语“适配体”、“TLR-4”和“功能等同变体”在上文已被详细描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。

术语“样本”或“生物样本”在本发明环境中指代细胞培养物或从对象分离的生物材料。生物样本可包含适于检测期望的生物标记物的任何生物材料，并且可包括来自对象的细胞和/或非细胞材料。样本可从任何适当的组织或生物学流体分离，如，例如，血液、血浆、血清、尿液、脑脊髓流体(CSF)、心脏、脑。用于TLR-4检测的样本优选是生物学流体。

可选地，样本是生物流体样本。术语“生物学流体”和“生物流体”在本文中可互换使用，并且指代生物源含水流体。生物流体可随处获得(如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、脑脊髓流体、玻璃体或房水、或任何身体分泌物)，可以是渗出物(如从脓肿或任何其它感染或发炎位置获得的流体)、或从关节(如正常关节或疾病如类风湿关节炎感染关节)获得的流体。用于TLR-4检测的生物流体优选是血液、血浆、血清或脑脊髓流体样本。

根据本发明的适配体被施用于处于适于使适配体与样本中可存在的TLR-4分子结合的缓冲液中的样本上。适于使本发明的适配体与TLR-4结合的缓冲液的非限制性实例包括PBS、TBS、磷酸缓冲液和柠檬酸缓冲液。优选地，这些缓冲液包含1mM MgCl₂。检测样本中存在的TLR-4分子所需的适配体量将取决于样本大小和其中存在的TLR-4量，并且其可容易通过本领域常用的优化方法确定。作为示例，适配体浓度为至少1fM、至少10fM、至少100fM、至少1pM、至少10pM、至少100pM、至少1nM、至少10nM、至少100nM、至少1μM、至少10μM、至少100μM或更多。优选地，适配体浓度在100fM和1μM之间，更优选在1pM和100nM之间，还更优选在100pM和1nM之间。

将适配体与样本一起在适当的温度和足以使适配体与样本中可存在的TLR-4分子结合的时间温育。温度在优选在20℃和37℃之间。作为示例，适配体与样本一起温育至少5min、至少10min、至少15min、至少20min、至少30min、至少60min、至少120min或更多。

在适配体与样本中可存在的TLR-4分子结合后，第二步，洗涤样本以去除未结合TLR-4的适配体分子。

第三步，检测与样本中存在的TLR-4结合的适配体的存在。由于本发明的适配体本身不是可检测分子，检测步骤是通过特异性结合适配体的第二可检测分子而间接检测的步骤。与TLR-4结合的适配体的检测可利用实际上任何已知的以高亲和性与本发明的适配体结合的抗体或试剂进行。然而，优选使用适配体特异性抗体，例如，多克隆血清、杂交瘤上清液、单克隆或人源化抗体和其片段。所述适配体特异性抗体用可检测试剂适当地标记。术语“可检测试剂”在上文已被详细描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。所述试剂可利用本领域技术人员已知的适于试剂类型和样本类型的设备通过荧光测定法或比色法检测。作为举例，将其中适配体与存在的TLR-4分子结合的样本与与酶缀合的适配体特异性的抗体一起在类似于适配体温育条件的条件下温育，并通过添加通过酶转化成可检测产物的底物，例如，通过荧光显微镜的荧光测定法或通过分光光度计的比色法，检测TLR-4-适配体-抗体复合物。可选地，检测可通过使用经可检测试剂适当标记的适配体特异性探针以类似方式进行。

本领域技术人员将理解，本发明的第一体外方法可作为诸如ELONA、ELASA、沉淀和qPCR、凝胶迁移率变动试验、蛋白质印迹、表面等离子体共振、动力学毛细管电泳、荧光结合试验、适配体组织化学、适配体细胞化学、荧光显微术或流式细胞术的检测技术的一部分进行。

可选地，根据本发明的适配体可与功能性基团(根据本发明的复合物的一部分)结合。因此，另一方面，本发明涉及检测样本中的TLR-4的体外方法，下称“本发明的第二体外 TLR-4检测方法”，包括

i)使所述样本与包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物接触，

ii)分离未结合TLR-4的适配体或复合物，和

iii)检测与样本中存在的TLR-4结合的复合物的存在。

术语“适配体”、“TLR-4”、“功能等同变体”、和“样本”在上文已被具体描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。同样，本发明的第一体外检测方法的第一步和第二步的特征也适用于本发明的第二体外检测方法，并且也通过引用而包括。

本发明的第二体外检测方法的第三步包括检测与样本中存在的TLR-4结合的本发明复合物的存在。根据本发明的复合物的检测可利用实际上任何已知的以高亲和性与本发明的适配体或功能性基团结合的抗体或试剂进行。本发明适配体的检测在本发明的第一体外检测方法的上下文中已被详细描述。同样，关于功能性基团，检测也可利用实际上任何已知的以高亲和性与所述功能性基团结合的抗体或试剂进行。为此，功能性基团是可检测试剂尤其适合于本发明的第二体外检测方法。

在具体实施方式中，功能性基团是选自放射性核素、荧光团、蛋白质和半抗原的可检测试剂。

术语“放射性核素”、“荧光团”、“可检测蛋白质”和“半抗原”在上文已被具体描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。

本领域技术人员将理解，本发明考虑的可检测试剂可在下列之间划分：自身直接可检测的试剂，如放射性核素或荧光团；和间接可检测的试剂，如蛋白质或半抗原。

在优选实施方式中，可检测试剂是放射性核素，并且检测通过检测放射性核素发出的辐射来进行。所述辐射将取决于放射性核素的类型，可以是α粒子发射，β粒子发射或γ型发射。为此目的，适于不同放射性核素的检测技术是公知的。作为举例，¹²³I发出的发射可通过γ相机来检测。

在另一优选实施方式中，可检测试剂是荧光团，并且检测通过检测荧光团发射的荧光进行。荧光团的利用需要其在先经其激发光谱内的波长激发，导致不同波长的发射。本发明考虑的荧光团的激发和发射波长是现有技术的一部分。发射的荧光可例如通过荧光测定法技术——通过利用荧光分光光度计或荧光显微镜——检测。

在另一优选实施方式中，可检测试剂是蛋白质。所述蛋白质可根据所用蛋白质类型被检测出来。例如：

-酶需要添加其特异性底物，该底物通过比色法、化学发光或荧光测定法可检测；

-荧光蛋白，如同荧光团，需要在适于通过荧光测定法检测的波长(例如，表1包括的波长)下激发；

-抗原或半抗原需要特异性识别其的抗体或另一分子。为进行检测，抗原/半抗原特异性的所述抗体或分子必须被标记(例如，用酶标记)，并且检测将取决于标记类型。

本领域技术人员将理解，本发明的第二体外方法可作为诸如ELONA、ELASA、沉淀和qPCR、凝胶迁移率变动试验、蛋白质印迹、表面等离子体共振、动力学毛细管电泳、荧光结合试验、适配体组织化学、适配体细胞化学、荧光显微术或流式细胞术的检测技术的一部分进行。

在具体实施方式中，TLR-4检测通过荧光法进行。

B.体外TLR-4抑制方法

另一方面，本发明涉及抑制样本中的TLR-4的体外方法，下称“本发明的第一体外 TLR-4抑制方法”，包括使包括TLR-4的样本与具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体在适于抑制TLR-4的条件下接触。

术语“适配体”、“TLR-4”、“功能等同变体”、“TLR-4抑制”和“样本”在上文已被具体描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。

在具体实施方式中，样本的TLR-4被包括在活细胞中。

本发明的第一体外TLR-4抑制方法包括使包括TLR-4的样本与根据本发明的适配体在适于抑制TLR-4的条件下接触。为此，本发明的适配体被施用于样本上，并且其必须结合TLR-4。

术语“适于抑制TLR-4的条件”在本发明环境中指代允许本发明的适配体与TLR-4结合然后对其抑制的温育条件。这些条件包括使本发明适配体施用于样本上的缓冲液的组成、适配体量、温育时间和温育温度。适于允许本发明适配体与TLR-4结合和对其抑制的缓冲液的非限制性实例包括PBS、TBS、磷酸缓冲液和柠檬酸缓冲液。优选地，这些缓冲液包含1mM MgCl₂。检测样本中存在的TLR-4分子所需的适配体量将取决于样本大小和其中存在的TLR-4量，并且其可容易通过本领域常用的优化方法确定。作为示例，适配体浓度为至少1fM、至少10fM、至少100fM、至少1pM、至少10pM、至少100pM、至少1nM、至少10nM、至少100nM、至少1μM、至少10μM、至少100μM或更多。优选地，适配体浓度在100fM和1μM之间，更优选在1pM和100nM之间，还更优选在100pM和1nM之间。

将适配体与样本一起在适当的温度和足以允许适配体与样本中可存在的TLR-4分子结合的时间温育。温度优选在20℃和37℃之间，更优选37℃。作为示例，适配体将与样本一起温育至少5min、至少10min、至少15min、至少20min、至少30min、至少60min、至少120min或更多。

另一方面，本发明涉及抑制样本中的TLR-4的体外方法，下称“本发明的第二体外 TLR-4抑制方法”，包括使包括TLR-4的样本与包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物在适于抑制TLR-4的条件下接触。

术语“适配体”、“TLR-4”、“功能等同变体”、“TLR-4抑制”、“样本”和“适于抑制TLR-4的条件”在上文已被具体描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。

本发明的医疗应用

本发明的作者已经证明本发明的适配体能够阻断或抑制在实验所用动物中诱发的中风模型中产生的梗塞的体积，如实施例4中描述。因此，本发明适配体特异性结合并抑制TLR-4的能力致使其在治疗角度来看是有用的。通过本发明的适配体实现的治疗效果显然可以与具有治疗活性的功能性基团形成补充，如在本发明的复合物的上下文中描述。因此，本发明考虑本发明的适配体和本发明的复合物的医疗应用。

A.本发明的适配体的医疗应用

另一方面，本发明涉及用于医药的具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体。

另一方面，本发明涉及具有用于制备治疗以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的药物的特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体。

可选地，其可表现为具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体用于治疗以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的应用。

可选地，其可表现为治疗对象的以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的体内方法，包括给予所述对象治疗有效量的具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体。

根据本发明，具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体特异性结合目标细胞表面上的TLR-4。当本发明的适配体与TLR-4接触时，它抑制其活性，导致促炎性细胞因子如IL-1、IL-8、TNF-α和IL-12释放减少或中断。

术语“适配体”关于定义已被详细描述，并且TLR-4特异性适配体(上文)及其定义和特性在本发明复合物的环境中同样适用。

术语“治疗”或“疗法”在本发明环境中指代试图预防、治愈、延迟、降低以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的严重程度、或改善其一种或多种症状、或为延长患者生命超过不进行这种治疗时的预期而实施的临床干预。

术语“目标细胞”在本发明环境中指代表达TLR-4的具体细胞，包括特别是髓样谱系细胞，如单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、粒细胞和未成熟树突状细胞，以及其它谱系细胞，如神经元等。在具体实施方式中，目标细胞是单核细胞或巨噬细胞。在另一具体实施方式中，目标细胞是小胶质细胞。在另一具体实施方式中，目标细胞是粒细胞。在另一具体实施方式中，目标细胞是未成熟树突状细胞。在另一具体实施方式中，目标细胞是神经元。

在具体实施方式中，目标细胞是哺乳动物细胞。在另一优选实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。

术语“对象”或“个体”指代哺乳动物物种的成员，包括但不限于，家养动物和灵长类，包括人；对象优选是任何年龄或种族的男人或女人。

术语“治疗有效量”在本发明环境中指代实现预防、治愈、延迟、降低以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的严重程度、或改善其一种或多种可观察症状所需的本发明适配体量。

术语“以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理”在本发明环境中指代表达TLR-4的细胞显示TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加的病理、和/或相对于正常或参考生理条件或参考值TLR-4表达细胞量增加并且无论TLR-4是否引起该疾病直接或间接涉及所述细胞的病理。由于TLR-4的激活产生信号传导级联，导致炎性细胞因子如IL-1、IL-8、TNF-α和IL-12释放，造成炎症和细胞损伤，以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理可另外表征为具有炎性组分。

在具体实施方式中，所述以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理选自中风、急性心肌梗塞、脓毒症、动脉粥样硬化、多发性硬化、类风湿关节炎、视网膜变性疾病、和药物成瘾等。

在优选实施方式中，所述以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理是中风。术语“中风”或“脑血管疾病”或“脑梗塞”或“卒中”在本发明环境中指代特征如下的病理：以异常突然的方式(缺血性中风)或因脑血管破裂造成出血(出血性中风)，脑血流大量减少导致神经系统缺损。在缺血性中风中，由于血流因任何灌注脑质的动脉阻塞而突然和立即中断，丧失血液灌注，产生梗塞区表观。动脉阻塞通常是因为动脉粥样硬化或来自其它位置(基本上是心脏或其它动脉)的栓子(脑栓塞)。在出血性中风中，发生脑血管破裂，丧失了脑中依赖于该动脉的血液的区域。另外，流出的血液压迫脑结构——包括其它血管，增加脑内出血继发缺血的影响区域。

在优选实施方式中，所述以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理是急性心肌梗塞。术语“急性心肌梗塞”或“梗塞”或“心脏病发作”在本发明环境中指代如下特征的病理：其中一个冠状动脉阻塞造成心脏区域血液供应不足，带有组织损伤。这种阻塞导致的缺血或缺氧供应造成心绞痛，如果重新插管足够快，其不导致心脏组织死亡，但如果这种缺氧保持，心肌会受损，并且最终发生坏死，即梗塞。

在优选实施方式中，所述以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理是脓毒症。术语“脓毒症”或“败血症”在本发明环境中指代由总体上严重的感染引起的全身性炎性响应综合征(SIRS)。生物体的这种反应响应病原性微生物在生物体任何组织或流体中的存在而发生，和由其免疫系统的作用(释放促炎性物质，引起SIRS)造成。其通过下列标准中至少两个存在来表征：发热、过热、呼吸急促、心动过速和白细胞增多。

在优选实施方式中，所述以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理是动脉粥样硬化。术语“动脉粥样硬化”在本发明环境中指代以如下特征的综合征或病理：脂质物质在中等和厚尺寸动脉的壁中沉积和浸润。动脉壁细胞将这种沉积解释为侵入，并激活免疫系统的循环单核细胞，该循环单核细胞穿透动脉壁，转化成巨噬细胞，并开始吞噬LDL颗粒，产生发炎过程。发炎进而导致壁平滑肌细胞增殖和迁移，逐渐导致动脉直径变窄。特异性增厚被称为动脉粥样化斑块。其是动脉硬化的最常见形式。根据所涉器官的动脉，形成动脉粥样硬化综合征并且特征在于涉及动脉(通过动脉粥样化斑块)和因此血流阻塞或缺血的疾病是：

-缺血性心脏疾病，其最大的代表是急性心肌梗塞，在心脏中。

-脑血管疾病，中风或脑血栓或脑出血的形式，在中枢神经系统中。

-间歇性跛行，其最严重程度是下肢急性动脉缺血。

-勃起功能障碍：这是40岁以上人群性无能的主要原因。

-缺血性结肠炎，是在肠动脉中流向结肠(大肠)的血流被干扰导致的发炎(刺激和溶胀)区域。

-主动脉瘤，其最严重程度是主动脉壁夹层形成。

在优选实施方式中，所述以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理是多发性硬化。术语“多发性硬化”在本发明环境中指代如下特征的病理：中枢神经系统的脱髓鞘、神经变性和慢性损伤发作。其原因现在未知，尽管已证明涉及各种自身免疫机制。在多发性硬化患者中，在发生巨噬细胞和神经胶质细胞协助的炎性过程时，淋巴细胞跨越血-脑屏障以影响髓鞘。

在优选实施方式中，所述以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理是类风湿关节炎。术语“类风湿关节炎”在本发明环境中指代如下特征的全身性自身免疫炎性病理：引起关节的持续性滑膜炎，导致其进行性破坏，产生不同程度的畸形和功能障碍。该过程始于体液和细胞因子(具体地CD4T-细胞)的介入，生成炎症介导分子，吸引和激活外周血液细胞，导致滑膜细胞增殖和激活，侵入和破坏关节软骨、软骨下骨、腱和韧带。

在优选实施方式中，所述以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理是视网膜变性疾病。术语“视网膜变性疾病”在本发明环境中指代如下特征的疾病或障碍：视网膜变性，其可以是视网膜发炎的结果。TLR-4介导的小胶质细胞激活已显示促进视网膜发炎过程。主要视网膜变性疾病包括：

-年龄相关性黄斑变性(AMD)，因视网膜损伤导致视野中心视力丧失(斑点)。其以"干燥"和"湿润"形式发生：在干燥(非渗出性)形式下，细胞碎片，被称为脉网膜小疣，在视网膜和脉络膜之间累积，导致视网膜萎缩和瘢痕形成；在湿润(渗出性)形式(其更为严重)下，血管在视网膜后方从脉络膜生长，其可泄露渗出物和流体，并且还造成出血。

-斯塔加特病(Stargardt disease)或眼底黄斑，是遗传形式的少年黄斑变性，导致进行性视力损失，通常直到法定盲(legal blindness)。症状发作通常在6和13岁之间(平均约16–18岁)出现。症状一般进展到20岁，包括波浪视觉、盲点、模糊、色觉削弱、和昏暗照明适应困难。

-色素性视网膜炎(RP)，是遗传变性眼病，因视网膜中杆型感光体细胞的进行性变性导致严重视力削弱。RP早期阶段患者最初因杆型感光体减少而发现外周和暗光视力减弱。进行性杆变性然后是邻近视网膜色素上皮异常和锥型感光体细胞恶化。随着外周视力逐渐减弱，患者经历进行性"隧道视觉"和最终失明。

-其它遗传性疾病，如无脉络膜，利伯氏(Leber)先天性黑矇、少年视网膜层分裂、乌斯赫尔氏病(Usher disease)和巴-比二氏综合征(Bardet Biedl)。

在特别优选的实施方式中，视网膜变性疾病选自AMD、斯塔加特病、RP、无脉络膜、利伯氏先天性黑矇、少年视网膜层分裂、乌斯赫尔氏病和巴-比二氏综合征。在更优选的实施方式中，视网膜变性疾病是AMD。在另一更优选实施方式中，视网膜变性疾病是斯塔加特病。在另一更优选实施方式中，视网膜变性疾病是RP。在另一更优选实施方式中，视网膜变性疾病是无脉络膜。在另一更优选实施方式中，视网膜变性疾病是利伯氏先天性黑矇。在另一更优选实施方式中，视网膜变性疾病是乌斯赫尔氏病。在另一更优选实施方式中，视网膜变性疾病是巴-比二氏综合征。

在优选实施方式中，所述以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理是药物成瘾。术语“药物成瘾”或“药物依赖”在本发明环境中指代频繁使用被称为药物的成瘾物质导致的障碍或病理。根据ICD-10(世界卫生组织(World Health Organization)，2005)，为如此诊断，药物依赖必须表现出下列涉及躯体依赖和心理依赖相关方面的标准中的三个或更多个，在12个月周期中：

-强烈渴望服用该物质，

-难以控制所述服用，

-在中断或减少服用时有戒断综合征，

-耐药性，

-逐渐放弃该物质服用以外的其它意愿，

-在与获得该物质相关的活动中投入的时间或从其效果恢复的时间增加，

-尽管清楚知道其有害效果，仍坚持服用该物质。

为给予对象具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体，将所述适配体配制成适当的药物组合物。所述药物组合物的详细内容在下文讨论。

B.本发明复合物的医疗应用

根据本发明的复合物——根据本发明，包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团——可包括适于治疗以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的药物作为功能性基团。(i)抑制TLR-4活性和(ii)以特异性方式将药物导向其作用位点的双重目的因此得以实现。

因此，另一方面，本发明涉及用于医药的包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物。

另一方面，本发明涉及用于制备治疗以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的药物的包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物。

可选地，其可表现为包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物用于治疗以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的应用。

可选地，其可表现为治疗对象的以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理的方法，包括给予所述对象治疗有效量的包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物。

根据本发明，包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和药物的复合物特异性结合目标细胞表面中的TLR-4。当本发明的适配体与TLR-4接触时，它抑制其活性，导致促炎性细胞因子如IL-1、IL-8、TNF-α和IL-12释放减少或中断，并且药物对细胞或对所述细胞所处环境发挥其功能。

术语“适配体”、“TLR-4”、“功能等同变体”、“复合物”、“功能性基团”、“药物”、“治疗”、“治疗有效量”、“对象”、“目标细胞”和“以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理”在上文已被具体描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。

可在与具有特异性结合并抑制TLR-4的能力的核酸适配体一起形成的复合物中用作功能性基团的适当药物非限制地包括，TLR-4拮抗剂，如纳洛酮、纳曲酮、LPS、异丁地特、丙戊茶碱、阿米替林、酮替芬、环苯扎林、米安色林和丙咪嗪；抗血小板药物，如阿司匹林和氯吡格雷；抗凝结剂，如肝素、醋硝香豆素、华法林、达比加群和利伐沙班；和抗氧化剂，如依达拉奉；组织纤溶酶原激活剂和其重组变体；具有沉默以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理所涉基因的表达的能力的核酸，如反义RNA、反义DNA和小干扰RNA；肽，如信号传导肽和目标结合肽。

药物组合物

为给予有需要的对象具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体、或包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物，可将所述适配体和复合物配制成适当的药物组合物。

另一方面，本发明涉及药物组合物，下称“本发明的第一药物组合物”，其包括至少一种具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体。

在具体实施方式中，本发明的第一药物组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、或溶剂。

另一方面，本发明涉及药物组合物，下称“本发明的第二药物组合物”，其包括至少一种包括具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体和功能性基团的复合物。

在具体实施方式中，本发明的第二药物组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、或溶剂。

本发明提供的药物组合物可被给予对象以治疗以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理。

术语“适配体”、“TLR-4”、“功能等同变体”、“复合物”、“功能性基团”、“药物”、“治疗”、“对象”和“以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的病理”在上文已被具体描述，并且在此通过引用而包括其定义和特性。

术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的溶剂”在本发明环境中意图包括与药物给予相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、吸收延迟剂和等渗剂、及类似物。这种载体和媒介在药物活性物质中的使用在本领域公知。除非任何常规载体与活性化合物不相容，否则考虑将其用在本发明组合物中。可接受的媒介、赋形剂、或可接受的稳定剂在所用剂量和浓度下对于对象无毒，并且包括缓冲液，如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲铵、苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇、和间甲酚)；低分子量多肽(小于约10个氨基酸)；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成型反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

补充活性化合物也可并入本发明提供的药物组合物中。因此，在具体实施方式中，本发明提供的药物组合物还可包含具体讨论中的适应症所需的多于一种活性化合物，优选具有补充活性的互无不利影响的那些。例如，可期望另外再提供化疗剂、细胞因子、镇痛剂、抗炎剂或免疫抑制剂。所述其它活性剂的有效量取决于药物组合物中存在的适配体或复合物的治疗量、待治疗病理的属性和严重程度、对象等。

在一个实施方式中，具有特异性结合并抑制TLR-4的能力并且包括选自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的序列的核酸适配体或其功能等同变体、或本发明的复合物与保护所述产品避免从身体快速清除的媒介配制在一起，如受控释放制剂，包括植入物和微胶囊递送系统。可使用生物降解性和生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。这种制剂的制备方法对于本领域技术人员显而易见。这些可按照本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利4,522,811所述。

本发明提供的药物组合物可通过任何适当的给药途径被给予对象，如，例如，通过胃肠外途径。

术语“胃肠外”在本发明环境中包括静脉内、腹膜内、肌内、或皮下给予。总体上优选胃肠外给予的静脉内形式。

此外，本发明提供的药物组合物可适当地通过脉冲输注来给予，例如，其中本发明的适配体或复合物的剂量逐渐减少。优选地，剂量通过注射来提供，更优选静脉内或皮下注射——部分取决于短暂还是长期给予。

在另一具体实施方式中，本发明提供的药物组合物可适用于胃肠外给予——其中在适当剂型中添加无菌溶液、悬浮液或冻干产物。适于注射性应用的药物组合物包括用于制备无菌可注射溶液或分散液的无菌水溶液或分散液或无菌粉末。为静脉内给予，适当的媒介包括生理盐水溶液，抑菌水CremophorEM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌并且流动的，以促进注射性。其在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须是防腐的，对抗微生物如细菌和真菌的污染作用。媒介可以是包含例如水、乙醇、药学上可接受的多元醇如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇和其适当混合物的溶剂或分散介质。可保持适当的流动性——例如通过利用包衣如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需颗粒尺寸和通过利用表面活性剂。微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞、及类似物。在多种情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、和氯化钠。组合物中包括吸收延迟剂，例如单硬脂酸铝和/或明胶，可导致可注射组合物的吸收延长。

可注射无菌溶液可通过如下制备：在适当的溶剂中掺入所需量的活性化合物(例如，本发明的适配体或复合物)和(按需)一种前文所列成分或前文所列成分的组合，然后过滤灭菌。总体上，分散液通过如下制备：在包含基础分散介质和前文所列那些其中的其它所需成分的无菌媒介中掺入活性化合物。在用于制备可注射无菌溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从此前过滤的其无菌溶液生成活性成分和任何其它期望成分的粉末。

在具体实施方式中，所述药物组合物通过静脉内途径给予。可使用适当的赋形剂，如填充剂、缓冲剂或表面活性剂。所述制剂将利用标准方法来制备，如西班牙和美国药典和类似参考书描述或考虑的那些。

以剂量单位形式配制药物组合物，即胃肠外组合物，以促进剂量给予和均匀性，是特别有利的。剂量单位形式，如本文所用，指代对于待治疗对象适合作为单位剂量的物理离散单位，每个单位包含预定量的活性化合物(本发明的适配体或复合物)，该预定量经计算联合所需药物媒介产生期望的治疗效果。本发明单位剂型的规格受制于和直接取决于活性化合物的独有特征和所要实现的具体治疗效果以及用于治疗对象的这种活性化合物的组成技术的固有限制。

活性化合物(本发明的适配体或复合物)一般被给予一天一次或多次，例如一天1、2、3或4次，并且一般总日剂量在0.0001至1.000mg/kg体重/天区间内，优选约0.001至约100mg/kg体重/天，更优选约0.01至10mg/kg体重/天。药物组合物可被配制以包含期望量如治疗有效量的本发明适配体或复合物。

本发明提供的药物组合物可与给药说明书一起被收纳在容器、包装、或分配器中。

本发明的成像方法

另一方面，本发明涉及根据本发明的复合物用于表达TLR4的细胞、组织或器官的体内成像的应用，其中所述复合物包括一种或多种根据本发明的适配体和功能性基团，所述功能性基团是可检测部分。

适用于根据本发明的体内成像方法的的可检测部分在如上本发明复合物的上下文中已被描述，并且非限制地包括放射性核素、荧光团、对比介质、蛋白质和半抗原。

***

下文通过下列实施例描述本发明，其仅仅是示例，绝不意为限制本发明的范围。

实施例

材料和方法

适配体文库

发明人利用IBA GmbH(Goettingen，德国)提供的RND40适配体文库进行TLR-4特异性适配体的筛选。原始RND40文库理论上由10²⁴种单链DNA(ssDNA)寡核苷酸构成，该寡核苷酸具有固定的末端序列——该固定的末端序列由18个核苷酸组成，在此各自杂交各自的引物以进行其PCR扩增，和中心区域——由具有随机序列的40个碱基组成。在进行筛选时，从此文库选用了10¹³种寡核苷酸。

6HIS-重组hTLR-4

通过在杆状病毒(baculovirus)中表达，重组生成人TLR-4蛋白胞外结构域对应的蛋白质——氨基酸24-631，其在C末端融合至6-组氨酸标签。

细胞

从Invivogen(San Diego，California，USA)获得HEK293T和HEK293T/TLR-4细胞。

利用HEK-293T-TLR4/HEK-293T细胞筛选

关于每轮筛选，在筛选试验24h前将8-10x 10⁵个HEK-293T细胞一式三份接种于P6板孔中，并在37℃，5％CO₂下温育。然后添加100μl PBS中1nmol来自RND40文库(或来自前一轮筛选分离的群体)适配体，该适配体此前在95℃下变性10min然后在4℃下温育10min；添加300μl补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和25μg/ml两性霉素的DMEM培养基(Dulbecco的改性Eagle培养基)，并施用于细胞上。在37℃，5％CO₂下温育1h后，去除带有未结合适配体的培养基，将细胞用PBS洗涤两次，并在500μl PBS中通过在1500rpm下离心回收。细胞离心去除上清液，并通过PCR扩增附着至细胞的适配体以制备足量用于后轮筛选。

在初始RND40群体先前制备期间和每3轮筛选对来自RND40适配体文库的HEK-293T细胞进行反筛选，从前轮筛选分离该群体。为此，在筛选试验前24h将8-10x 10⁵个HEK-293T细胞一式三份接种于P6板孔，并在37℃，5％CO₂下温育。然后，添加100μl PBS中1nmolRND40文库的(或在前轮筛选分离的群体的)适配体，该适配体此前在95℃下变性10min然后在4℃下温育10min；添加300μl补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和25μg/ml两性霉素的DMEM培养基(Dulbecco的改性Eagle培养基)，并施用于细胞上。在37℃，5％CO₂下温育1h后，移除用于TLR-4的筛选轮的带有未结合适配体的培养基。

利用可溶性hTLR-4蛋白的筛选

关于每轮筛选，使用前轮筛选富集的RND40文库。将1nmol适配体与7μg6xHIS-hTLR-4(以10个适配体分子：1个hTLR-4分子的比例)一起在适配体缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，1mM MgCl₂，150mM NaCl，5mM KCl)中在37℃下温育1h——伴以搅拌。随后，添加NTA-Ni树脂(QIAGEN，德国)，并将其在4℃下温育1h以获取蛋白质。在用适配体缓冲液3次洗涤后，通过PCR扩增结合序列以制备足量用于后轮筛选。

在与筛选相同但不存在与树脂结合的TLR-4蛋白的条件下进行反筛选。

选定适配体的扩增

将选定适配体重悬浮于20μl蒸馏水体积中，并利用引物通过PCR扩增，该引物相应于序列SEQ ID NO：5(GCGGATGAAGACTGGTGT)和SEQ ID NO：6(GTTGCTCGTATTTAGGGC)——在200μl最终体积中在0.8μM/引物SEQ ID NO：5、0.8μM/引物SEQ ID NO：6、200mM dNTPs、2mMMgCl₂、10U Taq聚合酶(Biotools，西班牙)的条件下，按照下列扩增程序：在95℃下2min；15个循环：在95℃下30s，在56℃下30s和在72℃下30s；和最后在72℃下5min。

ELONA

确定选定的适配体是否识别TLR-4蛋白。为此，将100ng/孔的6xHIS-重组TLR-4添加至96-孔微量滴定板，并在4℃下温育16h。随后，在5′端用地高辛标记的各个适配体以5μg/mL浓度稀释，然后在95℃下变性10min，并在冰上冷却10min。然后，将100μl(200nM)适配体缓冲液中的20pmol各适配体添加至每个孔，并将板在37℃下温育1h。最后，将板与过氧化物酶缀合的抗地高辛抗体一起温育，并利用ABTS显色。抗Li H2A DNA适配体用作阳性对照(Martín等，2013，PLoS ONE 8：e78886)。

适配体与重组hTLR-4结合的结合试验

为分析各确定的适配体与hTLR-4结合的能力，进行如下实验：通过组氨酸标签，将hTLR-4与此前平衡的Ni-NTA树脂结合。然后，包含1pmol TLR4的树脂：蛋白质复合物与此前通过在95℃下热变性10min并然后在4℃下复性10min而构造的1pmol适配体TLRApt#1R(SEQID NO：3)、TLRApt#2F、TLRApt#3R和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)一起温育。在37℃下温育10min后，洗涤复合物，并通过与1mM MgCl₂一起溶于PBS的150mM咪唑回收适配体。在IQ5热循环仪(BioRad)中利用具有序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物通过定量PCR(qPCR)确定与hTLR-4结合的适配体的数值。

适配体与细胞表达的TLR-4结合的结合试验

为分析确定的适配体与HEK-293细胞表达的TLR-4蛋白结合的能力，将20pmol适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)、TLRApt#2F、TLRApt#3R和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)中的每一种添加至在试验开始前2天以20,000个细胞/孔以2x 10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔微量滴定板的HEK-293-TLR4细胞培养物。在37℃，5％CO₂下温育30min后，洗涤细胞，通过与1mMMgCl₂一起溶于PBS的150mM咪唑回收适配体，并进行qPCR以确定Ct值。

受体hTLR-4活性试验

为进行这些试验，使用表达人受体TLR-4的HEK-Blue hTLR4细胞(Invivogen，ref.hkb-htlr4)、以及通过其激动剂(来自大肠杆菌K12的脂多糖(LPS-EK))结合而激活的MD2和CD14蛋白。关于检测TLR-4激活，该细胞系包含SEAP(分泌的胚胎碱性磷酸酶)报告基因，该SEAP报告基因受NF-kB启动子控制，使得其响应TLR-4诱导的这种NF-kB信号传导途径而表达。SEAP酶被分泌到培养基中，并且通过添加和代谢其商品底物QUANTI-Blue^TM(Invivogen，San Diego，California，USA)，其导致培养基的颜色从红色变成蓝色。另外，将对照激动剂分子LPS-EK UP(来自大肠杆菌(E.coli)K12的脂多糖，Ultra Pure)和拮抗剂LPS-RS UP(来自球形红细菌(R.sphaeroides)的脂多糖，Ultra Pure)分别以0.02ng/μL和2ng/μL的浓度溶解于无菌PBS中的1mM MgCl₂。制备在无菌PBS中的1mM Cl₂Mg中0.1、1、10和100ng/μL浓度的适配体，使其在95℃下变性10min，并在4℃下构造10min。

关于试验，将HEK Blue-hTLR4细胞以2x10⁴个细胞/孔接种到96孔培养板上的200μL补充有(1x)HEK-Blue^TMSelection的完全培养基DMEM中。24h或48h温育后，在细胞达到70-80％汇合时，回收培养基，并添加170μL新制培养基。在对照孔中添加30μLSELEX缓冲液。在其它孔中，添加20μL的20ng/mL(最终0.1ng/mL)的LPS-EK-ultra pure(Invivogen，USA)或20μL来自1.5-2.5x107个HEK293细胞/mL的溶解产物(损伤相关分子模式；DAMP)作为激动剂分子。1h温育后，将10μL在SELEX缓冲液中稀释至适当浓度的适配体添加至孔，以达到图中指示的最终浓度。200ng/mL浓度的LPS-RS ultra-pure(Invivogen，USA)用作拮抗剂对照。在24h后在630nm下利用QUANTI-Blue^TM底物(Invivogen)测量分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)活性。

适配体对巨噬细胞的影响

将腹膜巨噬细胞以1x10⁶个细胞/ml的密度接种于12孔板。在存在500ng/ml LPS的情况下刺激巨噬细胞，并在1h后将适配体添加到最终浓度20nM和200nM。24h后通过Griess反应测量硝酸根释放。样本进行两次试验。

中风动物模型

使用重28至30g的成年雄性C57BL小鼠。C57BL/10ScNJ(前称C57BL/10ScCr)和C57BL/10ScSn小鼠获自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，Me，USA)。小鼠品系C57BL/10ScNJ通过敲除TLR4基因而不表达功能性TLR4，并且C57BL/10ScSn品系不表达TLR4基因的任何突变并用作对照组。每组利用4只TLR4缺陷型小鼠(C57BL/10ScNJ)，并且每组利用4只对照小鼠(C57BL/10ScSn)。所有实验方案遵守Universidad Complutense的“ComitédeBienestar Animal”(Animal Well-being Committee)的指导(遵守European Directives86/609/EEC和32/2007/EC)。动物居住在正常温度条件、湿度条件和12小时光/暗循环条件下，并自由获得食物和水。

按照Caso等，2007(Caso等，2007，Circulation 115：1599-608)的教导通过脑中动脉闭塞(MCAO)进行灶性脑缺血的诱发。简言之，通过颈总动脉(CCA)的结扎和脑中动脉(MCA)的远端同侧闭塞来诱发永久性灶性脑缺血。关于CCA的结扎，制造腹颈切口以分离所述动脉，并通过结扎将其永久性闭塞。关于MCA的阻塞，在连接左眼外眦和外耳道的垂直线的1cm处制造切口，并去除颞肌。制造钻孔以暴露通过结扎闭塞的MCA。手术后，封闭切口并消毒，将动物放回其笼中，其自由获得水和食物。手术过程中控制动物的生命体征。

通过磁共振成像评价脑损伤。简言之，将小鼠用异氟烷麻醉，并在MCAO后24小时通过MRI评价梗塞尺寸。在4.7T下运行的BIOSPEC BMT 47/40(Bruker-Medical，Ettlingen，德国；MRI Unit，Instituto Pluridisciplinar，UCM)中获得在T2(T2WI)中突出的图像。

流式细胞术分析

所有流式细胞术分析在FACScan型流式细胞仪(Becton Dickinson免疫细胞术系统)上进行。通过如下分析适配体与细胞表面TLR4的结合：将HEK293或HEK Blue-hTLR4细胞以2x10⁵个细胞/孔接种到24孔培养板上的200μL补充有HEK-Blue^TM选择缓冲液的完全培养基DMEM中。然后，细胞进行或不进行如下处理：在黑暗中在室温下，用TLR-4激活剂LPS-EK-UP(0.4ng/孔)处理30min，然后利用50μL体积的包含1mM MgCl₂和1mg/ml BSA的PBS缓冲液中的Alexa Fluor 488标记的适配体(20nM)处理30min。然后将细胞用2mL相同缓冲液洗涤，悬浮于0.5mL缓冲液中，并进行流式细胞术分析。

核酸酶消化

通过加热至95℃和在冰上冷却，使300ng适配体在SELEX缓冲液中折叠。将再折叠适配体与2U的λ核酸外切酶或DNA酶I(Fermentas)一起在10μL反应中在37℃下温育10min、30min、1h、2h和4h。然后，将样本在3％琼脂糖凝胶上解决。将带通过GelRed(Biotium)可视化，并利用Image Studio Digits V3.1软件定量。

实施例1：TLR-4特异性适配体的筛选

发明人利用RND40适配体文库实施IBA GmbH(Goettingen，德国)提供的TLR-4的特异性适配体的筛选。初始RND40文库由寡核苷酸(ssDNA)构成，该寡核苷酸具有末端固定序列——该末端固定序列由18个核苷酸组成，在此其杂交各自的引物以进行其PCR扩增；和中央区域——由具有随机序列的40个碱基组成。

10¹³个适配体的初始RND40文库富集hTLR-4特异性适配体。作为TLR-4筛选的前一步骤，对文库进行“反筛选”过程，找到呈现目标分子(磁性树脂、目标蛋白质表达细胞的同系细胞等)的表面或基质。

实施例2：选定适配体的表征

按照如下策略在6轮筛选后确定选定的适配体：

a)通过将适配体群体克隆到质粒中——目的是获得各个适配体，然后Sanger测序。

b)通过大规模测序获得的适配体群体，确定重复最多的适配体。

通过IBA GmbH(Goettingen，德国)化学合成最具代表性的序列，并在与重组hTLR-4蛋白或与HEK-293细胞-TLR-4结合的结合试验中通过ELONA、适配体与重组TLR-4蛋白和与细胞表达的TLR-4结合的结合试验、受体hTLR-4活性试验研究各适配体的亲和性和活性。

ELONA试验的结果(图1)清楚显示，与重组hTLR-4蛋白较高效结合的适配体是适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)。通过相同类型的试验，确定了适配体TLRApt#2F和TLRApt#3R。图2显示利用mFold软件(Zuker M.，2003，Nucleic Acids Res31：3406-15)获得的选定适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)的最可能序列和二级结构。

通过将适配体与结合有hTLR-4的Ni-NTA树脂一起温育，回收，然后qPCR扩增结合的适配体，来确定适配体与hTLR-4结合的能力。所得结果显示，所有选定的适配体均能够与重组hTLR-4蛋白结合(图3A)。在这些实验中，Ct值较低表示与hTLR-4结合的适配体量较大。

为分析确定的适配体与HEK-293细胞表达的TLR-4蛋白结合的能力，将20pmol(500ng)适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)添加至HEK-293-TLR4细胞培养物。在37℃，5％CO₂下温育30min后，洗涤和回收细胞，并进行qPCR以计算Ct值。在这些实验中，Ct值较低表示与细胞结合的适配体量较大。所得结果显示，选定的适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)(图3B)是以较高亲和性结合的那些适配体。

制作剂量响应曲线以确定利用LPS-EK-UP(图4A)或HEK293细胞溶解产物(损伤-相关分子模式；DAMP)(图4B)作为激动剂获得最高拮抗剂效果的各适配体浓度。基于所得结果，可得出结论：观察到最佳效果的浓度对于激动剂LPS-EK-UP而言是20nM，对于DAMP而言是200nM。

适配体对巨噬细胞的影响显示在图5中。在用LPS刺激巨噬细胞后，适配体TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)和TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)抑制亚硝酸根释放。在这些实验中，适配体TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)看起来比相同浓度的TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)更具活性。

实施例3：在动物模型中TLR-4适配体拮抗剂增加其活性和稳定性的优化

对显示抑制受体TLR-4的能力的适配体通过从其序列去除特异性区域而进行修饰，目的是增加对于核酸酶的稳定性和/或抗性。为此，利用mFold程序(Zuker M.，2003，上文提到)进行不同适配体的二级结构研究，并通过QGRS Mapper程序(Kikin等，2006，Nucleic Acids Res 34：W676-W682)分析适配体形成G-四结构的能力。因此，设计和合成适配体TLRApt#1R-T(SEQ ID NO：1)和TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)——相应于第一筛选中确定的那些(图6)。

实施例4：TLR-4适配体拮抗剂在中风动物模型中的效果

新型适配体的能力被优化以阻止中风动物模型中中风发作后产生的炎性反应，评价TLR-4特异性适配体降低脑损伤的能力。

为此，使用成年雄性TLR-4缺陷型小鼠(C57BL/10ScNJ)和表达TLR-4(C57BL/10ScSn)的对照小鼠，在其中通过脑中动脉阻塞(MCAO)诱发灶性脑缺血。在正常表达TLR4的小鼠(对照小鼠)中获得的结果表明，适配体导致梗塞面积尺寸减少，这在适配体TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)的情况下是统计学显著的。另外，在TLR-4缺陷型小鼠中获得的结果显示，适配体TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)对其没有效果——其用媒介治疗小鼠时获得(图7)。此数据清楚表明适配体TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)的效果通过TLR-4发生。

在另一组实验中，成年雄性小鼠C57BL/10ScSn(WT；正常)经历灶性脑缺血诱发，然后通过腹膜内注射不同量的适配体TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)或媒介(PBS+1mM Mg²⁺)进行治疗。所得结果表明，1nmol适配体/动物的适配体致使梗塞面积尺寸减少较多并且这种减少是统计学显著的(图8)。

实施例5：流式细胞术

流式细胞术试验利用人TLR4，293-hTLR4A转染的HEK293细胞系进行。缺乏人TLR4的亲代人HEK293细胞系用作对照。在此实验中，用Alexa Fluor 488标记适配体。图9A显示Alexa Fluor 488标记的适配体与293-hTLR4A细胞结合强(右图)，但不与缺乏人TLR4的HK293细胞结合(左图)。另外，观察到ApTLR#4F-T(SEQ ID NO：2)以高于ApTLR#1R-T(SEQ IDNO：1)的亲和性与目标结合。进而，比较hTLR4-Blue-HEK细胞激活(或不激活)后采用选定适配体的细胞染色结果。如预期，相对于未激活细胞，适配体以类似水平结合激活后的TLR4(图9B)。

实施例6：通过核酸酶消化的半衰期计算

在存在λ核酸外切酶或DNA酶I的情况下体外测量适配体的半衰期(图10)。结果显示，四种适配体耐受λ核酸外切酶，同时DNA酶I产生四种适配体的时间依赖性降解。因此，适配体ApTLR#1R-T(SEQ ID NO：1)最敏感，并且在DNA酶I存在时5min温育后完全降解。相比之下，适配体ApTLR#4F(SEQ ID NO：4)和ApTLR#4F-T(SEQ ID NO：2)甚至在2h DNA酶I温育后仍耐受。

结论

-针对受体TLR-4的胞外结构域选择适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)，其识别人受体TLR-4，两者都处于其可溶性重组形式(体外)并且整合在HEK293细胞的膜中(体内)。

-适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)显示受体TLR-4的拮抗效果。

-获得了截短形式的适配体TLRApt#1R-T(SEQ ID NO：1)和TLRApt#4F-T(SEQ IDNO：2)，其分别保持原适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)和TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)的拮抗活性。

-适配体TLRApt#4F-T(SEQ ID NO：2)能够减少中风动物模型中的梗塞面积。

-针对TLR4受体的胞外结构域选择的适配体TLRApt#1R(SEQ ID NO：3)y TLRApt#4F(SEQ ID NO：4)识别人TLR-4受体，两者都处于其重组可溶形式(体外)，整合在HEK293细胞的膜中(体内)。

序列表

<110> 奥图视生物技术公司

<120> TLR-4特异性适配体及其应用

<130> P9923PC00

<150> P201430955

<151> 2014-06-24

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有特异性结合并抑制TLR-4的能力的TLRApt#1R-T适配体

<400> 1

ccggcacggg acaaggcgcg ggacggcgta gatcaggtcg acacc 45

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有特异性结合并抑制TLR-4的能力的TLRApt#4F-T适配体

<400> 2

ggtgtgccaa taaaccatat cgccgcgtta gcatgtactc ggttggccct aaatacgag 59

<210> 3

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有特异性结合并抑制TLR-4的能力的TLRApt#1R适配体

<400> 3

gttgctcgta tttagggcca ccggcacggg acaaggcgcg ggacggcgta gatcaggtcg 60

acaccagtct tcatccgc 78

<210> 4

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有特异性结合并抑制TLR-4的能力的TLRApt#4F适配体

<400> 4

gcggatgaag actggtgtgc caataaacca tatcgccgcg ttagcatgta ctcggttggc 60

cctaaatacg agcaac 76

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增适配体的引物

<400> 5

gcggatgaag actggtgt 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增适配体的引物

<400> 6

gttgctcgta tttagggc 18

<210> 7

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不能采用任何二级结构的非特异性序列

<400> 7

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 60

agagagagag agagag 76

Claims (25)

1.特异性结合TLR-4的核酸适配体，其中所述适配体选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其中所述核酸是DNA。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的核酸适配体，其中所述TLR-4是人TLR-4。

4.复合物，包括根据权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体和功能性基团，其中所述功能性基团选自可检测试剂、药物或纳米颗粒。

5.根据权利要求4所述的复合物，其中所述功能性基团是可检测试剂。

6.根据权利要求4所述的复合物，其中所述功能性基团是药物。

7.根据权利要求4所述的复合物，其中所述功能性基团是纳米颗粒。

8.根据权利要求7所述的复合物，其中所述纳米颗粒是金属纳米颗粒。

9.根据权利要求8所述的复合物，其中所述金属纳米颗粒是磁性介孔二氧化硅纳米颗粒。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体或根据权利要求4至9中任一项所述的复合物在制备用于检测TLR-4的试剂盒中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其中TLR-4的检测通过选自酶联寡核苷酸试验(ELONA)、适配体细胞化学、适配体组织化学和流式细胞术的方法进行。

12.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体或根据权利要求4至9中任一项所述的复合物用于抑制TLR-4的体外应用。

13.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体或根据权利要求4至9中任一项所述的复合物在制备用于进行检测样本中的TLR-4的体外方法的试剂盒中的应用，其中所述方法包括:

i)使所述样本与根据权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体、或根据权利要求4至9中任一项所述的复合物接触，和

ii)分离未结合TLR-4的适配体或复合物，

iii)检测与样本中存在的TLR-4结合的适配体或复合物的存在。

14.根据权利要求13所述的应用，其中检测通过荧光进行。

15.根据权利要求13所述的应用，其中所述样本是来自对象的生物样本。

16.根据权利要求15所述的应用，其中所述对象是人。

17.抑制样本中的TLR-4的体外方法，包括使包括TLR-4的样本与根据权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体、或根据权利要求4至9中任一项所述的复合物在适于抑制TLR-4的条件下接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述样本是来自对象的生物样本。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述对象是人。

20.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体或根据权利要求4至9中任一项所述的复合物在制备用于治疗以TLR-4表达增加和/或TLR-4激活增加为特征的疾病的药物中的应用。

21.根据权利要求20所述的应用，其中所述以TLR-4表达增加和/或激活增加为特征的疾病选自中风、急性心肌梗塞、脓毒症、动脉粥样硬化、多发性硬化、类风湿关节炎、视网膜变性疾病、和药物成瘾。

22.根据权利要求21所述的应用，其中所述以TLR-4表达增加和/或激活增加为特征的疾病是中风。

23.根据权利要求20所述的应用，其中所述以TLR-4表达增加和/或激活增加为特征的疾病是视网膜变性疾病，其选自年龄相关性黄斑变性、斯塔加特病、色素性视网膜炎、无脉络膜、利伯氏先天性黑矇、少年视网膜层分裂、乌斯赫尔氏病、和巴-比二氏综合征。

24.药物组合物，包括与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或溶剂组合的至少一种根据权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体或至少一种根据权利要求4至9中任一项所述的复合物。

25.根据权利要求4至9中任一项所述的复合物在制备用于检测TLR-4的试剂盒中的应用，其中所述复合物中的所述功能性基团是用于表达TLR-4的细胞、组织或器官的体内成像的可检测部分。

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