KR102454682B1 - Tlr-4에 특이적인 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

Tlr-4에 특이적인 압타머 및 이의 용도 Download PDF

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산체스 마리아 앙겔레스 모로
팔마 마리아 엘레나 마르틴
이베네스 아나 모랴가
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Abstract

본 발명은 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지는 핵산 압타머, 상기 압타머 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체, 및 이의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 TLR-4를 검출하기 위한 용도 및 방법 및 TLR-4를 저해하기 위한 용도 및 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 또한 TLR4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료를 위한 약물의 제조에서의 용도를 위한 압타머에 관한 것이다.

Description

TLR-4에 특이적인 압타머 및 이의 용도{APTAMERS SPECIFIC FOR TLR-4 AND USES THEREOF}
본 발명은 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지는 핵산 압타머 및 이의 용도를 제공한다.
중추 신경계(Central Nervous System: CNS)가 매우 잘 조직화된 선천성 면역 반응으로 박테리아 감염 및 뇌 손상 둘 다에 반응하는 것으로 오늘날 공지되어 있다. 선천성 면역계는 특히 톨 유사 수용체(toll-like receptor: TLR)를 통해 매우 보존된 분자 패턴를 인식할 수 있다.
TLR4는 포유류에서 규명된 처음의 TLR이다. 외인성 리간드는 그람 음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide: LPS), 그람 양성 박테리아의 리포테이코산(lipoteichoic acid: LTA), 또는 합포체 호흡기 바이러스의 단백질 F와 같은 이 TLR에 대해 기재되어 있다. 더욱이, 가장 중요한 내인성 리간드는 HMBG1, 내인성 기원의 또는 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)로부터 유래한 HSP-60, HPS-70, 피브로넥틴, 피브리노겐, 히알우론산 등이고, 모두 조직 손상, 세포 손상 및/또는 숙주의 혈액으로부터 유래한다. TLR4는 특히 다수의 매우 우세한 병리학, 예컨대 뇌졸중 또는 뇌혈관 질환, 급성 심근 경색, 패혈증, 죽상동맥경화증, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 망막 퇴행성 질환 및 약물 중독에 관여한다.
다수의 병리학에서 선천성 면역력 및 특히 TLR의 관여는 이 수용체의 작용제 및 길항제의 개발에서 증가하는 관심을 유발한다. 작용제는 암, 알레르기 질환, 감염의 가능한 치료를 위해, 및 백신 공동아쥬번트로서 따라서 개발되었다. 또한, TLR 길항제는 패혈증, 죽상동맥경화증, 만성 통증 및 대장염에서 연구되고 있고; 사실 이 병리학에서 연구된 여러 길항제, 에리토란(III상), 이부딜라스트(Av411; II상) 및 NI-0101 항체(전임상 단계)가 존재한다.
특허 문헌 WO 2006/138681은 TLR-4 저해제(이들 중 TLR-4 특이적 압타머가 언급됨)의 투여에 의해 간장내 활성화 T-세포 결실을 저해하는 방법을 기재한다.
로저(Roger) 등(Roger et al ., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:2348-52)은 TLR4의 세포외 도메인에 특이적인 항체를 기재한다. 이 항체는 마우스에서 그람 음성 박테리아의 치명적인 패혈증에 대해 보호를 제공한다. 내독소의 노출 후 4시간까지 및 에스체리치아 콜라이로 인한 감염의 발병 후 13시간까지 항체가 투여될 때 치료가 효과적이라는 것을 고려하여 이 항-TLR4 항체의 치료학적 유용성이 또한 제안된다.
따라서, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 치료제로서 유용한 새로운 분자에 대한 당해 분야의 수요가 존재한다.
제1 양태에서, 본 발명은 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 압타머 및 작용상 그룹(functional group)을 포함하는 복합체에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR-4를 검출하기 위한 본 발명의 압타머 또는 본 발명의 복합체의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR-4를 저해하기 위한 본 발명의 압타머 또는 본 발명의 복합체의 시험관내 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
ⅰ) 상기 샘플을 본 발명에 따른 압타머, 또는 본 발명에 따른 복합체와 접촉시키는 단계,
ⅱ) TLR-4에 결합하지 않은 압타머 또는 복합체를 분리시키는 단계, 및
ⅲ) 샘플에 존재하는 TLR-4에 결합하지 않은 압타머 또는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 샘플 내의 TLR-4의 검출을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR-4를 저해하기에 적합한 조건에서 TLR-4를 포함하는 샘플을 본 발명에 따른 압타머, 또는 본 발명에 따른 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 샘플 내의 TLR-4를 저해하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료에서의 용도를 위한 본 발명의 압타머에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 용매와 조합된 본 발명에 따른 적어도 하나의 압타머 또는 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
도 1. ELONA에 의해 선택된 압타머에 의한 TLR-4 단백질의 재인식. 인간 재조합 TLR-4 단백질(6xHIS-TLR-4)을 96웰 미량적정 플레이트에서 100ng/웰의 농도로 배양하고, 4℃에서 16시간 동안 항온처리하였다. 후속하여, 다이곡시제닌으로 표지된 20pmol의 각각의 압타머를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 퍼옥시다제 접합 항-다이곡시제닌 항체와 항온처리하고, ABTS를 사용하여 전개시켰다. 항-Li H2A DNA 압타머를 양성 대조군으로서 사용하였다(
Figure 112017005902301-pct00001
et al., 2013, PLoS ONE 8: e78886). 모든 실험을 3중 실행하였다.
도 2. mFold 프로그램을 사용하여 예측된 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)의 2차 구조. 예측된 G-쿼드러플 구조의 일부일 수 있는 구아닌이 QGRS Mapper 프로그램에 의해 박스 내에 표시되어 있다.
도 3. 재조합 hTLR-4(A) 및 세포에서 발현된 TLR-4 단백질(B)에 대한 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)의 결합. 모든 실험을 3중 실행하였다.
도 4. 대조군으로서 HEK-블루 hTLR4 세포 및 길항제 LPS-RS-UP(2ng/㎕; 20ng)에 대한 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)의 길항제 효과. 압타머를 0.2, 2, 20 및 200nM의 최종 농도로 또는 길항제 대조군 LPS-RS-UP(2ng/㎕; 20ng) 적용하였다. 작용제 LPS-EK-UP(0.02ng/㎕)(A) 또는 HEK293 세포로부터의 용해물(손상 연관 분자 패턴; DAMP)(B)을 작용제 대조군으로서 사용하고, 분비된 알칼리 포스파타제(SEAP) 활성을 630㎚에서 QUANTI-Blue(상표명) 기질을 사용하여 24시간 후 측정하였다. 데이터는 대조군 세포에 대한 SEAP 활성의 백분율로서 표현된다. 모든 실험을 3중 수행하고, 7-9회 상이한 실험의 평균이 도면에 도시되어 있다. 통계 유의성(*P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001).
도 5. 500ng/㎖의 LPS의 존재 하에 자극된 대식세포에 대한 압타머 TLRApt#4F-T(서열번호 2) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)의 효과. 압타머 중독 24시간에 Griess 반응에 의해 아질산염 방출을 연구하였다. 샘플을 2중 평가하였다. 1방향 ANOVA, 이어서 본페로니 시험에 의해 차이를 분석하였다. 결과는 2중 시험된 3회 실험의 평균이다. 통계 유의성(***P<0.001). 열쇠: 38x(AG)는 임의의 2차 구조를 채택할 수 없는 비특이적 서열인 서열번호 7의 서열의 올리고뉴클레오타이드이다; Inh: 히스파놀론 유도체 화합물 11(
Figure 112017005902301-pct00002
et al., 2008, Toxicol Appl Pharmacol 228:179-89).
도 6. mFold 프로그램을 사용하여 예측된 압타머 TLRApt#1R-T(서열번호 1) 및 TLRApt#4F-T(서열번호 2)의 2차 구조. 예측된 G-쿼드러플 구조의 일부일 수 있는 구아닌은 QGRS Mapper 프로그램에 의해 박스 내에 표시되어 있다.
도 7. 실험에 사용된 동물의 경색 부분의 감소에서 압타머 TLRApt#1R-T(서열번호 1), TLRApt#4F-T(서열번호 2) 및 TLRApt#4F(서열번호 4) 또는 38x(AG)(서열번호 7) 또는 비히클(PBS + 1mM Mg2+)의 1n㏖의 복강내 주사의 효과. 성체 수컷 마우스 C57BL/10ScSn(WT; 정상) 및 C57BL/10ScNJ(KO, 기능적 TLR4 결여)를 결찰을 통해 중뇌 동맥의 폐색에 의해 병소 뇌 허혈의 유도로 처리하였다. 마우스를 아이소플루란에 의해 마취하고, MCAO 24시간 후, 경색의 크기를 MRI에 의해 평가하였다. T2에 강조된 영상(T2WI)을 4.7T(Bruker-Medical(독일 에틀링겐); MRI Unit, Instituto Pluridisciplinar, UCM)에서 조작되는 BIOSPEC BMT 47/40에서 획득하고, 손상된 부위를 Image J 1.41(NIH(워싱턴주 베데스다))에 의해 정량화하였다. 통계 유의성(*P<0.05). 열쇠: 1RT, TLRApt#1R-T; 4FT, TLRApt#4F-T; 4F, TLRApt#4F.
도 8: 용량-반응 곡선. 실험에 사용된 동물에서 경색 부위의 감소에서 상이한 양의 압타머 TLRApt#4F-T(서열번호 2) 및 TLRApt#4F(서열번호 4) 또는 비히클(PBS + 1mM Mg2+)의 복강내 주사의 효과. 성체 수컷 마우스 C57BL/10ScSn(WT; 정상)을 결찰을 통해 중뇌 동맥의 폐색에 의해 병소 뇌 허혈의 유도로 처리하였다. 마우스를 아이소플루란에 의해 마취하고, MCAO 24시간 후, 경색의 크기를 MRI에 의해 평가하였다. T2에 강조된 영상(T2WI)을 4.7T(Bruker-Medical(독일 에틀링겐); MRI Unit, Instituto Pluridisciplinar, UCM)에서 조작되는 BIOSPEC BMT 47/40에서 획득하고, 손상된 부위를 Image J 1.41(NIH(워싱턴주 베데스다))에 의해 정량화하였다. 통계 유의성(*P<0.05).
도 9: 유세포분석법 검정. (A) 인간 HEK293(왼쪽 패널) 및 293-hTLR4A(오른쪽 패널) 세포주를 실온에서 30분 동안 20nM 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 488 표지된 압타머에 의해 항온처리하였다. 세포를 2㎖의 PBS에 의해 세척하고, 분석을 위해 1㎖의 PBS 중에 재현탁시켰다. 각각의 도면에서, 세로좌표는 사건의 빈도(또는 세포수)를 나타내지만, 가로좌표는 형광 강도(FL1)를 나타낸다. 검정 부위, 자가형광; 검정선, 압타머 TLRApt#1R-T(서열번호 31); 회색선, 압타머 TLRApt#4F-T(서열번호 42). (B) 인간 293-hTLR4A 세포주를 LPS-EK-UP에 의해 활성화하고, 이후 30분 20nM의 알렉사 플루오르 488 표지된 압타머에 의해 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 2㎖의 PBS에 의해 세척하고, 분석을 위해 1㎖의 PBS 중에 재현탁시켰다. 각각의 도면에서, 세로좌표는 사건의 빈도(또는 세포수)를 나타내지만, 가로좌표는 형광 강도(FL1)를 나타낸다. 검정 부위, 자가형광; 검정선, 압타머 TLRApt#1R-T(서열번호 31); 회색선, 압타머 TLRApt#4F-T(서열번호 42).
도 10: 시험관내 압타머의 반감기의 분석. 300ng의 폴딩된 압타머를 37℃에서 수 시간의 기간 동안 엑소뉴클레아제 또는 DNAse I의 2단위와 항온처리하였다. 이후, 샘플을 3% 아가로스 겔에서 용해시키고, 밴드를 GelRed에 의해 가시화하고, Image Studio Digits V3.1 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
본 발명의 저자들은, 특이적으로 TLR-4 단백질을 인식하고 이의 활성을 조절하는 능력을 제공하는, 서열로 인해, 소정의 pH, 온도 및 식염수 농도 조건에서 3차원으로 구조화될 수 있는, 2개의 분자를 선택하고 규명하였다. 이 분자는 생체내 수용체 TLR-4에 의해 매개된 세포 반응을 저해할 수 있고, 허혈성 뇌졸중의 동물 모델에서 뇌 경색의 크기를 감소시킬 수 있어서, 이것에 잠재적 치료학적 역할을 제공한다.
TLR-4에 특이적인 압타머
제1 양태에서, 본 발명은 이하 "본 발명의 압타머"라 칭하고, 서열번호 1(CCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCAGGTCGACACC) 및 서열번호 2(GGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCGGTTGGCCCTAAATACGAG)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지는 핵산 압타머, 또는 이의 작용상 동등한 변이체에 관한 것이다.
용어 "압타머"는, 본 발명의 맥락에서, 종래의 왓손-크리크(Watson-Crick) 염기 짝짓기 이외의 상호작용을 통해, 단일클론 항체와 필적하는, 높은 특이성 및 친화도를 가지는 분자 표적에 결합하게 하는, 특이적 3차 구조를 채택한 단일 가닥 핵산 사슬을 의미한다.
용어 "핵산"은, 본 발명의 맥락에서, 임의의 유형의 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA, 및 이의 변이체, 예컨대 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid: PNA), 잠긴 핵산(locked nucleic acid: LNA), 및 이들의 조합, 이들의 변형, 예컨대 변형 뉴클레오타이드 등을 의미한다. 용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본 발명의 맥락에서 상호교환되어 사용된다. 핵산은 재조합 발현 시스템을 사용하여 제조되고, 임의로, 정제된, 화학적으로 합성된 기타 등등의 천연 소스로부터 정제될 수 있다. 적절할 때, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우에, 핵산은 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격의 변형 등을 가지는 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 표시되지 않은 한 5'-3' 방향으로 표시된다.
용어 "TLR -4"는, 본 발명의 맥락에서, 막 수용체 톨 유사 수용체 4를 의미한다. 수용체 TLR-4는 또한 ARMD10, CD284, TLR4 또는 hTOLL이라 칭해질 수 있다. 인간에서, 수용체 TLR-4는 2014년 5월 27일에 수탁 번호 O00206.2 하에 유전자은행(GenBank)에 등록되었고, 이것은 TLR4 유전자에 의해 코딩된다. 이것은 839개 이하의 아미노산으로 이루어지고, 이의 잔기 1-23은 신호 서열을 구성하고, 잔기 24-631은 세포외 도메인을 구성하고, 잔기 632-652는 막관통 도메인을 구성하고, 잔기 653-839는 세포질 도메인을 구성한다.
특정한 실시형태에서, 압타머는 TLR-4(아미노산 24-631)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1(CCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCAGGTCGACACC) 및 서열번호 2(GGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCGGTTGGCCCTAAATACGAG)의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 압타머, 또는 이의 작용상 동등한 변이체를 고려한다.
본 발명은 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열의 압타머의 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력으로 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA, 및 핵산 변이체 및 유사체 및 이들의 조합, 이들의 변형, 예컨대, 제한 없이, 변형된 핵산 골격, 치환 결합, 변형 뉴클레오타이드, 및 리보스 또는 데옥시리보스 유사체, 변형 뉴클레오타이드 등으로 이루어진 본 발명의 압타머를 고려한다. 핵산 변이체 및 유사체의 비제한적인 예는, 제한 없이, PNA, LNA 및 TNA를 포함한다.
용어 "핵산 변이체" 또는 "핵산 유사체"는, 본 발명의 맥락에서, 핵산 변이체 및 유사체, 예컨대, 제한 없이, 변형된 핵산 골격, 치환 결합, 변형 뉴클레오타이드, 및 리보스 또는 데옥시리보스 유사체를 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 핵산 변이체는 통상적인 포스포다이에스터 골격의 유사체 합성 골격을 가지는 구조를 포함할 수 있다. 이것은 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미다이트, 알킬 포스포트라이에스터, 설파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카바메이트, 모르폴린 카바메이트 및 펩타이드 핵산(PNA), 메틸포스포네이트 결합 또는 교대 메틸포스포네이트 및 포스포다이에스터 및 벤질포스포네이트를 포함한다.
핵산 변이체는 당해 분야에 일반적으로 이해되는 바대로 하나 이상의 "치환" 결합을 또한 함유할 수 있다. 이들 치환 결합 중 몇몇은 비극성이고, 막을 통한 확산의 능력을 가지는 압타머를 제공하는 데 기여하다. 이 "치환" 결합은 종래의 대안적인 결합, 예컨대 포스포로티오에이트 또는 포스포르아미다이트로서 본 명세서에 정의되어 있고, 흔히 이용 가능한 문헌에 기재된 바대로 합성된다. 대안적인 결합 기는 비제한적인 방식으로, -S- 또는 -O-를 통해 인접한 뉴클레오타이드에 결합하는, 화학식 P(O)S, ("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), P(O)NR'2, P(O)R', P(O)OR6, CO, 또는 CONR'2(여기서, R'는 H(또는 염) 또는 1 내지 12개의 탄소 원자의 알킬기이고, R6은 1 내지 9개의 탄소 원자의 탄소 원자의 알킬기임)의 모이어티인 실시형태를 포함한다. 다이티오에이트 결합은 미국 특허 출원 248517에 기재되어 있다. 본 발명은 또한 인에 기반하지 않은 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하는 치환 결합, 예컨대 3'-티오폼아세탈, (-S-CH2-O-), 폼아세탈(-O-CH2-O-) 및 미국 특허 출원 690786 및 763130에 기재된 3'-아민 뉴클레오타이드간 결합(-NH-CH2-CH2-)의 사용을 고려한다. 하나 이상의 치환 결합은 심지어 TLR-4에 대한 결합을 추가로 촉진하기 위한 또는 뉴클레아제에 대해 압타머의 안정성을 증가시키기 위한, 및 투과 능력을 제공하기 위한 목적을 위해 본 발명의 압타머에서 사용될 수 있다. 동일한 압타머 내의 결합이 모두 동일할 필요는 없고, 본 발명은 따라서 모든 동일한 결합을 가지는 압타머, 및 이의 결합의 조성의 변형을 가지는 압타머를 고려한다.
마찬가지로, 본 발명에 따른 핵산 변이체는, 제한 없이, 2'에서 치환된 당, 예컨대 2'-O-메틸-리보스, 2'-플루오로-리보스 또는 2'-아지도-리보스, 당의 카보사이클릭 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 리속스, 피라노스 당, 퓨라노스 당 및 세도헵툴로스를 포함하는 당해 분야에 널리 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 유사체 형태를 또한 함유할 수 있다. 핵산은 또한 트레오스 핵산(TNA, 또한 알파-트레오푸라노실 올리고뉴클레오타이드라 칭함)을 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Schong et al., Science 2000, November 17, 290 (5495): 1347-1351] 참조). 특히, 푸라노스의 잔기의 2' 위치에서의 치환이 뉴클레아제 안정성에서의 개선과 관련하여 특히 중요하다.
용어 "뉴클레오타이드"는, 본 발명의 맥락에서, 핵산을 구성하는 단량체를 의미한다. 뉴클레오타이드는 펜토스, 질소 함유 염기 및 포스페이트기에 의해 형성되고, 포스포다이에스터 결합에 의해 결합한다. DNA 및 RNA의 일부인 뉴클레오타이드는 펜토스에서 다르고, 이것은 각각 데옥시리보스 및 리보스이다. 질소 함유 염기는 결국 아데닌(A) 및 구아닌(G)인 퓨린 질소 함유 염기, 및 타이민(T), 사이토신(C) 및 유라실(U)인 피리미딘 질소 함유 염기로 분할된다. 타이민은 단지 DNA에서 나타나지만, 유라실은 단지 RNA에서 나타난다. 본 발명은 본 발명의 압타머에서 변형 뉴클레오타이드의 용도를 고려한다. 용어 "변형 뉴클레오타이드"는, 본 발명의 맥락에서, 유사하거나 개선된 결합 특성을 가지는 공지된 천연 뉴클레오타이드 유사체를 의미한다. 퓨린 및 피리미딘의 유사체 형태는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 제한 없이, 아지리디닐사이토신, 4-아세틸사이토신, 5-플루오로유라실, 5-브로모유라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오유라실, 5-카복시메틸아미노메틸유라실, 이노신, N6-아이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸유사유라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸유라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오유라실, 베타-D-만노실케토신, 5-메톡시유라실, 2-메틸티오-N-6-아이소펜테닐아데닌, 유라실-5-옥시아세트산 메틸 에스터, 유사유라실, 케토신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오유라실, 2-티오유라실, 4-티오유라실, 5-메틸유라실, 유라실-5-옥시아세트산 및 2,6-다이아미노퓨린을 포함한다. 이전의 변형 뉴클레오타이드 이외에, 퓨린 또는 피리미딘이 없는 뉴클레오타이드는 잔기가 본 발명에 또한 포함될 수 있다.
이전의 변이체 이외에, 본 발명에 포함된 핵산 변이체는 또한 PNA, LNA 및 5'-5' 또는 3'-3' 사슬을 포함한다. 용어 "펩타이드 핵산" 또는 "PNA"는, 본 발명의 맥락에서, 펩타이드 결합에 의해 결합된 N-(2-아미노에틸)-글라이신의 반복 단위로 골격이 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 의미하고, 상이한 질소 함유 염기는 메틸렌 결합(-CH2-) 및 카보닐 결합(-(C=O)-)에 의해 주사슬에 결합한다. 용어 "잠긴 핵산" 또는 "LNA"는, 본 발명의 맥락에서, 2'에서의 산소를 4'에서의 탄소와 연결하는 추가적인 결합에 의해 리보스 모이어티가 변형되고, 3'-엔도 구성에서 리보스를 잠그는, 변형된 RNA 뉴클레오타이드를 의미한다. 용어 "5'-5' 사슬" 또는 "3'-3' 사슬"은, 본 발명의 맥락에서, 각각 3' 또는 5' 말단의 뉴클레오타이드가 역전된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 명세서에 이것이 사용되는 바대로, 용어 "작용상 동등한 변이체"는 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이것을 저해하는 능력을 유지시키면서 서열번호 1 또는 서열번호 2와 실질적으로 유사한 서열을 가지는 압타머를 의미한다. 본 발명의 압타머의 작용상 동등한 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 추가, 치환 또는 변형을 포함하는 서열번호 1 또는 서열번호 2로부터 유래한 핵산 서열일 수 있다. 예시에 의해, 본 발명의 압타머의 작용상 동등한 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열의 5' 말단에서 1개의 뉴클레오타이드, 2개의 뉴클레오타이드, 3개의 뉴클레오타이드, 4개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드, 적어도 500개의 뉴클레오타이드, 적어도 1000개 이상의 뉴클레오타이드, 및/또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열의 3' 말단에서 1개의 뉴클레오타이드, 2개의 뉴클레오타이드, 3개의 뉴클레오타이드, 4개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드, 적어도 500개의 뉴클레오타이드, 적어도 1000개 이상의 뉴클레오타이드의 추가를 포함하고, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 유지시키는 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지고, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 유지시키는, 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 압타머를 포함한다.
용어 "동일성", "동일한" 또는 "퍼센트 동일성"은 2개 이상의 핵산의 맥락에서 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고, 최대 상관성에 대해, 비교되고 정렬될 때(필요한 경우, 갭 도입), 동일하거나 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 특정한 퍼센트를 가지는, 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 얻기 위해 사용된 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 당해 분야에 공지되어 있다. 서열 정렬 알고리즘의 이러한 비제한적인 일 예는 문헌[Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-7]에서 변헝된 바대로 문헌[Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-8]에 기재되고, NBLAST 및 XBLAST 프로그램(Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-402)으로 통합된, 알고리즘이다. 소정의 실시형태에서, 갭핑된 BLAST는 문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-402]에 기재된 바대로 사용될 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2(Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-80), ALIGN, ALIGN-2(Genentech(캘리포니아주 사우쓰 프란시스코) 또는 Megalign(DNASTAR)은 서열을 정렬하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 공중에게 이용 가능한 소프트웨어 프로그램이다. 소정의 실시형태에서, 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어에서 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다(예를 들어, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 90의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용). 소정의 대안적인 실시형태에서, Needleman 및 Wunsch의 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:444-53 (1970))을 통합한 GCG 소프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램은 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5의 사슬 중량을 사용). 대안적으로, 소정의 실시형태에서, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Myers 및 Miller의 알고리즘(CABIOS, 4:11-7 (1989))을 이용하여 결정된다. 예를 들어, 퍼센트 동일성은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 그리고 잔기 표를 가지는 PAM120, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 결정될 수 있다. 특정한 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬에 대한 적절한 매개변수는 당해 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 매개변수를 사용한다. 소정의 실시형태에서, 제2 서열 아미노산에 대한 제1 아미노산 서열의 퍼센트 동일성 "X"는 100 x(Y/Z)(식 중, Y는 제1 서열 및 제2 서열의 정렬에서 동일한 일치로 점수매겨진 아미노산 잔기의 수(시각 검사 또는 특정한 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)이고, Z는 제2 서열에서의 잔기의 전체 수임)로서 계산된다. 제2 서열이 제1 서열보다 길 때, 퍼센트 동일성은 상기 제1 서열과 제2 서열 사이의 중첩의 구역에서만 결정될 수 있다. 이 경우에, 상기와 같은 동일한 식이 그러나 제1 서열 및 제2 서열이 중첩하는 구역의 길이를 Z 값으로서 사용하여 사용될 수 있고, 상기 구역은 제1 서열의 길이와 실질적으로 동일한 길이를 가진다.
비제한적인 예로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오타이드가 기준 서열에 대해 소정의 퍼센트 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 및 몇몇 실시형태에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일)을 가지는지는 소정의 실시형태에서 Bestfit 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다(Wisconsin Sequence Analysis Package, 유닉스용 버전 8, Genetics Computer Group(위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크)). Bestfit는 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Advances in Applied Mathematics 2:482-9 (1981))을 사용하여, 2개의 서열 사이의 상동성의 최고의 분절을 확인한다. 특정한 서열이 예를 들어 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한지를 결정하기 위해 Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용할 때, 매개변수는 동일성의 퍼센트가 기준 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고, 기준 서열에서의 뉴클레오타이드의 전체 수의 5% 이하의 상동성에서의 갭이 허용되도록 설정된다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 2개의 핵산은 실질적으로 동일하여서, 이들이 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 때 최대 상관성에 대해 비교되고 정렬될 때 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 몇몇 실시형태에서 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가진다는 것을 의미한다. 동일성은 길이가 적어도 약 10개, 약 20개, 약 40 내지 60개의 잔기 또는 이들 사이의 임의의 간격 값인 서열의 구역에 걸쳐 존재할 수 있고, 60 내지 80개의 잔기보다 긴 구역, 예를 들어, 적어도 약 90 내지 100개의 잔기에 걸쳐 일 수 있고, 몇몇 실시형태에서, 서열은 예를 들어 뉴클레오타이드 서열의 코딩 구역과 예컨대 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 실질적으로 동일하다.
용어 "특이적 결합" 또는 "TLR-4에 대한 특이적 결합"은, 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 압타머 및 수용체 TLR-4인 2개의 분자 사이의 비공유 물리적 회합을 의미한다. 본 발명의 압타머와 수용체 TLR-4 사이의 결합은 둘 다 사이의 결합 강도가 본 발명의 압타머와 관련 분자 사이의 결합 강도의 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 75배 또는 적어도 100배 초과인 경우 특이적이라 생각된다. 본 발명의 압타머와 수용체 TLR-4 사이의 결합은 사용되는 조건 하에, 예를 들어 생리학적 조건, 세포 배양 조건 또는 세포 생존을 허용하는 조건에서 평형 해리 상수 Kd가 10-3M 이하, 10-4M 이하, 10-5M 이하, 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 10-11M 이하, 또는 10-12M 이하일 때 또한 특이적이라 생각된다.
TLR-4에 특이적으로 결합하는 본 발명의 압타머의 능력은 당해 분야에 이용 가능한 검정의 범위에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, TLR-4에 대한 특이적 결합에 대한 본 발명의 압타머의 능력은 시험관내 결합 검정, 예컨대 효소 연결 올리고뉴클레오타이드 검정(ELONA), 효소 연결 압타머 수착 검정(ELASA), 침전 및 정량적 PCR(qPCR)에 의해, 또는 형광 기법, 예컨대 압타조직화학(aptahistochemistry), 압타세포화학(aptacytochemistry), 형광 현미경관찰법 또는 유세포분석법에 의해 결정된다. 마찬가지로, TLR-4에 대한 특이적 결합 및 TLR-4에 대한 압타머의 친화도의 능력 둘 다는 당해 분야의 당업자에 의해 널리 공지된 기법, 예컨대 겔 이동성 이동 검정, 표면 플라스몬 공명(SPR), 동역학 모세혈관 전기영동 및 형광 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 간단히 말하면, 형광 결합 검정은 (예를 들어, 카복시플루오레세인, FAM에 의해) 표지된 본 발명의 압타머의 상이한 농도(예를 들어, 0 내지 100nM)와 TLR-4에 의해 코팅된 자석 볼의 항온처리, 및 결합된 압타머의 후속하는 용리 및 검출로 이루어지고; 해리 상수(Kd)는 비선형 피트 분석에 의해 계산된다.
용어 "TLR-4의 저해"는, 본 발명의 맥락에서, TLR-4의 활성의 차단 또는 감소, 즉 수용체 TLR-4 매개된 신호의 전달을 의미한다. TLR-4의 활성은, 이의 활성이 이의 천연 작용제 LPS의 존재 하에 TLR-4의 활성의 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 적어도 15%, 적어도 10%, 적어도 5%, 적어도 1% 이하일 때, 저해제 또는 길항제에 의해 저해되는 것으로 생각된다.
TLR-4를 저해하는 본 발명의 압타머의 능력은 당해 분야에서 이용 가능한 검정의 범위에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 압타머의 TLR-4를 저해하는 능력은 재조합 TLR-4를 발현하는 세포 및 리포터 유전자(이의 발현은 재조합 TLR-4의 활성화와 연관됨)에 의해 시험관내 검정에 의해 결정된다. 당해 분야의 당업자는 사용된 세포 및 재조합 유전자에 따라 이 방법의 다수의 변이체가 존재한다는 것을 인식할 것이다. 이 검정의 예는 본 발명의 실시예("재료 및 방법" 및 실시예 2에서의 부문)에 포함된다. 다른 이용 가능한 기법은 염증성 사이토카인, 예컨대 TLR-4를 발현하는 세포에 의해 방출된 IL-1, IL-8, TNF-알파 및 IL-12의 수준의 결정을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 압타머는 30개 내지 200개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 35개 내지 150개의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 40개 내지 100개의 뉴클레오타이드, 훨씬 더 바람직하게는 45개 내지 80개의 뉴클레오타이드로 이루어진다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 본 발명의 압타머는 서열번호 3(GTTGCTCGTATTTAGGGCCACCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCAGGTCGACACCAGTCTTCATCCGC) 및 서열번호 4(GCGGATGAAGAC TGGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCGGTTGGCCCTAAATACGAGCAAC)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 서열번호 3의 서열은 서열번호 1의 작용상 동등한 변이체이고, 서열번호 4의 서열은 서열번호 2의 작용상 동등한 변이체이다.
특정한 실시형태에서, 핵산은 DNA이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 핵산은 RNA이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 핵산은 PNA이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 핵산은 LNA이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 핵산은 TNA이다.
또 다른 특정한 실시형태에서, TLR-4는 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 고양이, 개, 말, 영장류 및 인간 TLR-4에 의해 형성된 군으로부터 선택된 TLR-4이다. 바람직한 실시형태에서, TLR-4는 인간 TLR-4이다.
본 발명의 압타머의 제조는 당해 분야에서 종래의 방법에 따라 수행될 수 있다. 압타머의 제조를 위한 기법의 비제한적인 예는 효소 기법, 예컨대 전사, 재조합 발현 시스템 및 표준 고상(또는 용액상) 화학 합성(모두 상업적으로 구입 가능)을 포함한다. 적절할 때, 예를 들어, 본 발명의 압타머가 핵산 변이체, 예컨대 상기 기재된 것, 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격 변형 등을 가지는 유사체를 포함하는 경우에, 본 발명의 압타머는 화학 합성에 의해 제조될 것이다. 대안적으로, 발현은 상기 압타머가 200개 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 때 압타머의 제조에 바람직한 기법일 것이다. 임의의 상기 기법 또는 이에 의해 제조된 압타머는 당해 분야에서 널리 공지된 방법에 의해 임의로 정제될 수 있다.
본 발명의 복합체
당해 분야의 당업자가 이해하는 것처럼, 본 발명의 압타머의 작은 크기, 안정성 및 용이한 제조의 특징은 제시된 상기 압타머가 제2 분자에 결합하게 한다. 이것은 제2 분자가 작용상 그룹일 때 특히 유리하다. 본 발명의 압타머 및 작용상 그룹의 결합의 결과는 둘 다의 기능의 조합을 제시하는 복합체, 즉 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력 및 작용상 그룹과 연관된 활성을 가지는 복합체이다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지는 핵산 압타머, 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는, "본 발명의 복합체"로서 이하 칭하는 복합체를 의미한다.
용어 "압타머"는 정의 및 TLR-4에 특이적인 압타머(상기)와 관련하여 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 마찬가지로 본 발명의 복합체의 맥락에서 적용된다.
용어 "작용상 그룹"은, 본 발명의 맥락에서, 적어도 하나의 기능을 수행하기에 적합한 화합물을 의미한다. 상기 기능은, 제한 없이, TLR-4 또는 다른 수용체 TLR에 특이적으로 결합하는 능력, TLR-4 또는 다른 수용체 TLR을 저해하는 능력, 직접적으로 및 간접적으로 둘 다로 검출 가능한 능력, 세포사를 유도하는 능력, 치료학적 페이로드를 보유하는 능력 등을 포함한다. 당해 분야의 당업자가 이해하는 것처럼, 작용상 그룹은 하나 또는 다수의 기능과 이와 관련될 수 있다. 작용상 그룹의 비제한적인 예는 검출 가능한 시약 및 약물을 포함한다. 이 작용상 그룹은 영상화제, 약물 등과 같이 작용한다.
따라서, 특정한 실시형태에서, 작용상 그룹은 검출 가능한 시약, 약물 및 나노입자로부터 선택된다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 작용상 그룹은 검출 가능한 시약이다. 용어 "검출 가능한 시약", "영상화제" 및 "조영제"는 본 명세서에서 상호교환되어 사용되고, 생체적합성 화합물을 의미하고, 이의 사용은 영상의 다른 구역 사이의 "대조"를 증가시킴으로써 영상의 다른 부분의 구별을 촉진한다. 용어 "조영제"는 따라서 (예들 들어, MRI에서의 경우처럼) 그럼에도 불구하고 이러한 물질의 부재 하에 생성될 수 있는 영상의 품질을 증대시키기 위해 사용되는 물질, 및 (예들 들어, 핵 영상화의 경우에서처럼) 영상의 생성에 전제조건인 물질을 포함한다. 적합한 조영제는, 제한 없이, 방사성핵종 영상화, 컴퓨터단층촬영법(CT), 라만 분광학, 자기 공명 영상화(MRI) 및 광학 영상화를 위한 조영제를 포함한다.
방사성핵종 영상화를 위해 검출 가능한 시약은 예컨대 11C, 13N, 15O, 18F, 82Rb, 62Cu, 64Cu, 및 68Ga86Y, 124I, 213Bi 및 211At와 같은 포지트론 에미터에 의해 보통 표지된 방사성약물을 포함한다. SPECT 방사성약물은 94mTc, 201Tl 및 67Ga와 같은 포지트론 에미터에 의해 보통 표지된다. 방사성핵종 영상화 양상(포지트론 방출 단층촬영(PET); 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT))은 방사성핵종 표지된 방사성 트레이서의 위치 및 농도를 맵핑하는 진단학적 횡단면 영상화 기법이다. PET 및 SPECT는 대사 활성을 측정함으로써 방사성핵종을 국소화하고 규명하도록 사용될 수 있다. PET 및 SPECT는 세포 수준의 정보에 속하는 정보, 예컨대 세포 생존능력을 제공한다. PET에서, 포지트론 에미터는 신체를 통해 물질이 이동하면서 모니터링될 수 있는 환자에게 투여된다. 본 발명의 소정의 실시형태에서, 본 발명에 따른 복합체는 생체내 PET 또는 SPECT 영상화에 사용된다. 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영, 또는 SPECT는 PET에 밀접하게 관련된다. 2개 사이의 주요한 차이는 포지트론 방출 물질 대신에, SPECT는 저에너지 광자를 방출하는 방사성 트레이서를 사용한다는 것이다. 방사성핵종의 다른 비제한적인 예는 감마 카메라 또는 컴퓨터 단일 광자 방출 단층촬영을 사용하여 방사성신티그래피에서 사용될 수 있는 감마 방출 동위원소, 예컨대 99mTc, 123I 및 111In, 및 베타 에미터, 예컨대 131I, 90Y, 99mTc, 177Lu 및 67Cu를 포함한다. 당해 분야의 당업자는 방사성핵종이 치료학적 목적을 위해 또한 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
CT 영상화를 위해 검출 가능한 시약은 예를 들어 요오드화 또는 브롬화 조영제를 포함한다. 이러한 물질의 예는 이오탈라메이트, 이오헥실, 디아트리조에이트, 이오파미돌, 에티오돌 및 이오파노에이트를 포함한다. 가돌리늄 물질은 CT 조영제로서 사용되는 것으로 또한 보고되어 있다. 예를 들어, 가도펜테이트 물질은 CT 조영제로서 사용된다. 컴퓨터단층촬영법(CT)은 본 발명의 맥락에서 영상화 양상으로서 고려된다. 때때로 다양한 각도로부터 수천 개의 일련의 X선을 취하고, 이후 이를 컴퓨터와 조합함으로써, CT는 신체의 임의의 부분의 3차원 영상을 만들 수 있게 하였다. 컴퓨터는 임의의 각도로부터 및 임의의 깊이에서 2차원 슬라이스를 나타내도록 프로그래밍된다. CT에서, 방사선불투과성 조영제, 예컨대 본 명세서에 기재된 것의 정맥내 주사는 초기 CT 스캔이 진단학적이 아닐 때 연조직 덩어리의 확인 및 경계확정을 보조할 수 있다.
광학 영상화를 위한 검출 가능한 시약은 예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 유도체, 인도사이아닌 그린, 오레곤 그린, 오레곤 그린의 유도체, 로다민 그린, 로다민 그린의 유도체, 에오신, 에리쓰로신, 텍사스 레드, 텍사스 레드의 유도체, 말라사이트 그린, 나노골드 설포숙신이미딜 에스터, 케스케이드 블루, 쿠마린 유도체, 나프탈렌, 피리딜옥사졸 유도체, 케스케이드 옐로우 염료, 다롭실 염료, 및 다양한 다른 형광성 화합물, 예컨대 Cy3, Cy2, Cy5, 알렉사 플루오르(등록상표) 형광성 라벨 패밀리(Molecular Probes, Inc.), 카복시플루오레세인(FAM) 및 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC)를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출 가능한 시약은 단백질이다. 용어 "단백질"은, 본 발명의 맥락에서, 하나 이상의 아미노산 사슬로 이루어진 거대분자를 의미한다. 단백질은 다른 분자에 특이적으로 결합하는 능력에 기초하여 다양한 그룹의 세포 기능을 수행하는 것을 담당한다. 단백질은 다른 단백질, 및 작은 기질 분자에 결합할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 적합한 단백질의 비제한적인 예는, 제한 없이, 효소, 형광성 단백질, 발광성 단백질 및 항원을 포함한다.
훨씬 더 바람직한 실시형태에서, 단백질은 효소이다. 용어 "효소"는, 본 발명의 맥락에서, 매우 선택적인 촉매로서 작용하고, 이것이 특이적인 대사 반응의 속도 및 특이성 둘 다를 가속시키는 단백질을 의미한다. 본 발명에 적합한 효소의 비제한적인 예는, 제한 없이, 겨자무 과산화효소(HRP) 및 알칼리 포스파타제를 포함한다. 당해 분야의 당업자가 이해하는 것처럼, 본 발명에서 사용하기에 적합한 효소는 비색법, 화학발광법 또는 형광측정법에 의해 검출 가능한 화합물에서 기질의 변형을 촉진하는 이의 능력의 결과로서 간접적으로 검출 가능하다. 적합한 기질의 예는, 제한 없이, p-나이트로페닐 포스페이트(PNPP), 2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산](ABTS), o-페닐렌다이아민(OPD), 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 포함한다.
생물발광성 단백질 또는 광단백질은 이전의 여기를 요하지 않으면서 광 방출을 생성하는 이의 특정한 보결분자단의 화학 반응을 수행할 수 있는 산화 효소의 특정한 경우이다. 생물발광성 단백질의 비제한적인 예는 반딧불이 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제 및 아에쿼린을 포함한다.
또 다른 훨씬 더 바람직한 실시형태에서, 단백질은 형광성 단백질이다. 용어 "형광성 단백질"은, 본 발명의 맥락에서, 여기에 적합한 파장에서 이것이 여기될 때 광을 방출하는 능력을 가지는 단백질을 의미한다. 본 발명의 복합체에서 사용될 수 있는 형광성 단백질의 비제한적인 예는 제한 없이 GFP, GFPuv, BFP, CFP, YFP, EBFP2, mCerulean, mCerulean3, mVenus, mTurquoise, T-Sapphire, 시트린, amFP486, zFP506, zFP538, drFP, DsRed, mCherry, dTomate, mTFP1, TagRFP-T, mKO2, mRuby, mKate, mAmetrine, REACh, R-피코에리트린(R-PE) 및 알로피코사이아닌(APC)을 포함한다.
또 다른 훨씬 더 바람직한 실시형태에서, 단백질은 발광성 단백질이다. 용어 "발광성 단백질"은, 본 발명의 맥락에서, 여기에 적합한 파장에서 이것이 여기될 때 광을 방출하는 능력을 가지는 단백질을 의미한다. 본 발명의 복합체에서 사용될 수 있는 형광성 단백질의 비제한적인 예는, 제한 없이, 이의 상응하는 여기 및 방출 파장과 함께 표 1에 포함된 단백질이다.
또 다른 훨씬 더 바람직한 실시형태에서, 단백질은 항원이다. 용어 "항원"은, 본 발명의 맥락에서, 신체에서 면역 반응을 유도하는 분자를 의미한다. 따라서, 항원은 항원을 인식하고 이것에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 항원의 비제한적인 예는 특히 종양 항원, 예컨대 암태아 항원(CEA), HER2, 전립선 특이적 항원(PSA) 및 조직 플라스미노겐 활성제 및 이의 재조합 변이체, 예컨대 액티바제(Activase)(등록상표), 및 박테리아 항원, 알레르겐 등을 포함한다. 당해 분야의 당업자가 이해하는 것처럼, 본 발명에서 사용하기에 적합한 항원은 항체에 의해 특이적으로 인식되는 이의 능력의 결과로서 간접적으로 검출 가능하다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출 가능한 시약은 합텐이다. 용어 "합텐"은, 본 발명의 맥락에서, 항원성이지만 스스로 특정한 면역 반응을 유도할 수 없는 작은 분자 크기(10,000Da 미만)를 가지는 화학 화합물의 그룹을 의미한다. 담체라 불리는 큰 면역원성 단백질에 대한 합텐의 화학 커플링은 특정한 면역 반응을 유도할 수 있는 합텐-면역원성 캐리어 접합체를 생성한다. 비타민의 비제한적인 예는 바이오틴(비타민 B7), 다이곡시제닌, 다이나이트로페놀(DNP) 및 나이트로-요오도페놀(NIP)을 포함한다. 더 바람직한 실시형태에서, 비타민은 바이오틴이다. 용어 "바이오틴"은, 본 발명의 맥락에서, Kd = 10-15M의 속도로 기재된 가장 높은 친화도로 아비딘에 대한 특이적 결합을 특징으로 하는, 비타민 H 및 비타민 B7로도 불리는, 물- 및 알콜-가용성 열 안정 비타민을 의미한다. 당해 분야의 당업자가 이해하는 것처럼, 바이오틴은 아비딘 또는 이의 변이체, 예컨대 스트렙타비딘 및 뉴트라비딘에 의해 특이적으로 인식되는 이의 능력의 결과로서 간접적으로 검출 가능하다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 작용상 그룹은 약물이다. 용어 "약물"은, 본 발명의 맥락에서, 질환 또는 병태, 예컨대 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료, 치유 또는 예방에서 사용되는 화학 물질을 의미한다. 용어 "TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학"은 본 발명의 의학 용도의 맥락에서 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다.
당해 분야의 당업자는 어떠한 물질이 특히 질환의 치료에 적응증이 있는지 즉시 알 것이다. TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료에 적응증이 있는 거의 모든 물질이 본 발명의 복합체에 포함될 수 있지만, TLR-4 길항제 물질 및 소염제가 특히 바람직하다. 다양한 유형의 약물이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있지만, 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 약물이, 제한 없이, TLR-4 길항제, 예컨대 날록손, 날트렉손, LPS, 이부딜라스트, 프로펜토필린, 아미트립틸린, 케토티펜, 사이클로벤자프린, 미안세린 및 이미프라민; 항혈소판 약물, 예컨대 아스피린 및 클로피도그렐; 항응고제, 예컨대 헤파린, 아세노쿠마롤, 와파린, 다비가트란 및 리바록사반; 및 항산화제, 예컨대 에다라본을 포함하는 군으로부터 선택된다는 것을 고려한다. 이것이 이미 검출 가능한 시약의 맥락에서 언급되어 있지만, 조직 플라스미노겐 활성제 및 이의 재조합 변이체는 이의 혈전용해 작용으로 인해 약물로서 마찬가지로 고려될 수 있다.
본 발명은 약물이 핵산인 것을 고려한다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 약물은 핵산이다. 본 발명의 맥락에서의 약물 복합체로서 적합한 핵산은, 제한 없이, NFKB1, RIPK3, IFNB1, LY96( MD -2), IRF3, TLR3, TIRAP ( Mal ), TICAM1(TRIF), RIPK1, TRAF6, CD14, TRAM, IKBKG ( IKK -감마), IFNA1 및 TLR4 유전자를 포함하는 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학에 관여하는 유전자의 발현을 침묵화시키는 능력을 가지는 안티센스 RNA, 안티센스 DNA 및 소형 간섭 RNA를 포함한다. 용어 "안티센스 RNA"는, 본 발명의 맥락에서, 뉴클레오타이드 서열이 표적 메신저 RNA에 상보성이어서, 각각의 유전자의 발현을 방해하는, 단일 가닥 RNA를 의미한다. 용어 "안티센스 DNA"는, 본 발명의 맥락에서, 뉴클레오타이드 서열이 표적 메신저 RNA에 상보성이어서, 각각의 유전자의 발현을 방해하거나 침묵시키는, 단일 가닥 DNA를 의미한다. 용어 "소형 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는, 본 발명의 맥락에서, 이의 표적 메신저 RNA의 뉴클레오타이드 서열에 매우 특이적이어서, 각각의 유전자의 발현을 방해하는, 20개 내지 25개의 뉴클레오타이드의 길이를 가지는, 이중 가닥 RNA를 의미하다.
본 발명은 약물이 펩타이드라는 것을 고려한다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 약물은 펩타이드이다. 용어 "펩타이드"는, 본 발명의 맥락에서, 펩타이드 결합에 의해 결합된 아미노산의 짧은 사슬을 의미한다. 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산, 적어도 3개의 아미노산, 적어도 4개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 30개의 아미노산, 적어도 40개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 60개의 아미노산, 또는 적어도 70개의 아미노산을 포함할 것이다. 표적에 결합하고 세포 신호전달을 유도하거나 저해하는 능력을 가지는 펩타이드가 특히 본 발명의 목적을 위해 적합하다. 용어 "표적 결합 펩타이드"는, 본 발명의 맥락에서, 표적 결합 구역을 포함하는 펩타이드를 의미한다. 용어 "신호전달 펩타이드"는, 본 발명의 맥락에서, 세포 신호전달을 자극하는 능력을 가지는 펩타이드, 예컨대 세포 수용체 작용제 펩타이드를 의미한다. 표적 분자 결합에 적합한 아미노산 서열은 당해 분야에 널리 공지된 분자 재인식 공통 서열을 포함한다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 작용상 그룹은 나노입자이다. 용어 "나노입자"는, 본 발명의 맥락에서, 유체(수성 용액) 중에 분산된, 구조화된 구조(이합체, 삼합체, 사면체 등)를 형성하는 것으로 개별적으로 발견되거나 발견된, 1마이크로미터(㎛) 미만의 크기를 가지는, 구형 유형, 봉 유형, 다면체 유형 등, 또는 유사한 형성의 콜로이드 시스템을 의미한다. 특정한 실시형태에서, 본 발명을 입자로 되게 하기에 적합한 나노입자는 일반적으로 1 내지 999나노미터(㎚), 통상적으로 5 내지 500㎚, 바람직하게는 약 10 내지 150㎚를 포함하는 1㎛ 미만의 크기를 가진다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 나노입자는 통상적으로 2 내지 50㎚, 바람직하게는 5 내지 20㎚의 범위, 더 바람직하게는 13㎚의 평균 입자 직경을 가진다. 평균 입자 직경은 입자가 반드시 구형일 필요는 없다는 이해로 최대 평균 입자 치수이다. 상기 나노입자의 형상은 광범위하게 변할 수 있고; 유리하게는, 상기 나노입자는 임의의 광학적으로 효과적인 형상, 예컨대 구형, 봉, 별, 입방체, 다면체 또는 임의의 다른 변형, 및 여러 입자의 복잡한 회합을 채용할 것이고; 특정한 실시형태에서, 본 발명을 입자로 되게 하기에 적합한 나노입자의 형상은 구형 또는 실질적으로 구형이다. 형상은 종래의 광에 의해 또는 전자 현미경관찰법 기법에 의해 적합하게 평가될 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 나노입자는 중합체 나노입자, 지질 나노입자 및 금속 나노입자를 포함한다.
중합체 나노입자는 압타머에 부착된 중합체 매트릭스에 의해 형성된다. 본 발명에 따른 중합체 나노미립자에서 유용할 수 있는 생체적합성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리언하이드라이드, 폴리하이드록시산, 폴리프로필퓨마레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아마이드, 폴리아세탈, 폴리에터, 폴리에스터, 폴리(오르토에스터), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리유레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리유레아, 폴리스타이렌, 또는 폴리아민, 폴리글루타메이트, 덱스트란, 폴리언하이드라이드, 폴리유레탄, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트 또는 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리다이옥사논(PDO), 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리하이드록시뷰티레이트, 폴리(글라이세롤 세바케이트), 폴리글라이콜라이드, 폴리락타이드, PLGA, 폴리카프로락톤 또는 이들의 조합을 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 나노입자는 지질 나노입자, 예컨대 리포솜 또는 미셀일 수 있다. 예를 들어 베시클 형성 지질로부터의 미셀 및 리포솜의 형성은 당해 분야에 공지되어 있다. 베시클 형성 지질은 이의 겔-대-액체 결정질 단계 전이 온도 범위 초과로 지질 이중층을 저절로 형성하는 지질을 의미한다. 이러한 지질은 통상적으로, 자발적인 이중층 형성을 허용하는, 예컨대 라멜라 단계로 충전을 허용하는 이의 소수성 및 친수성 부분의 동일한 횡단면 면적에 가까운, 소정의 특징을 가진다. 지질 이중층, 예컨대 콜레스테롤 및 이의 다양한 유사체로 안정하게 혼입할 수 있는 지질은 이중층 형성 동안 지질 이중층으로 편입될 수 있다. 베시클 형성 지질은 바람직하게는 극성 또는 비극성인, 2개의 탄화수소 사슬, 통상적으로 아실 사슬, 및 헤드 기를 가지는 지질이다. 2개 탄화수소 사슬이 통상적으로 약 14개 내지 22개 길이의 탄소 원자이고, 포화 또는 다양한 정도의 불포화인, 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 및 스핑고미엘린을 포함하는 다양한 합성 베시클 형성 지질 및 천연 발생 베시클 형성 지질이 존재한다. 아실 사슬이 다양한 정도의 포화를 가지는 상기 기재된 지질 및 인지질은 공개 방법에 따라 상업적으로 얻어지거나 제조될 수 있다. 다른 적합한 지질은 인지질, 스핑고지질, 글라이코리피드, 및 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함한다.
용어 "리포솜"은 수상을 캡슐화하는 하나 이상의 동심으로 순서화된 지질 이중층으로 이루어진 베시클을 의미한다. 수상은 통상적으로 표적 부위로 전달되는 화합물을 함유한다. 표적 부위에 도달 시, 리포솜은 표적 세포, 즉 TLR-4를 발현하는 세포의 혈장 막과 융합하여, 세포기질로 화합물을 방출한다. 대안적으로, 리포솜은 수송 비시클의 내용물(예를 들어, 엔도솜 또는 파고솜)로서 표적 세포에 의해 세포섭취되거나 그렇지 않으면 취해진다. 수송 비시클에서, 리포솜은 분해되거나 베시클의 막과 융합하고, 이의 내용물을 방출한다. 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예컨대 음파처리, 압출, 고압/균질화, 미세유동화, 세제 투석, 작은 리포솜 비히클의 칼슘 유도 융합 및 에터 융합 방법(이들 모두 당해 분야에 널리 공지됨)은 리포솜을 제조하기 위해 이용 가능하다.
중합체 및 지질 나노입자는 입자가 면역계 성분에 의해 재인식을 피하도록 허용하고 입자 순환 반감기를 증가시킬 수 있는 입자에 대한 쉘을 형성하는 중합체 재료 또는 쉘 재료를 둘러싸는 양친매성 화합물의 코팅을 추가적으로 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 나노입자는 금속 나노입자일 수 있다. 용어 "금속 나노입자"는 금속을 포함하고, 표면 플라스몬 현상으로 공지된 광학 특성을 나타내는 나노입자, 즉 플라스몬 금속을 의미한다. 이 현상은, 공명 조건이 상기 전자에서 발생하는 파장에서 자외선-가시광선 스펙트럼(금속 및 나노입자의 크기에 통상적)에 위치한 흡수 밴드를 생성하는, 금속 표면의 전자의 집단 진동으로 이루어진다. 금속의 표면 플라스몬은 당해 분야의 최신에서 공지된 임의의 스펙트럼분석 기법, 예컨대 표면 플라스몬 공명(SPR) 분광학에 의해 결정될 수 있고, 이로써 금속 원자는 이것이 광자 빔으로 처리될 때 금속 원자의 굴절률의 변동의 검출에 기초하여 전자기 빔 또는 표면 플라스몬 공명 형광 분광학(SPFS)으로 처리된다. 본 명세서에 정의된 바대로, "플라스몬 금속"은 표면 플라스몬 현상으로 공지된 광학의 특성을 나타냄으로써 규명된 금속이다. 이것이 이의 각각의 근거리의 커플링을 발생시켜, 새로운 표면 플라스몬을 생성한다는 것을 고려하면, 여러 나노입자가 서로에 가깝게 위치할 때 플라스몬 반응의 변동은 특히 명확하다. 바람직한 실시형태에서, 상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 백금, 철, 코발트, 팔라듐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다
금속 나노입자의 바람직한 실시형태는 금속 코어 및 다공성 쉘을 함유하는 코어-쉘 나노입자이다. 코어-쉘 금속 나노입자의 예는 당해 분야에 널리 공지된 자기 메조다공성 실리카 나노입자를 포함한다. 따라서, 특히 바람직한 실시형태에서, 나노입자는 자기 메조다공성 실리카 나노입자이다.
나노입자는 이의 표면에 코팅을 첨가함으로써 작용상 그룹화될 수 있다. 생물학적 분야의 경우, 표면 코팅은 높은 수성 용해도를 제공하고 나노입자 응집을 방지하도록 극성이어야 한다. 혈청에서 또는 세포 표면에서, 매우 하전된 코팅은 비특이적 결합을 촉진하지만, 말단 하이드록실 또는 메톡시기에 연결된 폴리에틸렌 글라이콜은 비특이적 상호작용을 밀어낸다.
압타머는 바람직하게는 나노입자 표면에서 공유 연결에 의해 이상적으로 나노입자에 연결될 수 있다. 바람직하게는, 압타머는 나노입자당 제어된 수로 존재해야 한다.
본 발명의 복합체를 형성하기 위한 본 발명의 압타머와 작용상 그룹 사이의 결합은 당해 분야의 당업자에 의해 널리 공지된 공액 기법에 의해 수행될 수 있다. 결과는 본 발명의 압타머와 작용상 그룹 사이의 공유 결합이다. 공액은 압타머의 화학 합성 동안 작용상 그룹에 대한 본 발명의 압타머의 3' 또는 5' 말단의 1차 아민의 결합을 수반할 수 있다. 대안적으로, 공액은 뉴클레오타이드 자체의 아릴 아민과 관련하여 1차 알킬-아민 표지의 훨씬 더 큰 화학 반응성의 이점을 가지는 종래의 가교결합 반응에 의해 수행될 수 있다. 공액의 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 가교결합 시약의 사용에 기초한다. 가교결합 시약은 공액하고자 하는 분자에서 1차 아민, 설프하이드릴, 알데하이드, 카복실, 하이드록실, 아자이드 및 기타 등등과 같은 기를 표적화하는 적어도 2개의 반응성 기를 함유한다. 가교결합제는 이의 화학 특이성, 스페이서 암 길이, 스페이서 암 조성물, 절단 스페이서 암 및 구조에서 다르다. 예를 들어, 본 발명에 따른 복합체의 공액은 직접적으로 또는 연결 모이어티를 통해, 압타머 및/또는 작용상 그룹에서의 하나 이상의 비작용상 그룹, 예컨대 아민, 카복실, 페닐, 티올 또는 하이드록실 기를 통해 수행될 수 있다. 더 선택적인 결합은 이종이작용성 링커의 사용에 의해 달성될 수 있다. 종래의 연결제, 예컨대 다이아이소사이아네이트, 다이아이소티오사이아네이트, 비스(하이드록시숙신이미드) 에스터, 카보다이이미드, 말레이미드-하이드록시숙신이미드 에스터, 글루타르알데하이드 등, 또는 하이드라진 및 하이드라자이드, 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐) 뷰티르산 하이드라자이드(MPBH)를 사용할 수 있다.
또 다른 접근법은 예를 들어 형광단에 의해 표지된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 합성 동안 압타머를 표지하는 것으로 이루어진다. 이를 위해, 당해 분야의 당업자에게 이용 가능한 다양한 상업용 기관이 존재한다.
추가적으로, 작용상 그룹이 방사성핵종인 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따른 압타머와 방사성핵종 사이의 결합은 화학 배위에 의해 수행될 수 있고, 여기서 결합에 관여한 압타머의 원자는 방사성핵종에 전자를 공여한다. 배위 반응은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 압타머에 관여한 반응성 기 및 방사성핵종에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 시험관내 사용
A. TLR -4를 검출하기 위한 시험관내 용도
본 발명은 또한 TLR-4를 검출하기 위해 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체, 및 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체의 시험관내 용도를 고려한다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은, TLR-4를 검출하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체의 시험관내 용도에 관한 것이다.
따라서, TLR-4에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 압타머의 능력은 본 발명에 따른 압타머를 통해 TLR-4의 간접 검출에 이용될 수 있다. 이 목적을 위해, 당해 분야의 당업자는 상기 압타머의 후속하는 검출이 필요하다는 것을 인식할 것이다. 압타머 검출 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 압타머에 특이적인 항체 또는 프로브의 용도를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 압타머가 TLR-4에 결합하면, 결국 검출 가능한 시약에 의해 표지될 수 있거나, 2차 항체 또는 프로브에 의해 간접적으로 검출될 수 있는, 압타머에 특이적인 항체 또는 프로브가 적용될 것이다. TLR-4를 검출하기 위해 사용된 기법은 이후 예를 들어 형광측정법, 비색법 또는 방사성에 기초한 기법일 수 있는 검출 가능한 시약의 유형에 따라 달라질 것이다.
용어 "프로브" 또는 "혼성화 프로브"는, 본 발명의 맥락에서, 프로브에서 서열이 상보성인 단일 가닥 핵산(DNA 또는 RNA)의 존재를 검출하기 위해 사용된, 가변 길이 DNA 또는 RNA 단편, 일반적으로 10개 내지 1000개 길이의 염기를 의미한다. 프로브는 표적 단일 가닥 핵산에 혼성화하고, 이의 염기 서열은 프로브와 표적 핵산 사이의 상보성으로 인해 염기 쌍지음을 허용한다. 이의 표적 서열에 대한 프로브의 혼성화를 검출하기 위해, 프로브는 특히 검출 가능한 시약, 예컨대 방사성핵종, 형광단 또는 다이곡시제닌에 의해 표지된다.
본 발명의 압타머에 의한 TLR-4의 검출은 시험관내 결합 검정, 예컨대 효소 연결 올리고뉴클레오타이드 검정(ELONA), 효소 연결 압타머 수착 검정(ELASA), 침전 및 정량적 PCR(qPCR), 겔 이동성 이동 검정, 웨스턴 블로팅, 표면 플라스몬 공명(SPR), 동역학 모세혈관 전기영동, 형광 결합 검정, 압타조직화학, 압타세포화학, 형광 현미경관찰법 또는 유세포분석법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 시험관내 용도의 또 다른 특정한 실시형태에서, TLR-4의 검출은 ELONA, 압타세포화학, 압타조직화학 및 유세포분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행된다.
용어 "ELONA" 또는 "효소 연결 올리고뉴클레오타이드 검정"은, 본 발명의 맥락에서, 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)과 유사한 기법을 의미하고, 여기서 TLR-4의 경우에 관심 있는 분자를 검출하기 위해 사용된 항체는 상기 분자에 특이적인 검출 압타머에 대해 교환된다. ELISA 검정은 표적 항원과 표지된 항체 사이에 형성된 복합체가 효소 활성 복합체에 의해 형성되도록 예를 들어 효소에 의해 표지된 항원 또는 항체의 용도에 기초한다. 성분 중 하나, 이 경우에 항원이 캐리어에서 부동화되므로, 항원:항체 복합체는 캐리어에 부동화되고, 따라서 효소에 특이적인 기질의 첨가에 의해 검출될 수 있다. ELONA의 경우에, 검출 압타머는 효소에 공유 결합될 수 있거나, 이것은 효소에 접합된 압타머에 특이적인 2차 항체에 의해 그 자체로 검출될 수 있다. 상기 효소는 가시적인 신호를 생성하기 위해 특이적 기질의 변환을 촉매한다. 이 기법은 또 다른 검출 가능한 시약, 예컨대 형광단에 대해 효소를 교환하기 위해 변형될 수 있다. 용어 ELONA 및 ELASA, 또는 효소 연결 압타머 수착 검정은 본 명세서에서 상호교환되어 사용된다. 바람직한 실시형태에서, TLR-4의 검출은 ELONA에 의해 수행된다.
유사한 방식으로, 용어 "압타세포화학" 및 "압타조직화학"은, 본 발명의 맥락에서, 각각 세포 및 조직학적 절편에서 TLR-4의 검출을 위해 면역세포화학 및 면역조직화학과 유사한 기법을 의미하고, 여기서 관심 있는 분자, 이 경우에 TLR-4를 검출하기 위해 사용된 항체는 상기 분자에 특이적인 압타머에 대해 교환된다. 검출 압타머는 효소에 공유 결합할 수 있거나, 이것은 효소에 접합된 압타머에 특이적인 2차 항체에 의해 그 자체로 검출 가능할 수 있다. 상기 효소는 가시적인 신호를 제공하기 위해 특이적 기질의 변환을 촉매한다. 이 기법은 또 다른 검출 가능한 시약, 예컨대 형광단에 대해 효소를 교환시키도록 변형될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, TLR-4의 검출은 압타세포화학에 의해 수행된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출 of TLR-4는 압타조직화학에 의해 수행된다.
대안적으로, 당해 분야의 당업자는 이 기법(ELONA, 압타세포화학, 압타조직화학)이 압타머에 특이적인 프로브에 대해 검출 항체를 교환하기 위해 채택될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
용어 "유세포분석법"은, 본 발명의 맥락에서, 이것이 광의 선을 따라 통과하면서 세포가 가지는 형광 및 광 분산 특징을 측정하는 것을 포함하는 세포 분석 기법을 의미한다. 광 분산 이외에, 분석 전에 세포가 형광성 분자에 의해 표지된 압타머의 존재 하에 위치하는 경우, 어떠한 세포가 사용된 압타머에 상보성인 항원을 가지는지를 평가할 수 있다. 형광의 검출은 유동 세포형광기("세포계산기" 또는 "FACS"(형광 활성화 세포 분류기로 공지됨))에 의해 수행된다. 이 기법은, 이전 기법과 같이, 형광으로 표지된 항체에 의한 사용을 위해 초기에 개발되었지만, 본 발명의 압타머에 의한 사용을 위해 용이하게 채택될 수 있다.
당해 분야의 당업자가 이해하는 것처럼, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 검출 가능한 시약을 포함하는 복합체는 TLR-4를 검출하는 데 특히 유리한데, 왜냐하면 상기 검출 가능한 시약은 이것이 TLR-4에 결합될 때 복합체에 포함된 압타머의 검출을 가능하게 하기 때문이다. TLR-4를 검출하기 위해 사용된 기법은 형광측정법, 비색법 또는 방사성에 기초한 기법일 수 있는 검출 가능한 시약의 유형에 따라 달라질 것이다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은, TLR-4를 검출하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체에 관한 것이다.
특정한 실시형태에서, 작용상 그룹은 검출 가능한 시약이다.
본 발명의 시험관내 용도의 또 다른 특정한 실시형태에서, TLR-4의 검출은 ELONA, 압타세포화학, 압타조직화학 및 유세포분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행된다.
용어 "압타머", "TLR-4", "작용상 동등한 변이체", "복합체", "작용상 그룹", "검출 가능한 시약", "ELONA", "압타세포화학", "압타조직화학" 및 "유세포분석법"은 상기 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다.
ELISA, 면역세포화학, 면역조직화학 및 유세포분석법 기법이 당해 분야에 널리 공지된 것을 고려하여, 당해 분야의 당업자는 부당한 실험을 수행할 필요 없이 본 발명에 따른 압타머 또는 복합체에 대해 항체를 교환하는 것이 필요한 채택을 만들 수 있다.
B. TLR -4를 저해하기 위한 시험관내 용도
상기 기재된 바대로, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체는 TLR-4의 활성을 저해하여서, 이의 활성화의 결과로서 방출된 염증촉진 사이토카인의 수준을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 또한, TLR-4를 저해하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체, 및 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체의 시험관내 용도를 고려한다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은, TLR-4를 저해하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체의 시험관내 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, TLR-4를 저해하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체의 시험관내 용도에 관한 것이다.
본 발명의 시험관내 방법
A. TLR -4의 검출을 위한 시험관내 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은
ⅰ) 상기 샘플을 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체와 접촉시키는 단계,
ⅱ) TLR-4에 결합하지 않은 압타머를 분리시키는 단계, 및
ⅲ) 샘플에 존재하는 TLR-4에 결하한 압타머의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, "본 발명의 TLR-4의 검출을 위한 제1 시험관내 방법"이라 칭하는, 샘플 내의 TLR-4의 검출을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
제1 단계에서, 본 발명의 검출을 위한 제1 시험관내 방법은 상기 샘플을 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
용어 "압타머", "TLR-4" 및 "작용상 동등한 변이체"는 상기 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다.
용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은, 본 발명의 맥락에서, 세포 배양 또는 대상체로부터의 단리된 생물학적 재료를 의미한다. 생물학적 샘플은 원하는 바이오마커를 검출하기에 적합한 임의의 생물학적 재료를 함유할 수 있고, 대상체로부터의 세포 및/또는 비세포 재료를 포함할 수 있다. 샘플은 임의의 적합한 조직 또는 생물학적 유체, 예컨대, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 뇌척수액(CSF), 심장, 뇌 등으로부터 단리될 수 있다. TLR-4의 검출에 사용된 샘플은 바람직하게는 생물학적 유체이다.
대안적으로, 샘플은 바이오유체 샘플이다. 용어 "생물학적 유체" 및 "바이오유체"는 본 명세서에서 상호교환되어 사용되고, 생물학적 기원의 수성 유체를 의미한다. 바이오유체는 어디서든(예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 담즙, 뇌척수액, 유리체액 또는 안방수, 또는 임의의 체내 분비물), 삼출액(예컨대, 종기 또는 감염 또는 염증의 임의의 다른 부위로부터 얻어진 유체), 또는 관절(예컨대, 일반 관절 또는 류마티스성 관절염과 같은 질환에 의해 영향을 받은 관절)로부터 얻어진 유체로부터 얻어질 수 있다. TLR-4의 검출에 사용되는 바이오유체는 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청 또는 뇌척수액 샘플이다.
본 발명에 따른 압타머는 샘플에 존재할 수 있는 TLR-4 분자에 대한 압타머의 결합을 허용하기에 적합한 완충제 내에 샘플에 적용된다. 본 발명의 압타머 및 TLR-4의 결합을 허용하기에 적합한 완충제의 비제한적인 예는 PBS, TBS, 인산염 완충제 및 시트르산염 완충제를 포함한다. 바람직하게는, 이 완충제는 1mM MgCl2를 함유한다. 샘플에 존재하는 TLR-4 분자를 검출하는 데 필요한 압타머의 양은 샘플의 크기 및 내부에 존재하는 TLR-4의 양 둘 다에 따라 달라질 것이고, 이것은 당해 분야에 보통 사용되는 최적화 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 표시의 방식으로, 압타머 농도는 적어도 1fM, 적어도 10fM, 적어도 100fM, 적어도 1pM, 적어도 10pM, 적어도 100pM, 적어도 1nM, 적어도 10nM, 적어도 100nM, 적어도 1㎛, 적어도 10㎛, 적어도 100㎛ 이상이다. 바람직하게는, 압타머 농도는 100fM 내지 1㎛, 더 바람직하게는 1pM 내지 100nM, 훨씬 더 바람직하게는 100pM 내지 1nM이다.
압타머는 샘플에 존재할 수 있는 TLR-4 분자에 대한 압타머의 결합을 허용하기에 충분한 시간 동안 적합한 온도에서 샘플과 항온처리된다. 온도는 바람직하게는 20℃ 내지 37℃이다. 표시의 예로서, 압타머는 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 15분, 적어도, 20분, 적어도 30분, 적어도 60분, 적어도 120분 이상 동안 샘플과 항온처리될 것이다.
압타머가 샘플에 존재할 수 있는 TLR-4 분자에 결합하면, 제2 단계에서 샘플은 TLR-4에 결합하지 않은 압타머 분자를 제거하도록 세척된다.
제3 단계에서, 샘플에 존재하는 TLR-4에 결합한 압타머의 존재가 검출된다. 본 발명의 압타머가 자체가 검출 가능한 분자가 아니므로, 검출의 단계는 압타머에 특이적으로 결합하는 제2 검출 가능한 분자를 통한 간접 검출의 단계이다. TLR-4에 결합한 압타머의 검출은 본 발명의 압타머에 높은 친화도로 결합하는 실질적으로 임의의 공지된 항체 또는 시약에 의해 수행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 압타머에 특이적인 항체, 예를 들어, 다중클론 항체, 하이브리도마 상청액, 단일클론 또는 인간화 항체 및 이의 단편의 사용이 바람직하다. 압타머에 특이적인 상기 항체는 검출 가능한 시약에 의해 적합하게 표지된다. 용어 "검출 가능한 시약"은 상기 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다. 상기 시약은 당해 분야의 당업자에 의해 공지된 시약의 유형 및 샘플의 유형에 적합한 장치를 사용하여 형광측정법 또는 비색법에 의해 결정될 수 있다. 예로서, 존재하는 TLR-4 분자에 결합한 압타머를 가지는 샘플은 압타머와의 항온처리의 조건과 유사한 조건에서 효소에 접합된 압타머에 특이적인 항체와 항온처리되고, TLR-4-압타머-항체 복합체는 예를 들어 형광 형미경에서의 형광측정법 또는 분광광도계에서의 비색법에 의해 효소에 의해 검출 가능한 생성물로 전환된 기질의 첨가에 의해 검출된다. 대안적으로, 검출은 검출 가능한 시약에 의해 적합하게 표지된 압타머에 특이적인 프로브의 사용에 의해 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
당해 분야의 당업자는 본 발명의 제1 시험관내 방법이 검출 기법, 예컨대 ELONA, ELASA, 침전 및 qPCR, 겔 이동성 이동 검정, 웨스턴 블로팅, 표면 플라스몬 공명, 동역학 모세혈관 전기영동, 형광 결합 검정, 압타조직화학, 압타세포화학, 형광 현미경관찰법 또는 유세포분석법의 일부로서 수행될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
대안적으로, 본 발명에 따른 압타머는 본 발명에 따른 복합체의 일부인 작용상 그룹에 결합할 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은
ⅰ) 상기 샘플을 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계,
ⅱ) TLR-4에 결합하지 않은 압타머 또는 복합체를 분리시키는 단계, 및
ⅲ) 샘플에 존재하는 TLR-4에 결합한 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, "본 발명의 TLR-4의 검출을 위한 제2 시험관내 방법"이라 이하 칭하는, 샘플 내의 TLR-4의 검출을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
용어 "압타머", "TLR-4", "작용상 동등한 변이체", 및 "샘플"은 상기 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다. 마찬가지로, 본 발명의 검출을 위한 제1 시험관내 방법의 제1 및 제2 단계의 특별사항은 본 발명의 검출을 위한 제2 시험관내 방법에 또한 적용되고, 마찬가지로 참조로 포함된다.
본 발명의 검출을 위한 제2 시험관내 방법의 제3 단계는 샘플에 존재하는 TLR-4에 결합한 본 발명의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 복합체의 검출은 높은 친화도로 본 발명의 압타머 또는 작용상 그룹에 결합하는 실질적으로 임의의 공지된 항체 또는 시약에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 압타머의 검출은 본 발명의 검출을 위한 제1 시험관내 방법의 맥락에서 자세히 기재되어 있다. 마찬가지로, 작용상 그룹와 관련하여, 검출은 높은 친화도로 상기 작용상 그룹에 결합하는 실질적으로 임의의 공지된 항체 또는 시약에 의해 또한 수행될 수 있다. 이 이유로, 본 발명의 검출을 위한 제2 시험관내 방법에 대해 작용상 그룹이 검출 가능한 시약이라는 것이 특히 적절하다.
특정한 실시형태에서, 작용상 그룹은 방사성핵종, 형광단, 단백질 및 합텐에 의해 형성된 군으로부터 선택된 검출 가능한 시약이다.
용어 "방사성핵종", "형광단", "검출 가능한 단백질" 및 "합텐"은 상기 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다.
당해 분야의 당업자가 이해하는 것처럼, 본 발명에 의해 고려되는 검출 가능한 시약은 그 자체로 직접적으로 검출 가능한 시약, 예컨대 방사성핵종 또는 형광단과 간접적으로 검출 가능한 시약, 예컨대 단백질 또는 합텐 사이에 분할될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 검출 가능한 시약은 방사성핵종이고, 검출은 방사성핵종이 방출한 방사선의 검출에 의해 수행된다. 상기 방사선은 α 입자 방출, β 입자 방출 또는 γ 유형 방출일 수 있는 방사성핵종의 유형에 따라 달라질 것이다. 이 목적을 위해, 상이한 방사성핵종에 적합한 검출 기법은 널리 공지되어 있다. 예로서, 123I에 의해 방출된 방출은 감마 카메라에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출 가능한 시약은 형광단이고, 검출은 형광단에 의해 방출된 형광의 검출에 의해 수행된다. 형광단의 사용은 상이한 파장에서 방출을 발생시키는 이의 여기 스펙트럼 내의 파장에 의해 이의 이전의 여기를 요한다. 본 발명에서 고려되는 형광단의 여기 및 방출 파장은 당해 분야의 최신의 부분이다. 방출된 형광은 형광 분광광도계 또는 형광 현미경을 사용함으로써 예를 들어 형광법 기법을 통해 검출될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 검출 가능한 시약은 단백질이다. 상기 단백질은 사용된 단백질의 유형에 따라 검출될 수 있다. 예를 들어:
- 효소는 비색법, 화학발광 또는 형광법에 의해 검출 가능한 이의 특이적 기질의 첨가를 요한다;
- 형광단과 같은 형광성 단백질은 형광법에 의해 검출 가능하기에 적합한 파장에서 여기를 요한다(예를 들어, 표 1에 포함된 파장);
- 항원 또는 합텐은 특이적으로 이것을 인식하는 항체 또는 또 다른 분자를 요한다. 검출되기 위해, 항원/합텐에 특이적인 상기 항체 또는 분자는 예를 들어 효소에 의해 표지되어야 하고, 검출은 라벨링의 유형에 따라 달라질 것이다.
당해 분야의 당업자는 본 발명의 제2 시험관내 방법이 검출 기법, 예컨대 ELONA, ELASA, 침전 및 qPCR, 겔 이동성 이동 검정, 웨스턴 블로팅, 표면 플라스몬 공명, 동역학 모세혈관 전기영동, 형광 결합 검정, 압타조직화학, 압타세포화학, 형광 현미경관찰법 또는 유세포분석법의 일부로서 수행될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
특정한 실시형태에서, TLR-4의 검출은 형광에 의해 수행된다.
B. TLR-4의 저해를 위한 시험관내 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR-4를 저해하기에 적합한 조건에서 TLR-4를 포함하는 샘플을 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는, "본 발명의 TLR-4의 저해를 위한 제1 시험관내 방법"이라 이하 칭하는, 샘플 내의 TLR-4를 저해하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
용어 "압타머", "TLR-4", "작용상 동등한 변이체", "TLR-4의 저해" 및 "샘플"은 상기 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다.
특정한 실시형태에서, 샘플의 TLR-4는 살아 있는 세포에 포함된다.
본 발명의 TLR-4의 저해를 위한 제1 시험관내 방법은 TLR-4를 저해하기에 적합한 조건에서 TLR-4를 포함하는 샘플을 본 발명에 따른 압타머와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이를 위해, 본 발명의 압타머는 샘플에 적용되고, 이것은 TLR-4에 결합해야 한다.
용어 "TLR -4를 저해하기에 적합한 조건"은, 본 발명의 맥락에서, TLR-4에 대한 본 발명의 압타머의 결합 및 후속하는 이의 저해를 허용하는 항온처리 조건을 의미한다. 이 조건은 본 발명의 압타머가 샘플에 적용되는 완충제의 조성, 압타머의 양, 항온처리 시간 및 항온처리 온도를 포함한다. TLR-4에 대한 본 발명의 압타머의 결합 및 후속하는 이의 저해를 허용하기에 적합한 완충제의 비제한적인 예는 PBS, TBS, 인산염 완충제 및 시트르산염 완충제를 포함한다. 바람직하게는, 이 완충제는 1mM MgCl2를 함유한다. 샘플에 존재하는 TLR-4 분자를 검출하는 데 필요한 압타머의 양은 샘플의 크기 및 내부에 존재하는 TLR-4의 양 둘 다에 따라 달라질 것이고, 이것은 당해 분야에서 보통 사용된 최적화 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 표시의 예로서, 압타머 농도는 적어도 1fM, 적어도 10fM, 적어도 100fM, 적어도 1pM, 적어도 10pM, 적어도 100pM, 적어도 1nM, 적어도 10nM, 적어도 100nM, 적어도 1㎛, 적어도 10㎛, 적어도 100㎛ 이상이다. 바람직하게는, 압타머 농도는 100fM 내지 1㎛, 더 바람직하게는 1pM 내지 100nM, 훨씬 더 바람직하게는 100pM 내지 1nM이다.
압타머는 샘플에 존재할 수 있는 TLR-4 분자에 대한 압타머의 결합을 허용하기에 충분한 시간 동안 적합한 온도에서 샘플과 항온처리된다. 온도는 바람직하게는 20℃ 내지 37℃, 더 바람직하게는 37℃이다. 표시의 예로서, 압타머는 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 15분, 적어도, 20분, 적어도 30분, 적어도 60분, 적어도 120분 이상 동안 샘플과 항온처리될 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR-4를 저해하기에 적합한 조건에서 TLR-4를 포함하는 샘플을 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, "본 발명의 TLR -4의 저해를 위한 제2 시험관내 방법"이라 이하 칭하는, 샘플 내의 TLR-4를 저해하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
용어 "압타머", "TLR-4", "작용상 동등한 변이체", "TLR-4의 저해", "샘플" 및 "TLR-4를 저해하기에 적합한 조건"은 상기 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명의 의학 용도
본 발명의 저자들은 본 발명의 압타머가, 실시예 4에 기재된 바대로, 실험에서 사용된 동물에서 유도된 뇌졸중의 모델에서 생성된 경색의 용적을 차단하거나 저해할 수 있다는 것을 입증하였다. 따라서, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 본 발명의 압타머의 능력은 이것이 치료학적 관점으로부터 유용하게 하다. 본 발명의 압타머에 의해 얻어진 치료학적 효과가 본 발명의 복합체의 맥락에서 기재된 바대로 치료학적 활성을 가지는 작용상 그룹에 의해 보완될 수 있다는 것이 명확하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 압타머 및 본 발명의 복합체의 의학 용도를 고려한다.
A. 본 발명의 압타머의 의학 용도
또 다른 양태에서, 본 발명은, 약제에서 사용하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료를 위한 약물의 제조에서 사용하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체에 관한 것이다.
대안적으로, 이것은 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료에서 사용하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체의 용도로서 표현될 수 있다.
대안적으로, 이것은 치료학적 유효량의 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료에 대한 생체내 방법으로서 표현될 수 있다.
본 발명에 따르면, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체는 표적 세포의 표면에서 TLR-4에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 압타머가 TLR-4와 접촉할 때, 이것은 이의 활성을 저해하여서, 염증촉진 사이토카인, 예컨대 IL-1, IL-8, TNF-알파 및 IL-12의 방출의 감소 또는 중단을 발생시킨다.
용어 "압타머"는 정의 및 TLR-4에 특이적인 압타머(상기)와 관련하여 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 마찬가지로 본 발명의 복합체의 맥락에서 적용된다.
용어 "치료" 또는 "치료법"은, 본 발명의 맥락에서, TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 하나 이상의 증상의 예방, 치유, 지연, 이의 중증도의 감소, 또는 개선의 시도의, 또는 이러한 치료의 부재에서 예상되는 것을 넘어 환자의 생존을 연장시키는 목적을 위한 임상 중재를 의미한다.
용어 "표적 세포"는, 본 발명의 맥락에서, 특히 골수성 계통 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포, 미세아교세포 세포, 과립구 및 미성숙 수지상 세포, 및 다른 계통의 세포, 예컨대 뉴런 등을 포함하는 TLR-4를 발현하는 특정한 세포를 의미한다. 특정한 실시형태에서, 표적 세포는 단핵구 또는 대식세포이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 표적 세포는 미세아교세포 세포이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 표적 세포는 과립구이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 표적 세포는 미성숙 수지상 세포이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 표적 세포는 뉴런이다.
특정한 실시형태에서, 표적 세포는 포유류 세포이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 포유류 세포는 인간 세포이다.
용어 "대상체" 또는 "개인"은 다수의 포유류 종을 의미하고, 인간을 포함하는 가정용 동물 및 영장류를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고; 대상체는 바람직하게는 임의의 연령 또는 인종의 남성 또는 여성 인간이다.
용어 "치료학적 유효량"은, 본 발명의 맥락에서, TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 하나 이상의 관찰 가능한 증상의 예방, 치유, 지연, 이의 중증도의 감소, 또는 개선을 달성하는 데 필요한 본 발명의 압타머의 양을 의미하다.
용어 "TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학"은, 본 발명의 맥락에서, TLR-4를 발현하는 세포가 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 나타내는 병리학, 및/또는 정상 또는 기준 생리학적 조건 또는 기준 값과 관련하여 TLR-4를 발현하는 세포의 양의 증가가 존재하고, TLR-4가 질환의 원인인지와 관계없이 상기 세포가 직접적으로 또는 간접적으로 관여된 병리학을 의미한다. TLR-4의 활성화가 염증 및 세포 손상을 발생시키는 염증성 사이토카인, 예컨대 IL-1, IL-8, TNF-알파 및 IL-12를 방출시키는, 신호전달 캐스케이드를 생성한다는 것을 고려하면, TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 더욱이 염증성 성분을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 상기 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 특히 뇌졸중, 급성 심근 경색, 패혈증, 죽상동맥경화증, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 망막 퇴행성 질환 및 약물 중독으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 뇌졸중이다. 용어 "뇌졸중" 또는 "뇌혈관 질환" 또는 "뇌 경색" 또는 "중풍"은, 본 발명의 맥락에서, 비정상적으로 갑작스런 방식(허혈성 뇌졸중)으로, 또는 뇌의 혈관의 파열에 의해 생긴 출혈(출혈성 뇌졸중)로 인해 뇌 혈류의 중요한 감소에 의해 생긴 신경학적 결함을 특징으로 하는 병리학을 의미한다. 허혈성 뇌졸중에서, 경색 부위의 출현을 생성시키는, 뇌 덩어리를 관주시키는 임의의 동맥의 폐색으로 인한 혈류의 갑작스럽고 즉각적인 중단으로 인해 혈액 관주가 소실된다. 동맥 폐색은 일반적으로 또 다른 위치, 기본적으로 심장 또는 다른 동맥으로부터 생긴 죽상동맥경화증 또는 색전(뇌 색전증)으로 인한다. 출혈성 뇌졸중에서, 뇌에서의 혈관의 파열이 발생하여서, 혈액의 동맥에 따라 달라지는 뇌의 부분을 박탈한다. 또한, 흐르는 혈액은 뇌내 출혈에 부차하는 허혈에 의해 이환된 부위를 증가시키는, 다른 혈관을 포함하는 뇌 구조물을 누른다.
바람직한 실시형태에서, 상기 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 급성 심근 경색이다. 용어 "급성 심근 경색" 또는 "경색" 또는 "심장 마비"는, 본 발명의 맥락에서, 관상동맥 중 하나의 폐색에 의해 생긴 심장의 부위에서의 조직 손상에 의한 불충분한 혈액 공급을 특징으로 하는 병리학을 의미한다. 이러한 폐색으로부터 생긴 허혈 또는 산소 부족 공급은 충분히 곧 재배관삽입되지 않는 경우, 심장 조직의 사멸을 발생시키지 않는, 협심증을 발생시키지만, 이 산소결핍이 유지되는 경우, 심근은 손상되고, 괴사, 즉 경색이 궁극적으로 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 패혈증이다. 용어 "패혈증" 또는 "패혈병증"은, 본 발명의 맥락에서, 일반적으로 심각한 감염에 의해 생기는 전신 염증성 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome: SIRS)을 의미하다. 유기체의 이 반응은 유기체의 임의의 조직 또는 유체에서의 병원성 미생물의 존재에 반응하여 생기고, SIRS를 시작시키는 염증촉진 물질을 방출하는 면역계 자체의 작용에 의해 생긴다. 이것은 열, 발열요법, 빈호흡, 빈맥 및 백혈구증가증의 기준 중 적어도 2개의 존재를 특징으로 한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 죽상동맥경화증이다. 용어 "죽상동맥경화증"은, 본 발명의 맥락에서, 중간 및 두꺼운 크기의 동맥의 벽에서의 지질 물질의 침착 및 침윤을 특징으로 하는 증후군 또는 병리학을 의미한다. 동맥 벽의 세포는 이 침착물을 침범으로 해석하고, 동맥 벽을 침투하는 면역계의 순환 단핵구를 활성화하고, 대식세포로 전환되고, 식세포 LDL 입자로 시작하여서, 염증 과정을 생성시킨다. 염증은 결국, 점진적으로 동맥 직경이 좁아지게 하는, 벽의 평활근 세포의 증식 및 이동을 발생시킨다. 특정한 비후화는 죽상판이라 칭해진다. 이것은 동맥경화증의 가장 흔한 형태이다. 관여한 장기의 동맥에 따라 죽상동맥경화증 증후군을 형성하고 죽상판을 통한 동맥의 관여, 및 따라서 혈류의 폐색 또는 허혈을 특징으로 하는 질환은 하기이다:
- 심장에서의 허혈성 심장 질환(이의 최대 대표는 급성 심근 경색임).
- 중추 신경계에서의 뇌졸중 또는 뇌 혈전증 또는 뇌 출혈의 형태의 뇌혈관 질환.
- 간헐적 파행증(이의 최대 중증은 다리의 급성 동맥 허혈임).
- 발기부전: 이것은 40년에 걸쳐 사람들에서 성교불능의 주요 원인이다.
- 허혈성 대장염(장의 동맥에서의 결장직장(대장)으로의 혈류의 방해에 의해 생긴 염증(자극 및 종창)의 부위임).
- 대동맥류(이의 최대 중증은 대동맥 박리임).
바람직한 실시형태에서, 상기 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 다발성 경화증이다. 용어 "다발성 경화증"은, 본 발명의 맥락에서, 중추 신경계의 탈수초성, 신경퇴행성 및 만성 병변의 발병을 특징으로 하는 병리학을 의미한다. 이의 원인은 현재 공지되어 있지 않지만, 다양한 자가면역 기전의 관여가 입증되었다. 다발성 경화증 환자에서, 혈액-뇌 장벽에 걸쳐 림프구는 미엘린에 영향을 미치는 반면, 대식세포 및 신경아교 세포에 의해 보조된 염증 과정이 발생한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 류마티스성 관절염이다. 용어 "류마티스성 관절염"은, 본 발명의 맥락에서, 관절의 지속적인 건막염을 발생시키고, 이의 진행성 파괴를 발생시키고, 상이한 정도의 변형 및 기능 불능을 생성시키는 것을 특징으로 하는 전신 자가면역 염증성 병리학을 의미한다. 과정은, 염증 매개 분자를 생성하고, 말초 혈액 세포를 공격하고 활성화하여서, 활막세포의 증식 및 활성화를 발생시키고, 관절 연골, 연골하 골, 힘줄 및 인대를 침범하고 파괴시키는, 체액 및 세포 인자, 특히 CD4 T-세포의 중재에 의해 시작한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 망막 퇴행성 질환이다. 용어 "망막 퇴행성 질환"은, 본 발명의 맥락에서, 망막 염증의 결과일 수 있는 망막의 퇴행을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 의미한다. TLR-4 매개 미세아교세포 활성화는 망막 염증의 과정에 기여하는 것으로 나타났다. 주요 망막 퇴행성 질환은 하기를 포함한다:
- 망막에 대한 손상 때문에 시야의 중심(황반)에서 시야 손실을 발생시키는 연령 관련 황반변성(age-related macular degeneration: AMD). 이것은 "건성" 및 "습성" 형태로 발생한다: 건성(비삼출성) 형태에서, 드루센이라 불리는 세포 부스러기가 망막과 맥락막 사이에 축적되어, 망막에 위축 및 반흔을 발생시킨다; 더 심각한 습성(삼출성) 형태에서, 혈관이 망막 뒤로 맥락막으로부터 자라고, 이것은 삼출액 및 유체를 누수시키고 또한 출혈을 발생시킬 수 있다.
- 스타르가르트병(Stargardt disease) 또는 황반 안저(fundus flavimaculatus)는 보통 법적 실명의 지점까지 진행성 시야 손실을 발생시키는 연소성 황반변성의 유전성 형태이다. 증상의 발병은 보통 6세 내지 13세(평균 약 16-18세)에 생긴다. 증상은 통상적으로 20세까지 진행하고, 물결 시야, 맹점, 혼탁, 색각 손상 및 희미한 광의 채택의 어려움을 포함한다.
- 망막에서의 간상 시각세포의 진행성 퇴행으로 인해 중증 시각 손상을 발생시키는 유전성 퇴행성 눈 질환인 망막색소변성증(retinitis pigmentosa: RP). RP의 초기 단계의 환자는 처음에 간상 시각세포의 감소로 인해 손상된 말초 및 희미한 광 시야를 의식한다. 진행성 간상 퇴행은 후에 인접한 망막 색소 상피의 비정상 및 원추 시각세포의 악화가 후행한다. 말초 시야가 점점 더 손상되면서, 환자는 진행성 "터널 시야" 및 결국 실명을 경험한다.
- 다른 유전적 질환, 예컨대 맥락막결여, 레버 선천성 흑내장(Leber congenital amaurosis), 연소성 망막층간분리(retinoschisis juvenile), 어셔병(Usher disease) 및 바르데 비들(Bardet Biedl).
특히 바람직한 실시형태에서, 망막 퇴행성 질환은 AMD, 스타르가르트병, RP, 맥락막결여, 레버 선천성 흑내장, 연소성 망막층간분리, 어셔병 및 바르데 비들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직한 실시형태에서, 망막 퇴행성 질환은 AMD이다. 또 다른 더 바람직한 실시형태에서, 망막 퇴행성 질환은 스타르가르트병이다. 또 다른 더 바람직한 실시형태에서, 망막 퇴행성 질환은 RP이다. 또 다른 더 바람직한 실시형태에서, 망막 퇴행성 질환은 맥락막결여이다. 또 다른 더 바람직한 실시형태에서, 망막 퇴행성 질환은 레버 선천성 흑내장이다. 또 다른 더 바람직한 실시형태에서, 망막 퇴행성 질환은 어셔병이다. 또 다른 더 바람직한 실시형태에서, 망막 퇴행성 질환은 바르데 비들이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학은 약물 중독이다. 용어 "약물 중독" 또는 "약물 의존성"은, 본 발명의 맥락에서, 약물이라 불리는 흔한 중독 물질의 사용에 의해 생기는 장애 또는 병리학을 의미한다. ICD-10(세계 보건 기구, 2005)에 따르면, 이렇게 진단되기 위해서, 약물 의존성은, 12개월 기간에 신체 의존성 및 정신 의존성과 관련된 양태 둘 다를 의미하는, 하기 기준 중 3개 이상을 제시해야 한다:
- 물질을 소비하고자 하는 강한 열망,
- 상기 소비를 조절하는 데의 어려움,
- 소비가 중단 또는 감소할 때 금단 증후군,
- 내약성,
- 물질 소비 이외의 관심의 진행성 포기,
- 물질을 얻는 것 또는 이의 효과로부터 회복하는 것과 관련된 활성에 투자된 시간의 증가,
- 이의 해로운 효과의 명확한 인지에도 불구하고 물질의 사용의 지속성.
TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체의 대상체에 대한 투여를 위해, 상기 압타머는 적합한 약제학적 조성물에서 제제화될 것이다. 상기 약제학적 조성물의 세부사항은 하기 기재되어 있다.
B. 본 발명의 복합체의 의학 용도
TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 본 발명에 따른 작용상 그룹을 포함하는 본 발명에 따른 복합체는 작용상 그룹으로서 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료에 적합한 약물을 포함할 수 있다. (ⅰ) TLR-4의 활성을 저해하고, (ⅱ) 이의 작용 부위에 특정한 방식으로 약물을 지시할 이중 목적이 따라서 달성된다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은, 약제에서 사용하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료를 위한 약물의 제조에서 사용하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체에 관한 것이다.
대안적으로, 이것은 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료에서 사용하기 위한, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체의 용도로서 표현될 수 있다.
대안적으로, 이것은 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 치료학적 유효량의 복합체를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료의 방법으로 표현될 수 있다.
본 발명에 따르면, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 약물을 포함하는 복합체는 표적 세포의 표면에서 TLR-4에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 압타머가 TLR-4와 접촉할 때, 이것은 이의 활성을 저해하여서, 염증촉진 사이토카인, 예컨대 IL-1, IL-8, TNF-알파 및 IL-12의 방출의 감소 또는 중단을 발생시키고, 약물은 세포에서 또는 상기 세포가 위치한 환경에서 이의 기능을 발휘한다.
용어 "압타머", "TLR-4", "작용상 동등한 변이체", "복합체", "작용상 그룹", "약물", "치료", "치료학적 유효량", "대상체", "표적 세포" 및 "TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학"은 상기 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다.
TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지는 핵산 압타머에 의해 형성된 복합체에서 작용상 그룹로서 사용될 수 있는 적합한 약물은, 제한 없이, TLR-4의 길항제, 예컨대 날록손, 날트렉손, LPS, 이부딜라스트, 프로펜토필린, 아미트립틸린, 케토티펜, 사이클로벤자프린, 미안세린 및 이미프라민; 항혈소판 약물, 예컨대 아스피린 및 클로피도그렐; 항응고제, 예컨대 헤파린, 아세노쿠마롤, 와파린, 다비가트란 및 리바록사반; 및 항산화제, 예컨대 에다라본; 조직 플라스미노겐 활성제 및 이들의 재조합 변이체; TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학에 관여한 유전자의 발현을 침묵시키는 능력을 가지는 핵산, 예컨대 안티센스 RNA, 안티센스 DNA 및 소형 간섭 RNA; 펩타이드, 예컨대 신호전달 펩타이드 및 표적 결합 펩타이드를 포함한다.
약제학적 조성물
TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체, 또는 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 복합체를 필요로 하는 대상체에 대한 투여의 경우, 상기 압타머 및 복합체는 적합한 약제학적 조성물에서 제제화된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체를 포함하는, "본 발명의 제1 약제학적 조성물"이라 이하 칭하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 제1 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 용매를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체 및 작용상 그룹을 포함하는 적어도 하나의 복합체를 포함하는, "본 발명의 제2 약제학적 조성물"이라 이하 칭하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다.
특정한 실시형태에서, 본 발명의 제2 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 용매를 추가로 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 약제학적 조성물은 TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "압타머", "TLR-4", "작용상 동등한 변이체", "복합체", "작용상 그룹", "약물", "치료", "대상체" 및 "TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학"은 상기 자세히 기재되어 있고, 이의 정의 및 특별사항은 본 명세서에 참조로 포함된다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 부형제" 또는 "약제학적으로 허용되는 용매"는, 본 발명의 맥락에서, 약제학적 투여에 적합한, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 흡수 지연 및 등장성 물질 등을 포함하도록 추구한다. 약제학적 활성 물질 내의 이러한 담체 및 비히클의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 종래의 담체가 활성 화합물에 비적합하지 않으면, 본 발명의 조성물 내의 이의 용도가 고려된다. 허용되는 비히클, 부형제, 또는 허용되는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 대상체에 대해 독성이 아니고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올, 및 m-크레솔); 저분자량 폴리펩타이드(약 10개 미만의 아미노산); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노폴리사카라이드, 다이폴리사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)(상표명), 플루로닉스(PLURONICS)(상표명) 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 포함한다.
보충적 활성 화합물은 본 발명에 의해 제공된 약제학적 조성물에서 또한 혼입될 수 있다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공된 약제학적 조성물은 해당 특정한 적응증에 필요한 바대로 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가지는 것을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 더욱이 화학치료제, 사이토카인, 진통제, 소염제 또는 면역억제제를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 다른 활성 물질의 유효량은 무엇보다도 약제학적 조성물에 존재하는 압타머 또는 복합체의 치료학적 양, 치료하고자 하는 병리학의 성질 및 중증도, 대상체 등에 따라 달라진다.
일 실시형태에서, TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체, 또는 본 발명의 복합체는 신체로부터의 신속한 제거로부터 상기 생성물을 보호하는 비히클, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제에 의해 제제화된다. 생체분해성 및 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글라이콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당해 분야의 당업자에 대해 명확할 것이다. 이것은 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바대로 당해 분야의 당업자에 의해 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 약제학적 조성물은 임의의 적합한 투여 경로에 의해, 예를 들어 비경구 경로 등에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "비경구"는, 본 발명의 맥락에서, 정맥내, 복강내, 근육내 또는 피하 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내 형태가 일반적으로 바람직하다.
더욱이, 본 발명에 의해 제공된 약제학적 조성물은 예를 들어 본 발명의 압타머 또는 복합체의 용량의 감소로 펄스 점적주사에 의해 적합하게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투약량은 투여가 간단 또는 만성인지에 따라 주사, 더 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공된 약제학적 조성물은 적합한 투약량 형태로 무균 용액, 현탁액 또는 동결건조 생성물의 첨가에 의해 비경구 투여에 채택될 수 있다. 주사용 용도에 적합한 약제학적 조성물은 무균 주사용 용액 또는 분산액의 제조를 위한 무균 수성 용액 또는 분산액 또는 무균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 비히클은 생리학적 식염수 용액, 세균발육저지제 물 CremophorEM(BASF(뉴저지주 파시패니)) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 주사 가능성을 촉진하도록 무균 및 유체이어야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건에서 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보전되어야 한다. 비히클은 예를 들어 물, 에탄올, 약제학적으로 허용되는 폴리올, 예컨대 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 액체 폴리에틸렌 글라이콜, 및 적합한 이들의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장성 물질, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 조성물 내에 흡수 지연 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및/또는 젤라틴을 함유하는, 주사용 조성물의 연장된 흡수가 유발될 수 있다.
주사용 무균 용액은 적합한 용매 중의 필요한 양의 활성 화합물(예를 들어, 본 발명의 압타머 또는 복합체)과 필요한 바대로 이전에 기재된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과의 혼입, 이어서 여과 멸균에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 이전에 기재된 것으로부터 기본 분산 매질 및 다른 필요한 성분을 함유하는 무균 비히클 내의 활성 화합물의 혼입에 의해 제조된다. 주사용 무균 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이전에 여과된 이의 무균 용액으로부터 활성 성분의 분말과 임의의 추가적인 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
특정한 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 경로를 통해 투여된다. 적합한 부형제, 예컨대 벌크화제, 완충제 또는 계면활성제가 사용될 수 있다. 언급된 제제는 표준 방법, 예컨대 스페인 및 미국 약전 및 유사한 표준 교재에 기재되거나 고려되는 것을 사용하여 제조될 것이다.
투약량 투여 및 통합성을 촉진하기 위해 투약량 단위 형태로 약제학적 조성물, 즉 비경구 조성물을 제제화하는 것이 특히 유리하다. 투약량 단위 형태는, 본 명세서에 이것이 사용되는 바대로, 치료하고자 하는 대상체에 대한 단위 투약량으로서 적합한 물리적 별개의 단위를 의미하고, 각각의 단위는 필요한 약제학적 비히클과 연관되어 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물(본 발명의 압타머 또는 복합체)을 함유한다. 본 발명의 단위 투약량 형태에 대한 사양은 활성 화합물 및 달성하고자 하는 특정한 치료학적 효과, 및 대상체의 치료를 위한 이러한 활성 화합물의 조성물 기법에서의 고유 제한의 독특한 특징에 의해 컨디셔닝되고 이들에 따라 직접적으로 달라진다.
활성 화합물(본 발명의 압타머 또는 복합체)은 통상적으로 1일 수회, 예를 들어 1일 1회, 2회, 3회 또는 4회 투여될 것이고, 통상적인 전체 1일 용량은 0.0001 내지 1.000㎎/㎏의 체중/일, 바람직하게는 약 0.001 내지 약 100㎎/㎏의 체중/일, 더 바람직하게는 약 0.01 내지 10㎎/㎏의 체중/일의 간격이다. 약제학적 조성물은 본 발명의 압타머 또는 복합체의 원하는 양, 예컨대 치료학적 유효량을 함유할 목적을 위해 제제화될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 약제학적 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 용기, 패키징 또는 분산기에 포함될 수 있다.
본 발명의 영상화 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은, TLR4를 발현하는, 세포, 조직 또는 장기의 생체내 영사화를 위한 본 발명에 따른 복합체의 용도에 관한 것이고, 여기서 상기 복합체는 본 발명에 따른 하나 이상의 압타머 및 작용상 그룹을 포함하고, 상기 작용상 그룹은 검출 가능한 모이어티이다.
본 발명에 따른 생체내 영상화 방법에서 사용하기 위한 적합한 검출 가능한 모이어티는 본 발명의 맥락에서 상기 복합체에 기재되어 있고, 제한 없이, 방사성핵종, 형광단, 조영 매질, 단백질 및 합텐을 포함한다.
***
본 발명은 오직 예시적인 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위를 제한하지 않는 방식으로 하기 기재되어 있다.
실시예
재료 및 방법
압타머 라이브러리
본 발명자들은 IBA GmbH(독일 괴팅엔)에 의해 공급된 TLR-4에 특이적인 압타머의 스크리닝을 수행하기 위해 RND40 압타머 라이브러리를 사용하였다. 초기 RND40 라이브러리는, 18개의 뉴클레오타이드(여기서, 각각은 이의 PCR 증폭 동안 각각의 프라이머를 혼성화함)로 이루어진 말단에서의 고정된 서열, 및 무작위 서열을 가지는 40개의 염기로 이루어진 중앙 구역을 가지는, 1024개의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 올리고뉴클레오타이드로 이론적으로 구성된다. 이루어진 스크리닝에서, 이 라이브러리로부터의 1013개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다.
6HIS-재조합 hTLR-4
아미노산 24-631인 인간 TLR-4 단백질의 세포외 도메인에 상응하는 단백질을 바큘로바이러스에서의 발현에 의해 C 말단 끝에서 6-히스티딘 태그에 재조합으로 생성시켰다.
세포
HEK293T 및 HEK293T/TLR-4 세포를 인비보겐(Invivogen)(미국 캘리포니아주 샌 디에고)으로부터 얻었다.
HEK-293T-TLR4/HEK-293T 세포에 의한 스크리닝
각각의 스크리닝 회차에 대해, 8 내지 10x105개의 HEK-293T 세포를 스크리닝 검정 전 24시간에 P6 플레이트에서 3중 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 이후, 100㎕의 PBS 중의 RND40 라이브러리로부터(또는 이전 스크리닝 회차에서 단리된 집단으로부터) 1n㏖의 압타머(여기서, 압타머를 95℃에서 10분 동안 이전에 변성시킨 후, 4℃에서 10분 동안 항온처리함)를 첨가하고; 10%의 소 태아 혈청, 100U/㎖의 페닐실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 25㎍/㎖의 암포테리신이 보충된 300㎕의 DMEM 배지(둘베코 변형 이글 배지)를 첨가하고, 세포에 적용하였다. 37℃, 5% CO2에서 항온처리 1시간 후, 비결합 압타머를 가지는 배양 배지를 제거하고, 세포를 PBS에 의해 2회 세척하고, 1500rpm에서 원심분리에 의해 500㎕의 PBS 중에 회수하였다. 세포를 원심분리하여 상청액을 제거하고, 세포에 부착된 압타머를 PCR에 의해 증폭시켜 하기 스크리닝 회차 동안 충분한 양을 제조하였다.
RND40 압타머 라이브러리로부터의 HEK-293T 세포에서의 카운터 스크리닝을 초기 RND40 집단의 제조 및 매 3회 스크리닝 회차의 전에 수행하고, 집단은 이전의 스크리닝 회차로부터 단리되었다. 이를 위해, 8-10x105개의 HEK-293T 세포를 스크리닝 검정 전에 24시간에 P6 플레이트 웰에서 3중 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 이후, 100㎕의 PBS 중의 RND40 라이브러리로부터(또는 이전 스크리닝 회차에서 단리된 집단으로부터) 1n㏖의 압타머(여기서, 압타머를 95℃에서 10분 동안 이전에 변성시킨 후, 4℃에서 10분 동안 항온처리함)를 첨가하고; 10%의 소 태아 혈청, 100U/㎖의 페닐실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 25㎍/㎖의 암포테리신이 보충된 300㎕의 DMEM 배지(둘베코 변형 이글 배지)를 첨가하고, 세포에 적용하였다. 37℃, 5% CO2에서 항온처리 1시간 후, 비결합 압타머를 가지는 배양 배지을 제거하였다.
가용성 hTLR-4 단백질에 의한 스크리닝
각각의 스크리닝 회차에 대해, 이전 스크리닝 회차에서 농후화된 RND40 라이브러리를 사용하였다. 1n㏖의 압타머를 37℃에서 1시간 동안 교반하면서 압타머 완충제(20mM 트리스-HCl, pH 7.4, 1mM MgCl2, 150mM NaCl, 5mM KCl) 중에 (10개 압타머 분자 대 1개 hTLR-4 분자의 비율로) 7㎍의 6xHIS-hTLR-4와 항온처리하였다. 후속하여, NTA-Ni 수지(QIAGEN(독일))를 첨가하고, 이것을 4℃에서 1시간 동안 항온처리하여 단백질을 포획하였다. 압타머 완충제에 의해 3회 세척 후, 결합된 서열을 PCR에 의해 증폭하여 하기 스크리닝 회차에 대해 충분한 양을 제조하였다.
스크리닝과 동일한 조건에서, 그러나 수지에 결합된 TLR-4 단백질의 부재 하에 카운터 스크리닝을 수행하였다.
선택된 압타머의 증폭
선택된 압타머를 20㎕의 증류수의 용적 중에 재현탁시키고, 하기 증폭 프로그램에 따라 200㎕의 최종 용적에서 0.8μM/프라이머 서열번호 5, 0.8μM/프라이머 서열번호 6, 200mM dNTPs, 2mM MgCl2, 10U Taq 중합효소(Biotools(스페인))의 조건에서 서열번호 5(GCGGATGAAGACTGGTGT) 및 서열번호 6(GTTGCTCGTATTTAGGGC)의 서열과 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다: 95℃에서의 2분; 95℃에서의 30초, 56℃에서의 30초 및 72℃에서의 30초; 및 마지막으로 72℃에서의 5분의 15회 사이클.
ELONA
선택된 압타머가 TLR-4 단백질을 인식하는지를 결정하였다. 이를 위해, 100ng/웰의 6xHIS-재조합 TLR-4를 96웰 미량역가 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 16시간 동안 항온처리하였다. 후속하여, 5' 말달에서 다이곡시제닌에 의해 표지된 개별 압타머를 5㎍/㎖의 농도에서 희석시키고, 이후 95℃에서 10분 동안 변성시키고, 얼음에서 10분 동안 냉각시켰다. 이후, 100㎕(200nM)의 압타머 완충제 중의 20pmol의 각각의 압타머를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 퍼옥시다제 접합 항다이곡시제닌 항체와 항온처리하고, ABTS를 사용하여 전개시켰다. 항-Li H2A DNA 압타머를 양성 대조군으로서 사용하였다(
Figure 112017005902301-pct00003
et al., 2013, PLoS ONE 8: e78886).
재조합 hTLR-4에 대한 압타머의 결합에 대한 결합 검정
hTLR-4에 대한 결합의 각각의 확인된 압타머 능력을 분석할 목적을 위해, 실험을 수행하였고, 여기서 hTLR-4는 히스티딘 태그를 통해 이전에 평형화된 Ni-NTA 수지에 결합하였다. 이후, 1pmol의 TLR4를 함유하는 수지:단백질 복합체를, 95℃에서 10분 동안 열 변성 및 4℃에서 10분 동안 후속하는 복원에 의해 이전에 구조화된, 1pmol의 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3), TLRApt#2F, TLRApt#3R 및 TLRApt#4F(서열번호 4)와 항온처리하였다. 37℃에서 10분 동안 항온처리한 후, 복합체를 세척하고, 압타머를 1mM MgCl2와 PBS 중에 용해된 150mM 이미다졸에 의해 회수하였다. IQ5 유전자증폭기(BioRad)에서 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열을 가지는 프라이머를 사용하여 정량적 PCR(qPCR)에 의해 hTLR-4에 결합한 압타머의 값을 결정하였다.
세포에서 발현된 TLR-4에 대한 압타머의 결합을 위한 결합 검정
HEK-293 세포에서 발현된 TLR-4 단백질에 대한 결합의 확인된 압타머의 능력을 분석할 목적을 위해, 20pmol의 각각의 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3), TLRApt#2F, TLRApt#3R 및 TLRApt#4F(서열번호 4)를 검정의 시작 전에 2일에 2x104개의 세포/웰의 밀도로 96웰 미량역가 플레이트에서 20,000개 세포/웰에서 시딩된 HEK-293-TLR4 세포 배양에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 항온처리 후, 세포를 세척하고, 압타머를 1mM MgCl2와 PBS 중에 용해된 150mM 이미다졸에 의해 회수하고, qPCR을 수행하여 Ct의 값을 결정하였다.
수용체 hTLR-4 활성 검정
이 검정을 수행하기 위해, 에스체리치아 콜라이 K12(LPS-EK)로부터 리포폴리사카라이드인 이의 작용제에 의해 활성화된, MD2 및 CD14 단백질과 함께, 인간 수용체 TLR-4를 발현하는, HEK-블루 hTLR4 세포(인비보겐, 참조번호 hkb-htlr4)를 사용하였다. TLR-4의 활성화를 검출하기 위해, 이 세포주는 SEAP(분비된 배아 알칼리 포스파타제) 리포터 유전자를 함유하고, 이것은 NF-kB 프로모터에 의해 제어되어서, 이것은 TLR-4에 의해 유도된 이 NF-kB 신호전달 경로에 반응하여 발현된다. SEAP 효소는 배양 배지로 분비되고, 이의 상업용 기질 퀀티-블루(QUANTI-Blue)(상표명)(인비보겐(미국 캘리포니아주 샌 디에고))를 첨가하고 대사시킴으로써, 이것은 적색으로부터 청색으로 배지의 색상을 변경시켰다. 또한, 대조군 작용제 분자 LPS-EK UP(이. 콜라이 K12로부터의 리포폴리사카라이드, 울트라 퓨어(Ultra Pure)) 및 길항제 LPS-RS UP(일. 스파에로이데스로부터의 리포폴리사카라이드, 울트라 퓨어)를 각각 0.02ng/㎕ 및 2ng/㎕의 농도로 무균 PBS 중의 1mM MgCl2 중에 용해시켰다. 압타머를 무균 PBS 중의 1mM Cl2Mg 중의 0.1, 1, 10 및 100ng/㎕의 농도로 제조하고, 95℃에서 10분 동안 변성시키고, 4℃에서 10분 동안 구조화하였다.
검정을 위해, HEK 블루-hTLR4 세포를 (1x) HEK-블루(상표명) 설렉션(Selection)이 보충된 200㎕의 완전 배지 DMEM 중에 2x104개 세포/웰로 96웰 배양 플레이트에 시딩하였다. 24시간 또는 48시간 항온처리 후, 세포가 70-80% 포화상태에 도달할 때, 배지를 회수하고, 170㎕의 새로운 배지를 첨가하였다. 대조군 웰에서, 30㎕의 SELEX 완충제를 첨가하였다. 다른 웰에서, 20ng/㎖(0.1ng/㎖의 최종)에서 20㎕의 LPS-EK-울트라 퓨어(인비보겐, USA) 또는 1.5-2.5x107 HEK293 세포/㎖(손상 연관 분자 패턴; DAMP)로부터의 20㎕의 용해액을 작용제 분자로서 첨가하였다. 1시간 항온처리 후, 적절한 농도로 SELEX 완충제 중에 희석된 10㎕의 압타머를 웰에 첨가하여 도면에 표시된 최종 농도에 도달하였다. 200ng/㎖의 농도의 LPS-RS 울트라 퓨어(인비보겐, USA)를 길항제 대조군으로서 사용하였다. 630㎚에서 퀀티-블루(상표명) 기질(인비보겐)을 사용하여 24시간 후 분비된 배아 알칼리 포스파타제(SEAP) 활성을 측정하였다.
대식세포에 대한 압타머의 효과
복막 대식세포를 1x106개 세포/㎖의 밀도로 12웰 플레이트에서 시딩하였다. 대식세포를 500ng/㎖의 LPS의 존재 하에 자극하고, 1시간 후 압타머를 20nM 및 200nM의 최종 농도로 첨가하였다. 아질산염 방출을 24시간 후 Griess 반응에 의해 측정하였다. 샘플을 2중 평가하였다.
뇌졸중의 동물 모델
체중이 28 내지 30g인 성체 수컷 C57BL 마우스를 사용하였다. C57BL/10ScNJ(이전에 C57BL/10ScCr이라 칭함) 및 C57BL/10ScSn 마우스를 더 잭슨 래버러토리(The Jackson Laboratory)(미국 메인주 바 하버)로부터 획득하였다. 쥣과 균주 C57BL/10ScNJ는 TLR4 유전자의 결실에 의해 기능적 TLR4를 발현하지 않고, C57BL/10ScSn 균주는 TLR4 유전자에서 임의의 돌연변이를 발형하지 않고, 대조군으로서 사용되었다. 4마리의 TLR4 결핍 마우스를 군(C57BL/10ScNJ)마다 사용하고, 4마리의 대조군 마우스를 군(C57BL/10ScSn)마다 사용하였다. 모든 실험 프로토콜은 콤플루텐세 대학교(Universidad Complutense)(European Directives 86/609/EEC 및 32/2007/EC에 따라)의 "
Figure 112017005902301-pct00004
de Bienestar Animal"(동물 웰빙 위원회)의 가이드라인을 준수하였다. 동물은 식품 및 물에 자유로이 접근하면서 정상 온도 조건, 수분 조건 및 12시간 광/암 사이클 조건에서 감금되었다.
병소 뇌 허혈의 유도를 카사(Caso) 등의 교시내용(2007)(Caso et al., 2007, Circulation 115:1599-608)에 따라 중뇌 동맥 폐색(median cerebral arterial occlusion: MCAO)에 의해 수행하였다. 간단히 말하면, 영구적인 병소 뇌 허혈은 중뇌 동맥(MCA)의 총경동맥(CCA) 및 원위 동측성 폐색의 결찰에 의해 유도되었다. CCA의 결찰을 위해, 배쪽-자궁경부 절제를 만들어 상기 동맥을 격리시키고 이것을 결찰을 통해 영구적으로 폐색시켰다. MCA의 폐색을 위해, 왼쪽 눈의 측면 칸투스(lateral cantus) 및 외이도를 연결하는 선에 수직의 1㎝에서 절제를 만들고, 측두근을 제거하였다. 드릴 홀을 만들어 결찰에 의해 폐색된 MCA를 노출시켰다. 수술, 절제부의 봉쇄 및 소독 후, 동물은 물 및 식품에 자유로이 접근하면서 이의 우리로 돌려 보내졌다. 동물의 활력 징후는 수술 동안 제어되었다.
자기 공명 영상화에 의해 뇌 손상을 평가하였다. 간단히 말하면, 마우스를 아이소플루란에 의해 마취시키고, MCAO 후 24시간에, MRI에 의해 경색부의 크기를 평가하였다. 4.7T(Bruker-Medical(독일 에틀링겐); MRI Unit, Instituto Pluridisciplinar, UCM)에서 조작되는 BIOSPEC BMT 47/40에서 T2에서 강조된 영상(T2WI)을 획득하였다.
유세포분석법 분석
FACScan 모델 유세포분석기(Becton Dickinson Immunocytometry systems)에서 모든 유세포분석법 분석을 수행하였다. HEK-블루(상표명) 설렉션 완충제가 보충된 200㎕의 완전 배지 DMEM에서 2x105개의 세포/웰로 24웰 배양 플레이트에 HEK293 또는 HEK Blue-hTLR4 세포를 시딩함으로써 세포 표면 TLR4에 대한 압타머의 결합을 분석하였다. 이후, 세포를 30분 동안 TLR-4 활성제 LPS-EK-UP(0.4ng/웰)에 의해, 이어서 암소에서 실온에서 30분 동안 1mM MgCl2 및 1㎎/㎖의 BSA를 함유하는 PBS 완충제의 50㎕의 용적 중의 알렉사 플루오르 488 표지된 압타머(20nM)에 의해 처리하거나, 처리하지 않았다. 이후, 세포를 2㎖의 동일한 완충제에 의해 세척하고, 0.5㎖의 완충제 중에 현탁시키고, 유세포분석법 분석으로 처리하였다.
뉴클레아제 분해
95℃로 냉각시키고 얼음에서 냉각시킴으로써 300ng의 압타머를 SELEX 완충제 중에 폴딩하였다. 재폴딩된 압타머를 37℃에서 10분, 30분, 1시간, 2시간 및 4시간 동안 10㎕의 반응물 중에 2U의 λ 엑소뉴클레아제 또는 DNAse I(Fermentas)와 항온처리하였다. 이후, 샘플을 3% 아가로스 겔에서 용해시켰다. GelRed(Biotium)에 의해 밴드를 가시화하고, Image Studio Digits V3.1 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
실시예 1: TLR-4에 특이적인 압타머의 스크리닝
본 발명자들은 IBA GmbH(독일 괴팅겐)에 의해 제공된 TLR-4에 특이적인 압타머의 스크리닝을 수행하기 위해 RND40 압타머 라이브러리를 사용하였다. 초기 RND40 라이브러리는 각각 18개의 뉴클레오타이드로 이루어어진 말단에서 고정된 서열(여기서, 이것은 이의 PCR 증폭을 위해 각각의 프라이머에 혼성화함), 및 무작위 서열을 가지는 40개의 염기로 이루어진 중앙 구역을 가지는 올리고뉴클레오타이드(ssDNA)로 이루어진다.
1013개의 압타머의 초기 RND40 라이브러리를 hTLR-4에 특이적인 압타머에서 농후화시켰다. TLR-4에 의한 스크리닝의 이전 단계로서, 표적 분자(자기 수지, 표적 단백질을 발현하는 것과 동일한 세포주 등)가 제시되는 표면 또는 매트릭스에 대해 라이브러리에서 "카운터 스크리닝" 과정을 수행하였다.
실시예 2: 선택된 압타머의 규명
하기 전략에 따라 6회 스크리닝 회차 후 선택된 압타머를 확인하였다:
a) 개별 압타머를 얻을 목적을 위해 플라스미드로의 압타머의 집단의 클로닝, 및 후속하는 생거 서열분석(Sanger sequencing)에 의해.
b) 압타머의 집단의 대량 서열분석에 의해(확인되는 가장 반복된 압타머가 얻어짐).
가장 대표적인 서열을 IBA GmbH(독일 괴팅겐)에 의해 화학적으로 합성하고, 각각의 압타머의 친화도 및 활성을 ELONA에 의한 재조합 hTLR-4 단백질 또는 HEK-293 세포-TLR-4에 대한 결합에 대한 결합 검정, 재조합 TLR-4 단백질 및 세포에서 발현된 TLR-4에 대한 압타머의 결합에 대한 결합 검정, 수용체 hTLR-4 활성 검정에서 연구하였다.
ELONA 검정의 결과(도 1)는 재조합 hTLR-4 단백질에 더 효과적으로 결합하는 압타머가 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)라는 것을 명확히 보여준다. 동일한 유형의 검정에 의해, 압타머 TLRApt#2F 및 TLRApt#3R을 확인하였다. 도 2는 mFold 소프트웨어(Zuker M., 2003, Nucleic Acids Res 31:3406-15)를 사용하여 선택된 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)의 가장 가능할 것 같은 서열 및 2차 구조를 보여준다.
압타머와 결합된 hTLR-4를 가지를 Ni-NTA 수지의 항온처리, 회수 및 결합된 압타머의 후속하는 qPCR 증폭에 의해 hTLR-4에 대한 압타머의 결합의 능력을 결정하였다. 얻어진 결과는 모든 선택된 압타머가 재조합 hTLR-4 단백질에 결합할 수 있다는 것을 보여준다(도 3A). 이 실험에서, 더 낮은 Ct 값은 hTLR-4에 결합된 더 많은 양의 압타머를 나타낸다.
HEK-293 세포에서 발현된 TLR-4 단백질에 대한 결합의 확인된 압타머의 능력을 분석할 목적을 위해, 20pmol(500ng)의 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)를 HEK-293-TLR4 세포 배양에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 항온처리 후, 세포를 세척하고 회수하고, Ct 값을 계산할 목적을 위해 qPCR을 수행하였다. 이 실험에서, 더 낮은 Ct 값은 세포에 결합한 더 많은 양의 압타머를 나타낸다. 얻어진 결과는 선택된 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)(도 3B)가 더 높은 친화도로 결합한 것이다.
작용제 LPS-EK-UP(도 4A) 또는 HEK293 세포로부터의 용해물(손상 연관 분자 패턴; DAMP)(도 4B)을 사용하여 최대 길항제 효과가 얻어지는 각각의 압타머의 농도를 결정할 목적을 위해 용량-반응 곡선을 만들었다. 얻어진 결과에 기초하여, 최고의 효과가 관찰된 농도가 작용제 LPS-EK-UP에 대해 20nM 및 DAMP에 대해 200nM이라고 결론지어질 수 있다.
대식세포에 대한 압타머의 효과는 도 5에 도시되어 있다. 압타머 TLRApt#4F(서열번호 4) 및 TLRApt#4F-T(서열번호 2)는 LPS에 의한 대식세포의 자극 후 아질산염 방출을 저해하였다. 이 실험에서, 압타머 TLRApt#4F(서열번호 4)는 동일한 농도에 대해 TLRApt#4F-T(서열번호 2)보다 더 활성으로 보인다.
실시예 3: 동물 모델에서의 활성 및 안정성을 증가시키기 위한 TLR-4의 압타머 길항제의 최적화
수용체 TLR-4를 저해하는 능력을 나타낸 압타머는 뉴클레아제와 관련하여 안정성 및/또는 내성을 증가시킬 목적을 위해 이의 서열로부터 특정한 구역을 제거함으로써 변형되었다. 이를 위해, 상이한 압타머의 2차 구조의 연구는 mFold 프로그램(Zuker M., 2003, 상기 언급됨)을 사용하여 수행되었고, G-쿼드러플 구조를 형성하는 압타머의 능력은 QGRS Mapper 프로그램(Kikin et al., 2006, Nucleic Acids Res 34:W676-W682)에 의해 분석되었다. 따라서, 제1 스크리닝에서 확인된 것에 상응하는 압타머 TLRApt#1R-T(서열번호 1) 및 TLRApt#4F-T(서열번호 2)(도 6)를 설계하고 합성하였다.
실시예 4: 뇌졸중의 동물 모델에서의 TLR-4의 압타머 길항제의 효과
염증성 반응을 차단하기 위해 최적화된 새로운 압타머의 능력은 뇌졸중의 동물 모델에서 뇌졸중의 삽화 후 생성되어서, 뇌 손상을 감소시키는 TLR-4에 특이적인 압타머의 능력을 평가하였다.
이를 위해, 성체 수컷 TLR-4 결핍 마우스(C57BL/10ScNJ) 및 TLR-4를 발현하는 대조군 마우스(C57BL/10ScSn)를 사용하고, 여기서 병소 뇌 허혈은 중뇌 동맥 폐색(MCAO)에 의해 유도되었다. TLR4를 보통 발현하는 마우스(대조군 마우스)에서 얻어진 결과는 압타머가 경색된 부위의 크기를 감소시키고, 이것은 압타머 TLRApt#4F-T(서열번호 2)의 경우에 통계학적으로 유의하다는 것을 입증한다. 또한, TLR-4 결핍 마우스에서 얻은 결과는 마우스가 비히클에 의해 치료될 때 얻어진 압타머 TLRApt#4F-T(서열번호 2)에 효과가 없다는 것을 보여준다(도 7). 이 데이터는 압타머 TLRApt#4F-T(서열번호 2)의 효과가 TLR-4를 통해 발생한다는 것을 명확히 나타낸다.
또 다른 일련의 실험에서, 성체 수컷 마우스 C57BL/10ScSn(WT; 정상)을 병소 뇌 허혈의 유도로 처리하고, 상이한 양의 압타머 TLRApt#4F-T(서열번호 2) 및 TLRApt#4F(서열번호 4) 또는 비히클(PBS + 1mM Mg2+)의 복강내 주사에 의해 치료하였다. 얻어진 결과는 압타머가 1n㏖의 압타머/동물에서 경색된 부위의 및 크기를 더 크게 감소시키고, 이 감소가 통계학적으로 유의적이라는 것을 입증한다(도 8).
실시예 5: 유세포분석법
293-hTLR4A인 인간 TLR4에 의해 형질감염된 HEK293 세포주를 사용하여 유세포분석법 검정을 수행하였다. 인간 TLR4가 부족한 모 인간 HEK293 세포주를 대조군으로서 사용하였다. 이 실험에서, 압타머를 알렉사 플루오르 488에 의해 표지하였다. 도 9A는 알렉사 플루오르 488 표지된 압타머가 인간 TLR4(왼쪽 패널)가 부족한 HK293 세포가 아니라 293-hTLR4A 세포(오른쪽 패널)에 강하게 결합한다는 것을 보여준다. 또한, ApTLR#4F-T(서열번호 2)가 ApTLR#1R-T(서열번호 1)보다 높은 친화도로 표적에 결합한다는 것이 관찰되었다. 결국, hTLR4-Blue-HEK 세포의 활성화(또는 그렇지 않은) 후 선택된 압타머를 사용한 세포 염색의 결과를 비교하였다. 예상된 바대로, 압타머는 비활성화 세포에 대해 유사한 수준으로 활성화 후 TLR4에 결합하였다(도 9B).
실시예 6: 뉴클레아제 분해에 의한 반감기 계산
λ 엑소뉴클레아제 또는 DNAse I의 존재 하에 압타머의 반감기를 시험관내 측정하였다(도 10). 결과는 4개의 압타머가 λ 엑소뉴클레아제에 내성인 반면, DNAse I가 4개의 압타머의 시간 의존적 분해를 생성한다는 것으르 보여준다. 따라서, 압타머 ApTLR#1R-T(서열번호 1)는 가장 실용적이고, DNAse I의 존재 하에 5분 항온처리 후 완전히 분해되었다. 반대로, 압타머 ApTLR#4F(서열번호 4) 및 ApTLR#4F-T(서열번호 2)는 DNAse I와의 2시간 항온처리 후에도 내성이었다.
결론
- 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)는, 이의 가용성 재조합 형태로(시험관내) HEK293 세포의 막에 통합된 채(생체내) 둘 다에서, 인간 수용체 TLR-4를 인식하는 수용체 TLR-4의 세포외 도메인과 관련하여 선택된다.
- 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)는 수용체 TLR-4의 길항제 효과를 보여준다.
- 압타머 TLRApt#1R-T(서열번호 1) 및 TLRApt#4F-T(서열번호 2)는 절두 형태로 얻어져, 각각 원래 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)의 길항제 활성을 유지시킨다.
- 압타머 TLRApt#4F-T(서열번호 2)는 뇌졸중의 동물 모델에서 경색된 부위를 감소시킬 수 있다.
- TLR4 수용체의 세포외 도메인에 대해 선택된 압타머 TLRApt#1R(서열번호 3) 및 TLRApt#4F(서열번호 4)는, 이의 재조합 가용성 형태(시험관내)로 HEK293 세포의 막에 통합된 채(생체내) 둘 다에서, 인간 TLR-4 수용체를 인식한다.
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Claims (25)

  1. TLR-4에 특이적으로 결합하고 이를 저해하는 능력을 가지고 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 함유하는 핵산 압타머.
  2. TLR-4에 특이적으로 결합하고 TLR-4 활성을 저해하는 능력을 가지고, Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 서열번호 1 또는 서열번호 2와 적어도 70% 의 서열 동일성을 가지는 것으로 결정된 작용상 동등한 변이체 서열을 함유하는 핵산 압타머로서,
    상기 압타머는 40 내지 100 뉴클레오타이드의 길이를 가지고,
    상기 압타머는 TLR-4에 특이적으로 결합하고, 및
    상기 압타머는 TLR-4 활성을 저해하는 것인, 핵산 압타머.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TLR-4는 인간 TLR-4인, 압타머.
  4. 제1항에 따른 압타머 및 작용상 그룹(functional group)을 포함하는 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 작용상 그룹은 검출 가능한 시약, 약물 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된, 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 나노입자는 금속 나노입자인, 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 자기 메조다공성 실리카 나노입자인, 복합체.
  8. 제2항에 따른 압타머 및 작용상 그룹(functional group)을 포함하는 복합체.
  9. TLR-4를 시험관 내에서 검출하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 압타머 또는 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 복합체.
  10. TLR-4의 시험관 내 저해제로서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 압타머 또는 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 복합체.
  11. 샘플 내의 TLR-4의 검출을 위한 시험관내 방법으로서,
    ⅰ) 상기 샘플을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 압타머 또는 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 복합체와 접촉시키는 단계,
    ⅱ) TLR-4에 결합되지 않은 압타머 또는 복합체를 분리시키는 단계, 및
    ⅲ) 상기 샘플에 존재하는 TLR-4에 결합된 압타머 또는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 시험관내 방법.
  12. TLR-4를 저해하기에 적합한 조건에서 TLR-4를 포함하는 샘플을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 압타머 또는 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플 내의 TLR-4를 저해하기 위한 시험관내 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 샘플은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플인, 시험관내 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 샘플은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플인, 시험관내 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 압타머 또는 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하는,
    TLR-4의 발현의 증가 및/또는 TLR-4의 활성화의 증가를 특징으로 하는 병리학의 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
    TLR-4의 발현의 증가 및/또는 활성화의 증가를 특징으로 하는 상기 병리학은 뇌졸중, 급성 심근 경색, 패혈증, 죽상동맥경화증, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 약물 중독, 및 망막 퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    망막 퇴행성 질환인 경우 연령 관련 황반변성, 스타르가르트병(Stargardt disease), 망막색소변성증, 맥락막결여, 레버 선천성 흑내장(Leber congenital amaurosis), 연소성 망막층간분리(retinoschisis juvenile), 어셔병(Usher disease) 및 바르데 비들(Bardet Biedl)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 용매를 더욱 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. TLR4를 발현하는 세포, 조직 또는 장기의 생체내 영상화를 위한, 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 복합체로서, 상기 복합체 내의 작용상 그룹이 검출 가능한 모이어티인, 복합체.
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