BR112016030172B1 - Aptâmeros específicos para tlr-4 e usos dos mesmos - Google Patents

Aptâmeros específicos para tlr-4 e usos dos mesmos Download PDF

Info

Publication number
BR112016030172B1
BR112016030172B1 BR112016030172-2A BR112016030172A BR112016030172B1 BR 112016030172 B1 BR112016030172 B1 BR 112016030172B1 BR 112016030172 A BR112016030172 A BR 112016030172A BR 112016030172 B1 BR112016030172 B1 BR 112016030172B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
tlr
aptamer
seq
complex
sample
Prior art date
Application number
BR112016030172-2A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112016030172A2 (pt
Inventor
Ignacio LIZASOAIN HERNÁNDEZ
Víctor Manuel González Muñoz
Gerónimo Fernández Gómez-Chacón
María Ángeles Moro Sánchez
Mª ELENA MARTÍN PALMA
Ana MORAGA YÉBENES
Original Assignee
Aptatargets, S.L
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aptatargets, S.L filed Critical Aptatargets, S.L
Publication of BR112016030172A2 publication Critical patent/BR112016030172A2/pt
Publication of BR112016030172B1 publication Critical patent/BR112016030172B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/04—X-ray contrast preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/36—Opioid-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

APTÂMEROS ESPECÍFICOS PARA TLR-4 E USOS DOS MESMOS A presente invenção refere-se a um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4, a um complexo que compreende o dito aptâmero e um grupo funcional, assim como a composições farmacêuticas dos mesmos. A invenção também se refere a usos e métodos para detectar TLR-4 e a usos e métodos para inibir TLR-4. Finalmente, a invenção também se refere a um aptâmero para uso na fabricação de um fármaco para o tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção fornece aptâmeros de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e usos dos mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Sabe-se hoje em dia que o Sistema Nervoso Central (CNS) responda tanto a infecções bacterianas quanto a danos no cérebro com uma reação imunológica inata muito bem organizada. O sistema imunológico inato pode reconhecer padrões moleculares altamente conservados através, dentre outras coisas, de receptores do tipo Toll (TLR).
[0003] TLR4 foi o primeiro TLR distinguido em mamíferos. Ligantes exógenos foram descritos para esse TLR, tais como lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, ácido lipoteicoico (LTA) de bactérias gram-positivas ou proteína F de vírus respiratório sincicial. Ademais, os ligantes endógenos mais importantes são HMBG1, HSP-60 de uma origem endógena ou derivados de Chlamydia pneumoniae, HPS-70, fibronectina, fibrinogênio, ácido hialurônico, etc., todos derivados de danos ao tecido, danos celulares e/ou dos vasos do hospedeiro. TLR4 está envolvido em um grande número de patologias altamente prevalentes, tal como acidente vascular cerebral ou doença cerebrovascular, infarto agudo do miocárdio, sepse, aterosclerose, esclerose múltipla, artrite reumatoide, uma doença degenerativa da retina e toxicodependência, dentre outras coisas.
[0004] O envolvimento da imunidade inata e, particularmente, de TLRs em múltiplas patologias tem despertado interesse crescente no desenvolvimento de agonistas e antagonistas desses receptores. Os agonistas foram, portanto, desenvolvidos para o possível tratamento de câncer, doenças alérgicas, infecções e como coadjuvantes de vacina. Adicionalmente, os antagonistas de TLR estão sendo estudados na sepse, na aterosclerose, na dor crônica e na colite; de fato, há diversos antagonistas, eritoran (fase III), ibudilast (Av411; fase II) e anticorpos NI-0101 (fase pré- clínica), que estão sendo estudados nessas patologias.
[0005] O documento de patente WO 2006/138681 descreve um método para inibir a deleção de célula T ativada intra-hepática por meio da administração de um inibidor de TLR-4, dentre os quais, aptâmeros específicos para TLR-4 são mencionados.
[0006] Roger e outros (Roger et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:2.348 a 2.352) descrevem anticorpos específicos para o domínio extracelular de TLR4. Esses anticorpos fornecem proteção contra sepse letal de bactérias gram-negativas em camundongos. A utilidade terapêutica desses anticorpos anti-TLR4 é também sugerida dado que o tratamento é eficaz quando os anticorpos são administrados até 4 h após a exposição a uma endotoxina e até 13 h após o início da infecção devido à Escherichia coli.
[0007] Portanto, há uma necessidade na técnica de novas moléculas com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que sejam úteis como agentes terapêuticos.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0008] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas.
[0009] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um complexo que compreende o aptâmero da invenção e um grupo funcional.
[0010] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se ao uso do aptâmero da invenção ou do complexo da invenção para detectar TLR-4.
[0011] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se ao uso in vitro do aptâmero da invenção ou do complexo da invenção para inibir TLR-4.
[0012] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um método in vitro para a detecção de TLR-4 em uma amostra que compreende
[0013] i) colocar a dita amostra em contato com um aptâmero de acordo com a invenção ou um complexo de acordo com a invenção,
[0014] ii) separar o aptâmero ou complexo não ligado a TLR-4, e
[0015] iii) detectar a presença do aptâmero ou complexo ligado ao TLR-4 presente na amostra.
[0016] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um método in vitro para inibir TLR-4 em uma amostra que compreende colocar uma amostra que compreende TLR-4 em contato com um aptâmero de acordo com a invenção ou um complexo de acordo com a invenção, em condições adequadas para inibir TLR-4.
[0017] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se um aptâmero da invenção para uso no tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4.
[0018] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um aptâmero de acordo com a invenção ou pelo menos um complexo de acordo com a invenção, opcionalmente em combinação com um ou mais carreadores, excipientes ou solventes farmaceuticamente aceitáveis.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0019] Figura 1 Reconhecimento da proteína de TLR- 4 pelos aptâmeros selecionados por meio de ELONA. A proteína de TLR-4 recombinante humana (6xHIS-TLR-4) foi cultivada a uma concentração de 100 ng/cavidade em placas de microtitulação de 96 cavidades e incubada a 4 °C por 16 h. Subsequentemente, 20 pmol de cada um dos aptâmeros identificados como digoxigenina foram adicionados a cada cavidade, e a placa foi incubada por 1 h a 37 °C. Finalmente, a placa foi incubada com anticorpos antidigoxigenina conjugados com peroxidase e desenvolvida com o uso de ABTS. Um aptâmero de DNA anti-Li H2A foi usado como um controle positivo (Martín et al., 2013, PLoS ONE 8: e78886). Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
[0020] Figura 2 Estruturas secundárias dos aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) previstas com o uso do programa mFold. As guaninas que poderiam ser parte das estruturas G-quadruplex previstas são mostradas nas caixas com o programa QGRS Mapper.
[0021] Figura 3 Ligação dos aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) a hTLR-4 recombinante (A) e à proteína de TLR-4 expressa nas células (B). Todos os experimentos foram feitos em triplicata.
[0022] Figura 4 Efeito de antagonista dos aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) em células de hTLR4 HEK-Blue e antagonista LPS-RS-UP (2 ng/μl; 20 ng) como o controle. Os aptâmeros foram aplicados a concentrações finais de 0,2, 2, 20 e 200 nM ou o controle de antagonista LPS-RS-UP (2 ng/μl; 20 ng). O agonista LPS-EK- UP (0,02 ng/μl) (A) ou lisados de células HEK293 (padrão molecular associado a danos; DAMP) (B) foram usados como o controle de agonista e secretados, a atividade de fosfatase alcalina (SEAP) foi medida após 24 h com o uso do substrato QUANTI-Blue™ a 630 nm. Os dados são expressos como a porcentagem da atividade de SEAP em relação às células de controle. Todos os experimentos foram feitos em triplicata, e a média de 7 a 9 experimentos diferentes é mostrada na Figura. Significância estatística (*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001).
[0023] Figura 5 Efeito dos aptâmeros TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) em macrófagos estimulados na presença de 500 ng/ml de LPS. A liberação de nitritos foi estudada pela reação de Griess a 24 h de dependência de aptâmeros. As amostras foram avaliadas em duplicata. As diferenças foram analisadas por ANOVA unidirecional seguida pelo teste de Bonferroni. O resultado é a média de três experimentos testados em duplicata. Significância estatística (***P<0,001). Chaves: 38x (AG) é o oligonucleotídeo da sequência SEQ ID NO: 7 que é uma sequência não específica que não tem a capacidade de adotar qualquer estrutura secundária; Inh: composto derivado de hispanolona 11 (Girón et al., 2008, Toxicol Appl Pharmacol 228:179 a 189).
[0024] Figura 6. Estruturas secundárias dos aptâmeros TLRApt#1R-T (SEQ ID NO: 1) e TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) previstas com o uso do programa mFold. As guaninas que poderiam ser parte das estruturas G-quadruplex previstas são mostradas nas caixas com o programa QGRS Mapper.
[0025] Figura 7. Efeito da injeção intraperitoneal de 1 nmol dos aptâmeros TLRApt#1R-T (SEQ ID NO: 1), TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) ou 38x(AG) (SEQ ID NO: 7) ou veículo (PBS + Mg2+ a 1 mM) na redução da área infartada em animais usados em experimentos. Camundongos machos adultos C57BL/10ScSn (WT; normais) e C57BL/10ScNJ (KO, sem TLR4 funcional) foram submetidos à indução de uma isquemia cerebral focal por meio da oclusão da artéria cerebral média por meio de ligadura. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano, e, 24 horas após MCAO, o tamanho do infarto foi avaliado por IRM. As imagens destacadas em T2 (T2WI) foram adquiridas em BIOSPEC BMT 47/40 operando a 4,7 T (Bruker-Medical, Ettlingen, Alemanha; MRI Unit, Instituto Pluridisciplinar, UCM), e a área danificada é quantificada por meio de Image J 1.41 (NIH, Bethesda, Washington). Significância estatística (*P<0,05). Chaves:1RT, TLRApt#1R-T; 4FT, TLRApt#4F-T; 4F, TLRApt#4F.
[0026] Figura 8: Curva de resposta à dose. Efeito da injeção intraperitoneal de diferentes quantidades dos aptâmeros TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) ou veículo (PBS + Mg2+ a 1 mM) na redução da área infartada em animais usados em experimentos. Camundongos machos adultos C57BL/10ScSn (WT; normais) foram submetidos à indução de uma isquemia cerebral focal por meio da oclusão da artéria cerebral média por meio de ligadura. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano, e, 24 horas após MCAO, o tamanho do infarto foi avaliado por IRM. As imagens destacadas em T2 (T2WI) foram adquiridas em BIOSPEC BMT 47/40 operando a 4,7 T (Bruker-Medical, Ettlingen, Alemanha; MRI Unit, Instituto Pluridisciplinar, UCM), e a área danificada é quantificada por meio de Image J 1.41 (NIH, Bethesda, Washington). Significância estatística (*P<0,05).
[0027] Figura 9: Ensaios de citometria de fluxo. (A) As linhagens celulares HEK293 (painel esquerdo) e 293-hTLR4A (painel direito) humanas foram incubadas com aptâmeros identificados como Alexa fluor 488 a 20 nM por 30 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas com 2 ml de PBS e ressuspensas em 1 ml de PBS para análise. Em cada Figura, a ordenada representa a frequência de eventos (ou número de células) enquanto a abscissa indica a intensidade da fluorescência (FL1). Área preta, autofluorescência; linha preta, aptâmero TLRApt#1R-T (SEQ ID NO: 31); linha cinza, aptâmero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 42). (B) A linhagem celular 293- hTLR4A humana é ativada com LPS-EK-UP e, então, incubada por 30 min com 20 nM de aptâmeros identificados com Alexa Fluor 488 por 30 min à temperatura ambiente. As células são lavadas com 2 ml de PBS e ressuspensas em 1 ml de PBS para análise. Em cada Figura, a ordenada representa a frequência de eventos (ou número de células) enquanto a abscissa indica a intensidade da fluorescência (FL1). Área preta, autofluorescência; linha preta, aptâmero TLRApt#1R-T (SEQ ID NO: 31); linha cinza, aptâmero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 42).
[0028] Figura 10: Análise da meia-vida dos aptâmeros in vitro. Trezentos ng de aptâmeros dobrados foram incubados com 2 unidades de À Exonuclease ou DNAse I por diversos períodos de tempo a 37 °C. Depois, as amostras foram solvidas em um gel de agarose 3%, e as bandas visualizadas por GelRed e quantificadas com o uso do software Image Studio Digits V3.1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0029] Os autores da presente invenção selecionaram e distinguiram duas moléculas que, devido a suas sequências, podem ser estruturados tridimensionalmente em determinadas condições de pH, temperatura e concentração salina, dando às mesmas a capacidade de reconhecer especificamente a proteína de TLR-4 e modular sua atividade. Essas moléculas podem inibir a resposta celular mediada pelo receptor TLR-4 in vivo e podem reduzir o tamanho do infarto cerebral em modelos animais do infarto isquêmico, dando às mesmas um papel terapêutico potencial.
APTÂMERO ESPECÍFICO PARA TLR-4
[0030] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4, doravante referido como o “aptâmero da invenção”, e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1(CCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCAGGTCGACACC) e SEQ ID NO: 2(GGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCGGTTGGCCCT AAATACGAG) ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas.
[0031] O termo “aptâmero”, no contexto da presente invenção, refere-se a cadeias de ácido nucleico de fita simples que adotam uma estrutura terciária específica que permite que as mesmas se liguem a alvos moleculares com alta especificidade e afinidade, comparável a esta de anticorpos monoclonais, através de interações diferentes do pareamento de base de Watson-Crick convencional.
[0032] O termo “ácido nucleico”, no contexto da presente invenção, refere-se a qualquer tipo de ácido nucleico, tal como DNA e RNA, e a variantes dos mesmos, tal como ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA), assim como combinações dos mesmos, modificações dos mesmos, incluindo nucleotídeos modificados, etc. Os termos “ácido nucleico” e “oligonucleotídeo” e “polinucleotídeo” são usados de maneira intercambiável no contexto da presente invenção. Os ácidos nucleicos podem ser purificados de fontes naturais, produzidos com o uso de sistemas de expressão recombinante e, opcionalmente, purificados, quimicamente sintetizados, etc. Quando apropriado, por exemplo, no caso de moléculas quimicamente sintetizadas, os ácidos nucleicos podem compreender análogos de nucleosídeo tais como análogos que têm bases ou açúcares quimicamente modificados, modificações da cadeia principal, etc. Uma sequência de ácidos nucleicos é representada na direção 5’-3’ a não ser que indicado de outro modo.
[0033] O termo “TLR-4”, no contexto da presente invenção, refere-se ao receptor de membrana receptor do tipo Toll 4. O receptor TLR-4 pode também ser referido como ARMD10, CD284, TLR4 ou hTOLL. Em seres humanos, o receptor TLR-4 foi registrado no GenBank sob o número de acesso O00206.2 em 27 de maio de 2014, e o mesmo é codificado pelo gene TLR4. O mesmo é composto de 839 aminoácidos, dos quais, os resíduos 1 a 23 constituem a sequência de sinais, os resíduos 24 a 631 constituem o domínio extracelular, os resíduos 632 a 652 constituem o domínio transmembranar, e os resíduos 653 a 839 constituem o domínio citoplasmático.
[0034] Em uma modalidade particular, o aptâmero pode se ligar especificamente ao domínio extracelular de TLR-4 (aminoácidos 24 a 631).
[0035] A presente invenção contempla um aptâmero que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1(CCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCGTAGATCAGGTCGACACC) e SEQ ID NO: 2(GGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCGGTTGGCCCT AAATACGAG) ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas.
[0036] A presente invenção também contempla os aptâmeros da invenção que são compostos de ácidos nucleicos tais como DNA e RNA, assim como de variantes e análogos de ácido nucleico e combinações dos mesmos, modificações dos mesmos, incluindo, sem limitação, cadeias principais de ácido nucleico modificadas, ligações de substituição, nucleotídeos modificados e análogos de ribose ou desoxirribose, nucleotídeos modificados, etc., com uma capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% da capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 do aptâmero de sequência SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Os exemplos não limitantes de variantes e análogos de ácido nucleico incluem, sem limitação, PNA, LNA e TNA.
[0037] O termo “variante de ácido nucleico” ou “análogo de ácido nucleico”, no contexto da presente invenção, refere-se a variantes e análogos de ácido nucleico incluindo, sem limitação, cadeias principais de ácido nucleico modificadas, ligações de substituição, nucleotídeos modificados e análogos de ribose ou desoxirribose. Por exemplo, as variantes de ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem compreender estruturas com cadeias principais sintéticas análogas da cadeia principal de fosfodiéster típica. As mesmas incluem, sem limitação, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster alquílico, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato, carbamato de morfolina e ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ligações de metilfosfonato ou metilfosfonato e fosfodiéster e benzilfosfonato alternados.
[0038] As variantes de ácido nucleico podem também conter uma ou mais ligações de “substituição”, conforme é geralmente entendido na técnica. Algumas dessas ligações de substituição são apolares e contribuem para o fornecimento do aptâmero com uma capacidade de se espalhar através das membranas. Essas ligações de “substituição” são definidas no presente documento como ligações alternativas convencionais, tais como fosforotioato ou fosforamidato, e são sintetizadas conforme descrito na literatura comumente disponível. Os grupos de ligação alternativos incluem, de uma maneira não limitante, as modalidades em que uma porção de fórmula P(O)S, (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), P(O)NR'2, P(O)R', P(O)OR6, CO ou CONR'2, em que R' é H (ou um sal) ou um grupo alquila de 1 a 12 átomos de carbono, e R6 é um grupo alquila de 1 a 9 átomos de carbono que se liga a nucleotídeos adjacentes através de -S- ou -O-. As ligações de ditioato são descritas no pedido de patente n° US 248517. A presente invenção também contempla o uso de ligações de substituição incluindo ligações entre nucleotídeos que não têm base em fósforo, tais como ligações entre nucleotídeos de 3'-tioformacetal, (-S-CH2-O-), formacetal (-O-CH2-O-) e 3'- amina (-NH-CH2-CH2-) descritas nos pedidos de patente n° US 690786 e 763130. Uma ou mais ligações de substituição podem ser usadas nos aptâmeros da invenção para o propósito de facilitar ainda mais a ligação a TLR-4 ou para aumentar a estabilidade dos aptâmeros contra nucleases, assim como para fornecer capacidade de permeação. Nem todas as ligações dentro do mesmo aptâmero têm que ser idênticas, e a presente invenção contempla, portanto, aptâmeros com todas as ligações idênticas assim como aptâmeros com uma variação na composição de suas ligações.
[0039] Igualmente, as variantes de ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem também conter formas análogas de ribose ou desoxirribose que são bem conhecidas na técnica, incluindo, sem limitação, açúcares substituídos em 2’, tais como 2'-O-metil-ribose, 2'-fluoro- ribose ou 2'-azido-ribose, análogos carbocíclicos de açúcares, açúcares α- anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose e sedoeptuloses. Os ácidos nucleicos podem também conter ácido nucleico de treose (TNA, também referido como oligonucleotídeos de alfa-treofuranosila) (consulte, por exemplo, Schong et al., Science 2000, 17 de novembro, 290 (5495): 1.347 a 1.351). Particularmente, a substituição na posição 2' do resíduo de furanose é particularmente importante em relação à melhora na estabilidade de nuclease.
[0040] O termo “nucleotídeo”, no contexto da presente invenção, refere-se aos monômeros que compõem os ácidos nucleicos. Os nucleotídeos são formados por uma pentose, uma base nitrogenosa e um grupo fosfato e são ligados por meio de ligações de fosfodiéster. Os nucleotídeos que são parte do DNA e RNA diferem-se na pentose, esta sendo desoxirribose e ribose, respectivamente. As bases nitrogenosas, por sua vez, são divididas em bases nitrogenosas de purina, que são adenina (A) e guanina (G), e em bases nitrogenosas de pirimidina, que são timina (T), citosina (C) e uracila (U). A timina aparece apenas no DNA, enquanto que a uracila aparece apenas no RNA. A presente invenção contempla o uso de nucleotídeos modificados no aptâmero da invenção. O termo “nucleotídeo modificado”, no contexto da presente invenção, refere-se a análogos de nucleotídeos naturais conhecidos, com propriedades de ligação similares ou melhoradas. As formas análogas de purinas e pirimidinas são bem conhecidas na técnica e incluem, sem limitação, aziridinilcitosina, 4- acetilcitosina, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-carboximetilaminometil-2- tiouracila, 5-carboximetilaminometiluracila, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metiladenina, 1-metilpseudouracila, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5-metoxiaminometil- 2-tiouracila, beta-D-manosilceosina, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracila, ceosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5- metiluracila, ácido uracil-5-oxiacético e 2,6-diaminopurina. Adicionalmente aos nucleotídeos modificados anteriores, os resíduos de nucleotídeo que não têm uma purina ou uma pirimidina também podem ser incluídos na presente invenção.
[0041] Adicionalmente às variantes anteriores, as variantes de ácido nucleico compreendidas na invenção também incluem PNA, LNA e cadeias 5’-5’ ou 3’-3‘. O termo “ácido nucleico peptídico” ou “PNA”, no contexto da presente invenção, refere-se a um oligonucleotídeo cuja cadeia principal é composta de unidades repetitivas de ligação de N-(2-aminoetil)- glicina por ligações peptídicas, em que as diferentes bases nitrogenosas são ligadas à cadeia essencial por uma ligação de metileno (-CH2-) e um grupo carbonila ((C=O)-). O termo “ácido nucleico bloqueado” ou “LNA”, no contexto da presente invenção, refere-se a um nucleotídeo de RNA modificado cuja porção de ribose é modificada com uma ligação adicional que conecta o oxigênio em 2’ com o carbono em 4’, bloqueando a ribose na conformação 3'- endo. O termo “cadeia 5’-5’” ou “cadeia 3’-3’”, no contexto da presente invenção, refere-se a oligonucleotídeos em que o nucleotídeo das extremidades 3’ ou 5’, respectivamente, está invertido.
[0042] Conforme é usado no presente documento, o termo “variante funcionalmente equivalente” refere-se a aptâmeros com sequências substancialmente similares à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 mantendo a capacidade de se ligar especificamente e inibir TLR-4. Uma variante funcionalmente equivalente do aptâmero da invenção pode ser uma sequência de ácidos nucleicos derivada da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 que compreende a adição, substituição ou modificação de um ou mais nucleotídeos. A título de ilustração, as variantes funcionalmente equivalentes do aptâmero da invenção incluem sequências que compreendem a adição de 1 nucleotídeo, 2 nucleotídeos, 3 nucleotídeos, 4 nucleotídeos, 5 nucleotídeos, 10 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 25 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 35 nucleotídeos, 40 nucleotídeos, 45 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 70 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 90 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 150 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 1.000 nucleotídeos ou mais na extremidade 5’ da sequência SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 e/ou que compreendem a adição de 1 nucleotídeo, 2 nucleotídeos, 3 nucleotídeos, 4 nucleotídeos, 5 nucleotídeos, 10 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 25 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 35 nucleotídeos, 40 nucleotídeos, 45 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 60 nucleotídeos, 70 nucleotídeos, 80 nucleotídeos, 90 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 150 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 1.000 nucleotídeos ou mais na extremidade 3’ da sequência SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 e que mantêm uma capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 100% da capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4.
[0043] A presente invenção também inclui aptâmeros que compreendem sequências de nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com as sequências SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 e que mantêm uma capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 100% da capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4.
[0044] Os termos “identidade”, "idênticas" ou “identidade percentual", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos, referem- se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido que é igual, quando comparadas e alinhadas (introduzindo lacunas, se necessário) para correspondência máxima, sem considerar quaisquer substituições de aminoácido conservadoras como parte da identidade de sequência. A identidade percentual pode ser medida com o uso de algoritmos ou software de comparação de sequência ou por inspeção visual. Vários algoritmos e software são conhecidos na técnica que podem ser usados para obter alinhamentos de sequências de aminoácidos ou nucleotídeos. Tal exemplo não limitante de um algoritmo de alinhamento de sequências é o algoritmo descrito em Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2.264 a 2.268, conforme modificado em Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5.873 a 5.877, e incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3.389 a 3.402). Em determinadas modalidades, Gapped BLAST pode ser usado conforme descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3.389 a 3.402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460 a 480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Califórnia) ou Megalign (DNASTAR) são programas de software publicamente disponíveis adicionais que podem ser usados para alinhar sequências. Em determinadas modalidades, a identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos determinadas com o uso do programa GAP no software GCG (por exemplo, com o uso de uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 90 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6). Em determinadas modalidades alternativas, o programa GAP no pacote de software GCG que incorpora o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444 a 453 (1970)) pode ser usado para determinar a identidade percentual entre as duas sequências de aminoácidos (por exemplo, com o uso de uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250 e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, em determinadas modalidades, a identidade percentual entre sequências de nucleotídeos ou aminoácidos é determinada com o uso do algoritmo de Myers e Miller (CABIOS, 4:11 a 17 (1989)). Por exemplo, a identidade percentual pode ser determinada com o uso do programa ALIGN (versão 2.0) e com o uso de um PAM120 com tabela de resíduo, penalidade por comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade por lacuna de 4. Os parâmetros apropriados para o alinhamento máximo pelo software de alinhamento particular podem ser determinados por uma pessoa versada na técnica. Em determinadas modalidades, os parâmetros padrão do software de alinhamento são usados. Em determinadas modalidades, a identidade de porcentagem "X" de uma primeira sequência de aminoácidos para uma segunda sequência aminoácido é calculada como 100 x (Y/Z), em que Y é o número de resíduos de aminoácido classificados como correspondências idênticas no alimento da primeira e da segunda sequências (conforme alinhado por inspeção visual ou um programa de alinhamento de sequências particular), e Z é o número total de resíduos na segunda sequência. Se a segunda sequência for mais longa do que a primeira sequência, então, a identidade percentual pode ser determinada apenas na região de sobreposição entre a dita primeira e a dita segunda sequências. Nesse caso, a mesma fórmula que acima pode ser usada, mas usando como o valor Z o comprimento da região em que a primeira e a segunda sequências se sobrepõem, sendo que a dita região tem um comprimento que é substancialmente igual ao comprimento da primeira sequência.
[0045] Como um exemplo não limitante, a possibilidade de qualquer polinucleotídeo particular ter uma determinada identidade de sequência percentual (por exemplo, ser pelo menos 80% idêntico, pelo menos 85% idêntico, pelo menos 90% idêntico e, em algumas modalidades, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico) com uma sequência de referência pode, em determinadas modalidades, ser determinada com o uso do programa Bestfit (Pacote de Análise de Sequência de Wisconsin, Versão 8 para Unix, Grupo de Computação Genética, Parque Universitário de Pesquisa, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit usa o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482 a 489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao usar Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar a possibilidade de uma sequência particular ser, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são definidos de modo que a porcentagem de identidade seja calculada ao longo do comprimento completo da sequência de nucleotídeos de referência e que lacunas na homologia de até 5% do número total de nucleotídeos na sequência de referência sejam permitidas.
[0046] Em algumas modalidades, dois ácidos nucleicos da invenção são substancialmente idênticos, significando que os mesmos têm pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% e, em algumas modalidades, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de resíduo de nucleotídeo ou aminoácido, quando comparados e alinhados para correspondência máxima, conforme medido com o uso de um algoritmo de comparação de sequências ou por inspeção visual. A identidade pode existir ao longo de uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 10, cerca de 20, cerca de 40 a 60 resíduos de comprimento ou qualquer valor integral entre os mesmos e pode ser ao longo de uma região mais longa do que 60 a 80 resíduos, por exemplo, pelo menos cerca de 90 a 100 resíduos, e, em algumas modalidades, as sequências são substancialmente idênticas ao longo do comprimento completo das sequências sendo comparadas, tal como a região de codificação de uma sequência de nucleotídeos, por exemplo.
[0047] O termo “ligação específica” ou “ligação específica a TLR-4”, no contexto da presente invenção, refere-se à associação física não covalente entre duas moléculas, o aptâmero da invenção e o receptor TLR-4. A ligação entre o aptâmero da invenção e o receptor TLR-4 é considerada específica se a força de ligação entre ambos for pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 75 vezes ou pelo menos 100 vezes maior do que a força de ligação entre o aptâmero da invenção e uma molécula irrelevante. A ligação entre o aptâmero da invenção e o receptor TLR-4 é também considerada específica se a constante de dissociação de equilíbrio Kd for 10-3 M ou menos, 10-4 M ou menos, 10-5 M ou menos, 10-6 M ou menos, 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos ou 10-12 M ou menos sob as condições usadas, por exemplo, em condições fisiológicas, condições de cultura celular ou condições que permitem a sobrevivência de célula.
[0048] A capacidade do aptâmero da invenção de se ligar especificamente a TLR-4 pode ser determinada por meio de uma faixa de ensaios que estão disponíveis na técnica. De preferência, a capacidade do aptâmero da invenção de ligação específica a TLR-4 é determinada por meio de ensaios de ligação in vitro, tais como o ensaio de oligonucleotídeo ligado à enzima (ELONA), o ensaio sorvente de aptâmero ligado à enzima (ELASA), precipitação e PCR quantitativa (qPCR) ou por técnicas de fluorescência tais como apta-histoquímica, aptacitoquímica, microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. Igualmente, tanto a capacidade de ligação específica a TLR-4 quanto a afinidade do aptâmero para TLR-4 podem ser determinadas por técnicas bem conhecidas pela pessoa versada na técnica, tal como ensaio de alteração de mobilidade em gel, ressonância de plásmon de superfície (SPR), eletroforese capilar cinética e ensaio de ligação de fluorescência. Resumidamente, o ensaio de ligação de fluorescência consiste na incubação de esferas magnéticas revestidas com TLR-4 com diferentes concentrações (por exemplo, de 0 a 100 nM) do aptâmero da invenção identificado (por exemplo, com carboxifluoresceína, FAM) e a eluição e detecção subsequentes dos aptâmeros ligados; as constantes de dissociação (Kd) são calculadas por análise de ajuste não linear.
[0049] O termo “inibição de TLR-4”, no contexto da presente invenção, refere-se ao bloqueio ou diminuição da atividade de TLR-4, isto é, a transdução do sinal mediado por receptor TLR-4. Considera-se que a atividade de TLR-4 é inibida por um agente inibidor ou antagonista quando a atividade é pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, pelo menos 15%, pelo menos 10%, pelo menos 5%, pelo menos 1% ou menos da atividade de TLR-4 na presença de seu agonista natural LPS.
[0050] A capacidade do aptâmero da invenção de inibir TLR-4 pode ser determinada por meio de uma faixa de ensaios que estão disponíveis na técnica. De preferência, a capacidade de inibir TLR-4 do aptâmero da invenção é determinada por meio de ensaios in vitro com células que expressam TLR-4 recombinante e um gene-repórter, cuja expressão está associada à ativação do TLR-4 recombinante. A pessoa versada na técnica reconhecerá que há múltiplas variantes desse método, dependendo da célula e do gene recombinante usado. Um exemplo desse ensaio é incluído nos exemplos da presente invenção (seção em “Materiais e métodos” e Exemplo 2). Outras técnicas disponíveis incluem a determinação dos níveis de citocinas inflamatórias, tais como IL-1, IL-8, TNF-alfa e IL-12, liberadas pelas células que expressam TLR-4.
[0051] Em uma modalidade particular, o aptâmero da invenção consiste em entre 30 e 200 nucleotídeos, de preferência, entre 35 e 150 nucleotídeos, de maior preferência, entre 40 e 100 nucleotídeos, de ainda maior preferência, entre 45 e 80 nucleotídeos.
[0052] Em outra modalidade particular, o aptâmero da invenção compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3 (GTTGCTCGTATTTAGGGCCACCGGCACGGGACAAGGCGCGGGACGGCG TAGATCAGGTCGACACCAGTCTTCATCCGC) e SEQ ID NO: 4 (GCGGATGAAGACTGGTGTGCCAATAAACCATATCGCCGCGTTAGCATGTACTCGGTTGGCCC TAAATACGAGCAAC). A sequência SEQ ID NO: 3 é uma variante funcionalmente equivalente da SEQ ID NO: 1, e a sequência SEQ ID NO: 4 é uma variante funcionalmente equivalente da SEQ ID NO: 2.
[0053] Em uma modalidade particular, o ácido nucleico é DNA. Em outra modalidade particular, o ácido nucleico é RNA. Em outra modalidade particular, o ácido nucleico é PNA. Em outra modalidade particular, o ácido nucleico é LNA. Em outra modalidade particular, o ácido nucleico é TNA.
[0054] Em outra modalidade particular, o TLR-4 é um TLR-4 selecionado a partir do grupo formado por TLR-4 de camundongo, rato, coelho, porco, gato, cão, cavalo, primata e ser humano. Em uma modalidade preferencial, o TLR-4 é um TLR-4 humano.
[0055] A produção do aptâmero da invenção pode ser executada seguindo métodos convencionais na técnica. Os exemplos não limitantes de técnicas para a produção de aptâmeros incluem técnicas enzimáticas, tais como transcrição, sistemas de expressão recombinante e síntese química de fase sólida padrão (ou fase de solução), todos comercialmente disponíveis. Quando apropriado, por exemplo, no caso em que o aptâmero da invenção compreende variantes de ácido nucleico tais como aquelas descritas acima, análogos de nucleotídeo tais como análogos que têm açúcares ou bases quimicamente modificadas, modificações de cadeia principal, etc., o aptâmero da invenção será produzido por meio da síntese química. Alternativamente, a expressão será a técnica preferencial para a produção de aptâmeros quando os ditos aptâmeros têm um comprimento de 200 nucleotídeos ou mais. Os aptâmeros produzidos por qualquer uma das técnicas anteriores podem ser opcionalmente purificados por métodos que são bem conhecidos na técnica.
COMPLEXO DA INVENÇÃO
[0056] Conforme a pessoa versada na técnica apreciará, os recursos do tamanho pequeno, estabilidade e fácil produção do aptâmero da invenção permitem que o dito aptâmero seja apresentado ligado a uma segunda molécula. Isso é particularmente vantajoso quando a segunda molécula é um grupo funcional. O resultado da ligação do aptâmero da invenção e um grupo funcional é um complexo que apresenta a combinação de funções de ambos, isto é, um complexo com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e com a atividade associada ao grupo funcional.
[0057] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um complexo, doravante referido como o “complexo da invenção”, que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional.
[0058] O termo “aptâmero” foi descrito em detalhes em relação às Definições e ao Aptâmero específico para TLR-4 (supra), e suas definições e particularidades se aplicam igualmente no contexto do complexo da invenção.
[0059] O termo “grupo funcional”, no contexto da presente invenção, refere-se a compostos adequados para realizar pelo menos uma função. A dita função inclui, sem limitação, a capacidade de se ligar especificamente a TLR-4 ou a outros receptores TLR, a capacidade de inibir TLR-4 ou outros receptores TLR, a capacidade de ser tanto direta quanto indiretamente detectáveis, a capacidade de induzir morte celular, a capacidade de carregar uma carga terapêutica, etc. Conforme a pessoa versada na técnica entenderá, um grupo funcional pode ter associado ao mesmo uma ou múltiplas funções. Os exemplos não limitantes de grupos funcionais incluem reagentes detectáveis e fármacos. Esses grupos funcionais atuam como agentes de imaginologia, fármacos, etc.
[0060] Portanto, em uma modalidade particular, o grupo funcional é selecionado dentre um reagente detectável, um fármaco e uma nanopartícula.
[0061] Em outra modalidade particular, o grupo funcional é um reagente detectável. Os termos “reagente detectável”, “agente de imaginologia” e “agente de contraste” são usados no presente documento de forma intercambiável e se referem a um composto biocompatível, cujo uso facilita a diferenciação de diferentes partes da imagem, aumentando o "contraste" entre aquelas diferentes regiões da imagem. O termo "agentes de contraste" abrange, assim, agentes que são usados para melhorar a qualidade de uma imagem que pode, no entanto, ser gerada na ausência de tal agente (como é o caso, por exemplo, em IRM), assim como agentes que são pré- requisitos para a geração de uma imagem (como é o caso, por exemplo, na imaginologia nuclear). Os agentes de contraste adequados incluem, sem limitação, agentes de contraste para imaginologia de radionuclídeo, para tomografia computadorizada (CT), para espectroscopia de Raman, para imaginologia por ressonância magnética (MRI) e para imaginologia óptica.
[0062] Os reagentes detectáveis para imaginologia de radionuclídeo incluem radiofarmacêuticos que são comumente identificados com emissores de pósitron tais como 11C, 13N, 15O, 18F, 82Rb, 62Cu, 64Cu, e 68Ga86Y, 124I, 213Bi e 211At. Os radiofarmacêuticos SPECT são comumente identificados com emissores de pósitron tais como 94mTc, 201Tl e 67Ga. As modalidades de imaginologia de radionuclídeo (tomografia por emissão de pósitrons, (PET); tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT)) são técnicas de imaginologia de corte transversal diagnósticas que mapeiam a localização e a concentração de radiotraçadores identificados com radionuclídeo. PET e SPECT podem ser usadas para localizar e distinguir um radionuclídeo medindo-se a atividade metabólica. PET e SPECT fornecem informações que pertencem às informações no nível celular, tal como a viabilidade celular. Em PET, um emissor de pósitron é administrado ao paciente que pode ser monitorado na medida em que a substância se move através do corpo. Em determinadas modalidades da invenção, um complexo de acordo com a invenção é usado para imaginologia de PET ou SPECT in vivo. É estreitamente relacionada à PET a tomografia computadorizada de emissão de fóton único ou SPECT. A principal diferença entre as duas é que, em vez de uma substância emissora de pósitrons, SPECT usa um traçador radioativo que emite fótons de baixa energia. Outros exemplos não limitantes de radionuclídeos incluem isótopos de emissão gama, tais como 99mTc, 123I e 111In, que podem ser usados na radioscintigrafia com o uso de câmeras gama ou tomografia computadorizada de emissão de fóton único, assim como emissores beta, tais como 131I, 90Y, 99mTc, 177Lu e 67Cu”. A pessoa versada na técnica entenderá que os radionuclídeos podem também ser usados para propósitos terapêuticos.
[0063] Os reagentes detectáveis para imaginologia de CT incluem, por exemplo, meios de contraste iodinados ou brominados. Os exemplos desses agentes incluem iotalamato, io-hexil, diatrizoato, iopamidol, etiodol e iopanoato. Agentes de gadolínio também foram relatados como sendo de uso como um agente de contraste de CT. Por exemplo, agentes de gadopentato foram usados como um agente de contraste de CT. A tomografia computadorizada (CT) é contemplada como uma modalidade de imaginologia no contexto da presente invenção. Tirando-se uma série de raios X, algumas vezes mais do que mil, de vários ângulos e, então, combinando os mesmos com um computador, CT tornou possível construir uma imagem tridimensional de qualquer parte do corpo. Um computador é programado para exibir fatias bidimensionais de qualquer ângulo e a qualquer profundidade. Na CT, a injeção intravenosa de um agente de contraste radiopaco tais como aqueles descritos no presente documento pode auxiliar na identificação e delineamento de massas de tecido mole quando varreduras de CT iniciais não são diagnósticas.
[0064] Os reagentes detectáveis para imaginologia ótica incluem, por exemplo, fluoresceína, um derivado de fluoresceína, indocianina verde, Oregon verde, um derivado de Oregon verde, rodamina verde, um derivado de rodamina verde, uma eosina, uma eritrosina, vermelho Texas, um derivado de vermelho Texas, malaquita verde, éster sulfosuccinimidílico nanogold, azul cascata, um derivado de cumarina, um naftaleno, um derivado de piridiloxazol, corante amarelo cascata, corante de dapoxila e vários outros compostos fluorescentes, tais como Cy3, Cy2, Cy5, a família de identificação fluorescente Alexa Fluor® (Molecular Probes, Inc.), carboxifluoresceína (FAM) e isotiocianato de fluoresceína (FITC).
[0065] Em outra modalidade preferencial, o reagente detectável é uma proteína. O termo “proteína”, no contexto da presente invenção, refere-se a macromoléculas que consistem em uma ou mais cadeias de aminoácido. As proteínas são responsáveis por executar um grupo diverso de funções celulares com base em sua capacidade de se ligar especificamente a outras moléculas. As proteínas podem ser ligadas a outras proteínas assim como a pequenas moléculas de substrato. Os exemplos não limitantes de proteínas adequadas para os propósitos da presente invenção incluem, sem limitação, enzimas, proteínas fluorescentes, proteínas luminescentes e antígenos.
[0066] Em uma modalidade ainda mais preferencial, a proteína é uma enzima. O termo “enzima”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma proteína que funciona como um catalisador altamente seletivo, acelerando tanto a velocidade quanto a especificidade da reação metabólica para qual o mesmo é específico. Os exemplos não limitantes de enzimas adequadas para a invenção incluem, sem limitação, peroxidase de raiz-forte (HRP) e fosfatase alcalina. Conforme a pessoa versada na técnica entenderá, as enzimas adequadas para uso na presente invenção são indiretamente detectáveis como um resultado de sua capacidade de catalisar e modificar um substrato em um composto detectável por colorimetria, quimioluminescência ou fluorimetria. Os exemplos de substratos adequados incluem, sem limitação, fosfato de p-Nitrofenila (PNPP), 2,2'-azinobis[ácido 3-etilbenzotiazolin-6- sulfônico] (ABTS), o-fenilenodiamina (OPD) e 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).
[0067] As proteínas bioluminescentes ou fotoproteínas são um caso particular de enzimas oxidantes com a capacidade de executar uma reação química de seus grupos prostéticos específicos, resultando na emissão de luz sem exigir excitação anterior. Os exemplos não limitantes de proteínas bioluminescentes incluem luciferase de vagalume, luciferase de Renilla e aequorina.
[0068] Em outra modalidade ainda mais preferencial, a proteína é uma proteína fluorescente. O termo “proteína fluorescente”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma proteína com a capacidade de emitir luz quando é excitada a um comprimento de onda adequado para excitação. Os exemplos não limitantes de proteínas fluorescentes que podem ser usadas no complexo da invenção incluem, sem limitação, GFP, GFPuv, BFP, CFP, YFP, EBFP2, mCerulean, mCerulean3, mVenus, mTurquoise, T- Sapphire, citrina, amFP486, zFP506, zFP538, drFP, DsRed, mCherry, dTomate, mTFP1, TagRFP-T, mKO2, mRuby, mKate, mAmetrine, REACh, R- ficoeritrina (R-PE) e Aloficocinina (APC).
[0069] Em outra modalidade ainda mais preferencial, a proteína é uma proteína luminescente. O termo “proteína luminescente”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma proteína com a capacidade de emitir luz quando é excitada a um comprimento de onda adequado para excitação. Os exemplos não limitantes de proteínas fluorescentes que podem ser usados no complexo da invenção incluem, sem limitação, as proteínas incluídas na Tabela 1, juntamente com seus comprimentos de onda de excitação e emissão correspondentes.
[0070] Em outra modalidade ainda mais preferencial, a proteína é um antígeno. O termo “antígeno”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma molécula que induz uma resposta imunológica no corpo. Portanto, um antígeno pode ser usado para gerar um anticorpo que reconhece o mesmo e se liga especificamente ao mesmo. Os exemplos não limitantes de antígeno incluem, dentre outros, antígenos de tumor, tais como o antígeno carcinoembriônico (CEA), HER2, antígeno específico da próstata (PSA) e ativador de plasminogênio de tecido e suas variantes recombinantes, tal como Activase®, assim como antígenos bacterianos, alérgenos, etc. Conforme a pessoa versada na técnica entenderá, os antígenos adequados para uso na presente invenção são indiretamente detectáveis como um resultado de sua capacidade de serem especificamente reconhecidos por um anticorpo.
[0071] Em outra modalidade preferencial, o reagente detectável é uma hapteno. O termo “hapteno”, no contexto da presente invenção, refere-se a um grupo de compostos químicos que têm um tamanho molecular pequeno (< 10.000 Da) que são antigênicos, mas não têm a capacidade de induzir por eles próprios uma reação imunológica específica. O acoplamento químico de um hapteno a uma proteína imunogênica grande, chamada de carreador, gera um conjugado de carreador imunogênico e hapteno que tem a capacidade de induzir uma reação imunológica específica. Os exemplos não limitantes de vitaminas incluem biotina (vitamina B7), digoxigenina, dinitrofenol (DNP) e nitro-iodofenol (NIP). Em uma modalidade mais preferencial, a vitamina é biotina. O termo “biotina”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma vitamina estável ao calor solúvel em álcool e água, também referida como vitamina H e vitamina B7, distinguida por se ligar especificamente à avidina com a maior afinidade descrita até a presente data de Kd = 10-15 M. Conforme a pessoa versada na técnica entenderá, a biotina é indiretamente detectável como um resultado de sua capacidade de ser especificamente reconhecida por avidina ou variantes da mesma, tais como estreptavidina e neutravidina.
[0072] Em outra modalidade particular, o grupo funcional é um fármaco. O termo “fármaco”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma substância química usada no tratamento, cura ou prevenção de uma doença ou afecção, tal como uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4. O termo “patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4” é descrito em detalhes no contexto dos usos médicos da invenção, e sua definição e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência.
[0073] A pessoa versada na técnica saberá imediatamente quais agentes são indicados para o tratamento de uma doença em particular. Quase todos os agentes que são indicados para o tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 podem ser compreendidos no complexo da invenção, embora os agentes antagonistas de TLR-4 e agentes anti- inflamatórios sejam particularmente preferenciais. Embora inúmeros tipos de fármacos possam ser usados no contexto da invenção, em uma modalidade preferencial, a presente invenção contempla que o fármaco é selecionado a partir do grupo que inclui, sem limitação, antagonistas de TLR-4, tal como naloxona, naltrexona, LPS, ibudilast, propentofilina, amitriptilina, cetotifeno, ciclobenzaprina, mianserina e imipramina; fármacos antiplaquetários, tais como aspirina e clopidogrel; anticoagulantes, tais como heparina, acenocumarol, varfarina, dabigatrana e rivaroxabana; e antioxidantes, tal como edaravona. Embora já tenha sido mencionado no contexto de reagentes detectáveis, o ativador de plasminogênio de tecido e suas variantes recombinantes podem ser igualmente consideradas como um fármaco devido a sua ação trombolítica.
[0074] A presente invenção contempla que o fármaco é um ácido nucleico. Portanto, em uma modalidade preferencial, o fármaco é um ácido nucleico. Os ácidos nucleicos adequados como fármacos no contexto do complexo da invenção incluem RNA antissenso, DNA antissenso e RNA interferente pequeno que têm a capacidade de silenciar a expressão dos genes envolvidos em uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4, incluindo, sem limitação, os genes NFKB1, RIPK3, IFNB1, LY96 (MD-2), IRF3, TLR3, TIRAP (Mal), TICAM1 (TRIF), RIPK1, TRAF6, CD14, TRAM, IKBKG (IKK-gama), IFNA1 e TLR4. O termo “RNA antissenso”, no contexto da presente invenção, refere-se a um RNA de fita simples cuja sequência de nucleotídeos é complementar a um RNA mensageiro alvo, interferindo, assim, com a expressão do respectivo gene. O termo “DNA antissenso”, no contexto da presente invenção, refere-se a um DNA de fita simples cuja sequência de nucleotídeos é complementar a um RNA mensageiro alvo, interferindo com ou silenciando, assim, a expressão do respectivo gene. O termo “RNA interferente pequeno” ou “siRNA”, no contexto da presente invenção, refere-se a um RNA de fita dupla com um comprimento de 20 a 25 nucleotídeos que é altamente específico para a sequência de nucleotídeos de seu RNA mensageiro alvo, interferindo, assim, com a expressão do respectivo gene.
[0075] A presente invenção contempla que o fármaco é um peptídeo. Portanto, em uma modalidade preferencial, o fármaco é um peptídeo. O termo “peptídeo”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma cadeia curta de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. O peptídeo compreenderá pelo menos 2 aminoácidos, pelo menos 3 aminoácidos, pelo menos 4 aminoácidos, pelo menos 5 aminoácidos, pelo menos 10 aminoácidos, pelo menos 15 aminoácidos, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 30 aminoácidos, pelo menos 40 aminoácidos, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 60 aminoácidos ou pelo menos 70 aminoácidos. São adequados para os propósitos desta invenção, dentre outros, os peptídeos com a capacidade de se ligar a um alvo e de induzir ou inibir a sinalização celular. O termo “peptídeo de ligação alvo”, no contexto da presente invenção, refere-se a um peptídeo que compreende uma região de ligação alvo. O termo “peptídeo de sinalização”, no contexto da presente invenção, refere-se a um peptídeo com a capacidade de provocar a sinalização celular, tais como peptídeos agonistas de receptor de célula. As sequências de aminoácidos adequadas para a ligação de molécula alvo incluem sequências consenso de reconhecimento molecular que são bem conhecidas na técnica.
[0076] Em outra modalidade particular, o grupo funcional é uma nanopartícula. O termo “nanopartícula”, no contexto da presente invenção, refere-se a sistemas coloidais do tipo esférico, do tipo haste, do tipo poliedro, etc. ou formatos similares, tendo um tamanho menor do que 1 micrômetro (μm), que são individualmente encontrados ou são encontrados formando estruturas organizadas (dímeros, trímeros, tetraedros, etc.), dispersos em um fluido (solução aquosa). Em uma modalidade particular, as nanopartículas adequadas para colocar a invenção em prática têm um tamanho menor do que 1 μm, geralmente compreendido entre 1 e 999 nanômetros (nm), tipicamente entre 5 e 500 nm, de preferência, entre cerca de 10 e 150 nm. Em uma modalidade particular, as nanopartículas da invenção têm tipicamente um diâmetro médio de partícula na faixa de 2 a 50 nm, de preferência, de 5 a 20 nm, de maior preferência, de 13 nm. O diâmetro médio de partícula é a dimensão média máxima de partícula, com o entendimento de que as partículas não são necessariamente esféricas. O formato das ditas nanopartículas pode variar amplamente; vantajosamente, as ditas nanopartículas adotarão qualquer formato opticamente eficaz tais como esferas, hastes, estrelas, cubos, poliedros ou qualquer outra variante assim como associações de complexo de diversas partículas; em uma modalidade particular, o formato das nanopartículas para colocar a invenção em prática é esférico ou substancialmente esférico. O formato pode ser adequadamente avaliado por luz convencional ou por meio de técnica de microscopia eletrônica.
[0077] As nanopartículas adequadas para o uso na presente invenção incluem nanopartículas poliméricas, nanopartículas de lipídio e nanopartículas de metal.
[0078] As nanopartículas poliméricas são formadas por uma matriz polimérica que é ligada ao aptâmero. Os exemplos não limitantes de polímeros biocompatíveis que podem ser úteis nas nanopartículas poliméricas de acordo com a presente invenção incluem polietilenos, policarbonatos, polianidridos, poli-hidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetais, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, álcoois polivinílicos, poliuretanos, polifosfazenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureias, poliestirenos ou poliaminas, poliglutamato, dextrano, polianidridos, poliuretanos, polimetacrilatos, poliacrilatos ou policianoacrilatos, polidioxanona (PDO), poli-hidroxialcanoato, poli-hidroxibutirato, poli(sebacato de glicerol), poliglicolídeo, polilactídeo, PLGA, policaprolactona ou combinações dos mesmos.
[0079] Alternativamente, as nanopartículas da invenção podem ser nanopartículas de lipídio tais como um lipossoma ou uma micela. A formação de micelas e lipossomas a partir de, por exemplo, lipídios formadores de vesícula é conhecida na técnica. Lipídios formadores de vesícula referem-se a lipídios que formam espontaneamente bicamadas lipídicas acima de sua faixa de temperatura de transição de fase cristalina de gel para líquido. Tais lipídios têm tipicamente determinados recursos que permitem a formação espontânea de bicamada, tal como áreas de corte transversal quase idênticas de suas porções hidrofóbicas e hidrofílicas permitindo o empacotamento em fases lamelares. Os lipídios com capacidade de incorporação estável em bicamadas lipídicas, tais como colesterol e seus vários análogos, podem ser incorporados na bicamada lipídica durante a formação de bicamada. Os lipídios formadores de vesícula são, de preferência, lipídios que têm duas cadeias de hidrocarboneto, tipicamente cadeias de acila, e um grupo cabeça, ou polar ou não polar. Há uma variedade de lipídios formadores de vesícula sintéticos e lipídios formadores de vesícula de ocorrência natural, incluindo os fosfolipídios, tais como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol e esfingomielina, em que as cadeias de dois hidrocarbonetos têm, tipicamente, entre cerca de 14 a 22 átomos de carbono de comprimento e são ou saturadas ou têm graus variados de insaturação. Os lipídios e fosfolipídios descritos acima cujas cadeias de acila têm graus variados de saturação podem ser obtidos comercialmente ou preparados de acordo com os métodos publicados. Outros lipídios adequados incluem fosfolipídios, esfingolipídios, glicolipídios e esteróis, tal como colesterol.
[0080] O termo "lipossoma" refere-se a vesículas compreendidas de uma ou mais bicamadas lipídicas concentricamente ordenadas que encapsulam uma fase aquosa. A fase aquosa contém, tipicamente, o composto a ser entregue a um sítio alvo. Mediante o alcance de um sítio alvo, o lipossoma se funde com as membranas plasmáticas de células alvo, isto é, células que expressam TLR-4, liberando, assim, o composto no citosol. Alternativamente, o lipossoma é endocitado ou recolhido de outro modo pelas células alvo como o conteúdo de uma vesícula de transporte (por exemplo, um endossoma ou fagossoma). Uma vez na vesícula de transporte, o lipossoma ou degrada ou se funde com a membrana na vesícula e libera seus conteúdos. Uma variedade de métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica está disponível para preparar lipossomas, tais como sonicação, extrusão, alta pressão/homogeneização, microfluidificação, diálise de detergente, fusão induzida por cálcio de pequenos veículos de lipossoma e métodos de fusão de éter, todos os quais são bem conhecidos na técnica.
[0081] As nanopartículas poliméricas e lipídicas podem incluir adicionalmente um revestimento de um composto anfifílico que cerca o material polimérico que forma um invólucro para a partícula ou um material indetectável que pode permitir que as partículas evadam o reconhecimento por componentes do sistema imunológico e pode aumentar a meia-vida de circulação da partícula.
[0082] Alternativamente, as nanopartículas da invenção podem ser uma nanopartícula de metal. O termo “nanopartícula de metal” refere-se a uma nanopartícula que compreende um metal e que mostra a propriedade óptica conhecida como o fenômeno de plásmon de superfície, isto é, um metal plasmônico. Esse fenômeno consiste na vibração coletiva dos elétrons da superfície metálica, produzindo uma banda de absorção localizada no espectro ultravioleta-visível (típico do metal e do tamanho das nanopartículas) no comprimento de onda em que a condição de ressonância ocorre nos ditos elétrons. O plásmon de superfície de um metal pode ser determinado por meio de qualquer técnica espectroscópica conhecida no estado da técnica, tal como espectroscopia de ressonância de plásmon de superfície (SPR), através da qual os átomos de metal são submetidos a um feixe eletromagnético ou espectroscopia de fluorescência de ressonância de plásmon de superfície (SPFS) com base na detecção da variação do índice de refração dos átomos de metal quando os mesmos são submetidos a um feixe de fótons. Conforme definido no presente documento, um “metal plasmônico” é um metal distinguido por mostrar a propriedade de óptica conhecida como o fenômeno de plásmon de superfície. A variação da resposta plasmônica é particularmente evidente quando diversas nanopartículas são localizadas próximas uma à outra, dado que isso causa o acoplamento de seus respectivos campos próximos, gerando um novo plásmon de superfície. Em uma modalidade preferencial, o dito metal é selecionado a partir do grupo que consiste em ouro, prata, cobre, alumínio, platina, ferro, cobalto, paládio e combinações dos mesmos.
[0083] Uma modalidade preferencial de nanopartículas de metal é uma nanopartícula de núcleo-invólucro que contém um núcleo de metal e um envoltório poroso. Os exemplos de nanopartículas de metal de núcleo-invólucro incluem nanopartículas de sílica mesoporosas magnéticas que são bem conhecidas na técnica. Assim, em uma modalidade particularmente preferencial, a nanopartícula é uma nanopartícula de sílica mesoporosa magnética.
[0084] As nanopartículas podem ser funcionalizadas adicionando-se um revestimento em sua superfície. Para aplicações biológicas, o revestimento de superfície deve ser polar para gerar uma alta solubilidade aquosa e impedir a agregação de nanopartícula. No soro ou na superfície celular, revestimentos altamente carregados promovem a ligação não específica, enquanto que polietileno glicol ligado ao terminal hidroxila ou grupos metóxi repelem interações não específicas.
[0085] Os aptâmeros podem ser ligados a nanopartículas idealmente por uma ligação covalente, de preferência, na superfície de nanopartícula. De preferência, os aptâmeros devem estar presentes em um número controlado por nanopartícula.
[0086] A ligação entre um aptâmero da invenção e um grupo funcional para gerar o complexo da invenção pode ser executada por meio de técnicas de conjugação que são bem conhecidas pela pessoa versada na técnica. O resultado é uma ligação covalente entre o aptâmero da invenção e o grupo funcional. A conjugação pode envolver a ligação de aminas primárias das extremidades 3’ ou 5’ do aptâmero da invenção ao grupo funcional durante a síntese química do aptâmero. Alternativamente, a conjugação pode ser feita por meio de reações de reticulação convencionais que têm a vantagem da reatividade química muito maior de identificações de alquil-amina primária em relação às aril aminas dos próprios nucleotídeos. Os métodos de conjugação são bem conhecidos na técnica e têm base no uso de reagentes de reticulação. Os reagentes de reticulação contêm pelo menos dois grupos reativos que alvejam grupos tais como aminas primárias, sulfidrilas, aldeídos, carboxilas, hidroxilas, azidas e assim por diante na molécula a ser conjugada. Os agentes de reticulação diferem-se em sua especificidade química, comprimento de braço espaçador, composição de braço espaçador, braço espaçador de clivagem e estrutura. Por exemplo, a conjugação de complexos de acordo com a invenção pode ser executada diretamente ou através de uma porção de ligação, através de um ou mais grupos não funcionais no aptâmero e/ou grupo funcional, tais como grupos amina, carboxila, fenila, tiol ou hidroxila. Ligações mais seletivas podem ser alcançadas por meio do uso de um ligante heterobifuncional. É possível usar ligantes convencionais, tais como di- isocianatos, di-isotiocianatos, ésteres de bis (hidroxisuccinimida), carbodi- imidas, ésteres de maleimida-hidroxisuccinimida, glutaraldeído e similares ou hidrazinas e hidrazidas, tal como hidrazida do ácido 4-(4-N-maleimidofenil) butírico (MPBH).
[0087] Outra abordagem consiste em identificar os aptâmeros durante a síntese por meio de PCR com o uso de iniciadores identificados, por exemplo, com um fluoróforo. Para essa finalidade, há vários estabelecimentos comerciais disponíveis para a pessoa versada na técnica.
[0088] Adicionalmente, na modalidade particular em que o grupo funcional é um radionuclídeo, a ligação entre um aptâmero de acordo com a invenção e o radionuclídeo pode ser executada por meio de coordenação química, em que os átomos do aptâmero envolvido na ligação doam elétrons ao radionuclídeo. As reações de coordenação são bem conhecidas na técnica e dependerão do radionuclídeo e do grupo reativo envolvido no aptâmero.
USOS IN VITRO DA INVENÇÃO A. USOS IN VITRO PARA DETECTAR TLR-4
[0089] A presente invenção também contempla usos in vitro de um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e de um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional para detectar TLR-4.
[0090] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um uso in vitro de um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas para detectar TLR-4.
[0091] Portanto, a capacidade de um aptâmero de acordo com a invenção de se ligar especificamente a TLR-4 pode ser explorada para a detecção indireta de TLR-4 através do aptâmero de acordo com a invenção. Para esse propósito, a pessoa versada na técnica reconhecerá que a detecção subsequente do dito aptâmero é exigida. As técnicas de detecção de aptâmero são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos ou sondas específicas para o aptâmero. Portanto, uma vez que o aptâmero de acordo com a invenção é ligado a TLR-4, um anticorpo ou sonda específica para o aptâmero, que, por sua vez, pode ser identificado com um reagente detectável ou que pode ser detectado indiretamente por meio de um anticorpo ou sonda secundária, seria aplicada. A técnica usada para detectar TLR-4 dependerá, então, do tipo de reagente detectável, podendo ser técnicas com base em, por exemplo, fluorimetria, colorimetria ou radioatividade.
[0092] O termo “sonda” ou “sonda de hibridização”, no contexto da presente invenção, refere-se a um fragmento de DNA ou RNA de comprimento variável, geralmente entre 10 e 1000 bases de comprimento, que é usado para detectar a presença de ácidos nucleicos de fita simples (DNA ou RNA) que são complementares à sequência na sonda. A sonda é hibridizada ao ácido nucleico de fita simples alvo cuja sequência de bases permite o pareamento de base devido à complementaridade entre a sonda e o ácido nucleico alvo. Para detectar a hibridização da sonda a sua sequência alvo, a sonda é identificada com um reagente detectável, tal como um radionuclídeo, um fluoróforo ou digoxigenina, dentre outros.
[0093] A detecção de TLR-4 com o aptâmero da invenção pode ser executada por meio de ensaios de ligação in vitro, tais como o ensaio de oligonucleotídeo ligado à enzima (ELONA), ensaio sorvente de aptâmero ligado à enzima (ELASA), precipitação e PCR quantitativa (qPCR), ensaio de alteração de mobilidade em gel, Western Blotting, ressonância de plásmon de superfície (SPR), eletroforese capilar cinética, o ensaio de ligação de fluorescência, apta-histoquímica, aptacitoquímica, microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo.
[0094] Em outra modalidade particular dos usos in vitro da invenção, a detecção de TLR-4 é realizada por meio de um método selecionado a partir do grupo que consiste em ELONA, apta-histoquímica, aptacitoquímica e citometria de fluxo.
[0095] O termo “ELONA” ou “ensaio de oligonucleotídeo ligado à enzima ”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma técnica análoga ao ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), em que o anticorpo que é usado para detectar a molécula de interesse, nesse caso TLR-4, é trocado por um aptâmero de detecção específico para a dita molécula. O ensaio ELISA baseia-se no uso de antígenos ou anticorpo identificado, por exemplo, com enzimas, de modo que os complexos formados entre o antígeno alvo e o anticorpo identificado sejam complexos enzimaticamente ativos. Já que um dos componentes, nesse caso, o antígeno, é imobilizado em um carreador, os complexos de antígeno:anticorpo são imobilizados ao carreador e podem, portanto, ser detectados por meio da adição de um substrato específico para a enzima. No caso de ELONA, o aptâmero de detecção pode ser covalentemente ligado a uma enzima ou o mesmo pode ser detectado por si próprio por um anticorpo secundário específico para o aptâmero que é conjugado a uma enzima. A dita enzima catalisa a transformação de um substrato específico para produzir um sinal visível. Essa técnica pode ser modificada para trocar a enzima por outro reagente detectável, tal como um fluoróforo. Os termos ELONA e ELASA ou ensaio sorvente de aptâmero ligado à enzima são usados de forma intercambiável no presente documento. Em uma modalidade preferencial, a detecção de TLR-4 é realizada por meio de ELONA.
[0096] De uma maneira análoga, os termos “aptacitoquímica” e “apta-histoquimica”, no contexto da presente invenção, referem-se a técnicas análogas à imunocitoquímica e imuno-histoquímica para a detecção de TLR-4 em células e seções histológicas, respectivamente, em que o anticorpo que é usado para detectar a molécula de interesse, nesse caso TLR-4, é trocado por um aptâmero específico para a dita molécula. O aptâmero de detecção pode ser covalentemente ligado a uma enzima ou o mesmo pode ser detectado por si próprio por um anticorpo secundário específico para o aptâmero que é conjugado a uma enzima. A dita enzima catalisa a transformação de um substrato específico para produzir um sinal visível. Essa técnica pode ser modificada para trocar a enzima por outro reagente detectável, tal como um fluoróforo. Em uma modalidade preferencial, a detecção de TLR-4 é realizada por meio de aptacitoquímica. Em outra modalidade preferencial, a detecção de TLR-4 é realizada por meio de apta- histoquímica.
[0097] Alternativamente, a pessoa versada na técnica reconhecerá que essas técnicas (ELONA, aptacitoquímica, apta- histoquímica) podem ser adaptadas para trocar o anticorpo de detecção por uma sonda específica para o aptâmero.
[0098] O termo “citometria de fluxo”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma técnica de análise de célula que envolve medir os recursos de dispersão de luz e fluorescência que as células têm na medida em que passam através de um raio de luz. Adicionalmente à dispersão de luz, se as células forem colocadas na presença de aptâmeros identificados com moléculas fluorescentes antes da análise, é possível avaliar quais células têm antígenos complementares aos aptâmeros usados. A detecção da fluorescência é realizada com citofluorímetros de fluxo (conhecidos como “citômetros” ou “FACS” (ordenador de célula ativado por fluorescência)). Essa técnica, como as técnicas anteriores, foi inicialmente desenvolvida para o uso com anticorpos fluorescentemente identificados, mas pode ser prontamente adaptada para uso com o aptâmero da invenção.
[0099] Conforme a pessoa versada na técnica entenderá, um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um reagente detectável é particularmente vantajoso para detectar TLR-4, já que o dito reagente detectável permite a detecção do aptâmero compreendido no complexo quando o mesmo é ligado a TLR-4. A técnica usada para detectar TLR-4 dependerá do tipo de reagente detectável, podendo ser técnicas com base em, por exemplo, fluorimetria, colorimetria ou radioatividade.
[00100] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional para detectar TLR-4.
[00101] Em uma modalidade particular, o grupo funcional é um reagente detectável.
[00102] Em outra modalidade particular dos usos in vitro da invenção, a detecção de TLR-4 é realizada por meio de um método selecionado a partir do grupo que consiste em ELONA, apta-histoquímica, aptacitoquímica e citometria de fluxo.
[00103] Os termos “aptâmero”, “TLR-4”, “variante funcionalmente equivalente”, “complexo”, “grupo funcional”, “reagente detectável”, “ELONA”, “aptacitoquímica”, “apta-histoquímica” e “citometria de fluxo” foram descritos em detalhes acima, e suas definições e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência.
[00104] Dado que as técnicas de ELISA, imunocitoquímica, imuno-histoquímica e citometria de fluxo são bem conhecidas na técnica, a pessoa versada na técnica poderia fazer as adaptações exigidas para trocar o anticorpo pelo aptâmero ou complexo de acordo com a invenção sem ter que conduzir experimentação indevida.
B. USOS IN VITRO PARA INIBIR TLR-4
[00105] Conforme descrito acima, um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas pode inibir a atividade de TLR-4, reduzir os níveis de citocinas pró-inflamatórias liberadas como um resultado da ativação do mesmo. A presente invenção também contempla usos in vitro de um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e de um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional para inibir TLR-4.
[00106] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um uso in vitro de um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas para inibir TLR-4.
[00107] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um uso in vitro de um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional para inibir TLR-4.
MÉTODO IN VITRO DA INVENÇÃO A. MÉTODOS IN VITRO PARA A DETECÇÃO DE TLR-4
[00108] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um método in vitro para a detecção de TLR-4 em uma amostra, doravante, “o primeiro método in vitro para a detecção de TLR-4 da invenção” que compreende
[00109] i) colocar a dita amostra em contato com um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas,
[00110] ii) separar o aptâmero não ligado a TLR-4, e
[00111] iii) detectar a presença do aptâmero ligado ao TLR-4 presente na amostra.
[00112] Em uma primeira etapa, o primeiro método in vitro para a detecção da invenção compreende colocar a dita amostra em contato com um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas.
[00113] Os termos “aptâmero”, “TLR-4” e “variante funcionalmente equivalente” foram descritos em detalhes acima e suas definições e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência.
[00114] O termo “amostra” ou “amostra biológica”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma cultura celular ou ao material biológico isolado de um indivíduo. A amostra biológica pode conter qualquer material biológico adequado para detectar o biomarcador desejado e pode compreender células e/ou material não celular do indivíduo. A amostra pode ser isolada de qualquer tecido ou fluido biológico tais como, por exemplo, sangue, plasma, soro, urina, fluido cérebro-espinhal (CSF), coração, cérebro. As amostras usadas para a detecção de TLR-4 são, de preferência, fluidos biológicos.
[00115] Alternativamente, as amostras são amostras de biofluido. Os termos “fluido biológico” e “biofluido” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a fluidos aquosos de uma origem biológica. O biofluido pode ser obtido a partir de qualquer lugar (tal como sangue, plasma, soro, urina, bile, fluido cérebro-espinhal, humor vítreo ou aquoso ou qualquer secreção corporal), um exsudato (tal como o fluido obtido a partir de um abscesso ou qualquer outro sítio de infecção ou inflamação) ou o fluido obtido a partir de uma articulação (tal como uma articulação normal ou uma articulação afetada por uma doença tal como artrite reumatoide). Os biofluidos usados para a detecção de TLR-4 são, de preferência, amostras de sangue, plasma, soro ou fluido cérebro-espinhal.
[00116] O aptâmero de acordo com a invenção é aplicado à amostra em um tampão adequado para permitir a ligação do aptâmero às moléculas de TLR-4 que podem estar presentes na amostra. Os exemplos não limitantes de tampões adequados para permitir a ligação do aptâmero da invenção e TLR-4 incluem PBS, TBS, tampão de fosfato e tampão de citrato. De preferência, esses tampões contêm MgCl2 a 1 mM. A quantidade do aptâmero exigido para detectar as moléculas de TLR-4 presentes na amostra dependerão tanto do tamanho da amostra quanto da quantidade de TLR-4 presente na mesma, e a mesma poderia ser prontamente determinada por métodos de otimização comumente usados na técnica. A título de indicação, a concentração de aptâmero é pelo menos 1 fM, pelo menos 10 fM, pelo menos 100 fM, pelo menos 1 pM, pelo menos 10 pM, pelo menos 100 pM, pelo menos 1 nM, pelo menos 10 nM, pelo menos 100 nM, pelo menos 1 μM, pelo menos 10 μM, pelo menos 100 μM ou mais. De preferência, a concentração de aptâmero está entre 100 fM e 1 μM, de maior preferência, entre 1 pM e 100 nM, de ainda maior preferência, entre 100 pM e 1 nM.
[00117] O aptâmero é incubado com a amostra a uma temperatura adequada e por um tempo suficiente para permitir a ligação do aptâmero às moléculas de TLR-4 que podem estar presentes na amostra. A temperatura está, de preferência, entre 20 °C e 37 °C. A título de indicação, o aptâmero será incubado com a amostra por pelo menos 5 min, pelo menos 10 min, pelo menos 15 min, pelo menos, 20 min, pelo menos 30 min, pelo menos 60 min, pelo menos 120 min ou mais.
[00118] Uma vez que o aptâmero se ligou às moléculas de TLR-4 que podem estar presentes na amostra, em uma segunda etapa, a amostra é lavada para remover as moléculas de aptâmero que não se ligaram a TLR-4.
[00119] Em uma terceira etapa, a presença do aptâmero ligado ao TLR-4 presente amostra é detectada. Já que o aptâmero da invenção não é por si próprio uma molécula detectável, a etapa de detecção é uma etapa de detecção indireta através de uma segunda molécula detectável que se liga especificamente ao aptâmero. A detecção do aptâmero ligado a TLR-4 pode ser executada com virtualmente qualquer anticorpo ou reagente conhecido que se liga com alta afinidade ao aptâmero da invenção. No entanto, o uso de um anticorpo específico para o aptâmero, por exemplo, soro policlonal, sobrenadante de hibridoma, anticorpos monoclonais ou humanizados e fragmentos dos mesmos, é preferencial. O dito anticorpo específico para o aptâmero é adequadamente identificado com um reagente detectável. O termo “reagente detectável” foi descrito em detalhes acima, e sua definição e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência. O dito reagente pode ser detectado por meio de fluorimetria ou colorimetria com o uso de aparelhos adequados para o tipo de reagentes e o tipo de amostra que são conhecidos pela pessoa versada na técnica. A título de exemplo, a amostra com o aptâmero ligado às moléculas de TLR-4 presentes é incubada com um anticorpo específico para o aptâmero que é conjugado com uma enzima, em condições similares às condições de incubação com o aptâmero, e os complexos de TLR-4-aptâmero-anticorpo são detectados com a adição de um substrato que é convertido pela enzima em um produto detectável, por exemplo, por meio de fluorimetria em um microscópio de fluorescência ou por colorimetria em um espectrofotômetro. Alternativamente, a detecção pode ser feita de uma maneira análoga por meio do uso de uma sonda específica para o aptâmero adequadamente identificado com um reagente detectável.
[00120] A pessoa versada na técnica reconhecerá que o primeiro método in vitro da invenção pode ser executado como parte de técnicas de detecção tais como ELONA, ELASA, precipitação e qPCR, ensaio de alteração de mobilidade em gel, Western Blotting, ressonância de plásmon de superfície, eletroforese capilar cinética, ensaio de ligação de fluorescência, apta-histoquímica, aptacitoquímica, microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo.
[00121] Alternativamente, o aptâmero de acordo com a invenção pode ser ligado a um grupo funcional que é parte de um complexo de acordo com a invenção. Portanto, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método in vitro para a detecção de TLR-4 em uma amostra, doravante, “o segundo método in vitro para a detecção de TLR-4 da invenção” que compreende
[00122] i) colocar a dita amostra em contato com um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional,
[00123] ii) separar o aptâmero ou complexo não ligado a TLR-4, e
[00124] iii) detectar a presença do complexo ligado ao TLR-4 presente na amostra.
[00125] Os termos “aptâmero”, “TLR-4”, “variante funcionalmente equivalente” e “amostra” foram descritos em detalhes acima e suas definições e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência. Igualmente, as particularidades da primeira e da segunda etapas do primeiro método in vitro para detecção da invenção também se aplicam ao segundo método in vitro para a detecção da invenção e são igualmente incluídas a título de referência.
[00126] A terceira etapa para o segundo método in vitro para a detecção da invenção compreende detectar a presença do complexo da invenção ligado ao TLR-4 presente na amostra. A detecção do complexo de acordo com a invenção pode ser executada com virtualmente qualquer anticorpo ou reagente conhecido que se liga com alta afinidade ao aptâmero da invenção ou ao grupo funcional. A detecção do aptâmero da invenção foi descrita em detalhes no contexto do primeiro método in vitro para a detecção da invenção. Igualmente, em relação ao grupo funcional, a detecção pode também ser executada com virtualmente qualquer anticorpo ou reagente conhecido que se liga com alta afinidade ao dito grupo funcional. Por essa razão, é particularmente apropriado para o segundo método in vitro para a detecção da invenção que o grupo funcional seja um reagente detectável.
[00127] Em uma modalidade particular, o grupo funcional é um reagente detectável selecionado a partir do grupo formado por radionuclídeos, fluoróforos, proteínas e haptenos.
[00128] Os termos “radionuclídeo”, “fluoróforo”, “proteína detectável” e “hapteno” foram descritos em detalhes acima e suas definições e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência.
[00129] Conforme a pessoa versada na técnica entenderá, os reagentes detectáveis contemplados pela presente invenção podem ser divididos entre os reagentes que são diretamente detectáveis por si próprios, tais como radionuclídeos ou fluoróforos, e os reagentes que são indiretamente detectáveis, tais como proteínas ou haptenos.
[00130] Em uma modalidade preferencial, o reagente detectável é um radionuclídeo, e a detecção é realizada pela detecção da radiação emitida pelo radionuclídeo. A dita radiação dependerá do tipo de radionuclídeo, tendo a capacidade de ser uma emissão de partícula α, emissão de partícula β ou emissão do tipo Y. Para esse propósito, técnicas de detecção adequadas para diferentes radionuclídeos são bem conhecidas. A título de exemplo, a emissão emitida por 123I pode ser detectada por uma câmera gama.
[00131] Em outra modalidade preferencial, o reagente detectável é um fluoróforo, e a detecção é realizada pela detecção da fluorescência emitida pelo fluoróforo. O uso de um fluoróforo exige a excitação anterior do mesmo com um comprimento de onda dentro de seu espectro de excitação, o que causa a emissão a um comprimento de onda diferente. Os comprimentos de onda de excitação e emissão dos fluoróforos contemplados na presente invenção são parte do estado da técnica. A fluorescência emitida pode ser detectada, por exemplo, através de técnicas de fluorimetria com o uso de um espectrofotômetro de fluorescência ou um microscópio de fluorescência.
[00132] Em outra modalidade preferencial, o reagente detectável é uma proteína. A dita proteína poderia ser detectada dependendo do tipo de proteína usada. Por exemplo:
[00133] - uma enzima exige a adição de seu substrato específico que será detectável por colorimetria, quimioluminescência ou fluorimetria;
[00134] - uma proteína fluorescente, como um fluoróforo, exige excitação a um comprimento de onda adequado para ser detectável por fluorimetria (por exemplo, os comprimentos de onda incluídos na Tabela 1);
[00135] - um antígeno ou um hapteno exige um anticorpo ou outra molécula que reconhece especificamente o mesmo. A fim de ser detectado, o dito anticorpo ou molécula para o antígeno/hapteno deve ser identificado, por exemplo, com uma enzima, e a detecção dependerá do tipo de identificação.
[00136] A pessoa versada na técnica reconhecerá que o segundo método in vitro da invenção pode ser executado como parte de técnicas de detecção tais como ELONA, ELASA, precipitação e qPCR, ensaio de alteração de mobilidade em gel, Western Blotting, ressonância de plásmon de superfície, eletroforese capilar cinética, ensaio de ligação de fluorescência, apta-histoquímica, aptacitoquímica, microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo.
[00137] Em uma modalidade particular, a detecção de TLR-4 é realizada por meio de fluorescência.
B. MÉTODOS IN VITRO PARA A INIBIÇÃO DE TLR-4
[00138] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se um método in vitro para inibir TLR-4 em uma amostra, doravante “o primeiro método in vitro para a inibição de TLR-4 da invenção”, que compreende colocar uma amostra que compreende TLR-4 em contato com um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas em condições adequadas para inibir TLR-4.
[00139] Os termos “aptâmero”, “TLR-4”, “variante funcionalmente equivalente”, “inibição de TLR-4” e “amostra” foram descritos em detalhes acima e suas definições e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência.
[00140] Em uma modalidade particular, o TLR-4 da amostra está compreendido em células vivas.
[00141] O primeiro método in vitro para a inibição de TLR-4 da invenção compreende colocar uma amostra que compreende TLR-4 em contato com um aptâmero de acordo com a invenção em condições adequadas para inibir TLR-4. Para essa finalidade, o aptâmero da invenção é aplicado na amostra, e o mesmo deve se ligar a TLR-4.
[00142] O termo “condições adequadas para inibir TLR-4”, no contexto da presente invenção, refere-se a condições de incubação que permitem a ligação do aptâmero da invenção a TLR-4 e a inibição subsequente do mesmo. Essas condições incluem a composição do tampão em que o aptâmero da invenção é aplicado na amostra, a quantidade de aptâmero, o tempo de incubação e a temperatura de incubação. Os exemplos não limitantes de tampões adequados para permitir a ligação do aptâmero da invenção a TLR-4 e a inibição do mesmo incluem PBS, TBS, tampão de fosfato e tampão de citrato. De preferência, esses tampões contêm MgCl2 a 1 mM. A quantidade do aptâmero exigido para detectar as moléculas de TLR-4 presentes na amostra dependerão tanto do tamanho da amostra quanto da quantidade de TLR-4 presente na mesma, e a mesma poderia ser prontamente determinada por métodos de otimização comumente usados na técnica. A título de indicação, a concentração de aptâmero é pelo menos 1 fM, pelo menos 10 fM, pelo menos 100 fM, pelo menos 1 pM, pelo menos 10 pM, pelo menos 100 pM, pelo menos 1 nM, pelo menos 10 nM, pelo menos 100 nM, pelo menos 1 μM, pelo menos 10 μM, pelo menos 100 μM ou mais. De preferência, a concentração de aptâmero está entre 100 fM e 1 μM, de maior preferência, entre 1 pM e 100 nM, de ainda maior preferência, entre 100 pM e 1 nM.
[00143] O aptâmero é incubado com a amostra a uma temperatura adequada e por um tempo suficiente para permitir a ligação do aptâmero às moléculas de TLR-4 que podem estar presentes na amostra. A temperatura está, de preferência, entre 20 °C e 37 °C, de maior preferência, 37 °C. A título de indicação, o aptâmero será incubado com a amostra por pelo menos 5 min, pelo menos 10 min, pelo menos 15 min, pelo menos, 20 min, pelo menos 30 min, pelo menos 60 min, pelo menos 120 min ou mais.
[00144] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se um método in vitro para inibir TLR-4 em uma amostra, doravante “o segundo método in vitro para a inibição de TLR-4 da invenção”, que compreende colocar uma amostra que compreende TLR-4 em contato com um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional em condições adequadas para inibir TLR-4.
[00145] Os termos “aptâmero”, “TLR-4”, “variante funcionalmente equivalente”, “inibição de TLR-4”, “amostra” e “condições adequadas para inibir TLR-4” foram descritos em detalhes acima e suas definições e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência.
USOS MÉDICOS DA INVENÇÃO
[00146] Os autores da presente invenção demonstraram que o aptâmero da invenção tem a capacidade de bloquear ou inibir o volume de infarto produzido em um modelo de acidente vascular cerebral induzido em animais usados em experimentos, conforme descrito no Exemplo 4. Portanto, a capacidade do aptâmero da invenção de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 torna o mesmo útil de um ponto de vista terapêutico. É evidente que o efeito terapêutico obtido com o aptâmero da invenção pode ser contemplado com um grupo funcional com atividade terapêutica, conforme descrito no contexto do complexo da invenção. Consequentemente, a presente invenção contempla os usos médicos do aptâmero da invenção e do complexo da invenção.
A. USOS MÉDICOS DO APTÂMERO DA INVENÇÃO
[00147] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas para uso na medicina.
[00148] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas para uso na fabricação de um fármaco para o tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4.
[00149] Alternativamente, o mesmo pode ser expresso como o uso de um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas para uso no tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4.
[00150] Alternativamente, o mesmo pode ser expresso como um método in vivo para o tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 em um indivíduo que compreende a administração ao dito indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas ao dito indivíduo.
[00151] De acordo com a invenção, um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas se liga especificamente a TLR-4 na superfície de uma célula alvo. Quando o aptâmero da invenção é colocado em contato com TLR-4, o mesmo inibe sua atividade, resultando em uma redução ou interrupção da liberação de citocinas pró-inflamatórias tal como IL-1, IL-8, TNF-alfa e IL-12.
[00152] O termo “aptâmero” foi descrito em detalhes em relação às Definições e ao Aptâmero específico para TLR-4 (supra), e suas definições e particularidades se aplicam igualmente no contexto do complexo da invenção.
[00153] O termo “tratamento” ou “terapia”, no contexto da presente invenção, refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de prevenir, curar, atrasar, reduzir a gravidade ou melhorar um ou mais sintomas da patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 ou para o propósito de prolongar a sobrevivência de um paciente além do que é esperado na ausência de tal tratamento.
[00154] O termo “célula alvo”, no contexto da presente invenção, refere-se à célula particular que expressa TLR-4, incluindo, dentre outros, células de linhagem mieloide tais como monócitos, macrófagos, células microglia, granulócitos e células dendríticas imaturas, assim como células de outras linhagens tais como neurônios, etc. Em uma modalidade particular, a célula alvo é um monócito ou um macrófago. Em outra modalidade particular, a célula alvo é uma célula microglia. Em outra modalidade particular, a célula alvo é um granulócito. Em outra modalidade particular, a célula alvo é uma célula dendrítica imatura. Em outra modalidade particular, a célula alvo é um neurônio.
[00155] Em uma modalidade particular, a célula alvo é uma célula de mamífero. Em outra modalidade preferencial, a célula de mamífero é uma célula humana.
[00156] O termo “sujeito” ou “indivíduo” refere-se a um membro de uma espécie de mamífero e inclui, porém, sem limitação, animais domésticos e primatas, incluindo seres humanos; o sujeito é, de preferência, um humano do sexo masculino ou feminino de qualquer idade ou raça.
[00157] O termo “uma quantidade terapeuticamente eficaz”, no contexto da presente invenção, refere-se à quantidade do aptâmero da invenção exigida para alcançar uma prevenção, cura, atraso, redução da gravidade ou melhora de um ou mais sintomas observáveis da patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4.
[00158] O termo “patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma patologia em que as células que expressam TLR-4 mostram um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 e/ou uma patologia em que há um aumento na quantidade de células que expressam TLR-4, em relação às condições fisiológicas normais ou de referência ou valores de referência, e em que as ditas células estão direta ou indiretamente envolvidas em relação a se o TLR-4 é responsável pela doença ou não. Dado que a ativação de TLR-4 produz uma cascata de sinalização que resulta na liberação de citocinas inflamatórias tais como IL-1, IL-8, TNF-alfa e IL-12, causando inflamação e danos celulares, a patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 pode ser, ademais, distinguida pelo fato de que tem um componente inflamatório.
[00159] Em uma modalidade particular, a dita patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é selecionada a partir do grupo que consiste em, dentre outros, acidente vascular cerebral, infarto agudo do miocárdio, sepse, aterosclerose, esclerose múltipla, artrite reumatoide, uma doença degenerativa da retina e toxicodependência.
[00160] Em uma modalidade preferencial, a dita patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é um acidente vascular cerebral. O termo “acidente vascular cerebral” ou “doença cerebrovascular” ou “infarto cerebral” ou “apoplexia”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma patologia distinguida por um déficit neurológico causado por uma diminuição importante no fluxo sanguíneo cerebral, de uma maneira anormalmente abrupta (acidente vascular cerebral isquêmico) ou devido à hemorragia causada pela ruptura de um vaso do cérebro (acidente vascular cerebral hemorrágico). No acidente vascular cerebral isquêmico, a irrigação sanguínea é perdida devido à interrupção súbita e imediata do fluxo sanguíneo devido à oclusão de qualquer uma das artérias que irrigam a massa cerebral, o que gera o aparecimento de uma área infartada. A oclusão arterial é geralmente devido à aterosclerose ou uma embolia (embolismo cerebral) que vem de outra localização, fundamentalmente o coração ou outras artérias. No acidente vascular cerebral hemorrágico, a ruptura de um vaso sanguíneo no cérebro ocorre, privando a área do cérebro que depende dessa artéria de sangue. Adicionalmente, o sangue que flui para fora comprime estruturas do cérebro, incluindo outros vasos, o que aumenta a área afetada pela isquemia secundária à hemorragia intracerebral.
[00161] Em uma modalidade preferencial, a dita patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é um infarto agudo do miocárdio. O termo “infarto agudo do miocárdio” ou “infarto” ou “ataque cardíaco”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma patologia distinguida pelo suprimento de sangue insuficiente, com danos ao tecido, em uma área do coração, causado por uma obstrução em uma das artérias coronárias. A isquemia ou suprimento de oxigênio deficiente resultando de tal obstrução causa angina de peito que, se recanulada logo o suficiente, não causa a morte do tecido do coração, enquanto que, se essa anoxia for mantida, o miocárdio se torna lesionado e a necrose, isto é, infarto, ocorre por fim.
[00162] Em uma modalidade preferencial, a dita patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é sepse. O termo “sepse” ou “septicemia”, no contexto da presente invenção, refere-se à síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS) causada por uma infecção geralmente grave. Essa reação do organismo ocorre em resposta à presença de micro-organismos patogênicos em qualquer tecido ou fluido do organismo e é causada pela ação do próprio sistema imunológico que libera substâncias pró-inflamatórias que iniciam a SIRS. A mesma é distinguida pela presença de pelo menos dois dos seguintes critérios: febre, hipertermia, taquipnéia, taquicardia e leucocitose.
[00163] Em uma modalidade preferencial, a dita patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é aterosclerose. O termo “aterosclerose”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma síndrome ou patologia distinguida pela deposição e infiltração de substâncias lipídicas nas paredes das artérias de tamanho médio ou espessas. As células da parede arterial interpretam essa deposição como uma invasão e ativam monócitos em circulação do sistema imunológico que penetram na parede arterial, são convertidos em macrófagos e começam a fagocitar partículas de LDL, gerando um processo inflamatório. A inflamação, por sua vez, causa a multiplicação e migração de células de músculo liso da parede, o que causa gradualmente o estreitamento do diâmetro arterial. O estreitamento específico é referido como uma placa ateromatosa. A mesma é a forma mais comum de arteriosclerose. As doenças que formam a síndrome de aterosclerose e distinguidas pelo envolvimento das artérias através de placas ateromatosas e, consequentemente, obstrução do fluxo sanguíneo ou isquemia, dependendo da artéria do órgão envolvido, são:
[00164] - Doença cardíaca isquêmica, sendo que o máximo representativo da mesma é infarto agudo do miocárdio, no coração.
[00165] - Doença cerebrovascular, na forma de acidente vascular cerebral ou trombose cerebral ou hemorragia cerebral, no sistema nervoso central.
[00166] - Claudicação intermitente, sendo que a gravidade máxima da mesma é isquemia arterial aguda dos membros inferiores.
[00167] - Disfunção erétil: essa é a principal causa de impotência em pessoas com mais de 40 anos de idade.
[00168] - Colite isquêmica que é uma área de inflamação (irritação e inchaço) causada pela interferência com o fluxo sanguíneo ao cólon (intestino grosso), nas artérias dos intestinos.
[00169] - Aneurisma aórtico, sendo que a gravidade máxima do mesmo é dissecção aórtica.
[00170] Em uma modalidade preferencial, a dita patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é esclerose múltipla. O termo “esclerose múltipla”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma patologia distinguida pelo início de lesões desmielinizantes, neurodegenerativas e crônicas do sistema nervoso central. Suas causas são atualmente desconhecidas, embora o envolvimento de vários mecanismos autoimunes tenha sido demonstrado. Em pacientes com esclerose múltipla, os linfócitos atravessam a barreira hematoencefálica para afetar a mielina, enquanto um processo inflamatório auxiliado por macrófagos e células neuroglia ocorre.
[00171] Em uma modalidade preferencial, a dita patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é uma artrite reumatoide. O termo “artrite reumatoide”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma patologia inflamatória autoimune sistêmica distinguida por causar sinovite persistente das articulações, causando sua destruição progressiva, gerando diferentes graus de deformidade e deficiência funcional. O processo começa com a intervenção de fatores humorais e celulares, particularmente células T CD4, que geram moléculas mediadoras de inflamação, atraem e ativam células sanguíneas periféricas, causando a proliferação e a ativação dos sinoviócitos, invadindo e destruindo a cartilagem da articulação, osso subcondral, tendões e ligamentos.
[00172] Em uma modalidade preferencial, a dita patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é uma doença degenerativa da retina. O termo “doença degenerativa da retina”, no contexto da presente invenção, refere-se a uma doença ou distúrbio distinguido por uma degeneração da retina que pode ser o resultado da inflamação da retina. A ativação mediada por TLR-4 mostrou fazer uma contribuição para o processo de inflamação da retina. As doenças degenerativas da retina principais incluem:
[00173] - Degeneração macular relacionada à idade (AMD) que resulta em uma perda de visão no centro do campo visual (a mácula) por causa de danos à retina. A mesma ocorre em formas "seca" e "úmida": na forma seca (não exudativa), detritos celulares chamados de drusas se acumulam entre a retina e a coroide, causando atrofia e cicatrizes na retina; na forma úmida (exudativa), que é mais grave, vasos sanguíneos crescem a partir da coroide atrás da retina que podem vazar exudato e fluido e também causam hemorragia.
[00174] - Doença de Stargardt, ou fundus flavimaculatus, é uma forma herdada de degeneração macular juvenil que causa a perda de visão progressiva ao ponto de cegueira legal. O início dos sintomas usualmente aparece entre as idades de 6 e 13 anos (média de cerca de 16 a 18 anos). Os sintomas se desenvolvem tipicamente aos 20 anos de idade e incluem visão trêmula, pontos cegos, desfocagem, visão de cores prejudicada e dificuldade de se adaptar à iluminação fraca.
[00175] - Retinite pigmentosa (RP) que é uma doença ocular degenerativa herdada que causa deficiência visual grave devido à degeneração progressiva das células fotoreceptoras do tipo bastão na retina. Os pacientes nos estágios iniciais da RP notam primeiro a visão em luz fraca e periférica comprometida devido aos fotoreceptores do tipo bastão. A degeneração de bastão progressiva é posteriormente seguida por anormalidades no epitélio de pigmento da retina adjacente e deterioração de células fotoreceptoras do tipo cone. Conforme a visão periférica se torna crescentemente comprometida, os pacientes experimentam "visão de túnel" progressiva e eventual cegueira.
[00176] - Outras doenças genéticas tais como coroideremia, amaurose congênita de Leber, retinosquise juvenil, doença de Usher e Bardet Biedl.
[00177] Em uma modalidade particularmente preferencial, a doença degenerativa da retina é selecionada a partir do grupo que consiste em AMD, doença de Stargardt, RP, coroideremia, amaurose congênita de Leber, retinosquise juvenil, doença de Usher e Bardet Biedl. Em uma modalidade mais preferencial, a doença degenerativa da retina é AMD. Em outra modalidade mais preferencial, a doença degenerativa da retina é a doença de Stargardt. Em outra modalidade mais preferencial, a doença degenerativa da retina é RP. Em outra modalidade mais preferencial, a doença degenerativa da retina é coroideremia. Em outra modalidade mais preferencial, a doença degenerativa da retina é amaurose congênita de Leber. Em outra modalidade mais preferencial, a doença degenerativa da retina é a doença de Usher. Em outra modalidade mais preferencial, a doença degenerativa da retina é a doença de Bardet Biedl.
[00178] Em uma modalidade preferencial, a dita patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é uma toxicodependência. O termo “toxicodependência” ou “dependência de drogas”, no contexto da presente invenção, refere-se a um distúrbio ou patologia causada pelo uso frequente de substâncias viciantes chamadas drogas. De acordo com ICD-10 (Organização Mundial de Saúde, 2005), a fim de ser diagnosticada como tal, a dependência de drogas deve apresentar três ou mais dos seguintes critérios que se referem tanto aos aspectos relacionados à dependência física quanto à dependência psicológica em um período de 12 meses:
[00179] - forte desejo de consumir a substância,
[00180] - dificuldades em controlar o dito consumo,
[00181] - síndrome de abstinência quando o consume é descontinuado ou reduzido,
[00182] - tolerância,
[00183] - abandono progressivo de interesses diferentes do consumo de substância,
[00184] - aumento no tempo investido em atividades relacionadas à obtenção da substância ou à recuperação de seus efeitos,
[00185] - persistência no uso da substância apesar de perceber claramente seus efeitos nocivos.
[00186] Para a administração a um indivíduo de um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas, o dito aptâmero será formulado em uma composição farmacêutica adequada. Os detalhes da dita composição farmacêutica são discutidos abaixo.
B. USOS MÉDICOS DO COMPLEXO DA INVENÇÃO
[00187] Os complexos de acordo com a presente invenção que compreendem um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional de acordo com a invenção podem compreender, como um grupo funcional, um fármaco adequado para o tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4. O objetivo duplo de (i) inibir a atividade de TLR-4 e (ii) direcionar o fármaco de uma maneira específica a seu sítio de ação é, portanto, alcançado.
[00188] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional para uso na medicina.
[00189] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional para uso na fabricação de um fármaco para o tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4.
[00190] Alternativamente, o mesmo pode ser expresso como o uso de um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional para uso no tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4.
[00191] Alternativamente, o mesmo pode ser expresso como o método de tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4 em um indivíduo que compreende a administração ao dito indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional ao dito indivíduo.
[00192] De acordo com a invenção, um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um fármaco se liga especificamente a TLR-4 na superfície de uma célula alvo. Quando o aptâmero da invenção é colocado em contato com TLR-4, o mesmo inibe sua atividade, resultando em uma redução ou interrupção na liberação de citocinas pró- inflamatórias tais como IL-1, IL-8, TNF-alfa e IL-12, e o fármaco exerce sua função na célula ou no ambiente em que a dita célula está localizada.
[00193] Os termos “aptâmero”, “TLR-4”, “variante funcionalmente equivalente”, “complexo”, “grupo funcional”, “fármaco”, “tratamento”, “quantidade terapeuticamente eficaz”, “indivíduo”, “célula alvo” e “patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4” foram descritos em detalhes acima, e suas definições e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência.
[00194] Os fármacos adequados que podem ser usados como grupos funcionais nos complexos formados com um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 incluem, sem limitação, antagonistas de TLR-4, tais como naloxona, naltrexona, LPS, ibudilast, propentofilina, amitriptilina, cetotifeno, ciclobenzaprina, mianserina e imipramina; fármacos antiplaquetários, tais como aspirina e clopidogrel; anticoagulantes, tais como heparina, acenocumarol, varfarina, dabigatrana e rivaroxabana; e antioxidantes, tal como edaravona; o ativador de plasminogênio de tecido e as variantes recombinantes do mesmo; ácidos nucleicos que têm a capacidade de silenciar a expressão dos genes envolvidos em uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4, tal como RNA antissenso, DNA antissenso e RNA interferente pequeno; peptídeos, tais como peptídeos de sinalização e peptídeos de ligação alvo.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00195] Para a administração a um indivíduo que precisa de um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas ou um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional, os ditos aptâmeros e complexos podem ser formulados em composições farmacêuticas adequadas.
[00196] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a uma composição farmacêutica, doravante “a primeira composição farmacêutica da invenção”, que compreende pelo menos um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas.
[00197] Em uma modalidade particular, a primeira composição farmacêutica da invenção compreende adicionalmente um ou mais carreadores, excipientes ou solventes farmaceuticamente aceitáveis.
[00198] Em outro aspecto, a presente invenção refere- se a uma composição farmacêutica, doravante “a segunda composição farmacêutica da invenção”, que compreende pelo menos um complexo que compreende um aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas e um grupo funcional.
[00199] Em uma modalidade particular, a segunda composição farmacêutica da invenção compreende adicionalmente um ou mais carreadores, excipientes ou solventes farmaceuticamente aceitáveis.
[00200] As composições farmacêuticas fornecidas pela presente invenção podem ser administradas a um indivíduo para o tratamento de uma patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4.
[00201] Os termos “aptâmero”, “TLR-4”, “variante funcionalmente equivalente”, “complexo”, “grupo funcional”, “fármaco”, “tratamento”, “indivíduo” e “patologia distinguida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR-4” foram descritos em detalhes acima, e suas definições e particularidades são incluídas no presente documento a título de referência.
[00202] O termo “carreador farmaceuticamente aceitável” ou “excipiente farmaceuticamente aceitável” ou “solvente farmaceuticamente aceitável”, no contexto da presente invenção, busca incluir quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de atraso de absorção e similares compatíveis com a administração farmacêutica. O uso de tais carreadores e veículos em substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. A não ser que qualquer carreador convencional seja incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições da invenção é contemplado. Os veículos aceitáveis, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para o indivíduo nas doses e concentrações usadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo- hexanol; 3-pentanol e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 aminoácidos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).
[00203] Os compostos ativos suplementares podem também ser incorporados na composição farmacêutica fornecida pela presente invenção. Portanto, em uma modalidade particular, a composição farmacêutica fornecida pela presente invenção pode também conter mais do que um composto ativo conforme exigido para a indicação particular em questão, de preferência, aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável fornecer, ademais, um agente quimioterapêutico, uma citocina, um agente analgésico, um agente anti-inflamatório ou um agente imunossupressor. A quantidade eficaz dos ditos outros agentes ativos depende, dentre outras coisas, da quantidade terapêutica dos aptâmeros ou dos complexos que estão presentes na composição farmacêutica, da natureza e da gravidade da patologia a ser tratada, do indivíduo, etc.
[00204] Em uma modalidade, o aptâmero de ácido nucleico com a capacidade de se ligar especificamente a e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcionalmente equivalente das mesmas ou o complexo da invenção é formulado com veículos que protegerão os ditos produtos da eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistema de entrega microencapsulado. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis tais como acetato de etileno-vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico podem ser usados. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para pessoas versadas na técnica. As mesmas podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos por pessoas versadas na técnica, por exemplo, conforme descrito na patente n° US 4.522.811.
[00205] As composições farmacêuticas fornecidas pela presente invenção podem ser administradas a um indivíduo por meio de qualquer via de administração adequada, tal como, por exemplo, por via parenteral.
[00206] O termo “parenteral”, no contexto da presente invenção, inclui a administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea. A forma intravenosa da administração parenteral é geralmente preferencial.
[00207] Ademais, as composições farmacêuticas fornecidas pela presente invenção podem ser adequadamente administradas por infusão de pulso, por exemplo, com doses decrescentes do aptâmero ou do complexo da invenção. De preferência, a dosagem é fornecida por meio de injeções, de maior preferência, injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica.
[00208] Em outra modalidade particular, as composições farmacêuticas fornecidas pela presente invenção podem ser adaptadas para administração parenteral com a adição de soluções estéreis, suspensões ou produtos liofilizados na forma de dosagem adequada. As composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis ou pós estéreis para a preparação de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para a administração intravenosa, os veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática CremophorEM (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina de tampão de fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e fluida para facilitar a injetabilidade. A mesma deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser conservada contra a ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, um poliol farmaceuticamente aceitável tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, por meio do uso de um revestimento tal como lecitina, por meio da manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser alcançada por meio de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferencial incluir na composição agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tal como manitol, sorbitol e cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada incluindo na composição um agente de atraso de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e/ou gelatina.
[00209] As soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas incorporando-se a quantidade exigida do composto ativo (por exemplo, um aptâmero ou complexo da invenção) em um solvente adequado com um ou uma combinação dos ingredientes listados anteriormente, conforme exigido, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos dentre aqueles anteriormente listados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os métodos preferencias de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional da solução estéril anteriormente filtrada do mesmo.
[00210] Em uma modalidade particular, a dita composição farmacêutica é administrada através de via intravenosa. Excipientes adequados, tais como agentes avolumadores, agentes de tamponamento ou tensoativos, podem ser usados. As formulações mencionadas serão preparadas com o uso de métodos padrão tais como aqueles descritos ou contemplados nas farmacopeias da Espanha e dos Estados Unidos e textos de referência similares.
[00211] É particularmente vantajoso formular as composições farmacêuticas, ou seja, as composições parenterais, na forma unitária de dosagem para facilitar a uniformidade e administração de dosagem. Forma unitária de dosagem, conforme usado no presente documento, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado, sendo que cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto ativo (um aptâmero ou complexo da invenção) calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação ao veículo farmacêutico exigido. A especificação para as formas de dosagem unitária da invenção é condicionada e depende diretamente dos recursos exclusivos do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado e das limitações inerentes na técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de indivíduos.
[00212] Os compostos ativos (aptâmero ou complexo da invenção) serão tipicamente administrados uma ou mais vezes por dia, por exemplo 1, 2, 3 ou 4 vezes por dia, com doses diárias totais típicas no intervalo de 0,0001 a 1,000 mg/kg de peso corporal/dia, de preferência, de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal/dia, de maior preferência, de cerca de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal/dia. As composições farmacêuticas podem ser formuladas para o propósito de conter a quantidade desejada, tal como a quantidade terapeuticamente eficaz do aptâmero ou complexo da invenção.
[00213] As composições farmacêuticas fornecidas pela presente invenção podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou distribuidor juntamente com instruções para a administração.
MÉTODOS DE IMAGINOLOGIA DA INVENÇÃO
[00214] Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um complexo de acordo com a invenção para imaginologia in vivo de uma célula, tecido ou órgão que expressa TLR4, em que o dito complexo compreende um ou mais aptâmeros de acordo com a invenção e um grupo funcional, sendo que o dito grupo funcional é uma porção detectável.
[00215] - As porções detectáveis adequadas para uso nos métodos de imaginologia in vivo de acordo com a invenção foram descritas acima no contexto do complexo da invenção e incluem, sem limitação, um radionuclídeo, um fluoróforo, um meio de contraste, uma proteína e um hapteno.
[00216] A invenção é descrita abaixo por meio dos seguintes exemplos que são apenas ilustrados e não são, de modo algum, limitantes do escopo da invenção.
EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS BIBLIOTECA DE APTÂMEROS
[00217] Os inventores usaram a biblioteca de aptâmeros RND40 para executar a triagem de aptâmeros específicos para TLR-4, supridos por IBA GmbH (Goettingen, Alemanha). A biblioteca RND40 inicial é teoricamente composta de 1024 oligonucleotídeos de DNA de fita simples (ssDNA) com uma sequência fixa nas extremidades, consistindo em 18 nucleotídeos em que cada um hibridiza os respectivos iniciadores para amplificação por PCR dos mesmos, e uma região que consiste em 40 bases que têm sequência aleatória. Nas triagens feitas, 1013 oligonucleotídeos dessa biblioteca foram usados.
HTLR-4 RECOMBINANTE DE 6HIS
[00218] A proteína que corresponde ao domínio extracelular da proteína de TLR-4 humana, aminoácidos 24 a 631, foi recombinantemente gerada fundida a uma etiqueta de 6-histidina na extremidade de C-terminal, por meio da expressão no baculovírus.
CÉLULAS
[00219] Células HEK293T e HEK293T/TLR-4 foram obtidas junto à Invivogen (San Diego, Califórnia, EUA).
TRIAGEM COM CÉLULAS HEK-293T-TLR4/HEK-293T
[00220] Para cada ciclo de triagem, 8 a 10 x 105 células HEK-293T foram semeadas em triplicata em cavidades de placa P6, 24 h antes do ensaio de triagem e foram incubadas a 37 °C, CO2 5%. Então, 1 nmol de aptâmeros da biblioteca RND40 (ou da população isolada do ciclo de triagem anterior) em 100 μl de PBS, tais aptâmeros foram anteriormente desnaturados a 95 °C por 10 min seguido pela incubação a 4 °C por 10 min, foi adicionado; 300 μl de meio DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementados com soro bovino fetal 10% , 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina e 25 μg/ml de anfotericina foram adicionados e aplicados nas células. Após 1 h de incubação a 37 °C, CO2 5%, o meio de cultura com os aptâmeros não ligados foi removido, as células foram lavadas duas vezes com PBS e recuperadas em 500 μl de PBS por meio de centrifugação a 1.500 rpm. As células foram centrifugadas para remover o sobrenadante, e os aptâmeros aderidos às células foram amplificados por PCR para preparar uma quantidade suficiente para o ciclo de triagem seguinte.
[00221] A contratriagem em células HEK-293T da biblioteca de aptâmeros RND40 foi feita durante a preparação anterior da população RND40 inicial e a cada 3 ciclos de triagem, com a população isolada do ciclo de triagem anterior. Para essa finalidade, 8 a 10 x 105 células HEK- 293T foram semeadas em triplicata em cavidades de placa P6, 24 h antes do ensaio de triagem e foram incubadas a 37 °C, CO2 5%. Então, 1 nmol de aptâmeros da biblioteca RND40 (ou da população isolada do ciclo de triagem anterior) em 100 μl de PBS, tais aptâmeros foram anteriormente desnaturados a 95 °C por 10 min seguido pela incubação a 4 °C por 10 min, foi adicionado; 300 μl de meio DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementados com soro bovino fetal 10% , 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina e 25 μg/ml de anfotericina foram adicionados e aplicados nas células. Após 1 h de incubação a 37 °C, CO2 5%, o meio de cultura com os aptâmeros não ligados para serem usados nos ciclos de triagem em TLR-4 foi removido.
TRIAGEM COM PROTEÍNA DE HTLR-4 SOLÚVEL
[00222] Para cada ciclo de triagem, a biblioteca RND40 enriquecida em um ciclo de triagem anterior é usada. 1 nmol de aptâmeros foi incubado com 7 μg de 6xHIS-hTLR-4 (a uma razão de 10 moléculas de aptâmero para 1 molécula de hTLR-4), em um tampão de aptâmero (Tris-HCl a 20 mM, pH 7,4, MgCl2 a 1 mM, NaCl a 150 mM, KCl a 5 mM), a 37 °C por 1 h com agitação. Subsequentemente, a resina de NTA-Ni (QIAGEN, Alemanha) foi adicionada, e a mesma foi incubada a 4 °C por 1 h para capturar a proteína. Após 3 lavagens com tampão de aptâmero, as sequências ligadas foram amplificadas por PCR para preparar uma quantidade suficiente para o ciclo de triagem seguinte.
[00223] A contratriagem é realizada nas mesmas condições que a triagem, mas na ausência da proteína de TLR-4 ligada à resina.
AMPLIFICAÇÃO DOS APTÂMEROS SELECIONADOS
[00224] Os aptâmeros selecionados foram ressuspensos em um volume de 20 μl de água destilada e amplificados por meio de PCR com o uso dos iniciadores que corresponderão às sequências SEQ ID NO: 5 (GCGGATGAAGACTGGTGT) e SEQ ID NO: 6 (GTTGCTCGTATTTAGGGC) nas condições de 0,8 μM/SEQ ID NO: 5 iniciadora, 0,8 μM/SEQ ID NO: 6 iniciadora, dNTPs a 200 mM, MgCl2 a 2 mM, Taq polimerase a 10 U (Biotools, Espanha) em um volume final de 200 μl de acordo com o seguinte programa de amplificação: 2 min a 95 °C; 15 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 56 °C e 30 s a 72 °C; e, finalmente, 5 min a 72 °C.
ELONA
[00225] Foi determinado se os aptâmeros selecionados reconheceram a proteína de TLR-4. Para essa finalidade, 100 ng/cavidade de TLR-4 recombinante 6xHIS foram adicionados a uma placa de microtitulação de 96 cavidades e foram incubados a 4 °C por 16 h. Subsequentemente, aptâmeros individuais identificados com digoxigenina na extremidade 5' foram diluídos a uma concentração de 5 μg/ml e, então, desnaturados por 10 min a 95 °C e resfriados por 10 min em gelo. Então, 20 pmol de cada um dos aptâmeros em 100 μl (200 nM) de tampão de aptâmero foram adicionados a cada cavidade, e a placa foi incubada por 1 h a 37 °C. Finalmente, a placa foi incubada com anticorpos antidigoxigenina conjugados com peroxidase e desenvolvida com o uso de ABTS. Um aptâmero de DNA anti-Li H2A foi usado como um controle positivo (Martín et al., 2013, PLoS ONE 8: e78886).
ENSAIOS DE LIGAÇÃO PARA LIGAR OS APTÂMEROS AO HTLR-4 RECOMBINANTE
[00226] Para o propósito de analisar a capacidade de cada um dos aptâmeros identificados de se ligar a hTLR-4, experimentos foram realizados em que hTLR-4 foi ligado a uma resina de Ni-NTA, anteriormente equilibrada, através de uma etiqueta de histidina. Então, os complexos de resina:proteína contendo 1 pmol de TLR4 foram incubados com 1 pmol de aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3), TLRApt#2F, TLRApt#3R e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4), anteriormente estruturados por meio de desnaturação térmica a 95 °C por 10 min e renaturação subsequente a 4 °C por 10 min. Após a incubação por 10 min a 37 °C, os complexos foram lavados, e os aptâmeros foram recuperados com imidazol a 150 mM dissolvidos em PBS com MgCl2 a 1 mM. Os valores do aptâmero ligado a hTLR-4 foram determinados por meio de PCR quantitativa (qPCR) com o uso dos iniciadores com sequências SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 em um termociclador IQ5 (BioRad).
ENSAIOS DE LIGAÇÃO PARA LIGAR OS APTÂMEROS A TLR-4 EXPRESSO EM CÉLULAS
[00227] Para esse propósito de analisar a capacidade dos aptâmeros identificados de se ligar à proteína de TLR-4 expressa em células HEK-293, 20 pmol de cada um dos aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3), TLRApt#2F, TLRApt#3R e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) foram adicionados a uma cultura de células HEK-293-TLR4 semeada a 20.000 células/cavidade em placas de microtitulação de 96 cavidades a uma densidade de 2 x 104 células/cavidade, 2 dias antes do início do ensaio. Após a incubação por 30 min a 37 °C, CO2 5%, as células foram lavadas, os aptâmeros foram recuperados com imidazol a 150 mM dissolvidos em PBS com MgCl2 a 1 mM, e qPCR foi executada para determinar os valores de Ct.
ENSAIOS DE ATIVIDADE DE RECEPTOR HTLR-4
[00228] Para realizar esses ensaios, células de hTLR4 HEK-Blue (Invivogen, referência hkb-htlr4) que expressam o receptor humano TLR-4, juntamente com as proteínas MD2 e CD14, que são ativadas pela ligação de seu agonista, o lipopolissacarídeo de Escherichia coli K12 (LPS-EK), foram usadas. Para detectar a ativação de TLR-4, essa linhagem celular contém um gene-repórter de SEAP (fosfatase alcalina embrionária secretada) que é controlado pelo promotor de NF-kB, de modo que o mesmo seja expresso em resposta à via de sinalização de NF-kB, induzida por TLR-4. A enzima SEAP é secretada no meio de cultura, e, adicionando e metabolizando seu substrato comercial QUANTI-Blue™ (Invivogen, San Diego, Califórnia, EUA), a mesma causa uma alteração na cor do meio de vermelho para azul. Adicionalmente, a molécula agonista de controle LPS-EK UP (lipopolissacarídeo de E. coli K12, Ultrapuro) e o antagonista LPS-RS UP (lipopolissacarídeo de R. sphaeroides, Ultrapuro) são dissolvidos em MgCl2 a 1 mM em PBS estéril a concentrações de 0,02 ng/μl e 2 ng/μl, respectivamente. Os aptâmeros são preparados a concentrações de 0,1, 1, 10 e 100 ng/μl em Cl2Mg a 1 mM em PBS estéril, são desnaturados a 95 °C por 10 min e foram estruturados a 4 °C por 10 min.
[00229] Para o ensaio, células HEK Blue-hTLR4 foram semeadas em placa de cultura de 96 cavidades a 2x104 células/cavidade em 200 μl de meio completo DMEM suplementado com (1x) Seleção HEK-Blue™. Após 24 h ou 48 h de incubação, quando as células obtêm 70 a 80% de confluência, o meio é recuperado, e são adicionados 170 μl de meio fresco. Em cavidades de controle, 30 μl de tampão de SELEX são adicionados. Em outras cavidades, 20 μl de LPS-EK ultrapuro (Invivogen, EUA) a 20 ng/ml (0,1 ng/ml final) ou 20 μl de lisado de 1,5 a 2,5x107 células HEK293/ml (padrão molecular associado a danos; DAMP) foram adicionados como moléculas agonistas. Após 1 h de incubação, 10 μl de aptâmero diluídos em tampão de SELEX às concentrações apropriadas foram adicionados às cavidades para alcançar as concentrações finais indicadas nas figuras. LPS-RS ultrapuro (Invivogen, EUA) a uma concentração de 200 ng/ml foi usado como o controle antagonista. A atividade de fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) foi medida após 24 h com o uso do substrato QUANTI-Blue™ (Invivogen) a 630 nm.
EFEITO DOS APTÂMEROS EM MACRÓFAGOS
[00230] Os macrófagos peritoneais foram semeados em placas de 12 cavidades a uma densidade de 1x106 células/ml. Os macrófagos foram estimulados na presença de 500 ng/ml de LPS e 1 h após o aptâmero ter sido adicionado a uma concentração final de 20 nM e 200 nM. A liberação de nitritos foi medida pela reação de Griess após 24 h. As amostras foram analisadas em duplicata.
MODELO ANIMAL DE ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL
[00231] Camundongos C57BL machos adultos pesando 28 a 30 g foram usados. Camundongos C57BL/10ScNJ (anteriormente chamados de C57BL/10ScCr) e C57BL/10ScSn foram adquiridos junto à The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me, EUA). A cepa murina C57BL/10ScNJ não expressa TLR4 funcional pela deleção do gene TLR4, e a cepa C57BL/10ScSn não expressa qualquer mutação no gene TLR4 e é usada como um grupo de controle. 4 camundongos com deficiência de TLR4 foram usados por grupo (C57BL/10ScNJ), e 4 camundongos de controle foram usados por grupo (C57BL/10ScSn). Todos os protocolos experimentais cumpriram com as diretivas do “Comité de Bienestar Animal” (Comitê de Bem- estar Animal) da Universidad Complutense (seguindo as Diretivas europeias 86/609/EEC e 32/2007/EC). Os animais foram alojados em condições de temperatura, condições de umidade e condições de ciclo de luz/escuridão de 12 horas normais com livre acesso a alimento e água.
[00232] A indução de isquemia cerebral focal foi executada por meio da oclusão arterial cerebral média (MCAO) de acordo com os ensinamentos de Caso et al., 2007 (Caso et al., 2007, Circulation 115:1.599 a 1.608). Resumidamente, a isquemia cerebral focal permanente é induzida por ligadura da artéria carótida comum (CCA) e oclusão ipsilateral distal da artéria cerebral média (MCA). Para a ligadura da CCA, uma incisão ventral-cervical é feita para isolar a dita artéria e ocluir a mesma permanentemente por meio da ligadura. Para a oclusão da MCA, uma incisão é feita a 1 cm da linha perpendicular que une o canto lateral do olho esquerdo e o canal auditivo externo, e o músculo temporal é removido. Um orifício de perfuração é feito para expor a MCA que é ocluída pela ligadura. Após a cirurgia, o fechamento das incisões e a desinfecção, os animais foram retornados para suas gaiolas com livre acesso a alimento e água. Os sinais vitais do animal são controlados durante a cirurgia.
[00233] Danos cerebrais foram avaliados por meio da imaginologia por ressonância magnética. Resumidamente, os camundongos foram anestesiados com isoflurano, e, 24 horas após MCAO, o tamanho do infarto foi avaliado por IRM. As imagens destacadas em T2 (T2WI) foram adquiridas em um BIOSPEC BMT 47/40 operando a 4,7 T (Bruker-Medical, Ettlingen, Alemanha; MRI Unit, Instituto Pluridisciplinar, UCM).
ANÁLISE POR CITOMETRIA DE FLUXO
[00234] Todas as análises por citometria de fluxo foram realizadas em um citômetro de fluxo modelo FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry systems). A ligação dos aptâmeros a TLR4 de superfície celular foi analisada semeando-se células HEK293 ou HEK Blue-hTLR4 em placas de cultura de 24 cavidades a 2x105 células/cavidade em 200 μl de meio completo DMEM suplementado com tampão de Seleção HEK-Blue™. Depois, as células são tratadas ou não com o ativador de TLR-4 LPS-EK-UP (0,4 ng/cavidade) por 30 min e, então, com aptâmeros identificados com Alexa Fluor 488 (20 nM) em 50 μl de volume de tampão de PBS contendo MgCl2 a 1 mM e 1 mg/ml de BSA por 30 min à temperatura ambiente no escuro. As células foram, então, lavadas com 2 ml do mesmo tampão, suspensas em 0,5 ml do tampão e submetidas à análise de citometria de fluxo.
DIGESTÃO DE NUCLEASES
[00235] Trezentos ng de aptâmeros foram dobrados em tampão SELEX aquecendo-se a 95 °C e resfriando em gelo. Os aptâmero redobrados foram incubados com 2 U de À Exonuclease ou DNAse I (Fermentas) em uma reação de 10 μl por 10 min, 30 min, 1 h, 2 h e 4 h a 37 °C. Depois, as amostras foram solvidas em um gel de agarose 3%. As bandas foram visualizadas por GelRed (Biotium) e quantificadas com o uso do software Image Studio Digits V3.1.
EXEMPLO 1: TRIAGEM DE APTÂMEROS ESPECÍFICOS PARA TLR-4
[00236] Os inventores usaram a biblioteca de aptâmeros RND40 para executar a triagem de aptâmeros específicos para TLR-4, supridos por IBA GmbH (Goettingen, Alemanha). A biblioteca RND40 inicial é composta de oligonucleotídeos (ssDNA) com uma sequência fixa nas extremidades, consistindo em 18 nucleotídeos cada, em que os mesmos hibridizam os respectivos iniciadores para amplificação por PCR dos mesmos, e uma região que consiste em 40 bases que têm uma sequência aleatória.
[00237] A biblioteca RND40 inicial de 1013 aptâmeros foi enriquecida em aptâmeros específicos para hTLR-4. Como uma etapa anterior à triagem com TLR-4, um processo de “contratriagem” foi realizado na biblioteca para a superfície ou matriz em que a molécula alvo (resina magnética, células da mesma linhagem que aquela que expressa a proteína alvo, etc.) é apresentado.
EXEMPLO 2: CARACTERIZAÇÃO DOS APTÂMEROS SELECIONADOS
[00238] Os aptâmeros selecionados foram identificados após 6 ciclos de triagem de acordo com as seguintes estratégias:
[00239] a) Por meio da clonagem da população de aptâmeros em um plasmídeo para o propósito de obter aptâmeros individuais e sequenciamento de Sanger subsequente.
[00240] b) Por meio do sequenciamento massivo da população de aptâmeros foram obtidos os aptâmeros que são os mais repetidos sendo identificados.
[00241] As sequências que são mais representadas foram quimicamente sintetizadas por IBA GmbH (Goettingen, Alemanha), e a afinidade e atividade de cada um dos aptâmeros foram estudadas em ensaios de ligação quanto à ligação à proteína de hTLR-4 recombinante ou a TLR-4 de células HEK-293, por meio de ELONA, ensaios de ligação para a ligação dos aptâmeros à proteína de TLR-4 recombinante e a TLR-4 expresso em células, ensaios de atividade do receptor hTLR-4.
[00242] Os resultados dos ensaios de ELONA (Figura 1) mostram claramente que os aptâmeros que se ligam mais eficazmente à proteína de hTLR-4 recombinante são os aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4). Por meio do mesmo tipo de ensaio, os aptâmeros TLRApt#2F e TLRApt#3R foram identificados. A Figura 2 mostra as sequências e estruturas secundárias mais prováveis dos aptâmeros selecionados TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4), obtidos com o uso do software mFold (Zuker M., 2003, Nucleic Acids Res 31:3.406 a 3.415).
[00243] A capacidade de ligação dos aptâmeros a hTLR-4 foi determinada por meio da incubação dos aptâmeros com uma resina de Ni-NTA com hTLR-4 ligado, recuperação e amplificação por qPCR subsequente dos aptâmeros ligados. Os resultados obtidos mostram que todos os aptâmeros selecionados têm a capacidade de se ligar à proteína de hTLR-4 recombinante (Figura 3A). Nesses experimentos, um valor de Ct mais baixo indica uma quantidade maior de aptâmero ligado a hTLR-4.
[00244] Para esse propósito de analisar a capacidade dos aptâmeros identificados de se ligar à proteína de TLR-4 expressa em células HEK-293, 20 pmol (500 ng) dos aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) são adicionados a uma cultura de células HEK- 293-TLR4. Após a incubação por 30 min a 37 °C, CO2 5%, as células são lavadas e recuperadas, e qPCR é realizada para o propósito de calcular os valores de Ct. Nesses experimentos, um valor de Ct mais baixo indica uma quantidade maior de aptâmero ligado às células. Os resultados obtidos mostram que os aptâmeros selecionados TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) (Figura 3B) são aqueles que se ligam com uma afinidade mais alta.
[00245] Curvas de resposta à dose foram feitas para o propósito de determinar a concentração de cada aptâmero em que o efeito de antagonista máximo é obtido usando como agonista LPS-EK-UP (Figura 4A) ou lisados de células HEK293 (padrão molecular associado a danos; DAMP) (Figura 4B). Com base nos resultados obtidos, pode ser concluído que as concentrações nas quais o melhor efeito é observado são 20 nM para agonista LPS-EK-UP e 200 nM para DAMPs.
[00246] O efeito dos aptâmeros em macrófagos é mostrado na Figura 5. Os aptâmeros TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) e TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) inibiram a liberação de nitrito após a estimulação de macrófagos com LPS. Nesses experimentos, o aptâmero TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) parece mais ativo do que TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) para as mesmas concentrações.
EXEMPLO 3: OTIMIZAÇÃO DOS ANTAGONISTAS DE APTÂMERO DE TLR-4 PARA AUMENTAR SUA ATIVIDADE E ESTABILIDADE EM MODELOS ANIMAIS
[00247] Os aptâmeros que mostraram a capacidade de inibir o receptor TLR-4 foram modificados por meio da remoção de regiões específicas da sequência dos mesmos para o propósito de aumentar a estabilidade e/ou resistência em relação a nucleases. Para essa finalidade, um estudo da estrutura secundária dos diferentes aptâmeros foi conduzido com o uso do programa mFold (Zuker M., 2003, mencionado acima), e a capacidade dos aptâmeros de formar estruturas G-quadruplex foi analisada por meio do programa QGRS Mapper (Kikin et al., 2006, Nucleic Acids Res 34:W676 a W682). Portanto, os aptâmeros TLRApt#1R-T (SEQ ID NO: 1) e TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2), que correspondem àqueles identificados nas primeiras triagens (Figura 6), foram projetados e sintetizados.
EXEMPLO 4: EFEITO DOS ANTAGONISTAS DE APTÂMERO DE TLR-4 EM UM MODELO ANIMAL DE ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL
[00248] A capacidade dos novos aptâmeros, otimizados para bloquear a resposta inflamatória produzida após um episódio de acidente vascular cerebral em um modelo animal de acidente vascular cerebral, avaliando a capacidade dos aptâmeros específicos para TLR-4 de reduzir a lesão cerebral.
[00249] Para essa finalidade, camundongos com deficiência em TLR-4 machos adultos (C57BL/10ScNJ) e camundongos de controle que expressam TLR-4 (C57BL/10ScSn) foram usados, em que a isquemia cerebral focal foi induzida por meio da oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Os resultados obtidos em camundongos que expressam normalmente TLR4 (camundongos de controle) demonstram que os aptâmeros causam uma redução no tamanho da área infartada que, no caso do aptâmero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2), é estatisticamente significativa. Adicionalmente, os resultados obtidos em camundongos com deficiência em TLR-4 mostram que não há nenhum efeito do aptâmero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) no qual o mesmo é obtido quando os camundongos são tratados com o veículo (Figura 7). Esses dados indicam claramente que o efeito do aptâmero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) ocorre através do TLR-4.
[00250] Em outro conjunto de experimentos, camundongos machos adultos C57BL/10ScSn (WT; normais) foram submetidos à indução de uma isquemia cerebral focal e, então, tratados com injeção intraperitoneal de diferentes quantidades de aptâmeros TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) ou veículo (PBS + Mg2+ a 1 mM). Os resultados obtidos demonstram que os aptâmeros causam uma redução maior no tamanho da área infartada a 1 nmol de aptâmero/animal e que essa redução é estatisticamente significativa (Figura 8).
EXEMPLO 5: CITOMETRIA DE FLUXO
[00251] Ensaios de citometria de fluxo foram realizados com o uso ada linhagem de células HEK293 transfectada com TLR4 humano, 293-hTLR4A. A linhagem de células HEK293 humana parental, sem TLR4 humano, foi usada como um controle. Nesse experimento, os aptâmeros foram identificados com Alexa Fluor 488. A Figura 9A mostra que os aptâmeros identificados com Alexa Fluor 488 se ligam fortemente a células 293-hTLR4A (painel direito), mas não a células HK293 sem TLR4 humano (painel esquerdo). Adicionalmente, é observado que ApTLR#4F-T (SEQ ID NO: 2) se liga ao alvo com uma afinidade mais alta do que ApTLR#1R-T (SEQ ID NO: 1). Por sua vez, os resultados do manchamento celular com o uso dos aptâmeros selecionados após a ativação (ou não) de células hTLR4-Blue-HEK foram comparados. Conforme esperado, os aptâmeros ligaram TLR4 após a ativação em um nível similar em relação às células não ativadas (Figura 9B).
EXEMPLO 6: CÁLCULO DE MEIA-VIDA POR DIGESTÃO DE NUCLEASES
[00252] A meia-vida dos aptâmeros foi medida in vitro na presença de À Exonuclease ou DNAse I (Figura 10). Os resultados mostram que os quatro aptâmeros são resistentes à À Exonuclease enquanto que a DNAse I produz uma degradação dependente de tempo dos quatro aptâmeros. Assim, o aptâmero ApTLR#1R-T (SEQ ID NO: 1) é o mais sensível e é completamente degradado após 5 min de incubação na presença de DNAse I. Ao contrário, os aptâmeros ApTLR#4F (SEQ ID NO: 4) e ApTLR#4F-T (SEQ ID NO: 2) são resistentes mesmo após 2 h de incubação com DNAse I.
CONCLUSÕES
[00253] - Os aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) foram selecionados em relação ao domínio extracelular do receptor TLR-4 que reconhecem o receptor humano TLR-4 tanto em sua forma recombinante solúvel (in vitro) quanto integrado na membrana de células HEK293 (in vivo).
[00254] - Os aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4) mostram um efeito antagonista do receptor TLR-4.
[00255] - Os aptâmeros TLRApt#1R-T (SEQ ID NO: 1) e TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) foram obtidos em forma truncada mantendo a atividade antagonista dos aptâmeros originais TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4), respectivamente.
[00256] - O aptâmero TLRApt#4F-T (SEQ ID NO: 2) tem a capacidade de reduzir a área infartada em um modelo animal de acidente vascular cerebral.
[00257] - Os aptâmeros TLRApt#1R (SEQ ID NO: 3) e TLRApt#4F (SEQ ID NO: 4), selecionados contra o domínio extracelular do receptor TLR4, reconhecem o receptor TLR-4 humano tanto em sua forma solúvel recombinante (in vitro) quanto integrado na membrana de células HEK293 (in vivo).

Claims (15)

1. Aptâmero de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que possui a capacidade de se ligar especificamente a TLR-4 e inibir TLR-4 e que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
2. Aptâmero, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.
3. Aptâmero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o TLR-4 é um TLR-4 humano.
4. Complexo caracterizado pelo fato de que compreende o aptâmero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um grupo funcional.
5. Complexo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o grupo funcional é selecionado a partir do grupo que consiste em um reagente detectável, um fármaco e uma nanopartícula.
6. Complexo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula é uma nanopartícula de metal.
7. Complexo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula de metal é uma nanopartícula de sílica mesoporosa magnética.
8. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, para uso em imagiologia in vivo de uma célula, tecido ou órgão que expressa TLR4, caracterizado pelo fato de que o grupo funcional no complexo é uma porção detectável.
9. Uso in vitro de um aptâmero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de ser para detectar TLR-4 em uma amostra.
10. Uso in vitro de um aptâmero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de ser para inibir TLR-4 em uma amostra.
11. Método in vitro para a detecção de TLR-4 em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende: i) colocar a dita amostra em contato com um aptâmero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 7; ii) separar o aptâmero ou complexo não ligado ao TLR-4; e iii) detectar a presença do aptâmero ou complexo ligado ao TLR-4 presente na amostra.
12. Método in vitro para inibir TLR-4 em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma amostra que compreende TLR-4 em contato com um aptâmero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 7, em condições adequadas para inibir TLR-4.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 e 12, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra biológica de um indivíduo humano.
14. Uso de um aptâmero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma patologia definida por um aumento na expressão de TLR-4 e/ou um aumento na ativação de TLR- 4, em que a patologia definida por um aumento na expressão e/ou um aumento na ativação de TLR-4 é selecionada a partir do grupo que consiste em acidente vascular cerebral, infarto agudo do miocárdio, sepse, aterosclerose, esclerose múltipla, artrite reumatoide, dependência química e uma doença degenerativa da retina e, em que se a doença é uma doença degenerativa da retina, a doença é preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em degeneração macular relacionada à idade, doença de Stargardt, retinite pigmentosa, coroideremia, amaurose congênita de Leber, retinosquise juvenil, doença de Usher e Bardet Biedl.
15. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um aptâmero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou pelo menos um complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 7, em combinação com um solvente selecionado do grupo que consiste em PBS, TBS, tampão fosfato e tampão citrato.
BR112016030172-2A 2014-06-24 2015-06-24 Aptâmeros específicos para tlr-4 e usos dos mesmos BR112016030172B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201430955A ES2555160B1 (es) 2014-06-24 2014-06-24 Aptámeros específicos de TLR-4 y usos de los mismos
ESP201430955 2014-06-24
PCT/EP2015/064277 WO2015197706A1 (en) 2014-06-24 2015-06-24 Aptamers specific for tlr-4 and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112016030172A2 BR112016030172A2 (pt) 2017-11-14
BR112016030172B1 true BR112016030172B1 (pt) 2022-11-01

Family

ID=53496661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112016030172-2A BR112016030172B1 (pt) 2014-06-24 2015-06-24 Aptâmeros específicos para tlr-4 e usos dos mesmos

Country Status (18)

Country Link
US (4) US10196642B2 (pt)
EP (1) EP3161139B1 (pt)
JP (2) JP6959738B2 (pt)
KR (1) KR102454682B1 (pt)
CN (2) CN106459980B (pt)
AU (1) AU2015279248B2 (pt)
BR (1) BR112016030172B1 (pt)
CA (1) CA2953020C (pt)
DK (1) DK3161139T3 (pt)
ES (2) ES2555160B1 (pt)
MA (1) MA40283A (pt)
MX (1) MX2016016992A (pt)
PL (1) PL3161139T3 (pt)
PT (1) PT3161139T (pt)
RU (1) RU2709718C9 (pt)
SI (1) SI3161139T1 (pt)
WO (1) WO2015197706A1 (pt)
ZA (1) ZA201700363B (pt)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3129462A1 (en) * 2014-04-07 2017-02-15 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale New method for producing outer membrane vesicles
ES2555160B1 (es) * 2014-06-24 2016-10-25 Aptus Biotech, S.L. Aptámeros específicos de TLR-4 y usos de los mismos
WO2018014012A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 President And Fellows Of Harvard College Glycolipid compositions and methods of use
EP3494994A1 (en) * 2017-12-07 2019-06-12 Universität zu Köln Combinations of ripk1- and ikk-inhibitors for the prevention or treatment of immune diseases
CN113423833A (zh) * 2018-09-28 2021-09-21 奥曼尼提纳米有限公司 用于选择功能性适体的方法和组合物
AU2019347774A1 (en) 2018-09-28 2021-03-25 Nutcracker Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations comprising lipidated cationic peptide compounds for nucleic acid delivery
EP3860453A4 (en) 2018-10-02 2022-08-03 Wearoptimo Pty Ltd MEASUREMENT SYSTEM
US20220233570A1 (en) 2019-05-16 2022-07-28 Aptatargets, S.L. Treatment of ischemic stroke with aptamers targeting tlr-4
CN111474336B (zh) * 2020-03-21 2023-07-28 南昌大学 一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OhdG的方法
US20230372407A1 (en) * 2020-06-15 2023-11-23 President And Fellows Of Harvard College Methods for modulating tlr4 signaling
CN114152599B (zh) * 2021-12-01 2023-10-13 中国农业大学 一种基于双劈裂功能核酸变构的孔雀石绿生物传感器

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
NZ520745A (en) * 2000-02-03 2004-06-25 Res Dev Foundation Signaling aptamers that transduce molecular recognition to a differential signal
CN101227922A (zh) * 2005-05-06 2008-07-23 斯克里普斯研究学院 经由CD14和Toll样受体4信号传导途径调节细胞的组合物和方法
US20060257411A1 (en) * 2005-05-06 2006-11-16 Bruce Beutler Compositions and methods for modulating cells via CD14 and toll-like receptor 4 signaling pathway
EP1895842A4 (en) * 2005-06-17 2009-06-03 Univ Rochester METHOD AND COMPOSITIONS FOR EXPANDING THE IMMUNE MEMORY BY BLOCKING INTRA-HEPATIBLE ACTIVATED T-CELL ERASURE
FR2892730A1 (fr) * 2005-10-28 2007-05-04 Biomerieux Sa Methode pour detecter la presence ou le risque de developper un cancer
US20090317802A1 (en) * 2005-12-09 2009-12-24 Bhatia Sangeeta N Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells
US9012410B2 (en) * 2006-12-13 2015-04-21 Case Western Reserve University Method of treating intrauterine inflammation
WO2010053975A1 (en) 2008-11-04 2010-05-14 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of toll-like receptor 4 expression by antisense oligonucleotides
WO2010060030A1 (en) * 2008-11-24 2010-05-27 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Tlr ligand-nucleic acid nanostructure as a novel immune modulatory agent and method of using the same
AU2012223366B2 (en) * 2011-03-03 2017-02-23 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
WO2012118910A2 (en) * 2011-03-03 2012-09-07 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
ES2555160B1 (es) * 2014-06-24 2016-10-25 Aptus Biotech, S.L. Aptámeros específicos de TLR-4 y usos de los mismos

Also Published As

Publication number Publication date
EP3161139A1 (en) 2017-05-03
WO2015197706A1 (en) 2015-12-30
KR20170021298A (ko) 2017-02-27
PL3161139T3 (pl) 2021-01-11
SI3161139T1 (sl) 2020-12-31
DK3161139T3 (da) 2020-10-19
ZA201700363B (en) 2018-11-28
JP2020127422A (ja) 2020-08-27
ES2555160B1 (es) 2016-10-25
CA2953020C (en) 2023-01-10
PT3161139T (pt) 2020-10-23
US20190211334A1 (en) 2019-07-11
RU2016152094A3 (pt) 2019-01-29
RU2016152094A (ru) 2018-07-26
JP2017527260A (ja) 2017-09-21
JP6959738B2 (ja) 2021-11-05
CA2953020A1 (en) 2015-12-30
RU2709718C9 (ru) 2020-02-06
US20210130830A1 (en) 2021-05-06
US11591603B2 (en) 2023-02-28
MA40283A (fr) 2017-05-03
MX2016016992A (es) 2017-05-03
ES2555160A1 (es) 2015-12-29
CN106459980A (zh) 2017-02-22
US20230279402A1 (en) 2023-09-07
KR102454682B1 (ko) 2022-10-13
BR112016030172A2 (pt) 2017-11-14
EP3161139B1 (en) 2020-07-22
US10808252B2 (en) 2020-10-20
AU2015279248A1 (en) 2017-01-12
US20170130227A1 (en) 2017-05-11
CN112111495A (zh) 2020-12-22
US10196642B2 (en) 2019-02-05
ES2825106T3 (es) 2021-05-14
CN106459980B (zh) 2020-11-03
RU2709718C2 (ru) 2019-12-19
AU2015279248B2 (en) 2021-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11591603B2 (en) Aptamers specific for TLR-4 and uses thereof
Xue et al. Neutrophil-mediated anticancer drug delivery for suppression of postoperative malignant glioma recurrence
Chen et al. Targeting Xkr8 via nanoparticle-mediated in situ co-delivery of siRNA and chemotherapy drugs for cancer immunochemotherapy
CA3088710C (en) Langerin+ cell targeting
US20190351071A1 (en) Structures and methods for gene therapy
EA026309B1 (ru) Нуклеиново-кислотные модуляторы clec-2
US9731032B2 (en) Aptamers for tumor initiating cells
US11890352B2 (en) Plectin-targeted liposomes/PARP inhibitor in the treatment of cancer
Cai et al. Construction of Multi‐Module RNA Nanoparticles Harboring miRNA, AIE, and CH6 Aptamer for Bone Targeting and Bone Anabolic Therapy
JPWO2016129531A1 (ja) 非小細胞肺がん細胞（ｈ１９７５）に結合するｄｎａアプタマー
Zhao et al. Glucose-decorated engineering platelets for active and precise tumor-targeted drug delivery
Linton Nanoparticle-Mediated Communication in the Pancreatic Tumor Microenvironment
WO2009129619A1 (en) Aptamers for detection and imaging of apoptosis

Legal Events

Date Code Title Description
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: APTATARGETS, S.L. (ES)

B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 24/06/2015, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS