JP2020127422A - Tlr−4特異的アプタマーおよびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)前記試料を本発明によるアプタマー、または本発明による複合体と接触させること、
(ii)TLR−4に結合していない前記アプタマーまたは複合体を分離すること、および
(iii)前記試料中に存在する前記TLR−4に結合している前記アプタマーまたは複合体の存在を検出すること
を含む前記インビトロ方法に関する。
TLR−4特異的アプタマー
本発明の複合体
本発明のインビトロ使用
A. TLR−4を検出するためのインビトロ使用
B. TLR−4を阻害するためのインビトロ使用
本発明のインビトロ方法
A. TLR−4の検出のためのインビトロ方法
(i)TLR−4に特異的に結合してそれを阻害する能力を有し、且つ、配列番号1および配列番号2からなる群より選択される配列またはその機能的に同等の変異体を備える核酸アプタマーと前記試料を接触させること、
(ii)TLR−4に結合していない前記アプタマーを分離すること、および
(iii)前記試料中に存在する前記TLR−4に結合している前記アプタマーの存在を検出すること
を含む前記インビトロ方法に関する。
(i)TLR−4に特異的に結合してそれを阻害する能力を有し、且つ、配列番号1および配列番号2からなる群より選択される配列またはその機能的に同等の変異体を備える核酸アプタマーと官能基を含む複合体と前記試料を接触させること、
(ii)TLR−4に結合していない前記アプタマーまたは複合体を分離すること、および
(iii)前記試料中に存在する前記TLR−4に結合している前記複合体の存在を検出すること
を含む前記インビトロ方法に関する。
− 酵素は比色分析、化学発光法、または蛍光定量法によって検出可能になるその特異的基質の添加を必要とし、
− 蛍光タンパク質はフルオロフォアのように蛍光定量法によって検出可能であるために適切な波長(例えば、表1に含まれている波長)での励起を必要とし、
− 抗原またはハプテンはそれを特異的に認識する抗体または別の分子を必要とする。検出されるためにはその抗原/ハプテンに特異的な前記抗体または分子は例えば酵素で標識されていなければならず、その検出は標識の種類に依存することになる。
B. TLR−4の阻害のためのインビトロ方法
本発明の医療上の使用
A. 本発明のアプタマーの医療上の使用
− 心臓における疾患であり、その最も代表的なものが急性心筋梗塞である虚血性心臓疾患、
− 中枢神経系における疾患である、脳卒中または脳血栓症または脳出血の形態の脳血管性疾患、
− 最も重篤なものが急性下肢動脈虚血である間欠性跛行症、
− 40歳を超える人々における性交不能の主要な原因である勃起不全、
− 腸の動脈における疾患であり、結腸(大腸)への血流の妨害によって引き起こされる炎症(痛みと膨潤)のある領域である虚血性大腸炎、
− 最も重篤であるものが大動脈解離である大動脈瘤
である。
− 網膜に対する損傷のために視野の中央の視力喪失(黄斑)を引き起こす加齢黄斑変性(AMD)。加齢黄斑変性には「乾燥」型と「湿潤」型がある。乾燥(非滲出)型ではドルーゼンと呼ばれる細胞残屑が網膜と脈絡膜との間に蓄積し、網膜に対して萎縮と瘢痕形成を引き起こす。より重篤である湿潤(滲出)型では血管が網膜の裏の脈絡膜で成長し、それらの血管が滲出液と体液を漏出することがあり、出血を引き起こすこともある。
− 通常は法的盲目までの進行性の視力喪失を引き起こす遺伝性の若年性黄斑変性であるシュタルガルト病、すなわち黄色斑眼底。症状の発現は通常は6歳と13歳の間(平均で約16〜18歳)にあるようである。20歳までに症状が発生することが典型的であり、それらの症状には歪視、盲点、ぼやけ、色覚異常、および薄暗い照明への順応障害が含まれる。
− 網膜中の桿体光受容細胞の進行性変性に起因して重篤な視力障害を引き起こす遺伝性の変性眼疾患である網膜色素変性症(RP)。初期のRPの患者は最初に桿体光受容器の減退に起因する周辺視覚および薄明視覚の低下に気付く。その進行性桿体変性の後に続いて隣接する網膜色素上皮の異常と錐体光受容細胞の劣化が起こる。周辺視野が次第に低下するので、患者は進行性の「視野狭窄」と最終的な盲目を経験する。
− コロイデレミア、レーバー先天性黒内障、若年性網膜分離症、アッシャー病、およびバルデー・ビードル症などの他の遺伝疾患
が含まれる。
− その物質を摂取したいという強い欲望、
− 前記摂取を抑制することの困難さ、
− 摂取が中断または減少したときの離脱症候群、
− 耐性、
− 物質摂取以外の関心の漸進的な放棄、
− その物質の獲得、またはその物質の効果からの回復に関する活動に使われる時間の長期化、
− その物質の有害な効果を明確に認識したうえでのその物質の使用への固執
のうちの3つ以上を12か月の期間内に提示する必要がある。
B. 本発明の複合体の医療上の使用
医薬組成物
本発明のイメージング方法
***
アプタマーライブラリー
6HIS組換えhTLR−4
細胞
HEK−293T−TLR4/HEK−293T細胞を用いるスクリーニング
可溶性hTLR−4タンパク質を用いるスクリーニング
選択されたアプタマーの増幅
ELONA
前記アプタマーの組換えhTLR−4への結合についての結合アッセイ
前記アプタマーの細胞中で発現したTLR−4への結合についての結合アッセイ
hTLR−4受容体活性アッセイ
マクロファージに対するアプタマーの効果
脳卒中の動物モデル
フローサイトメトリー分析
ヌクレアーゼ消化
実施例1:TLR−4に特異的なアプタマーのスクリーニング
実施例2:選択されたアプタマーの特性解析
a)個々のアプタマーを得ることを目的としたアプタマー集団のプラスミドへのクローニングとその後のサンガーシーケンシングによる戦略、
b)最も反復して特定されたアプタマーである獲得アプタマー集団の大量シーケンシングによる戦略
に従う6回のスクリーニングラウンドの後に選択アプタマーを特定した。
実施例3:TLR−4のアプタマーアンタゴニストの活性と安定性の動物モデルにおける向上のための最適化
実施例4:脳卒中の動物モデルにおけるTLR−4のアプタマーアンタゴニストの効果
実施例5:フローサイトメトリー
実施例6:ヌクレアーゼ消化による半減期の算出
結論
− TLRApt#1Rアプタマー(配列番号3)およびTLRApt#4Fアプタマー(配列番号4)はTLR−4受容体のアンタゴニスト効果を示す。
− TLRApt#1R−Tアプタマー(配列番号1)およびTLRApt#4F−Tアプタマー(配列番号2)が、それぞれ元のTLRApt#1Rアプタマー(配列番号3)およびTLRApt#4Fアプタマー(配列番号4)のアンタゴニスト活性を保持する短縮型として獲得されている。
− TLRApt#4F−Tアプタマー(配列番号2)は脳卒中の動物モデルにおいて梗塞領域を減少させることができる。
− TLR4受容体の細胞外ドメインに対して選択されたTLRApt#1Rアプタマー(配列番号3)とTLRApt#4Fアプタマー(配列番号4)はヒトTLR−4受容体をその組換え可溶性型(インビトロ)でもHEK293細胞の膜内の組込み型(インビボ)としても認識する。
Claims (25)
- TLR−4に特異的に結合してそれを阻害する能力を有し、且つ、配列番号1および配列番号2からなる群より選択される配列またはその機能的に同等の変異体を備える核酸アプタマー。
- 前記配列が配列番号3および配列番号4からなる群より選択される、請求項1に記載のアプタマー。
- 前記核酸がDNAである、請求項1または2に記載のアプタマー。
- 前記TLR−4がヒトTLR−4である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のアプタマーと官能基を含む複合体。
- 前記官能基が検出可能試薬、薬品およびナノ粒子からなる群より選択される、請求項5に記載の複合体。
- 前記官能基が検出可能試薬である、請求項6に記載の複合体。
- 前記官能基が薬品である、請求項6に記載の複合体。
- 前記官能基がナノ粒子である、請求項6に記載の複合体。
- 前記ナノ粒子が金属ナノ粒子である、請求項9に記載の複合体。
- 前記金属ナノ粒子が磁性メソ多孔性シリカナノ粒子である、請求項10に記載の複合体。
- TLR−4を検出するための請求項1〜4のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項5〜11のいずれか一項に記載の複合体のインビトロ使用。
- ELONA、アプタサイトケミストリー、アプタヒストケミストリーおよびフローサイトメトリーからなる群より選択される方法によってTLR−4の検出が実施される、請求項12に記載の使用。
- TLR−4を阻害するための請求項1〜4のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項5〜11のいずれか一項に記載の複合体のインビトロ使用。
- 試料中のTLR−4を検出するためのインビトロ方法であって、
(i)前記試料を請求項1〜4のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項5〜11のいずれか一項に記載の複合体と接触させること、および
(ii)TLR−4に結合していない前記アプタマーまたは複合体を分離すること、
(iii)前記試料中に存在する前記TLR−4に結合している前記アプタマーまたは複合体の存在を検出すること
を含む前記インビトロ方法。 - 蛍光によって検出が実施される、請求項15に記載の方法。
- 試料中のTLR−4を阻害するためのインビトロ方法であって、請求項1〜4のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項5〜11のいずれか一項に記載の複合体とTLR−4を含む試料をTLR−4の阻害に適切な条件で接触させることを含む前記インビトロ方法。
- 前記試料が対象に由来する生体試料である、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項18に記載の方法。
- TLR−4の発現上昇および/またはTLR−4の活性化亢進を特徴とする病的状態の治療に使用される請求項1〜4のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項5〜11のいずれか一項に記載の複合体。
- TLR−4の発現上昇および/または活性化亢進を特徴とする前記病的状態が脳卒中、急性心筋梗塞、敗血症、アテローム性硬化症、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、網膜変性疾患、および薬物中毒からなる群より選択される、請求項20に記載の用途のためのアプタマーまたは複合体。
- TLR−4の発現上昇および/または活性化亢進を特徴とする前記病的状態が脳卒中である、請求項21に記載の用途のためのアプタマーまたは複合体。
- TLR−4の発現上昇および/または活性化亢進を特徴とする前記病的状態が加齢黄斑変性、シュタルガルト病、網膜色素変性症、コロイデレミア、レーバー先天性黒内障、若年性網膜分離症、アッシャー病、およびバルデー・ビードル症からなる群より選択される網膜変性疾患である、請求項21に記載の用途のためのアプタマーまたは複合体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の少なくも1種類のアプタマーまたは請求項5〜11のいずれか一項に記載の少なくも1種類の複合体を含み、所望により1種類以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または溶媒を組み合わせて含んでよい医薬組成物。
- 前記複合体中の前記官能基がTLR4を発現する細胞、組織、または器官の生体イメージングのための検出可能部分である、請求項5〜11のいずれか一項に記載の複合体の使用。
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