JP2023528462A - ナノボディ（ｖｈｈ）コンジュゲートおよびそれらの使用 - Google Patents

ナノボディ（ｖｈｈ）コンジュゲートおよびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本願明細書においては、ＶＨＨコンジュゲートを含む組成物および疾患を処置する際のそれらの使用が提供される。

Description

関連出願
本願は、２０２０年６月２日出願の「NANOBODY (VHH) CONJUGATES AND USES THERE OF」と題するＵ．Ｓ．仮出願シリアルＮｏ．６３／０３３，７１０および２０２１年２月２６日出願の「NANOBODY (VHH) CONJUGATES AND USES THERE OF」と題するＵ．Ｓ．仮出願シリアルＮｏ．６３／１５４，４５５の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による利益を主張する。これらのそれぞれの内容全体は参照によって本願に組み込まれる。
連邦出資の研究
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＰ０１ＤＫ０１１７９４による政府の援助によってなされた。政府は本発明にある種の権利を有する。
ヒト集団のおよそ１０％は、軽度から命を脅かすまでの症状によって付随される自己免疫状態を患う。自己免疫疾患のための現行の処置は一般的な免疫抑制を包含し、これはあらゆる種類の抗原に対する応答を鈍らせる。これは感染およびことによるとさらには悪性物の増大したリスクに患者を曝す。
本開示は、いくつかの側面において、抗原および／または薬剤（例えば、抗炎症薬剤または炎症促進薬剤）にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体断片（ナノボディ／ＶＨＨ）を含む１つ以上のコンジュゲートを含む組成物を提供し、ＶＨＨは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する。いくつかの態様において、抗原および薬剤（例えば、抗炎症薬剤または炎症促進薬剤）は同じＶＨＨにコンジュゲート化される。いくつかの態様において、抗原および薬剤（例えば、抗炎症薬剤または炎症促進薬剤）は２つのＶＨＨにコンジュゲート化される。
本願に記載されるコンジュゲートは抗原提示細胞（ＡＰＣ）に関与し、これは非炎症性状態においては寛容に至り得るが、炎症性状態におけるＡＰＣの関与は外来抗原に対する強い免疫応答を誘起し得る。驚くべきことに、本願においては、本開示の組成物は、抗原が自己抗原でありかつ薬剤が抗炎症薬剤であるときには、ＶＨＨ－抗原が単独で投与されるときと比較して、免疫寛容を誘導することおよび対象の自己免疫疾患の症状を軽減することにおいて有意に有効であるということが見出された。類似に、本開示の組成物は、抗原が病原体からであるときにかつ薬剤が炎症促進薬剤であるときに、ＶＨＨ－抗原が単独で投与されるときと比較して、抗原および／または病原体に対する免疫応答を誘導することにおいて有意に有効である。
本開示のいくつかの側面は：
（ｉ）ＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する、抗原および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲート；または
（ｉｉ）第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の１つ以上の表面蛋白質に結合する、抗原にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む第１のコンジュゲート、および抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲート、
を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ＡＰＣ上の表面蛋白質はＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＤＥＣ２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＣＬＥＣ９ａ、ＣＤ１０３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１ａ、およびＦ４／８０からなる群から選択される。いくつかの態様において、標的化部分は、ペプチド断片、一本鎖断片可変部（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、Ｆａｂ、または類似のフォーマットを包含するがこれらに限定されない天然のまたは合成のポリペプチドによって置き換えられ得る。
いくつかの態様において、組成物は、抗原および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する。いくつかの態様において、組成物は、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する。いくつかの態様において、ＶＨＨは配列番号１のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、抗原または抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨは、所定のコンジュゲートをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のフォーマットを有し得る。
いくつかの態様において、ＭＨＣＩＩに結合するＶＨＨはさらにソルターゼ認識配列をＮ末端またはＣ末端に含む。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はアミノ酸配列ＬＰＥＴＧ（配列番号２９）を含む。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はアミノ酸配列ＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を含む。いくつかの態様において、抗炎症薬剤または抗原はソルターゼ認識配列を介してＶＨＨにコンジュゲート化される。いくつかの態様において、抗炎症薬剤はさらに加水分解性のまたは非加水分解性のリンカーを含む。さらなる態様において、コンジュゲートは、遺伝子融合、他のライゲーション酵素（例えば、ブテラーゼ、ＯａＡＥＰ１、サブチリガーゼなど）、または化学的方法（例えば、２－ピリジンカルボアルデヒド（２－ＰＣＡ）を用いるＮ末端修飾など）の手段によって産生される。
いくつかの態様において、組成物は、抗原および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する。いくつかの態様において、組成物は、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方はＣＤ１１ｃに結合する。いくつかの態様において、ＶＨＨは配列番号２のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、抗原または抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨは、所定の付加体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のフォーマットを有し得る。
いくつかの態様において、ＣＤ１１ｃに結合するＶＨＨはさらにソルターゼ認識配列をＮ末端またはＣ末端に含む。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はアミノ酸配列ＬＰＥＴＧ（配列番号２９）を含む。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はアミノ酸配列ＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を含む。いくつかの態様において、抗炎症薬剤または抗原はソルターゼ認識配列を介してＶＨＨにコンジュゲート化される。いくつかの態様において、抗炎症薬剤はさらに加水分解性のまたは非加水分解性のリンカーを含む。さらなる態様において、コンジュゲートは、遺伝子融合、他のライゲーション酵素（例えば、ブテラーゼ、ＯａＡＥＰ１、サブチリガーゼなど）、または化学的方法（例えば、２－ピリジンカルボアルデヒド（２－ＰＣＡ）を用いるＮ末端修飾など）の手段によって産生される。
いくつかの態様において、組成物は、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨはＡＰＣ上の異なる表面蛋白質に結合する。いくつかの態様において、第１のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合し、第２のＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する。いくつかの態様において、第１のＶＨＨはＤＥＣ２０５に結合し、第２のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する。
いくつかの態様において、抗炎症薬剤はステロイド性抗炎症薬剤であり：デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、およびベタメタゾンからなる群から選択される。いくつかの態様において、抗炎症薬剤は非ステロイド性抗炎症薬剤であり：アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、シクロスポリンＡ、およびカルシトリオールからなる群から選択される。いくつかの態様において、抗炎症薬剤は抗炎症性サイトカインであり、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、およびＴＧＦβからなる群から選択される。
いくつかの態様において、抗原はポリペプチド、多糖、炭水化物、脂質、核酸、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗原は自己抗原である。いくつかの態様において、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質、ミエリンプロテオリピド蛋白質、シトルリン化フィブリノーゲン、インスリン、クロモグラニンＡ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５キロダルトンアイソフォーム（ＧＡＤ６５）、デスモグレイン１（ＤＳＧ１）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、筋特異的チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）、リボ核蛋白質から選択される。いくつかの態様において、抗原は、蛋白質補充療法または遺伝子治療に用いられる蛋白質を含む。いくつかの態様において、抗原は第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、およびＡＡＶ由来蛋白質から選択される。
本開示の他の側面は、それを必要とする対象に本願に記載される組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、投与される組成物は、（ｉ）ＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する、抗原および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲート；または（ｉｉ）第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の１つ以上の表面蛋白質に結合する、抗原にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む第１のコンジュゲート、および抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートを含む。いくつかの態様において、方法は、抗原に対する免疫寛容を誘導するためである。いくつかの態様において、方法は、自己免疫疾患を処置するためである。いくつかの態様において、自己免疫疾患は自己免疫性脳脊髄炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、ループス、セリアック病、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）からなる群から選択される。いくつかの態様において、投与は静脈内である。いくつかの態様において、対象はヒトである。
本開示の他の側面は：
（ｉ）ＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する、抗原および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲート；または
（ｉｉ）第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の１つ以上の表面蛋白質に結合する、抗原にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む第１のコンジュゲート、および炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲート、
を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ＡＰＣ上の表面蛋白質はＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＤＥＣ２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＣＬＥＣ９ａ、ＣＤ１０３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１ａ、およびＦ４／８０からなる群から選択される。いくつかの態様において、標的化部分は、ペプチド断片、一本鎖断片可変部（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、Ｆａｂ、または類似のフォーマットを包含するがこれらに限定されない天然のまたは合成のポリペプチドによって置き換えられ得る。
いくつかの態様において、組成物は、抗原および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する。いくつかの態様において、組成物は、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する。いくつかの態様において、ＶＨＨは配列番号１のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、抗原または炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨは、所定のコンジュゲートをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のフォーマットを有し得る。
いくつかの態様において、ＭＨＣＩＩに結合するＶＨＨはさらにソルターゼ認識配列をＮ末端またはＣ末端に含む。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はアミノ酸配列ＬＰＥＴＧ（配列番号２９）を含む。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はアミノ酸配列ＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を含む。いくつかの態様において、炎症促進薬剤または抗原はソルターゼ認識配列を介してＶＨＨにコンジュゲート化される。いくつかの態様において、炎症促進薬剤はさらに加水分解性のまたは非加水分解性のリンカーを含む。さらなる態様において、コンジュゲートは、遺伝子融合、他のライゲーション酵素（例えば、ブテラーゼ、ＯａＡＥＰ１、サブチリガーゼなど）、または化学的方法（例えば、２－ピリジンカルボアルデヒド（２－ＰＣＡ）を用いるＮ末端修飾など）の手段によって産生される。
いくつかの態様において、組成物は、抗原および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する。いくつかの態様において、組成物は、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＣＤ１１ｃに結合する。いくつかの態様において、ＶＨＨは配列番号２のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、抗原または炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨは、所定のコンジュゲートをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のフォーマットを有し得る。
いくつかの態様において、ＣＤ１１ｃに結合するＶＨＨは、さらにソルターゼ認識配列をＮ末端またはＣ末端に含む。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はアミノ酸配列ＬＰＥＴＧ（配列番号２９）を含む。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はアミノ酸配列ＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を含む。いくつかの態様において、炎症促進薬剤または抗原はソルターゼ認識配列を介してＶＨＨにコンジュゲート化される。いくつかの態様において、炎症促進薬剤はさらに加水分解性のまたは非加水分解性のリンカーを含む。さらなる態様において、コンジュゲートは、遺伝子融合、他のライゲーション酵素（例えば、ブテラーゼ、ＯａＡＥＰ１、サブチリガーゼなど）、または化学的方法（例えば、２－ピリジンカルボアルデヒド（２－ＰＣＡ）を用いるＮ末端修飾など）の手段によって産生される。
いくつかの態様において、組成物は、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨはＡＰＶ上の異なる表面蛋白質に結合する。いくつかの態様において、第１のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合し、第２のＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する。いくつかの態様において、第１のＶＨＨはＤＥＣ２０５に結合し、第２のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する。
いくつかの態様において、炎症促進薬剤は：ＴＬＲ９アゴニスト、ＬＰＳ、ＨＭＧＢ１蛋白質、ＩＬ２、ＩＬ１２、およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される。
いくつかの態様において、抗原はポリペプチド、多糖、炭水化物、脂質、核酸、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、抗原は微生物病原体からである。いくつかの態様において、微生物病原体はマイコバクテリア、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫、またはプリオンである。いくつかの態様において、抗原はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質を含む。
いくつかの態様において、抗原は腫瘍抗原である。
いくつかの態様において、組成物はワクチン組成物である。
本開示の他の側面は、それを必要とする対象に本願に記載される組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、組成物は、（ｉ）ＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する、抗原および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲート；または（ｉｉ）第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の１つ以上の表面蛋白質に結合する、抗原にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む第１のコンジュゲート、および炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートを含む。いくつかの態様において、方法は、抗原に対する免疫応答を誘導するためである。いくつかの態様において、抗原は微生物病原体からであり、方法は、病原体によって引き起こされる感染を処置するためである。いくつかの態様において、方法は治療的または予防的である。いくつかの態様において、抗原は腫瘍抗原であり、方法は癌を処置するためである。
いくつかの態様において、投与は静脈内である。いくつかの態様において、対象はヒトである。
上の概要は、限定しない様式で、本願において開示されるテクノロジーの態様、利点、特徴、および使用のいくつかを例解することを意味される。本願において開示されるテクノロジーの他の態様、利点、特徴、および使用は、詳細な記載、図面、例、および請求項から明らかになるであろう。
付随する図面は一定縮尺で描画されることを意図されていない。図面において、種々の図において例解されている各同一のまたは同一に近いコンポーネントは、同類の数字によって表される。明瞭性の目的のために、あらゆるコンポーネントがあらゆる図面において標識されるわけではなくあり得る。図面において：
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５のシングルドーズは、ＥＡＥからの持続的な保護を提供する。（図１Ａ）ＧＧＧを持つ抗原ペプチドによるナノボディＣ末端ソルターゼ標識の模式図。（図１Ｂ）精製されたＶＨＨＭＨＣＩＩおよびＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原付加体のＬＣ－ＭＳ。（図１Ｃ～Ｅ）ＶＨＨ－ペプチドの予防的処置を３（図１Ｃ）、２（図１Ｄ）、および１ドーズ（単数または複数）（図１Ｅ）で指示されている通り受けたマウスの平均疾患スコア。疾患スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。＊＊ｐ＜０．０１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。（図１Ｆ）１ドーズのＶＨＨ－抗原を受けたマウスのエンドポイントにおいて収集された脊髄のＴｈ１およびＴｈ１７ＣＤ４＋リンパ球のフローサイトメトリー。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の度数もまた指示されている。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。ｎ．ｓ．有意でない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。ＶＨＨ－抗原付加体のシングルドーズを受けたマウスからの脊髄切片の代表的な（図１Ｇ）Ｈ＆Ｅおよび（図１Ｈ）ルクソールファストブルー染色。スケールバー１００μｍ。（図１Ｉ）ＶＨＨ－ペプチドの予防的処置をＥＡＥの誘導に先行して６０、３０、および７日に受けたマウスの平均疾患スコア。（図１Ｊ）ＭＯＧ／ＣＦＡ／ＰＴＸおよびＭＯＧ／ＩＦＡ／ＰＴＸによる複数の負荷に付されたＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５レシピエントの平均臨床スコア。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。 脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞は抗原提示を増強することによってＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５寛容誘導の原因である。（図２Ａ）インビボのＶＨＨＭＨＣＩＩの生体内分布。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７がＭＨＣＩＩ－ＧＦＰマウスに静脈内注射された。注射の１．５時間後に、脾臓、全血、および鼠径部リンパ節（ｉＬＮ）が収集され、フローサイトメトリーによって分析された。（図２Ｂ）ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９によってまたはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって処置されたマウスからの脾細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を受けたマウスの平均臨床スコア。（図２Ｃ）ＥＡＥの誘導に先行して、指示されている細胞サブセットの枯渇化後に、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９またはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５による予防的処置を受けたマウスの平均臨床スコア。（図２Ｄ）指示されているＶＨＨ－抗原を受けたマウスの平均疾患スコア。（図２Ｅ）精製されたＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ１７－７８のＬＣ－ＭＳ。（図２Ｆ）ＶＨＨ－ペプチドの予防的処置を受けたマウスの平均疾患スコア。＊＊＊ｐ＜０．００１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５はＭＯＧ３５－５５特異的なＣＤ４Ｔ細胞上の共抑制性受容体を上方制御する。（図３Ａ）コンジェニックにマーキングされたＣＤ４５．１マウスが、ＶＨＨ－抗原の輸液に１日先行して、CellTrace Violet標識されたＣＤ４５．２の２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞を受けた。脾臓、血液、および鼠径部リンパ節（ｉＬＮ）の２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞数が、フローサイトメトリーによって決定された。（図３Ｂ）Violet Trace希釈は２Ｄ２のＴ細胞の増殖を指示している。（図３Ｃ）別個の実験において、輸液後の第３日に、脾臓が収集され、ＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋ＴＣＲａ３．２＋ＴＣＲｂ１１＋細胞がそれらが経過した分裂数に従ってソーティングされ、それから、ＲＮＡｓｅｑによるトランスクリプトーム分析のために処理された。ＲＮＡ－ｓｅｑデータの火山プロットが、３つの分裂（ｄｉｖ３）後のＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を受けたマウスの２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞を、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９を受けたマウスから回収された２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞と比較している。（図３Ｄ）２Ｄ２のＣＤ４＋Ｔ細胞上の共抑制性受容体の発現を示すヒートマップ。（図３Ｅ）CellTrace Violet希釈は第３日における２Ｄ２のＴ細胞の増殖を反映する。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５投与は２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞における表現型マーカーの独特のパターンに至る。代表的なフロー画像が示されている。各マーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は平均＋／－ＳＥＭとしてプロットされている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。（図３Ｆ）指示されている遺伝的背景の、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９またはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５による予防的処置を受けたマウスの平均疾患スコア；＊＊＊ｐ＜０．００１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。（図３Ｇ）ＣＤ４５．２の２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞を受けたＣＤ４５．１マウスが、第１０日に、ＣＦＡ中の乳化されたＭＯＧ３５－５５によるＶＨＨ－抗原の輸液を負荷された。脾臓、血液、およびｉＬＮが５日後に収集された。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９を注射されたマウスの２Ｄ２のＴ細胞とは違って、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を受けたマウスの２Ｄ２のＴ細胞は応答することはなかった。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている；＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原によって媒介される寛容は抗原特異的である。（図４Ａ）Ｔ１Ｄ進行をモニタリングするためのＶＨＨ－抗原または生理食塩水によって処置された個々のマウスの血中グルコースレベル。グルコースレベルが＞２６０ｍｇ／ｄＬであるときに、マウスは高血糖と考えられる。（図４Ｂ）ＶＨＨ－抗原のシングルドーズを受けたマウスからの膵臓切片の代表的なＨ＆Ｅ染色。スケールバー１００μｍ。（図４Ｃ）関節リウマチの進行を評価するためのＶＨＨ－抗原によって処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの平均の足蹠の厚さ。（図４Ｄ）ＶＨＨ－抗原のシングルドーズを受けたマウスからの関節切片の代表的なトルイジンブルー染色。スケールバー１００μｍ。（図４Ｅ）マウス（ＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋ＯＴＩのＴ細胞）が、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＲＦ８６０４－６１２またはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ２５７－２６４（ＯＴＩペプチド）の注射に１日先行して、アロタイプ的にマーキングされたＣＤ４５．２＋ＣＤ８＋ＯＴＩのＴ細胞を受けた。マウスが第１０日にＣＦＡ中の乳化されたＯＴＩペプチドを負荷された。脾臓、ｉＬＮ、および血液が５日後に収集され、フローサイトメトリーによって分析された。（図４Ｆ）脾細胞が、ＯＴＩペプチドを足された完全ＲＰＭＩによって３日に渡って培養された。上清が収集されて、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγの産生を測定した。ＯＢ１ペプチド（図４Ｇ）およびＯＶＡ蛋白質（図４Ｈ）に対する抗体が、生理食塩水、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＢ１、または等モル量の遊離ＯＶＡの３つの立て続けの注射を受けたＣ５７ＢＬ／６Ｊレシピエントから収集された血清において、ＥＬＩＳＡによって測定された。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。ｎ．ｓ．有意でない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原付加体の治療有効性。（図５Ａ）動物が１の疾患スコア（尾の下垂）に達したときに、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５のシングルドーズによって処置されたマウスの平均疾患スコア。マウスの～４０％（７／１６）が死に（†）、サイトカインストームに帰せられた。（図５Ｂ）ＧＧＧ－ＤＥＸの構造および精製されたＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸのＬＣ－ＭＳ。（図５Ｃ）ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸの同時投与ありまたはなしでＶＨＨ－抗原によって処置されたＥＡＥマウスにおけるＴＮＦαおよびＩＬ－６の血清中レベル。（図５Ｄ～Ｆ）マウスが１（図５Ｄ）、２（図５Ｅ）、または３（図５Ｆ）の疾患スコアに達した日にＶＨＨ－ペプチド＋／－ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸのドーズによって処置されたマウスコホートの、平均のおよび個々の疾患スコア。＊＊＊ｐ＜０．００１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。 抗ヒトＭＨＣＩＩＶＨＨ（ＶＨＨｈＭＨＣＩＩ）－抗原付加体の有効性。（図６Ａ）精製されたＶＨＨｈＭＨＣＩＩ構築物のＬＣ－ＭＳ。ＶＨＨｈＭＨＣＩＩはＤＲＢ３＊０１を例外として全てのヒトＨＬＡ－ＤＲ産物を認識する。（図６Ｂ）マウスＥＡＥモデルにおけるＶＨＨｈＭＨＣＩＩ有効性。（図６Ｃ）ＶＨＨｈＭＨＣＩＩ－シトルリン化フィブリノーゲン（ＣｉｔＦｉｂ）付加体。ＣｉｔＦｉｂは、シトルリン化Ｒ８４を有するフィブリノーゲンアルファ鎖アミノ酸７９－９１を有するシトルリン化フィブリノーゲンペプチドである。 ＶＨＨＭＨＣＩＩによって媒介される寛容は、主としてＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣによって提供される。（図７Ａおよび図７Ｂ）ＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７付加体によって標的化された血液、脾臓、およびｉＬＮのＡＰＣサブセットのフローサイトメトリー分析。（図７Ｃ）ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５またはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９を受けたマウスからの脾細胞を受けたマウスの平均臨床スコア。（図７Ｄ）種々のそれらの免疫細胞サブセットが枯渇化させられているＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を受けたマウスの平均臨床スコア。（図７Ｅ）ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５または他のＶＨＨ－ＭＯＧ３５－５５を受けたマウスの平均臨床スコア。 精製されたＶＨＨＭＨＣＩＩおよびＶＨＨ－抗原構築物のＬＣ－ＭＳ。ＶＨＨＭＨＣＩＩおよびＶＨＨ－抗原構築物が精製され、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析されて、純度およびアイデンティティを検証した。 脊髄ＣＤ４＋リンパ球浸潤は疾患状態と相関する。ＶＨＨ－ペプチドの予防的処置を３（図９Ａ）、２（図９Ｃ）、および１ドーズ（単数または複数）（図９Ｅ）で指示されている通り受けたそれぞれの個々の臨床スコア。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。ＶＨＨ－抗原の３（図９Ｂ）および２（図９Ｄ）ドーズを受けたマウスのエンドポイントにおける脊髄のＴｈ１およびＴｈ１７浸潤ＣＤ４＋リンパ球のフローサイトメトリー分析。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の度数もまた指示されている。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。ｎ．ｓ．有意でない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５による予防的処置は、縮減されたＣＤ４＋リンパ球浸潤を付与する。（図１０Ａ）ＥＡＥ誘導に先行して－６０、－３０、および－７日にＶＨＨ－ペプチドの予防的処置を受けたそれぞれの個々の臨床スコア。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。（図１０Ｂ）指示されている時点においてＶＨＨ－抗原の１ドーズを受けたマウスの、エンドポイントにおける脊髄のＴｈ１およびＴｈ１７浸潤ＣＤ４＋リンパ球のフローサイトメトリー分析。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の度数もまた指示されている。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。ｎ．ｓ．有意でない；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５のシングルドーズによる処置は、爾後の負荷による疾患の徴候を防止する。（図１１Ａ）ＶＨＨ－抗原の１ドーズ、次に複数のＥＡＥ負荷に対する暴露を受けたマウスの、エンドポイントにおける脊髄の浸潤ＣＤ４＋リンパ球のフローサイトメトリー分析。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。（図１１Ｂ）これらのマウスからの脊髄切片の代表的なＨ＆Ｅおよびルクソールファストブルー染色。スケールバー１００μｍ。 ＶＨＨフルオロフォアのインビトロキャラクタリゼーション。（図１２Ａ）未修飾およびソルタグ付けによって作出されたＡｌｅｘａ６４７を持つ修飾ＶＨＨ、すなわちＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７およびＶＨＨ対照－Ａｌｅｘａ６４７のクマシーおよび蛍光ウエスタンブロット。（図１２Ｂ）ＭＨＣＩＩ－ＧＦＰマウスからの脾細胞のフローサイトメトリー分析は、ＶＨＨＭＨＣＩＩ結合およびＭＨＣＩＩ発現の正の相関を指示している。 ＶＨＨＭＨＣＩＩのインビボ生体内分布。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７がＭＨＣＩＩ－ＧＦＰマウスに静脈内注射された。注射の１．５時間後に、脾臓が除去され、フローサイトメトリーによって分析された。脾臓ＧＦＰ＋Ａｌｅｘａ６４７＋ＡＰＣの亜集団がさらに解剖された。ｃＤＣ（古典的ＤＣ）；ｐＤＣ（形質細胞様ＤＣ）。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の静脈内投与のみが、ＥＡＥからの有意な保護を提供する。送達モードが、ＥＡＥにおけるＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって媒介される保護に影響するかどうかの決定。静脈内、腹腔内、または皮下注射されたＶＨＨ－ペプチドの予防的処置を受けたマウスの平均臨床スコア。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。＊＊＊ｐ＜０．０１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５処置された脾細胞はＥＡＥからの最も有効な保護を付与する。（図１５Ａ）ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９によってまたはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって処置されたマウスからの脾細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を受けたマウスの個々の臨床スコア。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。＊＊＊ｐ＜０．００１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。（図１５Ａ）の実験セットアップからの移入された脾細胞（図１５Ｂ）およびＰＢＭＣ（図１５Ｃ）の組成。 選択された細胞サブセットの枯渇化は、ＶＨＨＭＨＣＩＩによって媒介される抗原特異的な寛容を支持する細胞型を指示する。（図１６Ａ）指示されている細胞サブセットの枯渇化によって、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９を受けたかまたはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の予防的処置によるマウスの個々の臨床スコア。ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇化させるために、ＶＨＨ－抗原投与に２週先行して始まってかつＥＡＥ観察期に渡って、マウスは週２回の４００μｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射された。ＶＨＨ－抗原投与に２週先行して始まってかつＥＡＥ観察期に渡って、マクロファージが隔日の３００μｇの抗ＣＳＦ１Ｒのｉ．ｐ．注射によって枯渇化させられた。最後に、ＤＣを枯渇化させるために、１００ｎｇのＤＴＸのシングルドーズがＶＨＨ－抗原投与に２日先行してＣＤ１１ｃ－ＤＴＲマウスに投与された（ｉ．ｐ．）。（図１６Ｂ）ＶＨＨ－抗原投与に１日先行して、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ、およびＤＣの枯渇化のフローサイトメトリー確認。 主として樹状細胞を認識するＶＨＨ付加体は、ＥＡＥからの中程度のレベルの保護を提供する。指定されたＶＨＨ－抗原を受けたマウスの個々の臨床スコア。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。＊＊＊ｐ＜０．００１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５は、樹状細胞に非依存的なＢａｔｆ３－／－マウスにおけるＥＡＥからの保護を付与する。指定されたＶＨＨ－抗原を受けた野生型Ｃ５７ＢＬ６／ＪまたはＢａｔｆ３－／－マウス（ＣＤ８ａ＋ＤＣを欠くマウス）の平均臨床スコア。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。＊＊＊ｐ＜０．００１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５による処置後のＣＤ４＋細胞のイメージング。Ｒａｇ１－／－マウスにおける養子移入された２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞の非侵襲的な陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）－ＣＴイメージング。簡潔には、２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞がＲａｇ１－／－マウスに養子移入され、１日後に、ＶＨＨ－抗原が投与された。第３および１０日に、８９Ｚｒ標識されたＰＥＧ化抗ＣＤ４ｓｃＦＶが注射されて、レシピエントマウスの全身における２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞のインビボ分布を追跡した。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５による処置後の２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞集団のＲＮＡｓｅｑ分析。（図２０Ａ）CellTrace Violet標識された２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞が、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９またはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の輸液に１日先行して、コンジェニックにマーキングされたＣＤ４５．１マウスに養子移入された。輸液後の第３日に、脾臓が収集され、ＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋ＴＣＲａ３．２＋ＴＣＲｂ１１＋細胞が指示されている通りソーティングされ、ＲＮＡｓｅｑによるバルクトランスクリプトーム分析のために処理された。（図２０Ｂ）ＦＡＣＳソーティングされた集団による陰影付きのＲＮＡ－ｓｅｑデータの主成分プロット。（図２０Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のいくつかの転写特徴を示すヒートマップ。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９を受けたマウスに由来する２Ｄ２のＣＤ４Ｔと比較して、３つの分裂（ｄｉｖ３）後のＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を受けたマウスの２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞において上方制御（図２０Ｄ）および下方制御されている（図２０Ｅ）上位５００遺伝子の遺伝子オントロジー分析。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５による処置後の２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞における表現型マーカーの発現。アジュバントとしてのポリＩ：Ｃ／抗ＣＤ４０の存在下におけるＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９、または等モルのＭＯＧ３５－５５ペプチドの輸液に１日先行して、CellTrace Violet標識された２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞が、コンジェニックにマーキングされたＣＤ４５．１マウスに養子移入された。輸液後の第３日に、脾臓が収集され、フローサイトメトリーによって分析された。CellTrace Violet希釈は、第３日における２Ｄ２のＴ細胞の増殖を指示している。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５投与は２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞における表現型マーカーの独特のパターンに至る。代表的なフロー画像が示され、各マーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）が平均＋／－ＳＥＭとしてプロットされている。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。 制御性Ｔ細胞は、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５による処置によって付与されるＥＡＥからの保護に要求される。（図２２Ａ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇化ありまたはなしでＶＨＨ－ペプチドの予防的処置を受けたマウスの平均臨床スコア。治療に先行して第－９、－８、－１日に１μｇのＤＴＸの３ドーズをｉ．ｐ．、その後はエンドポイントまで毎週１μｇでｉ．ｐ．注射することによって、ＴｒｅｇがＦｏｘＰ３－ＤＴＲマウスにおいて枯渇化させられた。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。＊＊＊ｐ＜０．００１、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）。（図２２Ｂ）ＶＨＨ－抗原投与に１日先行して、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の枯渇化のフローサイトメトリー確認。（図２２Ｃ）２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞が、ＶＨＨ－抗原の輸液に１日先行して、コンジェニックにマーキングされたＣＤ４５．１マウスに養子移入された。マウスは、第３日に、ＣＦＡ中の乳化されたＭＯＧ３５－５５をさらに負荷された。脾臓およびｉＬＮが７日後に収集された。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を輸液されたマウスの２Ｄ２のＴ細胞は、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９を受けたマウスの２Ｄ２のＴ細胞ほど有効に増殖することはなかった。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。（図２２Ｄ）２Ｄ２のＴ細胞には、ＦｏｘＰ３＋細胞の増大があった。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。＊＊ｐ＜０．０１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ｐ３１による処置は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を防止し得る。（図２３Ａ）活性化ＢＤＣ２．５脾細胞の養子移入後の第１日における予防的なＴ１Ｄ処置の模式図。図３Ｃのデータの総体的な正常血糖のパーセンテージ。ｐ＜０．００１、ログランク検定。（図２３Ｂ）ＢＤＣ２．５脾細胞の養子移入の１４日後の、指定された器官における浸潤ＢＤＣ２．５ＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。ｎ．ｓ．有意でない；＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。（図２３Ｃ）活性化ＢＤＣ２．５脾細胞の養子移入後の第５日における半治療的なＴ１Ｄ処置の模式図。血中グルコースレベルが測定されて、Ｔ１Ｄ進行をモニタリングした。グルコースレベルが＞２５０ｍｇ／ｄＬであるときに、マウスは糖尿病と考えられた。 インスリンのＮ末端グリシンは直ちにソルターゼ求核剤としての用をなす。ソルターゼ求核剤として作用し得るインスリンのＮ末端グリシン残基を指示する模式図と、産生されたＶＨＨＭＨＣＩＩ－インスリン付加体のＦＣ－ＭＳ分析。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９による処置はＲＡ重症度を縮減し得る。（図２５Ａ）ＲＡ進行を評価するためのＶＨＨ－抗原によって処置されたマウスの個々の足蹠の厚さ。（図２５Ｂ）熱凝集オボアルブミン（ＨＡＯ）負荷後の第３日におけるマウス足蹠の代表的な画像。（図２５Ｃ）エンドポイント（ＨＡＯ負荷後の第７日）において収穫された膝窩リンパ節由来脾細胞のＴｈ１応答。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。＊ｐ＜０．０５、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。（図２５Ａ）に記載されているマウスからの抗オボアルブミン（図２５Ｄ）および抗ＯＶＡ３２３－３３９（図２５Ｅ）抗体応答。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。＊ｐ＜０．０５、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。 ＥＡＥの当初の症状と同時的なＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を投与されたマウスは、不均一なアウトカムを呈する。マウスが１の臨床スコアに達した日に受けたＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５のドーズによって処置されたマウスの個々の臨床スコア。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。マウスの～４０％（７／１６）が死んで見出され（†）、サイトカインストームに帰せられた。 ＧＧＧを持つデキサメタゾン（ＤＥＸ）の合成。模式図はＶＨＨＭＨＣＩＩ－デキサメタゾン付加体が産生されるステップを指示している。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸによる同時処置はＣＤ４＋Ｔ細胞の脊髄浸潤を縮減する。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。各マウスのエンドポイントにおける脊髄のＴｈ１およびＴｈ１７浸潤ＣＤ４＋リンパ球のフローサイトメトリー分析。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の度数もまた指示されている。データは平均＋／－ＳＥＭとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ホルム－シダック調整による対応のないｔ検定。 遊離デキサメタゾンによる同時処置は、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸよりも実質的に高いドーズを要求する。マウスが１の臨床スコアに達した日における、０．５μｇのＤＥＸ（図２９Ａ）または１００μｇのＤＥＸ（図２９Ｂ）の存在下において受けたＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５のドーズによって処置されたマウスの個々の臨床スコア。臨床スコア：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。マウスの５０％（２／４）は、それらが０．５μｇのＤＥＸのみを受けたときに死んで見出され（†）、サイトカインストームに帰せられた。 ソルタグ付けによるコンジュゲート化プロセスの模式図。模式図はマレイミドおよび銅不使用のクリックケミストリーソルタグ付けアプローチのためのステップを指示する。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ免疫化は、シュードタイプ化ＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する高力価の耐久的な抗スパイクＲＢＤ抗体を誘導する。（図３１Ａ）ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤの設計。（図３１Ｂ）産生されたＶＨＨＭＨＣＩＩ、スパイクＲＢＤ、およびＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ融合産物のクマシーゲル。（図３１Ｃ）免疫化スキーム：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスが腹腔内にワクチン接種され、指示されている通り血清を採血された：免疫前血清は免疫化に３日先行して収集される。血液が免疫化の第１のドーズから第３２日および第１５０日に収集される。（図３１Ｄ）免疫化されたマウスの血清の液性応答が抗スパイクＲＢＤＩｇＧについてのＥＬＩＳＡによって評価された（ｎ＝４／群）。（図３１Ｅ）ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ。（図３１Ｆ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖蛋白質によってシュードタイプ化されたＶＳＶの中和データ。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ融合体のシングルドーズによるマウスの免疫化は、スパイクＲＢＤに対する強いＴ細胞応答を速やかに誘起する。（図３２Ａ）免疫化スキーム：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスが腹腔内にワクチン接種され、脾臓がＴ細胞アッセイのために収穫された。（図３２Ｂ）ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために作出されたスパイクＲＢＤアミノ酸配列およびペプチドの模式図。（図３２Ｃ）アジュバントのみ、スパイクＲＢＤ＋アジュバント、またはＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ＋アジュバントをワクチン接種されたマウスにおけるスパイクＲＢＤ特異的Ｔ細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析。スパイクＲＢＤは１５ｍｅｒペプチド、１０アミノ酸オーバーラップに切り詰められ、ペプチド１～５３として指示されている。（図３２Ｄ）指示されているペプチドと培養された後の第３日における脾細胞のサイトカイン分泌。（図３２Ｅ）６時間のペプチド混合物（ペプチド４２＋４７＋４８＋４９）ありまたはなしのインキュベーション後の脾細胞のフローサイトメトリー分析。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤワクチン接種の２ドーズは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数のバリアントに対する遷延的な中和抗体力価を作出するために十分である。（図３３Ａ）免疫化されたマウスの血清の液性応答の動態が、抗スパイクＲＢＤＩｇＧについてのＥＬＩＳＡによって評価された（ｎ＝４／群）。（図３３Ｂ）ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ。（図３３Ｃ）Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ変異を有するスパイクＲＢＤ蛋白質に対する免疫化されたマウスの抗体力価。（図３３Ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖蛋白質Ｗｕｈａｎ＋Ｄ４１８Ｇおよび他のバリアントによってシュードタイプ化されたＶＳＶの中和データ。 ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ付加体は、送達モード、保存条件、凍結乾燥、および加齢していくマウスの最適でない免疫にかかわらず、強い抗体応答を誘起する。（図３４Ａ）免疫化の時系列。（図３４Ｂ）異なる送達モードを用いて免疫化されたマウスの血清中の抗スパイクＲＢＤＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ。（図３４Ｃ）異なる製剤保存条件を用いて免疫化されたマウスの血清中の抗スパイクＲＢＤＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ。（図３４Ｄ）加齢マウスにおける抗体産生の有効性。抗体力価がＥＬＩＳＡによって評価された（ｎ＝４／群）。
詳細な記載
本開示は、いくつかの側面において、ＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原、例えば自己抗原または治療に用いられる外因性酵素）および／または抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体断片（ナノボディ／ＶＨＨ）を含む１つ以上のコンジュゲート（例および図においては「付加体」ともまた言われる）を含む組成物、抗原に対する免疫寛容を誘導するためにかかる組成物を用いる方法、ならびに自己免疫疾患を処置するためにかかる組成物を用いる方法を提供する。いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原）および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する。いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の１つ以上の表面蛋白質に結合する。
本開示の他の側面は、ＶＨＨがＡＰＣ上の表面蛋白質に結合する、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原、例えば病原体からの抗原または腫瘍抗原）および／または炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む１つ以上のコンジュゲートを含む組成物、抗原に対する免疫応答を誘導するためにかかる組成物を用いる方法、ならびに感染（例えば病原体による）および癌を処置するためにかかる組成物を用いる方法を提供する。いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原、例えば病原体からの抗原または腫瘍抗原）および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する。いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原、例えば病原体からの抗原または腫瘍抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の１つ以上の表面蛋白質に結合する。
ＶＨＨおよびコンジュゲート
本開示のコンジュゲートはシングルドメイン抗体（ナノボディまたはＶＨＨともまた言われる）を含む。本願において用いられる「シングルドメイン抗体断片」、「ナノボディ」、または「ＶＨＨ」は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を言う。ラクダは重鎖のみの抗体を産生するということが公知である（例えば、参照によって本願に組み込まれるHamers－Casterman et al., 1992に記載される通り）。これらの重鎖のみの抗体のシングルドメイン可変断片はＶＨＨまたはナノボディと呼称される。ＶＨＨは抗体によって共有される免疫グロブリンフォールドを保持し、３つの超可変ループ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を用いてそれらの標的に結合する。多くのＶＨＨは、従来のフルサイズ抗体に類似の親和性によってそれらの標的に結合するが、それらよりも優れた他の特性を所有する。よって、ＶＨＨは生物学研究および治療薬への使用にとって魅力的なツールである。ＶＨＨは通常はサイズが１０から１５ｋＤａの間であり、Ｅ．ｃｏｌｉのサイトゾルおよびペリプラズムの両方において高い収量で組み換え発現され得る。ＶＨＨは哺乳類サイトゾルにおいてそれらの標的に結合し得る。ＶＨＨ断片（例えば、ナノボディ（登録商標））は、ラクダ重鎖抗体に由来する組み換えの抗原特異的なシングルドメインの可変断片である。それらは小さいが、ＶＨＨ断片は完全な抗体の完全な抗原結合能力を保持する。ＶＨＨはサイズが小さく、高度に可溶性、安定であり、従来の抗体と比較してアクセス可能なエピトープの多大なセットを有する。再フォーマットが要求されないので、それらは、本願に記載されるキメラ受容体の細胞外標的結合部分として用いることもまた容易である。
いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲートに用いられるＶＨＨは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する。「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、抗原提示として公知のプロセスの、それらの表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体化した抗原を呈する細胞を言う。Ｔ細胞はそれらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこれらの複合体を認識し得る。ほとんど全ての細胞型は何らかのやり方で抗原を提示し得る。それらは種々の組織型に見出される。本願において用いられる用語「抗原提示細胞」は、限定なしにマクロファージ、Ｂ細胞、および樹状細胞を包含するプロフェッショナル抗原提示細胞を言う。細胞傷害性およびヘルパーＴ細胞の両方の機能はＡＰＣに依存的であるので、抗原提示細胞は有効な適応免疫応答に重要な役割を演ずる。抗原提示は、適応免疫の特異性を可能にし、細胞内および細胞外病原体の両方に対する免疫応答に寄与し得る。それは腫瘍に対する防御にもまた関わる。いくつかの癌治療には、悪性細胞を標的化するために適応免疫系をプライミングするための人工ＡＰＣの創出が関わる。加えて、例えば参照によって本願に組み込まれるBest et al., Front Immunol. 2015; 6: 360に記載される通り、ＡＰＣはＴ細胞に自己抗原を提示することによって免疫寛容にもまた役割を演ずる。
ＭＨＣファミリーの蛋白質に加えて、ＡＰＣおよびＴ細胞の両方の表面上の他の特殊化したシグナル伝達分子もまた抗原提示に要求される。いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲートは、ＡＰＣの表面上の蛋白質に結合するＶＨＨを含み、それゆえにＡＰＣに関与する。本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨによって標的化され得るＡＰＣ上の表面蛋白質の限定しない例は、限定なしに：主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）、インテグリンアルファＸ（ＣＤ１１ｃ）、リンパ球抗原７５（ＤＥＣ２０５。ＣＤ２０５ともまた言われる）、樹状細胞特異的なＩＣＡＭ－３グラビング非インテグリン１（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、Ｃ型レクチンドメイン含有９Ａ（ＣＬＥＣ９ａ）、インテグリンアルファＥ（ＣＤ１０３）、Ｃ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）、分化抗原群１ａ（ＣＤ１ａ）、およびＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様１（Ｆ４／８０。ＥＭＲ１ともまた言われる）を包含する。
いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨはＡＰＣ上の１つの表面蛋白質に結合する（例えば、限定なしに、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＤＥＣ２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＣＬＥＣ９ａ、ＣＤ１０３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１ａ、またはＦ４／８０）。いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨは、二重特異性または多重特異性である。いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨはＡＰＣ上の１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはより多くの）表面蛋白質に結合する。ＡＰＣ上の表面蛋白質に結合するいずれかの公知のＶＨＨが本開示に従って用いられ得る。
いくつかの態様において、ＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する。ＭＨＣＩＩに結合するＶＨＨは、例えば、参照によって本願に組み込まれるＵＳ特許Ｎｏ．ＵＳ９７５１９４５に記載されている。ＭＨＣＩＩに結合するＶＨＨの例のアミノ酸配列が表１に提供されている。
いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨは、配列番号１のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨは配列番号１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、ＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する。ＣＤ１１ｃに結合するＶＨＨは、例えば、参照によって本願に組み込まれるBannas et al., Front Immunol. 2017; 8: 1603に記載されている。ＣＤ１１ｃに結合するＶＨＨの例のアミノ酸配列が表１に提供されている。
いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨは、配列番号２のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨは配列番号２のアミノ酸配列を含む。
Figure 2023528462000002
いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲート上のＶＨＨのいずれか１つは、追加の配列、例えばソルターゼ認識配列を含む（例えば、参照によって本願に組み込まれるＵＳ特許Ｎｏ．ＵＳ９７５１９４５に記載される通り）。グラム陽性細菌から「ソルターゼ」として同定された酵素は、蛋白質を切断し、インタクトな細胞壁上のプロテオグリカン部分へと移行させる。スタフィロコッカス・アウレウスから単離されたソルターゼにはソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）およびソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）がある。
いくつかの態様において、ソルターゼの認識配列はさらに１つ以上の追加のアミノ酸を例えばＮまたはＣ末端に含む。例えば、天然に生起するソルターゼ基質上の５アミノ酸認識配列のすぐＮ末端またはＣ末端に見出されるアミノ酸のアイデンティティを有する１つ以上のアミノ酸（例えば、最高で５アミノ酸）が組み込まれ得る。かかる追加のアミノ酸は、認識モチーフの認識を改善する文脈を提供し得る。
ソルターゼは、グラム陽性細菌ゲノムからの６１個のソルターゼの配列アラインメントおよび系統学分析に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤと指定される４つのクラスに分類されている（Dramsi S, Trieu－Cuot P, Bierne H, Sorting sortases: a nomenclature proposal for the various sortases of Gram－positive bacteria. Res Microbiol. 156(3):289－97, 2005。これらのクラスは、ソルターゼがComfortおよびClubbによってもまた分類されている次のサブファミリーに対応する（Comfort D, Clubb R T. A comparative genome analysis identifies distinct sorting pathways in gram－positive bacteria. Infect Immun., 72(5):2710－22, 2004）：クラスＡ（サブファミリー１）、クラスＢ（サブファミリー２）、クラスＣ（サブファミリー３）、クラスＤ（サブファミリー４および５）。上述の参照は数々のソルターゼおよび認識モチーフを開示している。Pallen, M. J.; Lam, A. C.; Antonio, M.; Dunbar, K. TRENDS in Microbiology, 2001, 9(3), 97－101をもまた見よ。当業者は、その配列および／または他の特徴、例えばDrami, et al.、上記に記載されているものに基づいて、ソルターゼを直ちに正しいクラスに割り付ける能力があるであろう。用語「ソルターゼＡ」は、本願においては、いずれかの特定の細菌種の通常はＳｒｔＡと名指しされるクラスＡソルターゼ、例えばＳ．アウレウスからのＳｒｔＡを言うために用いられる。同様に、「ソルターゼＢ」は、本願においては、いずれかの特定の細菌種の通常はＳｒｔＢと名指しされるクラスＢソルターゼ、例えばＳ．アウレウスからのＳｒｔＢを言うために用いられる。
いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲートを産生するために用いられるソルターゼはソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）である。ＳｒｔＡはモチーフＬＰＸＴＧ（配列番号２５）を認識し、普通の認識モチーフは例えばＬＰＫＴＧ（配列番号２６）、ＬＰＡＴＧ（配列番号２７）、ＬＰＮＴＧ（配列番号２８）である。いくつかの態様においては、ＬＰＥＴＧ（配列番号２９）が用いられる。しかしながら、このコンセンサス外に帰属するモチーフもまた認識され得る。例えば、いくつかの態様において、モチーフは、位置４に「Ｔ」よりもむしろ「Ａ」、例えばＬＰＸＡＧ（配列番号３０）、例えばＬＰＮＡＧ（配列番号３１）を含む。いくつかの態様において、モチーフは、位置５に「Ｇ」よりもむしろ「Ａ」、例えばＬＰＸＴＡ（配列番号３２）、例えばＬＰＮＴＡ（配列番号３３）を含む。いくつかの態様において、モチーフは、位置２に「Ｐ」よりもむしろ「Ｇ」、例えばＬＧＸＴＧ（配列番号３４）、例えばＬＧＡＴＧ（配列番号３５）を含む。いくつかの態様において、モチーフは、位置１に「Ｌ」よりもむしろ「Ｉ」、例えばＩＰＸＴＧ（配列番号３６）、例えばＩＰＮＴＧ（配列番号３７）またはＩＰＥＴＧ（配列番号３８）を含む。
いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲートを産生するために用いられるソルターゼは、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）、例えばＳ．アウレウス、Ｂ．アンスラシス、またはＬ．モノサイトゲネスのソルターゼＢである。Ｂクラスのソルターゼ（ＳｒｔＢ）によって認識されるモチーフは、多くの場合には、コンセンサス配列ＮＰＸＴＸ（配列番号３９）、例えばＮＰ［Ｑ／Ｋ］－［Ｔ／ｓ］－［Ｎ／Ｇ／ｓ］、例えばＮＰＱＴＮ（配列番号４０）またはＮＰＫＴＧ（配列番号４１）に帰属する。例えば、Ｓ．アウレウスまたはＢ．アンスラシスのソルターゼＢは、それぞれの細菌においてＩｓｄＣのＮＰＱＴＮ（配列番号４０）またはＮＰＫＴＧ（配列番号４１）モチーフを切断する（例えばMarraffini, L. and Schneewind, O., Journal of Bacteriology, 189(17), p. 6425－6436, 2007を見よ）。クラスＢソルターゼの推定上の基質に見出される他の認識モチーフは、ＮＳＫＴＡ（配列番号４４）、ＮＰＱＴＧ（配列番号４５）、ＮＡＫＴＮ（配列番号４６）、およびＮＰＱＳＳ（配列番号４７）である。例えば、Ｌ．モノサイトゲネスからのＳｒｔＢは、位置２のＰを欠くおよび／または位置３のＱもしくはＫを欠くある種のモチーフ、例えばＮＡＫＴＮ（配列番号４６）およびＮＰＱＳＳ（配列番号４７）を認識する（Mariscotti J F, Garcia－Del Portillo F, Pucciarelli M G. The listeria monocytogenes sortase－B recognizes varied amino acids at position two of the sorting motif. J Biol Chem. 2009 Jan. 7. [Epub ahead of print]）。
いくつかの態様において、本願に記載されるコンジュゲートを産生するために用いられるソルターゼはクラスＣソルターゼである。クラスＣソルターゼはＬＰＸＴＧ（配列番号２５）を認識モチーフとして利用し得る。
いくつかの態様において、ソルターゼはクラスＤソルターゼである。このクラスのソルターゼは、コンセンサス配列ＮＡ－［Ｅ／Ａ／Ｓ／Ｈ］－ＴＧを有するモチーフを認識することが予測される（Comfort D、上記）。クラスＤソルターゼは例えばストレプトマイセスｓｐｐ．、コリネバクテリウムｓｐｐ．、トロフェリマ・ウィッペリ、サーモビフィダ・フスカ、およびビフィドバクテリウム・ロンガムにおいて見出されている。ＬＰＸＴＡ（配列番号３２）またはＬＡＸＴＧ（配列番号４８）が、例えばそれぞれサブファミリー４および５のクラスＤソルターゼの認識配列としての用をなし得る（サブファミリー４およびサブファミリー５酵素はそれぞれモチーフＬＰＸＴＡ（配列番号３２）およびＬＡＸＴＧ（配列番号４８）をプロセシングする）。例えば、クラスＤソルターゼであるＢ．アンスラシスソルターゼＣは、Ｂ．アンスラシスＢａｓＩおよびＢａｓＨのＬＰＮＴＡ（配列番号３３）モチーフを特異的に切断することが示されている（Marrafini、上記）。
いくつかの態様においては、天然に生起するソルターゼのバリアントが用いられ得る。かかるバリアントは例えば指向性進化、部位特異的修飾などのプロセスによって産生され得る。例えば、出発の野生型酵素と比較してＬＰＥＴＧ（配列番号２９）カップリング活性の最高で１４０倍の増大を有するＳ．アウレウスソルターゼＡのバリアントが同定されている（Chen, I., et al., PNAS 108(28): 11399－11404, 2011）。いくつかの態様において、ソルターゼバリアントは野生型Ｓ．アウレウスＳｒｔＡに対して相対的に次の置換のいずれか１つ以上を含む：Ｐ９４ＳまたはＰ９４Ｒ、Ｄ１６０Ｎ、Ｄ１６５Ａ、Ｋ１９０Ｅ、およびＫ１９６Ｔ変異。例示的な野生型Ｓ．アウレウスＳｒｔＡ配列（遺伝子ＩＤ：１１２５２４３、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑのＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿３７５６４０）が下に示されている：
Figure 2023528462000003
 （配列番号３）
例えば参照によって本願に組み込まれるＵＳ９７５１９４５に記載されている通り、ソルターゼタグ付けは、反応性の化学部分（例えば、クリックケミストリーハンドル）をＶＨＨ上にインストールするために用いられ得る。クリックケミストリーハンドルは、ＶＨＨを他の薬剤（例えば、抗原、抗炎症薬剤、および／または炎症促進薬剤）にコンジュゲート化するために用いられ得る。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はＶＨＨのＮ末端にある。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列はＶＨＨのＣ末端にある。
いくつかの態様において、反応性の化学部分は、ソルターゼによって媒介されるタグ付け（「ソルタグ付け」と言われる）によってＶＨＨ上にインストールされる。クリックケミストリーハンドルは、クリックケミストリー反応に参加し得る反応性の基を提供する化学部分である。クリックケミストリー反応およびクリックケミストリー反応のための好適な化学基は当業者に周知であり、末端アルキン、アジド、歪みアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール、およびアルケンを包含するが、これらに限定されない。例えば、いくつかの態様においては、アジドおよびアルキンがクリックケミストリー反応に用いられる。本願に記載される蛋白質コンジュゲート化の方法への使用に好適な追加のクリックケミストリーハンドルは当業者に周知であり、かかるクリックケミストリーハンドルは、次に記載されているクリックケミストリー反応パートナー、基、およびハンドルを包含するが、これらに限定されない。[1] H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless, Angew. Chem. 2001, 113, 2056－2075; Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004－2021. [2] a) C. J. Hawker, K. L. Wooley, Science 2005, 309, 1200－1205; b) D. Fournier, R. Hoogenboom, U. S. Schubert, Chem. Soc. Rev. 2007, 36, 1369－1380; c) W. H. Binder, R. Sachsenhofer, Macromol. Rapid Commun. 2007, 28, 15－54; d) H. C. Kolb. K. B. Sharpless, Drug Discovery Today 2003, 8, 1128－1137; e) V. D. Bock, H. Hiemstra, J. H. van Maarseveen, Eur. J. Org. Chem. 2006, 51－68. [3] a) V. O. Rodionov, V. V. Fokin, M. G. Finn, Angew. 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Davis, C. Barner－Kowollik, M. H. Stenzel, Macromolecules 2008, 41, 4120－4126; b) S. Sinnwell, A. J. Inglis, T. P. Davis, M. H. Stenzel, C. Barner－Kowollik, Chem. Commun. 2008, 2052－2054. [43] A. J. Inglis, S. Sinwell, M. H. Stenzel, C. Barner－Kowollik, Angew. Chem. 2009, 121, 2447－2450; Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 2411－2414。上で引用されている全ての参照は、本願において提供される進歩的な概念および方法に従う蛋白質上のインストールにとって好適なクリックケミストリーハンドルの開示について、参照によって本願に組み込まれる。
他のタグもまたソルタグ付けによってＶＨＨに追加され得る。好適なタグの例は、限定なしに、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、核酸、ポリヌクレオチド、糖、炭水化物、ポリマー、脂質、脂肪酸、および低分子を包含する。他の好適なタグは当業者には明らかであろう。本発明はこの側面において限定されない。いくつかの態様において、タグは、ポリペプチドを精製、発現、可溶化、および／または検出するために有用な配列を含む。いくつかの態様において、タグは複数の機能を果たし得る。タグは多くの場合には比較的小さく、例えば数アミノ酸から最高で約１００アミノ酸の長さの範囲である。いくつかの態様において、タグは、１００アミノ酸の長さよりも多く、例えば最高で約５００アミノ酸の長さ、またはより多くである。いくつかの態様において、少数の例を名指しすると、タグはＨｉｓ６、ＨＡ、ＴＡＰ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、またはＧＳＴタグを含む。いくつかの態様において、タグは可溶性増強タグを含む（例えば、ＳＵＭＯタグ、ＮＵＳＡタグ、ＳＮＵＴタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、またはバクテリオファージＴ７のＯｃｒ蛋白質の単量体変異体）。例えばEsposito D and Chatterjee D K. Curr Opin Biotechnol.; 17(4):353－8 (2006)を見よ。いくつかの態様において、タグは、それが例えばプロテアーゼによって除去され得るようにして切断可能である。いくつかの態様において、これは、例えばタグの機能性部分に隣接または連結したプロテアーゼ切断部位をタグ上に包含することによって達成される。例示的なプロテアーゼは、例えばトロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子、PreScissionプロテアーゼなどを包含する。いくつかの態様においては、「自己切断性」タグが用いられる。例えばＰＣＴ／ＵＳ０５／０５７６３を見よ。
本願に記載されるコンジュゲートは、第２の分子にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む。いくつかの態様において、ＶＨＨはソルターゼ認識モチーフを含み、クリックケミストリーによって第２の分子にコンジュゲート化される。いくつかの態様において、本開示のコンジュゲートは、１つの分子にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む。いくつかの態様において、ＶＨＨにコンジュゲート化された１つの分子は抗原である。いくつかの態様において、ＶＨＨにコンジュゲート化された１つの分子は抗炎症薬剤または炎症促進薬剤である。いくつかの態様において、本開示のコンジュゲートは、２つの分子にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む。いくつかの態様において、本開示のコンジュゲートは、それに対する免疫応答が必要とされる抗原（例えば、病原体からの抗原または腫瘍抗原）および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む。いくつかの態様において、本開示のコンジュゲートは、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原（例えば、自己抗原または治療に用いられる外因性の酵素）および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む。２つの分子をＶＨＨにコンジュゲート化するための方法の例が図３０Ａ～３０Ｃに示されている。
いくつかの態様において、抗炎症薬剤または炎症促進薬剤はリンカーを介してＶＨＨのソルターゼ認識モチーフにコンジュゲート化される。いくつかの態様において、リンカーは非加水分解性のリンカーである（すなわち、非切断可能）。非加水分解性のリンカーの限定しない例は、Ｎ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、マレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＭＣＣ）、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、およびそれらの誘導体を包含する。いくつかの態様において、リンカーは加水分解性のリンカーである（すなわち、切断可能な）。加水分解性のリンカーの限定しない例は、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジスルフィド、４－（４’－アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）およびＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）、バリン－シトルリン（ＶＣ）、バリン－アラニン（ＶＡ）、フェニルアラニン－リジン（ＦＫ）、ならびにそれらの誘導体を包含する。加水分解性のリンカーは、焼身自殺性のリンカー（すなわち自己切断性の）、例えばｐＨ感受性リンカー（例えば、ヒドラゾン）であり得る。例えば、ｐＨ感受性リンカーが用いられて、生理的環境の酸度のシフトによって、例えばＶＨＨが所望の目的地（例えば、ＡＰＣまたはその細胞内区画）に送達されるときに、ＶＨＨにコンジュゲート化された抗炎症薬剤または炎症促進薬剤を放出し得る。いくつかの態様において、リンカーは図２７に示される通り自己加水分解性のヒドラゾンリンカーである。本願に記載される方法への使用に好適な追加のリンカーは、当業者に周知であり、Jain, N., Smith, S. W., Ghone, S., & Tomczuk, B. Pharm Res, 2015, 32(11), 3526－3540および Lu, J., Jiang, F., Lu, A., & Zhang, G. Int J Mol Sci, 2016, 17(4), 561に記載されているものを包含するが、これらに限定されない。これらの両方は参照によって本願に組み込まれる。
いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原）および抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、自己抗原および抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される自己抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）またはその断片である（例えば、ＭＯＧ蛋白質のアミノ酸３５－５５。いくつかの態様において、自己抗原はシトルリン化フィブリノーゲンである。いくつかの態様において、自己抗原はインスリンである。いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、蛋白質補充療法または遺伝子治療に用いられる蛋白質（例えば酵素、例えば第ＩＸ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来蛋白質）および抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。
いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、組成物は、自己抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される自己抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）またはその断片である（例えば、ＭＯＧ蛋白質のアミノ酸３５－５５。いくつかの態様において、自己抗原はシトルリン化フィブリノーゲンである。いくつかの態様において、自己抗原はインスリンである。いくつかの態様において、組成物は、蛋白質補充療法または遺伝子治療に用いられる蛋白質（例えば酵素、例えば第ＩＸ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来蛋白質）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと、抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。
いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原）および抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、自己抗原および抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される自己抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）またはその断片である（例えば、ＭＯＧ蛋白質のアミノ酸３５－５５。いくつかの態様において、自己抗原はシトルリン化フィブリノーゲンである。いくつかの態様において、自己抗原はインスリンである。いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、蛋白質補充療法または遺伝子治療に用いられる蛋白質（例えば酵素、例えば第ＩＸ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来蛋白質）および抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。
いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと、抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、組成物は、自己抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと、抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される自己抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）またはその断片である（例えば、ＭＯＧ蛋白質のアミノ酸３５－５５。いくつかの態様において、自己抗原はシトルリン化フィブリノーゲンである。いくつかの態様において、自己抗原はインスリンである。いくつかの態様において、組成物は、蛋白質補充療法または遺伝子治療に用いられる蛋白質（例えば、酵素、例えば第ＩＸ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来蛋白質）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと、抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。
いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨはＡＰＣ上の異なる表面蛋白質に結合する。いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合し（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）、第２のＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨはＤＥＣ２０５に結合し、第２のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、組成物は、自己抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合し（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）、第２のＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される自己抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）またはその断片である（例えば、ＭＯＧ蛋白質のアミノ酸３５－５５。いくつかの態様において、自己抗原はシトルリン化フィブリノーゲンである。いくつかの態様において、自己抗原はインスリンである。いくつかの態様において、組成物は、蛋白質補充療法または遺伝子治療に用いられる蛋白質（例えば酵素、例えば第ＩＸ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来蛋白質）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤（例えば、デキサメタゾン）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨはＤＥＣ２０５に結合し、第２のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。
いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原）および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、病原体からの抗原（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２蛋白質、例えばスパイク蛋白質）および炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される病原体からの抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、腫瘍抗原および炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される腫瘍抗原のいずれか１つが用いられ得る。
いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、組成物は、病原体からの抗原（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２蛋白質、例えばスパイク蛋白質）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される病原体からの抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、組成物は、腫瘍抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される腫瘍抗原のいずれか１つが用いられ得る。
いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原）および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、病原体からの抗原（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２蛋白質、例えばスパイク蛋白質）および炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される病原体からの抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、腫瘍抗原および炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。
いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと、炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、組成物は、病原体からの抗原（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２蛋白質、例えばスパイク蛋白質）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される病原体からの抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、組成物は、腫瘍抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される腫瘍抗原のいずれか１つが用いられ得る。
いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと、炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨはＡＰＣ上の異なる表面蛋白質に結合する。いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合し（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）、第２のＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、組成物は、抗原（例えば、それに対する免疫応答が必要とされる抗原）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨはＤＥＣ２０５に結合し、第２のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。いくつかの態様において、組成物は、病原体からの抗原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２蛋白質、例えばスパイク蛋白質）にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合し（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）、第２のＶＨＨはＣＤ１１ｃに結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。本願に記載される病原体からの抗原のいずれか１つが用いられ得る。いくつかの態様において、組成物は、腫瘍抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤（例えば、ＩＬ２）にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨはＤＥＣ２０５に結合し、第２のＶＨＨはＭＨＣＩＩに結合する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨＨ）。
抗原
本願において用いられる「抗原」は、対象において免疫応答を誘導する分子を言う。目当ての抗原は、例えばポリペプチド、多糖、炭水化物、脂質、核酸、またはそれらの組み合わせであり得るか、またはそれを含み得る。抗原は天然に生起するかまたは合成であり得る。
いくつかの態様において、抗原は、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原である。いくつかの態様において、かかる抗原は、自己抗原（self－antigen）（「自己抗原（autoantigen）」ともまた言われる）、または自己免疫疾患を引き起こす自己免疫応答を開始もしくは増強する能力を有する薬剤である。それゆえに、かかる自己抗原に対する免疫寛容を誘導することが望まれる。いくつかの態様において、本願に記載される組成物は、自己抗原に対する免疫寛容（例えば、抗原特異的な免疫寛容）を誘導するために用いられる。免疫寛容（例えば、抗原特異的な免疫寛容）の誘導は抗原に対する抗原特異的な免疫応答を縮減し、これはいくつかの態様において自己免疫疾患の重症度を軽減する。
いくつかの態様において、本開示に従って用いられる自己抗原は：ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）、ミエリンプロテオリピド蛋白質、シトルリン化フィブリノーゲン、インスリン、クロモグラニンＡ、ＧＡＤ６５、デスモグレイン１（ＤＳＧ１）およびデスモグレイン３（ＤＳＧ３）、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、筋特異的チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）、およびリボ核蛋白質からなる群から選択される。
いくつかの態様において、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）またはその抗原性断片を含む。ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリン鞘の膜に埋め込まれた表面蛋白質である。ＭＯＧを標的化する抗体は、ＣＮＳの後天性の炎症性脱髄性障害などの自己免疫疾患を患う患者の血清中に一貫して見出されている（例えば、参照によって本願に組み込まれるNessier et al., EBioMedicine. 2019 Oct; 48: 18－19に記載される通り）。ＭＯＧ抗体に関連する自己免疫疾患は、限定なしに、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、視神経炎（ＯＮ）、横断性脊髄炎、および脳幹脳炎を包含する。いくつかの態様において、本願に記載される組成物の自己抗原は全長ＭＯＧである。いくつかの態様において、本願に記載される組成物の自己抗原はＭＯＧ断片を含む（例えば、ＭＯＧのアミノ酸３５－５５、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号４９））。
いくつかの態様において、自己抗原はフィブリノーゲンまたはその抗原性断片を含む。フィブリノーゲン（血液凝固因子Ｉ）は血栓形成における主要なプレーヤーである；それはトロンビンによって切断されてフィブリンを形成し、これは凝血塊の最も豊富なコンポーネントである。フィブリノーゲンは血液凝固および心血管疾患（ＣＶＤ）に重要な役割を演ずる。加えて、フィブリノーゲンは、自己免疫および炎症性疾患、例えば関節リウマチ、血管炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、腎臓障害、および移植後線維化において、ならびに癌のいくつかの型において、炎症促進性の因子である（例えば、参照によって本願に組み込まれるArbustini et al., Circulation. 2013;128:1276－1280に記載される通り）。いくつかの態様において、自己抗原はシトルリン化フィブリノーゲンである。いくつかの態様において、本願に記載される組成物の自己抗原はフィブリノーゲン断片（シトルリン化フィブリノーゲンのアミノ酸７９－９１、ＱＤＦＴＮＣｉｔＩＮＫＬＫＮＳ（配列番号５０））を含む。抗シトルリン化蛋白質抗体（ＡＣＰＡ）は関節リウマチを有する患者の血清中に特異的にかつ高頻度で検出される（例えば、Takizawa et al., Ann Rheum Dis. 2006 Aug; 65(8): 1013－1020に記載される通り）。
いくつかの態様において、自己抗原はミエリンプロテオリピド蛋白質またはその抗原性断片を含む。例えば参照によって本願に組み込まれるTuohy et al., Neurochem Res. 1994 Aug;19(8):935－44に記載される通り、ミエリンプロテオリピド蛋白質は自己免疫性脱髄性疾患に関わることが示されている。
いくつかの態様において、自己抗原はインスリンまたはその抗原性断片を含む。いくつかの態様において、自己抗原はインスリンアルファ鎖ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号５１））を含む。いくつかの態様において、自己抗原はインスリンベータ鎖ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号５２））を含む。インスリンは、インスリン自己免疫症候群およびＢ型インスリン抵抗症を包含する稀な自己免疫疾患に関わる（例えば、参照によって本願に組み込まれるCensi et al., Ann Transl Med. 2018 Sep; 6(17): 335に記載される通り）。
いくつかの態様において、自己抗原はクロモグラニンＡまたはその抗原性断片を含む。クロモグラニンＡは自己免疫性胃炎に関連する（例えば、参照によって本願に組み込まれるPeracchi et al., European Journal of Endocrinology (2005) 152 443－448に記載される通り）。
いくつかの態様において、自己抗原はグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５キロダルトンアイソフォーム（ＧＡＤ６５）またはその抗原性断片を含み、これは中枢神経系の自己免疫疾患、神経自己免疫疾患、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、および悪性貧血に関連することが公知である（例えば、参照によって本願に組み込まれるMcKeon et al., Muscle Nerve. 2017 Jul;56(l):15－27に記載される通り）。
いくつかの態様において、自己抗原はデスモグレイン１（ＤＳＧ１）および／またはデスモグレイン３（ＤＳＧ３）またはその抗原性断片を含む。例えば参照によって本願に組み込まれるAmagai et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2010;86(5):524－37に記載される通り、ＤＳＧ１およびＤＳＧ３は皮膚自己免疫疾患に関わる。
いくつかの態様において、自己抗原はアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）またはその抗原性断片を含む。アセチルコリン受容体に対する抗体によって媒介される自己免疫応答は、例えば参照によって本願に組み込まれるLindstrom et al., J Neurobiol. 2002 Dec;53(4):656－65に記載される通り、重症筋無力症を引き起こす。
いくつかの態様において、自己抗原は筋特異的チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）またはその抗原性断片を含む。ＭｕＳＫは、例えば参照によって本願に組み込まれるVincent et al., Curr Opin Neurol. 2005 Oct;18(5):519－25に記載される通り、神経筋接合部自己免疫疾患に関わることが示されている。
いくつかの態様において、自己抗原はリボ核蛋白質またはその抗原性断片を含む。リボ核蛋白質は、例えば参照によって本願に組み込まれるWhittingham et al., Aust N Z J Med. 1983 Dec;13(6):565－70；およびNewkirk et al., Arthritis Research & Therapy volume 3, Article number: 253 (2001)に記載される通り、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）などの自己免疫疾患に関わる。
かかる自己免疫抗原および関連する自己免疫疾患の他の限定しない例は：インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）を処置するための膵ベータ細胞抗原、インスリン、およびＧＡＤ；関節リウマチを処置することへの使用のためのコラーゲン１１型、ヒト軟骨ｇｐ３９（ＨＣｇｐ３９）、およびｇｐ１３０－ＲＡＰＳ；多発性硬化症を処置するためのミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）；強皮症を処置するためのフィブリラリンおよび核小体低分子蛋白質（ｓｎｏＲＮＰ）；グレーブス病を処置することへの使用のための甲状腺刺激因子受容体（ＴＳＨ－Ｒ）；全身性エリテマトーデスを処置することへの使用のための核抗原、ヒストン、糖蛋白質ｇｐ７０およびリボソーム蛋白質；原発性胆汁性肝硬変を処置することへの使用のためのピルビン酸デヒドロゲナーゼ・デヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ＰＣＤ－Ｅ２）；円形脱毛症を処置することへの使用のための毛包抗原；ならびに潰瘍性大腸炎を処置することへの使用のためのヒトトロポミオシンアイソフォーム５（ｈＴＭ５）を包含する。これらの例は限定することを意味されない。当業者は目当ての自己免疫疾患に関連する自己免疫抗原を同定する能力がある。
いくつかの態様において、抗原は、蛋白質補充療法または遺伝子治療に用いられる蛋白質、例えば、限定なしに、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、およびＡＡＶ由来蛋白質を含む。これらの例は限定することを意味されない。当業者は、蛋白質補充治療または遺伝子治療に用いられる目当ての蛋白質を同定する能力がある。これらの蛋白質に対する免疫寛容を誘導することは、免疫系による蛋白質の破壊を縮減し、より長い持続的な治療効果に至る。
いくつかの態様において、本開示に従って用いられる抗原は、それに対する免疫応答が必要とされる抗原である。例えば、いくつかの態様において、かかる抗原は、病原体、感染細胞、もしくは新生物細胞（例えば、癌細胞）によって天然に産生され、および／またはそれによって遺伝子にコードされるポリペプチドもしくはペプチドを含む。いくつかの態様において、抗原はウイルス、細菌、真菌、または寄生虫によって産生されるかまたは遺伝子にコードされ、これはいくつかの態様において病原性因子である。いくつかの態様において、病原体はそのライフサイクルの少なくとも一部において細胞内にある。いくつかの態様において、病原体は細胞外にある。特定のソースを起源とする抗原は、いくつかの態様において、いずれかの適当な手段を用いて（例えば、組み換え的に、合成的になど）、例えば、抗原を用いて例えばそれに対する抗体を同定するか、作出するか、試験するか、または用いる目的で、かかるソースから単離または産生され得るということは了解されるであろう）。抗原は、例えば、別の分子または実体（例えば、アジュバント）に対するコンジュゲート化、化学的または物理的変性などによって修飾され得る。いくつかの態様において、抗原はエンベロープ蛋白質、カプシド蛋白質、分泌蛋白質、構造蛋白質、細胞壁蛋白質もしくは多糖、外殻蛋白質もしくは多糖、または酵素である。いくつかの態様において、抗原は、毒素、例えば細菌毒素である。
いくつかの態様において、抗原はウイルス抗原である。例示的なウイルスは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、レトロウイルス科（例えばレンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ－Ｉ）；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えばデングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）；コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えばハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、ＫＳＶ）；ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、リノウイルス、エコーウイルス）を包含する。いくつかの態様において、抗原は、ベータコロナウイルス蛋白質、例えばスパイク蛋白質（例えば、全長または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ））、エンベロープ蛋白質、膜蛋白質、またはヌクレオカプシド蛋白質を含む。いくつかの態様において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）蛋白質、例えばスパイク蛋白質（例えば、全長または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ））、エンベロープ蛋白質、膜蛋白質、またはヌクレオカプシド蛋白質を含む。本開示に従って抗原として用いられ得るベータコロナウイルス蛋白質の例が表２に提供されている。
Figure 2023528462000004
Figure 2023528462000005
Figure 2023528462000006
Figure 2023528462000007
いくつかの態様において、抗原は細菌抗原である。例示的な細菌は、例えばヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリア（例えば、Ｍ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシ、Ｍ．ゴルドネ）、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、リステリア・モノサイトゲネス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｂ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス（嫌気性ｓｐ．）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、カンピロバクターｓｐ．、エンテロコッカスｓｐ．、クラミジアｓｐ．、ヘモフィルス・インフルエンザ、バチルス・アンスラシア、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、エリジペロスリックス・ルシオパチエ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・テタニ、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・ニューモニエ、パスツレラ・ムルトシダ、バクテロイデスｓｐ．、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリホルミス、トレポネーマ・パリダム、トレポネーマ・ペルテヌ、レプトスピラ、アクチノミセス・イスラエリ、およびフランシセラ・ツラレンシスを包含する。
いくつかの態様において、抗原は真菌抗原である。例示的な真菌は、例えばアスペルギルス、例えばアスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニガー、ブラストミセス、例えばブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ、例えばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・ギリエルモンディイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス、コクシジオイデス、例えばコクシジオイデス・イミチス、クリプトコッカス、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス、エピデルモフィトン、フサリウム、ヒストプラズマ、例えばヒストプラズマ・カプスラタム、マラセチア、例えばマラセチア・フルフル、ミクロスポルム、ムコール、パラコクシジオイデス、例えばパラコクシジオイデス・ブラジリエンシ、ペニシリウム、例えばペニシリウム・マルネッフェイ、ピキア、例えばピキア・アノマラ、ピキア・ギリエルモンディイ、ニューモシスチス、例えばニューモシスチス・カリニ、シュードアレシェリア、例えばシュードアレシェリア・ボイジイ、リゾプス、例えばリゾプス・オリゼー、ロドトルラ、例えばロドトルラ・ルブラ、スケドスポリウム、例えばスケドスポリウム・アピオスペルムム、シゾフィラム、例えばシゾフィラム・コムーネ、スポロトリックス、例えばスポロトリックス・シェンキイ、トリコフィトン、例えばトリコフィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・ルブルム、トリコフィトン・ベルコーサム、トリコフィトン・ビオラセウム、トリコスポロン、例えばトリコスポロン・アサヒ、トリコスポロン・クタネウム、トリコスポロン・インキン、およびトリコスポロン・ムコイデスを包含する。
いくつかの態様において、抗原は寄生虫からである。例示的な寄生虫は、例えば、プラスモジウム属の寄生虫（例えばプラスモジウム・ファルシパルム、Ｐ．ビバックス、Ｐ．オバール、およびＰ．マラリアエ）、トリパノソーマ、トキソプラズマ（例えば、トキソプラズマ・ゴンディ）、リーシュマニア（例えばリーシュマニア・メジャー）、シストソーマ、またはクリプトスポリジウムを包含する。いくつかの態様において、寄生虫は原生動物である。いくつかの態様において、寄生虫はアピコンプレクサ門に属する。いくつかの態様において、寄生虫はそのライフサイクルの少なくとも一部において細胞外に在る。例は線虫、トレマトード（吸虫）、および条虫を包含する。いくつかの態様においては、アスカリスまたはトリクリスからの抗原が企図される。種々の態様において、抗原は寄生虫のいずれかのコンポーネントを起源とし得る。いくつかの態様において、抗原は、寄生虫のそれらのライフサイクルのいずれかのステージ、例えば、哺乳類または鳥類生物などの感染した生物において生起するいずれかのステージの寄生虫に由来し得る。いくつかの態様において、抗原は、寄生虫の卵または寄生虫によって分泌される物質に由来する。
いくつかの態様において、抗原は腫瘍抗原である。一般的に、腫瘍抗原は、腫瘍細胞（例えば、腫瘍原性細胞、またはいくつかの態様においては腫瘍間質細胞、例えば腫瘍関連細胞、例えば癌関連線維芽細胞）によって産生されるいずれかの抗原性物質であり得る。いくつかの態様において、腫瘍抗原は、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞によって差異的に発現される分子（またはその部分）である。腫瘍抗原は、例えば、正常では非常に小さい数量で産生され、腫瘍細胞によってより大きい数量で発現される蛋白質、正常では発生のある種のステージにおいて産生される蛋白質、その構造（例えば、配列または翻訳後修飾（単数または複数））が腫瘍細胞においては変異を原因として改変される蛋白質、または（正常な条件においては）免疫系から隔離される正常な蛋白質を包含し得る。腫瘍抗原は、例えば腫瘍細胞を同定または検出することに（例えば、診断の目的で、および／または腫瘍の処置を受けた対象をモニタリングする目的で、例えば再発について検査するために）および／または種々の薬剤（例えば、治療薬剤）を腫瘍細胞へと標的化する目的で有用であり得る。例えば、いくつかの態様においては、キメラ抗体が提供され、クリックケミストリーによって治療薬剤、例えば細胞傷害薬剤にコンジュゲート化されたかつ腫瘍抗原に結合する抗体断片の抗体を含む。いくつかの態様において、腫瘍抗原は、変異した遺伝子、例えば癌遺伝子もしくは変異した腫瘍抑制遺伝子の発現産物、過剰発現もしくは異状に発現した細胞蛋白質、発癌性ウイルス（例えば、ＨＢＶ；ＨＣＶ；ヘルペスウイルスファミリーメンバー、例えばＥＢＶ、ＫＳＶ；パピローマウイルスなど）によってコードされる抗原、または癌胎児抗原である。癌胎児抗原は正常では胚発生の早いステージにおいて産生され、免疫系が完全に発達した時間までに大体または完全に消失する。例は、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ。例えば胚細胞腫瘍および肝細胞癌に見出される）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ。例えば腸の癌および時たま肺または乳癌に見出される）である。チロシナーゼは、正常では非常に低い数量で産生されるが、その産生がある種の腫瘍細胞（例えば、メラノーマ細胞）において多大に増大している蛋白質の例である。他の例示的な腫瘍抗原は、例えばＣＡ－１２５（例えば卵巣癌に見出される）；ＭＵＣ－１（例えば乳癌に見出される）；上皮腫瘍抗原（例えば乳癌に見出される）；メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ；例えば悪性メラノーマに見出される）；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ。前立腺癌に見出される）を包含する。いくつかの態様において、腫瘍抗原は少なくとも部分的に腫瘍細胞の細胞表面に暴露される。いくつかの態様において、腫瘍抗原は、異常に修飾されたポリペプチドまたは脂質、例えば異状に修飾された細胞表面糖脂質または糖蛋白質を含む。腫瘍抗原は、特定の型の腫瘍のサブセットによっておよび／または腫瘍の細胞のサブセットによって発現され得るということは了解されるであろう。
いくつかの態様において、腫瘍抗原は：ＭＡＧＥファミリーメンバー、ＮＹ－ＥＳＯ－１、チロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、前立腺癌抗原、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼ、ＷＴ１、ＣＥＡ、ｇｐ１００、Ｐｍｅ１１７、マンマグロビン－Ａ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＥＲＢＢ２、ＯＡ１、ＰＡＰ、ＲＡＢ３８／ＮＹ－ＭＥＬ－１、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、ＴＲＰ－２、ＣＤ３３、ＢＡＧＥ－１、Ｄ３９３－ＣＤ２０ｎ、サイクリン－Ａ１、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－８、ＧｎＴＶｆ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＫＫ－ＬＣ－１、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１、ＬＹ６Ｋ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ムチンＫ、ＮＡ８８－Ａ、ＳＡＧＥ、ｓｐ１７、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－４、サバイビンｇ、ＴＡＧ－１、ＴＡＧ－３、ＴＲＡＧ－３、ＸＡＧＥ－１ｂ、ＢＣＲ－ＡＢ１、アジポフィリン、ＡＩＭ－２、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＩＮＧ－４、ＣＡＬＣＡ、ＣＤ４５、ＣＤ２７４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、グリピカン－３、Ｇ２５０、ＨＥＲ－２、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ヘプシン、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１２Ｒアルファ２、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファ－フェトプロテイン、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、Ｍ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＰ、ｍｄｍ－２、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ｐ５３、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ－１、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ｓｅｃｅｒｉｎｅ１、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、テロメラーゼ、ＴＰＢＧ、メソテリン、Ａｘ１、およびＶＥＧＦからなる群から選択される。
いくつかの態様において、抗原は、丸ごとの細胞、丸ごとの寄生虫、丸ごとのウイルス、丸ごとの細菌、または１つ以上の抗原を含む丸ごとのナノ粒子、エキソソーム、もしくはマイクロ粒子である。１つの例では、ＶＨＨは、ベータ膵島細胞にコンジュゲート化され、器官または組織補充療法の過程においてベータ膵島細胞寛容を誘導するために非炎症性状態において送達され得る。尚も別の例では、ＶＨＨは、寄生虫にコンジュゲート化され、一度に複数の寄生虫抗原に対する強い免疫応答を誘導するために炎症性状態において送達され得る。
抗炎症薬剤および炎症促進薬剤
本願において示される通り、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原（例えば、自己抗原）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートは、非炎症性状態の対象に投与されるときに、自己抗原に対する抗原特異的な免疫寛容を誘導することにおいてより有効である。いくつかの態様において、非炎症性状態は、ＶＨＨと抗原とを含む同じコンジュゲートに抗炎症薬剤を取り付けることによって提供される。いくつかの態様において、非炎症性状態は、自己抗原にコンジュゲート化されたＶＨＨに加えて、抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを同時投与することによって提供される。
「抗炎症薬剤」は体の炎症を縮減する物質を言う。抗炎症薬剤は、炎症を引き起こす体のある種の物質をブロックする。当分野において公知のいずれかの抗炎症薬剤が本開示に従って用いられ得る。いくつかの態様において、抗炎症薬剤はステロイド性抗炎症薬剤である。いくつかの態様において、ステロイド性抗炎症薬剤は：デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、およびベタメタゾンからなる群から選択される。いくつかの態様において、抗炎症薬剤は非ステロイド性抗炎症薬剤である。いくつかの態様において、非ステロイド性抗炎症薬剤は：アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、シクロスポリンＡ、およびカルシトリオールからなる群から選択される。いくつかの態様において、本開示に従って用いられる抗炎症薬剤はデキサメタゾンである。
いくつかの態様において、抗炎症薬剤は抗炎症性サイトカインである。「抗炎症性サイトカイン」は、ＩＬ－１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および他の主要な炎症促進性のサイトカインの合成を阻害ならびに炎症性応答を縮減するサイトカインを言う。いくつかの態様において、抗炎症性サイトカインはＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、およびＴＧＦβからなる群から選択される。
本開示は、他の側面において、それに対する免疫応答が必要とされる抗原（例えば、病原体からの抗原または腫瘍抗原）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートが、炎症性状態の対象に投与されるときに、抗原に対する抗原特異的な免疫応答を誘導することにおいてより有効であるということを提供する。いくつかの態様において、炎症性状態は、ＶＨＨと抗原とを含む同じコンジュゲートに炎症促進薬剤を取り付けることによって提供される。いくつかの態様において、非炎症性状態は、抗原にコンジュゲート化されたＶＨＨに加えて、炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを同時投与することによって提供される。いくつかの態様において、炎症促進薬剤は：ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ－ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＨＭＧＢ１蛋白質、ＩＬ２、ＩＬ１２、およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される。いくつかの態様において、炎症促進薬剤はＩＬ２である。
処置の方法
本開示のいくつかの側面は、それを必要とする対象に：（ｉ）ＶＨＨがＡＰＣ上の表面蛋白質（例えば、ＭＨＣＩＩまたはＣＤ１１ｃ）に結合する、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原（例えば、自己抗原）および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲート、または（ｉｉ）第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨがＡＰＣ上の１つ以上の（例えば、同じかまたは異なる）表面蛋白質に結合する、それに対する免疫寛容が必要とされる抗原（例えば、自己抗原）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む第１のコンジュゲートおよび抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートを投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、２つのＶＨＨが投与されるときに、それらは同じ組成物としてまたは異なる組成物として（例えば、順次に）投与される。いくつかの態様において、方法は抗原に対する免疫寛容を誘導するためである。いくつかの態様において、方法は自己免疫疾患を処置するためである。
「自己免疫疾患」は、それ自身の組織を攻撃および損傷する免疫系の異常に過剰活性を引き起こす障害である。自己免疫疾患の限定しない例は：関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症（ＭＧ）、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ギランバレー症候群、自己免疫性心筋炎、膜性糸球体腎炎、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、若年発症糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群、自己免疫性甲状腺炎、胃炎、セリアック病、白斑、肝炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、脊椎関節症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、免疫性好中球減少症、およびサイトカインによって媒介される遅延型過敏反応に関連する免疫応答、結核に典型的に見出されるＴリンパ球、サルコイドーシス、および多発筋炎、多発動脈炎、皮膚血管炎、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、または腫瘍随伴性天疱瘡）、類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、川崎病、全身性強皮症、抗リン脂質症候群、およびシェーグレン症候群を包含する。いくつかの態様において、自己免疫疾患は：多発性硬化症、ＩＩ型糖尿病、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、ループス、セリアック病、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）からなる群から選択される。いくつかの態様において、自己免疫疾患は：自己免疫性脳脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、視神経炎（ＯＮ）、横断性脊髄炎、および脳幹脳炎、関節リウマチ、血管炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、腎臓障害、移植後線維化、および癌のいくつかの型において、自己免疫性脱髄性疾患、インスリン自己免疫症候群、Ｂ型インスリン抵抗症、自己免疫胃炎、中枢神経系の自己免疫疾患、神経自己免疫疾患、１型糖尿病、自己免疫甲状腺疾患、悪性貧血、皮膚自己免疫疾患、重症筋無力症、神経筋接合部自己免疫疾患からなる群から選択される。異なる自己抗原が、異なる自己免疫疾患を処置するためにコンジュゲートに用いられ得る。当業者は、用いるべき適当な自己抗原を同定する能力がある。
本開示の他の側面は、それを必要とする対象に：（ｉ）ＶＨＨがＡＰＣ上の表面蛋白質（例えば、ＭＨＣＩＩまたはＣＤ１１ｃ）に結合する、それに対する免疫応答が必要とされる抗原（例えば、病原体からの抗原または腫瘍抗原）および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲート、または（ｉｉ）第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨがＡＰＣ上の１つ以上の（例えば同じかまたは異なる）表面蛋白質に結合する、それに対する免疫応答が必要とされる抗原（例えば、病原体からの抗原または腫瘍抗原）にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む第１のコンジュゲートおよび炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートを投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、２つのＶＨＨが投与されるときに、それらは同じ組成物としてまたは異なる組成物として（例えば、順次に）投与される。いくつかの態様において、方法は、抗原に対する免疫応答を誘導するためである。いくつかの態様において、方法は、病原体（例えば微生物病原体、例えば本願に記載されるもの）によって引き起こされる感染を処置するためである。いくつかの態様において、方法は癌を処置するためである。
癌は原発または転移癌であり得る。癌は、成人および小児急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳに関係する癌、肛門癌、虫垂の癌、星細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、胆道癌、骨肉腫、線維性組織球腫、脳の癌、脳幹グリオーマ、小脳星細胞腫、悪性グリオーマ、膠芽腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視床下部グリオーマ、乳癌、男性乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、未知の起源の癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、悪性グリオーマ、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性および骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、消化管間質腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、グリオーマ、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視神経視床下部グリオーマ、眼内メラノーマ、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、腎細胞癌、喉頭癌、口唇口腔癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、原発中枢神経系リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、慢性骨髄増殖性障害、鼻腔・副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽腫、中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体癌、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非メラノーマ皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、精巣癌、喉の癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌、絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、絨毛癌、造血器新生物、成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、間質腫瘍および胚細胞腫瘍、またはウイルムス腫瘍を包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様において、癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、脳・中枢神経系癌、皮膚癌、卵巣癌、白血病、子宮内膜癌、骨、軟骨、および軟部組織肉腫、リンパ腫、神経芽腫、腎芽腫、網膜芽細胞腫、または性腺胚細胞腫瘍である。
その最も幅広い意味において、用語「処置」または「処置する」は治療的および予防的処置の両方を言う。処置を必要とする対象が疾患（例えば、自己免疫疾患、感染、または癌）を有する場合には、「状態を処置する」は、疾患に関連する１つ以上の症状もしくは疾患の重症度を改善、縮減、もしくは消去すること、または疾患のいずれかのさらなる進行を防止することを言う。処置を必要とする対象が、疾患（例えば、感染または癌）を有するリスクがあるものである場合は、対象を処置することは、対象が感染、癌を有するリスクを縮減すること、または対象が感染もしくは癌を発生することを防止することを言う。
対象はヒトまたは脊椎動物または哺乳動物を意味し、齧歯類、例えばラットまたはマウス、犬、猫、馬、牛、豚、羊、山羊、七面鳥、鶏、および霊長類、例えば猿を包含するが、これらに限定されない。本開示の方法はそれを必要とする対象を処置することにとって有用である。
いくつかの態様において、本願に記載される組成物は医薬組成物である。薬学的に、本開示に従って用いられ得る組成物は、対象に直接的に投与され得るか、またはそれを必要とする対象に治療上有効量で投与され得る。用語「治療上有効量」は、所望の生物効果を実現するために必要または十分な量を言う。例えば、本開示に関連する組成物の治療上有効量は、標的の疾患（例えば、自己免疫疾患、感染、または癌）の１つ以上の症状を改善するために十分な量であり得る。本願において提供される教示と組み合わせられ、種々の活性化合物から選ぶこととポテンシー、相対的なバイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重症度、および好ましい投与モードなどの因子を秤に掛けることとによって、実質的な毒性を引き起こさずに尚も特定の対象を処置するために全く有効である有効な予防的または治療的処置レジメンが計画され得る。いずれかの特定の適用のための有効量は、処置されようとする疾患もしくは状態、投与されようとする特定の薬学的に組成物、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度などの因子に依存して変わり得る。当業者は、過度の実験作業を要することなしに本開示に関連する特定の治療化合物の有効量を経験的に決定し得る。
送達のための本願に記載される組成物の対象のドーズは、典型的には、投与当たり約０．１μｇから１０ｍｇの範囲であり、これは、適用に依存して、毎日、毎週、または毎月、およびそれらの間のいずれかの他の量の時間で与えられ得る。いくつかの態様においては、シングルドーズが集中的な強化または再強化期間の間に投与される。これらの目的のためのドーズは、投与当たり約１０μｇから５ｍｇ、最も典型的には約１００μｇから１ｍｇの範囲であり得、２～４つの投与が例えば数日もしくは数週、またはより多く離れた間隔であり得る。しかしながら、いくつかの態様において、これらの目的のための非経口的なドーズは、上に記載されている典型的なドーズよりも５から１０，０００倍高い範囲で用いられ得る。
いくつかの態様において、本開示組成物は、約1および１０ｍｇ／ｋｇ哺乳動物の体重の間の用量で投与される。他の態様において、本開示の組成物は、約０．００１および１ｍｇ／ｋｇ哺乳動物の体重の間の用量で投与される。尚も他の態様では、本開示の組成物は、約１０～１００ｎｇ／ｋｇ、１００～５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、または１～５ｍｇ／ｋｇ哺乳動物の体重の間の用量、またはその中のいずれかの個々の用量で投与される。
本開示の組成物は薬学的に許容される溶液として投与され、これらは、慣例的には、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合性の担体、および任意に他の治療薬成分を含有し得る。
治療への使用では、本開示に関連する有効量の組成物は、所望の表面に治療薬剤または化合物を送達するいずれかのモード、例えば粘膜、癌への注射、全身などによって対象に投与され得る。本開示の医薬組成物を投与することは、当業者に公知のいずれかの手段によって達成され得る。好適な投与経路は、経口、非経口、静脈内、筋肉内、経鼻、舌下、経気管、吸入、眼内、膣、直腸、および脳室内を包含するが、これらに限定されない。いくつかの態様において、組成物は静脈内投与される（例えば、注射または輸液による）。
本開示の医薬組成物は、それらを全身送達することが望ましいときには、注射による、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与のために製剤され得る。注射のための製剤は、ユニット剤形で、例えば追加される保存料を有するアンプルまたはマルチドーズ容器として提示され得る。組成物は、油系のまたは水系の基剤中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態を取り得、製剤用の薬剤、例えば懸濁、安定化、および／または分散剤を含有し得る。
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性の形態の活性化合物の水系の溶液を包含する。加えて、活性化合物の懸濁液が、適当な油系の注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒または基剤は、脂肪油、例えば胡麻油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームを包含する。水系の注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。任意に、懸濁液は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、好適な安定化剤または化合物の可溶性を増大させる薬剤をもまた含有し得る。
先に記載された製剤に加えて、組成物はデポ調製物としてもまた製剤され得る。かかる持効性製剤は、好適なポリマー系のもしくは疎水性の材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂によって、あるいは難溶解性の誘導体として、例えば難溶解性塩として製剤され得る。
組成物は好適な固体またはゲル相担体または賦形剤をもまた含み得る。かかる担体または賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー、例えばポリエチレングリコールを包含するが、これらに限定されない。
好適な液体または固体医薬調製物形態は、例えば、吸入のための水系もしくは生理食塩水溶液であるか、マイクロカプセル化されるか、コクリエート化されるか、金微粒子上にコーティングされるか、リポソーム中に含有されるか、ネブライザー化されるか、エアロゾルであるか、皮膚への埋植のためのペレットであるか、または皮膚にスクラッチされるべき鋭利な物体上に乾燥される。医薬組成物は、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルション、懸濁液、クリーム、ドロップ、または活性化合物の長引く放出を有する調製物をもまた包含し、それらの調製においては、賦形剤ならびに添加剤および／または助剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、香料、甘味料、または可溶化剤が上に記載されている通り慣用される。医薬組成物は種々の薬物送達システムへの使用にとって好適である。薬物送達のための方法の簡潔な総説はLanger, Science 249:1527－1533, 1990を見よ。これは参照によって本願に組み込まれる。
本開示の組成物および任意に他の治療薬は、そのままで（ニートで）または薬学的に許容される塩の形態で投与され得る。医療に用いられるときには、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩がその薬学的に許容される塩を調製するために便利に用いられ得る。かかる塩は次の酸から調製されるものを包含するが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン－２－スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、かかる塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩、例えばカルボン酸基のナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩として調製され得る。
好適な緩衝剤は：酢酸および塩（１～２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１～３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５～２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８～２％ｗ／ｖ）を包含する。好適な保存料は塩化ベンザルコニウム（０．００３～０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３～０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１～０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４～０．０２％ｗ／ｖ）を包含する。
本開示の医薬組成物は、任意に薬学的に許容される担体中に包含される本開示の有効量の治療化合物を含有する。用語の薬学的に許容される担体は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与にとって好適である１つ以上の適合性の固体または液体フィラー、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語の担体は、それと活性成分が組み合わせられて適用を容易化する天然のまたは合成の有機または無機成分を指す。医薬組成物のコンポーネントは、所望の薬学的効率を実質的に損なうであろう相互作用がないような様式で、本開示の化合物とおよび互いと混ぜ合わせられることもまたできる。
本開示の医薬組成物は、疾患（例えば、自己免疫疾患、感染、または癌）を処置するための他の治療薬と共に送達され得る。
例１．自己免疫疾患から保護するためにＭＨＣクラスＩＩを標的化するシングルドメイン抗体のモジュール性を操作する。
自己免疫は適応免疫系のコンポーネントによる自己抗原の認識からもたらされる。これは、悪い自己抗原を提示するクラスＩＩのＭＨＣ産物の特定のアレルバリアントとのほとんどの自己免疫疾患のリンクを説明する。自己免疫疾患を処置するためには、抗原特異的な寛容の誘導が高度に望ましいゴールであろう。病理にかかわらず、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は疾患の誘導に必須であり、逆に、ＡＰＣはそれらが非炎症性状態において抗原に遭遇する場合には寛容原性であり得る。本願においては、全てのＡＰＣ上に存在するクラスＩＩのＭＨＣ産物を認識するナノボディが記載され、これは自己免疫疾患の前臨床モデルの実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）においてミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）断片などの自己抗原に酵素的にコンジュゲート化され得る。非炎症性状態におけるこれらの付加体の投与はＥＡＥからの長く持続的な保護を提供する。類似の付加体は、急速なＩ型糖尿病のマウスモデルにおける高血糖および関節リウマチを防止した。自己抗原をナノボディにコンジュゲート化したのみならず、デキサメタゾン誘導体をもまた切断可能なヒドラゾンリンカーによって取り付けた。切断可能なデキサメタゾン誘導体によって修飾されたその同じナノボディとのＭＯＧペプチドを持つクラスＩＩのＭＨＣ特異的なナノボディの同時投与は、既に有症状である動物において疾患の進行を停止させた。これらがクラスＩＩのＭＨＣ陽性細胞であるはずだという事実を除いては、治療有効性の原因である正確な標的細胞集団は同定されないままであるが、これらの知見の実際的な有用性がある。種々の炎症性状態におけるかかる抗体－薬物コンジュゲートの適用は見込みある処置オプションと考えられるべきである。
序論
ヒト集団のおよそ１０％は、軽度から命を脅かすまでの症状によって付随される自己免疫状態を患う。選ばれたケースにおいてのみ、いかに疾患が開始されるのかの確かな説明がある。チェックポイントのブロックを用いる癌の免疫療法は、悪性物の選ばれたセットについては高度に成功するが、免疫ホメオスタシスのブレーキを放すことによって自己免疫を誘発するリスクを伴う。それは、チェックポイントのブロックが適用されるまでは抑止されている害がある自己反応性の細胞の存在を暴く実験的な引き金の明瞭な例である。
自己免疫疾患のための現行の処置は一般的な免疫抑制を包含し、これはあらゆる種類の抗原に対する応答を鈍らせる。これは感染およびことによるとさらには悪性物の増大したリスクに患者を曝す。自己免疫疾患は多くの場合に器官特異的であるので、免疫コンポーネントは、引き金、標的、または２つの何らかの組み合わせとしてどちらかで抗原特異的な要素を包含する。これは、おそらくは、病理が適当な刺激条件における定められた抗原の投与によって誘起され得る自己免疫の種々の前臨床モデルによって最も良く例解される。ある種のヒト自己免疫疾患では、自己免疫応答の過程において病理を誘導し、認識される抗原が公知である。例は、１型糖尿病のケースにおける膵島抗原、多発性硬化症におけるミエリン鞘のコンポーネント、および関節炎のケースにおけるシトルリン化抗原を包含する。
ペプチドをローディングしたＭＨＣ産物から組成されたナノ粒子が、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣの両方に制約された寛容の形態を誘起するために用いられている。さらなる際立った例は、自己抗原によって修飾された赤血球が重度の抗原不応答の状態を誘導する能力である。この形質は、他の細胞型と比較しての例外的なターンオーバー速度と、炎症性応答を引き起こすことなしに赤血球レムナントを消去する必要とに帰せられている。化学修飾されたアポトーシス末梢血リンパ球の輸注もまた自己免疫応答を減退させ得るので、細胞レムナントの寛容原性の消去の現象は赤血球に限定されない。
本願においては、クラスＩＩのＭＨＣ分子を認識するアルパカ由来シングルドメイン抗体断片（ナノボディ／ＶＨＨ）の開発およびキャラクタリゼーションが報告される。これらのナノボディは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を包含する全てのクラスＩＩのＭＨＣ陽性細胞を標的化する。従来の免疫グロブリンのサイズの１０分の１で、ナノボディの小さいサイズは、循環からの優秀な組織浸透および急速なクリアランスを保証する。これは、ＶＨＨを抗原ペプチドまたは低分子薬物などの目当てのペイロードの標的化された送達のための理想的な基剤にする。さらにその上、Ｓ．アウレウス由来トランスペプチダーゼのソルターゼＡを用いる操作戦略を確立した。それはそれらのＣ末端におけるこれらのＶＨＨの部位特異的修飾を可能化した。ソルターゼによって修飾されたクラスＩＩのＭＨＣ特異的なナノボディは陽電子放出断層撮影のためのイメージング剤として用いられた。これの結果は、優秀な標的化特性と対になった短い循環中半減期と整合した。これらの方法は、同様に、感染性のおよび自己免疫性の疾患に関わる広い範囲の抗原のインストールを許した。非炎症性状態における抗原提示細胞の関与は寛容に至り得るが、例えばアジュバントの存在下における炎症性状態における投与は外来抗原に対する強い保護的な応答を誘起し得るという幅広いコンセンサスがある。抗原の価数、凝集状態、およびドーズは、振り子を寛容原から免疫原へと振らせ得る追加のパラメータである。異なる解剖学的部位におけるＡＰＣの多様なセットの分布およびそのダイナミクスは、インビボの該当する寛容原性のＡＰＣの同定にとっての難題を提起する。この研究の目的は、寛容誘導の原因である特定のＡＰＣ（サブ）セットを突き止めることよりは、むしろ、免疫抑制性の低分子デキサメタゾンの標的化された送達を包含する異なる状況においてクラスＩＩのＭＨＣ陽性細胞集団を標的化するためにＶＨＨを用いることの有効性を実証することであった。自己ペプチドをローディングされた精製された樹状細胞の臨床使用は記録事項であるが、純粋に蛋白質性の調製物が同じ趣旨で投与され得る場合には、細胞に基づく治療を回避することには実際的な利点があるであろう。実に、知見は、デキサメタゾンにコンジュゲート化された同じＶＨＨとの組み合わせでのクラスＩＩのＭＨＣＶＨＨ－ペプチド付加体の組み合わせが、疾患の明白な徴候を有する動物においてＥＡＥの進行を阻止することに著しく有効であるということを指示した。
方法
ＶＨＨの発現およびエンドトキシン除去
対応するＶＨＨをコードするプラスミドを含有するＷＫ６のＥ．ｃｏｌｉを、ｌｏｇ期中央まで３７℃でテリフィックブロスプラスアンピシリンによって成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧによって３０℃で一晩誘導した。細菌を４℃での１５分の５，０００×ｇの遠心によって収穫し、それから、リットルの培養当たり２５ｍＬの１×ＴＥＳ緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、０．６５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース）に再懸濁し、撹拌をしながら４℃で１時間に渡ってインキュベーションした。それから、再懸濁された細胞を、０．２５×ＴＥＳ緩衝液中の１：４希釈による浸透圧ショックおよび４℃での一晩のインキュベーションに付した。ペリプラズム画分を４℃での３０分の５，０００×ｇの遠心によって単離し、それから、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭイミダゾール中においてＮｉ－ＮＴＡ（Qiagen）にローディングした。蛋白質を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、および１０％グリセロールによって溶出し、それから、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール中においてSuperdex7510／300カラムにローディングした。ピーク画分を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡに再結合させて、ＬＰＳを枯渇化させた（＜２ＩＵ／ｍｇ）。結合したＶＨＨを４０カラム体積のＰＢＳ＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４によって洗浄し、５００ｍＭイミダゾールを有する２．５カラム体積のエンドトキシンフリーＰＢＳ（Teknova）によって溶出した。イミダゾールを、ＬＰＳフリーＰＢＳによって溶出するＰＤ１０カラム（GE Healthcare）によって除去した。組み換えＶＨＨ純度はＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびＬＣ－ＭＳによって評価した。
ＧＧＧ－抗原、ＧＧＧ－Ｃｙ５、およびＧＧＧ－ＤＥＸの化学合成
ペプチドは標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）プロトコールに従って２－クロロトリチル樹脂（ChemImpex）上で合成するか、またはGenScriptに注文した。ＧＧＧ－Ｃｙ５では、ＧＧＧＣ（配列番号６１）（７．０ｍｇ、２４μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（Sigma Aldrich）（４００μＬ）に溶解し、シアニン５マレイミド（Lumiprobe）（５．０ｍｇ、７．８μｍｏｌ）に追加した。もたらされた混合物は、ＬＣ－ＭＳ分析が残りの出発材料なしを示すまで室温で穏やかに撹拌した。それから、ライゲーションされた産物をＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥した。ＧＧＧ－Ｃｙ５：Ｃ４７Ｈ６２Ｎ８Ｏ８Ｓ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算されたＬＣ－ＭＳは８９８．４４であり、実測８９８．５６であった。もたらされた粉末は４℃で保存した。
ＧＧＧ－デキサメタゾン（ＤＥＸ）では、第１の反応において、デキサメタゾン（Sigma Aldrich）（２５ｍｇ、６４μｍｏｌ）およびＮ－β－マレイミドプロピオン酸ヒドラジド（ThermoFisher）（４０ｍｇ、１３５μｍｏｌ）を３．０ｍＬの乾燥ＭｅＯＨ（Sigma Aldrich）に溶解し、１滴のＴＦＡを溶液に追加した。もたらされた混合物を室温で一晩撹拌した。それから、ＭｅＯＨを蒸発させ、沈殿をＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）に溶解し、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥した。ＤＥＸ－マレイミド：Ｃ２９Ｈ３７ＦＮ３Ｏ７［Ｍ＋Ｈ］＋の計算されたＬＣ－ＭＳは５５８．２６であり、実測５５８．３２であった。もたらされた粉末は－２０℃で保存した。第２の反応において、ＤＥＸ－マレイミド（２０ｍｇ、３６μｍｏｌ）およびＧＧＧＣ（配列番号６１）（２１ｍｇ、７２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ中の５％の０．１ＭのＮａＨＣＯ３（１．０ｍＬ）に溶解した。もたらされた混合物を反応の完了まで室温で撹拌した。ひとたび出発材料がなくなると、反応をＲＰ－ＨＰＬＣによって直接的に精製し、凍結乾燥した。ＧＧＧ－ＤＥＸ：Ｃ３８Ｈ５３ＦＮ７Ｏ１２Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算されたＬＣ－ＭＳは８５０．３５であり、実測８５０．２１であった。もたらされたペプチドは－２０℃で保存し、ソルターゼライゲーション前に適切な濃度で予めＰＢＳに再溶解した。
ＧＧＧを持つ部分によるＶＨＨまたはＧＦＰのＣ末端ソルタグ付け（ＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を用いる
ソルタグ付け反応を、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、トリグリシン含有プローブ（５００μＭ）、ＧＧＧ含有プローブ（１００μＭ）、および５Ｍ－ソルターゼＡ（５μＭ）を含有する１ｍＬ混合物中で実施した。１．５時間の撹拌しながらの４℃におけるインキュベーション後に、未反応のＶＨＨおよび５Ｍ－ＳｒｔＡをＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズへの吸着によって除去した。未結合の画分を濃縮し、過剰な求核剤はアミコン３，０００ｋＤａＭＷＣＯ濾過ユニット（Millipore）によった。反応産物を純度についてＬＣ－ＭＳによって分析し、－８０℃で保存した。
マウス
全ての動物はボストン小児病院（ＢＣＨ）の動物施設で受け入れ、ＢＣＨ動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従って維持した。C５７ＢＬ／６Ｊ（ＣＤ４５．２＋）、Ｂ６．ＳＪＬ－Ｐｔｐｒｃ（ＣＤ４５．１＋）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ６／２Ｄ２、ＮＯＤ／ＢＤＣ２．５、Ｂａｌｂｃ／ＤＯ１１．１０、ＣＤ１１ｃ－ＤＴＲ、μＭＴ－／－、Ｂａｔｆ３－／－、ＬＡＧ３－／－、およびＦｏｘＰ３－ＤＴＲマウスはJackson Laboratoryから購入したかまたは自前で育てたかどちらかであった。ＭＨＣＩＩ－ＧＦＰおよびＰＤ１－／－マウスは自前で育てた。ＯＴＩのＲａｇ２－／－およびＨＬＡ－ＤＲ４－ＩＥ－トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６ＩＡｂヌルマウスはTaconicから購入した。
フローサイトメトリー分析
細胞を脾臓、リンパ節、または他の器官から収穫し、１ｍＬシリンジプランジャーの後ろを用いて４０ミクロンセルストレイナーを通してＲＰＭＩ１６４０に分散した。細胞混合物を低張液リシス（ＮＨ４Ｃｌ）に付して赤血球を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２ｍＭのＥＤＴＡおよび１％ＦＢＳ）によって２回洗浄し、対応する蛍光色素コンジュゲート化抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。全ての染色は、１：１００希釈でＦｃブロックによって３０分に渡って４℃において暗所で実施した。サンプルはさらなる分析前にＦＡＣＳ緩衝液によって２回洗浄した。全てのフローデータはFACS Fortessaフローサイトメータ（BD Biosciences）によって取り込み、FlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いて分析した。
この研究に用いられた抗体は表３に列記されている。
Figure 2023528462000008
Figure 2023528462000009
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデル
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０～１２週齢）またはＣ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景を有する他のマウス系統を、Hookeキット：ＣＦＡ中のＭＯＧ３５－５５のエマルションおよびＰＢＳ中のＰＴＸによって、製造者の説明書に従って免疫化した（Hooke laboratories）。マウスは、免疫化後の第７日に開始して、個々のマウスの実験処置について盲検化された研究者によって、毎日スコア付けされた。マウスをランダムに異なる実験処置に割り付け、ケージ間のばらつきを消去するために一緒に同居させた。図の凡例に指示されている通り、全ての処置は少なくとも３匹のマウスでかつ少なくとも２つの独立した実験によって実施した。全ての動物を分析に包含した。臨床スコアは次の通り定められる：１、尾の下垂；２、部分的な後肢麻痺；３、完全な後肢麻痺；４、完全な後および部分的な前足麻痺；ならびに５、瀕死。ウェットフードおよび水への容易なアクセスを疾患進行中の実験マウスに提供した。別様に指示されない限り、予防的処置では、２０μｇのソルタグ付きＶＨＨ－抗原をＥＡＥの誘導に７日先行して静脈内投与した。治療的処置では、２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５、または２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を混合した２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸを、ＥＡＥの日に投与した。このときに、マウスは、指示されている通り１、２、および３の臨床スコアとして定められる症状を見せた。ＥＡＥ誘導後の第３０日に、またはマウスが４の臨床スコアに達したときに、マウスを窒息によって屠殺し、それから、ＰＢＳ中の５ｍＭのＥＤＴＡを灌流した。脊髄を単離し、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ホルマリン溶液（Sigma）によって固定し、パラフィン包埋し、２０μｍで切片化し、Ｈ＆Ｅまたはルクソールファストブルーによって染色した（ハーバード大学医学部齧歯類組織学コア施設）。染色された切片を４×および１０×倍率でイメージングした。脊髄に浸潤する免疫細胞の単離は、脊髄をホモジナイズすること、次に３８％パーコール（Sigma）勾配分離によって実施した（１００％パーコールは１．１２３ｇ／ｍＬである）。単離された細胞を４８ウェルプレートにプレーティングし、５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（Sigma）および５００ｎｇ／ｍＬイオノマイシン（Sigma）によって２時間に渡って３７℃において完全ＲＰＭＩ培地中で処置し、次に１０μｇ／ｍＬモネンシン（Sigma）の追加をし、もう２時間に渡ってインキュベーションした。それから、細胞を、製造者のプロトコールに従ってＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（ThermoFisher Scientific、００－５５２３－００）を用いて、表面染色し、固定し、透過処理した。細胞内およびＦｏｘｐ３染色を製造者のプロトコールに従って行ない、それから、細胞サンプルをフローサイトメトリーに用いた。
サイトカインストーム分析のために、これらのＥＡＥマウスが３の臨床スコアに達した最初の日に、血液サンプルを、２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９、または２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５＋２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸによる治療的処置の５時間後に取った。血液をＥＤＴＡ含有チューブに収集し、血漿を繰り返しの遠心によって単離した（５００ｇ、５ｍｉｎ、４℃）。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）およびインターロイキン６（ＩＬ－６）のさらなる分析まで、血漿を－８０℃で保存した。ＴＮＦ－α（ThermoFisher、８８－７３２４－２２）およびＩＬ－６（ThermoFisher、８８－７０６４－２２）ＥＬＩＳＡを製造者のプロトコールに従って実施した。
細胞サブセット枯渇化
ＶＨＨ－抗原による予防的処置に２週先行して始め、かつＥＡＥ観察期に渡って、４００μｇの抗ＣＤ８α枯渇化抗体（クローン２．４３、BioXCell）を週２回腹腔内投与することによって、ＣＤ８Ｔ細胞を枯渇化させた。マクロファージサブセットは、予防的処置に２週先行から実験セットアップの終わりまで隔日で３００μｇの抗ＣＳＦ１Ｒ（クローンＡＦＳ９８、BioXCell）を注射することによって取り除かれた。ＤＣを枯渇化させるためには、１００ｎｇのＤＴＸ（Sigma）をＶＨＨ－抗原投与に２日先行してＣＤ１１ｃ－ＤＴＲマウスに腹腔内投与した。Ｔｒｅｇを枯渇化させるためには、ＦｏｘＰ３－ＤＴＲマウスに、ＶＨＨ－抗原による予防的処置に先行して第－９、－８、および－１日に１μｇのＤＴＸ（Sigma）の３ドーズを、かつその後は観察期の終わりまで毎週、腹腔内注射した。細胞枯渇化をＰＢＭＣまたは脾細胞のフローサイトメトリーによって確認した。
２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞養子移入および負荷
２Ｄ２マウスからの脾臓およびｉＬＮ由来ＣＤ４Ｔ細胞を、磁気ビーズ（Miltenyi Biotec、１３０－１０４－４５３）を用いるネガティブセレクションによって濃縮し、Violet CellTrace（ThermoFisher Scientific、Ｃ３４５７１）によって製造者のプロトコールに従って標識した。５００，０００のこれらの２Ｄ２のＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４５．１＋マウスに移入した。２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９、２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５、等モルのＭＯＧ３５－５５ペプチド、または１００μｇのＭＯＧ３５－５５ペプチドの輸注を、アジュバントとしての２５μｇの抗ＣＤ４０（SouthernBiotech）および５０μｇのポリＩ：Ｃ（Sigma）と混合して、養子移入後の日に実施した。第３、５、および１０日に、マウスを屠殺し、脾臓、ｉＬＮ、および血液を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。いくつかの２Ｄ２のＴ細胞養子移入されたマウスには、第３または１０日にもまたＣＦＡ中の１００μｇのＭＯＧ３５－５５を皮下に負荷した。マウスを、それぞれの実験セットアップにおいて指示される通り７または５日後に屠殺した。脾臓、ｉＬＮ、および血液を収穫し、フローサイトメトリーによって分析した。
２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞のＲＮＡ－ｓｅｑ
細胞をソーティングし、β－メルカプトエタノールを足したＲＬＴリシス緩衝液（Qiagen）中でリシスした。ＲＮＡをRNeasyマイクロキット（Qiagen）を用いて製造者のプロトコールに従って単離した。２０ｎｇのＲＮＡを改変されたＳＭＡＲＴ－ｓｅｑ２プロトコールのインプットとして用いた。もたらされたライブラリーはBioanalyzer 2100システム（Agilent）にかけられた高感度ＤＮＡチップを用いて確認し、次に、Nextera XTキット（Illumina）およびカスタムインデックスプライマーを用いて製造者のプロトコールに従ってライブラリー調製をした。最終的なライブラリーを、Qubit dsDNA HSアッセイキット（Invitrogen）およびBioanalyzer 2100システム（Agilent）にかけられた高感度ＤＮＡチップを用いて定量した。全てのライブラリーはNextseq High Output CartridgeキットおよびNextseq 500シーケンサー（Illumina）を用いてシーケンシングした。シーケンシングされたライブラリーはｂｃｌ２ｆａｓｔｑプログラムを用いてデマルチプレックスし、もたらされたＦａｓｔｑデータをTrimmomaticによってトリミングおよびクロップした。マウスｍｍ１０参照ゲノムに対するアラインメントおよび遺伝子発現カウントはKallistoを用いて実施した。主成分分析（ＰＣＡ）をＲで実施した。我々のＲＮＡ－ｓｅｑデータからの差異的な遺伝子発現および個々の座位における差異的なクロマチンアクセス可能性について試験するためには、ＤＥｓｅｑ２法を用いた。火山プロットおよびヒートマップはＰｙｔｈｏｎ３．６によってＮｕｍＰｙ１．１２．１およびＭａｔｐｌｏｔｌｉｂ２．２．２を用いて作出した。機能分析では、Ｇｏｒｉｌｌａ（遺伝子オントロジー濃縮分析・視覚化ツール）を用いて、上位５００の最も差異的に発現された遺伝子の上方制御および下方制御されたサブセットにおいて濃縮された遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語を見出した。
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）モデル
脾臓および鼠径部リンパ節を７～９周齢ＢＤＣ２．５マウスから収穫した。細胞を、０．５μＭのｐ３１ペプチド（ＢＤＣ２．５ミモトープ、GenScript）を足した完全ＲＰＭＩ（２ｍＭのglutaMAX、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５５μＭのβ－メルカプトエタノール、１０％熱非動化ＦＢＳを足したＲＰＭＩ）に再懸濁し、組織培養皿に１００万細胞／ｍＬでプレーティングした。４日後に、細胞を収穫し、２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。５００万細胞を９～１２周齢雌ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに後眼窩注射によって養子移入した。生理食塩水、２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ｐ３１、またはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を指示されている通り１日または５日後にマウスに輸液した。血中グルコース測定を２週に渡って隔日でかつ最高で１～２ヶ月に渡って毎週実施した。対応するAviva Plus検査ストリップ（Accu－Check）にActive測定器（Accu－Chek）（範囲２０～６００ｍｇ／ｄＬ）を用いることによって測定される通り、それらの血中グルコースレベルが爾後の２週に渡って２６０ｍｇ／ｄＬを超えたときには、マウスは糖尿病と考えられた。
マウスは、２ヶ月エンドポイントにおいてまたは血中グルコースレベルが爾後の２週に渡って６００ｍｇ／ｄＬを超えたときに窒息によって屠殺した。膵臓を、さらなる免疫組織化学分析、すなわちＨ＆Ｅ染色のために固定した（ハーバード大学医学部齧歯類組織学コア施設）。マウスの別個のコホートにおいて、脾臓、鼠径部／膵臓リンパ節、および膵臓を養子移入後の第１４日にフローサイトメトリー分析のために収穫した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける関節リウマチ（ＲＡ）モデル
脾臓およびリンパ節をＤＯ１１．１０マウスから収集した。これらのマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ（Miltenyi Biotec、１３０－１０４－４５３）を用いるネガティブセレクションによって濃縮した。ＡＰＣはＤＯ１１．１０脾細胞を２０００ｒａｄで照射することによって得た。これらのナイーブＣＤ４Ｔ細胞からＴｈ１表現型への分化は、それらを次の通り培養することによって誘導した：２００，０００個のＣＤ４＋Ｔ細胞および２００万のＡＰＣを、０．３μＭのＯＶＡ３２３－３３９（GenScript）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１２（PeproTech）、および１０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ４ｍＡｂ（R&D Systems）を含有する完全ＲＰＭＩによって３日に渡って共培養した。それから、細胞を収穫、洗浄、およびカウントした。トータルで２００万のＴｈ１のＤＯ１１．１０Ｔ細胞をＢＡＬＢ／ｃレシピエントに静脈内注射した。Ｔ細胞移入の１日後に、レシピエントをＣＦＡ（Sigma－Aldrich）中の１００μｇのＯＶＡによって皮下に免疫化した。第１１日に、熱凝集ＯＶＡ（ＨＯＡ）をマウスの左足蹠に注射し、足蹠の厚さを第１８日まで毎日測定した。それから、マウスを屠殺し、それらの足蹠を除去し、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ホルマリン溶液（Sigma）で固定し、パラフィン包埋し、２０μｍで切片化し、トルイジンブルーによって染色した（ハーバード大学医学部齧歯類組織学コア施設）。染色された切片を４×および１０×倍率でイメージングした。膝窩リンパ節をもまた収集し、細胞をＩＦＮ－γ産生のために３日に渡って完全ＲＰＭＩ中の１ｍｇ／ｍＬのＯＶＡによってインビトロで再刺激した。ＩＦＮγはマウスＩＦＮ－γＥＬＩＳＡセット（BD Biosciences、５５５１３８）を用いて製造者のプロトコールに従って測定した。血清をもまたＤ１８エンドポイントにおいてＥＬＩＳＡアッセイのために収集して、抗ＯＶＡおよび抗ＯＶＡ３２３－３３９抗体応答を測定した。９６ウェルプレートを１０μｇ／ｍＬのＯＶＡまたはＧＦＰ－ＯＶＡ３２３－３３９（ＧＧＧ－ＯＶＡ３２３－３３９によってＧＦＰ－ＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）をソルタグ付けすることによって作出）蛋白質によってＰＢＳ中において４℃で一晩コーティングし、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋２％ＢＳＡ）中で血清サンプルの追加前にインキュベーションした。試験された血清とのインキュベーションは室温で３時間であった。プレートをＰＢＳによって４回洗浄し、山羊抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（SouthernBiotech）と１：１０，０００でブロッキング緩衝液中において１時間に渡ってインキュベーションし、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）液体基質試薬（Sigma）によって現像した。反応を１ＭのＨＣｌによって止め、吸光度を４５０ｎｍで読んだ。
ＯＴＩのＣＤ８Ｔ細胞養子移入および負荷
脾臓およびリンパ節をＯＴＩのＲａｇ２－／－マウスから収集した。ＯＴＩのＲａｇ２－／－からのＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気ビーズ（Miltenyi Biotec、１３０－０９５－２３６）を用いるネガティブセレクションによって濃縮し、Violet CellTraceによって製造者のプロトコールに従って標識した。５００，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４５．１＋マウスに静脈内移入した。２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＴＩまたはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＲＦ８の輸注を養子移入後の日に実施した。マウスに第１０日にＣＦＡ（Sigma）中の２５μｇのＯＴＩペプチドを負荷し、それから、分析のために５日後に屠殺した。脾臓、ｉＬＮ、および血液を収穫し、脾細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
２００万の脾細胞を９６ウェル丸底プレートにプレーティングし、細胞刺激混合物（eBioscience）およびブレフェルジンＡ（eBioscience）によって３日に渡って３７℃で１ｍｇ／ｍＬのＯＶＡペプチドを足した完全ＲＰＭＩ［ＲＰＭＩ１６４０、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）熱非動化ＦＢＳ、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×ギブコＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Life Technologies）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＨＥＰＥＳ］中において処置した。上清を収集し、ＥＬＩＳＡに利用して、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生を測定した。ＩＦＮγはマウスＩＦＮ－γＥＬＩＳＡセット（BD Biosciences、５５５１３８）を用いて製造者のプロトコールに従って測定した。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＢ１の繰り返しの輸注
ＯＢ１はＯＶＡに由来する１７ｍｅｒのＢ細胞エピトープである。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊレシピエントマウスに２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＢ１、等モル量のＯＶＡ蛋白質、またはＰＢＳを第０日に静脈内注射した。爾後のブーストを第７日および第１４日に実施した。血清サンプルを免疫化前におよび最後のブーストの７日後に収集した。ＯＶＡ特異的なおよびＯＢ１ペプチド特異的なＥＬＩＳＡのためには、９６ウェルプレートを１０μｇ／ｍＬのＯＶＡまたはＧＦＰ－ＯＢ１蛋白質によってＰＢＳ中において４℃で一晩コーティングし、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋２％ＢＳＡ）中で血清サンプルの追加前の追加前にインキュベーションした。試験された血清とのインキュベーションは室温で３時間であった。プレートをＰＢＳによって４回洗浄し、山羊抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（SouthernBiotech）と１：１０，０００でブロッキング緩衝液中において１時間に渡ってインキュベーションし、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）液体基質試薬（Sigma）によって現像した。反応を１ＭのＨＣｌによって止め、吸光度を４５０ｎｍで読んだ。
ＨＬＡ－ＤＲ４－ＩＥ－トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６ＩＡｂヌルマウスにおけるＥＡＥモデル
ＤＲ４－ＩＥマウスを、ＣＦＡ中の乳化された４００μｇのヒトＰＬＰ１７５－１９２（ｈＰＬＰ１７５－１９２）によって皮下に免疫化した。マウスは第０および３日に３００ｎｇの百日咳毒素をもまた静脈内に受けた。第７日に、マウスに、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の乳化された４００μｇのｈＰＬＰ１７５－１９２によって皮下に第２のブーストを与えた。マウスを秤量し、免疫化後の第７日に開始して毎日スコア付けした。臨床スコアシステムはＣ５６ＢＬ／６ＪマウスのＥＡＥモデルと類似に実施した。マウスが３の臨床スコアに達した第１日に、無関係のペプチド対照を持つ２０μｇの抗ヒトＭＨＣＩＩＶＨＨ（ＶＨＨｈＭＨＣＩＩ）または２０μｇのＶＨＨｈＭＨＣＩＩ－ｈＰＬＰ１７５－１９２どちらかを、２０μｇのＶＨＨｈＭＨＣＩＩ－ＤＥＸと混合して静脈内投与した。脊髄のフローサイトメトリーは上の通り記載された。
統計的方法
全てのデータは少なくとも２つの独立した実験を表した。全ての統計分析はＰｒｉｓｍ６を用いて行なった。用いられた統計的方法は各図の対応する凡例に指示されている。統計的に有意な違いは星印によって次の通り指示される：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
結果
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５のシングルドーズは実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘導からの耐久的な保護を提供する。
本願においては、Ｉ－ＡｂおよびＩ－Ａｄを包含する広い範囲のマウスクラスＩＩのＭＨＣ分子を認識するアルパカ由来シングルドメイン抗体（すなわち、ＶＨＨＭＨＣＩＩ）の作出およびキャラクタリゼーションが記載された。このＶＨＨは、ソルターゼ認識モチーフＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を持つように操作されて、少なくとも１つの好適に暴露されたグリシン残基（単数または複数）によって修飾された抗原ペプチドおよび低分子に対するその部位特異的なライゲーションを許した（図１Ａ）。このやり方でＶＨＨにコンジュゲート化された抗原ペプチドが表４に列記されている。精製されたＶＨＨ－ペプチド付加体をＬＣ－ＭＳによってキャラクタリゼーションして（図１Ｂおよび図８）、アイデンティティ、均一性、および純度を検証した。
Figure 2023528462000010
炎症性状態における、すなわち完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在下におけるＭＯＧ３５－５５によるＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫化は、１０～１４日以内に、多発性硬化症様状態の実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）を誘起する。非炎症性状態においてＭＨＣＩＩ＋ＡＰＣに送達されるＭＯＧ３５－５５の先行投与は、ＥＡＥの誘導に干渉することが予測された。症状の発症および重症度に干渉し得るＶＨＨ－ペプチド付加体の可能なドーズを決定するために、２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５付加体の３ドーズを疾患の誘導に７日先行して静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。この処置はＥＡＥの誘導を完全に抑制したが、無関係のペプチドにコンジュゲート化された同一の量のＶＨＨＭＨＣＩＩ（ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９）または無関係の特異的性のＶＨＨ（ＶＨＨＧＦＰ）に連結されたＭＯＧ３５－５５ペプチドを受けたマウスはＥＡＥまで進行した（図１Ｃ）。２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の単回注射であっても完全な保護を達成した（図１Ｄおよび１Ｅ）。よって、このドーズを全ての爾後の実験に用いた。免疫化後の第１５～１８日の有疾患マウスのおよびＥＡＥ誘導後の第３０日の保護されたマウスの脊髄から回収されたＣＤ４＋リンパ球浸潤物のフローサイトメトリーは、観察された疾患スコアと整合した：有疾患マウスは、ＩＬ１７およびＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の顕著な流入およびいくらかのＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を示した（図１Ｆおよび９Ａ～９Ｅ）。ＥＡＥの誘導に先行してＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を受けたマウスからの脊髄切片のＨ＆Ｅおよびルクソールファストブルー染色は、ＥＡＥまで進行した動物からのサンプルとは違って、ミエリン化の保全およびより少ない免疫細胞浸潤を示した（図１Ｇおよび１Ｈ）。結果は、ＥＡＥの誘導に先行して投与されるＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５付加体の単回の２０μｇドーズは疾患の発症を防止するために十分であるということを指示した。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって誘導される保護の耐久性を探究するために、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５のシングルドーズを、ＭＯＧ３５－５５／ＣＦＡ／ＰＴＸカクテルによるＥＡＥの誘導に１または２ヶ月先行して投与した。ＥＡＥの完全な抑制ではなくとも、遅延した発症が観察された（図１Ｉ、１０Ａ、および１０Ｂ）。＜０．５時間であると見積もられる遊離ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の短い循環中半減期にもかかわらず、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５は延長された保護を付与する。ＥＡＥに対する抵抗性の程度を探究するために、保護されたマウスに、最初のＥＡＥ負荷の３７日後に、ＰＴＸの存在下におけるＭＯＧ３５－５５／ＣＦＡの第２の投与を再負荷した。この第２の高度に炎症性の負荷にもかかわらず、マウスは、ひとたび保護されると、ＥＡＥを発生する徴候を示さなかった（図１Ｊ、１１Ａ、および１１Ｂ）。それゆえに、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５のシングルドーズによって呼び起こされる寛容は、その投与の数週後であっても、持続的な保護を提供する。
脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣは抗原特異的な寛容の誘導に関連するＡＰＣである
寛容のＶＨＨＭＨＣＩＩによって媒介される誘導の可能なメカニズムを探求するために、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７（図１２Ａおよび１２Ｂ）を作出し、ＭＨＣＩＩ－ＧＦＰマウスに注射して（ｉ．ｖ．）、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７の生体内分布をフォローした。これらのマウスは、Ｉ－Ａｂ－ＧＦＰ融合体をコードする標的化された遺伝子置き換えを持つ。それは内在性のＩ－Ａｂ座位を置き換え、全てのクラスＩＩのＭＨＣ＋細胞がＧＦＰを発現するということを保証する。注射の１．５時間後に、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７は脾臓および循環中ＭＨＣＩＩ－ＧＦＰ＋細胞集団によって捕捉される（図２Ａおよび１３）。蛍光ＶＨＨＭＨＣＩＩ付加体は、形質細胞様ＤＣではなく、脾臓ＣＤ８ａ＋ＤＣ、ＣＤ４－古典的ＤＣ（ｃＤＣ）、およびＣＤ４＋ｃＤＣを包含するＢ細胞およびＤＣサブセットによって捕捉された（図１３）。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の皮下または腹腔内ではなく静脈内注射はＥＡＥの誘導から保護した（図１４）。これは寛容誘導の部位としての脾臓または血流の役割を仄めかした。よって、２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５（図２Ｂおよび１５Ａ～１５Ｃ）をマウスに注射し（ｉ．ｖ．）、１週後に、脾細胞および全血をドナー細胞のソースとして収穫した。それから、ナイーブマウスは、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５処置された動物からの２０００万の未分画の脾細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を受けた。細胞移入の１日後に、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５－５５＋ＰＴＸを投与してＥＡＥを誘導した（図２Ｂおよび１５Ａ～１５Ｃ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって処置されたマウスからの脾細胞を受けたマウスにおける平均臨床ＥＡＥスコアの有意な縮減があった（図２Ｂおよび１５Ａ～１５Ｃ）。マクロファージおよびＣＤ８Ｔ細胞を、対応する枯渇化抗体：それぞれ抗ＣＦＳ１Ｒ抗体および抗ＣＤ８α抗体を投与することによってインビボで消去した（図２Ｃ、１６Ａ、および１６Ｂ）。ＤＣを枯渇化させるために、ジフテリア毒素（ＤＴＸ）をＣＤ１１ｃ－ＤＴＲ（ジフテリア毒素受容体）マウスに投与した（図２Ｃ、１６Ａ、および１６Ｂ）。Ｂ細胞の可能な関わりを検査するために、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５をＢ細胞を欠くμＭｔマウスに投与した。ＣＤ１１Ｃ＋ＤＣの消去のみが、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって提供される保護の措置を縮減した（図２Ｃ、１６Ａ、および１６Ｂ）。おそらく骨髄系細胞の異なるがオーバーラップするサブセットを標的化する２つのＶＨＨ－ＭＯＧ３５－５５付加体を創出した。これらの付加体は、ＣＤ１１ｂ（ほとんどはマクロファージ上に存在する）を指向するＶＨＨおよびＣＤ１１ｃ（ほとんどは樹状細胞上に存在する）を認識するＶＨＨを包含した（図８）。ＶＨＨＣＤ１１ｃ－ＭＯＧ３５－５５組み合わせのみがＥＡＥの誘導からの中程度のレベルの保護を提供し（図２Ｄおよび１７）、ＣＤ１１ｃ＋細胞の消去からの結果と整合した。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって処置されたＢａｔｆ３－／－マウスはＥＡＥの誘導に対して抵抗性のままであった。よって、この状況では、ＣＤ８α＋ＤＣは寛容原性のＡＰＣのセットに自明には寄与しない（図１８）。
最小限のエピトープだけよりも多くのＶＨＨＭＨＣＩＩによる送達が同様に寛容を誘導し得るかどうかを決定するために、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ１７－７８を作出し、負荷に７日先行してマウスを処置するために用いた。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ１７－７８は同様にＥＡＥの誘導から保護した（図２Ｅおよび２Ｆ）。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の投与は、ＭＯＧ３５－５５特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の激発、次に消耗を誘起する。
定められた抗原特異性のＴ細胞に対するＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５付加体のインパクトを検討するために、２Ｄ２ＴＣＲトランスジェニックマウスを、Ｉ－Ａｂ－ＭＯＧ３５－５５複合体を認識するモノクローナルＣＤ４＋Ｔ細胞のソースとして用いた。コンジェニックにマーキングされたViolet CellTrace標識された２Ｄ２のＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４５．１レシピエントに移入し、次に、１日後にＶＨＨＭＨＣＩＩ－ペプチド付加体の注射（ｉ．ｖ．）をした。脾臓、鼠径部リンパ節（ｉＬＮ）、および血液における２Ｄ２細胞数を１０日に渡って追跡した。脾臓、ｉＬＮ、および血液から回収された２Ｄ２細胞の絶対数、ならびに非侵襲的な陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを用いる全身イメージングによってＣＤ４＋細胞について決定される通り、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を受けたマウスでは、２Ｄ２のＣＤ４＋Ｔ細胞は、拡大の当初の激発、次に注射の５日後の縮小を経過した（図３Ａおよび１９）。この消失は数細胞分裂後に生起した。なぜなら、回収された２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞の全ては抗原を経験しており、Violet CellTrace希釈によって表される通り分裂していたからである（図３Ｂ）。投与されたＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５付加体のものと等モルの量のＭＯＧ３５－５５の送達は、２Ｄ２のＴ細胞のせいぜい～５％の分裂に至った。それゆえに、ＶＨＨＭＨＣＩＩによって媒介される抗原送達はその提示を明瞭に増強する（図３Ｂ）。
ＭＯＧ特異的な２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞はＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の投与によって共抑制性受容体を上方制御する。
これらの結果を裏付けるために、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５レシピエントの２Ｄ２のＴ細胞のトランスクリプトームを調べた。異なる分裂ステージにおける２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞をソーティングし（図３Ｂ）、ＲＮＡｓｅｑ分析を行なった。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の注射は共抑制性受容体転写物および負の制御転写因子を上方制御する。ＬＡＧ３転写物は規模および有意性の両方が突出している（図３Ｃ、３Ｄ、および２０Ａ～２０Ｅ）。蛋白質レベルでは、これらの２Ｄ２のＴ細胞は、Ｔｉｍ３、Ｆａｓ／ＣＤ９５、またはＬＡＰではなくＰＤ１およびＬＡＧ３などのアポトーシスおよび疲弊マーカーのより高いレベルをもまた示した（図３Ｅおよび２１）。注射後の第３日に、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５レシピエントの２Ｄ２のＣＤ４Ｔ細胞は、おそらくは珍しく、ＣＤ４４＋のままでありながら、ＣＤ６２Ｆを下方制御することはなかった（図２１）。ＬＡＧ３－／－マウスをＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５のシングルドーズによって処置し、それからＥＡＥの誘導を負荷したときには、有意な遅延を有してだが保護は失われたが、ＰＤ１－／－マウスは依然としてＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって寛容化された（図３Ｆ）。２Ｄ２ＴＣＲトランスジェニックマウスにおけるＬＡＧ３の欠失は自発的なＥＡＥに至る。活性化したエフェクターＴ細胞およびＴｒｅｇの両方はＬＡＧ３を発現するので、制御性Ｔ細胞の増大がＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって課される寛容に寄与するかどうかを評価した。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の投与はＭＯＧ３５－５５特異的な制御性ＣＤ４Ｔ細胞を誘導する。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって媒介される寛容における制御性Ｔ細胞の役割を暴くために、ＴｒｅｇをＦｏｘｐ３－ＤＴＲマウスにおいてＤＴＸの投与によって消去した（図２２Ａ～２２Ｄ）。処置されたマウスはＴｒｅｇを失い、もはやＥＡＥから保護されず、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって課される寛容へのその寄与を実証した（図２２Ａ～２２Ｄ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の投与はＦｏｘＰ３＋ＭＯＧ３５－５５特異的なＴｒｅｇ数を増大させる（図２２Ａ～２２Ｄ）。Ｔｒｅｇ数の増大に加えて、疲弊マーカーの発現もまたＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の投与によって増大した。最後に、２Ｄ２のＴ細胞を受けたマウスにＭＯＧ３５－５５／ＣＦＡを第１０日に負荷した。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を受けたマウスの２Ｄ２のＴ細胞は応答することはなかったが、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９を注射されたマウスの２Ｄ２のＴ細胞はロバストに増殖した（図３Ｇ）。これは、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５による寛容誘導の抗原特異性を明白にしている。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原付加体は自己免疫の他のモデルにおいてもまた抗原特異的な様式で作用する。
次に、ＶＨＨ－抗原付加体が他の自己免疫性状態に干渉する能力を試験した。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）では、β細胞の自己反応性Ｔ細胞によって媒介される破壊を模倣する積極的なＢＤＣ２．５のＴ細胞養子移入モデルを用いた。ＢＤＣ２．５のＴ細胞受容体を持つトランスジェニックＣＤ４Ｔ細胞は膵β細胞を認識し、ミモトープｐ３１によってエクスビボで活性化され得る。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、かかる活性化したＢＤＣ２．５のＴ細胞は移入後の８日以内に高血糖を引き起こす。ｐ３１をＶＨＨＭＨＣＩＩにコンジュゲート化した（図８）。活性化ＢＤＣ２．５脾細胞を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、１日後に、生理食塩水、２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５、または２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ｐ３１どちらかによって処置した（図４Ａ）。生理食塩水またはｐ３１どちらかによって処置されたマウスは移入後の第８日までに高血糖になった（図４Ａおよび２３Ａ～２３Ｃ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ｐ３１によって処置されたマウスのみが実験の実施期間に渡って正常血糖を維持した（図４Ａおよび２３Ａ～２３Ｃ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ｐ３１処置されたマウスは、より少数のＢＤＣ２．５のＣＤ４Ｔ細胞をそれらの膵臓および二次リンパ器官に有した（図２３Ａ～２３Ｃ）。保護されたマウスの膵島はインタクトなままであった（図４Ｂ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ｐ３１が活性化したＢＤＣ２．５のＴ細胞の移入後の第５日にマウスに投与されたときであっても、軽度の保護効果があった（図２２Ｃ）。丸ごとのインスリン蛋白質をもまたＶＨＨＭＨＣＩＩに取り付けた（図２４）。
関節炎は、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントにおいて、ＯＶＡ３２３－３３９を認識するエクスビボで活性化されたＴｈ１のＤＯ１１．１０のＴ細胞の静脈内移入、次に、１日後にＯＶＡ／ＣＦＡエマルションの足蹠注射および熱凝集オボアルブミン（ＨＡＯ）による１０日後の負荷によって誘導され得る（図４Ｃ）。それから、マウスを、足蹠の厚さを測定することによって、およびＨＡＯの負荷後の第７日における組織学的評価によって、関節炎の発生についてモニタリングした。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９の先行投与はオボアルブミンに対する暴露による関節炎症を縮減したが、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５は効果を有さなかった（図４Ｃおよび２５Ａ～２５Ｅ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９によって処置されたマウスは軟骨破壊のより少数の徴候をもまた示した（図４Ｄ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９によって処置されたマウスの膝窩リンパ節から得られた免疫細胞は、ＯＶＡによってエクスビボで刺激されたときにＩＦＮγを産生することはなかった（図２５Ａ～２５Ｅ）。おそらくは意外なことではなく、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９によって処置されたマウスからの血清は、より低いレベルの抗ＯＶＡおよび抗ＯＶＡ３２３－３３９ＩｇＧ１抗体をもまた有した（図２５Ａ～２５Ｅ）。
組み合わせられたこれらの結果は、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原付加体が活性化した自己反応性のＣＤ４Ｔ細胞によって被らせられる害を縮減する能力を確認している。基礎にあるメカニズム（単数または複数）はマウスＭＨＣハプロタイプ間で保存されているはずである。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原付加体はＣＤ８によって媒介されるＴおよびＢ細胞応答をもまた抑制する。
ＣＤ８Ｔ細胞応答がＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原付加体の投与によって影響されるかどうかを決定するために、ＯＶＡ由来ＣＤ８Ｔ細胞エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｈ－２Ｋｂによって制約されたＯＴＩペプチド）をＶＨＨＭＨＣＩＩに取り付けた（図８）。マウスは、コンジェニックにマーキングされたＯＴＩのＴ細胞、次にＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＴＩまたはＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＲＦ８の注射（アジュバントありまたはなし）を１日後に受けた（図４Ｅ）。ＭＣＭＶに由来するＯＲＦ８エピトープはＨ－２ｂマウスにおいてＣＤ８Ｔ細胞によって認識され、対照としての用をなした。移入後の第１０日におけるＯＶＡ／ＣＦＡによるレシピエントの再負荷は、いずれかの残りのＯＴＩのＴ細胞を活性化することはなかった（図４Ｆ）。Ｂ細胞応答がＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原付加体の投与によって類似に影響されるかどうかを探求するために、ＶＨＨＭＨＣＩＩをＢ細胞特異的なＯＶＡ由来エピトープ（ＯＢ１）によって修飾した（図８）。Ｃ５７ＢＬ／６ＪレシピエントへのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＯＢＩの３つの立て続けの注射は、インタクトなＯＶＡ蛋白質またはＯＢ１ペプチドどちらかに対するＩｇＧ抗体応答を誘起することはなかったが（図４Ｇおよび４Ｈ）、等モル量の遊離ＯＶＡ蛋白質を受けたマウスはかかる抗体を直ちに産生した。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５およびＶＨＨＭＨＣＩＩ－デキサメタゾンの同時送達は治療有効性を増大させる。
それから、ＥＡＥについて既に有症状のマウスへのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５投与のインパクトを探求した。１の臨床スコア（尾の下垂）を発生したマウスへのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の注射は、１６匹のうち９匹のマウスにおいてＥＡＥの進行を停止した（図５Ａおよび２６）。１６匹のうち残りの７匹のマウスの総体的な状態は、見たところではＥＡＥとは無関係に、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の注射後に急速に悪化した（例えば震え；縮減された運動量）。事実、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を受けたマウスの～４０％は、注射に先行したマウスの臨床スコアとの相関なしに、輸液後の日に死んだ。ＩＬ－６およびＴＮＦαの上昇したレベルによって指示される通り、既に炎症した環境への抗原の標的化された送達によって誘起されるサイトカインストームが原因であった（図５Ｃ）。
呼び起こされるＴ細胞応答のポリクローナル的性質およびむしろ表面的な臨床スコア付けシステムは、有疾患コホートの非均一性を含意する。これは、なぜＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５を受けた全ての動物が類似に応答したわけではないのかを説明し得る。それから、免疫抑制薬物を同時送達してサイトカインストームを避けることが可能であり得るかどうかを試験した。自己加水分解性のヒドラゾンリンカーを介してＶＨＨＭＨＣＩＩに取り付けられた免疫抑制性のコルチコステロイドのデキサメタゾンを、クラスＩＩのＭＨＣ＋細胞に送達した（ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸ；図５Ｂおよび２７）。２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５および２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸの組み合わせドーズを受けたマウスは、生残し、自明な副作用なしに、より低い臨床的なＥＡＥ臨床スコアに復帰した（図５Ｄ）。臨床スコアの改善は脊髄における浸潤ＣＤ４Ｔ細胞の縮減に映し出された（図２８）。観察された利益は、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸ付加体の形態でのせいぜい０．５μｇのＤＥＸの同等物を要求した。他方で、遊離ＤＥＸは、ｉ．ｐ．で１００μｇという２００倍高いドーズで投与されたときにのみ保護を提供した（図２９Ａおよび２９Ｂ）。治療範囲は２または３のＥＡＥスコアまで進行した動物まで及び、これらの全ては、再び副作用なしに、疾患進行の阻止によって、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５およびＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸの同時投与に応答した。罹患マウスはさらには疾患スコアの有意な改善を示した（図５Ｅ、５Ｆ、および２８）。驚くべきことに、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＤＥＸの皮下または腹腔内ではなく静脈内送達のみが予防的保護を提供し得るので、投与経路は重要である（図１４）。
自己免疫疾患のヒト化マウスモデルにおける抗ヒトＭＨＣＩＩＶＨＨ（ＶＨＨｈＭＨＣＩＩ）－抗原付加体
広い範囲のヒトクラスＩＩのＭＨＣ分子を認識するＶＨＨ（ＶＨＨｈＭＨＣＩＩ）を開発した。このＶＨＨはソルターゼに即時使用可能なフォーマットで調製し、ヒト起源のいくつかの自己抗原によって修飾した（図６Ａ～６Ｃ）。
ヒトＭＯＧ９７－１０８ペプチド（ＴＣＦＦＲＤＨＳＹＱＥＥ（配列番号５３））、ｈＰＬＰ１７５－１９２ペプチド（ＹＩＹＦＮＴＷＴＴＣＱＳＩＡＦＰＳＫ（配列番号４２））、およびＤＥＸをＶＨＨｈＭＨＣＩＩに取り付けた（図６Ｂ）。同時送達されるこれらの付加体の有効性を、ネズミＭＨＣ－ＩＩを欠くが代わりにヒトＨＬＡ－ＤＲ４のペプチド結合ドメインおよびマウスＩＥの膜近位ドメイン（ＤＲ４－ＩＥ）から組成されたトランスジェニックハイブリッドＭＨＣ－ＩＩ分子を発現するＨＬＡ－ＤＲ４－ＩＥ－トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６ＩＡｂヌルマウスにおいて試験した。ＶＨＨｈＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ９７－１０８は投与の２０日後にマウスのＥＡＥ臨床スコアを縮減した（ｎ＝１、図６Ｂ）。ＶＨＨｈＭＨＣＩＩ－ＯＶＡ３２３－３３９を負の対照として用いた（ｎ＝２、図６Ｂ）。
ＲＡ患者における自己抗体の高頻度の標的は、修飾アルギニン残基のシトルリンを持つフィブリノーゲンなどの翻訳後修飾された抗原である。ゆえに、ＶＨＨｈＭＨＣＩＩをシトルリン化Ｆｉｂα７９－９１によって修飾した（ＱＤＦＴＮＣｉｔＩＮＫＬＫＮＳ（配列番号５０）、図６Ｃ）。それは化学的酵素的アプローチのフレキシビリティーを例解した。これは、遺伝学的方法とは違って、部位特異的な様式での非天然のまたは翻訳後修飾されたアミノ酸の組み込みを直ちに許す。
ＶＨＨＭＨＣＩＩによって媒介される寛容誘導のメカニズムを探究するために、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７を構築して、ＶＨＨＭＨＣＩＩ付加体の生体内分布をフォローした。２０μｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７をクラスＩＩのＭＨＣ－ＧＦＰマウスに静脈内投与した。注射後の１．５時間に、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－Ａｌｅｘａ６４７の大多数はインビボで脾臓ＭＨＣＩＩ－ＧＦＰ＋細胞集団によって捕捉された（図７Ａ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ付加体は、脾臓ＣＤ８α＋ＤＣ、ＣＤ４陰性の古典的ＤＣ、およびＣＤ４＋古典的ＤＣを包含するＤＣの複数のサブセットに送達された（図７Ｂ）。
ＥＡＥモデルにおいて、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５の皮下または腹腔内ではなく静脈内注射はＥＡＥの誘導からの保護を付与した（図１４）。それから、２０ｍｇのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５をマウスに注射し（ｉ．ｖ．）、１週後に、それらの脾細胞を収穫し、トータルで２０００万の脾細胞をレシピエントマウスのコホートに移入した。移入の１日後に、ＥＡＥを誘導した（図７Ｃ）。平均臨床ＥＡＥスコアの有意な縮減があり、未分画の脾細胞であってもＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５によって媒介される寛容を誘導するということを実証した（図７Ｃ）。枯渇化実験を行なって、脾臓ＡＰＣサブセットを標的化した。Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞を、それぞれ対応する枯渇化薬剤の抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＦＳ１Ｒ抗体、およびジフテリア毒素（ＤＴＸ）をＣＤ１１ｃ－ＤＴＲ（ジフテリア毒素受容体）マウスに投与することによって枯渇化させた（図７Ｄ）。おそらくＡＰＣの異なるがオーバーラップするサブセットをＡＰＣ標的化する３つの異なるＶＨＨを同定した：ＣＤ１１ｂ（ほとんどはマクロファージ上に存在する）、ＣＤ１１ｃ（ほとんどは樹状細胞上に存在する）、およびＩｇｋ（Ｂ細胞）。これらのＶＨＨをソルターゼに即時使用可能なフォーマットで発現し、ソルターゼを用いてＧＧＧ－ＭＯＧ３５－５５によって部位特異的に標識した（図８）。ＶＨＨＣＤ１１ｃ－ＭＯＧ３５－５５のみがＥＡＥの誘導からの中程度のレベルの保護を提供した。これは寛容原性のＡＰＣとしてのＣＤ１１ｃ＋細胞の役割を示唆した（図７Ｅ）。
考察
抗原特異的な寛容の誘導は、自己免疫疾患の処置における野心的なゴールである。これは、診断における病理および既存の自己免疫の存在を考える場合にはクリアすべき特に高いバーである。標的細胞の自己免疫破壊は症状が生じる前にはもう既にその途上である。よって、治療は、既存の自己免疫のみならず、当初の傷害を越えたエピトープスプレッディングの可能性にもまた対処しなければならない。有素因集団が一義的に同定され得、それから、無用な副作用を誘起するリスクがそこそこ小さい場合でない限り、予防的処置のいずれかの型は限定された価値であろう。
炎症を抑えることに加えて、大規模な免疫抑制は、感染性疾患の増大したリスクが付き物である自己免疫の処置の防壁である。抗生物質処置はこの欠点を少なくとも部分的に和らげ得るが、望ましくない免疫反応を鈍らせるためのより標的化されたアプローチの探索は優先事項のままである。ほとんどの自己免疫疾患はＴ細胞によって媒介される；Ｔ細胞活性化にはプロフェッショナル抗原提示細胞が関わる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）が炎症性の環境において抗原を取り込む場合には、共刺激分子の上方制御およびサイトカインの適切なミックスの産生がＴ細胞活性化に寄与する。寛容原性の樹状細胞はかかる共刺激シグナルを欠如し、帰結として、非炎症性状態における抗原提示は不応答または寛容の状態を促進する。この概念は寛容原性の樹状細胞の探求を駆動した。樹状細胞は独特の機能的能力を有するサブセットに細分され得る。例えば、抗原クロスプレゼンテーションに関与する能力は、ほとんどＤＣ１サブセットに帰せられる特性である。抗原取り込みに関わる表面受容体の同定は、クロスプレゼンテーション経路への抗原の侵入に特に該当するとしてＤＥＣ２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、およびＣｌｅｃ９ａを同定している。主として抗腫瘍応答などの望ましい免疫の強い誘導因子として追求されているが、無用な応答を縮減する手段として制御性Ｔ細胞を誘導するそれらの能力は劣らず重要と考えられる。
樹状細胞に対するこのむしろ狭いフォーカスは、自己抗原にコンジュゲート化された抗クラスＩＩのＭＨＣ抗体の創出によって、全ての抗原提示細胞上に発現されるクラスＩＩのＭＨＣ産物へと抗原が標的化された以前の仕事に影を投げている。結局は、ＣＤ４Ｔ細胞区画にとっての戦闘号令であるのはクラスＩＩのＭＨＣペプチド複合体である。この理由から、自己抗原を非炎症性状態においてクラスＩＩのＭＨＣ陽性細胞に送達した。種々のＡＰＣサブセットを区別しないが、それでもやはり有効である戦略である。理想的には、製造および適用の両方の観点から、介入は抗原特異的かつ可能な限り単純であるべきである。
このデータは、クラスＩＩのＭＨＣ産物を認識するＭＯＧ３５－５５修飾されたＶＨＨが、マウスをＥＡＥの誘導から保護し得るということを確立している。１０マイクログラムの付加体の単回注射は、ナノボディ－ペプチド付加体の投与後に少なくとも２ヶ月に渡って続く保護を授けた。既にＥＡＥの症状を示す動物（スコア１、２、または３）における同じＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５付加体の投与は、進行を停止させ、さらには部分的に症状の重症度を後退させた。ＥＡＥ症状を有する動物を処置したときには、あるサブセットのみが応答し、残りは、サイトカインストームに帰せられ得る急速な増悪、次に死を示した。有症状の動物では、炎症性の環境が既に存在し、ＡＰＣへのＶＨＨＭＨＣＩＩ－ＭＯＧ３５－５５付加体の送達は火に油を注いだのみであった。この急性応答を克服するために、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－デキサメタゾン付加体を同時送達した。これは、死なしに、生残を劇的に改善した。
アジュバントとしての抗ＣＤ４０およびポリｄＩｄＣの存在下におけるナノボディ－ペプチド付加体の投与は、それらに対する抗体応答を強く向上させた。慢性の炎症性応答がある状況における投与は、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－デキサメタゾン付加体のケースのように、適当な対抗措置が利用可能である場合にのみ可能であろう。
ナノボディの薬物動態特性は、それらを抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の構築にとって魅力的にする。ナノボディはフルサイズの抗体よりもずっと短い循環中半減期を有し、それゆえに、毒性である化合物への全身暴露を最小化する。それらの標的化特性は優秀であり、ひとたび部位にあると、焼身自殺性のリンカーがペイロードを圧倒的に意図される部位において放出するであろうということを保証する。フルサイズの免疫グロブリンに基づくＡＤＣは、最高で数週の期間に渡って継続して循環し、それを介して薬物が取り付けられているリンカーの加水分解によって血流中に直接的にペイロードを放出する。それゆえに、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－デキサメタゾン付加体は、非侵襲的イメージング、短い循環中半減期、および修飾の容易さによって検証される通り、所望の優秀な標的化の特性を有する。ＶＨＨＭＨＣＩＩによって認識される細胞標的は、全てのクラスＩＩのＭＨＣ陽性細胞を包含する。寛容の誘導およびサイトカインストームを誘発することの原因であるＡＰＣは別物である場合であっても、クラスＩＩのＭＨＣに基づく標的化アプローチは自明に両方をカバーするであろう。ナノボディ－薬物付加体は未だそれらのフルサイズのカウンターパートの幅広い範囲の適用を見出していないが、これらのデータは、それが軽視されるべきでない機会であるということを示している。
抗クラスＩＩナノボディが取り付けられたペイロードに対する寛容を誘導する著しい能力の基礎にあるメカニズムについては、ノックアウトマウスでまたは細胞のある種のセットの枯渇化によって見られる応答に基づいて、多くの可能性が排除され得る。ＡＰＣの単一の型が、非炎症性状態において標的化される場合には寛容原性であり、抗原が炎症環境において遭遇される場合には強い応答を誘発し得るかどうかは、依然として未知である。
例２．有効なワクチンとしてのＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原融合蛋白質。
ＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合するシングルドメイン抗体断片（ナノボディまたはＶＨＨ）（ＶＨＨＭＨＣＩＩ）が単離され、ナノモーラーの親和性によってキャラクタリゼーションされた。このワクチンプラットフォームをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のために適応させるために、ＶＨＨＭＨＣＩＩおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメインの間の融合体からなる組み換え蛋白質を作出した（ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ）（図３１Ａ～３１Ｂ）。
ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤの免疫原性を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、２０ｕｇのアジュバントありの（ポリｄＩｄＣおよび抗ＣＤ４０モノクローナル抗体）スパイクＲＢＤ、アジュバントありのＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ、またはアジュバント単独によって腹腔内にプライミングし、爾後に、指示されている通りプライミング後において同種ワクチンによってブーストした（図３１Ｃ）。血清を第３２および１５０日に全ての動物から収集し、ＩｇＧ力価を組み換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤに対してＥＬＩＳＡによって決定した（図３１Ｄ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ融合体による免疫化は、様々な免疫応答を呈したスパイクＲＢＤと比較して、高い力価の抗原特異的なＩｇＧを一貫して産生する。意外なことではなく、循環ＩｇＧの力価は第３２日のサンプル後には落ちるが、第１５０日であっても、スパイクＲＢＤに対する直ちに検出可能な力価が、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤまたはスパイクＲＢＤを受けた全てのマウスで遷延する。第１５０日であっても、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ融合体を受けたマウスの抗体力価は、依然としてスパイクＲＢＤのみのコホートのものを上回る。予測可能に、アジュバントのみを受けたマウスから得られた血清または免疫前血清は、有意な抗スパイクＲＢＤ抗体産生を示さなかった。免疫グロブリンサブクラス分析はクラススイッチングの証拠を明らかにした。なぜなら、高いレベルのＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ｂが当初のドーズの３２日後に検出されたからである（図３１Ｅ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ融合体によって呼び起こされるより強いＩｇＡ応答が特に目立ち、これは気道感染について重要な粘膜保護を提供するであろう。オプソニン化された細胞の補体によって媒介されるリシスに該当するずっと強いＩｇＧ１応答もまた明らかである。
次に、血清学的応答の機能的相関性を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖蛋白質によってシュードタイプ化された水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に対するもたらされる血清の中和能力をアッセイすることによって評価した。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ融合体によって免疫化されたマウスから得られた血清は、スパイクＲＢＤのみによって免疫化されたマウスからのものを上回った（図３１Ｆ）。後者はかなりのマウス間の変動を示すが、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤを受けたマウスからの応答は、より強くかつ個々のマウス間でより一貫していることの両方であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の直接的な標的化の重要性を強調している。これは検出された液性免疫応答のレベルと一致している。
ロバストなＣＤ８＋Ｔ細胞応答はウイルス感染細胞のクリアランスにとって重要である。よって、マウスを、それぞれアジュバントの存在下においてＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤまたはスパイクＲＢＤどちらかのシングルドーズによって免疫化した（図３２Ａ）。１週後に、脾細胞を収穫し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施して、特異的なＴ細胞応答のサロゲート測定としてインビトロでＩＦＮγ産生を誘起することができるペプチドを同定した。オーバーラップする１５ｍｅｒペプチドを用い、強い応答を誘起する５つのペプチド（４２、４７、４８、４９、および５０）を同定した（図３２Ｂ～３２Ｄ）。スパイクＲＢＤによって免疫化されたマウスは、ペプチドのいくつかのみを、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤによって免疫化されたものよりもずっと弱いシグナルで認識し、より少数の数のＩＦＮγを分泌する細胞を指示する。これらの結果は少なくとも２つの刺激性領域をもまた指示している。興味深いことに、ペプチド４７～５０は、循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの公知の変異の外のスパイクＲＢＤ領域に帰属する。選択されたスパイクＲＢＤペプチド（４２、４７、４８、４９、および５０）と脾細胞を共培養することによるＩＦＮγ、ＩＦ６、ＩＦ２、およびＴＮＦαに対するサイトカイン分泌アッセイは、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤによって誘起される優れたＴ細胞応答ををさらに裏付けている（図３２Ｅ）。
ＩＦＮγのソースとしてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を見分けるために、フローサイトメトリーアッセイ、次に細胞内サイトカイン染色を実施した。炎症性サイトカインのほとんどは、ペプチド４２、４７、４８、および４９の混合物との脾細胞のインキュベーションに基づいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答から生じることが観察された（図３２Ｅ）。よって、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－抗原付加体はクロスプレゼンテーションを増強し、スパイクＲＢＤに対する有効なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し得る。
その上、強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答が単に単回の免疫化によって観察され、免疫化後の７日以内に生じる。これは、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する保護的な免疫を提供することができるということを強く示唆している。なぜなら、免疫化されたコホートは、より遅い液性応答が現れることを待ちながら、比較的早くＴ細胞応答を実証するからである。一緒になって、これらのデータは、クラスＩＩのＭＨＣを介してＡＰＣを直接的に標的化することの優越性を指示している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）パンデミックのスケールでは、３ドーズ以上による免疫化は実際的ではないことが蓋然的であるが、尚も、強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答がシングルドーズによる免疫化によって可能であり得る。よって、動物がＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤの２つの逐次的なドーズを受ける実験を実施した（図３３Ａ）。血清中免疫グロブリンを免疫化後に第７、１４、および２１日に追跡した（図３３Ａ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤコホートのトータルＩｇＧは第２のドーズ後の第７日にピークレベルに達し、これらのレベルは第２１日まで遷延した。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ調製物のシングルドーズおよびアジュバントを受けた動物は、全ての時点においてＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤのダブルドーズよりも低い有効性を実証した（図３３Ａ）。アイソタイプスイッチングも検証した（図３３Ｂ）。それから、免疫化された動物からの血清を、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ変異を持つスパイクＲＢＤの認識について試験した。第１４日に得られた血清はこのバリアントスパイクＲＢＤを効率的に認識した（図３３Ｃ）。よって、これらの動物からの血清を、スパイクバリアントの多様なセットを持つシュードタイプ化ＶＳＶの中和について試験した。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤの２ドーズによって免疫化されたマウスからの血清は、試験された全てのバリアントを有効に中和した（図３３Ｄ）。
図３１～３３に記載されている実験は全てワクチン調製物の腹腔内送達に依拠している。ヒトへの使用では、筋肉内送達が好ましい。針不使用のアプローチ、例えば鼻腔内送達は注射の高度に望ましい代替であろう。よって、２週のインターバルで２ドーズで投与されるときに、異なる送達経路が異なるレベルの抗体産生に至るであろうかどうかを検討した（図３４Ａ）。ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤ調製物を腹腔内（ｉ．ｐ）、筋肉内（ｉ．ｍ）、または鼻腔内（ｉ．ｎ）送達した。ｉ．ｐ．およびｉ．ｍ．送達はＩｇＡ応答を誘起したが、鼻腔内送達はそうすることはなかった（図３４Ｂ）。しかしながら、血清中ＩｇＧ産生はワクチン送達の経路には非依存的であるように見えた。全ての３つの送達経路は類似のレベルのトータルの抗スパイクＲＢＤＩｇＧを産した（図３４Ｂ）。
それから、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤワクチン調製物が室温保存および凍結乾燥に耐え、ポテンシーの損失なしに室温において最終的な「乾燥」産物を産し得るかどうかを探究した。試験された全ての保存方法は、先に観察された他のＩｇアイソタイプに加えて、同等のレベルのトータルＩｇＧを産生した（図３４Ｃ）。
別の鍵の考慮事項は、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤワクチンが全ての年齢クラスについて、特に加齢した個体について良く働くであろうかどうかである。よって、ＶＨＨＭＨＣＩＩ－スパイクＲＢＤワクチンを加齢マウスにおいて試験し（７２週齢。５６～６９歳のヒトの年齢と同等）、それはスパイクＲＢＤに対するロバストなトータルの抗体応答を実証した（図３４Ｄ）。
本願において、例えば背景、概要、詳細な記載、例、および／または参照の項において言及される全ての刊行物、特許、特許出願、公開、およびデータベースエントリー（例えば、配列データベースエントリー）は、各個々の刊行物、特許、特許出願、公開、およびデータベースエントリーが具体的にかつ個々に参照によって本願に組み込まれた場合のように、それらの全体が参照によってここに組み込まれる。不一致のケースでは、本願におけるいずれかの定義を包含する本願が優先されるであろう。
同等物および範囲
当業者は、本願に記載される態様の多くの同等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめる能力があるであろう。本開示の範囲は、上の記載に限定されることを意図されず、むしろ添付の請求項において提出される通りである。
それと反対に指示されないかまたは文脈から別様に明らかでない限り、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は１つまたは１つよりも多くを意味し得る。それと反対に指示されないかまたは文脈から別様に明らかでない限り、ある群の２つ以上のメンバーの間に「または」を包含する請求項または記載は、群のメンバーの１つ、１つよりも多く、または全てが存在する場合には満たされていると考えられる。２つ以上の群のメンバー間に「または」を包含する群の開示は、群のメンバーの厳密に１つが存在する態様、群のメンバーの１つよりも多くが存在する態様、および群のメンバーの全てが存在する態様を提供する。簡潔の目的のために、それらの態様は本願において個々には書き出されなかったが、これらの態様のそれぞれは本願において提供され、具体的に請求またはディスクレームされ得るということは理解されるであろう。
本開示は、請求項の１つ以上からのまたは明細書の１つ以上の該当する部分からの１つ以上の限定、要素、クローズ、または記述用語が別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせ、および順列を包摂するということは理解されるべきである。例えば、別の請求項に従属するある請求項は、同じ元の請求項に従属するいずれかの他の請求項に見出される限定の１つ以上を包含するように改変され得る。さらにその上、請求項が組成物を記載するところでは、別様に指示されない限りまたは矛盾もしくは非一貫性が生じるであろうということが当業者に明らかでない限り、本願において開示される作るもしくは用いる方法のいずれかに従って、または当分野において公知の何らかの方法に従って、組成物を作るまたは用いる方法が包含されるということは理解されるべきである。
要素がリストとして例えばマーカッシュ群フォーマットで提示されるところでは、要素のあらゆる可能な下位群もまた開示されるということと、いずれかの要素または要素の下位群が群から除去され得るということとが理解されるべきである。用語「含む」は開放的であることを意図され、追加の要素またはステップの包含を許可するということもまた指摘される。一般的に、態様、産物、または方法が特定の要素、特徴、またはステップを含むと言われるところでは、かかる要素、特徴、またはステップからなるかまたは本質的になる態様、産物、または方法も提供されるということは理解されるべきである。簡潔の目的のために、それらの態様は本願において個々には書き出されなかったが、これらの態様のそれぞれは本願において提供され、具体的に請求またはディスクレームされ得るということは理解されるであろう。
範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上、別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明らかでない限り、範囲として表現される値は、文脈が明瞭に別様に述べていない限り、いくつかの態様において、申し立てられている範囲内のいずれかの具体的な値を、範囲の下限の単位の十分の一までとり得るということは理解されるべきである。簡潔の目的のために、各範囲内の値は本願において個々には書き出されていないが、これらの値のそれぞれが本願において提供され、具体的に請求またはディスクレームされ得るということは理解されるであろう。別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明らかでない限り、範囲として表現される値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとり得、部分範囲のエンドポイントは範囲の下限の単位の十分の一と同じ正確度で表現されるということもまた理解されるべきである。
ウェブサイトが提供されるところでは、ＵＲＬアドレスはそれぞれのウェブアドレスのピリオドを括弧内にした非ブラウザ実行可能なコードとして提供される。実際のウェブアドレスは括弧を含有しない。
加えて、本開示のいずれかの特定の態様は請求項のいずれか１つ以上から明示的に排除され得るということは理解されるべきである。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値は請求項のいずれか１つ以上から明示的に排除され得る。本開示の組成物および／または方法のいずれかの態様、要素、特徴、適用、または側面は、いずれかの１つ以上の請求項から排除され得る。簡潔の目的のために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が排除される態様の全てが本願において明示的に提出されるわけではない。

Claims (66)

  1. （ｉ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する、抗原および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲート；または
    （ｉｉ）第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の１つ以上の表面蛋白質に結合する、抗原にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む第１のコンジュゲート、および抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲート、
    を含む組成物。
  2. ＡＰＣ上の表面蛋白質が、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＤＥＣ２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＣＬＥＣ９ａ、ＣＤ１０３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１ａ、およびＦ４／８０からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  3. 組成物が、抗原および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨがＭＨＣＩＩに結合する、請求項２に記載の組成物。
  4. 組成物が、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する、請求項２に記載の組成物。
  5. ＶＨＨが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３または請求項４に記載の組成物。
  6. ＶＨＨがさらにソルターゼ認識配列をＮ末端またはＣ末端に含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. ソルターゼ認識配列がＬＰＥＴＧ（配列番号２９）を含み、任意に、ソルターゼ認識配列がＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 抗炎症薬剤または抗原がソルターゼ認識配列を介してＶＨＨにコンジュゲート化されている、請求項６または請求項７に記載の組成物。
  9. 抗炎症薬剤がさらに加水分解性のまたは非加水分解性のリンカーを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 組成物が、抗原および抗炎症薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨがＣＤ１１ｃに結合する、請求項２に記載の組成物。
  11. 組成物が、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＣＤ１１ｃに結合する、請求項２に記載の組成物。
  12. ＶＨＨが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。
  13. ＶＨＨがさらにソルターゼ認識配列をＮ末端またはＣ末端に含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. ソルターゼ認識配列がＬＰＥＴＧ（配列番号２９）を含み、任意に、ソルターゼ認識配列がＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 抗炎症薬剤または抗原がソルターゼ認識配列を介してＶＨＨにコンジュゲート化されている、請求項１３または請求項１４に記載の組成物。
  16. 抗炎症薬剤がさらに加水分解性のまたは非加水分解性のリンカーを含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 組成物が、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと抗炎症薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨがＡＰＣ上の異なる表面蛋白質に結合する、請求項２に記載の組成物。
  18. 第１のＶＨＨがＭＨＣＩＩに結合し、第２のＶＨＨがＣＤ１１ｃに結合する、請求項１７に記載の組成物。
  19. 第１のＶＨＨがＤＥＣ２０５に結合し、第２のＶＨＨがＭＨＣＩＩに結合する、請求項１７に記載の組成物。
  20. 抗炎症薬剤がステロイド性抗炎症薬剤であり：デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、およびベタメタゾンからなる群から選択される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 抗炎症薬剤が非ステロイド性抗炎症薬剤であり：アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、シクロスポリンＡ、およびカルシトリオールからなる群から選択される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 抗炎症薬剤が抗炎症性サイトカインであり、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、およびＴＧＦβからなる群から選択される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 抗原がポリペプチド、多糖、炭水化物、脂質、核酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 抗原が自己抗原である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 自己抗原がミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質、ミエリンプロテオリピド蛋白質、シトルリン化フィブリノーゲン、インスリン、クロモグラニンＡ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５キロダルトンアイソフォーム（ＧＡＤ６５）、デスモグレイン１（ＤＳＧ１）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、筋特異的チロシンキナーゼ（ＭｕＳＫ）、リボ核蛋白質から選択される、請求項２４に記載の組成物。
  26. 抗原が、蛋白質補充療法または遺伝子治療に用いられる蛋白質を含む、請求項２３に記載の組成物。
  27. 抗原が第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、およびＡＡＶ由来蛋白質から選択される、請求項２６に記載の組成物。
  28. それを必要とする対象に請求項１～２７のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。
  29. それを必要とする対象に請求項１～２７のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、抗原に対する免疫寛容を誘導する方法。
  30. それを必要とする対象に請求項１～２５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、自己免疫疾患を処置する方法。
  31. 自己免疫疾患が自己免疫性脳脊髄炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、ループス、セリアック病、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 投与が静脈内である、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 対象がヒトである、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. （ｉ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の表面蛋白質に結合する、抗原および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたＶＨＨを含むコンジュゲート；または
    （ｉｉ）第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の１つ以上の表面蛋白質に結合する、抗原にコンジュゲート化されたＶＨＨを含む第１のコンジュゲート、および炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲート、
    を含む組成物。
  35. ＡＰＣ上の表面蛋白質がＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｃ、ＤＥＣ２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＣＬＥＣ９ａ、ＣＤ１０３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１ａ、およびＦ４／８０からなる群から選択される、請求項３４に記載の組成物。
  36. 組成物が、抗原および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨがＭＨＣＩＩに結合する、請求項３５に記載の組成物。
  37. 組成物が、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＭＨＣＩＩに結合する、請求項３５に記載の組成物。
  38. ＶＨＨが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３６または請求項３７に記載の組成物。
  39. ＶＨＨがさらにソルターゼ認識配列をＮ末端またはＣ末端に含む、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の組成物。
  40. ソルターゼ認識配列がＬＰＥＴＧ（配列番号２９）を含み、任意に、ソルターゼ認識配列がＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を含む、請求項３９に記載の組成物。
  41. 炎症促進薬剤または抗原がソルターゼ認識配列を介してＶＨＨにコンジュゲート化されている、請求項３９または請求項４０に記載の組成物。
  42. 炎症促進薬剤がさらに加水分解性のまたは非加水分解性のリンカーを含む、請求項３４～４１のいずれか１項に記載の組成物。
  43. 組成物が、抗原および炎症促進薬剤にコンジュゲート化されたシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を含むコンジュゲートを含み、ＶＨＨがＣＤ１１ｃに結合する、請求項３５に記載の組成物。
  44. 組成物が、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨの両方がＣＤ１１ｃに結合する、請求項３５に記載の組成物。
  45. ＶＨＨが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項４３または請求項４４に記載の組成物。
  46. ＶＨＨがさらにソルターゼ認識配列をＮ末端またはＣ末端に含む、請求項４３～４５のいずれか１項に記載の組成物。
  47. ソルターゼ認識配列がＬＰＥＴＧ（配列番号２９）を含み、任意に、ソルターゼ認識配列がＬＰＥＴＧＧ（配列番号４３）を含む、請求項４６に記載の組成物。
  48. 炎症促進薬剤または抗原がソルターゼ認識配列を介してＶＨＨにコンジュゲート化されている、請求項４６または請求項４７に記載の組成物。
  49. 炎症促進薬剤がさらに加水分解性のまたは非加水分解性のリンカーを含む、請求項４３～４８のいずれか１項に記載の組成物。
  50. 組成物が、抗原にコンジュゲート化された第１のＶＨＨを含む第１のコンジュゲートと炎症促進薬剤にコンジュゲート化された第２のＶＨＨを含む第２のコンジュゲートとを含み、第１のＶＨＨおよび第２のＶＨＨがＡＰＣ上の異なる表面蛋白質に結合する、請求項３５に記載の組成物。
  51. 第１のＶＨＨがＭＨＣＩＩに結合し、第２のＶＨＨがＣＤ１１ｃに結合する、請求項５０に記載の組成物。
  52. 第１のＶＨＨがＤＥＣ２０５に結合し、第２のＶＨＨがＭＨＣＩＩに結合する、請求項５０に記載の組成物。
  53. 炎症促進薬剤が：ＴＬＲ９アゴニスト、ＬＰＳ、ＨＭＧＢ１蛋白質、ＩＬ２、ＩＬ１２、およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、請求項３４～５２のいずれか１項に記載の組成物。
  54. 抗原が、ポリペプチド、多糖、炭水化物、脂質、核酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３４～５３のいずれか１項に記載の組成物。
  55. 抗原が微生物病原体からである、請求項３４～５４のいずれか１項に記載の組成物。
  56. 微生物病原体がマイコバクテリア、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫、またはプリオンである、請求項５５に記載の組成物。
  57. 抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質を含む、請求項３４～５６のいずれか１項に記載の組成物。
  58. 抗原が腫瘍抗原である、請求項３４～５４のいずれか１項に記載の組成物。
  59. 組成物がワクチン組成物である、請求項３４～５８のいずれか１項に記載の組成物。
  60. それを必要とする対象に請求項３４～５９のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  61. それを必要とする対象に請求項３４～５９のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法。
  62. 病原体によって引き起こされる感染を処置する方法であって、方法が、それを必要とする対象に請求項３４～５９のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含み、抗原が微生物病原体からである、方法。
  63. 方法が治療的または予防的である、請求項６２に記載の方法。
  64. 癌を処置する方法であって、方法が、それを必要とする対象に請求項３４～５９のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含み、抗原が腫瘍抗原である、方法。
  65. 投与が静脈内である、請求項６０～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 対象がヒトである、請求項６０～６５のいずれか１項に記載の方法。
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