CN117083079A - 纳米抗体（vhh）缀合物及其用途 - Google Patents

纳米抗体（vhh）缀合物及其用途 Download PDF

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CN117083079A CN202180050059.XA CN202180050059A CN117083079A CN 117083079 A CN117083079 A CN 117083079A CN 202180050059 A CN202180050059 A CN 202180050059A CN 117083079 A CN117083079 A CN 117083079A
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诺瓦利亚·皮谢沙
希德·L·普勒格
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Abstract

本文提供了包含VHH缀合物的组合物及其在治疗疾病中的用途。

Description

纳米抗体(VHH)缀合物及其用途
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年6月2日提交的题为“NANOBODY(VHH)CONJUGATES AND USES THERE OF”的美国临时申请序列号63/033,710和2021年2月26日提交的题为“NANOBODY(VHH)CONJUGATES AND USES THERE OF”的美国临时申请序列号63/154,455的权益，其中每一篇的全部内容通过引用并入本文。
联邦资助研究
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的P01DK011794的政府支持下完成的。政府对本发明有一定的权利。
背景技术
大约10％的人口患有自身免疫病，伴有轻度至危及生命的症状。目前对自身免疫病的治疗包括全身免疫抑制，这种抑制会减弱整个抗原谱上的响应。这使患者感染的风险增加，并甚至可能患上恶性肿瘤。
发明内容
在一些方面中，本公开内容提供了包含一种或更多种缀合物的组合物，所述缀合物包含与抗原和/或药剂(例如，抗炎剂或促炎剂)缀合的单结构域抗体片段(纳米抗体/VHH)，其中所述VHH与抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)上的表面蛋白结合。在一些实施方案中，抗原和药剂(例如，抗炎剂或促炎剂)与同一VHH缀合。在一些实施方案中，抗原和药剂(例如，抗炎剂或促炎剂)与两个VHH缀合。
本文所述的缀合物接合抗原呈递细胞(APC)，其在非炎性条件下可导致耐受，而在炎性条件下的APC接合可引发强的针对外源抗原的免疫应答。在本文中出乎意料地发现，当抗原是自身抗原且药剂是抗炎剂时，本公开内容的组合物与当单独施用VHH-抗原时相比在在对象中诱导免疫耐受和减轻自身免疫病的症状方面显著更有效。类似地，当抗原来自病原体且当药剂是促炎剂时，本公开内容的组合物与当单独施用VHH-抗原时相比在诱导针对抗原和/或病原体的免疫应答方面显著更有效。
本公开内容的一些方面提供了组合物，其包含：
(i)含有与抗原和抗炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合；或者
(ii)含有与抗原缀合的VHH的第一缀合物和含有与抗炎剂缀合的第二VHH的第二缀合物，其中所述第一VHH和所述第二VHH与抗原呈递细胞(APC)上的一种或更多种表面蛋白结合。在一些实施方案中，APC上的表面蛋白选自MHCII、CD11c、DEC205、DC-SIGN、CLEC9a、CD103、CX3CR1、CD1a、和F4/80。在一些实施方案中，靶向部分可被这样的天然或合成多肽替代：所述天然或合成多肽包括但不限于肽片段、单链可变片段(single-chain fragmentvariable，scFv)、双抗体、Fab或类似形式。
在一些实施方案中，所述组合物包含含有与抗原和抗炎剂缀合的VHH的缀合物，其中所述VHH与MHCII结合。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCII结合。在一些实施方案中，VHH包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列。在另一些实施方案中，与抗原或抗炎剂缀合的VHH可具有编码指定缀合物的DNA或RNA分子的形式。
在一些实施方案中，与MHCII结合的VHH还在N末端或C末端包含定位酶识别序列。在一些实施方案中，定位酶识别序列包含氨基酸序列LPETG(SEQ ID NO：29)。在一些实施方案中，定位酶识别序列包含氨基酸序列LPETGG(SEQ ID NO：43)。在一些实施方案中，抗炎剂或抗原通过定位酶识别序列与VHH缀合。在一些实施方案中，抗炎剂还包含可水解或不可水解的接头。在另一些实施方案中，通过遗传融合、其他连接酶(例如，butelase、OaAEP1、subtiligase等)或化学方法(例如，使用2-吡啶甲醛(2-PCA)进行的N末端修饰等)产生缀合物。
在一些实施方案中，所述组合物包含含有与抗原和抗炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与CD11c结合。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合。在一些实施方案中，VHH包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一些实施方案中，与抗原或抗炎剂缀合的VHH可具有编码指定加合物的DNA或RNA分子的形式。
在一些实施方案中，与CD11c结合的VHH还在N末端或C末端包含定位酶识别序列。在一些实施方案中，定位酶识别序列包含氨基酸序列LPETG(SEQ ID NO：29)。在一些实施方案中，定位酶识别序列包含氨基酸序列LPETGG(SEQ ID NO：43)。在一些实施方案中，抗炎剂或抗原通过定位酶识别序列与VHH缀合。在一些实施方案中，抗炎剂还包含可水解或不可水解的接头。在另一些实施方案中，通过遗传融合、其他连接酶(例如，butelase、OaAEP1、subtiligase等)或化学方法(例如，使用2-吡啶甲醛(2-PCA)进行的N末端修饰等)产生缀合物。
在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH与所述APC上的不同表面蛋白结合。在一些实施方案中，第一VHH与MHCII结合，以及第二VHH与CD11c结合。在一些实施方案中，第一VHH与DEC205结合，以及第二VHH与MHCII结合。
在一些实施方案中，所述抗炎剂是选自地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)和倍他米松(bethamethasone)的甾体抗炎剂。在一些实施方案中，所述抗炎剂是选自阿司匹林(aspirin)、塞来昔布(celecoxib)、双氯芬酸(diclofenac)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、奈普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、环孢菌素A和钙三醇的非甾体抗炎剂。在一些实施方案中，所述抗炎剂是选自IL-10、IL-35、IL-4、IL-11、IL-13和TGFβ的抗炎细胞因子。
在一些实施方案中，所述抗原包含多肽、多糖、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。在一些实施方案中，所述抗原是自身抗原。在一些实施方案中，所述自身抗原选自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘蛋白脂质蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原、胰岛素、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶65-千道尔顿同种型(GAD65)、桥粒黏蛋白1(DSG1)、桥粒黏蛋白3(DSG3)、乙酰胆碱受体(AChR)、肌肉特异性酪氨酸激酶(muscle-specific tyrosine kinase，MuSK)、核糖核蛋白。在一些实施方案中，所述抗原包含用于蛋白质替代治疗或基因治疗中的蛋白质。在一些实施方案中，所述抗原选自因子IX、因子VIII、胰岛素和AAV来源的蛋白质。
本公开内容的另一些方面提供了包括向有此需要的对象施用本文所述组合物的方法。在一些实施方案中，施用的组合物包含(i)含有与抗原和抗炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合；或者(ii)含有与抗原缀合的VHH的第一缀合物和含有与抗炎剂缀合的第二VHH的第二缀合物，其中所述第一VHH和所述第二VHH与抗原呈递细胞(APC)上的一种或更多种表面蛋白结合。在一些实施方案中，所述方法用于诱导对抗原的免疫耐受。在一些实施方案中，所述方法用于治疗自身免疫病。在一些实施方案中，自身免疫病选自自身免疫性脑脊髓炎、多发性硬化、I型糖尿病、寻常型天疱疮、重症肌无力、狼疮、乳糜泻和炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)。在一些实施方案中，施用是静脉内的。在一些实施方案中，对象是人。
本公开内容的另一些方面提供了组合物，其包含：
(i)含有与抗原和促炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合；或者
(ii)含有与抗原缀合的VHH的第一缀合物和含有与促炎剂缀合的第二VHH的第二缀合物，其中所述第一VHH和所述第二VHH与抗原呈递细胞(APC)上的一种或更多种表面蛋白结合。在一些实施方案中，APC上的表面蛋白选自MHCII、CD11c、DEC205、DC-SIGN、CLEC9a、CD103、CX3CR1、CD1a、和F4/80。在一些实施方案中，靶向部分可被这样的天然或合成多肽替代：所述天然或合成多肽包括但不限于肽片段、单链可变片段(scFv)、双抗体、Fab或类似形式。
在一些实施方案中，所述组合物包含含有与抗原和促炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与MHCII结合。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCII结合。在一些实施方案中，VHH包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在另一些实施方案中，与抗原或促炎剂缀合的VHH可以具有编码指定缀合物的DNA或RNA分子的形式。
在一些实施方案中，与MHCII结合的VHH还在N末端或C末端包含定位酶识别序列。在一些实施方案中，定位酶识别序列包含氨基酸序列LPETG(SEQ ID NO：29)。在一些实施方案中，定位酶识别序列包含氨基酸序列LPETGG(SEQ ID NO：43)。在一些实施方案中，促炎剂或抗原通过定位酶识别序列与VHH缀合。在一些实施方案中，促炎剂还包含可水解或不可水解的接头。在另一些实施方案中，通过遗传融合、其他连接酶(例如，butelase、OaAEP1、subtiligase等)或化学方法(例如，使用2-吡啶甲醛(2-PCA)进行的N末端修饰等)产生缀合物。
在一些实施方案中，所述组合物包含含有与抗原和促炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与CD11c结合。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合。在一些实施方案中，VHH包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一些实施方案中，与抗原或促炎剂缀合的VHH可具有编码指定缀合物的DNA或RNA分子的形式。
在一些实施方案中，与CD11c结合的VHH还在N末端或C末端包含定位酶识别序列。在一些实施方案中，定位酶识别序列包含氨基酸序列LPETG(SEQ ID NO：29)。在一些实施方案中，定位酶识别序列包含氨基酸序列LPETGG(SEQ ID NO：43)。在一些实施方案中，促炎剂或抗原通过定位酶识别序列与VHH缀合。在一些实施方案中，促炎剂还包含可水解或不可水解的接头。在另一些实施方案中，通过遗传融合、其他连接酶(例如，butelase、OaAEP1、subtiligase等)或化学方法(例如，使用2-吡啶甲醛(2-PCA)进行的N末端修饰等)产生缀合物。
在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH与所述APC上的不同表面蛋白结合。在一些实施方案中，第一VHH与MHCII结合，以及第二VHH与CD11c结合。在一些实施方案中，第一VHH与DEC205结合以及第二VHH与MHCII结合。
在一些实施方案中，促炎剂选自：TLR9激动剂、LPS、HMGB1蛋白、IL2、IL12和CD40L。
在一些实施方案中，所述抗原包含多肽、多糖、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。在一些实施方案中，所述抗原来自微生物病原体。在一些实施方案中，所述微生物病原体是分枝杆菌(mycobacterium)、细菌、真菌、病毒、寄生虫或朊病毒。在一些实施方案中，所述抗原包含SARS-CoV-2刺突蛋白。
在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原。
在一些实施方案中，组合物是疫苗组合物。
本公开内容的另一些方面提供了包括向有此需要的对象施用本文所述的组合物的方法。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)含有与抗原和促炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合；或者(ii)含有与抗原缀合的VHH的第一缀合物和含有与促炎剂缀合的第二VHH的第二缀合物，其中所述第一VHH和所述第二VHH与抗原呈递细胞(APC)上的一种或更多种表面蛋白结合。在一些实施方案中，所述方法用于诱导对抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述抗原来自微生物病原体，并且所述方法用于治疗由病原体引起的感染。在一些实施方案中，所述方法是治疗性或预防性的。在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原，并且所述方法用于治疗癌症。
在一些实施方案中，施用是静脉内的。在一些实施方案中，对象是人。
以上概述意在以非限制性方式示出本文公开的技术的一些实施方案、优点、特征和用途。根据具体实施方式、附图、实施例和权利要求书，本文公开的技术的其他实施方案、优点、特征和用途将变得明显。
附图说明
附图无意按比例绘制。在附图中，各图中描绘的每个相同或几乎相同的组件由相同的数字表示。为了清楚起见，并非在每个附图中都标出每个组件。在附图中：
图1A至图1J：单剂量的VHHMHCII-MOG35-55提供针对EAE的持久保护。(图1A)用携带GGG的抗原肽标记的纳米抗体C末端定位酶的示意图。(图1B)纯化的VHHMHCII和VHHMHCII-抗原加合物的LC-MS。(图1C至1E)如示出的以3个剂量(图1C)、2个剂量(图1D)和1个剂量(图1E)接受VHH-肽预防性处理的小鼠的平均疾病评分。疾病评分：1：尾巴无力(limp tail)；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。**，p＜0.01，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。(图1F)对于接受1个剂量的VHH-抗原的小鼠，在终点时收集的脊髓中Th1和Th17 CD4+淋巴细胞的流式细胞术。还示出了FoxP3+CD4+调节性T细胞的频率。数据显示为平均值+/-SEM。n.s.不显著；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。接受单剂量的VHH-抗原加合物的小鼠脊髓切片的代表性(图1G)H&E和(图1H)勒克司坚牢蓝(Luxol Fast Blue)染色。比例尺，100μm。(图1I)在诱导EAE之前60、30和7天接受VHH-肽预防性处理的小鼠的平均疾病评分。(图1J)用MOG/CFA/PTX和MOG/IFA/PTX进行多次攻击的VHHMHCII-MOG35-55接受者的平均临床评分。*p＜0.05，**p＜0.01，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。
图2A至2F：脾CD11c+树突状细胞通过增强抗原呈递产生VHHMHCII-MOG35-55耐受诱导。(图2A)体内VHHMHCII的生物分布。将VHHMHCII-Alexa 647静脉内注射到MHCII-GFP小鼠中。在注射之后1.5小时，收集脾、全血和腹股沟淋巴结(inguinal lymph node，iLN)，并通过流式细胞术分析。(图2B)接受来自用VHHMHCII-OVA323-339或用VHHMHCII-MOG35-55处理的小鼠之脾细胞和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的小鼠的平均临床评分。(图2C)在EAE诱导之前在指示的细胞亚群耗竭之后，接受用VHHMHCII-OVA323-339或VHHMHCII-MOG35-55进行预防性处理的小鼠的平均临床评分。(图2D)接受指示的VHH-抗原的小鼠的平均疾病评分。(图2E)纯化的VHHMHCII-MOG17-78的LC-MS。(图2F)接受VHH-肽预防性处理的小鼠的平均疾病评分。***p＜0.001，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。
图3A至3G：VHHMHCII-MOG35-55上调MOG35-55特异性CD4 T细胞上的共抑制受体。(图3A)同类系标记(Congenically marked)的CD45.1小鼠在输注VHH-抗原之前一天接受CellTrace Violet标记的CD45.2 2D2 CD4 T细胞。通过流式细胞术确定脾、血液和腹股沟淋巴结(iLN)中2D2 CD4 T细胞的数目。(图3B)Violet trace稀释示出2D2T细胞的增殖。(图3C)在一个单独的实验中，在输注之后第3天，收集脾，根据进行分裂的次数对CD45.2+ CD4+TCRa3.2+ TCRb11+细胞进行分选，并随后进行处理以用于通过RNAseq进行转录组分析。RNA-seq数据的火山图比较了在3次分裂(div 3)之后接受VHHMHCII-MOG35-55的小鼠中的2D2CD4T细胞与从接受VHHMHCII-OVA323-339的小鼠中回收的2D2 CD4 T细胞。(图3D)示出了2D2CD4+ T细胞上共抑制受体表达的热图。(图3E)CellTrace Violet稀释反映了第3天时2D2 T细胞的增殖。VHHMHCII-MOG35-55施用导致2D2 CD4 T细胞上表型标志物的独特模式。示出了代表性的流式图像。每种标志物的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)绘制为平均值+/-SEM。*p＜0.05，**p＜O.01，***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。(图3F)对于示出的遗传背景，接受用VHHMHCII-OVA323-339或VHHMHCII-MOG35-55进行的预防性处理的小鼠的平均疾病评分；***p＜0.001，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。(图3G)对接受CD45.2 2D2 CD4 T细胞的CD45.1小鼠进行攻击，并在第10天输注在CFA中乳化的具有MOG35-55的VHH-抗原。在5天之后收集脾、血液和iLN。与注射VHHMHCII-OVA323-339的小鼠中的2D2T细胞不同，已接受VHHMHCII-MOG35-55的小鼠中的2D2T细胞没有应答。数据显示为平均值+/-SEM；***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。
图4A至4H：VHHMHCII-抗原介导的耐受是抗原特异性的。(图4A)用VHH-抗原或盐水处理的个体小鼠中的血糖水平，以监测T1D进展。当葡萄糖水平＞260mg/dL时，小鼠被视为高血糖。(图4B)已接受单剂量VHH-抗原的小鼠的胰腺切片的代表性H&E染色。比例尺，100μm。(图4C)用VHH-抗原处理的Balb/c小鼠的平均爪厚度，以评估类风湿性关节炎的进展。(图4D)已接受单剂量VHH-抗原的小鼠的关节切片的代表性甲苯胺蓝(Toluidine Blue)染色。比例尺，100μm。(图4E)小鼠(CD45.1+ CD8+ OTI T细胞)在注射VHHMHCII-ORF8604-612或VHHMHCII-OVA257-264(OTI肽)之前一天接受了同种异型标记(allotypically marked)的CD45.2+ CD8+ OTI T细胞。在第10天，用在CFA中乳化的OTI肽攻击小鼠。在5天之后收集脾、iLN和血液，并通过流式细胞术进行分析。(图4F)将脾细胞在补充有OT1肽的完全RPMI中培养3天。收集上清液以通过ELISA测量IFNγ的产生。在从接受了盐水、VHHMHCII-OBI或等摩尔量的游离OVA的三次连续注射的C57BL/6J接受者收集的血清中，通过ELISA测量针对OB1肽(图4G)和OVA蛋白(图4H)的抗体。数据显示为平均值+/-SEM。n.s.不显著；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。
图5A至5F：VHHMHCII-抗原加合物的治疗效力。(图5A)当动物达到疾病评分为1(尾巴无力)时，用单剂量的VHHMHCII-MOG35-55处理的小鼠的平均疾病评分。约40％(7/16)的小鼠死亡，归因于细胞因子风暴。(图5B)纯化的VHHMHCII-DEX的LC-MS和GGG-DEX的结构。(图5C)在共施用或不共施用VHHMHCII-DEX的情况下，用VHH-抗原处理的EAE小鼠中TNFα和IL-6的血清水平。(图5D至5F)在小鼠达到疾病评分为1(图5D)、2(图5E)或3(图5F)的当天，用VHH-肽+/-VHHMHCII-DEX的给药进行处理的小鼠组群的平均和个体疾病评分。***，p＜0.001，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。
图6A至图6C：抗人MHCII VHH(VHHhMHCII)-抗原加合物的效力。(图6A)纯化的VHHhMHCII构建体的LC-MS。VHHhMHCII识别除DRB3*01之外的所有人HLA-DR产物。(图6B)小鼠EAE模型中的VHHhMHCII效力。(图6C)VHHhMHCII-瓜氨酸化纤维蛋白原(CitFib)加合物。CitFib是瓜氨酸化纤维蛋白原肽，具有纤维蛋白原α链第79至91位氨基酸和瓜氨酸化R84。
图7A至7E：VHHMHCII介导的耐受主要由CD11c+APC提供。(图7A和图7B)由VHHMHCII-Alexa 647加合物靶向的血液、脾和iLN APC亚群的流式细胞术分析。(图7C)接受来自接受了VHHMHCII-MOG35-55或VHHMHCII-OVA323-339的小鼠之脾细胞的小鼠的平均临床评分。(图7D)接受VHHMHCII-MOG35-55的小鼠(其中其多种免疫细胞亚群被耗竭)的平均临床评分。(图7E)接受VHHMHCII-MOG35-55或其他VHH-MOG35-55的小鼠的平均临床评分。
图8：纯化的VHHMHCII和VHH-抗原构建体的LC-MS。将VHHMHCII和VHH-抗原构建体纯化并通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析，以验证纯度和身份(identity)。
图9A至9E：脊髓CD4+淋巴细胞浸润与疾病状态相关。如示出的以3个剂量(图9A)、2个剂量(图9C)和1个剂量(图9E)接受VHH-肽预防性处理的每一者的个体临床评分。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。对于接受3个剂量(图9B)和2个剂量(图9D)的VHH-抗原的小鼠，在终点时脊髓中的Th1和Th17浸润性CD4+淋巴细胞的流式细胞术分析。还示出了FoxP3+CD4+调节性T细胞的频率。数据显示为平均值+/-SEM。n.s.不显著；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。
图10A至10B：用VHHMHCII-MOG35-55进行的预防性处理赋予了降低的CD4+淋巴细胞浸润。(图10A)在EAE诱导之前-60、-30和-7天接受VHH-肽预防性处理的每一者的个体临床评分。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。(图10B)对于在示出时间点接受1个剂量的VHH-抗原的小鼠，在终点时脊髓中的Th1和Th17浸润性CD4+淋巴细胞的流式细胞术分析。还示出了FoxP3+CD4+调节性T细胞的频率。数据显示为平均值+/-SEM。n.s.不显著；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。
图11A至11B：用单剂量的VHHMHCII-MOG35-55处理预防了在随后攻击之后的疾病迹象。(图11A)对于接受1个剂量的VHH-抗原随后暴露于多次EAE攻击的小鼠，在终点脊髓中的浸润性CD4+淋巴细胞的流式细胞术分析。数据显示为平均值+/-SEM。(图11B)这些小鼠的脊髓切片的代表性H&E和勒克司坚牢蓝染色。比例尺，100μm。
图12A至12B：VHH荧光团的体外表征。(图12A)携带Alexa 647的未经修饰和经修饰的VHH(即VHHMHCII-Alexa 647和VHH对照-Alexa 647)(通过分拣标记(sortagging)产生)的考马斯(Coomassie)和荧光western印迹。(图12B)MHCII-GFP小鼠脾细胞的流式细胞术分析示出VHHMHCII结合与MHCII表达呈正相关。
图13：VHHMHCII的体内生物分布。将VHHMHCII-Alexa 647静脉内注射到MHCII-GFP小鼠中。在注射之后1.5小时，将脾取出并通过流式细胞术分析。进一步剖析脾GFP+Alexa 647+APC的亚群。cDC(常规DC)；pDC(浆细胞样DC)。
图14：仅静脉内施用VHHMHCII-MOG35-55提供了针对EAE的显著保护。确定递送方式是否影响在EAE中由VHHMHCII-MOG35-55介导的保护。接受静脉内、腹膜内或皮下注射的VHH-肽预防性处理的小鼠的平均临床评分。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。***，p＜0.01，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。
图15A至15C：经VHHMHCII-MOG35-55处理的脾细胞赋予了针对EAE的最有效的保护。(图15A)接受了来自用VHHMHCII-OVA323-339或VHHMHCII-MOG35-55处理的小鼠之脾细胞和外周血单个核细胞(PBMC)的小鼠的个体临床评分。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。***p＜0.001，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。来自(图15A)中实验设置的转移的脾细胞(图15B)和PBMC(图15C)的组成。
图16A至16B：选定细胞亚群的耗竭指示了支持VHHMHCII介导的抗原特异性耐受的细胞类型。(图16A)接受VHHMHCII-OVA323-339或VHHMHCII-MOG35-55预防性处理、具有示出的细胞亚群耗竭的小鼠的个体临床评分。为了耗竭CD8+T细胞，从VHH-抗原施用之前2周开始并在整个EAE观察窗期间，每周两次向小鼠腹膜内(i.p.)注射400μg。从VHH-抗原施用之前2周开始并在整个EAE观察窗期间，每隔一天通过i.p.注射300μg抗CSF1R来耗竭巨噬细胞。最后，为了耗竭DC，在VHH-抗原施用之前2天，向CD11c-DTR小鼠施用(i.p.)单剂量的100ng DTX。(图16B)VHH-抗原施用之前一天CD8+T细胞、巨噬细胞和DC的耗竭的流式细胞术确认。
图17：主要识别树突状细胞的VHH加合物提供了针对EAE的中等水平的保护。接受指定VHH-抗原的小鼠的个体临床评分。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。***p＜0.001，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。
图18：VHHMHCII-MOG35-55在Batf3-/-小鼠中赋予针对EAE的保护，这不依赖于树突状细胞。接受指定的VHH-抗原的野生型C57BL6/J或Batf3-/-小鼠(缺乏CD8a+DC的小鼠)的平均临床评分。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。***p＜0.001，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。
图19：用VHHMHCII-MOG35-55处理之后的CD4+细胞的成像。Rag1-/-小鼠中过继性转移的2D2 CD4 T细胞的非侵入性正电子发射断层成像(positron-emission tomography，PET)-CT成像。简而言之，将2D2 CD4 T细胞过继性转移到Rag1-/-小鼠中，并在一天之后施用VHH-抗原。在第3天和第10天，注射89Zr标记的聚乙二醇化抗CD4scFV，以追踪接受者小鼠全身中2D2 CD4 T细胞的体内分布。
图20A至20E：用VHHMHCII-MOG35-55处理之后2D2 CD4 T细胞群的RNAseq分析。(图20A)在输注VHHMHCII-OVA323-339或VHHMHCII-MOG35-55之前一天，将CellTrace Viole标记的2D2CD4 T细胞过继性转移到同类系标记的CD45.1小鼠。在输注之后第3天，收集脾，并对CD45.2+CD4+TCRa3.2+TCRb11+细胞进行分选，并按指示进行处理，以便通过RNAseq进行集群(bulk)转录组分析。(图20B)由FACS分选的群体遮蔽的RNA-seq数据的主组分图。(图20C)示出了CD4+T细胞的一些转录特征的热图。与来源于接受VHHMHCII-OVA323-339的小鼠的2D2 CD4T相比，在在3次分裂(div 3)之后接受VHHMHCII-MOG35-55的小鼠的2D2 CD4 T细胞中上调(图20D)和下调(图20E)的前500个基因的基因本体分析。
图21：在用VHHMHCII-MOG35-55处理之后2D2 CD4 T细胞中表型标志物的表达。在作为佐剂的PolyI：C/抗CD40存在的情况下，在输注VHHMHCII-MOG35-55、VHHMHCII-OVA323-339或等摩尔MOG35-55肽之前一天，将CellTrace Violet标记的2D2 CD4 T细胞过继性转移到同类系标记的CD45.1小鼠中。在输注之后第3天，收集脾并通过流式细胞术进行分析。CellTraceViolet稀释示出第3天时2D2T细胞的增殖。VHHMHCII-MOG35-55施用导致2D2 CD4 T细胞上表型标志物的独特模式。示出了代表性流式图像，并将每种标志物的平均荧光强度(MFI)绘制为平均值+/-SEM。*p＜0.05，***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。
图22A至22D：对于通过用VHHMHCII-MOG35-55处理所赋予的针对EAE的保护，需要调节性T细胞。(图22A)在具有或不具有调节性T细胞(Treg)耗竭的情况下，接受VHH-肽预防性处理的小鼠的平均临床评分。通过在治疗之前第-9、-8、-1天注射3个剂量的1μg DTX i.p.，以及之后每周以1μg i.p.注射直至终点，使FoxP3-DTR小鼠中的Treg耗竭。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。***，p＜0.001，重复测量的双因素方差分析(ANOVA)。(图22B)在VHH-抗原施用之前一天，FoxP3+Treg细胞的耗竭的流式细胞术确认。(图22C)在输注VHH-抗原之前一天，将2D2CD4 T细胞过继性转移到同类系标记的CD45.1小鼠中。在第3天用在CFA中乳化的MOG35-55进一步攻击小鼠。在7天之后收集脾和iLN。在用VHHMHCII-MOG35-55输注的小鼠中，2D2 T细胞未能像接受VHHMHCII-OVA323-339的小鼠中的2D2T细胞那样有效增殖。数据显示为平均值+/-SEM。*p＜0.05，***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。(图22D)在2D2 T细胞中，FoxP3+细胞增多。数据显示为平均值+/-SEM。**p＜0.01，未配对t检验和Holm-Sidak调整。
图23A至23C：用VHHMHCII-p31处理可预防1型糖尿病(T1D)。(图23A)活化的BDC2.5脾细胞过继性转移之后第1天预防性T1D处理的示意图。图3C中数据的总体正常血糖百分比。p＜0.001，对数秩检验。(图23B)BDC2.5脾细胞过继性转移之后14天，指定器官中浸润性BDC2.5 CD4+T细胞的流式细胞术分析。数据显示为平均值+/-SEM。n.s.不显著；*p＜0.05，***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。(图23C)活化的BDC2.5脾细胞过继性转移之后第5天的半治疗性T1D处理的示意图。测量血糖水平以监测T1D进展。当葡萄糖水平＞250mg/dL时，小鼠被视为患有糖尿病。
图24：胰岛素的N末端甘氨酸很容易充当定位酶亲核体。示意图示出了可作为定位酶亲核体的胰岛素N末端甘氨酸残基，以及产生的VHHMHCII-胰岛素加合物的LC-MS分析。
图25A至25E：用VHHMHCII-OVA323-339处理可降低RA严重程度。(图25A)用VHH-抗原处理的小鼠的个体爪厚度，以评估RA进展。(图25B)热聚集卵清蛋白(heat-aggregatedovalbumin，HAO)攻击之后第3天小鼠爪的代表性图像。(图25C)在终点(在HAO攻击之后第7天)收获的腘淋巴结来源的脾细胞的Th1应答。数据显示为平均值+/-SEM。*p＜0.05，未配对t检验和Holm-Sidak调整。来自(图25A)中所述小鼠的抗卵清蛋白(图25D)和抗OVA323-339(图25E)抗体应答。数据显示为平均值+/-SEM。*p＜0.05，未配对t检验和Holm-Sidak调整。
图26：在EAE初始症状的同时施用VHHMHCII-MOG35-55的小鼠表现出异质性结局。在小鼠达到临床评分为1的当天，用所接受的VHHMHCII-MOG35-55的给药进行处理的小鼠的个体临床评分。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。发现约40％(7/16)的小鼠死于细胞因子风暴。
图27：携带GGG的地塞米松(DEX)的合成。示意图示出了产生VHHMHCII-地塞米松加合物的步骤。
图28：与VHHMHCII-DEX共处理降低了CD4+T细胞的脊髓浸润。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。每只小鼠在终点时脊髓中的Th1和Th17浸润性CD4+淋巴细胞的流式细胞术分析。还示出了FoxP3+CD4+调节性T细胞的频率。数据显示为平均值+/-SEM。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，未配对t检验和Holm-Sidak调整。
图29A至29B：与游离地塞米松共处理需要的剂量比用VHHMHCII-DEX显著更高。在小鼠达到临床评分为1的当天，在存在0.5μg DEX(图29A)或100μg DEX(图29B)的情况下，用所接受的VHHMHCII-MOG35-55的给药进行处理的小鼠的个体临床评分。临床评分：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。发现当只接受0.5μg DEX时，50％(2/4)的小鼠死于细胞因子风暴。
图30A至30C：通过分拣标记的缀合过程的示意图。示意图示出了马来酰亚胺和无铜点击化学分拣标记方法的步骤。
图31A至31F：VHHMHCII-刺突RBD免疫接种诱导了中和假型VSV SARS-CoV-2的高效价、持久的抗刺突RBD抗体。(图31A)VHHMHCII-刺突RBD的设计。(图31B)所产生的VHHMHCII、刺突RBD和VHHMHCII-刺突RBD融合产物的考马斯凝胶。(图31C)免疫接种方案：对C57BL/6J小鼠进行腹膜内疫苗接种，并如所示放血取血清：在免疫接种之前3天收集免疫前(pre-immune)血清。自第一次剂量的免疫接种之后第32天和第150天收集血液。(图31D)对于抗刺突RBD IgG，通过ELISA评价的经免疫接种小鼠(n＝4/组)血清中的体液应答。(图31E)IgM、IgA、IgG1、IgG2b。(图31F)用SARS-CoV-2刺突糖蛋白进行假型化的VSV的中和数据。
图32A至32E：用单剂量的VHHMHCII-刺突RBD融合体免疫接种小鼠迅速引发针对刺突RBD的强T细胞应答。(图32A)免疫接种方案：对C57BL/6J小鼠进行腹膜内疫苗接种，并收获脾用于T细胞测定。(图32B)所产生的用于ELISPOT分析的刺突RBD氨基酸序列和肽的示意图。(图32C)在用仅佐剂、刺突RBD+佐剂或VHHMHCII-刺突RBD+佐剂(其中刺突RBD被截短为15聚体肽(10个氨基酸重叠)，并表示为肽1至53)疫苗接种的小鼠中，刺突RBD特异性T细胞的ELISPOT分析。(图32D)用示出的肽培养之后第3天脾细胞的细胞因子分泌。(图32E)在与或不与肽混合物(肽42+47+48+49)孵育6小时之后，脾细胞的流式细胞术分析。
图33A至33D：两个剂量的VHHMHCII-刺突RBD疫苗接种足以产生针对SARS-CoV-2的多种变体的持续和中和抗体效价。(图33A)对于抗刺突RBD IgG，通过ELISA评价的经免疫接种小鼠(n＝4/组)血清中的体液应答的动力学。(图33B)IgM、IgA、IgG1、IgG2b。(图33C)针对具有K417T、E484K、N501Y突变的刺突RBD蛋白的经免疫接种小鼠的抗体效价。(图33D)用SARS-CoV-2刺突糖蛋白Wuhan+D418G以及其他变体进行假型化的VSV的中和数据。
图34A至34D：在衰老小鼠中，无论递送模式、储存条件、冻干法和次优免疫力如何，VHHMHCII-刺突RBD加合物均引起强抗体应答。(图34A)免疫接种时间线。(图34B)使用不同递送模式的经免疫接种小鼠的血清中的抗刺突RBD IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2b。(图34C)使用不同制剂储存条件的经免疫接种小鼠的血清中的抗刺突RBD IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2b。(图34D)在衰老小鼠中抗体产生的效力。通过ELISA评价抗体效价(n＝4/组)。
具体实施方式
在一些方面中，本公开内容提供了包含一种或更多种缀合物(在实施例和附图中也称为“加合物”)的组合物、使用这样的组合物以诱导对所述抗原的免疫耐受的方法、以及使用这样的组合物治疗自身免疫病的方法，所述缀合物包含与抗原(例如，需要免疫耐受的抗原，例如用于治疗的自身抗原或外源性酶)和/或抗炎剂缀合的单结构域抗体片段(纳米抗体/VHH)，其中所述VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合。在一些实施方案中，组合物包含含有与抗原(例如，需要免疫耐受的抗原)和抗炎剂缀合的VHH的缀合物，其中所述VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫耐受的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH与抗原呈递细胞(APC)上的一种或更多种表面蛋白结合。
本公开内容的另一些方面提供了包含一种或更多种缀合物的组合物、使用这样的组合物诱导对所述抗原的免疫应答的方法、以及使用这样的组合物治疗感染(例如，由病原体引起的)和癌症的方法，所述缀合物包含与抗原(例如，需要免疫应答的抗原，例如来自病原体的抗原或肿瘤抗原)和/或促炎剂缀合的VHH，其中所述VHH与APC上的表面蛋白结合。在一些实施方案中，组合物包含含有与抗原(例如需要免疫应答的抗原，例如来自病原体的抗原或肿瘤抗原)和促炎剂缀合的VHH的缀合物，其中所述VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如需要免疫应答的抗原，例如来自病原体的抗原或肿瘤抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH与抗原呈递细胞(APC)上的一种或更多种表面蛋白结合。
VHH和缀合物
本公开内容的缀合物包含单结构域抗体(也称为纳米抗体或VHH)。本文中使用的“单结构域抗体片段”、“纳米抗体”或“VHH”是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。已知骆驼科动物产生仅重链抗体(例如，如Hamers-Casterman et al.，1992中所述，通过引用并入本文)。这些仅重链抗体的单结构域可变片段被称为VHH或纳米抗体。VHH保留抗体共有的免疫球蛋白折叠，使用三个高变环(CDR1、CDR2和CDR3)，与其靶标结合。许多VHH以类似于常规全尺寸抗体的亲和力与其靶标结合，但具有优于它们的其他特性。因此，VHH是用于生物学研究和治疗学的有吸引力的工具。VHH的大小通常为10至15kDa，并在大肠杆菌(E.coli)的胞质溶胶和周质二者中均可以以高产率重组表达。在哺乳动物胞质溶胶中，VHH可以与其靶标结合。VHH片段(如)是来源于骆驼科重链抗体的重组、抗原特异性、单结构域、可变片段。虽然它们很小，但VHH片段保留了完整抗体的完整抗原结合能力。与传统抗体相比，VHH尺寸小、高度可溶且稳定，且具有更多组可及表位。它们也易于用作本文所述嵌合受体的胞外靶标结合部分，因为不需要重新格式化。
在一些实施方案中，本文中所述缀合物中使用的VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合。“抗原呈递细胞(APC)”是指在其表面展示与主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complexe，MHC)复合的抗原的细胞，这一过程被称为抗原呈递。T细胞可使用其T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别这些复合物。几乎所有的细胞类型都可以以某种方式呈递抗原。它们存在于多种组织类型中。本文中使用的术语“抗原呈递细胞”是指专业抗原呈递细胞，包括但不限于巨噬细胞、B细胞和树突状细胞。抗原呈递细胞在有效的适应性免疫应答中发挥重要作用，因为细胞毒性T细胞和辅助T细胞二者的功能都依赖于APC。抗原呈递允许适应性免疫的特异性，并可有助于针对胞内病原体和胞外病原体二者的免疫应答。它还参与防御肿瘤。一些癌症治疗涉及创建人工APC，以启动适应性免疫系统靶向恶性细胞。另外，APC还通过向T细胞呈递自身抗原而在免疫耐受中发挥作用，如Best etal.，Front Immunol.2015；6：360中所述，通过引用并入本文。
除了MHC蛋白家族，抗原呈递还需要APC和T细胞二者表面上的其他特化信号传导分子。在一些实施方案中，本文所述的缀合物包含与APC表面上的蛋白质结合的VHH，从而与APC接合。可被本文所述缀合物中的VHH靶向的APC上的表面蛋白的非限制性实例包括但不限于：主要组织相容性复合体II(MHCII)、整合素、αX(CD11c)、淋巴细胞抗原75(DEC205，也称为CD205)、树突状细胞特异性ICAM-3捕获非整合素1(DC-SIGN)、含有9A的C型凝集素结构域(C-Type Lectin Domain Containing 9A，CLEC9a)、整合素、αE(CD103)、C-X3-C基序趋化因子受体1(CX3CR1)、分化簇1a(CD1a)、和含EGF样模块的黏蛋白样激素受体样1(F4/80，也称为EMR1)。
在一些实施方案中，本文所述缀合物中的VHH与APC上的一种表面蛋白(例如但不限于MHCII、CD11c、DEC205、DC-SIGN、CLEC9a、CD103、CX3CR1、CD1a、或F4/80)结合。在一些实施方案中，本文所述缀合物中的VHH是双特异性或多特异性的。在一些实施方案中，本文所述缀合物中的VHH与APC中的一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)表面蛋白结合。根据本公开内容，可以使用与APC上的表面蛋白结合的任何已知的VHH。
在一些实施方案中，VHH与MHCII结合。与MHCII结合的VHH已有描述，例如在美国专利号US9751945中，通过引用并入本文。表1中提供了与MHCII结合的VHH的一个实例的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述缀合物中的VHH包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述缀合物中的VHH包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有80％、85％、905、95％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述缀合物中的VHH包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VHH与CD11c结合。与CD11c结合的VHH已有描述，例如在Bannaset al.，Front Immunol.2017；8：1603中，通过引用并入本文。表1中提供了与CD11c结合的VHH的一个实例的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述缀合物中的VHH包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述缀合物中的VHH包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述缀合物中的VHH包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
表1.与APC上的表面蛋白结合的VHH的实例
在一些实施方案中，本文所述缀合物中的任何一种VHH包含另外的序列，例如定位酶识别序列(例如，如美国专利号US9751945中所述，通过引用并入本文)。从革兰氏阳性菌中鉴定为“定位酶”的酶在完整细胞壁中将蛋白质切割并转移至蛋白聚糖部分。在已从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中分离出的定位酶中，存在定位酶A(SrtA)和定位酶B(SrtB)。
在一些实施方案中，定位酶的识别序列(例如在N末端或C末端)还包含一个或更多个另外的氨基酸。例如，可以并入一个或更多个氨基酸(例如，多至5个氨基酸)，所述氨基酸与天然存在的定位酶底物中5氨基酸识别序列N末端或C末端紧邻存在的氨基酸具有同一性。这样的另外的氨基酸可提供改善识别基序的识别的背景。
基于来自革兰氏阳性菌基因组的61种定位酶的序列比对和系统发育分析，定位酶已被分为4类，分别定名为A、B、C和D(Dramsi S，Trieu-Cuot P，Bierne H，Sortingsortases：a nomenclature proposal for the various sortases of Gram-positivebacteria.Res Microbiol.156(3)：289-97，2005.)。这些类别对应于以下亚家族(Comfort和Clubb(Comfort D，Clubb R T.A comparative genome analysis identifies distinctsorting pathways in gram-positive bacteria.Infect Immun.，72(5)：2710-22，2004)也已将定位酶分类为以下亚家族)：A类(亚家族1)、B类(亚家族2)、C类(亚家族3)、D类(亚家族4和5)。上述参考文献公开了许多定位酶和识别基序。另参见Pallen，M.J.；Lam，A.C.；Antonio，M.；Dunbar，K.TRENDS in Microbiology，2001，9(3)，97-101。本领域的技术人员将能够容易地基于其序列和/或其他特征(例如上述Drami，et al.中描述的那些)将定位酶分配到正确的类别。术语“定位酶A”在本文中用于指A类定位酶，在任何特定的细菌物种中通常命名为SrtA，例如来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的SrtA。同样地，“定位酶B”在本文中用于指B类定位酶，在任何特定的细菌物种中通常命名为SrtB，例如来自金黄色葡萄球菌的SrtB。
在一些实施方案中，用于产生本文所述缀合物的定位酶是定位酶A(SrtA)。SrtA识别基序LPXTG(SEQ ID NO：25)，常见的识别基序为例如LPKTG(SEQ ID NO：26)、LPATG(SEQID NO：27)、LPNTG(SEQ ID NO：28)。在一些实施方案中，使用LPETG(SEQ ID NO：29)。然而，不属于这种共有物(consensus)的基序也可被识别。例如，在一些实施方案中，基序在第4位包含“A”而不是“T”，例如LPXAG(SEQ ID NO：30)，例如LPNAG(SEQ ID NO：31)。在一些实施方案中，基序在第5位包含“A”而不是“G”，例如LPXTA(SEQ ID NO：32)，例如LPNTA(SEQ ID NO：33)。在一些实施方案中，基序在第2位包含“G”而不是“P”，例如LGXTG(SEQ ID NO：34)，例如LGATG(SEQ ID NO：35)。在一些实施方案中，基序在第1位包含“I”而不是“L”，例如IPXTG(SEQ ID NO：36)，例如IPNTG(SEQ ID NO：37)或IPETG(SEQ ID NO：38)。
在一些实施方案中，用于产生本文所述缀合物的定位酶是定位酶B(SrtB)，例如金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌(B.anthracis)或单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)的定位酶B。B类定位酶(SrtB)识别的基序通常属于共有序列NPXTX(SEQ ID NO：39)，例如NP[Q/K]-[T/s]-[N/G/s]，如NPQTN(SEQ ID NO：40)或NPKTG(SEQ ID NO：41)。例如，金黄色葡萄球菌或炭疽杆菌的定位酶B在各自的细菌中切割IsdC的NPQTN(SEQ ID NO：40)或NPKTG(SEQID NO：41)基序(参见，例如Marraffini，L.and Schneewind，O.，Journal ofBacteriology，189(17)，p.6425-6436，2007)。在B类定位酶的推定底物中存在的其他识别基序是NSKTA(SEQ ID NO：44)、NPQTG(SEQ ID NO：45)、NAKTN(SEQ ID NO：46)和NPQSS(SEQID NO：47)。例如，单核细胞增生李斯特菌的SrtB识别在第2位缺失P和/或在第3位缺失Q或K的某些基序，如NAKTN(SEQ ID NO：46)和NPQSS(SEQ ID NO：47)(Mariscotti J F，Garcia-Del Portillo F，Pucciarelli M G.The listeria monocytogenes sortase-Brecognizes varied amino acids at position two of the sorting motif.J BiolChem.2009 Jan.7[预印版])。
在一些实施方案中，用于产生本文所述缀合物的定位酶是C类定位酶。C类定位酶可利用LPXTG(SEQ ID NO：25)作为识别基序。
在一些实施方案中，定位酶是D类定位酶。预测该类中的定位酶识别具有共有序列NA-[E/A/S/H]-TG的基序(Comfort D，上文)。已发现D类定位酶，例如在链霉菌属(Streptomyces spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、惠普尔养障体(Tropherymawhipplei)、嗜热放线菌(Thermobifida fusca)、和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlonghum)中。LPXTA(SEQ ID NO： 32)或LAXTG(SEQ ID NO：48)可分别充当例如亚家族4和5的D类定位酶的识别序列，亚家族4和亚家族5酶分别加工基序LPXTA(SEQ ID NO：32)和LAXTG(SEQ ID NO：48)。例如，D类定位酶炭疽杆菌定位酶C已显示特异性切割炭疽杆菌BasI和BasH中的LPNTA(SEQ ID NO：33)基序(Marrafini，上文)。
在一些实施方案中，可以使用天然存在的定位酶的变体。这样的变体可以通过例如定向进化、位点特异性修饰等过程产生。例如，已鉴定出与起始野生型酶相比具有多至140倍高的LPETG(SEQ ID NO：29)偶联活性的金黄色葡萄球菌定位酶A的变体(Chen，I.，etal.，PNAS 108(28)：11399-11404，2011)。在一些实施方案中，定位酶变体包含相对于野生型金黄色葡萄球菌SrtA的以下替换中的任何一种或更多种：P94S或P94R、D160N、D165A、K190E和K196T突变。示例性野生型金黄色葡萄球菌SrtA序列(基因ID：1125243，NCBIRefSeq Acc.号NP_375640)如下所示：
定位酶标记可用于将反应性化学部分(例如，点击化学途径(click chemistryhandle))安装到VHH上，例如US9751945中所述，通过引用并入本文。点击化学途径可用于使VHH与其他试剂(例如，抗原、抗炎剂和/或促炎剂)缀合。在一些实施方案中，定位酶识别序列位于VHH的N末端。在一些实施方案中，定位酶识别序列位于VHH的C末端。
在一些实施方案中，通过定位酶介导的标记(称为“分拣标记”)将反应性化学部分安装到VHH上。点击化学途径是提供可参与点击化学反应的反应基团的化学部分。点击化学反应和用于点击化学反应的合适的化学基团是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于末端炔烃、叠氮化物、环炔烃(strained alkyne)、二烯、亲二烯体(dieneophile)、烷氧基胺、羰基、膦、酰肼、硫醇和烯烃。例如，在一些实施方案中，在点击化学反应中使用叠氮化物和炔烃。适用于本文所述蛋白质缀合方法的另外的点击化学途径是本领域技术人员公知的，并且这样的点击化学途径包括但不限于以下中所述的点击化学反应伴侣、基团和途径：
[1]H.C.Kolb，M.G.Finn，K.B.Sharpless，Angew.Chem.2001，113，2056-2075；Angew.Chem.Int.Ed.2001，40，2004-2021.[2]a)C.J.Hawker，K.L.Wooley，Science 2005，309，1200-1205；b)D.Fournier，R.Hoogenboom，U.S.Schubert，Chem.Soc.Rev.2007，36，1369-1380；c)W.H.Binder，R.Sachsenhofer，Macromol.Rapid Commun.2007，28，15-54；d)H.C.Kolb.K.B.Sharpless，Drug Discovery Today 2003，8，1128-1137；e)V.D.Bock，H.Hiemstra，J.H.van Maarseveen，Eur.J.Org.Chem.2006，51-68.[3]a)V.O.Rodionov，V.V.Fokin，M.G.Finn，Angew.Chem.2005，117，2250-2255；Angew.Chem.Int.Ed.2005，44，2210-2215；b)P.L.Golas，N.V.Tsarevsky，B.S.Sumerlin，K.Matyjaszewski，Macromolecules 2006，39，6451-6457；c)C.N.Urbani，C.A.Bell，M.R.Whittaker，M.J.Monteiro，Macromolecules 2008，41，1057-1060；d)S.Chassaing，A.S.S.Sido，A.Alix，M.Kumarraja，P.Pale，J.Sommer，Chem.Eur.J.2008，14，6713-6721；e)B.C.Boren，S.Narayan，L.K.Rasmussen，L.Zhang，H.Zhao，Z.Lin，G.Jia，V.V.Fokin，J.Am.Chem.Soc.2008，130，8923-8930；f)B.Saba，S.Sharma，D.Sawant，B.Kundu，Synlett2007，1591-1594.[4]J.F.Lutz，Angew.Chem.2008，120，2212-2214；Angew.Chem.Int.Ed.2008，47，2182-2184.[5]a)Q.Wang，T.R.Chan，R.Hilgraf，V.V.Fokin，K.B.Sharpless，M.G.Finn，J.Am.Chem.Soc.2003，125，3192-3193；b)J.Gierlich，G.A.Burley，P.M.E.Gramlich，D.M.Hammond，T.Carell，Org.Lett.2006，8，3639-3642.[6]a)J.M.Baskin，J.A.Prescher，S.T.Laughlin，N.J.Agard，P.V.Chang，I.A.Miller，A.Lo，J.A.Codelli，C.R.Bertozzi，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007，104，16793-16797；b)S.T.Laughlin，J.M.Baskin，S.L.Amacher，C.R.Bertozzi，Science 2008，320，664-667；c)J.A.Johnson，J.M.Baskin，C.R.Bertozzi，J.F.Koberstein，N.J.Turro.Chem.Commun.2008，3064-3066；d)J.A.Codelli，J.M.Baskin，N.J.Agard，C.R.Bertozzi，J.Am.Chem.Soc.2008，130，11486-11493；e)E.M.Sletten，C.R.Bertozzi，Org.Lett.2008，10，3097-3099；f)J.M.Baskin，C.R.Bertozzi，QSAR Comb.Sci.2007，26，1211-1219.[7]a)G.Wittig，A.Krebs，Chem.Ber.Reel.1961，94，3260-3275；b)A.T.Blomquist，L.H.Liu，J.Am.Chem.Soc.1953，75，2153-2154.[8]D.H.Ess，G.O.Jones，K.N.Houk，Org.Lett.2008，10，1633-1636.[9]W.D.Sharpless，P.Wu，T.V.Hansen，J.G.Lindberg，J.Chem.Educ.2005，82，1833-1836.[10]Y.Zou，J.Yin，Bioorg.Med.Chem.Leu.2008，18，5664-5667.[11]X.Ning，J.Guo，M.A.Wolfert，G.J.Boons，Angew，Chem.2008，120，2285-2287；Angew.Chem.Int.Ed.2008，47，2253-2255.[12]S.Sawoo，P.Dutta，A.Chakraborty，R.Mukhopadhyay，O.Bouloussa，A.Sarkar，Chem.Commun.2008，5957-5959.[13]a)Z.Li，T.S.Seo，J.Ju，Tetrahedron Lett.2004，45，3143-3146；b)S.S.van Berkel，A.J.Dirkes，M.F.Debets，F.L.van Delft，J.J.L.Cornelissen，R.J.M.Nolte，F.P.J.Rutjes，ChemBioChem 2007，8，1504-1508；c)S.S.van Berkel，A.J.Dirks，S.A.Meeuwissen，D.L.L.Pingen，O.C.Boerman，P.Laverman，F.L.van Delft，J.J.L.Cornelissen，F.P.J.Rutjes，ChemBioChem 2008，9，1805-1815.[14]F.Shi，J.P.Waldo，Y.Chen，R.C.Larock，Org.Lett.2008，10，2409-2412.[15]L.Campbell-Verduyn，P.H.Elsinga，L.Mirfeizi，R.A.Dierckx，B.L.Feringa，Org.Biomol.Chem.2008，6，3461-3463.[16]a)The Chemistry of the Thiol Group(Ed.：S.Patai)，Wiley，New York，1974；b)A.F.Jacobine，In Radiation Curing in PolymerScience and Technology III(Eds.：J.D.Fouassier，J.F.Rabek)，Elsevier，London，1993，Chap.7，pp.219-268.[17]C.E.Hoyle，T.Y.Lee，T.Roper，J.Polym.Sci.Part A 2008，42，5301-5338.[18]L.M.Campos，K.L.Killops，R.Sakai，J.M.J.Paulusse，D.Damiron，E.Drockenmuller，B.W.Messmore，C.J.Hawker，Macromolecules 2008，41，7063-7070.[19]a)R.L.A.David，J.A.Kornfield，Macromolecules 2008，41，1151-1161；b)C.Nilsson，N.Simpson，M.Malkoch，M.Johansson，E.Malmstrom，J.Polym.Sci.Part A 2008，46，1339-1348；c)A.Dondoni，Angew.Chem.2008，120，9133-9135；Angew.Chem.Int.Ed.2008，47，8995-8997；d)J.F.Lutz，H.Schlaad，Polymer 2008，49，817-824.[20]A.Gress，A.Voelkel，H.Schlaad，Macromolecules 2007，40，7928-7933.[21]N.ten Brummelhuis，C.Diehl，H.Schlaad，Macromolecules 2008，41，9946-9947.[22]K.L.Killops，L.M.Campos，C.J.Hawker，J.Am.Chem.Soc.2008，130，5062-5064.[23]J.W.Chan，B.Yu，C.E.Hoyle，A.B.Lowe，Chem.Commun.2008，4959-4961.[24]a)G.Moad，E.Rizzardo，S.H.Thang，Ace.Chem.Res.2008，41，1133-1142；b)C.Barner-Kowollik，M.Buback，B.Charleux，M.L.Coote，M.Drache，T.Fukuda，A.Goto.B.Klumperman，A.B.Lowe，J.B.McLeary，G.Moad，M.J.Monterio，R.D.Sanderson，M.P.Tonge，P.Vana，J.Polym.Sci.Part A 2006，44，5809-5831.[25]a)R.J.Pounder，M.J.Stanford，P.Brooks，S.P.Richards，A.P.Dove，Chem.Commun.2008，5158-5160；b)M.J.Stanford，A.P.Dove，Macromolecules 2009，42，141-147.[26]M.Li，P.De，S.R.Gondi，B.S.Sumerlin，J.Polym.Sci.Part A 2008，46，5093-5100.[27]Z.J.Witczak，D.Lorchak，N.Nguyen，Carbohydr.Res.2007，342，1929-1933.[28]a)D.Samaroo，M.Vinodu，X.Chen，C.M.Drain，J.Comb.Chem.2007，9，998-1011；b)X.Chen，D.A.Foster，C.M.Drain，Biochemistry 2004，43，10918-10929；c)D.Samaroo，C.E.Soll，L.J.Todaro，C.M.Drain，Org.Lett.2006，8，4985-4988.[29]P.Battioni，O.Brigaud，H.Desvaux，D.Mansuy，T.G.Traylor，Tetrahedron Lett.1991，32，2893-2896.[30]C.Ott，R.Hoogenboom，U.S.Schubert，Chem.Commun.2008，3516-3518.[31]a)V.Ladmiral，G.Mantovani，G.J.Clarkson，S，Cauet，J.L.Irwin，D.M.Haddleton，J.Am.Chem.Soc.2006，128，4823-4830；b)S.G.Spain，M.I.Gibson，N.R.Cameron，J.Polym.Sci.Part A 2007，45，2059-2072.[32]C.R.Becer，K.Babiuch，K.Pilz，S.Hornig，T.Heinze，M.Gottschaldt，U.S.Schubert，Macromolecules 2009，42，2387-2394.[33]
Otto Paul Hermann Diets和Kurt Alder在1928年首次记录了该反应。他们因在以其名字命名的反应方面的工作获得了1950年诺贝尔化学奖。
[34]a)H.L.Holmes，R.M.Husband，C.C.Lee，P.Kawulka，J.Am.Chem.Soc.1948，70，141-142；b)M.Lautens，W.Klute，W.Tarn，Chem.Rev.1996，96，49-92；c)K.C.Nicolaou，S.A.Snyder，T.Montagnon，G.Vassilikogiannakis，Angew.Chem.2002，114，1742-1773；Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，1668-1698；d)E.J.Corey，Angew.Chem.2002，114，1724-1741；Angew.Chem.Iht.Ed.2002，41，1650-1667.[35]a)H.Durmaz，A.Dag，O.Altintas，T.Erdogan，G.Hizal，U.Tunca，Macromolecules 2007，40，191-198；b)H.Durmaz，A.Dag，A.Hizal，G.Hizal，U.Tunca，J.Polym.Sci.Part A 2008，46，7091-7100；c)A.Dag，H.Durmaz，E.Demir，G.Hizal，U.Tunca，J.Polym.Sci.Part A 2008，46，6969-6977；d)B.Gacal，H.Akat，D.K.Balta，N.Arsu，Y.Yagci，Macromolecules 2008，41，2401-2405；e)A.Dag，H.Durmaz，U.Tunca，G.Hizal，J.Polym.Sci.Part A 2009，47，178-187.[36]M.L.Blackman，M.Royzen，J.M.Fox，J.Am.Chem.Soc.2008，130，13518-13519.[37]
应当注意，反式环辛烯是对四嗪最具反应性的亲二烯体，并比顺式环辛烯的反应性高七个数量级。
[38]N.K.Devaraj.R.Weissleder，S.A.Hilderbrand，Bioconjugate Chem.2008，19，2297-2299.[39]W.Song，Y.Wang，J.Qu，Q.Lin，J.Am.Chem.Soc.2008，130，9654-9655.[40]W.Song.Y.Wang.J.Qu，M.M.Madden，Q.Lin，Angew.Chem.2008，120，2874-2877；Angew.Chem.Int.Ed.2008，47，2832-2835.[41]A.Dag，H.Durmaz，G.Hizal，U.Tunca，J.Polym.Sci.Part A 2008，46，302-313.[42]a)A.J.Inglis，S.Sinnwell，T.P.Davis，C.Barner-Kowollik，M.H.Stenzel，Macromolecules 2008.41，4120-4126；b)S.Sinnwell，A.J.Inglis，T.P.Davis，M.H.Stenzel，C.Barner-Kowollik，Chem.Commun.2008，2052-2054.[43]A.J.Inglis，S.Sinwell，M.H.Stenzel，C.Bamer-Kowollik，Angew.Chem.2009，121，2447-2450；Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，2411-2414.
以上引用的所有参考文献通过引用并入本文，以公开适合于根据本文提供的发明概念和方法安装在蛋白质上的点击化学途径。
其他标签也可以通过分拣标记添加至VHH。合适的标签的实例包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、核酸、多核苷酸、糖、碳水化合物、聚合物、脂质、脂肪酸和小分子。其他合适的标签对本领域技术人员来说是显而易见的，并且本发明不限于本方面。在一些实施方案中，标签包含可用于纯化、表达、增溶和/或检测多肽的序列。在一些实施方案中，标签可服务于多种功能。标签通常相对较小，例如从数个氨基酸到大约100个氨基酸长。在一些实施方案中，标签的长度超过100个氨基酸，例如，长达约500个氨基酸，或更多。在一些实施方案中，标签包含His6、HA、TAP、Myc、Flag或GST标签，仅举数例。在一些实施方案中，标签包含溶解度增强标签(例如，噬菌体T7的Ocr蛋白的单体突变体或SUMO标签、NUS A标签、SNUT标签、Strep标签)。参见，例如Esposito D and Chatterjee D K.Curr Opin Biotechnol.；17(4)：353-8(2006)。在一些实施方案中，标签是可切割的，使得它可以被例如蛋白酶去除。在一些实施方案中，这通过在标签中包括蛋白酶切割位点来实现，例如与标签的功能部分相邻或连接。示例性蛋白酶包括，例如凝血酶、TEV蛋白酶、因子Xa、PreScission蛋白酶等。在一些实施方案中，使用“自切割”标签。参见例如，PCT/US05/05763。
本文所述的缀合物包含与第二分子缀合的VHH。在一些实施方案中，VHH包含定位酶识别基序，并通过点击化学与第二分子缀合。在一些实施方案中，本公开内容的缀合物包含与一个分子缀合的VHH。在一些实施方案中，与VHH缀合的一个分子是抗原。在一些实施方案中，与VHH缀合的一个分子是抗炎剂或促炎剂。在一些实施方案中，本公开内容的缀合物包含与两个分子缀合的VHH。在一些实施方案中，本公开内容的缀合物包含与需要免疫应答的抗原(例如，来自病原体的抗原或肿瘤抗原)和抗炎剂缀合的VHH。在一些实施方案中，本公开内容的缀合物包含与需要免疫耐受的抗原(例如，用于治疗的自身抗原或外源性酶)和促炎剂缀合的VHH。图30A至30C示出了用于使两个分子与VHH缀合的方法的实例。
在一些实施方案中，抗炎剂或促炎剂通过接头与VHH的定位酶识别基序缀合。在一些实施方案中，接头是不可水解的接头(即不可切割的)。不可水解的接头的非限制性实例包括N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯(MCC)、马来酰亚胺基己酰基(MC)及其衍生物。在一些实施方案中，接头是可水解的接头(即可切割的)。可水解接头的非限制性实例包括腙、酰肼、二硫化物、4-(4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、缬氨酸-瓜氨酸(VC)、缬氨酸-丙氨酸(VA)、苯丙氨酸-赖氨酸(FK)及其衍生物。可水解的接头可以是自毁灭(self-immolating)接头(即自切割)，例如对pH敏感的接头(例如腙)。可以使用pH敏感性的接头，例如当生理环境的酸度改变时(如当VHH被递送至所期望目的地(例如，其APC或胞内隔室)时)以释放与VHH缀合的抗炎剂或促炎剂。在一些实施方案中，接头是如图27所示的自水解腙接头。适用于本文所述方法的另外的接头是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于描述于以下中的接头：Jain，N.，Smith，S.W.，Ghone，S.，&Tomczuk，B.Pharm Res，2015，32(11)，3526-3540，和Lu，J.，Jiang，F.，Lu，A.，&Zhang，G.Int J Mol Sci，2016，17(4)，561，这两篇文献均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含缀合物，所述缀合物包含与抗原(例如需要免疫耐受的抗原)和抗炎剂(例如地塞米松)缀合的VHH，其中VHH与MHCII结合(例如具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含缀合物，所述缀合物包含与自身抗原和抗炎剂(例如地塞米松)缀合的VHH，其中VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的任何一种自身抗原。在一些实施方案中，自身抗原是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyteglycoprotein，MOG)或其片段(例如，MOG蛋白的第35至55位氨基酸)。在一些实施方案中，自身抗原是瓜氨酸化纤维蛋白原。在一些实施方案中，自身抗原是胰岛素。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含缀合物，所述缀合物包含与用于蛋白质替代治疗或基因治疗的蛋白质(例如酶，例如因子IX或因子VIII或腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)来源的蛋白质)和抗炎剂(例如地塞米松)缀合的VHH，其中VHH与MHCII结合(例如具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的VHH)。
在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫耐受的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如，地塞米松)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与自身抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如地塞米松)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCII结合(例如具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的任何一种自身抗原。在一些实施方案中，自身抗原是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其片段(例如，MOG蛋白的第35至55位氨基酸。在一些实施方案中，自身抗原是瓜氨酸化纤维蛋白原。在一些实施方案中，自身抗原是胰岛素。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与蛋白质替代治疗或基因治疗中使用的蛋白质(例如酶，例如因子IX或因子VIII或腺相关病毒(AAV)来源的蛋白质)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如，地塞米松)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCH结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有与抗原(例如需要免疫耐受的抗原)和抗炎剂(例如地塞米松)缀合的VHH的缀合物，其中所述VHH与CD11c结合(例如具有SEQID NO：2的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有与自身抗原和抗炎剂(例如地塞米松)缀合的VHH的缀合物，其中所述VHH与CD11c结合(例如，具有SEQID NO：2的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的任何一种自身抗原。在一些实施方案中，自身抗原是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其片段(例如，MOG蛋白的第35至55位氨基酸。在一些实施方案中，自身抗原是瓜氨酸化纤维蛋白原。在一些实施方案中，自身抗原是胰岛素。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有与蛋白质替代治疗或基因治疗中使用的蛋白质(例如酶，例如因子IX或因子VIII或腺相关病毒(AAV)来源的蛋白质)和抗炎剂(例如地塞米松)缀合的VHH的缀合物，其中VHH与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。
在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫耐受的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如，地塞米松)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与自身抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如地塞米松)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的任何一种自身抗原。在一些实施方案中，自身抗原是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其片段(例如，MOG蛋白的第35至55位氨基酸。在一些实施方案中，自身抗原是瓜氨酸化纤维蛋白原。在一些实施方案中，自身抗原是胰岛素。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与蛋白质替代治疗或基因治疗中使用的蛋白质(例如酶，例如因子IX或因子VIII或腺相关病毒(AAV)来源的蛋白质)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如，地塞米松)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。
在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫耐受的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如，地塞米松)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH与APC上的不同表面蛋白结合。在一些实施方案中，组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫耐受的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如，地塞米松)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)，以及所述第二VHH与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫耐受的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如，地塞米松)缀合的第二VHH，其中第一VHH与DEC205结合，以及第二VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与自身抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如地塞米松)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)，以及所述第二VHH与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的任何一种自身抗原。在一些实施方案中，自身抗原是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其片段(例如，MOG蛋白的第35至55位氨基酸。在一些实施方案中，自身抗原是瓜氨酸化纤维蛋白原。在一些实施方案中，自身抗原是胰岛素。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与蛋白质替代治疗或基因治疗中使用的蛋白质(例如酶，例如因子IX或因子VIII或腺相关病毒(AAV)来源的蛋白质)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂(例如，地塞米松)缀合的第二VHH，其中第一VHH与DEC205结合，以及第二VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的VHH)。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有与抗原(例如，需要免疫应答的抗原)和促炎剂缀合的VHH的缀合物，其中所述VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有与来自病原体的抗原(例如SARS-CoV-2蛋白，如刺突蛋白)和促炎剂(例如，IL2)缀合的VHH的缀合物，其中VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的来自病原体的任何一种抗原。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有与肿瘤抗原和促炎剂(例如，IL2)缀合的VHH的缀合物，其中VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的任何一种肿瘤抗原。
在一些实施方案中，组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫应答的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与来自病原体的抗原(例如SARS-CoV-2蛋白，例如刺突蛋白)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂(例如，IL2)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的来自病原体的任何一种抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与肿瘤抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂(例如，IL2)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCII结合(例如，具有SEQID NO：1的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的任何一种肿瘤抗原。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有与抗原(例如，需要免疫应答的抗原)和促炎剂缀合的VHH的缀合物，其中VHH与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有与来自病原体的抗原(例如SARS-CoV-2蛋白，例如刺突蛋白)和促炎剂(例如，IL2)缀合的VHH的缀合物，其中VHH与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的来自病原体的任何一种抗原。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含含有与肿瘤抗原和促炎剂(例如，IL2)缀合的VHH的缀合物，其中VHH与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。
在一些实施方案中，组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫应答的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与来自病原体的抗原(例如SARS-CoV-2蛋白，例如刺突蛋白)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂(例如，IL2)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的来自病原体的任何一种抗原。在一些实施方案中，组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与肿瘤抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂(例如，IL2)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合(例如，具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的任何一种肿瘤抗原。
在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫应答的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH与APC上的不同表面蛋白结合。在一些实施方案中，组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫应答的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂(例如，IL2)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)，以及所述第二VHH与CD11c结合(例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原(例如，需要免疫应答的抗原)缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂(例如，IL2)缀合的第二VHH，其中第一VHH与DEC205结合，以及第二VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。在一些实施方案中，组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与来自病原体(例如SARS-CoV-2，例如刺突蛋白)的抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂(例如，IL2)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)，以及所述第二VHH与CD11c结合(例如，具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的VHH)。可以使用本文所述的来自病原体的任何一种抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与肿瘤抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂(例如，IL2)缀合的第二VHH，其中所述第一VHH与DEC205结合，以及所述第二VHH与MHCII结合(例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VHH)。
抗原
本文中使用的“抗原”是指在对象中诱导免疫应答的分子。目的抗原可以是或可以包含例如多肽、多糖、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。抗原可以是天然存在的或合成的。
在一些实施方案中，抗原是需要免疫耐受的抗原。在一些实施方案中，这样的抗原是自身抗原(self-antigen)(也称为“自身抗原(autoantigen)”)或具有起始或增强自身免疫应答的能力、引起自身免疫病的物质。因此，期望诱导对这样的自身抗原的免疫耐受。在一些实施方案中，本文所述的组合物用于诱导对自身抗原的免疫耐受(例如，抗原特异性免疫耐受)。免疫耐受(例如，抗原特异性免疫耐受)的诱导降低了对抗原的抗原特异性免疫应答，在一些实施方案中，这减轻了自身免疫病的严重程度。
在一些实施方案中，根据本公开内容使用的自身抗原选自：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘蛋白脂质蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原、胰岛素、嗜铬粒蛋白A、GAD65、桥粒黏蛋白1(DSG1)和桥粒黏蛋白3(DSG3)、乙酰胆碱受体(AChR)、肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)和核糖核蛋白。
在一些实施方案中，自身抗原包含髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其抗原片段。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)是中枢神经系统(central nervous system，CNS)髓鞘的膜包埋表面蛋白。在患有自身免疫病(如CNS的获得性炎性脱髓鞘病症)的患者的血清中一致发现了靶向MOG的抗体(例如，如Nessier et al.，EBioMedicine.2019 Oct；48：18-19中所述，通过引用并入本文)。与MOG抗体相关的自身免疫病包括但不限于急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、视神经炎(optic neuritis，ON)、横贯性脊髓炎和脑干脑炎。在一些实施方案中，本文所述组合物中的自身抗原是全长MOG。在一些实施方案中，本文所述组合物中的自身抗原包含MOG片段(例如，MOG的第35至55位氨基酸，MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO：49))。
在一些实施方案中，自身抗原包含纤维蛋白原或其抗原片段。纤维蛋白原(凝血因子I)是血栓形成的主要因素；它被凝血酶切割形成纤维蛋白，纤维蛋白是血凝块中最丰富的组分。纤维蛋白原在凝血和心血管疾病中(CVD)起重要作用。另外，纤维蛋白原是自身免疫病和炎性疾病(如类风湿性关节炎、血管炎、炎性肠病、多发性硬化、慢性阻塞性肺疾病、肾病和移植术后纤维化以及数种类型的癌症)中的促炎因子(例如，如Arbustini et al.，Circulation.2013；128：1276-1280中描述，通过引用并入本文)。在一些实施方案中，自身抗原是瓜氨酸化纤维蛋白原。在一些实施方案中，本文所述组合物中的自身抗原包含纤维蛋白原片段(瓜氨酸化纤维蛋白原的第79至91位氨基酸，QDFTNCitINKLKNS(SEQ ID NO：50))。抗瓜氨酸化蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibody，ACPA)在类风湿性关节炎患者的血清中被特异性且频繁地检测到(例如，如Takizawa et al.，Ann RheumDis.2006 Aug；65(8)：1013-1020中所述)。
在一些实施方案中，自身抗原包含髓鞘蛋白脂质蛋白或其抗原片段。已经表明髓鞘蛋白脂质蛋白参与自身免疫性脱髓鞘疾病，例如如Tuohy et al.，Neurochem Res.1994Aug；19(8)：935-44中所述，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，自身抗原包含胰岛素或其抗原片段。在一些实施方案中，自身抗原包含胰岛素α链GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO：51)。在一些实施方案中，自身抗原包含胰岛素β链FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO：52))。胰岛素参与罕见的自身免疫病，包括胰岛素自身免疫性综合征和B型胰岛素抵抗综合征(例如，如Censi etal.，Ann Transl Med.2018 Sep；6(17)：335中所述，通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，自身抗原包含嗜铬粒蛋白A或其抗原片段。嗜铬粒蛋白A与自身免疫性胃炎相关(例如，如Peracchi et al.，European Journal of Endocrinology(2005)152 443-448中所述，通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，自身抗原包含谷氨酸脱羧酶65-千道尔顿同种型(GAD65)或其抗原片段，已知其与中枢神经系统的自身免疫疾、神经性自身免疫病、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病和恶性贫血相关(例如，如McKeon et al.，Muscle Nerve.2017 Jul；56(1)：15-27中所述，通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，自身抗原包含桥粒黏蛋白1(DSG1)和/或桥粒黏蛋白3(DSG3)或其抗原片段。DSG1和DSG3参与皮肤自身免疫病，例如，如Amagai et al.，Proc Jpn AcadSer B Phys Biol Sci.2010；86(5)：524-37中所述，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，自身抗原包含乙酰胆碱受体(AChR)或其抗原片段。对乙酰胆碱受体的抗体介导的自身免疫应答导致重症肌无力，例如如Lindstrom et al.，JNeurobiol.2002 Dec；53(4)：656-65中所述，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，自身抗原包含肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)或其抗原性片段。已证明MuSK参与神经肌肉接头自身免疫病，例如如Vincent et al.，Curr OpinNeurol.2005 Oct；18(5)：519-25中所述，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，自身抗原包含核糖核蛋白或其抗原片段。核糖核蛋白参与自身免疫病，如系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)和混合性结缔组织病(Mixed connective tissue disease，MCTD)，例如如Whittingham et al.，Aust N Z JMed.1983 Dec；13(6)：565-70和Newkirk et al.，Arthritis Research&Therapy volume3，Article number：253(2001)中所述，通过引用并入本文。
这样的自身免疫抗原和相关自身免疫病的其他非限制性实例包括：治疗胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)的GAD、胰岛素和胰腺β细胞抗原；用于治疗类风湿性关节炎的gpl30-RAPS、11型胶原和人软骨gp39(HCgp39)；治疗多发性硬化的蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘碱性蛋白质(myelin basic protein，MBP)；治疗硬皮病的小核仁蛋白(snoRNP)和核仁纤维蛋白；用于治疗格雷夫斯病(Graves′disease)的甲状腺刺激因子受体(TSH-R)；用于治疗系统性红斑狼疮的核糖体蛋白、核抗原、组蛋白、和糖蛋白gp70；用于治疗原发性胆汁性肝硬化的丙酮酸脱氢酶脱氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PCD-E2)；用于治疗斑秃的毛囊抗原；以及用于治疗溃疡性结肠炎的人原肌球蛋白同种型5(hTM5)。这些实例并不意味着是限制性的。本领域技术人员能够鉴定与目的自身免疫病相关的自身免疫抗原。
在一些实施方案中，抗原包含用于蛋白质替代治疗或基因治疗的蛋白质，例如但不限于因子IX、因子VIII、胰岛素和AAV来源的蛋白质。这些实例并不意味着是限制性的。本领域技术人员能够鉴定用于蛋白质替代治疗或基因治疗的目的蛋白质。诱导针对这些蛋白质的免疫耐受减少了免疫系统对蛋白质的破坏，从而产生更持久的治疗作用。
在一些实施方案中，根据本公开内容使用的抗原是需要免疫应答的抗原。例如，在一些实施方案中，这样的抗原通过由病原体、被感染细胞或赘生性细胞(例如癌细胞)遗传编码的多肽或肽天然产生和/或包含由病原体、被感染细胞或赘生性细胞(例如癌细胞)遗传编码的多肽或肽。在一些实施方案中，抗原由病毒、细菌、真菌或寄生虫产生或遗传编码，在一些实施方案中，所述病毒、细菌、真菌或寄生虫是病原体。在一些实施方案中，病原体在其生命周期的至少一部分期间是胞内的。在一些实施方案中，病原体是胞外的。应当理解，在一些实施方案中，来源于特定来源的抗原可以从这样的来源分离，或者使用任何合适的方法(例如，重组、合成等)产生，例如，为了使用抗原的目的，例如以鉴定、产生、测试或使用其抗体。抗原可以被修饰，例如通过与另一个分子或实体(例如佐剂)缀合、化学或物理变性等。在一些实施方案中，抗原是包膜蛋白、衣壳蛋白、分泌性蛋白、结构蛋白、细胞壁蛋白或多糖、荚膜蛋白或多糖或酶。在一些实施方案中，抗原是毒素，例如细菌毒素。
在一些实施方案中，抗原是病毒抗原。示例性的病毒包括，例如SARS-CoV-2、逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，慢病毒如人免疫缺陷病毒，如HIV-I)；杯状病毒科(Caliciviridae)(例如引起肠胃炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒、丙型肝炎病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如水疱性口炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副黏病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如汉坦病毒、bunga病毒(bunga virus)、白蛉病毒(phlebovirus)和奈罗病毒(Nairo virus))；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒(orbiviurs)和轮状病毒(rotavirus))；双RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)1和2、带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、EBV、KSV)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和微小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒(human coxsackie virus)、鼻病毒、埃可病毒)。在一些实施方案中，抗原包含β冠状病毒蛋白，例如刺突蛋白(例如，全长或受体结合结构域(receptor binding domain，RBD))、包膜蛋白、膜蛋白或核壳蛋白。在一些实施方案中，抗原包含SARS-CoV(例如，SARS-CoV-1或SARS-CoV-2)蛋白，例如刺突蛋白(例如，全长或受体结合结构域(RBD))、包膜蛋白、膜蛋白或核壳蛋白。表2中提供了根据本公开内容可用作抗原的β冠状病毒蛋白的实例。
表2.β冠状病毒蛋白抗原
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在一些实施方案中，抗原是细菌抗原。示例性的细菌包括，例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)、链球菌(Streptococcus)(草绿色组(viridans group))、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(Streptococcus)(厌氧属)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、衣原体属(Chlamydia sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracia)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴氏杆菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、具核梭形杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)、雅司螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、衣氏放线菌(Actinomyces israelii)和土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)。
在一些实施方案中，抗原是真菌抗原。示例性真菌包括，例如：曲霉(Aspergillus)如黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillusniger)，芽生菌属(Blastomyces)如皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，念珠菌属(Candida)如白念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、高里念珠菌(Candida guilliermondii)、克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)，球孢子菌属(Coccidioides)如粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，隐球菌属(Cryptococcus)如新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、表皮癣菌(Epidermophyton)、镰孢菌(Fusarium)，组织胞浆菌属(Histoplasma)如荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)，马拉色菌属(Malassezia)如糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、小孢子癣菌(Microsporum)、毛霉菌(Mucor)，副球孢子菌属(Paracoccidioides)如巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)，青霉菌(Penicillium)如马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)，毕赤酵母属(Pichia)如异常毕赤酵母(Pichia anomala)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)，肺孢子虫属(Pneumocystis)如卡氏肺孢菌(Pneumocystis carinii)，假性阿利什霉(Pseudallescheria)如波氏假性阿利什霉(Pseudallescheria boydii)，根霉(Rhizopus)如米根霉(Rhizopus oryzae)，红酵母(Rhodotorula)如深红酵母菌(Rhodotorula rubra)，丝孢菌属(Scedosporium)如尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)，裂褶菌属(Schizophyllum)如裂褶菌(Schizophyllum commune)，孢子丝菌属(Sporothrix)如申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)，发癣菌如须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)，毛孢子菌(Trichosporon)如阿沙毛孢子菌(Trichosporonasahii)、皮肤毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)、皮瘤丝孢酵母(Trichosporon inkin)和黏状毛孢子菌(Trichosporon mucoides)。
在一些实施方案中，抗原来自寄生虫。示例性的寄生虫包括例如以下的寄生虫：疟原虫属(genus Plasmodium)(例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)和三日疟原虫(P.malariae))、锥虫属(Trypanosoma)、弓形虫属(Toxoplasma)(例如刚地弓形虫(Toxoplasma gondii))、利什曼原虫(Leishmania)(例如硕大利什曼原虫(Leishmania major))、血吸虫属(Schistosoma)或隐孢子虫属(Cryptosporidium)。在一些实施方案中，寄生虫是原生动物。在一些实施方案中，寄生虫属于顶复门(phylum Apicomplexa)。在一些实施方案中，寄生虫在其生命周期的至少一部分期间驻留在胞外。实例包括线虫、吸虫(trematode)(吸虫(fluke))和绦虫。在一些实施方案中，考虑了来自蛔虫(Ascaris)或鞭虫属(Trichuris)的抗原。在多个实施方案中，抗原可以来源于寄生虫的任何组分。在一些实施方案中，抗原可以来源于寄生虫生命周期的任何阶段，例如在被感染的生物体如哺乳动物或鸟类生物体中发生的任何阶段。在一些实施方案中，抗原来源于寄生虫卵或寄生虫分泌的物质。
在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原。通常，肿瘤抗原可以是由肿瘤细胞(例如，致瘤细胞或在一些实施方案中的肿瘤基质细胞，例如肿瘤相关细胞如癌症相关成纤维细胞)产生的任何抗原性物质。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与非肿瘤细胞相比由肿瘤细胞差异表达的分子(或其部分)。肿瘤抗原可以包括，例如通常以非常小的量产生并由肿瘤细胞以较大的量表达的蛋白质，通常仅在发育的某些阶段中产生的蛋白质，其结构(例如，序列或翻译后修饰)由于肿瘤细胞中的突变而被修饰的蛋白质，或(在正常条件下)与免疫系统隔离的正常蛋白质。肿瘤抗原可用于例如鉴定或检测肿瘤细胞(例如，用于诊断目的和/或用于监测已接受肿瘤治疗的对象的目的，例如用于测试复发)和/或用于将多种药剂(例如，治疗剂)靶向肿瘤细胞的目的。例如，在一些实施方案中，提供了嵌合抗体，其包含结合肿瘤抗原的抗体片段的抗体，并通过点击化学与治疗剂(例如细胞毒性剂)缀合。在一些实施方案中，肿瘤抗原是突变基因的表达产物，例如癌基因或突变的肿瘤抑制基因，过表达或异常表达的细胞蛋白，致癌病毒(例如，HBV；HCV；疱疹病毒家族成员例如EBV，KSV；乳头状瘤病毒等)编码的抗原，或癌胚抗原。癌胚抗原通常在胚胎发育的早期阶段产生，并在免疫系统完全发育时大部分或完全消失。实例是甲胎蛋白(AFP，存在于例如生殖细胞肿瘤和肝细胞癌中)和癌胚抗原(CEA，存在于例如肠癌、并偶尔存在于肺癌或乳腺癌中)。酪氨酸酶是通常以非常低的量产生但在某些肿瘤细胞(例如黑素瘤细胞)中其产生大大提高的蛋白质的实例。其他示例性肿瘤抗原包括，例如CA-125(存在于例如卵巢癌中)；MUC-1(存在于例如乳腺癌中)；上皮肿瘤抗原(存在于例如乳腺癌中)；黑素瘤相关抗原(MAGE，存在于例如恶性黑素瘤中)；前列腺酸性磷酸酶(PAP，存在于前列腺癌中)。在一些实施方案中，肿瘤抗原至少部分暴露于肿瘤细胞的细胞表面。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含异常修饰的多肽或脂质，例如异常修饰的细胞表面糖脂或糖蛋白。应当理解，肿瘤抗原可以由特定类型的肿瘤亚组和/或由肿瘤中的细胞亚群表达。
在一些实施方案中，肿瘤抗原选自：MAGE家族成员、NY-ESO-1、酪氨酸酶、Melan-A/MART-1、前列腺癌抗原、Her-2/neu、存活蛋白、端粒酶、WT1、CEA、gp100、Pmel17、乳腺珠蛋白-A、NY-BR-1、ERBB2、OA1、PAP、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、CD33、BAGE-1、D393-CD20n、周期蛋白-A1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、LY6K、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C1、MAGE-C2、黏蛋白K、NA88-A、SAGE、sp17、SSX-2、SSX-4、存活(surviving)、TAG-1、TAG-3、TRAG-3、XAGE-1b、BCR-ABl、adipophiln、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CD274、CPSF、周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、G250、HER-2、HLA-DOB、hepsin、IDO1、IGF2B3、IL12Rα2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、M-CSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、secerine 1、SOX10、STEAP1、端粒酶、TPBG、间皮素、Axl、和VEGF。
在一些实施方案中，抗原是完整细胞、完整寄生虫、完整病毒、完整细菌、或完整纳米颗粒、外排体或微粒，其包含一种或更多种抗原。在一个实例中，VHH可与β胰岛细胞缀合并在非炎性条件下递送，以在器官或组织替代治疗过程中诱导β胰岛细胞耐受。在又一个实例中，VHH可与寄生虫缀合并在炎性条件下递送，以立刻诱导强的针对多种寄生虫抗原的免疫应答。
抗炎剂和促炎剂
如本文所示，当在非炎性条件下施用于对象时，包含与需要免疫耐受的抗原(例如自身抗原)缀合的VHH的缀合物在诱导对自身抗原的抗原特异性免疫耐受方面更有效。在一些实施方案中，通过将抗炎剂与包含VHH和抗原的相同缀合物连接来提供非炎性条件。在一些实施方案中，通过共施用除了与自身抗原缀合的VHH之外的与抗炎剂缀合的VHH来提供非炎性条件。
“抗炎剂”是指减少体内炎症的物质。抗炎剂阻断体内导致炎症的某些物质。本领域已知的任何抗炎剂都可根据本公开内容使用。在一些实施方案中，抗炎剂是甾体抗炎剂。在一些实施方案中，甾体抗炎剂选自：地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、曲安西龙、甲基泼尼松龙和倍他米松。在一些实施方案中，抗炎剂是非甾体抗炎剂。在一些实施方案中，非甾体抗炎剂选自：阿司匹林、塞来昔布、双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬、奈普生、奥沙普秦、吡罗昔康、环孢菌素A和钙三醇。在一些实施方案中，根据本公开内容使用的抗炎剂是地塞米松。
在一些实施方案中，抗炎剂是抗炎细胞因子。“抗炎细胞因子”是指抑制IL-1、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和其他主要促炎细胞因子的合成并减少炎性反应的细胞因子。在一些实施方案中，抗炎细胞因子选自IL-10、IL-35、IL-4、IL-11、IL-13、和TGFβ。
在另一些方面中，本公开内容提供了包含与需要免疫应答的抗原(例如，来自病原体的抗原或肿瘤抗原)缀合的VHH的缀合物，当在炎性条件下施用于对象时，在诱导针对抗原的抗原特异性免疫应答方面更有效。在一些实施方案中，通过将促炎剂与包含VHH和抗原的相同缀合物连接来提供炎性条件。在一些实施方案中，通过共施用除了与抗原缀合的VHH之外的与促炎剂缀合的VHH来提供非炎性条件。在一些实施方案中，促炎剂选自：TLR9激动剂(例如，CpG ODN)、LPS、HMGB1蛋白、IL2、IL12和CD40L。在一些实施方案中，促炎剂是IL2。
治疗方法
本公开内容的一些方面提供了包括向有此需要的对象施用以下的方法：(i)包含与需要免疫耐受的抗原(例如自身抗原)和抗炎剂缀合的VHH的缀合物，其中VHH与APC上的表面蛋白(例如MHCII或CD11c)结合；或(ii)包含与需要免疫耐受的抗原(例如，自身抗原)缀合的VHH的第一缀合物和包含与抗炎剂缀合的第二VHH的第二缀合物，其中第一VHH和第二VHH与APC上的一种或更多种(例如相同或不同)表面蛋白结合。在一些实施方案中，当施用两种VHH时，它们以同一组合物或不同的组合物施用(例如，顺序施用)。在一些实施方案中，所述方法用于诱导对抗原的免疫耐受。在一些实施方案中，所述方法用于治疗自身免疫病。
“自身免疫病”是导致免疫系统的异常过度活性的病症，这样的病症攻击和损伤自身组织。自身免疫病的非限制性实例包括：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)、格雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic Thrombocytopenia Purpura，ITP)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre Syndrome)、自身免疫性心肌炎、膜性肾小球肾炎、I型或II型糖尿病、幼年型糖尿病、多发性硬化、雷诺综合征(Reynaud’s syndrome)、自身免疫性甲状腺炎、胃炎、乳糜泻、白癜风、肝炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、脊柱关节病、实验性自身免疫性脑脊髓炎、免疫中性白细胞减少症，以及与由细胞因子、通常存在于以下中的T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应相关的免疫应答：结核病、结节病和多发性肌炎、多发性大动脉炎、皮肤血管炎、天疱疮(例如寻常型天疱疮、落叶型天疱疮或副肿瘤性天疱疮)、类天疱疮(pemphigoid)、古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)、川崎病(Kawasaki’s disease)、系统性硬化病、抗磷脂综合征和舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)。在一些实施方案中，自身免疫病选自：多发性硬化、II型糖尿病、寻常型天疱疮、重症肌无力、狼疮、乳糜泻和炎性肠病(IBD)。在一些实施方案中，自身免疫病选自：自身免疫性脑脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎(acutedisseminated encephalomyelitis，ADEM)、视神经炎(optic neuritis，ON)、横贯性脊髓炎和脑干脑炎、类风湿性关节炎、血管炎、炎性肠病、多发性硬化、慢性阻塞性肺疾病、肾病、移植术后纤维化以及数种类型的癌症、自身免疫性脱髓鞘疾病、胰岛素自身免疫性综合征、B型胰岛素抵抗综合征、自身免疫性胃炎、中枢神经系统的自身免疫病、神经性自身免疫病、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、皮肤自身免疫病、重症肌无力、神经肌肉接头自身免疫病。不同的自身抗原可在用于治疗不同的自身免疫病的缀合物中使用。本领域技术人员能够鉴定合适的自身抗原以使用。
本公开内容的另一些方面提供了包括向有此需要的对象施用以下的方法：(i)包含与需要免疫应答的抗原(例如来自病原体的抗原或肿瘤抗原)和促炎剂缀合的VHH的缀合物，其中VHH与APC上的表面蛋白(例如MHCII或CD11c)结合；或(ii)包含与需要免疫应答的抗原(例如来自病原体的抗原或肿瘤抗原)缀合的VHH的第一缀合物和包含与促炎剂缀合的第二VHH的第二缀合物，其中第一VHH和第二VHH与APC上的一种或更多种(例如相同或不同)表面蛋白结合。在一些实施方案中，当施用两种VHH时，它们以同一组合物或不同的组合物施用(例如，顺序施用)。在一些实施方案中，所述方法用于诱导对抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述方法用于治疗由病原体(例如，微生物病原体，如本文所述的那些)引起的感染。在一些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。
癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。癌症包括但不限于：成人和小儿急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、胆道癌、骨肉瘤、纤维组织细胞瘤、脑癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、恶性胶质瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤、下丘脑胶质瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、类癌瘤、不明来源的癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞和髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏家族肿瘤(Ewing family tumor)、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、肾细胞癌、喉癌、唇癌与口腔癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、瓦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinema)、恶性纤维组织细胞瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、恶性间皮瘤、鳞状颈癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、慢性骨髓增殖性疾病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚瘤、垂体癌、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征(Sezarysyndrome)、非黑素瘤皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、幕上原始神经外胚瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、绒毛膜癌、血液系统肿瘤、成人T细胞白血病、淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、间质肿瘤和生殖细胞肿瘤、或肾母细胞瘤(Wilms tumor)。在一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、脑癌和中枢神经系统癌、皮肤癌、卵巢癌、白血病、子宫内膜癌、骨肉瘤、软骨肉瘤和软组织肉瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、视网膜母细胞瘤或性腺生殖细胞肿瘤。
在其最广泛的意义上，术语“治疗”及其变形形式是指治疗性和预防性治疗二者。如果需要治疗的对象患有疾病(例如，自身免疫病、感染或癌症)，那么“治疗病症”是指改善、减轻或消除与所述疾病相关的一种或更多种症状或疾病严重程度，或预防疾病的任何进一步进展。如果需要治疗的对象是有患病(例如感染或癌症)风险的对象，那么治疗对象是指降低对象患感染癌症的风险或防止对象发生感染或癌症。
对象应意指人或脊椎动物或哺乳动物，包括但不限于啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡和灵长类(例如，猴)。本公开内容的方法可用于治疗有此需要的对象。
在一些实施方案中，本文所述的组合物是药物组合物。可根据本公开内容使用的药物组合物可直接施用于对象或可以以治疗有效量施用于有此需要的对象。术语“治疗有效量”是指实现期望的生物学作用所必需或足够的量。例如，与本公开内容相关的组合物的治疗有效量可以是足以改善目标疾病(例如，自身免疫病、感染或癌症)的一种或更多种症状的量。结合本文中提供的教导，通过在多种活性化合物中进行选择并权衡例如效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重程度和优选的施用方式等因素，可设计有效的预防性或治疗性治疗方案，其不会引起大量毒性，并且还对治疗特定对象完全有效。任何特定应用的有效量可根据如所治疗的疾病或病症、所施用的特定药物组合物、对象的尺寸、或者疾病或病症的严重程度等这样的因素而变化。本领域普通技术人员可凭经验确定与本公开内容相关的特定治疗化合物的有效量，而无需过度的实验。
本文中所述的用于递送的组合物的对象剂量通常为每次施用约0.1μg至10mg，这取决于应用可每天、每周或每月以及其间的任何其他时间量给出。在一些实施方案中，在关键合并或再合并期间施用单一剂量。为了这些目的，剂量可为每次施用约10μg至5mg，并且最通常为约100μg至1mg，间隔2至4次施用，例如间隔数天或数周或更长时间。然而，在一些实施方案中，用于这些目的的肠胃外剂量可以以上述典型剂量的5至10,000倍高来使用。
在一些实施方案中，本公开内容的组合物以约1至10mg/kg哺乳动物体重的剂量施用。在另一些实施方案中，本公开内容的组合物以约0.001至1mg/kg哺乳动物体重的剂量施用。在另一些实施方案中，本公开内容的组合物以约10至100ng/kg、100至500ng/kg、500ng/kg至1mg/kg或1至5mg/kg哺乳动物体重的剂量或本文中的任何单独剂量施用。
本公开内容的组合物以可药用溶液施用，其可常规地含有可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体和任选地其他治疗成分。
为了在治疗中使用，可通过将治疗剂或化合物递送至所期望表面(例如黏膜、注射至癌症、全身性等)的任何方式，将与本公开内容相关的有效量的组合物施用于对象。本公开内容的药物组合物的施用可以通过本领域技术人员已知的任何方式完成。合适的施用途径包括但不限于经口、肠胃外、静脉内、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、经眼、经阴道、经直肠和脑室内。在一些实施方案中，组合物静脉内施用(例如，通过注射或输注)。
当期望全身性地递送本公开内容的药物组合物时，可将其配制成用于通过注射(例如，通过推注注射或持续输注)进行肠胃外施用。用于注射的制剂可在添加防腐剂的情况下以单位剂型的形式存在，例如在安瓿中，或在多剂量容器中。组合物可采用在油性或水性载剂中作为混悬剂、溶液剂或乳剂的这样的形式，并且可含有配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液剂。另外的，可将活性化合物的混悬剂制备为适当的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油，例如芝麻油；或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射用混悬剂可包含提高混悬剂的黏度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，混悬液还可包含合适的稳定剂或提高化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。
除前述制剂之外，还可将组合物配制成储存制剂(depot preparation)。这样的长效制剂可使用合适的聚合材料或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂来配制，或配制为微溶性(sparingly soluble)衍生物(例如微溶性盐)。
组合物还可包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的一些实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物，例如聚乙二醇。
合适的液体或固体药物制剂形式是例如用于吸入的水性或盐溶液，微囊化、包囊、包被在微观金颗粒上，包含在脂质体中，雾化的，气雾剂，用于植入皮肤中的微丸或干燥到尖锐的物体上以待刮擦至皮肤中。药物组合物还包含颗粒剂、散剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、乳膏剂、滴剂或活性化合物长期释放的制剂，其制备中通常如上所述使用赋形剂和添加剂和/或助剂，例如崩解剂、黏合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、矫味剂、甜味剂或增溶剂。药物组合物适用于多种药物递送系统。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见Langer，Science 249：1527-1533，1990，其通过引用并入本文中。
本公开内容的组合物和任选地另一些治疗剂可本身(纯净)或以可药用盐的形式施用。当在药物中使用时，盐应是可药用的，但可方便地使用非可药用的盐以制备其可药用盐。这样的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。而且，这样的盐可作为碱金属或碱土金属盐，例如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐来制备。
合适的缓冲剂包含：乙酸和盐(1％w/v至2％w/v)；柠檬酸和盐(1％w/v至3％w/v)；硼酸和盐(0.5％w/v至2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8％w/v至2％w/v)。合适的防腐剂包含苯扎氯铵(0.003％w/v至0.03％w/v)；氯丁醇(0.3％w/v至0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01％w/v至0.25％w/v)和硫柳汞(0.004％w/v至0.02％w/v)。
本公开内容的药物组合物包含任选地包含在可药用载体中的有效量的本公开内容的治疗化合物。术语“可药用载体”意指适合施用于人或其他脊椎动物的一种或更多种相容性的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。术语“载体”表示天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其组合以促进应用。药物组合物的组分还能够与本公开内容的化合物混合，以及与彼此混合，以使得不存在会显著损害期望的药物效力的相互作用的方式。
本公开内容的药物组合物可以与用于治疗疾病(例如，自身免疫病、感染或癌症)的其他治疗剂一起递送。
实施例
实施例1.改造靶向MHC II类的单结构域抗体的模块性(modularity)，以针对自身免疫病进行保护。
自身免疫是适应性免疫系统的组分识别自身抗原的结果。这解释了大多数自身免疫病与呈递攻击性自身抗原的II类MHC产物的特定等位基因变体之间的联系。为了治疗自身免疫病，诱导抗原特异性耐受将是一个非常理想的目标。无论病理状况如何，抗原呈递细胞(APC)在疾病诱导中是必不可少的，而相反，如果APC在非炎性条件下遇到抗原，则其可以是致耐受的。本文描述了识别存在于所有APC上的II类MHC产物的纳米抗体，所述纳米抗体可与自身抗原(例如自身免疫病(实验性自身免疫性脑炎(experimental autoimmuneencephalitis，EAE))的临床前模型中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)片段)酶促缀合。在非炎性条件下施用这些加合物提供了针对EAE的长期保护。在加速(accelerated)I型糖尿病和类风湿性关节炎的小鼠模型中，类似的加合物预防高血糖。自身抗原不仅与纳米抗体缀合，还与地塞米松衍生物缀合，其通过可切割的腙接头连接。携带MOG肽的II类MHC特异性纳米抗体与经可切割地塞米松衍生物修饰的该相同纳米抗体共施用可阻止已有症状动物的疾病进展。虽然除了这些细胞必须是II类MHC阳性细胞这一事实之外，产生治疗效力的确切靶细胞群仍有待确定，但这些发现具有实际效用。在多种炎性条件下应用这样的抗体-药物缀合物应被视为可行的治疗选择。
简介
大约10％的人口患有自身免疫病，伴有轻度至危及生命的症状。只有在特定情况下，才存在对疾病如何开始的似乎合理的解释。使用检查点阻断剂的癌症免疫治疗虽然在选定的恶性肿瘤组中非常成功，但其通过解除对免疫内环境稳定的打断(break)而有引发自身免疫的风险。这是一个实验性触发物的明显实例，它揭示了有害的自反应细胞的存在，在应用检查点阻断剂之前这些细胞受抑制(hold in check)。
目前对自身免疫病的治疗包括全身免疫抑制，这种抑制会减弱整个抗原谱上的响应。这使患者感染的风险增加，并甚至可能患上恶性肿瘤。因为自身免疫病通常是器官特异性的，所以免疫组分包括抗原特异性成分，作为触发物、作为靶标，或作为这两者的某种组合。这可能通过自身免疫的多种临床前模型得到最好的说明，在这些模型中，病理状况可以通过在适当的刺激条件下施用确定的抗原而引发。对于某些人自身免疫病，诱导病理状况并在自身免疫应答过程中被识别的抗原是已知的。实例包括在1型糖尿病的情况下的胰岛抗原、多发性硬化中的髓鞘的组分以及在关节炎的情况下的瓜氨酸化抗原。
由荷肽MHC产物构成的纳米颗粒已被用于引发I类和II类MHC二者限制性耐受的形式。另一个引人注目的实例是用自身抗原修饰的红细胞诱导抗原无应答的深度状态的能力。这种特征归因于与其他细胞类型相比异常的周转率，以及消除红细胞残留物而不引起炎性反应的需要。细胞残留物的致耐受消除的现象并不局限于红细胞，因为输注经化学修饰的凋亡外周血淋巴细胞也可抑制自身免疫应答。
本文报道了识别II类MHC分子的羊驼来源的单结构域抗体片段(纳米抗体/VHH)的开发和表征。这些纳米抗体靶向所有II类MHC阳性细胞，包括抗原呈递细胞(APC)。在常规免疫球蛋白尺寸的十分之一下，小尺寸的纳米抗体确保了出色的组织穿透和从循环中的快速清除。这使得VHH成为靶向递送目的载荷的理想载剂，例如抗原肽或小分子药物。此外，还建立了使用定位酶A(金黄色葡萄球菌来源的转肽酶)的改造策略。它能够对这些VHH在其C末端进行位点特异性修饰。将经定位酶修饰的II类MHC特异性纳米抗体用作正电子发射断层成像的显像剂，其结果与短的循环半衰期一致，同时具有出色的靶向特性。这些方法同样允许设置参与感染性疾病和自身免疫病的多种抗原。普遍的共识是，抗原呈递细胞在非炎性条件下的接合可导致耐受，而在炎性条件下施用(例如在佐剂存在下施用)可引发强的针对外源抗原的保护性应答。抗原的价态、聚集状态和剂量是可使摆从耐受原摆动到免疫原的另外的参数。不同解剖部位上多种APC的分布及其动态对体内相关耐受原性APC的识别提出了挑战。本研究的目的不在于确定负责耐受诱导的特定APC(亚)群，而在于表明在不同环境中使用VHH以靶向II类MHC阳性细胞群，包括靶向递送地塞米松(免疫抑制小分子)的效力。荷有自身肽的经纯化树突状细胞的临床使用是有记录的事项，但如果施用纯蛋白质制剂可产生相同效果，则存在避免基于细胞的治疗的实际优势。事实上，研究结果表明，在有明显疾病迹象的动物中，II类MHC VHH-肽加合物和与地塞米松缀合的相同VHH的组合在阻止EAE进展方面非常有效。
方法
VHH的表达与内毒素去除
使含有编码相应VHH的质粒的WK6大肠杆菌在Terrific Broth加氨苄青霉素中在37℃下生长至对数中期，并在30℃下用1mM IPTG诱导过夜。通过在4℃下以5,000×g离心15分钟收获细菌，并随后将其重悬于25mL的1×TES缓冲液(200mM Tris，pH 8，0.65mM EDTA，0.5M蔗糖)/升培养物中，并在4℃下搅拌孵育1小时。然后，将重悬的细胞在0.25×TES缓冲液中以1∶4稀释进行渗透压冲击，并在4℃下孵育过夜。将周质级分通过在4℃下以5,000×g离心30分钟分离，并随后在50mM Tris、pH 8、150mM NaCl和10mM咪唑中加载到Ni-NTA(Qiagen)上。将蛋白质在50mM Tris、pH 8、150mM NaCl、500mM咪唑和10％甘油中洗脱，并随后在50mM Tris、pH 8、150mM NaCl、10％甘油中加载至Superdex 75 10/300柱上。回收了峰级分，并将其回弹(rebound)至Ni-NTA，以耗竭LPS(＜2IU/mg)。将结合的VHH用40个柱体积的PBS+0.1％TritonX-114洗涤，并用500mM咪唑在2.5个柱体积的无内毒素PBS(Teknova)中洗脱。将咪唑通过PD10柱(GE Healthcare)移出，在不含LPS的PBS中洗脱。通过SDS/PAGE和LC-MS评估重组VHH纯度。
GGG抗原、GGG-Cy5和GGG-DEX的化学合成
肽是根据标准固相肽合成(solid phase peptide synthesis，SPPS)方案在2-氯三苯甲基树脂(ChemImpex)上合成的，或在GenScript上订购的。对于GGG-Cy5，将GGGC(SEQID NO：61)(7.0mg，24μmol)溶解在DMSO(Sigma Aldrich)(400μL)中，并添加至花菁5马来酰亚胺(Lumiprobe)(5.0mg，7.8μmol)。将所得混合物在室温下轻轻搅拌，直至LC-MS分析显示无剩余起始物质。然后将连接的产物通过RP-HPLC纯化并冻干。对于GGG-Cy5：C47H62N8O8S2[M+H]+，LC-MS的计算值为898.44，实测值为898.56。将所得粉末储存在4℃下。
对于GGG-地塞米松(DEX)，在第一个反应中，将地塞米松(Sigma Aldrich)(25mg，64μmol)和N-β-马来酰亚胺丙酸酰肼(ThermoFisher)(40mg，135μmol)溶解在3.0mL的无水MeOH(Sigma Aldrich)中，并向该溶液添加一滴TFA。将所得混合物在室温下搅拌过夜。然后蒸发MeOH，将沉淀物溶解在DMSO(1.0mL)中，通过RP-HPLC纯化并冻干。对于DEX-马来酰亚胺：C29H37FN3O7[M+H]+，LC-MS的计算值为558.26，实测值为558.32。将所得粉末储存在-20℃下。在第二个反应中，将DEX-马来酰亚胺(20mg，36μmol)和GGGC(SEQ ID NO：61)(21mg，72μmol)溶解于在DMSO中的5％0.1M NaHCO3(1.0mL)中。在室温下搅拌所得混合物，直至反应完成。一旦无起始物质残余，则通过RP-HPLC直接纯化反应物并冻干。对于GGG-DEX：C38H53FN7O12S[M+H]+，LC-MS的计算值为850.35，实测值为850.21。将所得肽储存在-20℃下，并在定位酶连接之前将其以合适的浓度重新溶解在PBS中。
具有携带GGG的部分的GFP或VHH的C-末端分拣标记(使用LPETGG(SEQ ID NO：43)
在含有Tris HCl(50mM，pH 7.5)、CaCl2(10mM)、NaCl(150mM)、含三甘氨酸探针(500μM)、含GGG探针(100μM)和5M-定位酶A(5μM)的1mL混合物中进行分拣标记反应。在4℃下搅拌孵育1.5小时之后，将未反应的VHH和5M-SrtA通过吸附到Ni-NTA琼脂糖珠上来去除。将未结合的级分浓缩并且Amicon 3,000kDa MWCO过滤装置(Millipore)上的亲核体过量。通过LC-MS分析反应产物的纯度，并将反应产物储存在-80℃下。
小鼠
所有动物均容纳在波士顿儿童医院(Boston Children’s Hospital，BCH)的动物机构中，并按照BCH动物护理委员会批准的方案进行饲养。C57BL/6J(CD45.2+)、B6.SJL-Ptprc(CD45.1+)、NOD/SCID、BALB/c、B6/2D2、NOD/BDC2.5、Balbc/DO11.10、CD11c-DTR、μMT-/-、Batf3-/-、LAG3-/-和FoxP3-DTR小鼠购自Jackson实验室或在内部繁育。MHCII-GFP和PD1-/-小鼠在内部繁育。OTI Rag2-/-和HLA-DR4-IE-转基因C57BL/6 IAb null小鼠购自Taconic。
流式细胞术分析
从脾、淋巴结或其他器官中收获细胞，并使用1mL注射器柱塞尾部(back)通过40微米细胞过滤器将细胞分散到RPMI1640中。对细胞混合物进行低渗裂解(NH4Cl)以去除红细胞，在FACS缓冲液(PBS中，2mM EDTA和1％FBS)中洗涤两次，并重悬于含有相应荧光染料缀合抗体的FACS缓冲液中。所有染色均以1∶100的稀释度并用Fc阻断剂在4℃下在黑暗中进行30分钟。将样品使用FACS缓冲液洗涤两次，然后进一步分析。所有流式数据均在FACSFortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上获得，并使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。
本研究中使用的抗体列于表3中。
表3.数据图中用于免疫表型表征的抗体
靶标 颜色 克隆 制造商 目录编号
B220 Alexa 700 RA3-6B2 eBioscience 56-0452-82
CD115(CSF1R) PeCy7 AFS98 BioLegend 135523
CD11b APC M1/70 BioLegend 101212
CD11b BV711 M1/70 BioLegend 101242
CD11c PerCP N418 BioLegend 117326
CD11c BV605 N418 BioLegend 117333
CD19 PE 6D5 BioLegend 115508
CD27 APC-Cy7 LG.3A10 BioLegend 124225
CD3 BV421 17A2 BioLegend 100228
CD4 FITC GK1.5 BioLegend 100406
CD4 APC RM4-5 BioLegend 100516
CD4 PeCy7 RM4-5 BioLegend 100528
CD44 PE IM7 BioLegend 103008
CD45.1 PeCy7 A20 eBioscience 25-0453-82
CD45.2 APC 104 BioLegend 109814
CD45.2 PeCy7 104 BioLegend 109830
CD5 PE 53-7.3 BioLegend 100607
CD62L PeCy7 MEL-14 BioLegend 104418
CD8 APC-Cy7 53-6.7 BioLegend 100714
CD95 PeCy7 Jo2 BD Bioscience 557653
Fc阻断剂(CD16/CD32) N/A 93 BioLegend 101302
FoxP3 eFluor 450 FJK-16s eBioscience 2136519
FoxP3 FITC FJK-16s Invitrogen 430671
IFNγ FITC XMG1.2 BioLegend 505806
IgD BV711 11-26c.2a BioLegend 405731
IL17a PE TC11-18H10.1 BioLegend 506904
Lag3(CD223) PE eBioC9B7W eBioscience 12-2231-81
LAP PE TW7-16B4 BD Bioscience 563143
MHC II类(I-A/I-E) PE M5/114.15.2 BioLegend 107608
PD1(CD279) PeCy7 29F.1A12 BioLegend 135216
PDCA-1(CD317) PE 129C1 BioLegend 127103
TCRa3.2 APC RR3-16 Invitrogen 17-5799-82
TCRb11 PerCP-eFluor 710 RR3-15 eBioscience 46-5827-80
Tim-3(CD366) PE RMT3-23 BioLegend 119704
C57BL/6J小鼠中实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)模型
将雌性C57BL/6小鼠(10至12周龄)或具有C57BL/6J遗传背景的其他小鼠品系用Hooke试剂盒：在PBS中的PTX和在CFA中的MOG35-55的乳剂，按照制造商的说明(Hookelaboratories)进行免疫接种。从免疫接种之后第7天开始，由对单独小鼠的实验处理不知情的研究者每天对小鼠评分。将小鼠随机分配至不同的实验处理，并使其一起共居，以消除笼间变异性。所有处理均在至少3只小鼠上和至少两个独立实验中进行，如图例所示。所有动物均被纳入分析。临床评分定义如下：1：尾巴无力；2：后肢部分瘫痪；3：后肢完全瘫痪；4：后肢完全瘫痪和前肢部分瘫痪；以及5：濒死。在整个疾病进展过程中，为实验小鼠提供了易于获取的潮湿食物和水。对于预防性处理，除非另有说明，否则在EAE诱导之前7天静脉内施用20μg经分拣标记的VHH-抗原。对于治疗性处理，当小鼠表现出如所示的定义为临床评分为1、2和3的症状时，在EAE当天施用20μg VHHMHCII-OVA323-339、VHHMHCII-MOG35-55或20μgVHHMHCII-MOG35-55混合的20μg VHHMHCII-DEX。在EAE诱导之后第30天或当小鼠达到临床评分为4时，将小鼠通过窒息处死，并随后用在PBS中的5mM EDTA灌注。将脊髓分离并在10％(wt/vol)福尔马林溶液(Sigma)中固定，包埋在石蜡中，以20μm切片，并用H&E或勒克司坚牢蓝染色(哈佛医学院啮齿动物组织学中心设施(Harvard Medical School Rodent HistologyCore Facility))。将经染色切片以4×和10×放大倍率成像。通过使脊髓均质化来分离浸润脊髓的免疫细胞，然后进行38％Percoll(Sigma)梯度分离(100％Percoll为1.123g/mL)。将分离的细胞平板接种在48孔板中，并在完全RPMI培养基中于37℃下用50ng/mL PMA(Sigma)和500ng/mL离子霉素(Sigma)处理2小时，然后添加10μg/mL莫能菌素(Sigma)，并再孵育2小时。然后将细胞使用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(ThermoFisher Scientific，00-5523-00)根据制造商的方案进行表面染色、固定和透化。胞内和Foxp3染色根据制造商的方案进行，并随后将细胞样品用于流式细胞术。
对于细胞因子风暴分析，在这些EAE小鼠达到临床评分为3的第一天，在使用20μgVHHMHCII-MOG35-55、VHHMHCII-OVA323-339或20μg VHHMHCII-MOG35-55+20μg VHHMHCII-DEX治疗性处理之后5小时采集血液样品。在含有EDTA的管中收集血液，并将血浆通过重复离心(500g，5分钟，4℃)分离。将血浆储存在-80℃下，直至进一步分析肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactor alpha，TNF-α)和白介素6(IL-6)。根据制造商的方案进行TNF-α(ThermoFisher，88-7324-22)和IL-6(ThermoFisher，88-7064-22)ELISA。
细胞亚群耗竭
在用VHH-抗原进行预防性处理之前2周开始并在整个EAE观察窗期内，通过每周两次腹膜内施用400μg抗CD8α耗竭抗体(克隆2.43，BioXCell)来耗竭CD8 T细胞。从预防性处理之前2周到实验设置结束，通过每隔一天注射300μg抗CSF1R(克隆AFS98，BioXCell)消耗巨噬细胞亚群。为了耗竭DC，在施用VHH-抗原之前2天，将100ng DTX(Sigma)腹膜内施用到CD11c-DTR小鼠中。为了耗竭Treg，在用VHH-抗原进行预防性处理之前的第-9天、第-8天和第-1天，向FoxP3-DTR小鼠腹膜内注射3剂量的1μg DTX(Sigma)，并且之后每周一次直到观察窗结束。通过PBMC或脾细胞的流式细胞术确认细胞耗竭。
2D2 CD4 T细胞过继性转移和攻击
将来自2D2小鼠的脾来源的和iLN来源的CD4 T细胞使用磁珠(Miltenyi Biotec，130-104-453)通过阴性选择富集，并用Violet CellTrace(ThermoFisher Scientific，C34571)按照制造商的方案标记。将500,000个这些2D2 CD4+T细胞转移到CD45.1+小鼠中。在过继性转移之后的那一天进行与作为佐剂的50μg PolyI：C(Sigma)和25μg抗CD40(SouthernBiotech)混合的20μg VHHMHCII-OVA323-339、20μg VHHMHCII-MOG35-55、等摩尔的MOG35-55肽或100μg MOG35-55肽的输注。在第3、5和10天，将小鼠处死，并收集脾、iLN和血液，并通过流式细胞术进行分析。一些2D2T细胞过继性转移的小鼠也在第3天或第10天用CFA中的100μg MOG35-55皮下攻击。如各个实验设置中所示，在7天或5天之后处死小鼠。收获脾、iLN和血液，并通过流式细胞术进行分析。
2D2 CD4 T细胞RNA-seq
将细胞分选并在补充有β-巯基乙醇的RLT裂解缓冲液(Qiagen)中裂解。将RNA使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案分离。将20ng的RNA用作经改变的SMART-seq2方案的输入。使用在Bioanalyzer 2100系统(Agilent)上运行的高灵敏度DNA芯片来确认所得文库，随后使用Nextera XT试剂盒(Illumina)和定制索引引物(index primer)根据制造商的方案来制备文库。使用Qubit dsDNA HS测定试剂盒(Invitrogen)和在Bioanalyzer 2100系统(Agilent)上运行的高灵敏度DNA芯片对最终文库进行量化。使用Nextseq高输出Cartridge试剂盒和Nextseq500测序仪(Illumina)对所有文库进行测序。使用bcl2fastq程序对测序的文库进行分路(demultiplex)，并用Trimmomatic修剪和裁剪(trim and crop)所得的Fastq数据。使用Kallisto进行与小鼠mm10参考基因组的比对和基因表达计数。在R中进行主成分分析(Principal Component Analyses，PCA)。为了测试我们的RNA-seq数据中的差异基因表达和个体基因座中的差异染色质可及性，使用了DEseq2方法。使用NumPy 1.12.1和Matplotlib 2.2.2在Python 3.6中产生火山图和热图。对于功能分析，将Gorilla(基因本体富集分析和可视化工具)用于在前500个最大差异表达基因的上调和下调亚组中寻找富集的基因本体(Gene Ontology，GO)项。
NOD/SCID小鼠中1型糖尿病(T1D)模型
从7至9周龄的BDC2.5小鼠收获脾和腹股沟淋巴结。将细胞重悬于补充有0.5μMp31肽(BDC2.5模拟表位，GenScript)的完全RPMI(补充有2mM glutaMAX、10mM HEPES、非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、55μMβ-巯基乙醇、10％热灭活FBS的RPMI)培养基中，并以100万个细胞/mL平板接种在组织培养皿中。在四天之后，收获细胞，洗涤两次，并重悬于PBS中。将500万个细胞通过眶后注射过继性转移到9至12周龄雌性NOD.SCID小鼠中。按指示在一天或5天之后向小鼠输注盐水、20μg VHHMHCII-p31或VHHMHCII-MOG35-55。每隔一天进行血糖测量，持续2周，以及每周一次进行血糖测量，持续1至2个月。当小鼠的血糖水平在随后两周内超过260mg/dL(如通过使用Active仪(Accu-Chek)(范围20至600mg/dL)以及相应Aviva Plus测试条(Accu-Chek)进行测量的)时，该小鼠被视为患有糖尿病。
当在随后两周内血糖水平超过600mg/dL时或在2个月终点时，将小鼠通过窒息处死。将胰腺固定以进行进一步的免疫组织化学分析，即H&E染色(哈佛医学院啮齿动物组织学中心设施)。在另外的小鼠组群中，在过继性转移之后第14天收获脾、腹股沟/胰腺淋巴结和胰腺，以用于流式细胞术分析。
BALB/c小鼠中类风湿性关节炎(RA)模型
从DO11.10小鼠收集脾和淋巴结。将来自这些小鼠的CD4+T细胞通过阴性选择使用磁珠(Miltenyi Biotec，130-104-453)富集。通过在2000rad下对DO11.10脾细胞进行辐照来获得APC。通过如下进行的培养来诱导这些初始CD4 T细胞分化为Th1表型：将200,000个CD4+T细胞和200万个APC在含有0.3μM OVA323-339(GenScript)、5ng/mL IL12(PeproTech)和10μg/mL抗IL4mAb(R&D系统)的完全RPMI培养基中共培养3天。然后将细胞收获，洗涤并计数。向BALB/c接受者静脉内注射总计200万个Th1 DO11.10 T细胞。在T细胞转移之后一天，将接受者用CFA(Sigma-Aldrich)中的100μg OVA皮下免疫接种。在第11天，将热聚集的OVA(HOA)注射到小鼠的左爪中，并且每天测量爪厚度直到第18天。然后将小鼠处死，取出爪并在10％(wt/vol)福尔马林溶液(Sigma)中固定，包埋在石蜡中，以20μm切片，并用甲苯胺蓝染色(哈佛医学院啮齿动物组织学中心设施)。将经染色的切片以4×和10×放大倍率成像。还收集了胭淋巴结，并将细胞在体外用在完全RPMI中的1mg/mL OVA进行了再刺激，持续3天，以产生IFN-γ。使用小鼠IFN-γELISA Set(BD Biosciences，555138)按照制造商的方案测量IFNγ。还在D18终点处收集血清用于ELISA测定，以测量抗OVA和抗OVA323-339抗体应答。将96孔板用在PBS中的10μg/mL的OVA或GFP-OVA323-339蛋白(通过用GGG-OVA323-339对GFP-LPETGG(SEQ ID NO：43)进行分拣标记产生)在4℃下包被过夜，并在封闭缓冲液(PBS中0.05％吐温20+2％BSA)中孵育，然后添加血清样品。与受试血清在室温下孵育3小时。将板用PBS洗涤4次，与山羊抗小鼠IgG-HRP(SouthernBiotech)以1∶10,000在封闭缓冲液中孵育1小时，并用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)液体底物试剂(Sigma)显影。用1M HCl停止反应，并在450nm处读取吸光度。
OTI CD8 T细胞过继性转移及攻击
从OTI Rag2-/-小鼠收集了脾和淋巴结。将来自OTI Rag2-/-的CD8+T细胞通过阴性选择使用磁珠(Miltenyi Biotec，130-095-236)富集，并使用Violet CellTrace根据制造商的方案标记。将500,000个CD8+T细胞静脉内转移到CD45.1+小鼠中。在过继性转移之后的那一天进行20μg VHHMHCII-OTI或VHHMHCII-ORF8输注。将小鼠在第10天用在CFA(Sigma)中的25μg OTI肽攻击，并随后在5天之后处死小鼠用于分析。收获脾、iLN和血液，并通过流式细胞术分析脾细胞。
将200万个脾细胞平板接种在96孔圆底板中，并在补充有1mg/mL OVA肽的完全RPMI[RPMI 1640，10％(vol/vol)热灭活FBS，50μMβ-巯基乙醇，100U/mL Pen/Strep，1×Gibco MEM非必需氨基酸溶液(Life Technologies)，1mM丙酮酸钠，1mM HEPES]中用细胞刺激混合物(eBioscience)和布雷菲德菌素A(eBioscience)在37℃下处理3天。收集上清液并用于ELISA，以测量干扰素γ(FNγ)产生。使用小鼠IFN-γELISA Set(BD Biosciences，555138)根据制造商的方案测量IFNγ。
重复输注VHHMHCII-OB1
OB1是来源于OVA的17聚体B细胞表位。在第0天，向C57BL6/J接受者小鼠静脉内注射20μg VHHMHCII-OB1、等摩尔量的OVA蛋白或PBS。在第7天和第14天进行随后的加强。在免疫接种之前以及在最后一次加强之后7天收集血清样品。对于OVA特异性和OB1肽特异性ELISA，将96孔板用在PBS中的10μg/mL的OVA或GFP-OB1蛋白在4℃下包被过夜，并在封闭缓冲液(PBS中的0.05％吐温20+2％BSA)中孵育，然后添加血清样品。与受试血清在室温下孵育3小时。将板用PBS洗涤4次，与山羊抗小鼠IgG-HRP(SouthernBiotech)以1∶10,000在封闭缓冲液中孵育1小时，并用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)液体底物试剂(Sigma)显影。用1MHCl终止反应，并在450nm处读取吸光度。
HLA-DR4-IE转基因C57BL/6 IAb null小鼠中的EAE模型
将DR4-IE小鼠用在CFA中乳化的400μg人PLP175-192(hPLP175-192)进行皮下免疫接种。在第0天和第3天，小鼠还静脉内接受了300ng百日咳毒素。在第7天，将小鼠用在不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant，IFA)中乳化的400μg的hPLP175-192进行皮下第二次加强。从免疫接种之后第7天开始，每天对小鼠称重并评分。临床评分系统的进行与C56BL/6J小鼠中的EAE模型相似。在第一天，小鼠达到临床评分为3，静脉内施用携带20μg抗人MHCII VHH(VHHhMHCII)的不相关肽对照或与20μg VHHhMHCII-DEX混合的20μg VHHhMHCII-hPLP175-192。脊髓的流式细胞术如上所述。
统计方法
所有数据至少代表了两个独立的实验。所有统计分析均使用Prism 6进行。所用的统计方法如各图相应的图例所示。统计学显著的差异用星号如下表示：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
结果
单剂量的VHHMHCII-MOG35-55针对诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)提供了持久的保护。
本文描述了羊驼来源的单结构域抗体(即VHHMHCII)的产生和表征，所述抗体识别多种小鼠II类MHC分子，包括I-Ab和I-Ad。该VHH被改造为携带定位酶识别基序-LPETGG(SEQ IDNO：43)-以允许其位点特异性连接(图1A)至抗原肽和用至少一个适当暴露的甘氨酸残基修饰的小分子。表4中列出了以这种方式与VHH缀合的抗原肽。通过LC-MS对纯化的VHH-肽加合物进行表征(图1B和图8)，以验证其身份、同质性和纯度。
表4.抗原肽探针的氨基酸序列
在炎性条件下，即在存在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)和百日咳毒素(PTX)的情况下，在10至14天内用MOG35-55对C57BL/6小鼠进行免疫接种引发了实验性自身免疫性脑炎(EAE)(多发性硬化样病症)。预测在非炎性条件下递送至MHCII+APC的MOG35-55先前施用干扰EAE的诱导。为了确定可能干扰症状发作和严重程度的VHH-肽加合物的可能剂量，在诱导疾病之前7天静脉内(i.v.)施用3个剂量20μg VHHMHCII-MOG35-55加合物。该处理完全抑制了EAE的诱导，而接受相同量的与无关肽缀合的VHHMHCII(VHHMHCII-OVA323-339)，或与无关特异性VHH(VHHGFP)连接的MOG35-55肽的小鼠进展至EAE(图1C)。甚至20μg VHHMHCII-MOG35-55的单次注射也实现了完全保护(图1D和1E)，因此在所有随后的实验中使用该剂量。从在免疫接种之后第15至18天患病小鼠以及EAE诱导之后第30天受保护小鼠的脊髓中回收的CD4+淋巴细胞浸润物的流式细胞术与观察到的疾病评分一致：患病小鼠表现出产生IL17和IFNγ的CD4+ T细胞以及一些Foxp3+CD4+调节性T细胞的显著流入(图1F和9A至9E)。与来自进展至EAE的动物的样品不同，在诱导EAE之前接受VHHMHCII-MOG35-55的小鼠的脊髓切片的H&E和勒克司坚牢蓝染色显示出髓鞘的维持和免疫细胞浸润减少(图1G和1H)。结果表明，在诱导EAE之前施用的单20μg剂量的VHHMHCII-MOG35-55加合物足以预防疾病的发作。
为了探索VHHMHCII-MOG35-55诱导的保护的持久性，在EAE诱导之前一或两个月，施用单剂量的VHHMHCII-MOG35-55与MOG35-55/CFA/PTX混合物。观察到延迟发作(如果不是完全抑制EAE的话)(图1I、10A和10B)。尽管游离VHHMHCII-MOG35-55的循环半衰期短(估计＜0.5小时)，但VHHMHCII-MOG35-55赋予更长的保护。为了探索对EAE的耐受程度，在第一次EAE攻击之后37天，在PTX存在的情况下，用第二次施用MOG35-55/CFA来再次攻击受保护小鼠。虽然进行了该第二次高度炎性攻击，但一旦受到保护，小鼠就不会表现出发生EAE的迹象(图1J、11A和11B)。因此，单剂量的VHHMHCII-MOG35-55(甚至在其施用之后数周)引起的耐受提供了持久的保护。
脾CD11c+DC是与诱导抗原特异性耐受相关的APC
为了探索VHHMHCII介导的耐受诱导的可能机制，产生了VHHMHCII-Alexa 647(图12A和12B)，并将其(i.v.)注射到MHCII-GFP小鼠中，以追踪VHHMHCII-Alexa647的生物分布。这些小鼠带有编码I-Ab-GFP融合体的靶向基因替换。它取代内源性I-Ab基因座，并确保所有II类MHC+细胞表达GFP。在注射之后1.5小时，VHHMHCII-Alexa647被脾和循环MHCII-GFP+细胞群捕获(图2A和13)。荧光VHHMHCII加合物被B细胞和DC亚群捕获，包括脾CD8a+DC、CD4-常规DC(cDC)，以及CD4+cDC，但不包括浆细胞样DC(图13)。
静脉内但非皮下或腹膜内注射VHHMHCII-MOG35-55防止诱导EAE(图14)。这暗示脾或血流作为耐受诱导位点的作用。因此，将20μg的VHHMHCII-MOG35-55(图2B和15A至15C)注射(i.v.)到小鼠中，并在一周之后收获脾细胞和全血作为供体细胞的来源。然后，原初小鼠接受了来自经VHHMHCII-MOG35-55处理的动物的2000万个未分级脾细胞或外周血单个核细胞(PBMC)。在细胞转移之后一天，施用CFA+PTX中的MOG35-55以诱导EAE(图2B和15A至15C)。在接受来自用VHHMHCII-MOG35-55处理的小鼠的脾细胞的小鼠中，平均临床EAE评分显著降低(图2B和15A至15C)。巨噬细胞和CD8 T细胞通过施用相应的耗竭抗体在体内被消除：所述耗竭抗体分别是抗CFS1R抗体和抗-CD8α抗体(图2C、16A和16B)。为了耗竭DC，在CD11c-DTR(白喉毒素受体)小鼠中施用白喉毒素(DTX)(图2C、16A和16B)。为了测试B细胞的可能参与，将VHHMHCII-MOG35-55施用到缺乏B细胞的μMt-小鼠中。只有CD11c+DC的消除降低了VHHMHCII-MOG35-55提供的保护措施(图2C、16A和16B)。产生了两种VHH-MOG35-55加合物，推测其靶向不同但重叠的髓系细胞亚群。这些加合物包括针对CD11b(主要存在于巨噬细胞上)的VHH和识别CD11c(主要存在于树突状细胞上)的VHH(图8)。只有VHHCD11c-MOG35-55组合提供了中等水平的针对EAE诱导的保护(图2D和17)，这与消除CD11c+细胞的结果一致。用VHHMHCII-MOG35-55处理的Batf3-/-小鼠仍对EAE诱导有抗性。因此，在这种情况下，CD8α+DC对致耐受APC组没有明显贡献(图18)。
为了确定通过不仅仅是最小表位的VHHMHCII的递送是否同样可诱导耐受，产生了VHHMHCII-MOG17-78，并在攻击之前7天用于处理小鼠。VHHMHCII-MOG17-78同样有针对EAE诱导的保护作用(图2E和2F)。
VHHMHCII-MOG35-55的施用引起了MOG35-55特异性CD4 T细胞的增殖爆发，随后发生消耗。
为了研究VHHMHCII-MOG35-55加合物对具有确定抗原特异性的T细胞的影响，使用2D2TCR转基因小鼠作为识别I-Ab-MOG35-55复合物的单克隆CD4+ T细胞的来源。将同类系标记的Violet CellTrace标记的2D2 CD45.2+CD4+ T细胞转移至CD45.1接受者中，然后在一天之后注射(i.v.)VHHMHCII肽加合物。追踪脾、腹股沟淋巴结(iLN)和血液中的2D2细胞数，持续10天。接受VHHMHCII-MOG35-55，2D2 CD4+ T细胞的小鼠在注射之后5天经历了初始的扩增爆发，随后是收缩，如通过从脾、iLN和血液中回收的2D2细胞的绝对数以及CD4+细胞的使用非侵入性正电子发射断层(PET)成像进行的全身成像来确定的(图3A和19)。这种消失发生在数次细胞分裂之后，因为所有回收的2D2 CD4 T细胞都经历过抗原并已分裂，如VioletCellTrace稀释所示(图3B)。与施用的VHHMHCII-MOG35-55加合物等摩尔量的MOG35-55的递送导致不超过约5％的2D2 T细胞分裂。因此VHHMHCII介导的抗原递送明显增强了其呈递(图3B)。
在施用VHHMHCII-MOG35-55之后，MOG特异性2D2 CD4 T细胞上调共抑制受体。
为了证实这些结果，检查了VHHMHCII-MOG35-55接受者中2D2 T细胞的转录组。对不同分裂期的2D2 CD4 T细胞进行分选(图3B)，并进行RNAseq分析。注射VHHMHCII-MOG35-55上调了共抑制受体转录物以及负调节转录因子。LAG3转录物在量级和意义上都很突出(图3C、3D和20A至20E)。在蛋白质水平上，这些2D2 T细胞也显示出较高水平的凋亡和衰竭标志物，如PD1和LAG3，但Tim3、Fas/CD95或LAP并不如此(图3E和21)。在注射之后第3天，VHHMHCII-MOG35-55接受者中的2D2 CD4 T细胞可能异常地未能下调CD62L，而仍保持CD44+(图21)。当将LAG3-/-小鼠用单剂量的VHHMHCII-MOG35-55处理并随后通过诱导EAE攻击时，保护丧失(虽然有显著的延迟)，而PD1-/-小鼠仍然被VHHMHCII-MOG35-55耐受(图3F)。2D2 TCR转基因小鼠中LAG3的耗竭导致自发性EAE。由于活化的效应T细胞和Treg二者均表达LAG3，因此评价了调节性T细胞的增加是否会导致VHHMHCII-MOG35-55施加的耐受。
VHHMHCII-MOG35-55的施用诱导了MOG35-55特异性调节性CD4 T细胞。
为了揭示调节性T细胞在VHHMHCII-MOG35-55介导的耐受中的作用，通过施用DTX在Foxp3-DTR小鼠中消除了Treg(图22A至22D)。经处理的小鼠丧失了Treg，并且不再防御EAE，表明了其对VHHMHCII-MOG35-55施加的耐受的贡献(图22A至22D)。VHHMHCII-MOG35-55的施用增加了FoxP3+MOG35-55特异性Treg的数目(图22A至22D)。除了Treg数目增加之外，耗竭标志物的表达在施用VHHMHCII-MOG35-55之后也提高。最后，将接受2D2 T细胞的小鼠在第10天用MOG35-55/CFA攻击。接受VHHMHCII-MOG35-55的小鼠中的2D2 T细胞无应答，而注射有VHHMHCII-OVA323-339的小鼠中的2D2 T细胞稳健增殖(图3G)。这强调了VHHMHCII-MOG35-55诱导耐受的抗原特异性。
VHHMHCII-抗原加合物也在其他自身免疫模型中以抗原特异性方式起作用。
接下来，测试了VHH-抗原加合物干扰其他自身免疫病症的能力。对于1型糖尿病(T1D)，使用了模拟自身反应性T细胞介导的β细胞破坏的侵袭性BDC2.5 T细胞过继性转移模型。携带BDC2.5 T细胞受体的转基因CD4 T细胞识别胰腺β细胞，并可用模拟表位p31离体活化。在NOD/SCID小鼠中，这样的活化的BDC2.5 T细胞在转移之后8天内引起高血糖。p31与VHHMHCII缀合(图8)。将接受活化的BDC2.5脾细胞的NOD/SCID小鼠在一天之后用盐水、20μgVHHMHCII-MOG35-55或20μg VHHMHCII-p31处理(图4A)。用盐水或p31处理的小鼠在转移之后第8天成为高血糖的(图4A和23A至23C)。只有用VHHMHCII-p31处理的小鼠在实验期间维持血糖量正常(图4A和23A至23C)。经VHHMHCII-P31处理的小鼠在其胰腺和次级淋巴样器官中的BDC2.5CD4 T细胞较少(图23A至23C)。受保护小鼠中的胰岛保持完整(图4B)。即使在活化的BDC2.5T细胞转移之后第5天将VHHMHCII-p31施用于小鼠中时，也有轻度保护作用(图22C)。全胰岛素蛋白也与VHHMHCII连接(图24)。
在BALB/c接受者中，可通过以下诱导关节炎：静脉内转移识别OVA323-339的离体活化的Th1 DO11.10 T细胞，随后在一天之后足垫注射OVA/CFA乳剂，并在10天之后通过热聚集的卵清蛋白(HAO)进行攻击(图4C)。然后，通过在用HAO攻击之后第7天的组织学评估和测量爪厚度来监测小鼠关节炎的发生。VHHMHCII-OVA323-339的预先施用减少了暴露于卵清蛋白之后的关节炎症，而VHHMHCII-MOG35-55无作用(图4C和25A至25E)。用VHHMHCII-OVA323-339处理的小鼠也显示较少的软骨破坏迹象(图4D)。当用OVA离体刺激时，从用VHHMHCII-OVA323-339处理的小鼠的腘淋巴结获得的免疫细胞不能产生IFNγ(图25A至25E)。或许并非出人意料地，用VHHMHCII-OVA323-339处理的小鼠的血清也具有较低水平的抗OVA和抗OVA323-339IgG1抗体(图25A至25E)。
总之，这些结果确认了VHHMHCII-抗原加合物能够减轻由活化的、自身反应性CD4 T细胞造成的伤害。潜在机制在小鼠MHC单倍型之间必须是保守的。
VHHMHCII-抗原加合物也抑制CD8介导的T和B细胞应答。
为了确定施用VHHMHCII-抗原加合物是否影响CD8 T细胞应答，将OVA来源的CD8 T细胞表位SIINFEKL(H-2Kb限制的OTI肽)与VHHMHCII连接(图8)。小鼠接受同类系标记的OTI T细胞，然后在一天之后注射VHHMHCII-OTI或VHHMHCII-ORF8(在有或没有佐剂的情况下)(图4E)。来源于MCMV的ORF8表位由H-2b小鼠中的CD8 T细胞识别，并充当对照。在转移之后第10天，用OVA/CFA对接受者进行的再攻击未能活化任何剩余的OTI T细胞(图4F)。为了探索施用VHHMHCII-抗原加合物是否类似地影响B细胞应答，用B细胞特异性OVA来源的表位(OB1)修饰VHHMHCII(图8)。向C57BL/6J接受者连续三次注射VHHMHCII-OBI未能引发针对完整OVA蛋白或OB1肽的IgG抗体应答(图4G和4H)，而接受等摩尔量游离OVA蛋白的小鼠则容易产生这样的抗体。
VHHMHCII-MOG35-55和VHHMHCII-地塞米松的共递送提高了治疗效力。
然后探索了向已经有EAE症状的小鼠施用VHHMHCII-MOG35-55的影响。将VHHMHCII-MOG35-55注射到已发展到临床评分为1(尾巴无力)的小鼠中，在16只小鼠中的9只中停止了EAE的进展(图5A和26)。在注射VHHMHCII-MOG35-55之后，16只小鼠中的剩余7只的总体状况迅速恶化(如颤抖；运动活性降低)，看起来与EAE无关。事实上，约40％接受VHHMHCII-MOG35-55的小鼠在输注之后的那一天死亡，与注射之前小鼠的临床评分无相关性。如IL-6和TNFα水平升高所示，抗原靶向递送至已发炎环境中引发的细胞因子风暴是原因(图5C)。
诱发的T细胞应答的多克隆性质和相当粗略的临床评分系统意味着患病组群中的异质性，这可解释为什么并非所有接受VHHMHCII-MOG35-55的动物的响应相似。然后检测是否可能共递送免疫抑制药物以避免细胞因子风暴。通过自水解腙接头与VHHMHCII连接的免疫抑制性皮质类固醇地塞米松被递送至II类MHC+细胞(VHHMHCII-DEX；图5B和27)。接受20μgVHHMHCII-MOG35-55和20μg VHHMHCII-DEX组合给药的小鼠存活下来，并恢复到较低的临床EAE临床评分，而无明显副作用(图5D)。临床评分的改善反映为脊髓中浸润性CD4 T细胞的减少(图28)。所观察到的益处仅需要为VHHMHCII-DEX加合物形式的0.5μg DEX的等同物。在另一方面，游离DEX仅在以100μg i.p.的约200倍高剂量施用时提供保护(图29A和29B)。治疗范围扩大到进展至EAE评分为2或3的动物，其全部对VHHMHCII-MOG35-55和VHHMHCII-DEX共施用的响应都是疾病进展停止，同样没有副作用。受影响的小鼠甚至显示疾病评分显著改善(图5E、5F和28)。令人惊讶的是，施用途径很重要，因为只有静脉内而非皮下或腹膜内递送VHHMHCII-DEX可提供预防性保护(图14)。
自身免疫病的人源化小鼠模型中的抗人MHCII VHH(VHHhMHCII)-抗原加合物
开发了识别多种人II类MHC分子的VHH(VHHhMHCII)。这种VHH是以已有定位酶(sortase-ready)的形式制备的，并用数种人来源的自身抗原进行修饰(图6A至6C)。
将人MOG97-108肽(TCFFRDHSYQEE(SEQ ID NO：53))、hPLP175-192肽(YIYFNTWTTCQSIAFPSK(SEQ ID NO：42))和DEX与VHHhMHCII连接(图6B)。测试了在HLA-DR4-IE转基因C57BL/6 I4bnull小鼠中共递送的这些加合物的效力，所述小鼠缺乏鼠MHC-II，但表达由人HLA-DR4的肽结合结构域和小鼠IE(DR4-IE)的膜近端结构域构成的转基因杂交MHC-II分子。在施用之后20天，VHHhMHCII-MOG97-108降低了小鼠的EAE临床评分(n＝1，图6B)。将VHHhMHCII-OVA323-339用作阴性对照(n＝2，图6B)。
RA患者自身抗体的常见靶标是翻译后修饰的抗原，如携带瓜氨酸(经修饰的精氨酸残基)的纤维蛋白原α。因此，使用瓜氨酸化Fibα79-91(QDFTNCitINKLKNS(SEQ ID NO：50))对VHHhMHCII进行了修饰(图6C)。其说明了化学酶法的灵活性，与遗传方法不同，化学酶法很容易允许以位点特异性方式并入非天然或翻译后修饰的氨基酸。
为了探索VHHMHCII介导的耐受诱导机制，构建了VHHMHCII-Alexa647以追踪VHHMHCII加合物的生物分布。向II类MHC-GFP小鼠静脉内施用20μg VHHMHCII-Alexa647。在注射之后1.5小时时，体内脾MHCII-GFP+细胞群捕获了大部分VHUMHCII-Alexa647(图7A)。将VHHMHCII加合物递送至多个DC亚群，包括脾CD8α+DC、CD4阴性常规DC以及CD4+常规DC(图7B)。
在EAE模型中，静脉内而非皮下或腹膜内注射VHHMHCII-MOG35-55赋予针对EAE诱导的保护(图14)。然后将20mg的VHHMHCII-MOG35-55注射(i.V.)到小鼠中，并在一周之后收获它们的脾细胞，并将2000万个总脾细胞转移到接受者小鼠组群中。在转移之后1天，诱导EAE(图7C)。平均临床EAE评分显著降低，这表明即使是未分级的脾细胞也诱导了VHHMHCII-MOG35-55介导的耐受(图7C)。进行耗竭实验以靶向脾APC亚群。通过向CD11c-DTR(白喉毒素受体)小鼠分别施用相应的耗竭剂、抗CD20抗体、抗CFS1R抗体和白喉毒素(DTX)来耗竭B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(图7D)。鉴定了推测APC靶向不同但重叠的APC亚群的三种不同的VHH：CD11b(主要存在于巨噬细胞上)、CD11c(主要存在于树突状细胞上)和Igk(B细胞)。这些VHH以已有定位酶的形式表达，并使用定位酶用GGG-MOG35-55进行位点特异性标记(图8)。只有VHHCD11c-MOG35-55提供了中等水平的针对EAE诱导的保护。这表明了CD11c+细胞作为致耐受APC的作用(图7E)。
讨论
诱导抗原特异性耐受是治疗自身免疫病的迫切目标。如果在诊断时考虑到病理状况的存在和预先存在的自身免疫，则这是一个需要明确的特别高的障碍。在症状出现之前，靶细胞的自身免疫破坏已经在进行中。因此，治疗必须不仅处理现有的自身免疫，而且也要处理表位扩散到起始损伤以外的可能性。除非可以明确识别易感群体，并且只有在引发不期望副作用的风险可接受地小的情况下，任何类型的预防性治疗的价值都是有限的。
除了抑制炎症之外，大规模免疫抑制一直是治疗自身免疫的支柱，而大规模免疫会提高感染性疾病的风险。虽然抗生素治疗至少可以部分缓解这一缺陷，但寻找更有针对性的方法来减弱不期望的免疫反应仍是当务之急。大多数自身免疫病是T细胞介导的；T细胞活化涉及专业抗原呈递细胞。如果抗原呈递细胞(APC)在炎性环境中获得抗原，则共刺激分子的上调以及细胞因子适当混合物的产生有助于T细胞活化。致耐受树突状细胞缺乏这样的共刺激信号，并因此在非炎性条件下的抗原呈递促进了非响应性或耐受的状态。这一概念推动了对致耐受树突状细胞的探索。树突状细胞可细分为具有不同功能能力的亚群，例如参与抗原交叉呈递的能力是主要归于DC1亚群的特性。对参与抗原获取的表面受体的鉴定已鉴定了DEC205、DC-SIGN和Clec9a，其与抗原进入交叉呈递途径特别相关。虽然主要作为期望免疫(如抗肿瘤应答)的强诱导剂被研究，但它们诱导调节性T细胞(作为减少不期望的应答的方法)的能力也被认为同样重要。
这种对树突状细胞相当狭隘的关注使早期的工作黯然失色，早期的工作即通过产生与自身抗原缀合的抗II类MHC抗体，将抗原靶向至在所有抗原呈递细胞上表达的II类MHC产物。毕竟，正是II类MHC肽复合物是CD4T细胞区室战斗的召唤。因此，在非炎性条件下将自身抗原递送至II类MHC阳性细胞，这是一种不能在多种APC亚群之间进行区分但仍然有效的策略。理想情况下，从生产和应用角度看，干预措施应具有抗原特异性且尽可能简单。
该数据确定了识别II类MHC产物的MOG35-55修饰的VHH可针对EAE的诱导对小鼠进行保护。单次注射10微克的加合物提供了在施用纳米抗体-肽加合物之后持续至少两个月的保护。在已经表现出EAE症状(评分为1、2或3)的动物中施用相同的VHHMHCII-MOG35-55加合物停止了进展，以及甚至部分逆转了症状的严重程度。当治疗具有EAE症状的动物时，只有一个亚组有响应，而剩余亚组显示出快速恶化，随后由于细胞因子风暴而死亡。在有症状的动物中，炎性环境已经存在，将VHHMHCII-MOG35-55加合物递送至APC仅是火上浇油。为了克服这种急性响应，共递送了VHHMHCII-地塞米松加合物，这显著提高了存活，没有死亡。
在抗CD40和聚dIdC(作为佐剂)存在的情况下，施用纳米抗体-肽加合物强烈增强了针对它们的抗体应答。在有慢性炎性反应的环境中，只有在有适当的对策时，施用才有可能，如在VHHMHCII-地塞米松加合物的情况下。
纳米抗体的药代动力学特性使其在构建抗体-药物缀合物(antibody-drugconjugate，ADC)方面具有吸引力。纳米抗体的循环半衰期比全尺寸抗体短得多，从而使对有毒化合物的全身暴露最小化。它们的靶向特性极好，确保一旦到达现场(on site)，自毁灭接头将主要在预定的位点释放载荷。基于全尺寸免疫球蛋白的ADC持续循环多至数周，并在连接药物的接头水解之后，将载荷直接释放到血流中。因此，VHHMHCII-地塞米松加合物具有期望的优良靶向特性，如通过非侵入性成像、短的循环半衰期和易于修饰所证实的。VHHMHCII识别的细胞靶标包括所有II类MHC阳性细胞。即使负责诱导耐受和引发细胞因子风暴的APC是不同的，基于II类MHC的靶向方法显然也涵盖了这两者。还没有找到纳米抗体药物加合物的全尺寸对应物应用的广泛范围，但这些数据表明这是一个不容忽视的机会。
至于抗II类纳米抗体诱导对连接的载荷的耐受之显著能力背后的机制，根据在敲除小鼠中或在某些细胞群耗竭之后观察到的响应，可以排除许多可能性。以下是未知的：如果在非炎性条件下靶向，则单一类型的APC是否可致耐受，而如果在炎性环境中遇到抗原，是否会激发强烈的响应。
实施例2.VHHMHCII-抗原融合蛋白作为有效的疫苗。
分离了结合MHC II类抗原的单结构域抗体片段(纳米抗体或VHH)(VHHMHCII)，并对其进行了表征，亲和力为纳摩尔级。为了使该疫苗平台适用于SARS-CoV-2，产生了由VHHMHCII和SARS-CoV-2受体结合结构域之间的融合组成的重组蛋白(VHHMHCII-刺突RBD)(图31A至31B)。
为了确认VHHMHCII-刺突RBD的免疫原性，将C57BL/6J小鼠用20ug的佐剂化(聚dIdC和抗CD40单克隆抗体)刺突RBD、佐剂化的VHHMHCII-刺突RBD或仅佐剂腹膜内初免，并随后在初免之后用同源疫苗加强，如所示的(图31C)。在第32天和第150天从所有动物中收集血清，并通过ELISA确定针对重组SARS-CoV-2刺突RBD的IgG效价(图31D)。与显示出多种免疫应答的刺突RBD相比，用VHHMHCII-刺突RBD融合体免疫接种始终产生更高效价的抗原特异性IgG。并非出乎意料的是，在第32天采样之后循环IgG的效价下降，但甚至在第150天，对于接受VHHMHCII-刺突RBD或刺突RBD的所有小鼠而言，仍持续存在针对刺突RBD的可轻易检测到的效价。甚至在第150天，接受VHHMHCII-刺突RBD融合体的小鼠中的抗体效价仍优于仅接受刺突RBD的组群中的抗体效价。可以预见，免疫前血清或从仅接受佐剂的小鼠获得的血清未显示出显著的抗刺突RBD抗体产生。免疫球蛋白亚类分析显示了类别转换的证据，因为在初始给药之后32天检测到高水平的IgA、IgG1和IgG2b(图31E)。特别值得注意的是，VHHMHCII-刺突RBD融合体引起的IgA应答更强，这将提供对呼吸道感染重要的黏膜保护。强得多的IgG1应答也很明显，与补体介导的调理细胞裂解相关。
接下来，通过测定所得血清对用SARS-CoV-2刺突糖蛋白假型化的水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)的中和能力，评价血清学应答的功能相关性。从用VHHMHCII-刺突RBD融合体免疫接种的小鼠获得的血清优于从仅用刺突RBD免疫接种的小鼠获得的血清(图31F)。后者显示出相当大的小鼠间差异，而接受VHHMHCII-刺突RBD的小鼠的响应更强，且个体小鼠之间更一致，这突出了抗原呈递细胞(APC)直接靶向的重要性。这与检测到的体液免疫应答水平一致。
稳健的CD8+T细胞应答对于清除病毒感染的细胞非常重要。因此，在佐剂存在的情况下，将小鼠用单剂量的VHHMHCII-刺突RBD或刺突RBD免疫接种(图32A)。在一周之后，收获脾细胞，并进行ELISpot测定以鉴定能够在体外引起IFNγ产生的肽，作为特异性T细胞应答的替代测量。使用重叠的15聚体肽，并鉴定出引起强烈应答的5种肽(42、47、48、49和50)(图32B至32D)。用刺突RBD免疫接种的小鼠仅识别一些肽，且信号比用VHHMHCII-刺突RBD免疫接种的小鼠弱得多，表明分泌IFNγ的细胞数较少。这些结果还表明至少有2个刺激区域。有趣的是，肽47至50属于循环SARS-CoV-2变体的已知突变之外的刺突RBD区域。在将脾细胞与选定的刺突RBD肽(42、47、48、49和50)共培养之后，针对IFNγ、IL6、IL2和TNFα的细胞因子分泌测定进一步证实了由VHHMHCII-刺突RBD引发的T细胞应答更优(图32E)。
为了区分作为IFNγ来源的CD4+和CD8+T细胞，进行了流式细胞术测定，然后进行胞内细胞因子染色。基于脾细胞与肽42、47、48和49的混合物的孵育，观察到大多数炎性细胞因子由CD8+T细胞应答产生(图32E)。因此，VHHMHCII-抗原加合物可增强交叉呈递并诱导对刺突RBD的有效CD8+T细胞应答。
此外，在仅单次免疫接种的情况下观察到强CD8+T细胞应答，并且该强CD8+T细胞应答在免疫接种之后7天内出现。这强有力地表明VHHMHCII-刺突RBD能够提供针对SARS-CoV-2感染的保护性免疫，因为经免疫接种的组群在等待较慢的体液应答出现的同时，相对较早地表现出T细胞应答。总之，这些数据表明了通过II类MHC直接靶向APC的优越性。
在SARS-CoV-2(COVID-19)大流行病的规模下，三剂或更多剂的免疫接种可能不切实际，但用单剂量免疫接种可能产生强CD8+T细胞应答。因此，进行了实验，其中动物接受两个连续剂量的VHHMHCII-刺突RBD(图33A)。免疫接种之后第7、14和21天追踪血清免疫球蛋白(图33A)。在第二次给药之后第7天，VHHMHCII-刺突RBD组群中的总IgG达到峰值水平，并且这些水平持续到第21天。在所有时间点，接受单剂量VHHMHCII-刺突RBD制剂和佐剂的动物表现出的效力低于接受双剂量VHHMHCII-刺突RBD的动物表现出的效力(图33A)。还验证了同种型切换(图33B)。然后测试了来自经免疫接种动物的血清对携带K417T、E484K、N501Y突变的刺突RBD的识别。在第14天获得的血清有效地识别了这种变体刺突RBD(图33C)。因此，测试来自这些动物的血清对携带多种刺突变体的假型VSV的中和。来自用2个剂量的VHHMHCII-刺突RBD免疫接种的小鼠的血清有效中和了所有受试变体(图33D)。
图31至33中描述的实验都依赖于疫苗制剂的腹膜内递送。对于在人中的使用，优选肌内递送。无针方法(如鼻内递送)，将是非常期望的对注射的替代方法。因此，研究了当以2周间隔以2个剂量施用时，不同的递送途径是否会导致不同水平的抗体产生(图34A)。VHHMHCII-刺突RBD制剂通过腹膜内(i.p)、肌内(i.m)或鼻内(i.n)递送。虽然i.p.和i.m.递送引起IgA应答，但鼻内递送未能引起IgA应答(图34B)。然而，血清IgG的产生看起来与疫苗递送途径无关。所有三种递送途径产生相似水平的总抗刺突RBD IgG(图34B)。
然后探索VHHMHCII-刺突RBD疫苗制剂是否能在室温储存和冻干下存活，并在室温下产生最终“干”产品，而不丧失效力。除了之前观察到的其他Ig同种型外，测试的所有储存方法均产生了等同水平的总IgG(图34C)。
另一个关键考虑因素是VHHMHCII-刺突RBD疫苗是否适用于所有年龄组，尤其是老年个体。因此，在老年小鼠(72周龄，相当于人年龄56至69岁)中测试了VHHMHCII-刺突RBD疫苗，其中它显示了针对刺突RBD的稳健的总抗体应答(图34D)。
本文中提及的所有出版物、专利、专利申请、出版物和数据库条目(例如序列数据库条目)，例如在背景技术、发明内容、具体实施方式、实施例和/或参考文献部分中，均通过引用其整体并入本文，好像每个单独的出版物、专利、专利申请、出版物和数据库条目都是通过引用具体地和单独地并入本文中一样。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
等同方案和范围
本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文中所述的一些实施方案的许多等同方案。本公开内容的范围并不旨在限于以上描述，而是如在所附权利要求中阐述的那样。
未用数量词限定的名词可意指一个/种或多于一个/种，除非指出相反或者从上下文中另外明显的。在组的两个或更多个成员之间包含“或”的权利要求或描述被认为满足如果存在的一个、多于一个或全部组成员，除非指出相反或者从上下文中另外明显的。在两个或更多个组成员之间包含“或”的组的公开内容提供了其中恰好存在一个组成员的实施方案、其中存在多于一个组成员的实施方案以及其中所有组成员均存在的实施方案。为了简洁的目的，这些实施方案在本文中没有被单独地阐述，但是应当理解，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。
应当理解，本公开内容涵盖其中将一个或更多个权利要求或说明书的一个或更多个相关部分中的一个或更多个限制、要素、条款和描述性术语引入到另一个权利要求中的所有变化、组合和排列。例如，引用另一个权利要求的权利要求可被修改为包含在引用相同基础权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或更多个限制。此外，在权利要求记载组合物的情况下，应当理解，根据本文中公开的任何制作或使用的方法或根据本领域中已知的方法(如果有的话)来制作或使用组合物的方法都包括在内，除非另有说明，或者除非对本领域中的普通技术人员明显地会出现矛盾或不一致。
在要素以列表(例如以马库什组形式)表示的情况下，应当理解还公开了要素的每个可能的亚组，并且任何要素或要素的亚组都可从组移除。还应注意的是，术语“包含”旨在为开放性的，并且允许包含另外的要素或步骤。应当理解，通常，将实施方案、产品或方法称为包括特定要素、特征或步骤的实施方案、产品或方法，还提供了由这样的要素、特征或步骤组成或基本上由这样的要素、特征或步骤组成的实施方案、产品或方法。为了简洁的目的，这些实施方案在本文中没有被单独地阐述，但是应理解，这些实施方案中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。
在范围给定的情况下，包括端点。此外，应理解的是，除非另有说明或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解另外明显的，否则表示为范围的值在一些实施方案中可采用所述范围内的任何特定值至该范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。为了简洁的目的，每个范围中的值在本文中没有被单独地阐述，但是应当理解，这些值中的每一个都在本文中提供并且可被具体地要求保护或放弃保护。还应当理解，除非另外指出或者从上下文中和/或根据本领域普通技术人员的理解另外明显的，作为范围表达的值可假定为给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点以与范围下限的十分之一单位的精度相同的精度表示。
在提供网站的情况下，URL地址以非浏览器可执行的代码提供，括号中是相应网址的周期。实际的网址不包含括号。
另外，应当理解，本公开内容的任何特定实施方案可明确地从任何一个或更多个权利要求排除。在给出范围的情况下，该范围内的任何值可明确地从任何一个或更多个权利要求排除。本公开内容的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可从任何一个或更多个权利要求排除。为了简洁的目的，本文中未明确示出其中排除了一个或更多个要素、特征、目的或方面的所有实施方案。

Claims (66)

1.组合物，其包含：
(i)含有与抗原和抗炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合；或者
(ii)含有与抗原缀合的VHH的第一缀合物和含有与抗炎剂缀合的第二VHH的第二缀合物，其中所述第一VHH和所述第二VHH与抗原呈递细胞(APC)上的一种或更多种表面蛋白结合。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述APC上的表面蛋白选自MHCII、CD11c、DEC205、DC-SIGN、CLEC9a、CD103、CX3CR1、CD1a和F4/80。
3.权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含含有与抗原和抗炎剂缀合的VHH的缀合物，其中所述VHH与MHCII结合。
4.权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCII结合。
5.权利要求3或权利要求4所述的组合物，其中所述VHH包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
6.权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述VHH还在N末端或C末端包含定位酶识别序列。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述定位酶识别序列包含LPETG(SEQ ID NO：29)，任选地其中所述定位酶识别序列包含LPETGG(SEQ ID NO：43)。
8.权利要求6或权利要求7所述的组合物，其中抗炎剂或抗原通过所述定位酶识别序列与所述VHH缀合。
9.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述抗炎剂还包含可水解或不可水解的接头。
10.权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含含有与抗原和抗炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与CD11c结合。
11.权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合。
12.权利要求10或权利要求11所述的组合物，其中所述VHH包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
13.权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中所述VHH还在N末端或C末端包含定位酶识别序列。
14.权利要求13所述的组合物，其中所述定位酶识别序列包含LPETG(SEQ ID NO：29)，任选地其中所述定位酶识别序列包含LPETGG(SEQ ID NO：43)。
15.权利要求13或权利要求14所述的组合物，其中抗炎剂或抗原通过所述定位酶识别序列与所述VHH缀合。
16.权利要求10至15中任一项所述的组合物，其中所述抗炎剂还包含可水解或不可水解的接头。
17.权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与抗炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH与所述APC上的不同表面蛋白结合。
18.权利要求17所述的组合物，其中所述第一VHH与MHCII结合，以及所述第二VHH与CD11c结合。
19.权利要求17所述的组合物，其中所述第一VHH与DEC205结合，以及所述第二VHH与MHCII结合。
20.权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述抗炎剂是选自地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、曲安西龙、甲泼尼龙和倍他米松的甾体抗炎剂。
21.权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述抗炎剂是选自阿司匹林、塞来昔布、双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬、奈普生、奥沙普秦、吡罗昔康、环孢菌素A和钙三醇的非甾体抗炎剂。
22.权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述抗炎剂是选自IL-10、IL-35、IL-4、IL-11、IL-13和TGFβ的抗炎细胞因子。
23.权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述抗原包含多肽、多糖、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。
24.权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述抗原是自身抗原。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述自身抗原选自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘蛋白脂质蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原、胰岛素、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶65-千道尔顿同种型(GAD65)、桥粒黏蛋白1(DSG1)、桥粒黏蛋白3(DSG3)、乙酰胆碱受体(AChR)、肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)、核糖核蛋白。
26.权利要求23所述的组合物，其中所述抗原包含用于蛋白质替代治疗或基因治疗中的蛋白质。
27.权利要求26所述的组合物，其中所述抗原选自因子IX、因子VIII、胰岛素和AAV来源的蛋白质。
28.包括向有此需要的对象施用权利要求1至27中任一项所述的组合物的方法。
29.诱导对抗原的免疫耐受的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用权利要求1至27中任一项所述的组合物。
30.治疗自身免疫病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用权利要求1至25中任一项所述的组合物。
31.权利要求30所述的方法，其中所述自身免疫病选自自身免疫性脑脊髓炎、多发性硬化、I型糖尿病、寻常型天疱疮、重症肌无力、狼疮、乳糜泻和炎性肠病(IBD)。
32.权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内的。
33.权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
34.组合物，其包含：
(i)含有与抗原和促炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与抗原呈递细胞(APC)上的表面蛋白结合；或者
(ii)含有与抗原缀合的VHH的第一缀合物和含有与促炎剂缀合的第二VHH的第二缀合物，其中所述第一VHH和所述第二VHH与抗原呈递细胞(APC)上的一种或更多种表面蛋白结合。
35.权利要求34所述的组合物，其中所述APC上的表面蛋白选自MHCII、CD11c、DEC205、DC-SIGN、CLEC9a、CD103、CX3CR1、CD1a、和F4/80。
36.权利要求35所述的组合物，其中所述组合物包含含有与抗原和促炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与MHCII结合。
37.权利要求35所述的组合物，其中所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与MHCII结合。
38.权利要求36或权利要求37所述的组合物，其中所述VHH包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
39.权利要求34至38中任一项所述的组合物，其中所述VHH还在N末端或C末端包含定位酶识别序列。
40.权利要求39所述的组合物，其中所述定位酶识别序列包含LPETG(SEQ ID NO：29)，任选地其中所述定位酶识别序列包含LPETGG(SEQ ID NO：43)。
41.权利要求39或权利要求40所述的组合物，其中促炎剂或抗原通过所述定位酶识别序列与所述VHH缀合。
42.权利要求34至41中任一项所述的组合物，其中所述促炎剂还包含可水解或不可水解的接头。
43.权利要求35所述的组合物，其中所述组合物包含含有与抗原和促炎剂缀合的单结构域抗体(VHH)的缀合物，其中所述VHH与CD11c结合。
44.权利要求35所述的组合物，其中所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH均与CD11c结合。
45.权利要求43或权利要求44所述的组合物，其中所述VHH包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
46.权利要求43至45中任一项所述的组合物，其中所述VHH还在N末端或C末端包含定位酶识别序列。
47.权利要求46所述的组合物，其中所述定位酶识别序列包含LPETG(SEQ ID NO：29)，任选地其中所述定位酶识别序列包含LPETGG(SEQ ID NO：43)。
48.权利要求46或权利要求47所述的组合物，其中促炎剂或抗原通过所述定位酶识别序列与所述VHH缀合。
49.权利要求43至48中任一项所述的组合物，其中所述促炎剂还包含可水解或不可水解的接头。
50.权利要求35所述的组合物，其中所述组合物包含第一缀合物和第二缀合物，所述第一缀合物包含与抗原缀合的第一VHH，以及所述第二缀合物包含与促炎剂缀合的第二VHH，其中所述第一VHH和所述第二VHH与所述APC上的不同表面蛋白结合。
51.权利要求50所述的组合物，其中所述第一VHH与MHCII结合，以及所述第二VHH与CD11c结合。
52.权利要求50所述的组合物，其中所述第一VHH与DEC205结合，以及所述第二VHH与MHCII结合。
53.权利要求34至52中任一项所述的组合物，其中所述促炎剂选自：TLR9激动剂、LPS、HMGB1蛋白、IL2、IL12和CD40L。
54.权利要求34至53中任一项所述的组合物，其中所述抗原包含多肽、多糖、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。
55.权利要求34至54中任一项所述的组合物，其中所述抗原来自微生物病原体。
56.权利要求55所述的组合物，其中所述微生物病原体是分枝杆菌(mycobacterium)、细菌、真菌、病毒、寄生虫或朊病毒。
57.权利要求34至56中任一项所述的组合物，其中所述抗原包含SARS-CoV-2刺突蛋白。
58.权利要求34至54中任一项所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原。
59.权利要求34至58中任一项所述的组合物，其中所述组合物是疫苗组合物。
60.包括向有此需要的对象施用权利要求34至59中任一项所述的组合物的方法。
61.诱导对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用权利要求34至59中任一项所述的组合物。
62.治疗由病原体引起的感染的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用权利要求34至59中任一项所述的组合物，其中所述抗原来自微生物病原体。
63.权利要求62所述的方法，其中所述方法是治疗性或预防性的。
64.治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用权利要求34至59中任一项所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原。
65.权利要求60至64中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内的。
66.权利要求60至65中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
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