KR20150051245A - Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드 - Google Patents

Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드 Download PDF

Info

Publication number
KR20150051245A
KR20150051245A KR1020157011185A KR20157011185A KR20150051245A KR 20150051245 A KR20150051245 A KR 20150051245A KR 1020157011185 A KR1020157011185 A KR 1020157011185A KR 20157011185 A KR20157011185 A KR 20157011185A KR 20150051245 A KR20150051245 A KR 20150051245A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
set forth
nanobody
Prior art date
Application number
KR1020157011185A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101832040B1 (ko
Inventor
미셸 브래들리
자린 브라운
스티븐 존 찰튼
카렌 크로미
브루노 돔브레흐트
소렌 스테펜센
기노 반 헤에케
Original Assignee
노파르티스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
Publication of KR20150051245A publication Critical patent/KR20150051245A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101832040B1 publication Critical patent/KR101832040B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 케모카인 수용체 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 특히 CXCR2로부터 신호 전달을 조정할 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물 및 CXCR2의 이상 기능을 수반하는 질환의 치료를 위한 상기 폴리펩티드 및 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

ＣＸＣＲ２ 결합 폴리펩티드{CXCR2 BINDING POLYPEPTIDES}
본 발명은 케모카인 수용체 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 특히 CXCR2로부터 신호 전달을 조정할 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물 및 CXCR2의 이상 기능을 수반하는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 및 다른 질환의 치료를 위한 상기 폴리펩티드 및 조성물의 용도에 관한 것이다.
만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)은 대부분의 경우 진행적이고 기도 기능을 감소시키는 폐 실질의 파괴와 함께 유해한 입자에 대한 폐의 비정상적인 염증 반응과 연관된 기류 제한을 특징으로 하는 다양한 장애를 설명하기 위해 사용되는 용어이다 ([Barnes PJ et al., 2003, Chronic obstructive pulmonary disease: molecular and cellular mechanisms. Eur. Respir J, 22, 672-688]; [Barnes PJ et al., 2004, Mediators of chronic obstructive pulmonary disease. Pharmacol. Rev. 56, 515-548]). 유전 및 환경 인자가 COPD의 발병에 기여하지만, 흡연이 가장 중요한 단일 원인이고, 재발되는 폐 감염은 폐 기능의 진행적 감소를 야기한다. 금연은 초기에 적용될 경우에만 질환 진행을 감소시키고, 유의한 증상이 발생한 후에는 효과가 거의 없다. 몇몇 동반하는 병태, 예컨대 천식, 심혈관 질환, 우울증 및 근 쇠약이 COPD와 연관된다 (Mannino DM and Buist S, 2007 Global burden of COPD: risk factors, prevalence and future trends. Lancet, 370, 765-773).
케모카인은 화학주성 인자 중에서 우세하게 존재하고, 따라서 COPD 폐의 만성 염증 및 급성 악화 동안 그의 추가의 확대의 조정시에 핵심 역할을 수행한다. 케모카인 IL-8 (CXCL8), GROα (CXCL1) 및 ENA-78 (CXCL5)의 생물학적 활성은 신체 전체에 걸쳐 백혈구 및 많은 다른 세포 종류 상에 존재하는 세포-표면 수용체 CXCR1 및 CXCR2의 2개의 집단에 의해 매개된다. 백혈구의 이동은 IL-8, GROα, β, γ, ENA78, 및 GCP-2를 비롯한 몇몇 리간드에 결합하는 CXCR2를 통해 주로 매개된다. 이와 반대로, CXCR1은 IL-8에 의해 및 보다 작은 정도로 GCP-2에 의해 선택적으로 활성화된다. 생체 내에서 인간 호중구 화학주성이 하나의 수용체 또는 두 수용체 모두에 의해 매개되는지의 여부는 아직 불분명한 상태이다.
CXCR2는 CXCR1과 아미노산 수준에서 78% 상동성을 공유하고, 두 수용체는 상이한 분포 패턴으로 호중구 상에 존재한다. CD8+ T 세포, NK, 단핵구, 비만 세포, 상피, 내피, 평활근 및 중추신경계 내의 다수의 세포 종류를 포함하는 다양한 세포 및 조직 상에서의 CXCR2의 발현은 상기 수용체가 구성적 병태 하에 및 많은 급성 및 만성 질환의 병태생리학에서 광범한 기능적 역할을 수행할 수 있음을 시사한다. CXCR2 활성화는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질의 Gi 패밀리와 수용체의 결합을 자극하고, 이것은 다시 세포내 이노시톨 포스페이트의 방출, 세포내 Ca2 + 증가, 및 ERK1/2-의존성 메카니즘에 의한, 케모카인 구배로 유도된 세포 이동과 연관된 세포내 단백질의 인산화를 자극한다. 일단 활성화된 후에, CXCR2는 인산화되고, 어레스틴/다이나민-의존성 메카니즘을 통해 신속하게 내재화되어 수용체 탈감작화 (desensitization)를 유발한다. 상기 과정은 대부분의 다른 GPCR에서 관찰된 바와 유사하지만, CXCR2의 효능제-유도 내재화의 비율 및 정도는 CXCR1에서 관찰된 것보다 더 크다 (Richardson RM, Pridgen BC, Haribabu B, Ali H, Synderman R. 1998 Differential cross-regualtion of the human chemokine receptors CXCR1 and CXCR2. Evidence for time-dependent signal generation. J Biol. Chem, 273, 23830-23836).
IL-8은 COPD에서 호중구성 염증의 매개체로서 오랫동안 제시되었다 ([Keatings VM et al., 1996, Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153, 530-534]; [Yamamoto C et al., 1997 Airway inflammation in COPD assessed by sputum levels of interleukin-8. Chest, 112, 505-510]). COPD 환자로부터의 기관지 기도, 소기도 및 폐 실질의 생검에서, 특히 기도의 강 (lumen)에 T 세포의 침윤 및 호중구의 수 증가가 존재한다 (Hogg JC et al., 2004, The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Eng. J. Med. 350, 2645-2653). 호중구는 COPD 환자의 폐에서 증가하고, 이것은 질환 중증도와 연관성이 있다 (Keatings VM et al., 1996, Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153, 530-534). 또한, TNFα의 수준은 COPD 환자의 가래에서 증가하고, 이것은 기도 상피 세포로부터 IL-8을 유도한다 (Keatings). GROα 농도는 정상 흡연자 및 비-흡연자에 비해 COPD 환자의 유도된 가래 및 기관지 폐포 세정 (BAL) 유체에서 현저하게 증가한다 ([Traves SL et al 2002, Increased levels of the chemokines GROα and MCP-1 in sputum samples from patients with COPD. Thorax, 57, 50-595]; [Pesci A. et al., 1998, Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with COPD. Eur Respir J. 12, 380-386]). GROα는 TNFα 자극에 반응하여 폐포 대식세포 및 기도 상피 세포에 의해 분비되고, 호중구 및 단핵구에 대해 화학주성인 CXCR2를 선택적으로 활성화시킨다. COPD 환자에서 GROα에 대한 단핵구 화학주성 반응의 증가가 존재하고, 이것은 이들 세포에서 CXCR2의 증가된 교체 또는 재순환과 관련될 수 있다 (Traves SL et al., 2004, Specific CXC but not CC chemokines cause elevated monocyte migration in COPD: a role for CXCR2, J Leukoc. Biol. 76, 441-450). 바이러스성 및 세균성 폐 감염은 종종 기도에서 호중구 수의 증가를 특징으로 하는 COPD 환자의 심각한 악화를 야기한다 (Wedzicha JA, Seemungal TA., 2007, COPD exacerbations: defining their cause and prevention, Lancet 370 (9589): 786-96). COPD의 급성의 심각한 악화를 겪는 환자의 기관지 생검은 유의하게 증가된 양의 ENA-78, IL-8 및 CXCR2 mRNA 발현을 보였고 (Qiu Y et al., 2003, Biopsy neutrophilia, neutrophil chemokine and receptor gene expression in severe exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 168, 968-975), 가래는 증가된 호중구 계수를 나타내었고 (Bathoorn E, Liesker JJw, Postma DS et al., Change in inflammation in out-patient COPD patients from stable phase to a subsequent exacerbation, (2009) Int J COPD, 4(1): 101-9), 이것은 COPD와 상기 질환의 심각한 악화 둘 모두에서 상기 수용체의 잠재적인 역할을 시사한다. CXCR2 mRNA의 발현 증가가 기관지 생검 표본에서 보이고, 이것은 조직 호중구의 존재와 연관성이 있다 (Qiu 2003). ENA-78은 상피 세포로부터 우세하게 유래되고, COPD의 악화 동안 상피 세포 내에 ENA-78 발현의 현저한 증가가 존재한다 (Qiu 2003). IL-8, GROα 및 ENA-78의 농도가 COPD 기도에서 증가하고, 3개의 모든 리간드가 CXCR2를 통해 신호를 전달하기 때문에, 선택적 길항제를 사용한 상기 공통적인 수용체의 차단은 상기 질환에서 효과적인 소염 전략이 될 것이다.
COPD는 서서히 및 점진적으로 진전되고, 질환 진행은 전통적으로 폐-기능 시험, 예컨대 강제 호기량의 폐활량 측정 (FEV1)을 사용하여 평가된다. 예상 FEV1이 <50%인 환자는 심각한 것으로 분류된다. 단지 5%의 경도 내지 중등도 환자에 비해 거의 35%의 심각한 COPD 환자가 12세 이내에 질환으로 사망하기 때문에 폐 기능은 사망률과 밀접하게 관련된다. COPD는 세계적으로 네 번째의 주요 사망 원인이고 (World Health Organization (WHO), World Health Report, Geneva, 2000. URL: http://www.who.int/whr/2000/en/whr00_annex_en.pdf로부터 이용가능), 앞으로 수십 년 내에 그의 유병률 및 사망률의 추가의 증가가 예측될 수 있다 (Lopez AD, Shibuya K, Rao C et al., 2006, Chronic obstructive pulmonary disease: current burden and future projections, Eur Respir J, 27(2), 397-412). 악화는 질병 악순환의 핵심 인자이고, 주로 대부분의 COPD 입원의 원인이 되고 있다 (BTS (British Thoracic Society), 2006, Burden of Lung Disease Report, 2nd ed, http://www.brit-thoracic.org.uk/Portals/0/Library/BTS%20Publications/burdeon of_lung_disease2007.pdf). 매년 평균 발생률은 증상-규정된 악화의 경우 2.3, 보건-규정된 악화의 경우 2.8이었다 (O'Reilly JF, Williams AE, Holt K et al., 2006, Prim Care Respir J. 15(6): 346-53). 보다 조기의 진단 및 환자의악화에 대한 개선된 관리 및 개선된 억제는 이들 입원에 의해 이미 부담을 준 자원에 대한 부담 감소를 도울 것이다. COPD에 대한 이용가능한 치료는 주로 일시적이고, 질환과 연관된 폐 기능의 감소 또는 기도의 진행적 파괴를 중지시키는 이용가능한 요법이 존재하지 않는다. 현재의 치료제, 예컨대 단기 및 장기 지속성 β-아드레날린성 기관지확장제, 흡입 항콜린작용제 (무스카린 길항제) 및 흡입 코티코스테로이드가 질환의 증상 및 악화를 치료하기 위해 사용된다. 현재의 코티코스테로이드 요법의 주요 제한은 환자가 코티코스테로이드에 대해 내성을 보여 이들 약물의 소염 작용을 불활성화시키기 때문에 이들이 비효과적으로 된다는 점이다. 명백하게, COPD의 진행을 예방하는 신규한 약물에 대한 충족되지 않는 큰 의료적 필요성이 계속 존재한다. COPD에서 교환되는 염증-세포는 다중 케모카인에 의해 조정되고, 따라서 LMW 길항제를 사용한 케모카인 수용체의 차단이 상기 질환의 효과적인 소염 전략일 수 있기 때문에, 케모카인 수용체 길항제가 COPD 요법의 매력적인 접근법이다. COPD의 중요한 특징은 정상 흡연자에서 관찰되는 염증성 반응의 증폭이고, 따라서 요법의 목적은 염증성 세포 침윤을 완전히 억제하는 것이 아니라, COPD가 없는 정상 흡연자에서 관찰되는 수준으로 저하시키는 것이다. 특이적으로 작용함으로써, 항-CXCR2는 스테로이드와 연관된 일반적인 면역 억제를 방지할 것이고 - CXCR1 활성의 보존은 COPD 및 CF의 숙주 방어에 중요한 기준선 호중구 활성화를 허용할 것이다. 대부분의 COPD 약물은 현재 전신 부작용을 감소시키기 위해 흡입에 의해 투여되지만, 케모카인 길항제는 순환 염증성 세포에서 발현되는 수용체에 대해 작용하기 때문에, 전신 투여가 최적일 것이다. 이것은 COPD에서 침범된 소기도 및 폐 실질에 도달하기 위한 효율적인 방법을 제공할 것이다.
시토카인 및 인터류킨 수용체와 달리 케모카인 수용체는 7TM-GPCR의 고도로 '약물에 의한 표적화가 가능한' 수퍼패밀리에 속한다. 그럼에도 불구하고, 효능있는 길항제를 발견하기 위한 초기 시도는 작은 펩티드 또는 생체 (biogenic) 아민 리간드를 갖는 GPCR을 사용한 실험을 기초로 하여 예상되는 것보다 더 많은 어려움에 직면하였다. 케모카인-수용체 길항제에 초점을 맞춘 소분자 약물-발견 프로그램에 대한 노력은 케모카인 수용체의 특질 및 소분자가 길항제로서 작용하기 위해 필요한 구조적 요소를 점진적으로 이해하기 시작하였다. 흥미롭게도, 확인된 근본적으로 별개의 화학물질 시리즈의 수에 의해 표시되는, CC-케모카인-수용체 길항제의 구조적 다양성은 CXC-케모카인-수용체 길항제보다 상당히 더 높고, 이것은 길항제 발견의 상대적인 어려움이 수용체의 2개의 클래스 사이에서 상이할 수 있음을 시사한다.
케모카인 수용체는 일반적으로 길항하는 것이 어려운 표적으로 입증되었고, 강력하고 선택적인 CXCR2 길항제를 확인하기 위해 지대한 노력이 필요하였다. 제1 저 분자량 CXCR2 길항제가 1998년도에 설명되었고, 그 이후로 많은 비-경쟁적 알로스테리 (allosteric) CXCR2 길항제가 개발되었고, 그 중 몇몇이 현재 임상 시험으로 진행되고 있다. 그럼에도 불구하고, CXCR2 기능의 보다 우수하고 보다 효능있는 길항제에 대한 필요성이 명백하게 존재한다.
면역글로불린 클래스의 분자는 지난 10년 정도에 걸쳐 그의 임상 유용성이 엄청나게 증가하였다. 표적에 대한 그의 특이성 및 이를 재조합 기술을 사용하여 조작하는 능력은 질환에 대한 고도로 유도된 치료 요법을 개발하기 위한 엄청난 잠재력을 제공한다. 통상적인 4 사슬 항체, Fab 및 F(ab)2 단편, 단일 도메인 항체 (D(ab)), 단일쇄 Fv 및 나노바디 (Nanobody)를 비롯한 많은 종류의 면역글로불린 분자 및 변형된 면역글로불린 분자가 적합하게 조작되기 위해 잠재적으로 이용가능하다. 이들은 CXCR2의 적어도 2개의 에피토프에 대해 작용하도록 구축된 폴리펩티드에 관한 본 발명과 관련하여 본원에서 추가로 논의될 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 케모카인 수용체 CXCR2의 이상 기능과 연관된 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 COPD 및 다른 질환의 예방 또는 치료를 위한 새로운 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 면역요법인, CXCR2의 이상 기능과 연관된 COPD 및 다른 질환의 치료 또는 예방 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 추가의 목적은 CXCR2 신호 전달의 길항제인 면역글로불린 CDR을 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 적어도 2개의 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이 폴리펩티드는 케모카인 수용체 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하고, 상기 폴리펩티드는 CXCR2 상의 제1 에피토프를 인식하는 제1 항원 결합 도메인 및 CXCR2 상의 제2 에피토프를 인식하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 서열 7에 제시된 아미노산의 서열로 이루어지는 선형 펩티드에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인 및 상기 선형 펩티드에 결합할 수 없거나 보다 낮은 친화도로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 서열 7은 인간 CXCR2의 처음 19개의 N-말단 아미노산이다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 이중 파라토프성 (biparatopic)이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중 파라토프성"은 폴리펩티드가 동일한 단백질 표적 상의 2개의 상이한 에피토프를 인식하는 2개의 항원 결합 도메인을 포함함을 의미한다. 그러나, 이중- 또는 다중 파라토프성 및 다가, 즉 하나 이상의 다른 표적 단백질을 인식하는 항원 결합 도메인을 또한 갖는 폴리펩티드처럼, 다중 파라토프성인, 즉 동일한 표적 단백질 상의 3, 4 또는 그 초과의 에피토프를 인식하는 항원 결합 도메인을 함유하는 폴리펩티드도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 바람직한 폴리펩티드에서, 제1 항원 결합 도메인을 포함하는 아미노산 서열 및 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 링커 영역에 의해 연결된다. 본원에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 링커는 면역글로불린에서 기원하거나 기원하지 않을 수 있지만, 바람직하게는 펩티드이다.
본 발명에 따라 특히 바람직한 폴리펩티드에서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 내에 포함되고, 상기 제2 항원 결합 도메인은 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인 내에 포함된다. 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인 중의 적어도 하나는 VL 도메인 또는 그의 단편일 수 있거나 또는 VH 도메인 또는 그의 단편일 수 있다. 각각의 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 VL 도메인 또는 그의 단편 내에 포함되거나 또는 각각의 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 VH 도메인 또는 그의 단편 내에 포함되는 폴리펩티드가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 단일 분자 내에 VL 및 VH 아미노산 서열 또는 그의 단편을 모두 포함할 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 도메인 항체 (dAb)인 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인 내에 포함된다. 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인 중의 적어도 하나 및 바람직하게는 둘 모두는 낙타류 (camelid) 또는 적어도 하나의 인간화 치환이 프레임워크 영역 내에 도입된 그의 인간화 버전으로부터 얻을 수 있는 중쇄 항체의 단일 중쇄로부터의 VHH 도메인 또는 그의 단편인 면역글로불린 단일 가변 도메인 내에 포함된다.
낙타류로부터 얻을 수 있는 종류의 중쇄 단일 항체로부터의 아미노산의 VHH 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 측면에서 "VHH 도메인" 또는 그의 단편 또는 "나노바디"로서 본원에서 언급될 수 있다. 나노바디®, 나노바디즈® 및 나노클론(Nanoclone)®은 아블링스 엔.브이. (Ablynx N.V.)의 등록 상표임을 유의하여야 한다.
본 발명의 폴리펩티드에서, 각각의 항원 결합 도메인은 본원에서 규정된 적어도 하나의 CDR, 바람직하게는 2 또는 3개의 CDR을 포함한다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 바람직한 구조는 다음 구조를 갖는 VHH 도메인 또는 나노바디의 것이다:
FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR
여기서, CDR 및 FR은 본원에서 추가로 규정된다.
본 발명에 따라 바람직한 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조 중의 하나를 갖는다:
i) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
ii) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--링커--HLE
iii) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--HLE--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4가 제1 항원 결합 도메인 (선형 서열 7 결합제)을 포함하면, FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8은 제2 항원 도메인 (선형 서열 7 비-결합제)를 포함하고, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4가 제2 항원 도메인 (선형 서열 7 비-결합제)를 포함하면, FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8은 제1 항원 결합 도메인 (선형 서열 7 결합제)을 포함하고, HLE는 증가된 생체내 반감기를 제공하는 결합 단위이다.
상기 바람직한 이중 파라토프성 나노바디의 단편 또는 변이체는 CDR 및 FR이 낙타류에서 기원하는 실시양태 또는 FR 중의 하나가 적어도 하나의 인간화 치환을 갖고 바람직하게는 완전 인간화된 것인 실시양태를 포함하는 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따라 특히 바람직한 이중 파라토프성 나노바디는 본원에서 163D2/127D1, 163E3/127D1, 163E3/54B12, 163D2/54B12, 2B2/163E3, 2B2/163D2, 97A9/2B2 및 97A9/54B12로 지정된 것 (그의 아미노산 서열이 표 13에 제시됨), 및 특히 FR이 본원에서 규정된 서열 최적화 아미노산 치환, 및 예컨대 표 32에서 성분 나노바디에 대해 제시된 것을 갖는 그의 변이체이다.
본 발명에 따른 추가의 특히 바람직한 이중 파라토프성 나노바디는 표 33에 제시된 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 CXCR2 신호 전달의 조절물질이고, CXCR2 활성을 차단하거나 감소시키거나 억제한다. 이들은 천연 리간드, 예를 들어 Gro-α의 인간 CXCR2에 대한 결합을 20 nM 미만의 IC50으로 억제할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 및 특히 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 상기 논의한 163D2/127D1, 163E3/127D1, 163E3/54B12, 163D2/54B12, 2B2/163E3, 2B2/163D2, 97A9/2B2 및 97A9/54B12 중의 하나 이상의 CXCR2에 대한 결합을 교차차단할 수 있다.
본원에서 설명되는 본 발명에는 이중 또는 다중 파라토프성 또는 다가 나노바디의 구축에 사용되는 1가 폴리펩티드 빌딩 블록이 포함된다. 바람직한 1가 나노바디는 표 9, 표 34에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 하나의 프레임워크 영역이 표 9 또는 표 34에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 각각의 및 모든 폴리펩티드이다. 바람직한 1가 나노바디는 표 9에 제시된, 그러나 프레임워크 영역에 적어도 하나의 서열 최적화, 치환을 갖는 것, 예컨대 표 32 또는 표 34에 제시된 나노바디이다. 특히 바람직한 것은 137B7로 지정된 1가 나노바디 및 그의 서열 최적화된 버전이다.
본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 서열 1 (CXCR2)의 아미노산 F11, F14 및 W15를 포함하는 에피토프에 결합한다. 본 발명의 바람직한 이중 파라토프성 폴리펩티드, 예컨대 이중 파라토프성 나노바디에서, 제2 항원 결합 도메인은 인간 CXCR2의 외부 루프 내의 에피토프 (서열 1의 아미노산 잔기 106-120, 184-208 및 274-294)에 결합한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 에피토프는 입체형태를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 에피토프는 서열 1의 아미노산 잔기 W112, G115, I282 및 T285를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 그의 단편을 코딩하는 핵산, 예컨대 이중 파라토프성 나노바디 내에 포함되는 개개의 나노바디를 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하고 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포도 본 발명에 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 CXCR2의 활성을 차단하거나, 억제하거나 감소시킬 수 있기 때문에, CXCR2로부터의 이상 신호 전달이 일정 역할을 수행하는 질환의 치료에 유용하다. 상기 질환은 아테롬성 동맥경화증, 사구체신염, 염증성 장 질환 (크론 (Crohn) 병), 혈관신생, 다발 경화증, 건선, 연령 관련 황반 변성 질환, 눈 베체트 (Behcet) 병, 포도막염, 비-소세포 암종, 결장암, 췌장암, 식도암, 흑색종, 간세포 암종 또는 허혈 관류 손상을 포함할 수 있다. 상기 질환은 또한 호흡관의 병태, 예컨대 낭성 섬유증, 중증 천식, 천식의 악화, 알러지성 천식, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 특발성 폐 섬유증, 기도 개형 (airway remodeling), 폐쇄성 세기관지염 증후군 또는 기관지폐 이형성증을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 백혈구, 특히 호중구의 폐 실질로의 이동 (CXCR2 신호전달을 통해 매개됨) 및 그의 후속적인 파괴를 특징으로 하는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 또는 COPD의 악화의 치료에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 CXCR2 활성을 차단하거나, 억제하거나 감소시키는 능력 때문에 상기 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 훌륭한 후보이다.
인간의 치료를 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 인간 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다. 그러나, 적절한 독성 시험을 원숭이에서 수행할 수 있기 위해, 상기 폴리펩티드가 영장류 CXCR2, 특히 시노몰거스 원숭이 CXCR2와 교차반응할 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 수의 용도가 고려될 경우 다른 종으로부터의 CXCR2 상동체에 대해 작용하거나 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본원에서 추가의 논의로부터 분명해질 것이다.
본 발명은 케모카인 수용체 CXCR2의 이상 기능과 연관된 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 COPD 및 다른 질환의 예방 또는 치료를 위한 새로운 수단을 제공한다.
정의
본원의 설명, 실시예 및 청구의 범위에서:
a) 달리 나타내거나 규정되지 않으면, 사용되는 모든 용어는 당업계의 통상적인 의미를 가질 것이고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어 아래에서 언급되는 표준 안내서를 참조한다 ([Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ( 2nd. Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; [F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]; [Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985)]; [Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981)]; [Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001)]; [Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10 Ed. Blackwell Publishing, UK (2001)]; 및 [Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)]).
b) 달리 나타내지 않으면, 용어 "면역글로불린" 또는 "면역글로불린 서열"은 - 중쇄 항체 또는 통상적인 4-사슬 항체를 나타내기 위해 본원에서 사용되는지와 무관하게 - 전장 항체, 그의 개개의 사슬, 및 모든 부분, 도메인 또는 그의 단편 (각각 항원-결합 도메인 또는 단편, 예컨대 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인을 포함하고 이로 제한되지 않음)을 포함하는 일반적인 용어로서 사용된다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "서열" (예를 들어, "면역글로불린 서열", "항체 서열", "가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어에서)은 문맥상 보다 제한된 해석이 필요하지 않다면 일반적으로 관련 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
c) 달리 나타내지 않으면, 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 각각 항원-결합 도메인 또는 단편, 예컨대 VHH 도메인 또는 VH 또는 VL 도메인을 포함하고 이로 제한되지 않는 일반적인 용어로서 사용된다. 용어 항원-결합 분자 또는 항원-결합 단백질은 교환가능하게 사용되고, 용어 나노바디를 또한 포함한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가로 경쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어 VL-서열), 또는 중쇄 가변 도메인 서열 (예를 들어 VH 서열)이고; 보다 구체적으로, 통상적인 4 사슬 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열 또는 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열일 수 있다. 따라서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 도메인 항체, 또는 도메인 항체로서 사용하기 적합한 면역글로불린 서열, 단일 도메인 항체, 또는 단일 도메인 항체로서 사용하기 적합한 면역글로불린 서열, "dAb" 또는 dAb로서 사용하기 적합한 면역글로불린 서열, 또는 VHH 서열을 포함하고 이로 제한되지 않는 나노바디일 수 있다. 본 발명은 마우스, 래트, 토끼, 당나귀, 인간 및 낙타류 면역글로불린 서열을 포함하는 상이한 기원의 면역글로불린 서열을 포함한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 완전 인간, 인간화, 달리 서열 최적화된 또는 키메라 면역글로불린 서열을 포함한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 면역글로불린 단일 가변 도메인의 구조는 당업계 및 본원에서 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"로; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"로; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"으로; 및 프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 각각 언급되는 "FR"의 4개의 프레임워크 영역으로 이루어지는 것으로 간주될 수 있고 (그러나, 이로 제한되지 않음); 여기서 프레임워크 영역에는 당업계에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"로; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"로; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로 각각 언급되는 3개의 상보성 결정 영역 또는 "CDR"이 개재한다.
d) 달리 나타내지 않으면, 상세하게 구체적으로 설명되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자에게 명백할 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있거나 수행되었다. 예를 들어 표준 안내서 및 본원에서 언급되는 일반적인 배경 기술 및 본원에서 인용되는 추가의 참고문헌; 및 예를 들어 단백질 조작 기술, 예컨대 친화도 성숙 및 단백질, 예컨대 면역글로불린의 특이성 및 다른 요구되는 특성을 개선하기 위한 다른 기술을 설명하고 있는 다음 문헌을 참고한다: [Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56]; [Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57]; [Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45]; [Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12]; [Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43].
e) 아미노산 잔기는 표준 3 문자 또는 1 문자 아미노산 코드에 따라 표시될 것이다.
f) 2개 이상의 뉴클레오티드 서열을 비교하기 위해, 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이의 "서열 동일성"의 비율은 [제2 뉴클레오티드 서열 내의 상응하는 위치에서 뉴클레오티드에 동일한 제1 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 수]를 [제1 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 총 수]로 나누고 [100%]를 곱함으로써 (여기서 제2 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가 - 제1 뉴클레오티드 서열에 비해 -는 단일 뉴클레오티드 (위치)에서의 차이로서 간주된다); 또는 적합한 컴퓨터 알고리즘 또는 기술을 사용하여 계산하거나 결정될 수 있다. 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성 정도는 표준 설정을 사용하여 서열 정렬을 위한 공지의 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 NCBI Blast v2.0을 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성 정도를 결정하기 위한 일부 다른 기술, 컴퓨터 알고리즘 및 설정은 예를 들어 WO 04/037999, EP 0 967 284, EP 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 및 GB 2 357 768-A에 기재되어 있다. 대체로, 본원에서 개략적으로 설명되는 계산 방법에 따라 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 "서열 동일성" 비율을 결정하기 위해서, 최대 수의 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열은 "제1" 뉴클레오티드 서열로 간주되고, 다른 뉴클레오티드 서열은 "제2" 뉴클레오티드 서열로 간주될 것이다.
g) 2개 이상의 아미노산 서열을 비교하기 위해서, 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성" 비율 (본원에서 "아미노산 동일성"으로도 언급됨)은 [제2 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 아미노산 잔기에 동일한 제1 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 총수]로 나누고 [100%]를 곱함으로써 (여기서 제2 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가 - 제1 아미노산 서열에 비해 -는 단일 아미노산 잔기 (위치)에서의 차이, 즉, 본원에서 규정된 "아미노산 차이"로서 간주된다); 또는 적합한 컴퓨터 알고리즘 또는 기술을 사용하여 계산하거나 결정될 수 있다. 본원에서 개략적으로 설명되는 계산 방법에 따라 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성" 비율을 결정하기 위해서, 최대 수의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열은 "제1" 아미노산 서열로 간주되고, 다른 아미노산 서열은 "제2" 아미노산 서열로 간주될 것이다.
또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성 정도를 결정할 때, 당업자는 아래 v)에 개시된 바와 같이 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다.
본원에서 설명되는 폴리펩티드에 적용되는 임의의 아미노산 치환은 문헌 [Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978]에 의해 개발된, 상이한 종의 상동성 단백질 사이의 아미노산 변이의 빈도의 분석, 문헌 [Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974] 및 [Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978]에 의해 개발된 구조 형성 능력의 분석, 및 문헌 [Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984]; [Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981] 및 [Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986]에 의해 개발된 단백질의 소수성 패턴 분석을 기초로 할 수 있고, 상기 문헌은 모두 그 전부가 본원에 참고로 포함된다. 나노바디의 1차 및 2차 구조에 대해, 라마로부터의 VHH 도메인의 결정 구조는 예를 들어 문헌 [Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996)]; [Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757]; 및 [Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)]에 제시되어 있다.
h) 2개의 아미노산 서열을 비교할 때, 용어 "아미노산 차이"는 제2 서열에 비해 제1 서열의 위치 상의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 의미하고; 2개의 아미노산 서열이 1개, 2개 이상의 상기 아미노산 차이를 함유할 수 있음이 이해된다.
i) 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 각각 또 다른 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 "포함하거나", 또는 "본질적으로 또 다른 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다"고 언급될 때, 이것은 후자의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 각각 먼저 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 내로 도입되었음을 의미할 수 있지만, 보다 대체로 이것은 일반적으로 먼저 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 그의 서열 내에, 먼저 언급된 서열이 실제로 생성되거나 얻어지는 방법 (예를 들어 본원에서 설명되는 임의의 적합한 방법에 의할 수 있다)과 무관하게, 후자의 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 각각 갖는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 스트레치를 각각 포함함을 의미한다. 비-제한적인 예로서, 본 발명의 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 나노바디가 CDR 서열을 포함하는 것으로 언급될 때, 이것은 상기 CDR 서열이 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 내로 도입되었음을 의미할 수 있지만, 보다 대체로 이것은 일반적으로 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디가 그의 서열 내에, 상기 이중 파라토프성 나노바디가 생성되거나 얻어지는 방법과 무관하게, 상기 CDR 서열과 동일한 아미노산 서열을 각각 갖는 아미노산 잔기의 스트레치를 각각 포함함을 의미한다. 또한, 후자의 아미노산 서열이 특이적인 생물학적 또는 구조적 기능을 갖는 경우, 이것은 바람직하게는 먼저 언급된 아미노산 서열에 본질적으로 동일한, 유사한 또는 동등한 생물학 또는 구조적 기능을 갖는다는 것을 유의하여야 한다 (즉, 먼저 언급된 아미노산 서열은, 후자의 서열이 본질적으로 동일한, 유사한 또는 동등한 생물학 또는 구조적 기능을 수행할 수 있도록 하는 것이 바람직하다). 예를 들어, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디가 각각 CDR 서열 또는 프레임워크 서열을 포함하는 것으로 언급될 경우, CDR 서열 및 프레임워크는 바람직하게는 상기 이중 파라토프성 나노바디에서 각각 CDR 서열 또는 프레임워크 서열로서 기능할 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열이 또 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 언급될 경우, 먼저 언급된 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 발현 생성물 (예를 들어 폴리펩티드)로 발현될 때, 후자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 상기 발현 생성물의 일부를 형성하도록 하는 것이다 (즉, 후자의 뉴클레오티드 서열은 먼저 언급된 더 큰 뉴클레오티드 서열과 동일한 해독 프레임으로 존재한다).
j) 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 대체로 그의 공급원 또는 배지에 함께 존재하는 적어도 하나의 다른 성분, 예컨대 또 다른 핵산, 또 다른 단백질/폴리펩티드, 또 다른 생물학적 성분 또는 거대분자 또는 적어도 하나의 오염물, 불순물 또는 소량 성분으로부터 분리된 경우에 "본질적으로 단리된 (형태로 존재하는)" 것으로 간주된다 - 예를 들어, 그 서열이 얻어지는 그의 천연 생물학 공급원 및/또는 반응 매질 또는 배양 배지에 비해 -. 특히, 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 보다 특히 적어도 100배, 및 1000배까지 또는 그 초과로 정제될 경우 "본질적으로 단리된" 것으로 간주된다. "본질적으로 단리된 형태"로 존재하는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 바람직하게는 적합한 기술, 예컨대 적합한 크로마토그래피 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드-겔 전기영동을 사용하여 결정될 때 본질적으로 균일하다.
k) 본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 도메인"은 적어도 하나의 CDR을 포함하고 표적 항원 결정자 또는 에피토프를 인식하는 입체형태인 면역글로불린 내의 아미노산 서열을 의미한다.
l) 또한 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있는 용어 "항원 결정자" 및 "에피토프"는 선형 또는 비-선형 입체형태 여부와 상관 없이 항원 결합 도메인에 의해 인식되는 표적 CXCR2 내의 아미노산 서열을 의미한다.
m) 특이적 항원 결정자, 에피토프, 항원 또는 단백질 (또는 그의 적어도 하나의 부분, 단편 또는 에피토프)에 (특이적으로) 결합할 수 있고/있거나 친화도를 갖고/갖거나 특이성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드, 예컨대, 본원에서 설명되는 이중 파라토프성 나노바디 또는 그의 단편은 상기 항원 결정자, 에피토프, 항원 또는 단백질"에 대한" 또는 "에 대해 작용하는" 것으로 언급된다.
n) 용어 "특이성"은 본 발명의 폴리펩티드의 특정 항원-결합 도메인이 결합할 수 있는 상이한 종류의 항원 또는 항원 결정자의 수를 나타낸다. 임의의 특정 항원/에피토프에 대한 항원-결합 단백질의 특이성은 또한 폴리펩티드와 관련 항원 또는 에피토프 사이의 결합을 측정하기 위한 일부 바람직한 기술을 설명하고 있는 WO 08/020079 (본원에 참고로 포함됨)의 53-56 페이지에 기재된 바와 같이 친화도 및/또는 결합력 (avidity)을 기초로 하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 각각의 항원-결합 단백질 (예컨대 본 발명의 폴리펩티드)에서 각각의 항원 결합 도메인은 각각 독립적으로 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수 (KD) (즉, 105 내지 1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰의 회합 상수 (KA))로 그의 항원/에피토프에 결합할 수 있다. 104 mol/리터보다 큰 임의의 KD 값 (또는 104 M-1보다 낮은 임의의 KA 값)이 일반적으로 비-특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 요구되는 항원에 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 결합할 것이다. 본 발명의 폴리펩티드의 CXCR2에 대한 특이적 결합은 예를 들어 스캐챠드 (Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정, 예컨대 방사성 면역검정 (RIA), 효소 면역검정 (EIA) 및 샌드위치 경쟁 검정, 및 당업계에 공지된 그의 상이한 변이 방법; 및 본원에서 언급되는 다른 기술을 포함하는 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다. 당업자에게 명백하고 WO 08/020079의 53-56 페이지에 기재된 바와 같이, 해리 상수는 실제 또는 겉보기 해리 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 WO 08/020079의 53-56 페이지에 언급된 기술을 포함한다.
o) 본 발명의 폴리펩티드, 특히 본 발명에 따른 이중 파라토프성 나노바디의 반감기는 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드의 혈청 농도가, 예를 들어 폴리펩티드의 분해 및/또는 자연 메카니즘에 의한 폴리펩티드의 소실 또는 제거에 의해 생체 내에서 50% 감소하는데 걸리는 시간으로서 규정될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 생체내 반감기는 그 자체로 공지된 임의의 방식으로, 예컨대 약동학 분석에 의해 결정될 수 있다. 적합한 기술은 당업계의 숙련인에게 명백할 것이고, 예를 들어 일반적으로 WO 08/020079의 페이지 57의 문단 o)에 기재된 것일 수 있다. 또한 WO 08/020079의 페이지 57에서 언급된 바와 같이, 반감기는 파라미터, 예컨대 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선 하 면적 (AUC)을 사용하여 표현될 수 있다. 예를 들어 아래 실험 부분, 및 표준 안내서, 예컨대 문헌 [Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists] 및 [Peters et al., Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]을 참조한다. 또한, 문헌 ["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]을 참조한다. 용어 "반감기의 증가" 또는 "증가된 반감기"는 t1/2-알파 및/또는 AUC의 증가와 함께 또는 이의 증가가 없는 상태에서 t1/2-베타의 증가를 의미한다.
p) 본 발명의 문맥에서, 적합한 시험관내, 세포 또는 생체 내 검정을 사용하여 측정될 때 CXCR2의 활성을 "차단하거나, 감소시키거나 억제하는" 것은 동일한 조건이지만 본 발명의 폴리펩티드의 부재 하에서 동일한 검정으로 측정한 CXCR2의 활성에 비해, CXCR2의 관련 또는 의도되는 생물학적 활성의 활성을 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 적어도 25%, 예를 들어 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 90% 이상 차단하거나, 감소시키거나 억제하는 것을 의미할 수 있다.
당업자에게 명백할 바와 같이, 억제는 또한 동일한 조건이지만 본 발명의 폴리펩티드의 부재 하에 비해, 하나 이상의 그의 리간드 또는 결합 파트너에 대한 CXCR2의 친화도, 결합력, 특이성 및/또는 선택성의 감소의 초래, 및/또는 CXCR2가 존재하는 배지 또는 환경 내의 하나 이상의 조건 (예컨대 pH, 이온 강도, 보조-인자의 존재 등)에 대한 CXCR2의 감수성의 감소의 초래를 수반할 수 있다. 당업자에게 명백할 바와 같이, 이것은 다시 관련되는 표적 또는 항원에 따라 임의의 적합한 방식으로 및/또는 그 자체로 공지된 임의의 적합한 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
q) 본원에서 사용되는 바와 같이, "조절하는"은 CXCR2의 알로스테리 조정; 및/또는 그의 리간드 중의 하나에 대한 CXCR2의 결합의 감소 또는 억제 및/또는 CXCR2에 대한 결합을 위해 천연 리간드와의 경쟁을 의미할 수 있다. 또한, 조절하는은 예를 들어 CXCR2의 폴딩 또는 입체형태에 대한 또는 그의 입체형태를 변화시키는 (예를 들어, 리간드의 결합 시에), 다른 (하위)단위와 회합하는, 또는 해리하는 그의 능력에 대한 변화의 초래를 수반할 수 있다. 또한, 조절하는은 예를 들어 다른 화합물을 수송하거나 또는 다른 화합물 (예컨대 이온)에 대한 채널로서 기능하는 CXCR2의 능력의 변화의 초래를 수반할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 특히 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디에 의한 CXCR2 활성의 조절, 특히 억제 또는 감소는 가역적 또는 비가역적일 수 있지만, 제약 및 약리적 목적을 위해 대체로 가역적 방식일 것이다.
r) 본 발명의 폴리펩티드는 제2 표적 또는 폴리펩티드에 결합하는 친화도보다 적어도 10배, 예컨대 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 1000배, 및 10,000배까지 또는 그 초과의 친화도 (상기한 바와 같이, 및 KD 값, KA 값, Koff 속도 및/또는 Kon 속도로 적합하게 표현되는)로 CXCR2에 결합할 때 제2 표적 또는 항원에 비해 CXCR2에 "대해 특이적인" 것으로 언급된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 또 다른 표적 또는 폴리펩티드 또는 그의 에피토프에 결합하는 KD보다 적어도 10배, 예컨대 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 1000배, 예컨대 10,000배 더 작은 또는 심지어 이보다 더 작은 KD 값으로 CXCR2에 결합할 수 있다.
s) 용어 "교차차단", "교차차단된" 및 "교차차단하는"은 제시된 표적에 대한 본 발명의 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드의 결합을 저해하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드의 능력을 의미하기 위해 본원에서 교환가능하게 사용된다. 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드가 또 다른 표적의 결합을 저해하고 따라서 본 발명에 따라 교차차단하는 것으로 언급될 수 있는 정도는 경쟁적 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 특히 적합한 한 정량적 교차차단 검정은 표적에 대한 그의 결합의 측면에서 본 발명에 따른 표지된 (예를 들어 His-태깅된 (tagged), 방사성 또는 형광 표지된) 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드와 다른 결합제 사이의 경쟁을 측정하는 FACS- 또는 ELISA-기반 방법을 이용한다. 실험 부분은 결합 분자가 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드를 교차차단하거나 교차차단할 수 있는지를 결정하기 위한 적합한 FACS- 및 ELISA-대체-기반 검정을 일반적으로 설명한다. 검정은 본원에서 설명되는 임의의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 다른 결합제와 함께 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 일반적으로, 본 발명에 따른 교차차단 아미노산 서열 또는 다른 결합제는 검정 동안 제2 아미노산 서열 또는 본 발명의 다른 결합제의 존재 하에 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드의 기록된 대체가, 시험되는 잠재적인 교차차단제 (예를 들어 다른 항체 단편, VHH, dAb 또는 유사한 VH/VL 변이체)에 의한 최대 이론적 대체의 50% 내지 100%가 되도록 상기 교차차단 검정에서 표적에 결합하는 것이다.
t) 본 발명에 따른 폴리펩티드는 상이한 항원 또는 항원 결정자 둘 모두에 대해 (본원에서 규정된 바와 같이) 특이적이면, 2개의 상이한 항원 또는 항원성 결정자 (예컨대 포유동물의 2가지 상이한 종, 예컨대 인간 및 시노몰거스 원숭이로부터의 혈청 알부민 또는 CXCR2)에 대해 "교차반응성"인 것으로 언급된다.
u) 본원에서 규정된 바와 같이, 보존적 아미노산 변화는 아미노산 잔기가 유사한 화학적 구조의 또 다른 아미노산 잔기로 교체되고 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에 대한 영향을 거의 또는 본질적으로 전혀 갖지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 상기 보존적 아미노산 치환은 예를 들어 WO 04/037999, GB-A-3 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 및 WO 01/09300으로부터 당업계에 공지되어 있고; 상기 치환의 (바람직한) 종류 및/또는 조합은 WO 04/037999 및 WO 98/49185로부터 및 본원에서 인용되는 추가의 참고문헌으로부터의 관련 교시내용을 기초로 하여 선택될 수 있다.
상기 보존적 치환은 바람직하게는 다음 군 (a) - (e) 내의 하나의 아미노산이 동일한 군 내의 또 다른 아미노산 잔기로 치환된 치환이다: (a) 작은 지방족, 비극성 또는 저극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성, 음 하전 잔기 및 그의 (비하전) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성, 양 하전 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.
특히 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala의 Gly 또는 Ser; Arg의 Lys; Asn의 Gln 또는 His; Asp의 Glu; Cys의 Ser; Gln의 Asn; Glu의 Asp; Gly의 Ala 또는 Pro; His의 Asn 또는 Gln; Ile의 Leu 또는 Val; Leu의 Ile 또는 Val; Lys의 Arg, Gln 또는 Glu; Met의 Leu, Tyr 또는 Ile; Phe의 Met, Leu 또는 Tyr; Ser의 Thr; Thr의 Ser; Trp의 Tyr; Tyr의 Trp; 및/또는 Phe의 Val, Ile 또는 Leu로의 치환.
v) 본원에서 사용되는 바와 같이, CDR은 본 발명의 폴리펩티드의 상보성 결정 영역이다. CDR은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 CDR과 조합되어 본 발명의 폴리펩티드가 인식하는 항원(들) 또는 에피토프(들)과의 상보성을 확립하는 아미노산의 스트레치이다. CDR은 특정 넘버링 (numbering) 규약에 의해 아미노산 서열에서 확인된다. 본원의 청구의 범위 및 구체적인 설명에서, 카바트 넘버링이 사용된다.
w) 본원에서 사용되는 바와 같이, FR은 프레임워크 영역 (때때로 FW로 불림)이다. 프레임워크 영역은 하나 이상의 CDR에 인접하여 이를 항원 또는 에피토프 인식을 위한 정확한 3차원 입체형태로 지지하는 아미노산의 스트레치이다. FR은 표적 항원 또는 에피토프에 특이적이지 않지만, 이들이 존재하는 면역글로불린 분자의 종 기원 또는 종류에 특이적이다. 본원에서 상세히 논의되는 바와 같이, 면역글로불린의 공급원, 예를 들어 낙타류에 의해 적용되는 프레임워크 서열에 상이하도록 조작되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 대한 범위가 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재한다.
x) 본원에서 사용되는 바와 같이, CXCR2는 백혈구의 표면에 존재하고 그에 대한 천연 생성 리간드가 Gro-α, β, γ, IL-8, ENA-78 또는 GCP-2일 수 있는 시토카인 수용체를 의미한다. CXCR2는 일반적으로 본원에서 유래하는 종과 무관하게 CXCR2 기능을 보이는 임의의 단백질을 의미한다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이 인간 CXCR2는 서열 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그의 임의의 대립유전자 변이체 또는 오솔로그 (orthologue)를 의미하고, 시노몰거스 CXCR2는 서열 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그의 임의의 대립유전자 변이체 또는 오솔로그를 의미한다.
y) 본원에서 사용되는 바와 같이, "서열-최적화"는 천연 서열 내에 존재하지 않을 수 있는 특정 특성 또는 구조적 특성을 확보하기 위해 아미노산 서열내의 치환, 삽입 또는 결실을 용이하게 하는 것을 의미한다. 상기 치환, 삽입 또는 결실은 예를 들어 화학적 안정화, 제조 능력의 개선, 피로글루타메이트 형성 또는 산화 또는 이성체화의 방지를 위해 수행될 수 있다. 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 특히 이중 파라토프성 나노바디에 사용될 수 있는, 상기 특성의 최적화를 달성하기 위한 방법은 본원에 참고로 포함된 WO 2009/095235에 기재되어 있다. 또한, 서열 최적화 기술은 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드를 본원에서 설명되는 방식으로 인간화하기 위해 수행될 수 있다. 따라서, 서열 최적화, 서열 최적화 또는 서열-최적화된이 본원에서 사용될 경우, 이것은 인간화 치환 또는 삽입에 대한 구체적인 언급 및 부분적으로 또는 완전히 인간화된 이중 파라토프성 폴리펩티드, 바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디를 포함한다.
발명의 상세한 설명
상기한 바와 같이, 제1 측면에서, 본 발명은 적어도 2개의 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 케모카인 수용체 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 CXCR2 상의 제1 에피토프를 인식하는 제1 항원 결합 도메인 및 CXCR2 상의 제2 에피토프를 인식하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 서열 7에 제시된 아미노산의 서열로 이루어지는 선형 펩티드에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인 및 상기 선형 펩티드에 결합할 수 없거나 보다 낮은 친화도로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 서열 7은 인간 CXCR2의 처음 19개의 N-말단 아미노산이다.
한 실시양태에서, 제1 항원 결합 도메인은 CXCR2의 아미노산 1 내지 19를 포함하거나 이 내의 제1 에피토프를 인식하고, 상기 제2 항원 결합 도메인은 아미노산 1 내지 19 외부의 CXCR2 상의 제2 에피토프를 인식한다.
제1 및 제2 항원 결합 도메인은 면역글로불린 클래스의 분자를 특징으로 하는 하나 이상의 아미노산 서열에 포함될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 각각 링커에 의해 연결된 통상적인 4 사슬 항체를 포함한다. 특히 본 발명의 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 각각 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 제1 및 제2 항체에 각각 포함되고 상기 제1 및 제2 항체가 링커에 의해 연결된 것이다. 별법으로, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단일 항체 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 중쇄 항체인 아미노산 서열 내에 포함되고, 특히 본 발명의 폴리펩티드는 상기 제1 항원 결합 도메인이 제1 중쇄 항체 내에 포함되고 상기 제2 항원 결합 도메인이 제2 중쇄 항체 내에 포함되고 상기 제1 및 제2 중쇄 항체가 링커에 의해 연결된 것일 수 있다. 상기 중쇄 항체는 낙타류 패밀리로부터 얻고, 각각 불변 및 가변 영역을 갖는 단지 2개의 중쇄를 사실상 포함할 수 있다. 2개의 중쇄를 포함하는 단일 중쇄 항체 내에 상기 제1 및 제2 결합 도메인이 포함되는 폴리펩티드도 본 발명에서 고려된다.
제1 및 제2 결합 도메인을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 또 다른 실시양태는 단일쇄 Fv (scFv)일 수 있다. 이들은 VL 및 VH 도메인의 선형 융합체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 각각 제1 및 제2 항체 단일쇄 Fv (scFv) 단편 내에 포함되고 상기 제1 및 제2 scFv 단편이 링커에 의해 연결된 것일 수 있다.
추가의 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 통상적인 4 사슬 항체의 하나 이상의 Fab 또는 F(ab)2 단편에 포함될 수 있다. Fab 단편은 통상적인 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 각각으로부터의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인을 포함한다. F(ab)2 단편은 통상적인 항체의 힌지 영역의 일부에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함한다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 각각 제1 및 제2 항체 Fab 또는 F(ab)2 단편 내에 포함되고 상기 제1 및 제2 Fab 또는 F(ab)2 단편이 링커에 의해 연결된 것일 수 있다. 상기 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 항체 Fab 단편 내에 포함될 수 있고 상기 제2 항원 결합 도메인은 F(ab)2 단편 내에 포함되거나 또는 그 반대일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제1 항원 결합 도메인은 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 내에 포함되고, 상기 제2 항원 결합 도메인은 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인 내에 포함된다.
본 발명의 상기 실시양태의 특정 예는 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 d(ab)로 불리는 도메인 항체에 포함되는 것이다. d(ab)는 통상적인 항체로부터의 단일 VL 또는 VH 도메인을 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 제1 및 제2 도메인 항체 (dAb) 내에 포함되고, 상기 제1 및 제2 dAb가 링커에 의해 연결된 것일 수 있다. 상기 제1 및 제2 dAb는 항체 VL 단편 또는 항체 VH 단편일 수 있다. 그러한 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 도메인은 VL 단편에 포함될 수 있고, 상기 제2 항원 결합 도메인은 VH 단편에 포함될 수 있거나 또는 그 반대일 수 있다.
(단일) 도메인 항체의 일반적인 설명에 대해서는, 또한 EP 0 368 684를 참조한다. 용어 "dAb"에 대해, 예를 들어 문헌 [Ward et al., (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6)], [Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490]; 및 예를 들어 WO 06/030220, WO 06/003388 및 도만티스 엘티디. (Domantis Ltd.)의 다른 공개된 특허 출원을 참조한다. 또한, 포유동물 기원이 아니기 때문에 본 발명의 문맥에서 덜 바람직지만, 단일 도메인 항체 또는 단일 가변 도메인는 특정 종의 상어로부터 유래될 수 있음을 유의하여야 한다 (예를 들어, 소위 "IgNAR 도메인", 예를 들어 WO 05/18629 참조).
상기 중쇄 항체의 단일쇄의 가변 영역은 VHH 도메인으로 알려져 있고, 나노바디로서 알려진 항체 단편을 포함한다. 나노바디는 전체 VHH 도메인 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 중쇄 항체 및 그의 가변 도메인의 일반적인 설명에 대해서는 WO08/020079의 59 페이지에 언급된 선행 기술 및 국제 특허 출원 WO06/040153의 41 내지 43 페이지에 언급된 참고문헌의 목록을 참고한다. VHH 도메인은 단리된 VHH 도메인 (및 천연 생성 VHH 도메인과 동일한 구조적 및 기능적 특성을 갖는 그를 기초로 한 나노바디) 및 이를 함유하는 폴리펩티드를 기능적 항원 결합 도메인 또는 폴리펩티드로서 고도로 유익하게 만드는 많은 독특한 구조적 특성 및 기능적 특성을 갖는다. 특히, VHH 도메인 (경쇄 가변 도메인의 부재 하에 또는 이와 임의의 상호작용을 보이지 않으면서, 본래 항원에 기능적으로 결합하도록 "설계된") 및 나노바디는 단일, 비교적 작은, 기능적 항원-결합 구조적 단위, 도메인 또는 단백질로서 기능할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 나노바디는 천연 생성 VHH 도메인 및 그의 단편뿐만 아니라 본원에서 상세히 논의되는 그의 변이체 및 유도체도 포함한다.
본 발명의 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 상기 제1 항원 결합 도메인이 제1 나노바디 내에 포함되고 상기 제2 항원 결합 도메인이 제2 나노바디 내에 포함되고 상기 제1 및 제2 나노바디가 링커에 의해 연결된 것이다.
VHH 도메인의 구조는
FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR
로 제시될 수 있고, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 다음 구조 중의 하나를 가질 수 있다:
i) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커-FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
ii) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--링커--HLE
iii) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--HLE--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4가 제1 항원 결합 도메인 (선형 서열 7 결합제)을 포함하면, FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8은 제2 항원 도메인 (선형 서열 7 비-결합제)을 포함하고, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4가 제2 항원 도메인 (선형 서열 7 비-결합제)을 포함하면, FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8은 제1 항원 결합 도메인 (선형 서열 7 결합제)을 포함하고, HLE는 증가된 생체내 반감기를 제공하는 결합 단위이다.
따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이 "본 발명에 따른 이중 파라토프성 나노바디"는 링커에 의해 연결된 2개의 단일 나노바디를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
그러나, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 각각의 나노바디에 단지 하나의 CDR만을 포함할 수 있다. 그 경우, 바람직한 CDR은 CDR3 및/또는 CDR6이다. 그러나, 본 발명에 따른 이중 파라토프성 나노바디는 N-말단 나노바디에 CDR1 또는 CDR2 또는 CDR3 또는 CDR1 및 CDR2 또는 CDR1 및 CDR3 또는 CDR2 및 CDR3 또는 CDR1 및 CDR2 및 CDR3을 및 C-말단 나노바디에 다음 조합 중의 임의의 하나를 포함할 수 있다: CDR4 또는 CDR5 또는 CDR6 또는 CDR4 및 CDR5 또는 CDR4 및 CDR6 또는 CDR5 및 CDR6 또는 CDR4 및 CDR5 및 CDR6. 상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 모든 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 및 CDR6을 포함할 수 있고, 각각의 CDR에는 FR이 측면에 접한다.
FR은 낙타류 공급원과 일치하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에서 하나 이상의 FR은 적어도 하나의 서열 최적화 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 하나 이상, 보다 바람직하게는 모든 FR이 부분적으로 또는 완전 인간화된다. 서열 최적화를 위한 치환은 아래에서 보다 상세히 논의한다.
또한, 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 나노바디가 아니라 상기 논의된 바와 같은 통상적인 항체의 도메인 또는 단편, 예를 들어 인간 항체, 도메인 또는 단편인 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 포함되는 본 발명의 실시양태에서, 그 내의 CDR(들)을 적어도 하나의 낙타화 치환으로 변경하고 임의로 완전히 낙타화된 CDR의 생성이 가능함이 본원에서 언급된다.
본원에서 추가로 설명되는 바와 같이, 단일 나노바디 내의 아미노산 잔기의 총수는 110-120일 수 있고, 바람직하게는 112-115이고, 가장 바람직하게는 113이다. 그러나, 나노바디의 부분, 단편, 유사체 또는 유도체 (본원에서 추가로 설명되는)는 상기 부분, 단편, 유사체 또는 유도체가 본원에서 개략적으로 설명하는 추가의 요건을 충족하고 본원에서 설명되는 목적에 바람직하게는 적합하다면 그의 길이 및/또는 크기로 특히 제한되지 않음을 유의하여야 한다.
본원에서 추가로 설명되는 바와 같이, 나노바디의 아미노산 잔기는 문헌 [Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195 (예를 들어 상기 간행물의 도 2 참조)]에서 낙타류로부터의 VHH 도메인에 적용되는 바와 같이 문헌 [Kabat et al., ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)]에서 제시된 VH 도메인에 대한 일반적인 넘버링에 따라 넘버링되고, 따라서 나노바디의 FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 CDR1은 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 FR3은 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 CDR3은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 이중 파라토프성 나노바디에서, N-말단 나노바디는 상기 제시된 위치에 FR 및 CDR을 가질 수 있고, C-말단 나노바디에서 나노바디의 FR5는 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 CDR4는 위치 31-35의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 FR6은 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 CDR5 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 FR7은 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 CDR6은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 나노바디의 FR8은 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
그러나, 항체, 특히 나노바디의 CDR 및 FR은 카바트에 대한 대안인 넘버링 시스템에 의해 확인할 수 있음이 이해될 것이다. 이들은 코티아 (Chothia), IMGT 및 AHo 시스템을 포함한다. 이들 대안적인 넘버링 시스템에 따라 표 9, 13, 19, 32, 33 및 34에서 확인된 임의의 하나의 아미노산 서열의 CDR 또는 FR의 위치의 확인은 서열의 분석에 의해 달성할 수 있다. 이를 위해, 다음 웹사이트를 참고할 수 있다: http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/ (코티아); http://imgt.cines.fr (IMGT) 및 http://www.bio.uzh.ch/antibody/index.html (AHo). 구체적으로, 본원에 설명되는 본 발명의 바람직한 이중 파라토프성 나노바디에서, CDR 1, 2, 3, 4, 5 또는 6은 카바트에 대한 대안인 이들 넘버링 시스템 중의 하나에 의해 규정될 수 있고, 본 발명의 범위 내에 또한 포함될 것이다.
본 발명에 따른 일부 나노바디에 대한 코티아 CDR은 표 35에 제시된다.
나노바디는 소위 "VH3 클래스" (즉, VH3 클래스, 예컨대 DP-47, DP-51 또는 DP-29의 인간 생식계열 (germline) 서열에 대해 높은 수준의 서열 상동성을 갖는 나노바디)일 수 있고, 이 나노바디는 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디의 구축에 바람직하다. 그러나, CXCR2에 대해 작용하는 임의의 종류의 나노바디, 및 예를 들어 WO 07/118670에 설명된 바와 같은 소위 "VH4 클래스" (즉, VH4 클래스, 예컨대 DP-78의 인간 생식계열 서열에 대해 높은 수준의 서열 상동성을 갖는 나노바디)에 속하는 나노바디가 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디의 구축에 사용될 수 있음을 유의하여야 한다.
본 발명에 따른 제1 및 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 연결하는 링커 분자는 면역글로불린 기원일 수 있거나 아닐 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 나노바디인 경우, 링커는 항원 결합 도메인을 포함하는 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 C-말단을 항원 결합 도메인을 포함하는 또 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인의 N-말단에 연결한다.
제1 및 제2 항원 결합 도메인을 함께, 특히 2개의 나노바디를 함께 연결하기 위해 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드에 사용하기 적합한 스페이서 또는 링커는 당업자에게 명백할 것이고, 일반적으로 아미노산 서열을 연결하기 위해 당업계에서 사용되는 임의의 링커 또는 스페이서일 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커 또는 스페이서는 제약 용도가 의도되는 단백질 또는 폴리펩티드를 구축하는데 사용하기에 적합하다.
예를 들어, 링커는 적합한 아미노산 서열, 특히 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 30, 예컨대 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 아미노산 서열의 일부의 바람직한 예는 WO 99/42077에 기재된, 예를 들어 타입 (glyxsery)z의 gly-ser 링커, 예컨대 (gly4ser)3 또는 (gly3ser2)3 및 본원에 언급된 아블링스의 출원에 기재된 GS30, GS15, GS9 및 GS7 링커 (예를 들어 WO 06/040153 및 WO 06/122825 참조), 및 힌지-유사 영역, 예컨대 천연 생성 중쇄 항체 또는 유사한 서열의 힌지 영역 (예컨대 WO 94/04678에 기재된)을 포함한다.
일부의 다른 가능한 링커는 폴리-알라닌 (예컨대 AAA), 및 링커 GS30 (WO 06/122825의 서열 85) 및 GS9 (WO 06/122825의 서열 84)이다.
본 발명에 따른 바람직한 링커는 3 내지 50개, 예를 들어 3 내지 9, 10 내지 15, 16 내지 20, 21 내지 25, 26 내지 35, 36 내지 40, 41 내지 45 또는 46 내지 50개 아미노산 길이의 펩티드 링커이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 펩티드 링커는 35개 아미노산 길이이다. 링커는 단지 2개의 상이한 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기한 바와 같이 이들은 글라이신 및 세린일 수 있다. 별법으로, 이들은 프롤린 및 세린일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태, 특히 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디에서, 펩티드 링커는 다음 아미노산 서열로 이루어진다:
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 220).
다른 적합한 링커는 일반적으로 유기 화합물 또는 중합체, 특히 제약 용도를 위한 단백질에 사용하기 적합한 것을 포함한다. 예를 들어, 폴리(에틸렌글리콜) 모이어티 (moiety)가 항체 도메인을 연결하기 위해 사용되었다 (예를 들어 WO 04/081026 참조).
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함하는 분자에 관한 것이고, 상기 분자는 케모카인 수용체 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 CXCR2 상의 제1 및 제2 에피토프를 인식하고, 상기 적어도 2개의 폴리펩티드는 비-펩티드 링커에 의해 연결된다.
바람직하게는, 본 발명의 측면에서, 제1 항원 결합 도메인은 서열 7에 제시된 아미노산의 서열로 이루어진 선형 펩티드에 결합할 수 있고, 상기 제2 항원 결합 도메인은 상기 선형 펩티드에 결합할 수 없거나 보다 낮은 친화도로 결합한다. 바람직하게는, 제1 에피토프는 CXCR2의 아미노산 1 내지 19를 포함하거나 이 내에 존재하고, 제2 에피토프는 CXCR2의 아미노산 1 내지 19 외부에 존재한다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 측면에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 면역글로불린 단일 가변 도메인 내에 포함되고, 여기서 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게는 나노바디 및 특히 본원에서 구체적으로 설명되는 임의의 나노바디이다.
본원에 설명되는 본 발명의 모든 측면에서, 링커의 본질적인 특성은 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 CXCR2 상의 그 각각의 에피토프에 결합하도록 허용하는 길이 및 입체형태를 갖는다는 것이다.
사용되는 링커(들)은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 하나 이상의 다른 유리한 특성 또는 기능성을 부여하고/하거나 유도체의 형성을 위한 및/또는 기능적 기의 부착을 위한 하나 이상의 부위 (예를 들어 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디의 유도체에 대해 본원에서 설명되는)를 제공할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기를 함유하는 링커 (국제 특허 출원 WO 08/020079의 48 페이지의 표 A-2 참조)는 개선된 친수성 특성을 제공할 수 있는 반면에, 작은 에피토프 또는 태그를 형성하거나 함유하는 링커는 검출, 확인 및/또는 정제를 위해 사용될 수 있다. 다시, 본원의 개시내용을 기초로 하여, 당업자는 임의로 일부의 제한된 통상적인 실험 후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적 링커를 결정할 수 있을 것이다.
마지막으로, 2개 이상의 링커가 본 발명의 폴리펩티드에 사용될 때, 이들 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 다시, 본원의 개시내용을 기초로 하여, 당업자는 임의로 일부의 제한된 통상적인 실험 후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적 링커를 결정할 수 있을 것이다.
대체로, 용이한 발현 및 생산을 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 선형 폴리펩티드일 것이다. 그러나, 본 발명은 가장 넓은 의미에서 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드가 3개 이상의 나노바디를 포함할 경우, 이들을 3개 이상의 "아암 (arm)"을 갖는 링커를 사용하여 연결하는 것이 가능하고, 각각의 "아암"은 "별 형태의" 구축물을 제공하도록 나노바디에 연결된다. 또한, 대체로 덜 바람직하기는 하지만 환상 구축물을 사용할 수도 있다. 특히, 상기 확인된 하나 이상의 링커를 사용한 2개 이상의 나노바디의 임의의 정렬을 준비할 수 있다. 예를 들어, CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하는 2개의 면역글로불린 결합 도메인 및 인간 혈청 알부민 (HSA)에 대해 작용하거나 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 이중 파라토프성, 이중 특이적 나노바디가 고려될 수 있고, 상기 HSA 결합 도메인은 임의의 위치에서, 예를 들어 2개의 CXCR2 결합 나노바디 사이에서 본원에서 규정된 링커를 통해 CXCR2 결합 나노바디에 연결된 나노바디 내에 포함될 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 이중 파라토프성 폴리펩티드를 제조하였다. 다가 및 이중 파라토프성 항-CXCR2 나노바디의 아미노산 서열은 본원의 실시예 내의 표 13에 제시한다. 이들 중에서, 본 발명에 따른 특히 바람직한 폴리펩티드는 163D2-127D1, 163E3-127D1, 163E3-54B12, 163D2-54B12, 2B2-163E3, 2B2-163D2, 97A9-2B2, 97A9-54B12, 127D1-163D2, 127D1-163E3, 2B2-97A9, 54B12-163D2, 54B12-163E3, 163D2-2B2 및 163E3-2B2 및 127D1-97A9, 54B12-97A9 및 97A9-127D1로서 표 13에 지정된 이중 파라토프성 나노바디 및 그의 서열 최적화된 변이체이다. 모든 이들 이중 파라토프성 나노바디는 서열 7에 제시된 아미노산의 서열 (CXCR2의 아미노산 1-19)로 이루어지는 선형 펩티드에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 나노바디 및 상기 선형 펩티드에 결합할 수 없거나 보다 낮은 친화도로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 나노바디를 포함한다 (표 8 참조). 본 발명에 따라 특히 바람직한 것은 163D2-127D1, 163E3-127D1, 163E3-54B12, 163D2-54B12, 2B2-163E3, 2B2-163D2, 97A9-2B2 및 97A9-54B12이다.
1) 163 D2 -127 D1 (서열 58)
본 발명의 본 실시양태는 상기 규정된 상기 제2 나노바디가 서열 145, 165 및 185로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 145, 165 또는 185의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 나노바디가 서열 141, 161 및 181로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 141, 161 또는 181의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는, 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제2 나노바디에서 CDR1은 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 나노바디에서 CDR4는 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 161에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 145, 165, 185, 141, 161 또는 181에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 145, 165, 185, 141, 161 또는 181에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 83, 104, 124, 131, 79, 100, 또는 120에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 58에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 58의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 58에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 58과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 58에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 163D2 나노바디에 대해 표 28에서 및 127D1 나노바디에 대해 표 26에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 163D2 나노바디는 서열 218에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 218과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 127D1 나노바디는 서열 216에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 216과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
2) 163 E3 -127 D1 (서열 59)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 제2 나노바디가 서열 146, 166 및 186으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 146, 166 또는 186의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 나노바디가 서열 141, 161 및 181로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 141, 161 또는 181의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는, 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제2 나노바디에서 CDR1은 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 나노바디에서 CDR4는 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 161에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 146, 166, 186, 141, 161 또는 181에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 146, 166, 186, 141, 161 또는 181에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 125에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 84, 105, 125, 131, 79, 100, 또는 120에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성, 또는 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 59에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 59의 아미노산 서열에 적어도 80% 아미노산 동일성, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 59에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 59와 적어도 80% 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 59에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 163E3 나노바디에 대해 표 24에서 및 127D1 나노바디에 대해 표 26에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 163E3 나노바디는 서열 217에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 217과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 127D1 나노바디는 서열 216에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 216과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
3) 163 E3 /54B12 (서열 62)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 제2 나노바디가 서열 146, 166 및 186으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 146, 166 또는 186의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 나노바디가 서열 151, 171 및 191로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 151, 171 또는 191의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제2 나노바디에서 CDR1은 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 나노바디에서 CDR4는 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6은 서열 146, 166, 186, 151, 171 또는 191에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성, 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 146, 166, 186, 151, 171, 191에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면에 따르면, FR1은 서열 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 125에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 84, 105, 125, 131, 89, 110 또는 130에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 62에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 62의 아미노산 서열에 적어도 80% 아미노산 동일성, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 62에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 62와 적어도 80% 아미노산 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 62에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 163E3 나노바디에 대해 표 24에서 및 51B12 나노바디에 대해 표 30에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 163E3 나노바디는 서열 217에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 217과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 54B12 나노바디는 서열 219에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 219와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 212 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
4) 163 D2 /54B12 (서열 63)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 제2 나노바디가 서열 145, 165 및 185로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 145, 165 또는 185의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 나노바디가 서열 151, 171 및 191로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 151, 171 또는 191의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6는 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6은 서열 145, 165, 185, 151, 171, 또는 191에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 서열 145, 165, 185, 151, 171 또는 191에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면에 따르면, FR1은 서열 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6는 서열 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 83, 104, 124, 131, 89, 110, 또는 130에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 63에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 63의 아미노산 서열에 적어도 80% 아미노산 동일성, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 63에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 63과 적어도 80% 아미노산 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 2.0E-09M 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 63에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 163D2 나노바디에 대해 표 28에서 및 54B12 나노바디에 대해 표 30에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 163D2 나노바디는 서열 218에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 218과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 54B12 나노바디는 서열 219에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 219와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
5) 2B2/163 E3 (서열 64)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 제1 나노바디가 서열 147, 167 및 187로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 147, 167 또는 187의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 나노바디가 서열 146, 166 및 186으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 146, 166 또는 186의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 167에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6은 서열 147, 167, 187, 164, 146 또는 186에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 서열 147, 167, 187, 146, 166 또는 186에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 측면에 따르면, FR1은 서열 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 125에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 85, 106, 126, 131, 84, 105, 또는 125에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중 파라토프성 나노바디는 서열 64에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 64의 아미노산 서열에 적어도 80% 아미노산 동일성, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 이중 파라토프성 나노바디의 바람직한 실시양태는 서열 64에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 64와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 64에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 2B2 나노바디에 대해 표 20에서 및 163E2 나노바디에 대해 표 24에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 2B2 나노바디는 서열 213 또는 214에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 213 또는 214와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 163E3 나노바디는 서열 217에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 217과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
6) 2B2/163 D2 (서열 65)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 제1 나노바디가 서열 147, 167 및 187로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 147, 167 또는 187의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 나노바디가 서열 145, 165 및 185로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 145, 165 또는 185의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는, 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 167에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6은 서열 147, 167, 187, 145, 165 또는 185에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 서열 147, 167, 187, 145, 165 또는 185에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면에 따르면, FR1은 서열 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 85, 106, 126, 131, 83, 104, 또는 124에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 이중 파라토프성 나노바디는 서열 65에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 65의 아미노산 서열에 적어도 80% 아미노산 동일성, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 이중 파라토프성 나노바디의 바람직한 실시양태는 서열 65에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 65와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 65에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 2B2 나노바디에 대해 표 20에서 및 163D2 나노바디에 대해 표 28에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 2B2 나노바디는 서열 213 또는 214에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 213 또는 214와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 163D2 나노바디는 서열 218에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 218과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
7) 97A9/2B2 (서열 47)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 제2 나노바디가 서열 143, 163 및 183으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 143, 163 또는 183의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 나노바디가 서열 147, 167 및 187로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 147, 167 또는 187의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제2 나노바디에서 CDR1은 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제1 나노바디에서 CDR4는 서열 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 167에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6은 서열 143, 163, 183, 147, 167, 또는 187에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 서열 143, 163, 183, 147, 167 또는 187에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 측면에 따르면, FR1은 서열 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 133에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 81, 102, 122, 133, 85, 106, 126 또는 131에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 이중 파라토프성 나노바디는 서열 47에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 47의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 47에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 47과 적어도 80% 아미노산 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 47에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 97A9 나노바디에 대해 표 22에서 및 2B2 나노바디에 대해 표 20에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 97A9 나노바디는 서열 215에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 215와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 2B2 나노바디는 서열 213 또는 214에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 213 또는 서열 214와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
8) 97A9/54B12 (서열 61)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 제2 나노바디가 서열 143, 163 및 183으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 143, 163 또는 183의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 나노바디가 서열 151, 171 및 191로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 151, 171 또는 191의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제2 나노바디에서 CDR1은 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 나노바디에서 CDR4는 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6은 서열 143, 163, 183, 151, 171 또는 191에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 서열 143, 163, 183, 151, 271 또는 191에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면에 따르면, FR1은 서열 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 아미노산 서열 133에 제시된 서열을 포함하고, FR5는 서열 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 81, 102, 122, 133, 89, 110, 130 또는 131에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 61에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 61의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 61에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 61의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 61에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 97A9 나노바디에 대해 표 22에서 및 54B12 나노바디에 대해 표 30에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 97A9 나노바디는 서열 215에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 215와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 54B12 나노바디는 서열 219에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 219과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
9) 127 D1 /163 D2 (서열 53)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 규정된 상기 제1 나노바디가 서열 141, 161 및 181로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 141, 161 또는 181의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 나노바디가 서열 145, 165 및 185로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 145, 165 또는 185의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 161에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 141, 161, 181, 145, 165 또는 185에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 145, 165, 185, 141, 161 또는 181에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 79, 100, 120, 131, 83, 104, 또는 124에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 53에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 53의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 53에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 53의 아미노산 서열과 또는 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 54에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 127D1 나노바디에 대해 표 26에서 및 163D2 나노바디에 대해 표 28에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 127D1 나노바디는 서열 216에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 216과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 163D2 나노바디는 서열 218에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 218과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
10) 127 D1 /163 E3 (서열 54)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 규정된 상기 제1 나노바디가 서열 141, 161 및 181로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 141, 161 또는 181의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 나노바디가 서열 146, 166 및 186으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 146, 166 또는 186의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 161에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 146, 166, 186, 141, 161 또는 181에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 서열 146, 166, 186, 141, 161 또는 181에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 125에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 79, 100, 120, 131, 84, 105, 또는 125에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 54에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 54의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 54에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 54와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 54에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 127D1 나노바디에 대해 표 26에서 및 163E3 나노바디에 대해 표 24에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 127D1 나노바디는 서열 216에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 216과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 163E3 나노바디는 서열 217에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 217과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
11) 127 D1 /97A9 (서열 37 및 39)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 규정된 상기 제1 나노바디가 서열 141, 161 및 181로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 141, 161 또는 181의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 나노바디가 서열 143, 163 및 183으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 143, 163 또는 183의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 161에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 141, 161, 181, 143, 163 또는 183에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 141, 161, 181, 143, 163 또는 183에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 133에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 79, 100, 120, 131, 81, 102, 122, 또는 133에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 도메인 및 서열 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 항원 결합 도메인 또는 서열 37 및 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디의 바람직한 실시양태는 서열 37 및 39에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 37 및 39와 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 폴리펩티드는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 37 및 39에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 127D1 나노바디에 대해 표 26에서 및 97A9 나노바디에 대해 표 22에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 127D1 나노바디는 서열 216에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 216과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 97A9 나노바디는 서열 215에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 215와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
12) 2B2/97A9 (서열 46)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 규정된 상기 제1 나노바디가 서열 147, 167 및 187로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 147, 167 또는 187의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 나노바디가 서열 143, 163 및 183으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 143, 163 또는 183의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 167에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 147, 167, 187, 143, 163 또는 183에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 147, 167, 187, 143, 163 또는 183에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 133에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 85, 106, 126, 131, 81, 102, 122 또는 133에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 46에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 46의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 46에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 46과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 46에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 2B2 나노바디에 대해 표 20에서 및 97A9 나노바디에 대해 표 22에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 2B2 나노바디는 서열 213 또는 214에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 213 또는 214와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 97A9 나노바디는 서열 215에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 215와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
13) 54B12/163 D2 (서열 69)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 규정된 상기 제1 나노바디가 서열 151, 171 및 191로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 151, 171 또는 191의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 나노바디가 서열 145, 165 및 185로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 145, 165 또는 185의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 151, 171, 191, 145, 165 또는 185에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 151, 171, 191, 145, 165 또는 185에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 89, 110, 130, 131, 83, 104, 또는 124에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 69에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 69의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 69에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 69와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 69에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 54B12 나노바디에 대해 표 30에서 및 163D2 나노바디에 대해 표 28에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 54B12 나노바디는 서열 219에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 219와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 163D2 나노바디는 서열 218에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 218과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
14) 54B12/163 E3 (서열 68)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 규정된 상기 제1 나노바디가 서열 151, 171 및 191로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 151, 171 또는 191의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 나노바디가 서열 146, 166 및 186로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 146, 166 또는 186의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 151, 171, 191, 146, 166 또는 186에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 151, 171, 191, 146, 166 또는 186에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 125에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 89, 110, 130, 131, 84, 105, 또는 125에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 68에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 68의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 68에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 68과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 68에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 54B12 나노바디에 대해 표 30에서 및 163E3 나노바디에 대해 표 24에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 54B12 나노바디는 서열 219에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 219와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 163E3 나노바디는 서열 217에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 217과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
15) 54B12/97A9 (서열 90 및 39)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 규정된 상기 제1 나노바디가 서열 141, 161 및 181로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 141, 161 또는 181의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 나노바디가 서열 143, 163 및 183으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 143, 163 또는 183의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제1 나노바디에서 CDR1은 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 161에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 나노바디에서 CDR4는 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 141, 161, 181, 143, 163 또는 183에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 141, 161, 181, 143, 163 또는 183에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7는 서열 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 89, 110, 130, 131, 81, 102, 또는 122에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 90 및 39에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 90 및 39의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 90 및 39에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 90 및 39와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 90 및 39에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 54B12 나노바디에 대해 표 30에서 및 97A9 나노바디에 대해 표 22에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 54B12 나노바디는 서열 90 및 39에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 90 및/또는 39와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 97A9 나노바디는 서열 215에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 215와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
16) 97A9/127 D1 (서열 39 및 37)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 제2 나노바디가 서열 143, 163 및 183으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 143, 163 또는 183의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 나노바디가 서열 141, 161 및 181로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 141, 161 또는 181의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제2 나노바디에서 CDR1은 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제1 나노바디에서 CDR4는 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 161에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 143, 163, 183, 141, 161 또는 181에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 143, 163, 183, 141, 161 또는 181에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 133에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 81, 102, 122, 133, 79, 100, 120 또는 131에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 39 및 37에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 39 및/또는 37의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 39 및 37에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 39 및/또는 37과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 39 및 37에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 97A9 나노바디에 대해 표 22에서 및 97A9 나노바디에 대해 표 26에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 97A9 나노바디는 서열 39 및 37에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 39 및 37과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 127D1 나노바디는 서열 216에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 216과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
17) 163 D2 /2B2 (서열 67)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 제2 나노바디가 서열 145, 165 및 185로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 145, 165 또는 185의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 나노바디가 서열 147, 167 및 187로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 147, 167 또는 187의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제2 나노바디에서 CDR1은 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제1 나노바디에서 CDR4는 서열 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 167에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 145, 165, 185, 147, 167 또는 187에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 145, 165, 185, 147, 167 또는 187에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 83, 104, 124, 131, 85, 106, 또는 126에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 67에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 67의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 67에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 67과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 67에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 163D2 나노바디에 대해 표 28에서 및 2B2 나노바디에 대해 표 20에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 163D2 나노바디는 서열 218에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 218과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 2B2 나노바디는 서열 213 또는 214의 아미노산 서열 또는 서열 213 또는 214와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
18) 163 E3 /2B2 (서열 66)
본 발명의 상기 실시양태는 상기 규정된 상기 제2 나노바디가 서열 146, 166 및 186으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 146, 166 또는 186의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 나노바디가 서열 147, 167 및 187로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 147, 167 또는 187의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 이중 파라토프성 나노바디에 관한 것이다.
바람직하게는 이중 파라토프성 나노바디는 다음 구조를 포함한다:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서, 상기 제2 나노바디에서 CDR1은 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 나노바디에서 CDR4는 서열 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 167에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 146, 166, 186, 147, 167 또는 187에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
아미노산 서열은 임의의 서열 146, 166, 186, 147, 167 또는 187에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이할 수 있다. 아미노산 서열은 상기 임의의 서열 번호의 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만 상이할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 실시양태에서, FR1은 서열 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 125에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5는 서열 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6은 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7은 서열 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8은 임의의 서열 84, 105, 125, 131, 85, 106, 또는 126에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 측면에서, FR1 및/또는 FR4는 서열 70 내지 89 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR2 및/또는 FR5는 서열 91 내지 110 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR3 및/또는 FR6은 서열 111 내지 130 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, FR4 및/또는 FR8은 서열 131 내지 133 중의 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 특히 바람직한 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 66에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 66의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 이중 파라토프성 나노바디는 서열 66에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 66과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성 또는 카바트 넘버링에 따른 그의 프레임워크 영역과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 서열 66에 제시된, 그러나 하나 이상의 서열-최적화 치환, 바람직하게는 163E3 나노바디에 대해 표 24에서 및 2B2 나노바디에 대해 표 20에서 적합한 것으로 확인된 하나 이상의 치환을 포함하도록 프레임워크 영역에서 변형된 CDR 서열을 실질적으로 포함한다. 바람직하게는, 163E3 나노바디는 서열 217에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 217과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 2B2 나노바디는 서열 213 또는 214에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 213 또는 214와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 이들 나노바디의 프레임워크 영역은 표 32에서 서열 213 내지 219 중의 임의의 하나에 제시된, 카바트 넘버링에 따른 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 최적화된 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다.
본원에서 이미 논의된 바와 같이, 163D2/127D1, 163E3/127D1, 163E3/54B12, 163D2/54B12, 2B2/163E3, 2B2/163D2, 97A9/2B2, 97A9/54B12, 127D1/163D2, 127D1/163E3, 127D1/97A9, 2B2/97A9, 54B12/163D2, 54B12/163E3, 54B12/97A9, 97A9/127D1, 163D2/2B2 또는 163E3/2B2로 지정된 구체적인 실시양태 및 그의 변이체를 포함하는 본 발명의 바람직한 이중 파라토프성 나노바디가 그의 프레임워크 영역 내에 적어도 하나의 서열 최적화 아미노산 치환을 갖고 상기 프레임워크 영역이 예를 들어 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있는 것이 바람직하다. 서열 최적화 정도는 서열 58, 59, 62, 63, 64, 65, 47, 61, 53, 54, 46, 69, 68, 67 또는 66과 프레임워크 영역에 대해 적어도 80 내지 90% 서열 동일성을 갖는 이중 파라토프성 나노바디를 생성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 실시양태는 제1 항원 결합 도메인이 서열 213, 214, 216 및 219 또는 이들 중의 하나에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되고, 제2 항원 결합 도메인이 서열 215, 217 및 218, 또는 이들 중의 하나에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 것인 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
(0079-0076)
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 CDR1이 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR2가 서열 236에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR3이 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제2 면역글로불린을 포함하고, CDR4가 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR5가 서열 237에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR6이 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제1 면역글로불린을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 141, 236, 181, 146, 237 또는 186에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 141, 236, 181, 146, 237 또는 186에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 216 또는 서열 216에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제1 항원 결합 도메인, 및 서열 217, 또는 서열 217에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 221을 포함한다.
(0079-0086)
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 CDR1이 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR2가 서열 236에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR3이 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제2 면역글로불린을 포함하고, CDR4가 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR5가 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR6이 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제1 면역글로불린을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 141, 236, 181, 145, 165 또는 185에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 141, 236, 181, 145, 165 또는 185에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 216 또는 서열 216에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제1 항원 결합 도메인, 및 서열 218, 또는 서열 218에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 222를 포함한다.
(0079-0061)
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 CDR1이 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR2가 서열 236에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR3이 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제2 면역글로불린을 포함하고, CDR4가 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR5가 서열 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR6이 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제1 면역글로불린을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 141, 236, 181, 143, 235 또는 183에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 141, 236, 181, 143, 235 또는 183에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 216 또는 서열 216에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제1 항원 결합 도메인, 및 서열 220의 링커에 의해 분리된, 서열 215, 또는 서열 215에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
(0104-0076)
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 CDR1이 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR2가 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR3이 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제2 면역글로불린을 포함하고, CDR4가 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR5가 서열 237에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR6이 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제1 면역글로불린을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 151, 171, 191, 146, 237 또는 186에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 151, 171, 191, 146, 237 또는 186에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 219 또는 서열 219에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제1 항원 결합 도메인, 및 서열 217, 또는 서열 217에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 223을 포함한다.
(0104-0086)
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 CDR1이 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR2가 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR3이 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제2 면역글로불린을 포함하고, CDR4가 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR5가 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR6이 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제1 면역글로불린을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 151, 171, 191, 145, 165 또는 185에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 151, 171, 191, 145, 165 또는 185에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 219 또는 서열 219에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제1 항원 결합 도메인, 및 서열 218, 또는 서열 218에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 224를 포함한다.
(0104-0061)
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 CDR1이 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR2가 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR3이 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제2 면역글로불린을 포함하고, CDR4가 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR5가 서열 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 CDR6이 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 가변 도메인의 상기 제1 면역글로불린을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열은 서열 151, 171, 191, 143, 235 또는 183에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 151, 171, 191, 143, 235 또는 183에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 219 또는 서열 219에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제1 항원 결합 도메인, 및 서열 220의 링커에 의해 분리된, 서열 215, 또는 서열 215에 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드로부터 선택되는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 실시양태의 상기한 논의에 있어서, 개시내용은 이중 파라토프성 나노바디에 대해 구체적으로 관한 것이지만, 이것은 또한 제1 및 제2 결합 도메인이 통상적인 4 사슬 항체, 중쇄 항체, 단일쇄 Fv, Fab 또는 Fab(2)에 포함되지만 상기 바람직한 실시양태의 하나 이상의 기능적 또는 구조적 특성을 갖는, CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하는 이중 파라토프성 폴리펩티드에도 관련됨이 이해될 것이다.
또한, 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 VL 도메인, VH 도메인, (dAb) 및 VHH 도메인 및 그의 단편 내에 포함되고 각각의 상기 실시양태의 하나 이상의 기능적 또는 구조적 특성을 갖는 실시양태가 분명하게 개시된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CXCR2 결합에 대해 1가이고 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드에 대한 빌딩 블록이고 그의 생산 방법의 중간체로서 간주될 수 있는 폴리펩티드, 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 VHH 도메인 또는 나노바디를 제공한다. 바람직한 1가 면역글로불린 단일 가변 도메인은 표 9에 제시된 서열 25 내지 43 및 90을 갖는 폴리펩티드 또는 서열 25 내지 43 및 90 중의 임의의 하나에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드이다.
바람직한 1가 폴리펩티드는 서열 36에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 36과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 137B7로 지정된 것이다. 바람직한 실시양태에서, 서열 36의 프레임워크 영역은 하나 이상의 서열 최적화 아미노산 치환을 갖는다. 다른 바람직한 1가 폴리펩티드는 프레임워크 영역 내에서 서열 최적화된 것을 비롯하여 127D1, 2B2, 54B12, 97A9, 163D2 및 163E3으로 지정된 것이다.
예를 들어, 127D1은 표 26에서 고려되는 하나 이상의 서열 최적화 아미노산 치환이 이루어진 서열 37의 아미노산 서열을 포함할 수 있고 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 216에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
2B2는 표 20에서 고려되는 하나 이상의 서열 최적화 아미노산 치환이 이루어진 서열 43의 아미노산 서열을 포함할 수 있고 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 213 또는 214에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
54B12는 표 30에서 고려되는 하나 이상의 서열 최적화 아미노산 치환이 이루어진 서열 90의 아미노산 서열을 포함할 수 있고 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 219에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
97A9는 표 22에서 고려되는 하나 이상의 서열 최적화 아미노산 치환이 이루어진 서열 39의 아미노산 서열을 포함할 수 있고 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 215에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
163D2는 표 28에서 고려되는 하나 이상의 서열 최적화 아미노산 치환이 이루어진 서열 41의 아미노산 서열을 포함할 수 있고 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 218에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
163E3은 표 24에서 고려되는 하나 이상의 서열 최적화 아미노산 치환이 이루어진 서열 42의 아미노산 서열을 포함할 수 있고 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 217에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 서열 58, 59, 62, 63, 64, 65, 47 또는 61에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나를 갖는 폴리펩티드의 CXCR2에 대한 결합을 교차-차단할 수 있는 1가 폴리펩티드, 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디가 본 발명의 상기 측면에 포함된다.
상기 논의된 임의의 바람직한 1가 나노바디 및, 특히 137B7는 본원에서 언급되는 용도를 위해, 예를 들어 COPD의 치료에 사용될 수 있다.
그의 모든 낙타화 및 인간화 버전을 비롯하여 본 발명에 따른 이중 파라토프성 폴리펩티드, 특히 상기 논의된 바람직한 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인은 CXCR2의 조절물질이고, 특히 CXC2 신호 전달을 억제한다.
바람직하게는, 이중 파라토프성 폴리펩티드, 특히 본 발명의 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인 내의 CDR 서열 및 FR 서열은 이들이
- 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수 (KD) (즉, 105 내지 1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰의 회합 상수 (KA))로 CXCR2에 결합하고/하거나:
102 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1 내지 107 M-1s-1의 kon 속도로 CXCR2에 결합하고/하거나;
1 s-1 (t1 /2=0.69 s) 내지 10-6 s-1 (t1 /2이 수일인 근 비가역적 (near irreversible) 복합체를 제공함), 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1 내지 10-6 s-1의 koff 속도로 CXCR2에 결합하도록 하는 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 및 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인에 존재하는 CDR 서열 및 FR 서열은 이들이 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 CXCR2에 결합하도록 하는 것이다.
특히, 본원의 실시예에서 제시되는 바와 같이, 본 발명의 바람직한 이중 파라토프성 나노바디는 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 이중 파라토프성 나노바디는 또한 100 nM 미만의 IC50으로 CXCR2 보유 RBL 세포로부터 효능제 유도 (Gro-α) Ca 방출을 억제할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 이중 파라토프성 나노바디는 또한 50 nM 미만의 IC50으로 CXCR2-CHO 막 내의 효능제 유도 (Gro-α) [35S]GTPγS 축적을 억제할 수 있다. 본 발명의 바람직한 이중 파라토프성 나노바디는 또한 Gro-α 노출시에 인간 백혈구 형태 변화를 1 nM 미만의 IC50으로 또는 시노몰거스 백혈구 형태 변화를 2 nM 미만의 IC50으로 억제할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 예컨대 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 본원에서 설명되는 나노바디는 임의의 또는 모든 서열 58, 59, 62, 63, 64, 65, 47 또는 61에 제시된 폴리펩티드의 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 CXCR2 폴리펩티드에 대한 결합을 교차차단할 것이다. 교차-차단은 당업계의 숙련인에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.
제약 용도를 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 인간 CXCR2, 예를 들어 서열 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 대해 작용하는 반면에; 수의 목적을 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 치료되는 종으로부터의 CXCR2에 대해 작용하거나, 또는 치료되는 종으로부터의 CXCR2와 적어도 교차반응성이다.
추가로, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 임의로, 및 CXCR2에 대한 결합을 위한 적어도 2개의 항원 결합 도메인 이외에, 다른 에피토프, 항원, 단백질 또는 표적에 대한 결합을 위한 하나 이상의 추가의 결합 부위 또는 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 및 이를 포함하는 조성물의 효능은 폴리펩티드가 COPD 또는 이상 CXCR2 신호 전달을 수반하는 임의의 다른 질환의 치료에 유용할 수 있음을 나타내기 위해 적합한, 그 자체로 공지된 임의의 적합한 시험관내 검정, 세포-기반 검정, 생체내 검정 및/또는 동물 모델, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 시험할 수 있다. 적합한 검정 및 동물 모델은 당업자에게 명백할 것이다.
또한, 본 발명에 따르면, 인간 CXCR2에 대해 작용하는 폴리펩티드는 온혈 동물의 하나 이상의 다른 종으로부터의 CXCR2와 교차 반응성을 보이거나 보이지 않을 수 있다. 그러나, 바람직하게는 인간 CXCR2에 대해 작용하는 본 발명의 폴리펩티드는 독성 시험을 위해 하나 이상의 다른 종의 영장류 (예컨대, 비제한적으로, 마카카 (Macaca) 속으로부터의 원숭이 (예컨대, 및 특히, 시노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis)) 및/또는 붉은털 원숭이 (마카카 물라타 (Macaca mulatta))) 및 개코원숭이 (파피오 우르시누스 (Papio ursinus))))로부터의 CXCR2와 교차 반응성을 보일 것이다. 바람직한 교차 반응성은 시노몰거스 원숭이로부터의 CXCR2와의 교차 반응성이다. 질병에 대한 동물 모델 (예를 들어 마우스, 래트, 마우스, 돼지 또는 개), 및 특히 CXCR2와 연관된 질환 및 장애에 대한 동물 모델에서 종종 사용되는 하나 이상의 종의 동물과의 교차 반응성이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 존재할 경우 상기 교차 반응성은, 인간 CXCR2에 대해 작용하는 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 상기 질환 모델에서 시험되도록 허용할 수 있기 때문에 약물 개발 관점에서 잇점을 가질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
보다 일반적으로, 다수의 종의 포유동물로부터의 CXCR2와 교차 반응성인 본 발명의 폴리펩티드는, 동일한 폴리펩티드가 다수의 종에 걸쳐 사용되도록 허용할 것이기 때문에 수의 용도로 사용하기에 대체로 유익할 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 CXCR1 또는 CXCR4와 교차 반응성이 아니다.
본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드에서, 적어도 하나의 항원 결합 부위는 상호작용 부위, 즉, CXCR2가 또 다른 분자, 예를 들어, 그의 천연 리간드 또는 리간드들과 상호작용하는 부위에 대해 작용할 수 있다.
본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 예를 들어 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 제2 항원 결합 도메인이 서열 7의 선형 펩티드에 결합하지 않고 서열 8, 9, 10, 11 또는 12에 제시된 펩티드를 포함하거나 이 내부에 존재하는 에피토프를 인식하도록 하는 것일 수 있다. 또한, 제1 항원 결합 도메인은 서열 7의 펩티드를 포함하거나 이 내부에 존재하는 에피토프를 인식할 수 있다.
시노몰거스 원숭이 CXCR2와 교차 반응하는 본 발명의 실시양태에서, 제1 항원 결합 도메인은 또한 서열 4의 펩티드를 포함하거나 이 내부에 존재하는 에피토프를 인식한다. 상기 실시양태에서 제2 항원 결합 도메인은 서열 5 또는 6의 펩티드를 포함하거나 이 내부에 존재하는 에피토프를 인식할 수 있다.
또한, 일반적으로 CXCR2의 모든 천연 생성 또는 합성 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편; 또는 적어도 본 발명의 폴리펩티드가 결합하는 CXCR2 내의 (예를 들어 서열 1의 야생형 CXCR2 내의) 항원 결정자(들) 또는 에피토프(들)와 본질적으로 동일한 하나 이상의 항원 결정자 또는 에피토프를 함유하는 CXCR2의 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에 결합하는 이중 파라토프성 폴리펩티드, 특히 이중 파라토프성 나노바디의 종류가 본 발명의 범위 내에서 제공된다. 이 경우에, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드가 (야생형) CXCR2가 결합하는, 상기 논의된 친화도 및 특이성과 동일하거나 상이한 (즉, 더 높거나 더 낮은) 친화도 및/또는 특이성으로 상기 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에 결합할 수 있다.
또한, 당업자에게 명백할 바와 같이, 이중 파라토프성인 폴리펩티드는 대응하는 단일 항원 결합 도메인 폴리펩티드보다 CXCR2에 대해 보다 높은 결합력으로 결합한다.
또한, 항상 전체 폴리펩티드와 동등한 관련 기능적 도메인을 포함한다면, 이중 파라토프성 폴리펩티드, 특히 본 발명의 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인의 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자 및/또는 유도체를 본원에서 논의된 다양한 치료 측면에 사용하는 것이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자 또는 유도체는 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 모든 기능적 특성을 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의로 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하는 이중 파라토프성 폴리펩티드, 임의로 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다. 상기 추가의 기, 잔기, 모이어티, 결합 단위 또는 아미노산 서열은 추가의 기능성을 본 발명의 폴리펩티드에 제공하거나 제공하지 않을 수 있고, 그의 특성을 변경하거나 변경하지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 본 발명이 (융합) 단백질 또는 (융합) 폴리펩티드가 되도록 하는 하나 이상의 추가의 아미노산 서열일 수 있다. 바람직하지만 비-제한적인 측면에서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 면역글로불린 서열이다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 또는 나노바디로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
별법으로, 상기 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 예를 들어 그 단독으로 생물학적으로 및/또는 약리적으로 활성을 보이거나 보이지 않을 수 있는 화학적 기, 잔기, 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 상기 기는 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드의 "유도체"를 제공하기 위해 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드에 연결될 수 있다.
상기 구축물에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 및 하나 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 서로 직접 및/또는 하나 이상의 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 아미노산 서열일 때, 링커는 생성되는 구축물이 융합 (단백질) 또는 융합 (폴리펩티드)가 되도록 아미노산 서열일 수도 있다.
상기 및 본원의 추가의 설명으로부터 명백할 바와 같이, 이것은 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드가, 다중 파라토프성 및 임의로 다가 또는 다중특이적, 2가/다가 및 이중/다중특이적인 본원에서 논의되는 구축물을 형성하기 위해 이를 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위와 적합하게 조합함으로써 본 발명의 추가의 폴리펩티드를 형성하기 위한 "빌딩 블록"으로서 사용될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 상기 측면의 폴리펩티드는 일반적으로 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 하나 이상의 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위, 임의로 하나 이상의 적합한 링커를 통해 적합하게 연결하는 적어도 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 한 구체적인 측면에서, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 비변형된 폴리펩티드에 비해 증가된 반감기를 갖도록 변형된다. 일부 바람직한 폴리펩티드는 본원의 추가의 개시내용을 기초로 하여 당업자에게 명백해질 것이고, 예를 들어 그의 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 변형된 (예를 들어, peg화, pas화 (pasylation) 또는 hes화 (hesylation)에 의해) 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드를 포함하고; 본 발명의 폴리펩티드는 혈청 단백질 (예컨대 혈청 알부민)에 대한 결합을 위한 적어도 하나의 추가의 결합 부위를 포함할 수 있거나; 또는 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 적어도 하나의 모이어티 (및 특히 적어도 하나의 아미노산 서열)에 연결된 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 반감기를 연장하는 모이어티 또는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 예는 하나 이상의 혈청 단백질 또는 그의 단편 (예컨대 (인간) 혈청 알부민 또는 적합한 그의 단편)에 또는 혈청 알부민에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 단위 (예컨대, 예를 들어, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 또는 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민 (예컨대 인간 혈청 알부민), 혈청 면역글로불린, 예컨대 IgG, 또는 트랜스페린에 결합할 수 있는 나노바디에 적합하게 연결하는 폴리펩티드; Fc 부분 (예컨대 인간 Fc) 또는 적합한 일부 또는 그의 단편에 연결된 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 소형 단백질 또는 펩티드 (예컨대, 비제한적으로, WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 및 2006년 12월 5일 출원된 아블링스 엔.브이.의 미국 특허 가출원 (명칭: "Peptides capable of binding to serum proteins")에 기재된 단백질 및 펩티드 (또한 PCT/EP2007/063348 참조))에 연결된 본 발명의 폴리펩티드도 본 발명 내에 포함된다.
제약 단백질의 반감기 증가 및/또는 면역원성 증가를 위한 가장 널리 사용되는 기술 중의 하나는 적합한 약리적으로 허용되는 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) (PEG) 또는 그의 유도체(예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다.
일반적으로, 임의의 적합한 형태의 peg화, 예컨대 항체 및 항체 단편 ((단일) 도메인 항체 및 ScFv를 포함하고 이로 제한되지 않음)에 대해 당업계에서 사용되는 peg화가 사용될 수 있고; 예를 들어 문헌 [Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002)]; [Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003)], [Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003)] 및 WO 04/060965를 참조한다. 또한, 단백질의 peg화를 위한 다양한 시약은 상업적으로, 예를 들어 넥타 써라퓨틱스 (Nektar Therapeutics, 미국)로부터 이용가능하다.
바람직하게는, 특히 시스테인-잔기를 통한 부위 지정 peg화가 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)] 참조). 예를 들어, 이를 위해, PEG는 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디에서 천연 생성되는 시스테인 잔기에 부착될 수 있다. 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 모두 당업자에게 공지된 단백질 조작 기술을 사용하여 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적합하게 도입하기 위해 변형될 수 있거나, 또는 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 이중 파라토프성 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 융합될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 폴리펩티드에 대해, 사용되는 PEG의 분자량은 5000 초과, 예컨대 10,000 초과 200,000 미만, 예컨대 100,000 미만; 예를 들어 20,000-80,000의 범위이다.
Peg화는 면역글로불린 가변 도메인 중의 하나 또는 둘 모두에 및/또는 임의의 펩티드 링커 영역에 적용될 수 있다. 적합한 peg화 기술은 EP 1639011에 기재되어 있다.
PEG에 대한 대안으로서, 반감기는 히드록시에틸 전분 (HES) 유도체의 본 발명의 폴리펩티드에 대한 부착을 수반하는 HES로 알려진 기술에 의해 연장될 수 있다. 사용되는 히드록시에틸 전분은 분자량을 조정하기 위해 산 가수분해에 의해 변형되고 그 내의 포도당 잔기가 히드록시에틸화된 찰옥수수 전분으로부터 유래된 아밀로펙틴이다. 추가의 상세한 내용은 문헌 [Pavisic R, et al., Int J Pharm (2010) March 15, 387 (1-2): 110-9]으로부터 얻을 수 있다.
일반적으로, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 본 발명의 상응하는 폴리펩티드 자체의 반감기보다 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 2배, 예컨대 적어도 5배, 예를 들어 적어도 10배 또는 20배 초과로 더 큰 반감기를 갖는다. 예를 들어, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 폴리펩티드 자체에 비해 1 시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 본 발명의 상기 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 폴리펩티드 자체에 비해 1 시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 갖는다,
본 발명의 또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 인간에서 적어도 약 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 보다 바람직하게는 적어도 48시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 72시간 이상의 혈청 반감기를 보인다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 5일 (예컨대 약 5 내지 10일), 바람직하게는 적어도 9일 (예컨대 약 9 내지 14일), 보다 바람직하게는 적어도 약 10일 (예컨대 약 10 내지 15일), 또는 적어도 약 11일 (예컨대 약 11 내지 16일), 보다 바람직하게는 적어도 약 12일 (예컨대 약 12 내지 18일 이상), 또는 14일 초과 (예컨대 약 14 내지 19일)의 반감기를 가질 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에서 설명되는 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 및 조성물의 제조 또는 생성 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 이들 방법은
a) 폴리펩티드의 세트, 집합체 또는 라이브러리를 제공하는 단계; 및
b) 상기 폴리펩티드의 세트, 집합체 또는 라이브러리를 CXCR2에 결합하고/하거나 이에 대한 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열에 대해 스크리닝하는 단계; 및
c) CXCR2에 결합하고/하거나 이에 대한 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열을 단리하는 단계
를 포함할 수 있다.
폴리펩티드의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 면역글로불린 서열 (본원에 설명된 바와 같은)의 세트, 집합체 또는 라이브러리, 예컨대 면역글로불린 서열의 나이브 (naive) 세트, 집합체 또는 라이브러리; 면역글로불린 서열의 합성 또는 반-합성 세트, 집합체 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 성숙에 적용된 면역글로불린 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리일 수 있다.
또한, 상기 방법에서, 폴리펩티드의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 중쇄 가변 도메인 (예컨대 VH 도메인 또는 VHH 도메인) 또는 경쇄 가변 도메인의 세트, 집합체 또는 라이브러리일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체의 세트, 집합체 또는 라이브러리일 수 있거나, 또는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체로서 기능할 수 있는 아미노산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리일 수 있다.
상기 방법의 바람직한 측면에서, 폴리펩티드의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 예를 들어 CXCR2 또는 이를 기초로 한 또는 이로부터 유도된 적합한 항원 결정자, 예컨대 그의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화시킨 포유동물, 예를 들어, 라마로부터 유도된 면역글로불린 서열의 면역 세트, 집합체 또는 라이브러리일 수 있다.
상기 방법에서, 펩티드 또는 폴리펩티드의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 예컨대 스크리닝을 용이하게 하기 위해 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물 (예컨대 효모) 상에 디스플레이될 수 있다. 아미노산 서열 (의 세트, 집합체 또는 라이브러리)의 디스플레이 및 스크리닝에 적합한 방법, 기술 및 숙주 유기체는 예를 들어 본원의 추가의 개시내용을 기초로 하여 당업계의 숙련인에게 명백할 것이다. 또한, 문헌 [Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]을 참조한다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 이중 파라토프성 폴리펩티드의 구축에 사용하기 위한 폴리펩티드를 생성하는 방법은 적어도
a) 폴리펩티드의 집합체 또는 샘플을 발현하는 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포의 집합체 또는 샘플을 CXCR2에 결합하고/하거나 이에 대한 친화도를 가질 수 있는 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대해 스크리닝하는 단계; 및
c) (i) 상기 폴리펩티드를 단리하거나; 또는 (ii) 상기 세포로부터 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 단리한 후, 상기 폴리펩티드를 발현시키는 단계
를 포함한다.
예를 들어, 요구되는 폴리펩티드가 면역글로불린 서열일 경우, 세포의 집합체 또는 샘플은 예를 들어 B-세포의 집합체 또는 샘플일 수 있다. 또한, 상기 방법에서, 세포의 샘플은 예를 들어 CXCR2 또는 이를 기초로 한 또는 이로부터 유도된 적합한 항원 결정자, 예컨대 그의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화시킨 포유동물, 예를 들어, 라마로부터 유도될 수 있다. 한 특정 측면에서, 상기 항원 결정자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
본원에서 확인된 본 발명의 바람직한 이중 파라토프성 나노바디의 제조에서, 라마는 인간 CXCR2를 발현하는 포유동물 세포, 시노몰거스 CXCR2를 발현하는 포유동물 세포, 전장 인간 CXCR2를 코딩하는 DNA, Δ1-17 인간 CXCR2를 코딩하는 DNA, 시노몰거스 CXCR2를 코딩하는 DNA, 및 표 5에 제시된 펩티드로 면역화되었다.
상기한 바와 같은 스크리닝 방법은 당업자에게 명백할 바와 같이 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, EP 0 542 810, WO 05/19824, WO 04/051268 및 WO 04/106377을 참조한다. 단계 b)의 스크리닝은 바람직하게는 유동 세포측정 기술, 예컨대 FACS를 사용하여 수행된다. 이를 위해, 예를 들어 문헌 [Lieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820 (2001)]을 참조한다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 구축에 사용하기 위한, CXCR2에 대해 작용하는 폴리펩티드를 생성하는 방법은 적어도
a) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) 상기 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리를 CXCR2에 결합하고/하거나 이에 대한 친화도를 가질 수 있는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 대해 스크리닝하는 단계; 및
c) 상기 핵산 서열을 단리한 후, 상기 폴리펩티드를 발현시키는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 방법에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 예를 들어 면역글로불린 서열의 나이브 세트, 집합체 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리; 면역글로불린 서열의 합성 또는 반-합성 세트, 집합체 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 성숙에 적용된 면역글로불린 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리일 수 있다.
또한, 상기 방법에서, 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 중쇄 가변 도메인 (예컨대 VH 도메인 또는 VHH 도메인) 또는 경쇄 가변 도메인의 세트, 집합체 또는 라이브러리를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체의 세트, 집합체 또는 라이브러리, 또는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체로서 기능할 수 있는 아미노산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리를 코딩할 수 있다.
상기 방법의 바람직한 측면에서, 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 예를 들어 CXCR2 또는 이를 기초로 한 또는 이로부터 유도된 적합한 항원 결정자, 예컨대 그의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화시킨 포유동물로부터 유도된 핵산 서열의 면역 세트, 집합체 또는 라이브러리일 수 있다. 한 특정 측면에서, 상기 항원 결정자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생성에서, 라마를 상기 설명한 바와 같은 항원으로 면역화시켰다.
상기 방법에서, 뉴클레오티드 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리는 예컨대 스크리닝을 용이하게 하기 위해 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물 (예컨대 효모) 상에 디스플레이될 수 있다. 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (의 세트, 집합체 또는 라이브러리)의 디스플레이 및 스크리닝에 적합한 방법, 기술 및 숙주 유기체는 예를 들어 본원의 추가의 개시내용을 기초로 하여 당업계의 숙련인에게 명백할 것이다. 또한, 문헌 [Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]을 참조한다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 이중 파라토프성 폴리펩티드에 사용될 수 있는, CXCR2에 대해 작용하는 폴리펩티드를 생성하는 방법은 적어도
a) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) 상기 핵산 서열의 세트, 집합체 또는 라이브러리를, CXCR2에 결합하고/하거나 이에 대한 친화도를 가질 수 있고 교차 차단되거나 또는 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디, 예를 들어 서열 58, 59, 62, 63, 64, 65, 47 또는 61에 의해 코딩되는 것을 교차차단하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 대해 스크리닝하는 단계; 및
c) 상기 핵산 서열을 단리한 후, 상기 폴리펩티드를 발현시키는 단계
를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해, 또는 별법으로 상기 방법 중의 하나 및 상기 면역글로불린 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 결정하고; 그 자체로 공지된 방식으로, 예컨대 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현에 의해 또는 화학적 합성에 의해 상기 아미노산 서열을 발현시키거나 합성하고, 이로부터 이중 파라토프성 폴리펩티드를 구축하는 단계를 적어도 추가로 포함하는 방법에 의해 얻은 이중 파라토프성 폴리펩티드에 관한 것이다.
상기 방법은 당업자에세 명백할 바와 같이 및 아래에 보다 상세히 논의되는 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, EP 0 542 810, WO 05/19824, WO 04/051268 및 WO 04/106377을 참조한다. 예를 들어, 단계 b)의 스크리닝은 바람직하게는 유동 세포측정 기술, 예컨대 FACS를 사용하여 수행된다. 이를 위해, 예를 들어 문헌 [Lieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820]을 참조한다. 특히, 국제 특허 출원 WO 06/079372 (아블링스 엔.브이.)에 기재된 소위 "나노클론™" 기술을 참조한다.
CXCR2에 대해 작용하는 VHH 서열 또는 나노바디 서열을 얻기 위한 또 다른 기술은 중쇄 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 (transgenic) 포유동물을 적합하게 면역화시키고 (즉, 면역 반응 및/또는 CXCR2에 대해 작용하는 중쇄 항체를 유도하기 위해), 상기 VHH 서열 또는 나노바디 서열 (을 코딩하는 핵산 서열)을 함유하는 상기 트랜스제닉 포유동물로부터 적합한 생물학적 샘플 (예컨대 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 B-세포의 샘플)을 얻고, 이어서 그 자체로 공지된 임의의 적합한 기술 (예컨대 본원에서 설명되는 임의의 방법 또는 하이브리도마 (hybridoma) 기술)을 사용하여 상기 샘플로부터 시작하여 CXCR2에 대해 작용하는 VHH 서열을 생성하는 것을 수반한다. 예를 들어, 이를 위해, 중쇄 항체-발현 마우스 및 WO 02/085945, WO 04/049794 및 WO 06/008548 및 문헌 [Janssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Oct 10;103(41):15130-5]에 기재된 추가의 방법 및 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 중쇄 항체 발현 마우스는 임의의 적합한 (단일) 가변 도메인, 예컨대 천연 공급원 (예를 들어 인간 (단일) 가변 도메인, 낙타류 (단일) 가변 도메인 또는 상어 (단일) 가변 도메인)으로부터의 (단일) 가변 도메인, 및 예를 들어 합성 또는 반-합성 (단일) 가변 도메인을 갖는 중쇄 항체를 발현할 수 있다.
천연 생성 VH 서열 또는 바람직하게는 VHH 서열로부터 출발하여, 본 발명에서 사용하기 위한 나노바디 및/또는 이를 코딩하는 핵산을 얻기 위한 다른 적합한 방법 및 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 본원에 언급된 바와 같이 WO 08/00279의 64 페이지에 언급된 기술을 포함할 수 있다.
VHH 도메인 또는 나노바디는 그의 FR 내의 하나 이상의 "홀마크 (Hallmark) 잔기"를 특징으로 할 수 있다. 홀마크 잔기는 낙타류, 예를 들어, 라마 공급원으로부터의 FR을 특징으로 하는 잔기이다. 따라서, 홀마크 잔기는 치환, 바람직하게는 인간화 치환을 위한 바람직한 표적이다.
카바트 넘버링에 따르면, 홀마크 잔기는 나노바디의 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 또는 108에 존재할 수 있다. 상기 프레임워크 서열 및 다른 홀마크 잔기 (의 적합한 조합)의 비-제한적인 예는 WO 2008/020079의 65 내지 98 페이지에 제시되어 있고, 이들 페이지는 그 전부가 본원에 참고로 포함된다. 당업계에 공지된 다른 인간화 또는 부분 인간화된 서열도 고려되고, 본 발명에 포함된다.
이미 본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명에서 사용하기 위한 나노바디는 천연 생성 인간 VH 도메인의 상응하는 프레임워크 영역에 비해, 특히 DP-47의 상응하는 프레임워크 영역에 비해 적어도 하나의 프레임워크 영역에 적어도 "하나의 아미노산 차이" (본원에서 규정된 바와 같은)를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 하나의 비-제한적인 측면에 따르면, 나노바디는 천연 생성 인간 VH 도메인의 상응하는 프레임워크 영역에 비해, 특히 DP-47의 상응하는 프레임워크 영역에 비해 적어도 하나의 홀마크 잔기 (위치 108, 103 및/또는 45의 잔기 포함)에 적어도 "하나의 아미노산 차이" (본원에서 규정된 바와 같은)를 가질 수 있다. 대체로, 나노바디는 적어도 하나의 FR2 및/또는 FR4, 특히 FR2 및/또는 FR4의 적어도 하나의 홀마크 잔기 (다시, 위치 108, 103 및/또는 45의 잔기 포함)에서 천연 생성 VH 도메인과 적어도 하나의 상기 아미노산 차이를 가질 것이다.
또한, 본 발명의 인간화된 나노바디는 본원에서 규정된 것일 수 있지만, 천연 생성 VHH 도메인의 상응하는 프레임워크 영역에 비해 적어도 하나의 프레임워크 영역에 적어도 "하나의 아미노산 차이" (본원에서 규정된 바와 같은)를 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 하나의 비-제한적인 측면에 따르면, 인간화된 또는 달리 서열 최적화된 나노바디는 본원에서 규정된 것일 수 있지만, 천연 생성 VHH 도메인의 상응하는 프레임워크 영역에 비해 적어도 하나의 홀마크 잔기 (위치 108, 103 및/또는 45의 잔기 포함)에 적어도 "하나의 아미노산 차이" (본원에서 규정된 바와 같은)를 갖는다. 대체로, 인간화된 또는 달리 서열 최적화된 나노바디는 적어도 하나의 FR2 및/또는 FR4, 특히 FR2 및/또는 FR4의 적어도 하나의 홀마크 잔기 (다시, 위치 108, 103 및/또는 45의 잔기 포함)에서 천연 생성 VHH 도메인과 적어도 하나의 상기 아미노산 차이를 가질 것이다.
본원의 개시내용으로부터 명백할 바와 같이, 또한 본원에서 규정되는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립유전자, 상동체 및 오솔로그 (본원에서 집합적으로 "유사체"로 칭함), 특히 서열 58, 59, 62, 63, 64, 65, 47, 61, 53, 54, 46, 69, 68, 67 또는 66의 이중 파라토프성 나노바디의 유사체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
일반적으로, 상기 유사체에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 본원에서 규정되는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인에 비해 치환, 결실 및/또는 부가될 수 있다. 상기 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 프레임워크 영역에서 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 상기 치환, 삽입 또는 결실이 하나 이상의 프레임워크 영역에서 이루어질 경우, 이들은 하나 이상의 홀마크 잔기에서 및/또는 프레임워크 잔기 내의 하나 이상의 다른 위치에서 이루어질 수 있지만, 홀마크 잔기에서의 치환, 삽입 또는 결실은 일반적으로 덜 바람직하다 (이들이 본원에서 설명되는 적합한 인간화 치환이 아닌 한).
비-제한적인 예로서, 치환은 예를 들어 보존적 치환 (본원에 설명된 바와 같은)일 수 있고/있거나 아미노산 잔기는 또 다른 VHH 도메인 내의 동일한 위치에서 천연 생성되는 또 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있지만 (상기 치환의 일부 비-제한적인 예에 대해서는 WO 2008/020079 참조), 본 발명은 일반적으로 이로 제한되지 않는다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디에 사용하기 위한 나노바디의 특성을 개선하거나 또는 적어도 본 발명의 요구되는 특성 또는 요구되는 특성의 균형 또는 조합을 너무 많이 (즉, 나노바디 또는 이중 파라토프성 나노바디가 더 이상 그의 의도되는 용도에 적합하지 않은 정도로) 손상시키지 않는 임의의 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이들의 임의의 조합이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 당업자는 일반적으로 본원의 개시내용을 기초로 하고, 예를 들어 제한된 수의 가능한 치환을 도입하고 이렇게 얻어진 나노바디의 특성에 대한 그의 영향을 결정하는 것을 수반할 수 있는 제한된 정도의 통상적인 실험을 임의로 수행한 후에, 적합한 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이들의 적합한 조합을 결정하고 선택할 수 있을 것이다.
예를 들어, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용되는 숙주 유기체에 따라, 상기 결실 및/또는 치환은 번역후 변형을 위한 하나 이상의 부위 (예컨대 하나 이상의 글리코실화 부위)가 제거되는 방식으로 설계될 수 있고, 이것은 당업계의 숙련인이 그 능력으로 수행할 수 있다. 별법으로, 치환 또는 삽입은 예를 들어 부위-특이적 peg화 (다시 본원에 설명된 바와 같은)를 허용하기 위해, 기능적 기 (본원에 설명된 바와 같은)의 부착을 위한 하나 이상의 부위를 도입하도록 설계될 수 있다.
본원에서 일반적으로, "인간화" 치환을 비롯하여 천연 서열 내에 존재하지 않는 특정 특성 또는 구조적 특성을 지지하기 위해 아미노산 서열 내의 치환, 삽입 또는 결실을 용이하게 하는 것은 "서열 최적화"로 언급된다. 이와 관련하여, 항목 y)의 본원의 정의 섹션을 참조할 수 있다.
유사체는 바람직하게는 이들이 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디에 대해 본원에서 규정된 친화도 (본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도로서, 또는 별법으로 IC50 값으로서 적합하게 측정 및/또는 표현된)로 CXCR2에 결합할 수 있도록 하는 것이다.
또한, 유사체는 바람직하게는 이들이 본원에서 설명되는 바와 같은 이중 파라토프성 나노바디의 유리한 특성을 보유하도록 하는 것이다.
또한, 한 바람직한 측면에 따르면, 유사체는 서열 58, 59, 62, 63, 64, 65, 47, 61, 53, 54, 46, 69, 68, 67 또는 66의 이중 파라토프성 나노바디 중의 하나와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 또는 99% 이상의 서열 동일성 정도를 갖고/갖거나; 바람직하게는 최대 20, 바람직하게는 최대 10, 훨씬 더 바람직하게는 최대 5, 예컨대 4, 3, 2 또는 단지 1개의 아미노산 차이 (본원에서 규정된 바와 같은)를 갖는다.
또한, 유사체의 프레임워크 서열 및 CDR은 바람직하게는 이들이 본원에서 규정되는 바람직한 측면에 따르도록 하는 것이다. 보다 일반적으로, 본원에서 설명되는 바와 같이, 유사체는 (a) 위치 108에 Q; 및/또는 (b) 위치 45에 하전된 아미노산 또는 시스테인 잔기 및 바람직하게는 위치 44에 E, 및 보다 바람직하게는 위치 44에 E 및 위치 45에 R; 및/또는 (c) 위치 103에 P, R 또는 S를 가질 것이다.
본 발명의 이중 파라토프성 VHH 도메인 또는 나노바디의 유사체의 한 바람직한 클래스는 인간화되었다 (즉, 천연 생성 나노바디의 서열에 비해). 언급한 바와 같이, 상기 인간화는 일반적으로 천연 생성 VHH의 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간 VH 도메인, 예컨대 인간 VH3 도메인 내의 동일한 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 수반한다. 가능한 인간화 치환의 예는 본원의 표 20, 22, 24, 26, 28 및 30에 구체적으로 개시되지만, 나노바디의 서열과 천연 생성 인간 VH 도메인 서열의 비교로부터 및 본원에 이미 개시된 WO 2008/020079의 개시내용으로부터 인간화 치환의 다른 조합이 당업자에게 명백할 것이다.
일반적으로, 인간화의 결과로서, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인, 특히 나노바디는 본원에서 설명되는 본 발명의 나노바디의 유리한 특성을 계속 보유하면서 보다 "인간-유사" 형태로 될 수 있다. 그 결과, 상기 인간화된 나노바디는 상응하는 천연 생성 VHH 도메인에 비해 몇몇 잇점, 예컨대 감소된 면역원성을 가질 수 있다. 다시, 본원의 개시내용을 기초로 하고 임의로 제한된 정도의 통상적인 실험을 수행한 후에, 당업자는 한편으로 인간화 치환에 의해 제공되는 유리한 특성과 다른 한편으로 천연 생성 VHH 도메인의 유리한 특성 사이의 요구되는 또는 적합한 균형을 최적화하거나 달성하는 인간화 치환 또는 인간화 치환의 적합한 조합을 만들 수 있다.
본 발명의 이중 파라토프성 나노바디에 포함시키기 위한 나노바디는 임의의 프레임워크 잔기(들)에서, 예컨대 하나 이상의 홀마크 잔기 (본원에서 규정된 바와 같은)에서 또는 하나 이상의 다른 프레임워크 잔기 (즉 비-홀마크 잔기) 또는 그의 임의의 적합한 조합에서 적합하게 인간화될 수 있다. "P,R,S-103 군" 또는 "KERE 군"의 나노바디에 대한 한 바람직한 인간화 치환은 Q108의 L108로의 치환이다. 또한, "GLEW 클래스"의 나노바디는 적어도 하나의 다른 홀마크 잔기가 낙타류 (낙타화) 치환 (본원에서 규정된 바와 같은)을 보유한다면 Q108의 L108로의 치환에 의해 인간화될 수 있다. 예를 들어, 상기한 바와 같이, 인간화된 나노바디의 하나의 특히 바람직한 클래스는 위치 44-47에 GLEW 또는 GLEW-유사 서열; 위치 103에 P, R 또는 S (특히 R), 및 위치 108에 L을 갖는다.
인간화된 및 다른 유사체, 및 그를 코딩하는 핵산 서열은 그 자체로 공지된 임의의 방식으로, 예를 들어 하나 이상의 WO 08/020079의 103 및 104 페이지에 언급된 기술을 사용하여 제공될 수 있다.
여기서 언급된 바와 같이, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 (그의 유사체 포함)은 본 발명의 나노바디의 서열을 제공하고/하거나 이렇게 얻어진 서열에 나노바디의 유리한 특성을 부여하기 위해, 인간 VH 서열 (즉 아미노산 서열 또는 상응하는 뉴클레오티드 서열)로부터, 예를 들어 인간 VH3 서열, 예컨대 DP-47, DP-51 또는 DP-29로부터 출발하여, 하나 이상의 낙타화 치환의 도입 (즉, 상기 인간 VH 도메인의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 VHH 도메인의 상응하는 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 변경)에 의해 설계 및/또는 제조될 수 있음도 당업자에게 명백할 것이다. 다시, 이것은 일반적으로 인간 VH 도메인에 대한 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열을 출발점으로 사용하여, 이전의 문단에서 언급된 다양한 방법 및 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 바람직하지만 비-제한적인 낙타화 치환은 WO 2008/020079로부터 유도될 수 있다. 또한, 하나 이상의 홀마크 잔기에서의 낙타화 치환이 일반적으로 하나 이상의 다른 아미노산 위치에서의 치환보다 요구되는 특성에 대해 더 큰 영향을 갖지만, 그 둘 및 이들의 임의의 적합한 조합이 본 발명의 범위 내에 포함됨이 명백할 것이다. 예를 들어, 이미 적어도 일부의 요구되는 특성을 부여하는 하나 이상의 낙타화 치환을 도입한 후, 상기 특성을 추가로 개선하고/하거나 추가의 유리한 특성을 부여하는 추가의 낙타화 치환을 도입하는 것이 가능하다. 다시, 당업자는 일반적으로 본원의 개시내용을 기초로 하고 예를 들어 제한된 수의 가능한 낙타화 치환을 도입하고 면역글로불린 단일 가변 도메인의 유리한 특성이 얻어지거나 개선되는지 (즉, 원래의 VH 도메인에 비해) 결정하는 것을 수반할 수 있는 임의로 제한된 정도의 통상적인 실험을 수행한 후, 적합한 낙타화 치환 또는 낙타화 치환의 적합한 조합을 결정하고 선택할 수 있을 것이다. 그러나, 일반적으로, 상기 낙타화 치환은 바람직하게는 생성되는 아미노산 서열이 적어도 (a) 위치 108에 Q; 및/또는 (b) 위치 45에 하전된 아미노산 또는 시스테인 잔기 및 바람직하게는 위치 44에 E, 및 보다 바람직하게는 위치 44에 E 및 위치 45에 R; 및/또는 (c) 위치 103에 P, R 또는 S; 및 임의로 하나 이상의 추가의 낙타화 치환을 함유하도록 하는 것이다. 보다 바람직하게는, 낙타화 치환은 이들이 본 발명에 사용하기 위한 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 그의 유사체 (본원에서 규정된 바와 같은), 예컨대 인간화된 유사체 및/또는 바람직하게는 선행 문단에서 규정된 바와 같은 유사체를 생성하도록 하는 것이다.
또한, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디는, 특성이 희귀하지만, 그럼에도 불구하고 VH 도메인 폴드 (fold)와 구조적으로 적합한 치환의 도입에 의해 VH 도메인으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 이들 치환은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 위치 35의 Gly, 위치 37의 Ser, Val 또는 Thr, 위치 39의 Ser, Thr, Arg, Lys, His, Asp 또는 Glu, 위치 45의 Glu 또는 His, 위치 47의 Trp, Leu, Val, Ala, Thr, 또는 Glu, 위치 50의 S 또는 R ([Barthelemy et al., J Biol Chem. 2008 Feb 8;283(6):3639-54], [Epub 2007 Nov 28]).
본 발명은 또한 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드의 유도체를 포함한다. 상기 유도체는 일반적으로 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드의 및/또는 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드를 형성하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형, 특히 화학적 및/또는 생물학적 (예를 들어 효소에 의한) 변형에 의해 얻을 수 있다.
상기 변형의 예, 및 상기 방식으로 (즉, 단백질 백본 상의, 그러나 바람직하게는 측쇄 상의) 변형될 수 있는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기의 예, 상기 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 기술 및 상기 변형의 잠재적인 용도 및 잇점은 당업자에게 명백할 것이다.
예를 들어, 상기 변형은 하나 이상의 기능적 기, 잔기 또는 모이어티의 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드 내로 또는 상으로의, 특히 하나 이상의 요구되는 특성 또는 기능성을 부여하는 하나 이상의 기능적 기, 잔기 또는 모이어티의 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드로의 도입 (예를 들어 공유 연결에 의한 또는 다른 적합한 방식으로)을 수반할 수 있다. 상기 기능적 기의 예는 당업자에게 명백할 것이다.
예를 들어, 상기 변형은 본 발명의 폴리펩티드의 반감기, 용해도 및/또는 흡수를 증가시키고, 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 및/또는 독성을 감소시키고, 본 발명의 폴리펩티드의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시키고/시키거나, 다른 유익한 특성을 부여하고/하거나 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및/또는 폴리펩티드의 원하지 않는 특성을 감소시키거나; 또는 상기 기능의 임의의 조합을 제공하는 하나 이상의 기능적 기의 도입 (예를 들어, 공유 결합에 의해 또는 임의의 다른 적합한 방식으로)을 포함할 수 있다. 상기 기능적 기 및 이를 도입하기 위한 기술의 예는 당업자에게 명백할 것이고, 일반적으로 당업계에 공지된 모든 기능적 기 및 제약 단백질의 변형을 위해, 특히 항체 또는 항체 단편 (ScFv 및 단일 도메인 항체 포함)의 변형을 위해 그 자체로 공지된 기능적 기 및 기술을 포함할 수 있고, 이에 대해서는 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)]을 참조한다. 상기 기능적 기는 예를 들어 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드에 직접 (예를 들어 공유), 또는 임의로 당업자에게 명백할 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있다.
또 다른, 대체로 덜 바람직한 변형은 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 따라, 대체로 동시 번역 및/또는 번역후 변형의 일부로서 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화를 포함한다.
또 다른 변형은 표지된 폴리펩티드 또는 나노바디의 의도되는 용도에 따라 하나 이상의 검출가능한 표지 또는 다른 신호-생성기 또는 모이어티의 도입을 포함할 수 있다. 적합한 표지 및 이를 부착, 사용 및 검출하기 위한 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 형광 표지, 인광 표지, 화학발광 표지, 생체발광 표지, 방사성 동위원소, 금속, 금속 킬레이트, 금속 양이온, 발색단 및 효소, 예컨대 WO 08/020079의 109 페이지에 언급된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 적합한 표지는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 NMR 또는 ESR 분광법을 사용하여 검출될 수 있는 모이어티를 포함한다.
본 발명의 상기 표지된 이중 파라토프성 나노바디 및 폴리펩티드는 예를 들어 특이적 표지의 선택에 따라, 시험관 내, 생체 내 또는 계내 (in situ) 검정 (그 자체로 공지된 면역검정, 예컨대 ELISA, RIA, EIA 및 다른 "샌드위치 검정" 등 포함) 및 생체 내 진단 및 영상화 목적을 위해 사용될 수 있다.
당업자에게 명백할 바와 같이, 또 다른 변형은 예를 들어 위에서 언급한 금속 또는 금속 양이온 중의 하나를 킬레이팅하기 위한 킬레이팅기의 도입을 수반할 수 있다. 적합한 킬레이팅기는 예를 들어 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 비제한적으로 포함한다.
또 다른 변형은 특이적 결합쌍, 예컨대 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합쌍의 한 부분인 기능적 기의 도입을 포함할 수 있다. 상기 기능적 기는 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드 또는 나노바디를 결합쌍의 다른 절반에 결합된 또 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 화합물에, 즉 결합쌍의 형성을 통해 연결하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 비오틴에 접합되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된 또 다른 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 담체에 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 접합된 이중 파라토프성 나노바디는 예를 들어 검출가능한 신호-생성제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된 진단 시스템에서 리포터로서 사용될 수 있다. 상기 결합쌍은 예를 들어 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디를 제약 목적에 적합한 담체를 포함하는 담체에 결합시키기 위해 사용될 수도 있다. 하나의 비-제한적인 예는 문헌 [Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000)]에 기재된 리포좀 제제이다. 상기 결합쌍은 또한 치료 활성제를 본 발명의 나노바디에 연결하기 위해 사용될 수 있다.
일부 용도를 위해, 특히 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인이 그에 대해 작용하는, CXCR2 표적을 발현하는 세포를 사멸시키는 (예를 들어 암의 치료에서), 또는 상기 세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키거나 지연시키는 것이 의도되는 용도를 위해, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 또한 독소 또는 독성 잔기 또는 모이어티에 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포독성 화합물을 제공하기 위해 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드에 연결될 수 있는 독성 모이어티, 화합물 또는 잔기의 예는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 상기 인용된 선행 기술 및/또는 본원의 추가의 설명에서 볼 수 있다. 하나의 예는 WO 03/055527에 기재된 소위 ADEPT™ 기술이다.
다른 잠재적인 화학적 및 효소에 의한 변형은 당업자에게 명백할 것이다. 상기 변형은 또한 연구 목적을 위해 (예를 들어, 기능-활성 관계를 연구하기 위해) 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997)]을 참조한다.
바람직하게는, 유도체는 이들이 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디에 대해 본원에서 규정된 친화도 (본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 KD-값 (실제 또는 겉보기), KA-값 (실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff-속도로서, 또는 별법으로 IC50 값으로서 적합하게 측정 및/또는 표현된)로 CXCR2에 결합하도록 하는 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 이중 파라토프성 폴리펩티드로 본질적으로 이루어지거나 이를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. "본질적으로 이루어지는"은 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열이 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드의 아미노산 서열과 정확하게 동일하거나, 또는 제한된 수의 아미노산 잔기, 예컨대 1-20개 아미노산 잔기, 예를 들어 1-10개 아미노산 잔기, 바람직하게는 1-6개 아미노산 잔기, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 잔기가 아미노 말단 단부에, 카르복시 말단 단부에, 또는 이중 파라토프성 폴리펩티드의 아미노산 서열의 아미노 말단 단부 및 카르복시 말단 단부 둘 모두에 부가된 본 발명의 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대응함을 의미한다.
상기 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 (생물학적) 특성을 변화, 변경하거나 달리 영향을 주거나 주지 않을 수 있고, 그에 대해 추가의 기능성을 추가하거나 추가하지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노산 잔기는:
- 예를 들어 이종성 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현의 결과로서 N-말단 Met 잔기를 포함할 수 있다.
- 합성시에 숙주 세포로부터 이중 파라토프성 폴리펩티드의 분비를 지시하는 신호 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있다. 적합한 분비 리더 펩티드는 당업자에게 명백할 것이고, 본원에서 추가로 설명될 수 있다. 대체로, 상기 리더 서열은 이중 파라토프성 폴리펩티드의 N-말단에 연결될 것이다;
- 이중 파라토프성 폴리펩티드가 특정 장기, 조직, 세포, 또는 세포의 일부 또는 구획을 향해 유도되고/되거나 이를 투과하거나 도입되도록 허용하고/하거나, 이중 파라토프성 폴리펩티드가 생물학적 장벽, 예컨대 세포막, 세포층, 예컨대 상피 세포의 층, 고형 종양을 포함하는 종양, 또는 혈액-뇌-장벽을 투과하거나 가로지르도록 허용하는 서열 또는 신호를 형성할 수 있다. 상기 아미노산 서열의 예는 당업자에게 명백할 것이고, WO 08/020079의 112 페이지의 문단 c)에서 언급된 것을 포함한다.
- 예를 들어 그 서열 또는 잔기에 대해 작용하는 친화도 기술을 사용하여 이중 파라토프성 나노바디의 정제를 허용하거나 용이하게 하는 "태그", 예를 들어 아미노산 서열 또는 잔기를 형성할 수 있다. 이후에, 상기 서열 또는 잔기는 이중 파라토프성 폴리펩티드 서열을 제공하기 위해서 제거될 수 있다 (예를 들어 화학적 또는 효소에 의한 절단에 의해) (이를 위해, 태그는 절단가능한 링커 서열을 통해 이중 파라토프성 폴리펩티드 서열에 임의로 연결되거나 또는 절단가능한 모티프를 함유할 수 있다). 상기 잔기의 일부의 바람직한, 그러나 비-제한적인 예는 다수의 히스티딘 잔기, 글루타티온 잔기 및 myc-태그 (예를 들어 WO 06/12282의 서열 31 참조)이다.
- 기능화된 및/또는 기능적 기의 부착 부위로서 기능할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 적합한 아미노산 잔기 및 기능적 기는 당업자에게 명백할 것이고, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드 또는 나노바디의 유도체에 대해 본원에서 언급된 아미노산 잔기 및 기능적 기를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 하나 이상의 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공하기 위해, 그의 아미노 말단 단부에서, 그의 카르복시 말단 단부에서, 또는 그의 아미노 말단 단부 및 그의 카르복시 말단 단부 둘 모두에서 적어도 하나의 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디를 포함한다. 상기 융합체는 또한 "나노바디 융합체"로서 본원에서 언급될 것이다.
바람직하게는, 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 요구되는 특성 또는 기능성을 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드에 부여하도록 하는 것이다.
예를 들어, 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 추가의 결합 부위를 제공할 수 있고, 이 결합 부위는 임의의 요구되는 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정자 또는 에피토프 (본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드가 그에 대해 작용하는 동일한 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정자 또는 에피토프, 또는 상이한 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정자 또는 에피토프를 포함하고 이로 제한되지 않음)에 대해 작용할 수 있다.
상기 펩티드 또는 폴리펩티드의 예는 당업자에게 명백할 것이고, 일반적으로 통상적인 항체 및 그의 단편 (ScFv 및 단일 도메인 항체를 포함하고 이로 제한되지 않음)을 기초로 한 펩티드 융합체에 사용되는 모든 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005)]을 참조한다.
예를 들어, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드 자체에 비해 본 발명의 폴리펩티드의 반감기, 용해도, 또는 흡수를 증가시키고, 면역원성 또는 독성을 감소시키고, 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시키고/시키거나 다른 유익한 특성을 부여하고/하거나 원하지 않는 특성을 감소시키는 아미노산 서열일 수 있다. 상기 펩티드 및 폴리펩티드의 일부의 비-제한적인 예는 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 (예를 들어 WO 00/27435 참조) 또는 합텐 분자 (예를 들어 순환 항체에 의해 인식되는 합텐, 예를 들어 WO 98/22141 참조)이다.
특히, 면역글로불린의 단편 (예컨대 VH 도메인)을 혈청 알부민 또는 그의 단편에 연결하는 것이 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있음이 선행 기술에 설명되어 있다. WO 00/27435 및 WO 01/077137을 참조한다. 본 발명에 따르면, 이중 파라토프성 폴리펩티드, 바람직하게는 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 바람직하게는 혈청 알부민에 (또는 그의 적합한 단편에) 직접 또는 본 발명의 폴리펩티드가 유전자 융합체 (단백질)로서 발현될 수 있도록 적합한 링커를 통해, 특히 적합한 펩티드를 통해 연결된다. 하나의 구체적인 측면에 따르면, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 혈청 알부민의 도메인 III 또는 그의 일부를 적어도 포함하는 혈청 알부민의 단편에 연결될 수 있다. 예를 들어, 아블링스 엔.브이.의 WO 07/112940을 참조한다.
별법으로, 본원에서 이미 논의된 바와 같이, 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드는 혈청 내의 증가된 반감기를 제공하도록 혈청 단백질 (예컨대, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 또 다른 혈청 단백질, 예컨대 IgG)에 대해 작용하는 추가의 결합 부위 또는 결합 단위를 제공할 수 있다. 상기 아미노산 서열은 예를 들어 아래에 설명된 나노바디, 및 WO 91/01743, WO 01/45746 및 WO 02/076489에 기재된 작은 펩티드 및 결합 단백질 및 WO 03/002609 및 WO 04/003019에 기재된 dAb를 포함한다. 또한, 문헌 [Harmsen et al., Vaccine, 23(41); 4926-42, 2005], 및 EP 0 368 684, 및 WO 08/028977, WO 08/043821, WO 08/043822 (아블링스 엔.브이.) 및 2006년 12월 5일 출원된 아블링스 엔.브이.의 미국 특허 가출원 (명칭: "Peptides capable of binding to serum proteins") (또한 PCT/EP2007/063348 참조))를 참조한다.
상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 특히 혈청 알부민 (보다 특히 인간 혈청 알부민) 및/또는 IgG (보다 특히 인간 IgG)에 대해 작용할 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열은 (인간) 혈청 알부민에 대해 작용하는 아미노산 서열 및 혈청 알부민의 FcRn에 대한 결합에 관여하지 않는 (인간) 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 아미노산 서열 (예를 들어 WO 06/0122787 참조) 및/또는 혈청 알부민의 도메인 III의 일부를 형성하지 않는 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 아미노산 서열 (다시 예를 들어 WO 06/0122787 참조); 증가된 반감기를 갖거나 제공할 수 있는 아미노산 서열 (예를 들어 아블링스 엔.브이.의 WO 08/028977 참조); 적어도 하나의 종의 포유동물, 및 특히 하나 이상의 종의 영장류 (예컨대, 비제한적으로, 마카카 속으로부터의 원숭이 (예컨대, 및 특히, 시노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) 및/또는 붉은털 원숭이 (마카카 물라타)) 및 개코원숭이 (파피오 우르시누스))로부터의 혈청 알부민과 교차 반응성인, 인간 혈청 알부민에 대해 작용하는 아미노산 서열 (다시 WO 08/028977 참조); pH 비의존성 방식으로 혈청 알부민에 결합할 수 있는 아미노산 서열 (예를 들어, 아블링스 엔.브이.의 WO 08/043821 (명칭: "Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof) 참조) 및/또는 조건 (conditional) 결합제인 아미노산 서열 (예를 들어, 아블링스 엔.브이의 WO 08/043822 (명칭: "Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner") 참조)일 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 하나 이상의 추가의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열은 통상적인 4 사슬 항체 (특히 인간 항체) 및/또는 중쇄 항체의 하나 이상의 부분, 단편 또는 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대체로 덜 바람직하지만, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디는 다시 임의로 링커 서열 (다른 (단일) 도메인 항체, 예컨대 문헌 [Ward et al.]에 기재된 dAb를 포함하고 이로 제한되지 않음)을 통해 통상적인 (바람직하게는 인간) VH 또는 VL 도메인에 또는 VH 또는 VL 도메인의 천연 또는 합성 유사체에 연결될 수 있다.
이중 파라토프성 폴리펩티드 또는 나노바디는 또한 임의로 링커 서열을 통해 하나 이상의 (바람직하게는 인간) CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들어, 적합한 CH1 도메인에 연결된 이중 파라토프성 나노바디는 예를 들어 통상적인 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편에 유사하지만 통상적인 VH 도메인의 하나 또는 (F(ab')2 단편의 경우) 둘 모두가 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디에 의해 교체된 항체 단편/구조를 생성하기 위해서 적합한 경쇄와 함께 사용될 수 있다. 또한, 2개의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 생체 내에서 증가된 반감기를 갖는 구축물을 제공하기 위해 CH3 도메인 (임의로 링커를 통해)에 연결될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 한 구체적인 측면에 따르면, 본 발명의 하나 이상의 이중 파라토프성 폴리펩티드 또는 나노바디는 하나 이상의 불변 도메인 (예를 들어, Fc 부분의 일부로서/Fc 부분을 형성하기 위해 사용될 수 있는 2 또는 3 불변 도메인)에, Fc 부분에 및/또는 하나 이상의 이펙터 기능을 본 발명의 폴리펩티드에 부여하고/하거나 하나 이상의 Fc 수용체에 결합하는 능력을 부여할 수 있는 하나 이상의 항체 부분, 단편 또는 도메인에 연결될 수 있다 (임의로 적합한 링커 또는 힌지 영역을 통해). 예를 들어, 상기 목적을 위해, 및 그로 제한되지 않으면서, 하나 이상의 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드는 항체, 예컨대 중쇄 항체 (본원에 설명된 바와 같은), 보다 바람직하게는 통상적인 인간 4 사슬 항체로부터의 하나 이상의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있고/있거나; 예를 들어 IgG (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgE 또는 또 다른 인간 Ig, 예컨대 IgA, IgD 또는 IgM로부터의 Fc 영역 (의 일부)를 형성할 수 있다. 예를 들어, WO 94/04678에는 낙타류 VHH 도메인 또는 그의 인간화된 유도체 (즉, 나노바디)를 포함하는 중쇄 항체가 기재되어 있고, 인간화된 유도체에서 낙타과 (Camelidae) CH2 및/또는 CH3 도메인은 각각 나노바디 및 인간 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 (그러나, CH1 도메인은 포함하지 않는) 2개의 중쇄로 이루어지는 면역글로불린을 제공하기 위해서 인간 CH2 및 CH3 도메인에 의해 교체되었고, 상기 면역글로불린은 CH2 및 CH3 도메인에 의해 제공되는 이펙터 기능을 갖고 임의의 경쇄가 존재하지 않은 경우에도 기능할 수 있다. 이펙터 기능을 제공하기 위해서 본 발명의 나노바디에 적합하게 연결될 수 있는 다른 아미노산 서열은 당업자에게 명백할 것이고, 요구되는 이펙터 기능(들)을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, WO 04/058820, WO 99/42077, WO 02/056910 및 WO 05/017148, 및 문헌 [Holliger and Hudson, 상기 문헌]을 참조한다. 폴리펩티드, 예를 들어 본 발명의 나노바디의 Fc 부분에 대한 커플링은 또한 본 발명의 상응하는 폴리펩티드에 비해 증가된 반감기를 유도할 수 있다. 일부 용도를 위해, 임의의 생물학상 유의한 이펙터 기능을 보이지 않으면서 증가된 반감기를 부여하는 Fc 부분 및/또는 불변 도메인 (즉 CH2 및/또는 CH3 도메인)의 사용이 또한 적합하거나 또는 심지어 바람직할 수 있다. 생체 내에서 증가된 반감기를 갖는 하나 이상의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 예컨대 나노바디 및 하나 이상의 불변 도메인을 포함하는 다른 적합한 구축물은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 임의로 링커 서열을 통해 CH3 도메인에 연결된 2개의 나노바디를 포함할 수 있다. 일반적으로, 증가된 반감기를 갖는 임의의 융합 단백질 또는 유도체는 바람직하게는 신장 흡수를 위한 컷오프 (cut-off) 값인 50 kD을 초과하는 분자량을 가질 것이다.
또 다른 하나의 구체적이지만 비-제한적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드를 형성하기 위해서, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열은 이량체로 자가회합하는 경향이 감소된 (또는 본질적으로 없는) (즉, 통상적인 4 사슬 항체에서 천연 생성되는 불변 도메인에 비해) 천연 생성, 합성 또는 반합성 불변 도메인 (또는 그의 유사체, 변이체, 돌연변이체, 일부 또는 단편)에 연결될 수 있다 (임의로 적합한 링커 또는 힌지 영역을 통해). 상기 단량체성 (즉, 자가회합하지 않는) Fc 사슬 변이체, 또는 그의 단편은 숙련인에게 명백할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Helm et al., J Biol Chem 1996 271 7494]에는 본 발명의 폴리펩티드 사슬에 사용될 수 있는 단량체성 Fc 사슬 변이체가 기재되어 있다.
또한, 상기 단량체성 Fc 사슬 변이체는 바람직하게는 이들이 보체 또는 관련 Fc 수용체(들) (이들이 유래되는 Fc 부분에 따라)에 계속 결합할 수 있도록 하고/하거나, 이들이 유래되는 Fc 부분의 이펙터 기능의 일부 또는 전부를 (또는 의도되는 용도에 계속 적합한 감소된 수준으로) 계속 갖도록 하는 것이다. 별법으로, 본 발명의 상기 폴리펩티드 사슬에서, 단량체성 Fc 사슬은 폴리펩티드 사슬에 증가된 반감기를 부여하기 위해 사용될 수 있고, 이 경우에 단량체성 Fc 사슬은 또한 이펙터 기능을 전혀 또는 본질적으로 갖지 않을 수 있다.
추가의 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 합성시에 숙주 세포로부터 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드의 분비를 지시하는 신호 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있다 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포에 따라 본 발명의 폴리펩티드의 프리 (pre)-, 프로 (pro)- 또는 프리프로(prepro)-형태를 제공하기 위해).
추가의 펩티드 또는 폴리펩티드는 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드가 특정 장기, 조직, 세포, 또는 세포의 일부 또는 구획을 향해 유도되고/되거나 이를 투과하거나 그 내에 도입되도록 허용하고/하거나, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드가 생물학적 장벽, 예컨대 세포막, 세포층, 예컨대 상피 세포의 층, 고형 종양을 포함하는 종양, 또는 혈액-뇌-장벽을 투과하거나 가로지르도록 허용하는 서열 또는 신호를 형성할 수 있다. 상기 아미노산 서열의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 WO 08/020079의 118 페이지에 언급된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부의 용도를 위해, 특히 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드가 그에 대해 작용하는 표적을 발현하는 세포를 사멸시키는 (예를 들어 암의 치료에서), 또는 상기 세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키거나 지연시키는 것이 의도되는 용도를 위해, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 또한 (세포)독성 단백질 또는 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포독성 폴리펩티드를 제공하기 위해 본 발명의 나노바디에 연결될 수 있는 상기 독성 단백질 및 폴리펩티드의 예는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 상기 인용된 선행 기술 및/또는 본원의 추가의 설명에서 볼 수 있다. 하나의 예는 WO 03/055527에 기재된 소위 ADEPT™ 기술이다.
하나의 선택적이지만 비-제한적인 측면에 따르면, 상기 하나 이상의 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 링커 서열 (본원에서 규정된 바와 같은)을 통해 임의로 연결될 수 있는 적어도 3, 예컨대 4, 또는 5개 이상의 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 제공하기 위해서 적어도 하나의 추가의 나노바디를 포함한다.
마지막으로, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드가 2개 이상의 나노바디 및 하나 이상의 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드 (본원에 언급된 바와 같이)를 포함할 수 있는 것도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
2개 이상의 VHH 도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩티드 및 그의 제제에 대해서는, 또한 문헌 [Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001]; [Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302]; 및 예를 들어 WO 96/34103 및 WO 99/23221을 참조한다. 본 발명의 일부의 특정 다중특이적 및/또는 다가 폴리펩티드의 일부의 다른 예는 본원에서 언급되는 아블링스 엔.브이.의 출원에서 볼 수 있다.
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드의 한 바람직한 예는 본 발명의 적어도 하나의 이중 파라토프성 나노바디 및 증가된 반감기를 제공하는 적어도 하나의 나노바디를 포함한다. 상기 나노바디는 예를 들어 혈청 단백질, 특히 인간 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민, 티록신-결합 단백질, (인간) 트랜스페린, 피브리노겐, 면역글로불린, 예컨대 IgG, IgE 또는 IgM에 대해 작용하는, 또는 WO 04/003019에 나열된 혈청 단백질 중의 하나에 대해 작용하는 나노바디일 수 있다. 이들 중에서, 혈청 알부민 (특히 인간 혈청 알부민)에 또는 IgG (특히 인간 IgG, 예를 들어 문헌 [Muyldermans, 상기 문헌]에서 설명된 나노바디 VH-1 참조)에 결합할 수 있는 나노바디가 특히 바람직하다 (그렇지만, 예를 들어 마우스 또는 영장류에서의 실험을 위해, 각각 마우스 혈청 알부민 (MSA) 또는 상기 영장류로부터의 혈청 알부민에 대해 작용하거나 이와 교차반응성인 나노바디가 사용될 수 있다. 그러나, 제약 용도를 위해서는, 인간 혈청 알부민 또는 인간 IgG에 대해 작용하는 나노바디가 대체로 바람직할 것이다). 증가된 반감기를 제공하고 본 발명의 폴리펩티드에 사용될 수 있는 나노바디는 WO 04/041865, WO 06/122787 및 아블링스 엔.브이.의 추가의 특허 출원, 예컨대 위에서 언급한 것에 기재된 혈청 알부민에 대해 작용하는 나노바디를 포함한다.
예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 증가된 반감기를 제공하는 일부의 바람직한 나노바디는 혈청 알부민의 FcRn에 대한 결합에 관여하지 않는 (인간) 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 나노바디 (예를 들어 WO 06/0122787 참조) 및/또는 혈청 알부민의 도메인 III의 일부를 형성하지 않는 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 나노바디 (예를 들어 WO 06/0122787 참조); 증가된 반감기를 갖거나 제공할 수 있는 나노바디 (예를 들어 본원에 언급된 아블링스 엔.브이.의 WO 08/028977 참조); 적어도 하나의 종의 포유동물, 및 특히 하나 이상의 종의 영장류 (예컨대, 비제한적으로, 마카카 속으로부터의 원숭이 (예컨대, 및 특히, 시노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스) 및/또는 붉은털 원숭이 (마카카 물라타)) 및 개코원숭이 (파피오 우르시누스))로부터의 혈청 알부민과 교차 반응성인, 인간 혈청 알부민에 대해 작용하는 나노바디 (아블링스 엔.브이.의 WO 08/028977 참조); pH 비의존성 방식으로 혈청 알부민에 결합할 수 있는 나노바디 (예를 들어, 본원에 언급된 아블링스 엔.브이.의 WO2008/043821 참조) 및/또는 조건 결합제인 나노바디 (예를 들어, 아블링스 엔.브이의 WO 08/043822 참조)를 포함한다.
증가된 반감기를 제공하고 본 발명의 폴리펩티드에서 사용될 수 있는 일부의 특히 바람직한 나노바디는 WO 06/122787 (표 II 및 III 참조)에 개시된 나노바디 ALB-1 내지 ALB-10을 포함하고, 그 중 ALB-8 (WO 06/122787의 서열 62)이 특히 바람직하다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 2개 이상의 나노바디 이외에, 인간 혈청 알부민에 대해 작용하는 적어도 하나의 나노바디를 함유한다.
또한, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드에 부가되거나 부착되거나 융합될 수 있는 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드는 프롤린, 알라닌 및 세린 (PAS 서열)로 이루어진 중합체를 포함한다. PAS 서열은 200-600개 잔기로 이루어지고, 유체역학적 부피의 극적인 증가를 유도하여 혈장 반감기를 연장할 수 있다. 또한, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드의 혈청 반감기는 문헌 [Schellenbrger et al., (2009), Nature Biotechnology 27, No 12, p1186-1190]에 기재된 바와 같이 XTEN으로 불리는 864개 아미노산의 폴리펩티드에 대한 융합에 의해 연장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 하나 이상의 이중 파라토프성 나노바디를 함유하는 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 임의의 폴리펩티드, 및 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디의 또는 상기 폴리펩티드의 임의의 유도체는 바람직하게는 본 발명의 상응하는 나노바디 자체의 반감기보다 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 2배, 예컨대 적어도 5배, 예를 들어 적어도 10배 또는 20배 초과로 더 큰 반감기를 갖는다. 예를 들어, 증가된 반감기를 갖는 상기 유도체 또는 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 폴리펩티드 자체에 비해 1 시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직하지만 비-제한적인 측면에서, 상기 유도체 또는 폴리펩티드는 인간에서 적어도 약 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 보다 바람직하게는 적어도 48시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 72시간 이상의 혈청 반감기를 보일 수 있다. 예를 들어, 상기 유도체 또는 폴리펩티드는 적어도 5일 (예컨대 약 5 내지 10일), 바람직하게는 적어도 9일 (예컨대 약 9 내지 14일), 보다 바람직하게는 적어도 약 10일 (예컨대 약 10 내지 15일), 또는 적어도 약 11일 (예컨대 약 11 내지 16일), 보다 바람직하게는 적어도 약 12일 (예컨대 약 12 내지 18일 이상), 또는 14일 초과 (예컨대 약 14 내지 19일)의 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드의 또 다른 바람직한, 그러나 비-제한적인 예는 본 발명의 적어도 하나의 이중 파라토프성 나노바디, 및 본 발명의 폴리펩티드를 특정 장기, 조직, 세포, 또는 세포의 일부 또는 구획을 향해 유도하고/하거나 본 발명의 폴리펩티드가 이를 투과하거나 그 내에 도입되도록 허용하고/하거나, 나노바디가 생물학적 장벽, 예컨대 세포막, 세포층, 예컨대 상피 세포의 층, 고형 종양을 포함하는 종양, 또는 혈액-뇌-장벽을 투과하거나 가로지르도록 허용하는 적어도 하나의 나노바디를 포함한다. 상기 나노바디 예는 요구되는 장기, 조직 또는 세포의 특정 세포-표면 단백질, 마커 또는 에피토프 (예를 들어 종양 세포와 연관된 세포-표면 마커)를 향해 유도되는 나노바디, 및 WO 02/057445 및 WO 06/040153에 기재된 단일-도메인 뇌 표적화 항체 단편을 포함하고, 그 중 FC44 (WO 06/040153의 서열 189) 및 FC5 (WO 06/040154의 서열 190)가 바람직한 예이다.
본 발명의 폴리펩티드에서, 2개 이상의 나노바디 및 하나 이상의 폴리펩티드는 서로 직접 연결될 수 있고/있거나 (예를 들어 WO 99/23221에 기재된 바와 같이) 하나 이상의 적합한 스페이서 또는 링커, 또는 그의 임의의 조합을 통해 서로 연결될 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 본원에서 규정된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태로 존재한다.
본 발명의 아미노산 서열, 이중 파라토프성 나노바디, 폴리펩티드 및 핵산은 본원의 추가의 설명으로부터 당업자에게 명백할 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 폴리펩티드는 항체의 제조, 특히 항체 단편 ((단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편을 포함하고 이로 제한되지 않음)의 제조를 위해 그 자체로 공지된 임의의 방식으로 제조될 수 있다. 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 핵산을 제조하기 위한 일부의 바람직하지만 비-제한적인 방법은 본원에서 설명되는 방법 및 기술을 포함한다.
당업자에게 명백할 바와 같이, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 /또는 폴리펩티드의 제조에 특히 유용한 한 방법은 일반적으로 다음 단계를 포함한다:
i) 본 발명의 상기 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (또한 "본 발명의 핵산"으로서 본원에서 언급됨)의 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 (또한 "본 발명의 숙주"로서 본원에서 언급됨) 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서의 발현, 및 이어서 임의로
ii) 이와 같이 얻은 본 발명의 상기 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드의 단리 및/또는 정제.
특히, 상기 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
i) 본 발명의 상기 숙주가 본 발명의 적어도 하나의 이중 파라토프성 나노바디 및/또는 폴리펩티드를 발현 및/또는 생산하도록 하는 조건 하에 본 발명의 숙주의 배양 및/또는 유지, 및 이어서 임의로
ii) 이와 같이 얻은 본 발명의 상기 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드의 단리 및/또는 정제.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 (또는 그의 적합한 단편)을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산은 또한 본원에서 "본 발명의 핵산"으로서 언급될 것이고, 예를 들어 본원에서 추가로 설명되는 유전자 구축물의 형태로 존재할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 표 9 및 32의 개개의 특정 나노바디에 관한 서열 25 내지 43, 90 및 서열 213 내지 219에 제시된 아미노산 서열의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 별법으로, 본 발명에 따른 핵산 분자는 서열 44 내지 69의 다가 및 이중 파라토프성 나노바디 구축물을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따른 핵산 분자는 표 18에서 확인된 나노바디에 관한 서열 192 내지 211에 관한 핵산 서열을 갖는 분자를 포함한다.
본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있고, 바람직하게는 이중 가닥 DNA의 형태이다. 예를 들어, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA (예컨대, 의도되는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현을 위해 특이적으로 조정된 코돈 사용 빈도를 갖는 DNA)일 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명의 핵산은 본원에서 규정된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태로 존재한다.
본 발명의 핵산은 또한 다시 본질적으로 단리된 형태로 존재할 수 있는 벡터, 예컨대 예를 들어 플라스미드, 코스미드 또는 YAC의 형태로 존재하고/하거나, 그 내에 존재하고/하거나, 그의 일부일 수 있다.
본 발명의 핵산은 본원에 제시된 본 발명의 폴리펩티드에 대한 아미노산에 대한 정보를 기초로 하여 그 자체로 공지된 방식으로 제조되거나 얻을 수 있고/있거나 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 유사체를 제공하기 위해, 천연 생성 VHH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 상기 유사체를 코딩하는 본 발명의 핵산을 제공하기 위해 부위 지정 돌연변이 유발에 적용될 수 있다. 또한, 당업자에게 명백할 바와 같이, 본 발명의 핵산을 제조하기 위해서, 또한 몇몇의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및 예를 들어 하나 이상의 링커를 코딩하는 핵산은 적합한 방식으로 함께 연결될 수 있다.
본 발명의 핵산을 생성하는 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 자동 DNA 합성; 부위 지정 돌연변이 유발; 2개 이상의 천연 생성 및/또는 합성 서열 (또는 그의 2개 이상의 일부)의 조합, 말단절단된 발현 생성물의 발현을 유도하는 돌연변이의 도입; 하나 이상의 제한 부위의 도입 (예를 들어 적합한 제한 효소를 사용하여 쉽게 소화시키고/시키거나 라이게이팅시킬 수 있는 카세트 및/또는 영역의 생성을 위한), 및/또는 예를 들어 주형으로서 CXCR2의 천연 생성 형태의 서열을 사용하고 하나 이상의 "불일치" 프라이머를 이용하는 PCR 반응에 의한 돌연변이의 도입을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 이들 및 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 다시 표준 안내서, 예컨대 상기 언급된 문헌 [Sambrook et al., and Ausubel et al.], 및 아래 실시예를 참조한다.
본 발명의 핵산은 또한 유전자 구축물의 형태로 존재하고/하거나 그 내에 존재하고/하거나 그의 일부일 수 있다. 상기 유전자 구축물은 일반적으로 그 자체로 공지된 유전자 구축물의 하나 이상의 요소, 예컨대 예를 들어 하나 이상의 적합한 조절 요소 (예컨대 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 종결인자(들) 등) 및 본원에서 언급되는 유전자 구축물의 추가의 요소에 임의로 연결된 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 상기 유전자 구축물은 또한 "본 발명의 유전자 구축물"로서 본원에서 언급될 것이다.
본 발명의 유전자 구축물은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 구축물은 또한 의도되는 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 형질전환에 적합한 형태, 의도되는 숙주 세포의 게놈 DNA 내로의 통합에 적합한 형태 또는 의도되는 숙주 유기체에서 비의존성 복제, 유지 및/또는 유전에 적합한 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 구축물은 벡터, 예컨대 예를 들어 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스 벡터 또는 트랜스포존 (transposon)의 형태로 존재할 수 있다. 특히, 벡터는 발현 벡터, 즉 발현 시험관 내 및/또는 생체 내에서 (예를 들어 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템에서) 발현을 제공할 수 있는 벡터일 수 있다.
바람직하지만 비-제한적인 측면에서, 본 발명의 유전자 구축물은
i) 본 발명의 적어도 하나의 핵산; 이에 작동가능하게 연결된
ii) 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 임의로 적합한 종결인자; 및 임의로 또한
iii) 그 자체로 공지된 유전자 구축물의 하나 이상의 추가의 요소
를 포함하고;
여기서, "작동가능하게 연결된(operably connected)" 및 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 WO 08/020079의 131-134 페이지에 제시된 의미를 갖고; "조절 요소", "프로모터", "종결인자" 및 "추가의 요소"는 WO 08/020079의 131-134 페이지에 기재되어 있고; 유전자 구축물은 WO 08/020079의 131-134 페이지에 추가로 기재될 수 있다.
본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 유전자 구축물은 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질전환시키기 위해, 즉 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드의 발현 및/또는 생산을 위해 사용될 수 있다. 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 유기체, 예를 들어 WO 08/020079의 134 및 135 페이지에 기재된 것; 및 당업자에게 명백할, 항체 및 항체 단편 ((단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편을 포함하고 이로 제한되지 않음)의 발현 및 생산을 위해 그 자체로 공지된 모든 다른 숙주 또는 숙주 세포일 수 있다. 또한, 상기 인용된 일반적인 배경 기술, 및 예를 들어 WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; [Frenken et al., (1998), 상기 문헌]; [Riechmann and Muyldermans, (1999), 상기 문헌]; [van der Linden, (2000), 상기 문헌]; [Thomassen et al., (2002), 상기 문헌]; [Joosten et al., (2003), 상기 문헌]; [Joosten et al., (2005), 상기 문헌]; 및 본원에서 언급된 추가의 참고문헌을 참조한다.
본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 폴리펩티드는 또한 예를 들어 WO 08/020079의 135 및 136 페이지 및 WO 08/020079에서 인용된 추가의 참고문헌에서 추가로 설명되는 바와 같이 예방 및/또는 치료 목적을 위해 (예를 들어 유전자 요법으로서) 다세포 유기체의 하나 이상의 세포, 조직 또는 장기에 도입되고 발현된다.
세포에서 나노바디의 발현을 위해, 이들은 또한 예를 들어 WO 94/02610, WO 95/22618 및 US-A-7004940; WO 03/014960; 문헌 [Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag]; 및 [Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170]에 기재된 바와 같이 소위 "인트라바디 (intrabody)"로서 발현될 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 폴리펩티드는 예를 들어 트랜스제닉 포유동물의 젖에서, 예를 들어 마우스, 소, 염소 또는 양의 젖에서 (예를 들어 포유동물 내로 도입유전자의 도입을 위한 일반적인 기술에 대해서는 US-A-6,741,957, US-A-6,304,489 및 US-A-6,849,992 참조), 식물 또는 잎, 꽃, 열매, 종자, 뿌리 또는 괴경을 포함하고 이로 제한되지 않는 식물의 일부에서 (예를 들어 감자, 옥수수, 대두 또는 알팔파에서) 또는 예를 들어 누에 봄빅스 모리 (Bombix mori)의 번데기에서 생산될 수 있다.
추가로, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 폴리펩티드는 또한 무세포 발현 시스템에서 발현 및/또는 생산될 수 있고, 상기 시스템의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이다. 일부의 바람직한, 그러나 비-제한적인 예는 맥아 시스템; 토끼 망상적혈구 용해물; 또는 이. 콜라이 (E. coli) 주베이 (Zubay) 시스템에서의 발현을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 이중 파라토프성 폴리펩티드 및 나노바디의 사용의 잇점 중의 하나는 그를 기초로 한 폴리펩티드가 적합한 세균 시스템에서의 발현을 통해 제조될 수 있다는 것이고, 적합한 세균 발현 시스템, 벡터, 숙주 세포, 조절 요소 등은 예를 들어 상기 언급된 참조문헌으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러나, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 세균 시스템에서의 발현으로 제한되지 않음을 유의하여야 한다.
바람직하게는, 본 발명에서, 본 발명의 폴리펩티드를 제약 용도에 적합한 형태로 제공하는 (생체 내 또는 시험관 내) 발현 시스템, 예컨대 세균 발현 시스템이 사용되고, 그러한 발현 시스템은 다시 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 제약 용도에 적합한 본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 합성을 위한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
산업적 규모의 생산을 위해, 이중 파라토프성 나노바디 또는 나노바디-함유 단백질 치료제의 (산업적) 생산을 위한 바람직한 이종성 숙주는 대규모 발현/생산/발현에, 특히 대규모 제약 (즉 GMP 등급) 발현/생산/발현에 적합한 이. 콜라이, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)의 균주를 포함한다. 상기 균주의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이다. 상기 균주 및 생산/발현 시스템은 또한 회사, 예컨대 바이오비트룸 (Biovitrum, 스웨덴 웁살라))으로부터 이용가능하다.
별법으로, 포유동물 세포주, 특히 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 대규모 발현/생산/발현, 특히 대규모 제약 발현/생산/발현을 위해 사용될 수 있다. 다시, 상기 발현/생산 시스템은 또한 상기 언급한 일부의 회사로부터 이용가능하다.
특정 발현 시스템의 선택은 부분적으로는 특정 번역후 변형, 보다 구체적으로 글리코실화의 필요성에 따라 결정될 것이다. 그에 대한 글리코실화가 요구되거나 또는 필요한 나노바디-함유 재조합 단백질의 생산은 재조합 단백질을 글리코실화하는 능력을 갖는 포유동물 발현 숙주의 사용을 필요로 할 것이다. 이와 관련하여, 얻어지는 글리코실화 패턴 (즉, 부착되는 잔기의 종류, 수 및 위치)은 발현에 사용되는 세포 또는 세포주에 따라 결정될 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 바람직하게는, 인간 세포 또는 세포주가 사용되거나 (즉, 본질적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 생성) 또는 인간 글리코실화와 본질적으로 및/또는 기능적으로 동일하거나 또는 적어도 인간 글리코실화를 모방하는 글리코실화 패턴을 제공할 수 있는 또 다른 포유동물 세포주가 사용된다. 일반적으로, 원핵 숙주, 예컨대 이. 콜라이는 단백질을 글리코실화하는 능력을 갖지 않고, 저등 원핵생물, 예컨대 효모는 대체로 인간 글리코실화와 상이한 글리코실화 패턴을 생성한다. 그럼에도 불구하고, 모든 상기 숙주 세포 및 발현 시스템이 얻어지는 요구되는 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드에 따라 본 발명에서 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
따라서, 본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드는 글리코실화된다. 본 발명의 또 다른 비-제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 비-글리코실화된다.
본 발명의 바람직하지만 비-제한적인 한 측면에 따르면, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드는 세균 세포, 특히 대규모 제약 생산에 적합한 세균 세포, 예컨대 상기 언급한 균주의 세포에서 생산된다.
본 발명의 또 다른 바람직하지만 비-제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드는 효모 세포, 특히 대규모 제약 생산에 적합한 효모 세포, 예컨대 상기 언급된 종의 세포에서 생산된다.
본 발명의 또 다른 바람직하지만 비-제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드는 포유동물 세포, 특히 인간 세포 또는 인간 세포주의 세포, 보다 특히 대규모 제약 생산에 적합한 인간 세포 또는 인간 세포주의 세포, 예컨대 상기 본원에서 언급된 세포주에서 생산된다.
WO 08/020079의 138 및 139 페이지에 추가로 기재된 바와 같이, 숙주 세포에서의 발현이 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 때, 이들은 세포 내에서 (예를 들어 시토졸, 주변세포질 또는 봉입체에서) 생산된 후 숙주 세포로부터 단리되고 임의로 추가로 정제되거나; 또는 세포 외에서 (예를 들어 숙주 세포가 배양되는 배지에서) 생산된 후 배양 배지로부터 단리되고 임의로 추가로 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 비-제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드는 세포 내에서 생산되고 숙주 세포, 특히 세균 세포 또는 세균 세포 내의 봉입체로부터 단리된 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드이다. 본 발명의 또 다른 비-제한적인 측면에 따르면, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드는 세포 외에서 생산되고 숙주 세포가 배양되는 배지로부터 단리된 나노바디 또는 폴리펩티드이다.
이들 숙주 세포와 사용하기 바람직하지만 비-제한적인 일부 프로모터는 WO 08/020079의 139 및 140 페이지에 언급된 것을 포함한다.
이들 숙주 세포와 사용하기 바람직하지만 비-제한적인 일부 분비 서열은 WO 08/020079의 140 페이지에 언급된 것을 포함한다.
본 발명의 숙주 또는 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 적합한 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 의도되는 숙주 세포/숙주 유기체 및 사용되는 유전자 구축물에 따라 결정될 수 있다. 다시 상기 언급한 안내서 및 특허 출원을 참조한다.
형질전환 후에, 본 발명의 뉴클레오티드 서열/유전자 구축물로 성공적으로 형질전환된 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 검출하고 선택하는 단계를 수행할 수 있다. 이것은 예를 들어 본 발명의 유전자 구축물에 존재하는 선택가능한 마커를 기초로 한 선택 단계 또는 예를 들어 특정 항체를 사용한 본 발명의 폴리펩티드의 검출을 수반하는 단계일 수 있다.
형질전환된 숙주 세포 (안정한 세포주의 형태로 존재할 수 있는) 또는 숙주 유기체 (안정한 돌연변이체주 또는 균주의 형태로 존재할 수 있는)는 본 발명의 추가의 측면을 형성한다.
바람직하게는, 이들 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 이들이 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드를 (예를 들어 적합한 조건 하에) (및 숙주 유기체의 경우에: 그의 적어도 하나의 세포, 일부, 조직 또는 장기에서) 발현하거나 (적어도) 발현할 수 있도록 하는 것이다. 본 발명은 또한 예를 들어 세포 분열 또는 유성 또는 무성 번식에 의해 얻어질 수 있는 본 발명의 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 추가의 세대, 자손체 및/또는 자손을 추가로 포함한다.
본 발명의 아미노산 서열의 발현체를 생산하거나 얻기 위해, 형질전환된 숙주 세포 또는 형질전환된 숙주 유기체는 일반적으로 본 발명의 (요구되는) 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드가 발현/생산되도록 하는 조건 하에 존재, 유지 및/또는 배양될 수 있다. 적합한 조건은 당업자에게 명백할 것이고, 대체로 사용되는 숙주 세포/숙주 유기체, 및 본 발명의 (관련) 뉴클레오티드 서열의 발현을 제어하는 조절 요소에 따라 결정될 것이다. 다시, 상기 본 발명의 유전자 구축물에 대한 문단에서 언급된 안내서 및 특허 출원을 참조한다.
일반적으로, 적합한 조건은 적합한 배지의 사용, 식품 및/또는 적합한 영양소의 적합한 공급원의 존재, 적합한 온도의 사용, 및 임의로 적합한 유도 인자 또는 화합물의 존재 (예를 들어 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 유도성 프로모터의 제어 하에 존재할 경우)를 포함할 수 있고; 이들은 모두 당업자에 의해 선택될 수 있다. 다시, 상기 조건 하에서, 본 발명의 폴리펩티드는 구성적 방식으로, 일시 방식으로, 또는 적합하게 유도된 경우에만 발현될 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드는 (먼저) 미성숙 형태 (상기 언급된 바와 같은)로 생성되고, 이어서 사용되는 숙주 세포/숙주 유기체에 따라 번역후 변형에 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드는 다시 사용되는 숙주 세포/숙주 유기체에 따라 글리코실화될 수 있다.
본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드는 그 자체로 공지된 단백질 단리 및/또는 정제 기술, 예컨대 (예비) 크로마토그래피 및/또는 전기영동 기술, 속도차 침전 기술, 친화도 기술 (예를 들어 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드와 융합된 절단가능한 특정 아미노산 서열을 이용) 및/또는 예비 면역학적 기술 (즉 단리되는 아미노산 서열에 대한 항체를 이용)을 사용하여 숙주 세포/숙주 유기체 및/또는 상기 숙주 세포 또는 숙주 유기체가 배양된 배지로부터 단리될 수 있다.
일반적으로, 제약 용도를 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩티드 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아주반트, 및 임의로 하나 이상의 추가의 제약 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 제약 제제 또는 조성물로서 제제화될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 상기 제제는 경구 투여, 비경구 투여 (예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내 주입에 의한), 국소 투여, 흡입에 의한 투여 (예를 들어, 연무기, 계량 투여 흡입기 (MDI) 또는 건조 분말 흡입기 (DPI)를 통한 또는 비내 경로를 통한), 피부 패치, 이식물, 좌제, 설하 경로 등에 의한 투여에 적합한 형태로 존재할 수 있다. 상기 적합한 투여 형태 (투여 방식에 따라 고체, 반-고체 또는 액체일 수 있는) 및 그의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체는 당업자에게 명백할 것이고, 본원에서 추가로 설명된다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 바람직하게는 적어도 하나의 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인, 보다 바람직하게는 본 발명에 따른 적어도 하나의 이중 파라토프성 나노바디, 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제 (즉, 적합한 제약 용도를 위해), 및 임의로 하나 이상의 추가의 활성 물질을 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방식으로 제제화되고 투여될 수 있고, 그에 대해서는 상기 언급된 일반적인 배경 기술 (및 특히 WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 및 WO 08/020079) 및 표준 안내서, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)], [Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)]; 또는 [Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (예를 들어, 252-255 페이지 참조)]을 참조한다.
예를 들어, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 통상적인 항체 및 항체 단편 (ScFv 및 디아바디 포함) 및 다른 제약 활성 단백질에 대해 그 자체로 공지된 임의의 방식으로 제제화되고 투여될 수 있다. 상기 제제 및 그의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 비경구 투여 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 체강내, 동맥내 또는 경막내 투여) 또는 국소 (즉 경피 또는 피부내) 투여에 적합한 제제를 포함한다.
비경구 투여용 제제는 예를 들어 주입 또는 주사에 적합한 멸균 용액, 현탁액, 분산액 또는 에멀젼일 수 있다. 상기 제제에 적합한 담체 또는 희석제는 예를 들어 WO 08/020079의 143 페이지에서 언급된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 대체로, 수성 용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다.
이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 나노바디를 포함하는 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 또한 유전자 요법 전달 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,399,346을 참조한다. 유전자 요법 전달 방법을 이용하여, 본 발명의 이중 파라토프성 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 형질감염된 1차 세포를 특정 장기, 조직, 이식편, 종양 또는 세포를 표적화 하기 위해 조직 특이적 프로모터로 추가로 형질감염시키고, 세포 소기관에 편재된 (subcellularly localized) 발현을 위한 신호 및 안정화 서열로 추가로 형질감염시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 이중 파라토프성 및 폴리펩티드, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 나노바디는 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 비활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 조합되어 전신, 예를 들어, 경구 투여될 수 있다. 이는 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐에 봉입되거나, 정제로 압축되거나, 또는 환자의 식품과 직접 배합될 수 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 하나 이상의 부형제와 조합되고, 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 상기 조성물 및 제제는 적어도 0.1%의 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 나노바디를 함유하여야 한다. 조성물 및 제제 내의 그의 비율은 물론 변할 수 있고, 편리하게는 제시된 단위 투여 형태의 중량의 약 2 내지 약 60%일 수 있다. 상기 치료상 유용한 조성물 내의 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드는 효과적인 투여 수준이 얻어지도록 하는 것이다.
정제, 트로키제, 알약, 캡슐 등은 또한 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제 및 감미제 또는 향미제, 예를 들어 WO 08/020079의 143-144 페이지에 언급된 것을 함유할 수 있다. 단위 투여 형태가 캡슐인 경우, 이것은 상기 종류의 물질 이외에 액체 담체, 예컨대 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질은 코팅으로서 또는 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 달리 변경하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약, 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 쉘락 (shellac) 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르제는 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 폴리펩티드, 감미제로서 수크로스 또는 프럭토스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 향미제, 예컨대 체리 또는 오렌지 향미제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태의 제조에 사용되는 임의의 물질은 제약상 허용되고 사용되는 양에서 실질적으로 비-독성이어야 한다. 또한, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 폴리펩티드는 지효성 제제 및 장치 내에 포함될 수 있다.
경구 투여용 제제 및 제형에는 또한 본 발명의 구축물이 위 환경을 견디고 장으로 통과할 수 있도록 하는 장용 코팅이 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 경구 투여용 제제 및 제제는 위장관의 임의의 요구되는 부분 내로의 전달을 위해 적합하게 제제화될 수 있다. 또한, 적합한 좌제가 위장관 내로 전달을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 폴리펩티드는 또한 WO 08/020079의 144 및 145 페이지에 추가로 기재된 바와 같이 주입 또는 주사에 의해 정맥 내 또는 복강 내로 투여될 수 있다.
국소 투여를 위해, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 폴리펩티드는 순수한 형태로, 즉, 액체일 때 적용될 수 있다. 그러나, WO 08/020079의 145 페이지에 추가로 기재된 바와 같이 고체 또는 액체일 수 있는 피부에 허용되는 담체와 조합되어 조성물 또는 제제로서 피부에 투여하는 것이 일반적으로 바람직하다.
일반적으로, 액체 조성물, 예컨대 로션 내의 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 폴리펩티드의 농도 약 0.1-25 wt-%, 바람직하게는 약 0.5-10 wt-%일 것이다. 반-고체 또는 고체 조성물, 예컨대 겔 또는 분말 내의 농도는 약 0.1-5 wt-%, 바람직하게는 약 0.5-2.5 wt-%일 것이다.
치료에 사용하기 위해 필요한 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 폴리펩티드의 양은 선택된 특정 이중 파라토프성 나노바디 또는 폴리펩티드뿐만 아니라 투여 경로, 치료되는 병태의 특성 및 환자의 연령 및 상태에 따라 상이할 것이고, 최종적으로 담당의 또는 임상의의 판단에 따라 결정될 것이다. 또한, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 폴리펩티드의 투여량은 표적 세포, 종양, 조직, 이식편, 또는 장기에 따라 상이하다.
요구되는 용량은 편리하게 단일 용량으로 또는 적절한 간격, 예를 들어, 1일당 2, 3, 4회 이상의 하위 용량으로 투여되는 분할 용량으로 제시될 수 있다. 하위 용량 자체는 예를 들어 많은 별개의 대략적으로 이격된 투여;, 예컨대 취입기로부터의 다수의 흡입 또는 눈 내로의 많은 점적제의 적용으로 추가로 분할될 수 있다.
투여 요법은 장기간, 1일 치료를 포함할 수 있다. "장기간"은 적어도 2주, 바람직하게는, 수 주, 수 개월, 또는 수 년의 기간을 의미한다. 상기 투여량 범위의 필요한 변형은 당업자가 본원의 교시내용을 고려하여 단지 통상적인 실험만을 사용하여 결정할 수 있다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA] 참조). 투여량은 또한 임의의 합병증의 사건시에 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
또 다른 그의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 유효량의 폴리펩티드 또는 제약 조성물, 바람직하게는 본 발명에 따른 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 나노바디 또는 이를 함유하는 조성물을 투여함으로써 CXCR2 신호 전달의 이상 기능을 수반하는 질환 또는 병태의 치료 방법에 관한 것이다. 본원에서 논의되는 바와 같이, CXCR2 신호 전달은 폐 실질의 파괴를 야기하는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)으로 고통받는 환자의 폐에서 염증성 반응을 매개한다. COPD로 고통받는 환자의 폐에서 증가된 수로 관찰되는 백혈구의 이동은 IL-8, Gro-α, β, γ, EMA 78 및 GCP-2를 포함하는 몇몇 리간드에 결합하는 그 세포의 표면 상의 CXCR2에 의해 매개된다. 폐 내의 호중구 수의 증가는 질환의 중증도와 연관성이 있다. 추가로, Gro-α 농도는 COPD 환자의 유도된 가래 및 기관지 세척 (BAL) 액에서 현저하게 증가한다. 따라서, CXCR2 길항은 상기 질환의 고통스러운 증상을 예방, 치료 또는 완화할 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명은 이중 파라토프성 폴리펩티드, 예컨대 본 발명의 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 나노바디 및 특히 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, COPD 또는 COPD 악화의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 COPD 또는 COPD 악화의 치료를 위한, 이중 파라토프성 나노바디 및 이를 함유하는 조성물을 포함하는 상기 이중 파라토프성 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 특히 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 나노바디 및 그의 조성물이 또한 CXCR2 신호 전달의 이상 기능이 수반되는 다른 질환, 예를 들어, 호흡관의 다른 병태, 예컨대 낭성 섬유증, 중증 천식, 천식의 악화, 알러지성 천식, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 특발성 폐 섬유증, 기도 개형, 폐쇄성 세기관지염 증후군 또는 기관지폐 이형성증의 치료에 유용함은 숙련된 독자에게 쉽게 명백할 것이다.
본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 예를 들어, 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 나노바디 및 그의 제약 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 추가의 질환 및 병태는 아테롬성 동맥경화증, 사구체신염, 염증성 장 질환 (크론병), 혈관신생, 및 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 당뇨병성 신경병증을 포함하는 새로운 혈관 발생을 특징으로 하는 질환, 다발 경화증, 건선, 연령 관련 황반 변성 질환, 눈 베체트 질환, 포도막염, 특발성 폐 동맥 고혈압 (PAH), 가족성 PAH 및 관련 PAH를 포함하는 PAH, 만성 염증성 질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 비-소세포 암종, 결장암, 췌장암, 식도암, 난소암, 유방암, 고형 종양 및 전이, 흑색종, 간세포 암종 또는 허혈 재관류 손상이다.
본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 예를 들어, 이중 파라토프성 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 나노바디 및 그의 제약 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 추가의 질환 및 병태는 겸상 적혈구 질환에서 용혈성 수혈 유도 혈관 폐색 위기, 허혈증/재관류 손상, 급성 뇌졸중/심근 경색, 폐쇄성 두부 손상, 외상후 염증 및 인슐린 내성 당뇨병이다.
상기 방법을 위해, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 폴리펩티드 및/또는 그를 포함하는 조성물은 사용되는 특정 제약 제제 또는 조성물에 따라 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이중 파라토프성 나노바디 및 /또는 폴리펩티드 및/또는 그를 포함하는 조성물은 예를 들어 다시 사용되는 특정 제약 제제 또는 조성물에 따라 경구, 복강내 (예를 들어 정맥내, 피하, 근육내, 또는 위장관을 우회하는 임의의 다른 투여 경로를 통해), 비내, 경피, 국소, 좌제에 의해, 흡입에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로 COPD에 대해, 흡입은 바람직한 경로가 아니다. 임상의는 개별 환자의 필요에 따라 적합한 투여 경로 및 상기 투여에 사용되는 적합한 제약 제제 또는 조성물을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 폴리펩티드 및/또는 그를 포함하는 조성물은 예방 또는 치료되는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료에 적합한 치료 요법에 따라 투여된다. 임상의는 일반적으로 예방 또는 치료되는 질환 또는 장애, 치료되는 질환의 중증도 및/또는 그의 증상의 중증도, 사용되는 본 발명의 특정 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드, 사용되는 특정 투여 경로 및 제약 제제 또는 조성물, 환자의 연령, 성별, 체중, 음식, 전반적인 상태, 및 임상의에게 잘 알려진 유사한 인자와 같은 인자에 따라 적합한 치료 요법을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 본원에 언급된 질환 및 장애, 특히 COPD의 예방 및/또는 치료를 위해, 투여되는 양은 본 발명의 특정 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드의 효력, 특정 투여 경로 및 사용되는 특정 제약 제제 또는 조성물에 따라 결정될 것이다. 일반적으로, 1 그램 내지 0.01 마이크로그램/kg (체중)/일, 바람직하게는 0.1 그램 내지 0.1 마이크로그램/kg (체중)/일, 예컨대 약 1, 10, 100 또는 1000 마이크로그램/kg (체중)/일의 양으로, 연속적으로 (예를 들어, 주입에 의해), 단일 1일 용량으로서 또는 하루 동안 다수의 분할 용량으로서 투여될 것이다. 임상의는 일반적으로 본원에 언급된 인자에 따라 적합한 1일 용량을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 특정 경우에 임상의가 예를 들어 상기 언급된 인자 및 그의 전문가적인 판단을 기초로 하여 상기 양으로부터 변경된 양을 선택할 수 있음은 명백할 것이다.
본 발명의 이중 파라토프성 나노바디, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 추가의 제약 활성 화합물 또는 성분과 조합되어, 즉 상승 효과를 유도하거나 유도하지 않을 수 있는 조합 치료 요법으로서 사용될 수 있다. 다시, 임상의는 예를 들어 상기 언급된 인자 및 그의 전문가적인 판단을 기초로 하여 상기 추가의 화합물 또는 성분, 및 적합한 조합 치료 요법을 선택할 수 있을 것이다.
예를 들어, 본 발명의 이중 파라토프성 폴리펩티드, 예컨대 이중 파라토프성 나노바디를 COPD에 대한 통상적인 치료법, 예컨대 단기 및 장기 지속성 β-아드레날린성 기관지확장제, 흡입 항콜린작용제 (무스카린 길항제) 및 흡입 코티코스테로이드와 조합하는 것이 가능할 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 치료 요법의 효과는 임상의에게 명백할 바와 같이 관련 질환 또는 장애에 대해 그 자체로 공지된 임의의 방식으로 결정 및/또는 추적될 수 있다. 임상의는 또한 적절한 경우에 및 사안별로, 요구되는 치료 효과를 달성하기 위해, 원치 않는 부작용을 방지, 제한 또는 저하시키기 위해, 및/또는 한편으로 요구되는 치료 효과의 달성과 다른 한편으로 원치 않는 부작용을 방지, 제한 또는 저하시키는 것 사이의 적절한 균형을 달성하기 위해 특정 치료 요법을 조정 또는 변경할 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 요법은 요구되는 치료 효과가 달성될 때까지 및/또는 요구되는 치료 효과가 유지되어야 하는 만큼 오랫동안 수행될 것이다. 다시, 이것은 임상의가 결정할 수 있다.
치료되는 대상체는 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유동물, 보다 특히 인간이다. 당업자에게 명백할 바와 같이, 치료할 대상체는 본원에 언급된 질환 및 장애에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 사람일 것이다.
본 발명은 이제 다음 비-제한적인 바람직한 측면, 실시예 및 도면에 의해 추가로 설명될 것이다.
본원에 언급되는 모든 간행물은 본원에 참고로 포함된다.
기탁물 정보
표 32에 제시된 서열 최적화된 나노바디의 폴리펩티드를 코딩하는 삽입물 (insert)을 갖는 플라스미드 DNA의 6개 기탁물을 노바티스 파르마 아게 (Novartis Pharma AG, 스위스)가 2010년 6월 15일에 DSMZ (Deutsche SammlUng von Mikroorganismen and Zallkulturem GmbH, Inhoffenstrasse, 7B, D-38124, Braunschweig, Germany)에 기탁하였다. 기탁은 1997년 4월 28일의 특허목적상 미생물 기탁의 세계적 승인에 관한 부다페스트 조약 (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Proceddure)에 따라 이루어졌고, 다음과 같은 기탁 번호를 갖는다:
Figure pat00001
1. 인간 및 시노 CXCR2 클로닝
Figure pat00002
pcDNA3.1(+) (인비트로겐 (Invitrogen), V790-20)은 다양한 포유동물 세포주 내에서 고-수준의 구성적 발현을 위해 설계된다. 이것은 인간 사이토메갈로바이러스 최조기 프로모터, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호, 포유동물 세포를 위한 네오마이신 선택 마커, 및 이. 콜라이 내에서 선택을 위한 암피실린 내성 유전자를 함유한다.
pVAX1 (인비트로겐, V260-20)은 DNA 백신을 위해 설계된 플라스미드 벡터이다. 이것은 인간 사이토메갈로바이러스 최조기 프로모터, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 이. 콜라이 내에서 선택을 위한 카나마이신 내성 유전자를 함유한다.
구축물 :
수용체 벡터 구축
인간 CXCR2
(N-말단 3xHA-태그)		 pcDNA4/TO 3개의 HA 태그를 코딩하는 DNA 서열에 이어 huCXCR2 서열을 서브클로닝하고, pcDNA4/TO 내에서 5' 및 3' 단부에서 각각 HindIII 및 XhoI 제한 효소 부위로 막았다
인간 N-말단 CCR9 키메라 CXCR2
(N-말단 3xHA-태그)		 pcDNA4/TO 3개의 HA 태그를 코딩하는 DNA 서열에 이어 huCCR9에 대한 처음 39개 아미노산, TEV 프로테아제 부위 및 huCXCR2 서열 - N-말단 43개 아미노산을 서브클로닝하고, pcDNA4/TO 내에서 5' 및 3' 단부에서 각각 HindIII 및 XhoI 제한 효소 부위로 막았다
인간 Δ1-17 CXCR2
(N-말단 3xHA-태그)		 pcDNA4/TO 3개의 HA 태그를 코딩하는 DNA 서열에 이어 N-말단 17개 아미노산이 결여된 huCXCR2 서열을 서브클로닝하고, pcDNA4/TO 내에서 5' 및 3' 단부에서 각각 HindIII 및 XhoI 제한 효소 부위로 막았다
인간 CXCR2 pXoon 인간 CXCR2 (hCXCR2) cDNA (GENBANK:L19593)를 EcoRI 절단 부위를 함유하는 5' 프라이머 및 NotI 부위를 함유하는 3' 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 생성물을 pXOON 플라스미드 벡터 내로 라이게이팅하였다.
시노몰거스 CXCR2 pcDNA3.1 시노몰거스 CXCR2 cDNA를 비장/흉선 시노몰거스 cDNA 라이브러리로부터 증폭하였다. NotI 및 XhoI 제한 효소 부위를 PCR을 통해 첨가하고, 생성되는 단편을 pcDNA3.1 내로 클로닝하였다.
인간 CXCR2 pVAX1 pXoon_hCXCR2에 대한 PCR (NheI-NotI)
시노몰거스 CXCR2 pVAX1 pcDNA3.1_cCXCR2로부터 NheI-XhoI
인간 Δ1-17 CXCR2 pVAX1 pcDNA3.1_3x-HA-Δ1-17-hCXCR2에 대한 PCR (HindIII-XhoI)
인간 Δ1-17 CXCR2
(N-말단 3xHA-태그)		 pcDNA3.1 pCR4Blunt-TOPO_3xHA-Δ1-17-hCXCR2로부터 HindIII-XhoI
인간 CXCR2 pcDNA3.1 pVAX1_hCXCR2로부터 NheI-XhoI
2. 인간 및 시노몰거스 CXCR2 를 발현하는 CHO , CaKi , RBL 및 HEK293T 세포주의 확립
Figure pat00003
CHO - K1 Δ1-17 인간 CXCR2 (N-말단 3 xHA 태그)
CHO-K1 세포를 아막사 (Amaxa) 전기천공 시스템 (솔루션 T에서 프로그램 U 23)을 이용하여 플라스미드 pcDNA3.1_3xHA-Δ1-17-hCXCR2로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포 풀 (pool)을 형질감염 후 제2일로부터 선택 압력 (1000 ㎍/mL G418) 하에 유지하였다. 8일 후에, FMAT Blue-표지된 인간 Gro-α를 사용하여 인간 CXCR2 양성 집단을 확인하였다. 인간 Gro-α의 FMAT Blue 표지 (바이오소스 (Biosource), PHC1063)는 제조자의 지시 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 4328408)에 따라 FMAT Blue 단일기능성 반응성 염료 키트를 사용하여 이루어졌다. 단일 세포를 FACSaria (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences))를 사용하여 96-웰 세포 배양 플레이트 내로 분류하였다. 성장하는 클론을 FMAT Blue-표지된 인간 Gro-α를 사용하여 FACSarray (비디 바이오사이언시즈) 장치 상에서 Δ1-17 인간 CXCR2 발현에 대해 시험하였다. 최고 발현을 갖는 CHO-K1 클론을 선택하였다 (9000의 MCF 값).
HEK293T 시노몰거스 CXCR2
HEK293T 세포를 FuGene HD 형질감염 시약 (로슈 (Roche))을 사용하여 플라스미드 pcDNA3.1_cCXCR2로 형질감염시켰다. 형질감염의 2일 후에, 세포를 50 nM FMAT Blue 표지된 Gro-α를 사용하여 FACSarray (비디 바이오사이언시즈) 장치 상에서 cCXCR2 발현에 대해 시험하였다. 우수한 발현을 갖는 세포 (약 12000의 MCF 값)를 추가로 사용하였다.
RBL -2 H3 시노몰거스 CXCR2
래트 호염기구 백혈병 세포 (RBL-2H3) (37℃/5% CO2에서 성장시키고 1X 비-필수 아미노산, 0.15% 중탄산나트륨, 1 mM 피루브산나트륨 및 15% 태소 혈청 (인비트로겐)을 보충한 MEM 이글 (Eagle) 배지 (인비트로겐)내에서 통상적으로 계대배양함)를 제조자의 프로토콜에 따라 전기천공 (아막사 바이오시스템즈 (Amaxa Biosystems))에 의해 핵형질감염 (nucleofection)시켰다. 형질감염된 세포를 37℃/5% CO2에서 인큐베이팅하고, 형질감염의 24시간 후에, 제네티신 (Geneticin)을 1 mg/mL의 최종 농도로 첨가함으로써 항생제 선택을 개시하였다. 형질감염된 세포를 성장시키고, 선택 배지 내에서 3-5일 동안 계대배양한 후, 96-웰 플레이트 내로 연속 희석함으로써 단일-세포 분류하였다. 대략 2주 후에, 활성적으로 성장하는 콜로니를 팽창시키고, 시노CXCR2 전사체 발현에 대해 후속적으로 분석하였다. 이어서, 양성 클론을 분석을 위해 추가로 팽창시켰다.
CHO - Trex ( HA )3- huCXCR2 및 ( HA )3 huCCR9 - CXCR2 하이브리드 ( hybrid )
차이니즈 햄스터 난소 T-Rex (T-Rex™-CHO, 인비트로겐, #R718-07)을 37℃에서 10% 테트라사이클린-비함유 태소 혈청 (FBS) (Biosera), 1% 페니실린/스트렙토마이신 & 10 μg/mL의 블라스티시딘 (Blasticidin)을 보충한, 2 mM L-글루타민을 함유하는 햄 (Ham) F12 배지 내에서 단층 배양액으로 유지하였다. 상기 테트라사이클린-조절된 발현 (T-Rex™) 세포주는 테트라사이클린 억제유전자 (repressor: TetR)을 안정적으로 발현한다. 이어서, 두 CXCR2 구축물 모두를 발현하는 안정한 세포주는 핵형질감염 절차 (세포주 핵형질감염 키트 T, 아막사 바이오시스템, 프로그램 U-23)를 이용하여 생산하였다. 형질감염된 세포를 37℃/5% CO2에서 인큐베이팅하고, 형질감염의 48시간 후에 300 ㎍/mL의 제오신 (Zeocin)으로 처리하였다. 양성 형질전환체의 선택을 허용하기 위해 세포를 2주 동안 제오신의 존재 하에 배양하고, 이 후에 Mo-Flo FACS 분류기를 사용하여 단일-세포 분류를 수행하였다. 2주 후에, 300 ㎍/mL의 제오신 농도에서 그들의 규정 배지 내에 유지시키면서 활성적으로 성장하는 콜로니를 팽창시켰다.
3. 인간 Gro -α, 시노몰거스 Gro -α, 인간 IL -8, 인간 ENA -78
NVTS - IL-8, ENA-78, 시노몰거스 Gro-α
리간드 해설 공급원
인간 GROα 재조합 바이오소스 (PHC 1063)
인간 IL-8 재조합 노바티스 비엔나
인간 ENA-78 재조합 페프로테크 엘티디 (Peprotech ltd) (300-22)
시노 GROα 재조합 알맥 사이언시즈 (ALMAC Sciences)
4. 펩티드
인간 및 시노몰거스 CXCR2의 상이한 N-말단 및 세포외 루프 (EL) 스트레치 (stretch)를 제시하는 펩티드는 바켐 (Bachem)으로부터 주문하였다 (표 5). "고리형"으로 지시된 펩티드에서, 처음 및 마지막 아미노산은 시스테인 잔기로 교체되고, 야생형 서열의 천연 생성 내부 시스테인은 류신 잔기로 교체되었다. 이들 펩티드는 측면에 접하는 시스테인 잔기를 통해 고리화되었다.
Figure pat00004
5. 면역화
3마리의 라마를 인간 CXCR2를 발현하는 포유동물 세포로 7 내지 9회 면역화시키고, 1마리의 라마를 시노몰거스 CXCR2를 발현하는 포유동물 세포로 6회 면역화시켰다. 상기 요법에 이어 (불)완전 프로인트 (Freund) 아주반트 (Adjuvant) 내에 혼합된 펩티드-키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin; KLH) 접합체 칵테일을 4회 투여하였고, 상기 펩티드는 인간 및 시노몰거스 CXCR2 둘 모두의 세포외 루프 번호 2 및 3를 제시한다 (표 5 참조). 8마리의 다른 라마를 인간 전장 CXCR2 또는 pVAX1로부터 발현된 Δ1-17 CXCR2를 코딩하는 DNA로 4 내지 5회 면역화시킨 후, 인간 전장 CXCR2를 발현하는 포유동물 세포를 1회 투여하였다. 추가로 3마리의 라마를 pVAX1로부터 발현된 시노몰거스 CXCR2를 코딩하는 DNA로 4회 면역화시킨 후, 시노몰거스 CXCR2를 발현하는 포유동물 세포를 1회 투여하였다. 면역 혈액 및 림프절 샘플을 각각의 항원의 투여 4 및 8일 후에 취하였다.
6. 라이브러리 구축
cDNA 샘플을 면역 혈액 및 림프절 샘플의 총 RNA 제제로부터 제조하였다. 나노바디를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 프라이머 ABL051, ABL052 및 ABL003을 사용하는 1-단계 RT-PCR 반응으로 인간 또는 시노몰거스 CXCR2로 면역화시킨 모든 라마의 cDNA 샘플로부터 증폭하였다. 프라이머 서열을 표 6에 제시한다. 샘플 내의 IgG2 및 IgG3 cDNA로부터 증폭된 700bp 앰플리콘을 겔로부터 단리하고, 후속적으로 SfiI 제한 효소 부위를 함유하는 ABL050 프라이머, 및 ABL003 프라이머를 사용하는 네스티드 (nested) PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. PCR 생성물을 후속적으로 SfiI 및 BstEII (VHH 유전자의 FR4 내에 천연 발생하는)으로 소화시키고, 파지미드 벡터 pAX50의 상응하는 제한 부위 내로 라이게이팅시켜, 에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli) TG-1 내에서 전기천공 후에 라이브러리를 얻었다. pAX50은 LacZ 프로모터, 콜리파지 pIII 단백질 코딩 서열, 암피실린 또는 카르베니실린에 대한 내성 유전자, 멀티클로닝 부위 및 gen3 리더 서열을 함유하는 pUC119로부터 유래된 발현 벡터이다. 나노바디® 코딩 서열과 함께, 벡터는 C-말단 c-myc 태그 및 (His)6 태그를 코딩하였다. 파지미드 벡터는 geneIII 생성물과의 융합 단백질로서 개별 나노바디를 발현하는 파지 입자의 생산을 허용한다.
Figure pat00005
7. 선택
박테리오파지의 표면 상에 발현된 상기 언급한 pAX50 나노바디 라이브러리를 CXCR2 에피토프를 제시하는 펩티드, 막 추출액 및 전체 세포를 사용하여 선택하였다.
펩티드를 사용하는 선택은 뉴트라비딘-코팅된 (피어스 (Pierce), 31000) 맥시소프 (Maxisorp) 미량역가 플레이트 (넝크 (Nunc), 430341) 상에 포획된 0 - 1000 nM의 비오티닐화 펩티드 (표 5 참조) 상에서 파지 라이브러리를 인큐베이팅하는 것으로 이루어졌다. 별법으로, 파지 라이브러리를 용액 내에서 10 nM 비오티닐화 펩티드와 함께 인큐베이팅한 후, 스트렙타비딘 코팅된 다이나비드 (Dynabead) (인비트로겐, 112-06D) 상에서 펩티드-파지 복합체의 포획을 수행하였다. 차단은 1% 카제인을 보충한 PBS를 사용하여 수행하였다. 라이브러리로부터 제조된 파지를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이팅하였다 (0.1% 카제인 및 0.1% tween20을 보충한 PBS 내에서). 비결합된 파지를 세척 제거하고 (0.05% tween20을 보충한 PBS를 사용하여); 결합된 파지를 15분 동안 트립신 (PBS 내의 1 mg/ml)을 첨가하여 용리시켰다. 제2 선택 라운드는 본질적으로 상기 설명된 바와 같이 수행하였다.
막 추출액을 사용하는 선택은 면역튜브 (넝크, 444474)를 인간 CXCR2를 발현하는 세포 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer), ES-145-M400UA 및 6110524400UA)로부터 제조된 50 ug/mL (총 단백질) 막 추출액으로 코팅함으로써 수행하였다. 음성 대조군으로서, 인간 FPR1을 발현하는 CHO 세포 (퍼킨 엘머, 6110527400UA)로부터 제조된 막 추출액을 평행으로 코팅하였다. 차단은 4% 마벨 (Marvel) 탈지 분유를 보충한 PBS를 사용하여 수행하였다. 파지를 2시간 동안 인큐베이팅하였다 (1% 마벨 탈지 분유를 보충한 PBS 내에서). 비결합된 파지를 PBS로 세척 제거하고; 결합된 파지를 15분 동안 트립신 (PBS 내의 1 mg/ml)을 첨가하여 용리시켰다. 제2 라운드 선택은 본질적으로 상기 설명된 바와 같이 수행하였다. 일부 경우에, 비관련 세포 배경 에피토프에 결합하는 파지는 파지를 대조 막 추출액으로 코팅한 연속적인 튜브 또는 웰 상에 예비-흡수시킴으로써 특이적으로 고갈시켰다. 이어서, 코팅된 인간 CXCR2 막 추출액 상의 인큐베이션을 용액 내에서 대조 막 추출액의 존재 하에 수행하였다. 다른 실험에서, 펩티드에 대한 1 또는 2 라운드의 선택에 이어 막 추출액에 대한 1 라운드의 선택을 수행하거나 그 반대로 수행하였다.
또 다른 실험 세트에서, 인간 또는 시노몰거스 CXCR2를 발현하는 1 내지 5백만개의 포유동물 세포를 파지 라이브러리와 함께 10% FBS 및 1% 마벨 탈지 분유를 보충한 PBS 내에서 인큐베이팅하였다. 형질전환되지 않은 세포주를 음성 대조군으로서 사용하였다. 비결합된 파지를 PBS로 세척 제거하고; 결합된 파지를 15분 동안 트립신 (PBS 내의 1 mg/ml)을 첨가하여 용리하였다. 제2 라운드는 본질적으로 상기 설명된 바와 같이, 그러나 제1 라운드와 상이한 세포주 배경에 대해 수행하였다.
다른 실험에서, 파지를 펩티드에 의해 제시된 영역에 결합하는 나노바디를 발현하는 파지를 고갈시키기 위해 용액 내에서 1 μΜ의 펩티드 (표 5 참조)의 존재 하에 CXCR2를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 추출액과 함께 인큐베이팅하였다.
8. 주변세포질 추출액의 제조
용리된 파지로 지수 성장하는 TG-1 세포를 감염시키고, 이어서, 이를 카르베니실린 함유 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 카르베니실린-내성 클론을 삽입물의 존재에 대해 분석하고, 양성 클론의 서열을 확인하였다. 관심있는 클론을 카르베니실린을 보충한 TB 배지 내에서 성장시키고, IPTG의 첨가에 의해 발현을 유도하였다. 37℃에서 4시간 동안 계속 발현시킨 후, 세포를 원심분리하였다. 이. 콜라이 발현 배양액으로부터 밤새 동결시킨 세포 펠렛을 PBS (원래의 배양액 부피의 1/10) 내에 용해시키고, 부드러운 진탕 조건 하에 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 1회 더 원심분리하고, 주변세포질 공간 내로 분비된 단백질을 함유하는 상청액을 저장하였다.
9. 스크리닝
주변세포질 추출액 (상기 설명된 바와 같은)을 FACS 상에서 인간 CXCR2에 대한 결합에 있어서 Gro-α와의 경쟁에 대해 분석하였다. 2x105 세포를 FACS 완충제 (PBS + 10% 태소 혈청 (시그마 (Sigma), F7524)) 내에서 주변세포질 추출액의 1/2 희석액과 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, FACS 완충제 내의 동일 부피의 6 nM의 FMAT Blue-표지된 인간 Gro-α를 첨가하고, 추가로 30분 동안 4℃에서 암소에서 계속 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충제 내에 3회 세척하고, 마지막으로 FACS 완충제 내에 재현탁하였다. 죽은 세포를 요오드화프로피듐 (시그마, P4170)로 염색하였다. 이어서, 샘플을 FACSarray (비디 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다. 표 7은 그의 주변세포질 추출액이 인간 CXCR2에 대해 Gro-α와 경쟁을 보인 나노바디를 나열한다.
Figure pat00006
또 다른 배열에서, 주변세포질 추출액을 ELISA에 의해 인간 1 내지 19 펩티드에 대한 결합에 대해 분석하였다. MaxiSorb 플레이트 (넝크, 430341)를 2시간 동안 뉴트라비딘으로 코팅한 후, 1시간 차단하였다 (PBS, 1% 카제인). 이어서, 100 nM 비오티닐화 인간 1 내지 19 펩티드를 이들 플레이트에 1시간 동안 첨가한 후 (PBS, 0.1% 카제인, 0.05% tween20), 주변세포질 추출액의 10배 희석액과 함께 1시간 인큐베이팅하였다. 비결합된 주변세포질 추출액을 세척 제거하고 (0.05% tween20을 보충한 PBS), 결합된 나노바디를 마우스 항-myc (로슈, 11667149001)에 이어 토끼 항-마우스-HRP 접합체 (다코사이토메이션 (Dakocytomation), P0260)를 사용하여 검출하였다. 표 8은 비관련 대조 나노바디에 비해 항-CXCR2 나노바디의 결합 신호의 비를 요약한다.
Figure pat00007
10. 서열
Figure pat00008
Figure pat00009
1가 나노바디의 특징규명으로 이어짐
11. 1가 나노바디의 구축
Fwd-EVQL-MfeI 및 Rev-TVSS-BstEII 프라이머를 사용하여 기능적 파지미드 클론에 대한 PCR에 의해 얻어진 나노바디 함유 DNA 단편 (표 1)을 MfeI 및 BstEII로 소화시키고, pAX 100 벡터 내로 라이게이팅시키고, 이. 콜라이 TG-1 적격 (competent) 세포 내로 형질전환시켰다. pAX100은 LacZ 프로모터, 카나마이신에 대한 내성 유전자, 멀티클로닝 부위 및 OmpA 리더 서열을 함유한 pUC119로부터 유래된 발현 벡터이다. 나노바디 코딩 서열과 함께, 벡터는 C-말단 c-myc 태그 및 His6 태그를 코딩하였다. 카나마이신 내성 클론을 삽입물의 존재에 대해 분석하고, 양성 클론의 서열을 확인하였다.
12. 소규모 발현
관심있는 나노바디를 코딩하는 발현 벡터를 함유하는 TG-1 세포를 TB 배지 + 100 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배플이 달린 (baffled) 진탕기 플라스크 내에서 성장시키고, 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 4시간 동안 37℃에서 계속 발현시켰다. 세포를 수집한 후에, 주변세포질 추출액을 제조하고, His6-태깅된 나노바디를 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 (HisTrap FF Crude, 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))에 이어 PBS 내에서 탈염 (HiPrep 26/10, 지이 헬쓰케어) 또는 겔 여과 크로마토그래피 (Superdex 75 HR16/10, 지이 헬쓰케어)에 의해 정제하였다.
13. 리간드 경쟁 검정
정제된 1가 항-CXCR2 나노바디를 인간 및 시노몰거스 CXCR2에 대한 FACS 리간드 경쟁 검정으로 3 nM FMAT-Blue-표지된 Gro-α에 대해 적정하였다 (표 10). 인간 CXCR2에 대해 차단 효력은 두자릿수 nM 내지 nM 미만 범위인 반면, 시노몰거스 CXCR2에 대해 한자릿수 내지 두자릿수 nM 범위이다.
Figure pat00010
14. 재조합 세포주를 사용하는 기능 검정
(1) 세포내 칼슘의 효능제 유도된 방출의 측정 ( FLIPR )
인간 또는 시노몰거스 CXCR2 수용체를 발현하는 RBL 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고, 37℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 실험일에, 세포에 Fluo-4 염료를 30분 동안 37℃에서 부하한 후, 정제된 1가 항-CXCR2 나노바디와 함께 30분 인큐베이팅하였다. 마지막으로, Gro-α의 첨가를 형광측정 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR)를 사용하여 수행한 후, 세포내 칼슘의 방출에 대응하는 형광 신호를 검출하였다. 선택도 검정은 인간 CXCR1을 발현하는 L2071 세포를 사용하여 수행하였다. 검정 프로토콜은 CXCR2에 대해 설명한 것과 동일하게 유지되었지만, IL-8을 효능제로서 사용하였다. 평균 IC50 값의 요약을 표 11에 제시하고, 추가로, 시험한 어떠한 나노바디도 시험한 농도 (1 μΜ 최대 농도)에서 CXCR1 수용체에서 세포내 칼슘의 효능제 유도된 방출의 임의의 억제를 보이지 않았다.
(2) [ 35 S] GTP γS의 효능제 자극된 축적의 측정
정제된 1가 항-CXCR2 나노바디를 96-웰 플레이트 내에서 Gro-α, GDP, SPA 비드 및 인간 CXCR2 수용체를 발현하는 CHO 세포로부터 제조된 CHO-CXC2 막과 함께 60분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, [35S]GTPγS를 첨가하고 추가로 60분 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 플레이트를 원심분리한 후 탑카운트 (Topcount) 상에서 판독하였다. 평균 IC50 값의 요약을 표 11에 제시한다.
Figure pat00011
15. 1차 호중구를 사용하는 기능 검정
(1) 인간 호중구 전체 혈액 형상 변화 검정 ( hWBSC )
공여자는 전신 약물을 투약하지 않은 건강한 정상 지원자였다 (노바티스 호샴 (Novartis Horsham) 공여자 패널). 52 mM EDTA (멸균)로 항응고 처리한 전체 혈액을 1 mL EDTA 대 9 mL 혈액의 비로 수집하였다. 혈액을 실온에서 수집하고 사용 전에 37℃로 예온하였다. 80 ㎕의 전체 혈액을 CXCR2 나노바디와 함께 10 min 동안 실온에서 예비-인큐베이팅한 후 (용량 반응당 10개 점 (0.03-1.144 x 10-7 μΜ), 케모카인으로 자극하였고; 10 ㎕ rhGROα (2 nM 근사 EC70 농도)를 10 ㎕ 형상 변화 검정 완충제를 첨가한 제로 (zero) 화합물을 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 샘플을 부드럽게 진탕하고, 추가로 5분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 튜브를 얼음 상에 놓고, 250 ㎕의 빙냉 최적화된 CellFix™ 용액을 부드럽게 진탕시킨 튜브에 첨가하고, 추가로 5분 동안 인큐베이팅하고, 그 후 1.4 mL의 1X 염화암모늄 용해 용액을 모든 튜브에 첨가하고, 얼음 상에서 추가로 20분 동안 방치하였다. 적혈구 용해 후에, 샘플을 FACSCalibur 유동 세포측정기 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson)) 상에서 분석하였다. 세포 집단을 전면 산란검출기 (scatter)/측면 산란검출기 (FSC/SSC) 게이팅 (gating)에 이어, 제1 플롯으로부터 게이팅된 과립구를 사용하는 FSC/FL-2 플롯에 의해 확인하였다. 호중구는 FL-2 플롯 상에서 호산구로부터 구분되었고, 이것은 후자가 더 높은 자가형광을 갖기 때문이다. 샘플당 5000 사건이 계수되었다.
(2) 인간 호중구 화학주성 검정
공여자는 전신 약물을 투약하지 않은 건강한 정상 지원자였다 (노바티스 호샴 공여자 패널). 52 mM EDTA (멸균)로 항응고 처리한 전체 혈액을 1 mL EDTA 대 9 mL 혈액의 비로 수집하였다. 백혈구를 표준 프로토콜을 이용하여 단리하였다: 4% 덱스트란을 20 mL 항응고 처리한 혈액에 첨가하고, 부드럽게 혼합한 후, 얼음 상에서 30 min 동안 인큐베이팅하여, 적혈구를 침전시켰다. 이어서, 말초 혈액 단핵 세포 (PMN)를 함유하는 상청액을 Ficoll-Paque® 밀도 구배 상에 적층시키고, 300 x g에서 25 min 동안 18℃에서 원심분리하였다. PMN 풍부 분획을 500 ㎕ 1X PBS 내에 재현탁하고, 저장성 쇼크를 이용하여 적혈구 용해를 수행하였다. 20 mL 빙냉 멸균 내독소-비함유 증류수를 펠렛에 첨가하고, 30-40초 동안 용해가 일어나도록 한 후, 20 mL 2X PBS를 첨가하였다. 샘플을 부드럽게 혼합하고, 300 x g에서 10분 동안 18℃에서 원심분리하여 과립구를 얻었다. 과립구 펠렛을 500 ㎕ 1x PBS 내에 재현탁하고, 50 mL의 x1 PBS로 2회 세척하였다. 과립구 펠렛을 RPMI 1640 (pH 7.4) + 2.5% FBS 내에 재현탁하고, 계수하고, 2e6/mL의 최종 농도로 희석하였다. 3 ㎛ PET 막 (벡톤 디킨슨)을 갖는 트랜스웰 플레이트를 사용하여 이동을 측정하였다. 간단히 설명하면, 6 nM의 GROα (EC80-EC100)를 플레이트의 하부 웰 (1000 ㎕/웰)에 첨가한 후, 멀티웰 삽입물을 위치로 낮춘 후, 가변 농도의 나노바디 (1가 파라토프에 대해 0.13-1000 nM 또는 이중 파라토프에 대해 0.6 pM-30 nM)와 함께 30분 동안 RT에서 예비-인큐베이팅한 PMN을 삽입물에 첨가하였다 (500 ㎕/웰). 이어서, 플레이트를 37℃에서 90분 동안 인큐베이팅하고, 하부 챔버로 이동한 세포를 FACSCalibur 유동 세포측정기를 사용하여 계수하였다. 유동 세포측정기는 샘플당 20초의 설정 시간 동안 FSC/FL-2 플롯 상에서 R2 게이트 내의 사건의 수를 계수하도록 설정하였다.
(3) 시노몰거스 호중구 전체 혈액 형상 변화 검정 (시노 WBSC )
3.8% 시트르산나트륨 (멸균)으로 항응고 처리한 전완 또는 다리로부터 취한 정맥 혈액을 1 mL 시트르산나트륨 대 9 mL 혈액의 비로 첨가하였다. 혈액을 실온에서 수집하고 사용 전에 37℃로 예온하였다. 80 ㎕의 전체 혈액을 CXCR2 나노바디와 함께 10 min 동안 실온에서 예비-인큐베이팅한 후 (용량 반응당 10개 점 (0.03-1.144 x 10-7 μΜ), 케모카인으로 자극하였고; 10 ㎕ rhGROα (30 nM 근사 EC70-90 농도)를 10 ㎕ 형상 변화 검정 완충제를 첨가한 제로 화합물을 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 샘플을 부드럽게 진탕하고, 추가로 5분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 튜브를 얼음 상에 놓고, 250 ㎕의 빙냉 최적화된 CellFix™ 용액을 부드럽게 진탕시킨 튜브에 첨가하고, 추가로 5분 동안 인큐베이팅하고, 그 후 2 mL의 용해 완충제 (시그마 알드리치 (Sigma Aldrich) #R7757)를 모든 튜브에 첨가하고, 얼음 상에서 추가로 40-60분 동안 방치하였다. 적혈구 용해 후에, 샘플을 FACSCalibur 유동 세포측정기 (벡톤 디킨슨) 상에서 분석하였다. 세포 집단을 전면 산란검출기/측면 산란검출기 (FSC/SSC) 게이팅에 이어, 제1 플롯으로부터 게이팅된 과립구를 사용하는 FSC/FL-2 플롯에 의해 확인하였다. 호중구는 FL-2 플롯 상에서 호산구로부터 구분되었고, 이것은 후자가 더 높은 자가형광을 갖기 때문이다. 샘플당 5000 사건이 계수되었다.
Figure pat00012
다가 나노바디
16. 2가 나노바디의 구축
2가 나노바디를 구축하기 위해 2가지 방안을 사용하였다.
PCR 증폭을 1가 빌딩 블록을 코딩하는 플라스미드 DNA에 대해 수행하였다. N-말단 빌딩 블록은 Fwd-EVQL-MfeI 및 GlySer 링커의 일부를 코딩하는 역방향 프라이머를 사용하여 증폭한 반면, C-말단 빌딩 블록은 GlySer 링커의 나머지 부분을 코딩하는 정방향 프라이머 및 Rev-TVSS-BstEII를 사용하여 증폭하였다 (표 6). N-말단 단편은 MfeI 및 BamHI로 소화시키고, C-말단 단편은 BamHI 및 BstII로 소화시킨 후; 이들을 pAX100 벡터 내로 동시에 라이게이팅시키고, 이. 콜라이 TG-1 적격 세포 내로 형질전환시켰다.
별법으로, 상이한 PCR 증폭을 1가 빌딩 블록을 코딩하는 플라스미드 DNA에 대해 수행하였다. N-말단 빌딩 블록은 Fwd-EVQL-MfeI 및 Rev-TVSS-BspEI를 사용하여 증폭한 반면, C-말단 빌딩 블록은 Fwd-EVQL-BamHI 및 Rev-TVSS-BstEII를 사용하여 증폭하였다 (표 6). N-말단 단편은 MfeI 및 BamHI로 소화시키고, C-말단 단편은 BspEI 및 BstII로 소화시켰다. N-말단 단편을 GlySer 링커에 대한 코딩 정보를 함유하는 pAX100-유도체 내로 라이게이팅시키고 (MfeI-BspEI), 이. 콜라이 TG-1 적격 세포 내로 형질전환시켰다. 상기 형질전환 혼합물로부터의 플라스미드 DNA를 제조하고, BspEI 및 BstEII로 소화시킨 후, C-말단 단편을 pAX100 벡터 내로 라이게이팅시키고, 이. 콜라이 TG-1 적격 세포 내로 형질전환시켰다.
카나마이신 내성 클론을 삽입물의 존재에 대해 분석하고, 양성 클론의 서열을 확인하였다.
17. 다가 항- CXCR2 나노바디의 서열
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
18. 리간드 경쟁 검정
다가 항-CXCR2 나노바디를 인간 및 시노몰거스 CXCR2에 대해 FACS 리간드 경쟁 검정으로 3 nM FMAT-Blue-표지된 Gro-α에 대해 적정하였다 (표 14). 인간 CXCR2에 대해 차단 효력은 두자릿수 nM 내지 nM 미만 범위인 반면, 시노몰거스 CXCR2에 대해 한자릿수 내지 두자릿수 nM 범위이다.
Figure pat00016
19. 재조합 세포주를 사용하는 기능 검정
(1) 세포내 칼슘의 효능제 유도된 방출의 측정 ( FLIPR )
인간 또는 시노몰거스 CXCR2 수용체를 발현하는 RBL 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고, 37℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 실험일에, 세포에 Fluo-4 염료를 30분 동안 37℃에서 부하한 후, 정제된 다가 항-CXCR2 나노바디와 함께 30분 인큐베이팅하였다. 마지막으로, Gro-α의 첨가를 형광측정 영상화 플레이트 판독기 (FLIPR)를 사용하여 수행한 후, 세포내 칼슘의 방출에 대응하는 형광 신호를 검출하였다. 선택도 검정은 효능제로서 IL-8을 사용하여 인간 CXCR1을 발현하는 L2071 세포를 사용하여 수행하고, 효능제로서 SDF-1을 사용하여 인간 CXCR4를 내인성으로 발현하는 CEM 세포를 사용하여 수행하였지만, 검정 프로토콜은 CXCR2에 대해 설명한 것과 동일하게 유지되었다. 평균 IC50 값의 요약을 표 15에 제시하고, 추가로, 시험한 어떠한 나노바디도 시험한 농도 (1 μΜ 최대 농도)에서 CXCR1 또는 CXCR4에서 세포내 칼슘의 효능제 유도된 방출의 임의의 억제를 보이지 않았다.
(2) [ 35 S] GTP γS의 효능제 자극된 축적의 측정
정제된 다가 항-CXCR2 나노바디를 96-웰 플레이트 내에서 효능제 (GRO-α, IL-8 또는 ENA-78) GDP, SPA 비드 및 인간 CXCR2 수용체를 발현하는 CHO 세포로부터 제조된 CHO-CXC2 막과 함께 60분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, [35S]GTPγS를 첨가하고 추가로 60분 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 플레이트를 원심분리한 후 탑카운트 상에서 판독하였다. 평균 IC50 값의 요약을 표 15에 제시한다.
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
(3) 항- CXCR2 나노바디의 작용 메카니즘을 결정하기 위한 쉴트 ( Schild ) 분석
IL-8 및 Gro-α 자극된 [35S]GTPγS 축적 검정을 이용하여 쉴트 분석을 수행하였다. 상기 검정 형식은 [35S]GTPγS의 첨가에 앞서 효능제 및 나노바디의 평형을 허용하였고, 그 결과로서, 메카니즘의 오역을 일으킬 수 있는 반-평형의 임의의 인공물을 피할 수 있다. 이를 위해, 증가하는 농도의 나노바디의 존재 하에 효능제 농도 반응 곡선을 결정하였다. 2개의 1가 나노바디 54B12 및 163E3에 대한 데이타 및 생성되는 다가 나노바디를 예로서 제시한다. 데이타는 Gro-α에 대한 농도 반응 곡선을 보여주지만, IL-8을 사용할 때 유사한 데이타가 얻어졌다.
1가 나노바디 54B12 및 163E3은 모두 알로스테리 작용 메카니즘을 보이지만, 효능제의 억제에 대해 차별적인 효과를 갖는다. 54B12 및 다른 1-19 결합제의 알로스테리 메카니즘은 증가하는 농도의 나노바디의 존재 하에 추가로 우측으로 이동하지 않는 낮은 나노바디 농도에서 효능제 농도 반응 곡선의 평행 우측 이동에 의해 예시된다. 최대 효능제 반응의 감소를 보이지 않으면서 상기 효과의 포화가능 특성은 효능제의 친화도에 대한 알로스테리 효과를 표시한다. 이와 반대로, 163E3 및 다른 비 1-19 결합제의 알로스테리 메카니즘은 보다 높은 나노바디 농도에서 최대치 효능제 반응의 감소와 조합되어 효능제 농도 반응 곡선의 평행 우측 이동에 의해 예시된다. 상기 효과는 포화가능하지만, 이것은 사용된 농도에서 관찰되지 않았고, 그러나, 핵심 관찰은 효능제의 효능에 대한 알로스테리 효과를 표시하는 최대 효능제 반응의 감소이다. 마지막으로, 다가 나노바디 54B12-163E3은 훨씬 더 낮은 나노바디 농도에서의 평행 우측 이동 및 최대 효능제 반응의 유의한 감소에 의해 예시되는 효능제 농도 반응 곡선에 대한 효과를 생성하기 위해 두 알로스테리 메카니즘을 조합한다.
알로스테리 조절물질의 현재의 정의는 이 물질이 효능제 (오르토스테릭 (orthosteric) 리간드) 결합 부위와 별개의 부위에서 결합하고 오르토스테릭 리간드와 알로스테리 조절물질 둘 모두가 수용체에 동시에 결합된다는 것이다. 본 발명자들은 현재 이를 확인하는 데이타를 갖고 있지 않고 이론에 매이기를 바라지 않지만, 나노바디 결합 부위가 효능제 결합 부위와 구분되지 않고 결합 부위가 중복된다고 생각된다. 또한, 효능제 및 나노바디 둘 모두가 수용체에 동시에 결합됨을 보여주는 데이타가 이용가능하지 않지만, 쉴트 분석 데이타는 이들 나노바디가 CXCR2의 알로스테리 조절물질임을 시사한다.
20. 기능 검정 - NSC
섹션 15에서 설명된 바와 동일한 방법
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
Figure pat00024
Figure pat00025
리드패널 (leadpanel)-CDR+FR CXCR2 카바트
Figure pat00026
Figure pat00027
21. 서열 최적화 - CXCR2 길항제 폴리펩티드
열 전환 검정 ( TSA ): 5 ㎕의 정제된 1가 나노바디 (80 mg/ml)를 10 ㎕의 완충제 (100 mM 포스페이트, 100 mM 보레이트, 100 mM 시트레이트, 115 mM NaCl, 3.5 내지 9의 상이한 pH에서 완충됨) 내의 5 ㎕의 형광 프로브 시프로 오렌지 (Sypro Orange) (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드, 카탈로그 # S6551) (최종 농도 10x)와 혼합하였다. 이어서, 샘플을 라이트사이클러 (LightCycler) 480II 기기 (로슈, 스위스 바젤)에서 4.4℃/s로 37로부터 90℃로 가열한 후, 2.2℃/s로 37℃로 냉각하였다. 열-유도된 비폴딩 후에, 단백질의 소수성 패치는 노출되고, 시프로 오렌지가 여기에 결합하여 형광 강도를 증가시킨다. 형광 강도 곡선의 제1 유도체의 변곡점은 용융 온도 (Tm)의 척도로서 기능한다 (Ericsson et al., 2006 (Annals of Biochemistry, 357: 289-298)).
시차 주사 열량 측정 ( DSC ): 실험은 제조자의 지시에 따라 Auto-Cap VP-DSC (마이크로칼 (MicroCal) - 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))로 수행하였다. 나노바디 (0.25 mg/ml)의 용융 온도 결정은 30℃ 내지 95℃의 온도 범위에 걸쳐 1℃/min의 가열 속도로 수행하였다. 최종 써모그램 (thermogram)은 적절한 기준선 공제 후에 얻었다. 소프트웨어 (Origin 7.0)를 통한 피크 검출을 통해 상응하는 용융 온도를 얻었다.
강제 산화: 나노바디 샘플 (1 mg/ml)은 H2O2가 없는 대조군 샘플과 병행하여 PBS 내의 10 mM H2O2에 RT에서 및 암소에서 4시간 동안 적용한 후, Zeba 탈염 스핀 컬럼 (0.5 ml) (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))을 사용하여 완충제를 PBS로 전환하였다. 이어서, 스트레스를 가한 및 대조군 샘플을 70℃에서 조르박스 (Zorbax) 300SB-C3 컬럼 (애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies)) 상에서 시리즈 (Series) 1200 기기 (애질런트 테크놀로지스)로 RPC에 의해 분석하였다. 나노바디의 산화는 주 단백질 피크에 비해 산화 스트레스의 결과로 발생하는 예비-피크의 피크 면적 %의 결정에 의해 정량하였다.
2B2 서열 최적화
모 2B2의 단백질 서열을 인간 VH3-23 (DP-47) 및 JH5 생식계열에 정렬하였다 (표 20, 219 페이지). 인간 생식계열 서열에 대한 아미노산 차이는 문자로, 동일한 아미노산은 점으로 표시하였다. 밑줄로 나타낸 아미노산 차이를 인간 대응물로의 전환을 위해 선택하였고, 다른 것은 그대로 두었다.
정제된 1가 물질은 2B2, CXCR20059 및 CXCR20063으로부터 생산되었고, 이어서 FACS 리간드 경쟁 검정 및 인간 및 시노몰거스 CXCR2 둘 모두에 대한 세포내 칼슘의 효능제-유도 방출 (FLIPR) 검정에서 그 특성이 결정되었다. 또한, 변이체의 용융 온도는 열 전환 검정 (TSA) 또는 시차 주사 열량 측정 (DSC)에 의해 결정하였다 (표 21). CXCR20059 및 CXCR20063 내의 M93L 돌연변이는 강제 산화에 대한 모 2B2의 감수성을 제거한다.
Figure pat00028
97A9 서열 최적화
모 97A9의 단백질 서열을 인간 VH3-23 (DP-47) 및 JH5 생식계열에 정렬하였다 (표 22, 220 페이지). 인간 생식계열 서열에 대한 아미노산 차이는 문자로, 동일한 아미노산은 점으로 표시하였다. 밑줄로 나타낸 아미노산 차이를 인간 대응물로의 전환을 위해 선택하였고, 다른 것은 그대로 두었다.
정제된 1가 물질은 97A9 및 CXCR20061로부터 생산되었고, 이어서 FACS 리간드 경쟁 검정 및 인간 및 시노몰거스 CXCR2 둘 모두에 대한 세포내 칼슘의 효능제-유도 방출 (FLIPR) 검정에서 그 특성이 결정되었다. 또한, 변이체의 용융 온도는 열 전환 검정 (TSA)으로 결정하였다 (표 23).
Figure pat00029
163 E3 서열 최적화
모 163E3의 단백질 서열을 인간 VH3-23 (DP-47) 및 JH5 생식계열에 정렬하였다 (표 24, 221 페이지). 인간 생식계열 서열에 대한 아미노산 차이는 문자로, 동일한 아미노산은 점으로 표시하였다. 밑줄로 나타낸 아미노산 차이를 인간 대응물로의 전환을 위해 선택하였고, 다른 것은 그대로 두었다.
정제된 1가 물질은 163E3 및 CXCR20076으로부터 생산되었고, 이어서 FACS 리간드 경쟁 검정 및 인간 및 시노몰거스 CXCR2 둘 모두에 대한 세포내 칼슘의 효능제-유도 방출 (FLIPR) 검정에서 그 특성이 결정되었다. 또한, 변이체의 용융 온도는 열 전환 검정 (TSA)으로 결정하였다 (표 25).
Figure pat00030
127 D1 서열 최적화
모 127D1의 단백질 서열을 인간 VH3-23 (DP-47) 및 JH5 생식계열에 정렬하였다 (표 26, 222 페이지). 인간 생식계열 서열에 대한 아미노산 차이는 문자로, 동일한 아미노산은 점으로 표시하였다. 밑줄로 나타낸 아미노산 차이를 인간 대응물로의 전환을 위해 선택하였고, 다른 것은 그대로 두었다.
정제된 1가 물질은 127D1 및 CXCR20079로부터 생산되었고, 이어서 FACS 리간드 경쟁 검정 및 인간 및 시노몰거스 CXCR2 둘 모두에 대한 세포내 칼슘의 효능제-유도 방출 (FLIPR) 검정에서 그 특성이 결정되었다. 또한, 변이체의 용융 온도는 열 전환 검정 (TSA)으로 결정하였다 (표 27). CXCR20079 내의 M57R 돌연변이는 강제 산화에 대한 모 127D1의 감수성을 제거한다.
Figure pat00031
163 D2 서열 최적화
모 163D2의 단백질 서열을 인간 VH3-23 (DP-47) 및 JH5 생식계열에 정렬하였다 (표 28, 223 페이지). 인간 생식계열 서열에 대한 아미노산 차이는 문자로, 동일한 아미노산은 점으로 표시하였다. 밑줄로 나타낸 아미노산 차이를 인간 대응물로의 전환을 위해 선택하였고, 다른 것은 그대로 두었다.
정제된 1가 물질은 163D2 및 CXCR20086으로부터 생산되었고, 이어서 FACS 리간드 경쟁 검정 및 인간 및 시노몰거스 CXCR2 둘 모두에 대한 세포내 칼슘의 효능제-유도 방출 (FLIPR) 검정에서 그 특성이 결정되었다. 또한, 변이체의 용융 온도는 열 전환 검정 (TSA)으로 결정하였다 (표 29).
Figure pat00032
54B12 서열 최적화
모 54B12의 단백질 서열을 인간 VH3-23 (DP-47) 및 JH5 생식계열에 정렬하였다 (표 30, 224 페이지). 인간 생식계열 서열에 대한 아미노산 차이는 문자로, 동일한 아미노산은 점으로 표시하였다. 밑줄로 나타낸 아미노산 차이를 인간 대응물로의 전환을 위해 선택하였고, 다른 것은 그대로 두었다.
정제된 1가 물질은 54B12, CXCR20103 및 CXCR2104로부터 생산되었고, 이어서 FACS 리간드 경쟁 검정 및 인간 및 시노몰거스 CXCR2 둘 모두에 대한 세포내 칼슘의 효능제-유도 방출 (FLIPR) 검정에서 그 특성이 결정되었다. 또한, 변이체의 용융 온도는 열 전환 검정 (TSA)으로 결정하였다 (표 31).
Figure pat00033
Figure pat00034
Figure pat00035
Figure pat00036
Figure pat00037
Figure pat00038
Figure pat00039
Figure pat00040
Figure pat00041
Figure pat00042
Figure pat00043
Figure pat00044
22. 에피토프 매핑 ( mapping )
나노바디의 에피토프 매핑은 샷건 (Shotgun) 돌연변이 유발 기술을 사용하여 인테그랄 몰레큘라 인크. (Integral Molecular Inc., 미국 펜실베니아주 필라델피아 스위트 900 마켓 스트리트 3711, www.integralmolecular.com)에 의해 수행되었다.
샷건 돌연변이 유발 기술 요약
샷건 돌연변이 유발은 진핵 세포 내의 돌연변이된 표적 단백질의 큰 라이브러리의 발현 및 분석을 가능케하는 전유의 (proprietary) 고효율 (high throughput) 세포 발현 기술을 이용한다. 단백질 내의 모든 잔기는 대체로 기능의 변화를 검정하기 위해 다수의 다른 아미노산으로 개별적으로 돌연변이된다. 단백질은 표준 포유동물 세포주 내에서 발현되고, 따라서 심지어 진핵 번역 또는 번역후 처리를 필요로 하는 어려운 단백질도 매핑될 수 있다.
에피토프 매핑에 대한 명명법은 다음과 같다:
RDHBC 792 = CXCR20079
RDHBC 793 = CXCR20061
RDHBC 792 = CXCR20076
항-CXCR2 항체 RD-HBC792 (CXCR20079), RD-HBC793 (CXCR220061) 및 RD-HBC794 (CXCR20076)의 에피토프는 다음과 같이 샷건 돌연변이 유발을 사용하여 단일 아미노산 해상력에서 매핑되었다.
모 구축물: 비태깅된 모 유전자는 고-발현 벡터 내로 클로닝하고, 서열을 결정하고, 면역검출에 의해 발현에 대해 입증되었다. 나노바디 최적화: 나노바디의 검출은 394-웰 마이크로플레이트 내의 일련의 나노바디 희석액을 검정함으로써 샷건 돌연변이 유발 형식에서 최적화되었다. 각각의 나노바디의 최적 농도를 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하기 위해 선택하였다. 돌연변이 라이브러리를 완성하고, 각각의 아미노산 위치를 모든 잔기의 Ala 치환으로의 돌연변이를 비롯하여 보존 및 비-보존된 변화로 돌연변이시켰다. 라이브러리를 표면 발현에 대해 시험하고 면역검출에 의해 나노바디 결합에 대해 삼중으로 스크리닝하였다. 나노바디 결합의 손실에 대한 라이브러리의 분석을 수행하였고, 중요 잔기가 확인되고 매핑되었다.
모 구축물 발현: 일시적으로 발현된 야생형 모 구축물의 면역검출을 면역발광 및 면역형광에 의해 384 웰 형식으로 수행하였다. 모든 실험에 대해, 세포 형질감염 및 면역염색에 수반되는 액체 취급 단계는 정확성 및 높은 실험적 재현성을 보장하기 위해 액체 취급 로봇을 사용하여 수행하였다.
모 플라스미드를 시험하기 위해 사용된 실험 파라미터
실험 파라미터 면역발광 면역형광
세포 HEK-293T HEK-293T
고정액 4% PFA 4% PFA
차단 버퍼 10% 염소 혈청 10% 염소 혈청
1°MAb 표적 농도
인큐베이션
제조자 카탈로그 #		 α-CXCR2 2 ㎍/ml 1시간 R&D
시스템즈 MAB331		 α-CXCR2 3 ㎍/ml 1시간 R&D
시스템즈 MAB331
2°MAb 표적 농도
제조자 카탈로그 #		 α-마우스 HRP 0.8 ㎍/ml
잭슨 이뮤노리써치 115-035-003		 α-마우스 다이라이트(Dyelight) 549 3.75 ㎍/ml 잭슨 이뮤노리써치
115-505-003
세척 PBS++ PBS++
신호:배경 29:1 2.2:1
모체의 CV % 4.7% 12%
폴리클로날 면역검출에 사용된 실험 파라미터
폴리클로날 혈청을 사용하여 총 수용체 세포 표면 발현의 검출. 폴리클로날 혈청 (모든 돌연변이체와 반응할 수 있음)은 돌연변이 라이브러리 내의 각각의 클론이 검출될 수 있도록 총 발현을 정량하기 위해 사용된다. 실험 파라미터 폴리클로날 면역검출
세포 HEK-293T
고정액 4% PFA
차단 버퍼 10% 염소 혈청
1°PAb 표적 농도
인큐베이션 제조자 카탈로그 #		 α-CXCR2 1:1,000 희석 1시간
노부스 NBP1-49218
2°MAb 표적 농도
제조자 카탈로그 #		 α-토끼 HRP 0.8 ㎍/ml
서던 바이오테크 4050-05
세척 PBS++
신호:배경 17:1
% CV 10%
결론: 강력한 표면 발현 및 총 발현이 대조군 MAb 및 폴리클로날 혈청을 사용하여 야생형 모 구축물에 대해 검출되고, 따라서 야생형 모 구축물은 샷건 돌연변이 유발을 위해 사용될 수 있다. 면역발광 검정은 높은 신호:배경 및 낮은 변이성을 보이고, 매핑 연구에 사용될 것이다.
면역검출을 매핑 나노바디를 사용하여 최적화하였다. 면역검출은 야생형 수용체 또는 벡터 단독 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 세포를 사용하여 384-웰 형식으로 수행하였다. 추가의 매핑 연구에 대해 선택된 농도는 높은 신호:배경 및 낮은 변이성과 함께 최대 신호에 근접한 신호를 기초로 하였다.
돌연변이 라이브러리의 스크리닝을 위한 최종 검정 조건
샷건 돌연변이 유발 384-웰 형식에서 최적화된 검정 검출에 사용된 실험 파라미터
실험 파라미터 RD - HBC792 RD - HBC793 RD - HBC794
세포 HEK-293T HEK-293T HEK-293T
고정액 4% PFA 4% PFA 4% PFA
차단 버퍼 10% 염소 혈청 10% 염소 혈청 10% 염소 혈청
1°MAb
표적
최적 농도
인큐베이션
α-CXCR2
1.0 ㎍/ml
1시간
α-CXCR2
1.0 ㎍/ml
1시간
α-CXCR2
2.0 ㎍/ml
1시간
2°MAb
표적 농도
인큐베이션
제조자
항체 명칭
α-myc 2 ㎍/ml
1시간
사내
하이브리도마 9E10
α-myc 2 ㎍/ml
1시간
사내
하이브리도마 9E10
α-myc 2 ㎍/ml
1시간
사내
하이브리도마 9E10
3°MAb
표적
농도
제조자
카탈로그 #
α-마우스 HRP
0.8 ㎍/ml
잭슨 이뮤노리써치
115-035-003
α-마우스 HRP
0.8 ㎍/ml
잭슨 이뮤노리써치
115-035-003
α-마우스 HRP
0.8 ㎍/ml
잭슨 이뮤노리써치
115-035-003
세척 PBS++ PBS++ PBS++
신호:배경 13:1 6.9:1 20:1
CV % 7.9% 22% 13%
본원에서 규정된 최적화된 검정 조건을 384-웰 형식으로 CXCR2 돌연변이 라이브러리를 매핑하기 위해 사용하였다. 라이브러리 내의 각각의 클론은 일시적 형질감염에 의해 세포에서 발현되었고, 대략 형질감염 18시간 후에 나노바디 반응성에 대해 검정하였다. CXCR2 나노바디 RD-HBC792, RD-HBC793 및 RD-HBC794는 Fc 영역이 결여되지만, myc-태그를 함유하고, 따라서 중간체 마우스 항-myc 항체 (9E10)가 사용되는 다단계 검출 전략을 사용한 후, 항-마우스 HRP 항체를 사용하여 검출하였다.
결론: 3개의 CXCR2 나노바디의 면역검출 및 에피토프 매핑을 위한 최종 조건을 결정하였다. 최적화된 조건은 샷건 돌연변이 유발 형식에서 높은 신호:배경 및 낮은 변이성을 생성하였고, 따라서 높은 신뢰도로 에피토프 매핑을 위해 사용될 수 있다. 에피토프 매핑은 여기서 결정된 동일한 검정 조건을 적용하되, 수용체 변이체의 돌연변이 라이브러리를 사용하는 것을 수반하였다.
나노바디 에피토프에 중요한 잔기의 확인
Figure pat00045
MAb에 중요한 잔기는 클론의 나노바디 반응성을 폴리클로날 반응성 (표면 발현)에 비교함으로써 확인되었다. 항체 에피토프에 포함되는 잔기는 나노바디 결합에 대해 음성이지만 폴리클로날 결합에 대해 양성인 것으로서 확인되었고, Ala 잔기 치환 (즉, 잔기의 측쇄의 제거)을 포함하고, 세포외 루프에 위치하였다. MAb 결합 및 폴리클로날 항체 결합에 대한 평균 반응성 및 표준 편차가 제시된다. 각각의 MAb에 대해 확인된 중대한 잔기는 회색으로 음영처리하였다. 또한, RD HBC792에 대한 데이타를 RD HBC793과 비교하였고, 그 이유는 RD HBC792에 대한 결합 프로파일이 시판 폴리클로날 혈청 (인간 CXCR2의 N-말단 세포외 도메인으로부터 유래됨, 이것은 아마도 F11, F14, 및 W15 돌연변이에 대한 혈청의 저하된 반응성을 설명함)과 유사한 것으로 밝혀졌기 때문이다.
에피토프 정보의 추가의 분석
샷건 돌연변이 유발 매핑에 의해 확인된 중요한 아미노산은 3개의 CXCR2 MAb에 대한 결합 부위(들)를 규정한다. MAb RD HBC792는 CXCR2의 N-말단 영역에 매핑되고, 중요한 잔기의 밀접한 근접성은 에피토프가 사실상 선형임을 시사한다. MAb RD HBC793 및 RD HBC794는 주로 CXCR2의 ECL1 및 ECL3에 의해 형성된 입체형태적으로 복잡한 에피토프에 결합하는 것으로 보인다. 또한, 세포외 루프를 케모카인 수용체 내에서 제자리에 유지하는 2개의 디술피드 다리를 형성하는 것으로 알려진 세포외 Cys 잔기의 돌연변이는 MAb 793 및 794의 결합을 제거하고, 따라서 에피토프 상호작용에 직접 관여하는 것으로 생각되지 않는다. 그 둘 사이의 미묘한 차이가 명백하지만, 793 및 794의 에피토프는 유의하게 중복된다.
실시양태
1. 적어도 2개의 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 케모카인 수용체 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하고, CXCR2 상의 제1 에피토프를 인식하는 제1 항원 결합 도메인 및 CXCR2 상의 제2 에피토프를 인식하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
2. 실시양태 1에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 서열 7에 제시된 아미노산의 서열로 이루어지는 선형 펩티드에 결합할 수 있고, 상기 제2 항원 결합 도메인이 상기 선형 펩티드에 결합할 수 없거나 보다 낮은 친화도로 결합하는 것인 폴리펩티드.
3. 실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 내에 포함되고, 상기 제2 항원 결합 도메인이 항체의 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인 내에 포함되는 것인 폴리펩티드.
4. 실시양태 3에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인 중의 적어도 하나가 항체 VL 도메인 또는 그의 단편 내에 포함되는 것인 폴리펩티드.
5. 실시양태 3에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인 중의 적어도 하나가 항체 VH 도메인 또는 그의 단편 내에 포함되는 것인 폴리펩티드.
6. 실시양태 4 또는 5에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 VL 도메인 또는 그의 단편에 포함되고, 상기 제2 항원 결합 도메인이 VH 도메인 또는 그의 단편에 포함되는 것인 폴리펩티드.
7. 실시양태 4 또는 5에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 VH 도메인 또는 그의 단편에 포함되고, 상기 제2 항체 결합 도메인이 VL 도메인 또는 그의 단편에 포함되는 것인 폴리펩티드.
8. 실시양태 3 내지 7 중의 임의의 하나에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 제1 및 제2 도메인 항체 (dAb) 내에 포함되는 것인 폴리펩티드.
9. 실시양태 3 또는 실시양태 5에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인 중의 적어도 하나가 낙타류로부터 얻을 수 있는 중쇄 항체의 단일 중쇄로부터의 VHH 도메인 또는 그의 단편 내에 포함되거나 또는 인간화된 것을 비롯하여 서열-최적화된 그의 변이체인 폴리펩티드.
10. 실시양태 9에 있어서, 각각의 상기 항원 결합 도메인이 낙타류로부터 유래된 중쇄 항체의 단일 중쇄로부터의 VHH 도메인 또는 그의 단편 내에 포함되거나 또는 인간화된 것을 비롯하여 서열-최적화된 그의 변이체인 폴리펩티드.
11. 실시양태 9 또는 10에 있어서, 각각의 VHH 서열 또는 그의 단편이 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드.
12. 실시양태 9 내지 11 중의 임의의 하나에 있어서, 각각의 VHH 서열이 FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR의 구조를 갖는 것인 폴리펩티드.
13. 상기 실시양태 중의 임의의 하나에 있어서, 상기 적어도 2개의 항원 결합 도메인이 링커에 의해 연결되는 것인 폴리펩티드.
14. 실시양태 3 내지 13 중의 임의의 하나에 있어서, 다음 구조를 갖는 폴리펩티드:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--링커--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
여기서 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4가 제1 항원 결합 도메인을 포함하면, FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8은 제2 항원 도메인을 포함하고, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4가 제2 항원 도메인을 포함하면, FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8은 제1 항원 결합 도메인을 포함한다.
15. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 각각의 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 중쇄 항체 내에 포함되는 것인 폴리펩티드.
16. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 제1 중쇄 항체의 단일쇄 내에 포함되고, 상기 제2 항원 결합 도메인이 제2 중쇄 항체의 단일쇄 내에 포함되고, 여기서 상기 제1 및 제2 단일 중쇄 항체는 링커에 의해 연결되는 것인 폴리펩티드.
17. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 각각의 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 항체 내에 포함되는 것인 폴리펩티드.
18. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 각각 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 제1 및 제2 항체에 각각 포함되고, 상기 제1 및 제2 항체는 링커에 의해 연결되는 것인 폴리펩티드.
19. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 각각 제1 및 제2 항체 Fab 또는 F(ab)2 단편 내에 포함되고, 상기 제1 및 제2 Fab 또는 F(ab)2 단편은 링커에 의해 연결되는 것인 폴리펩티드.
20. 실시양태 19에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 항체 Fab 단편 내에 포함되고 상기 제2 항원 결합 도메인이 F(ab)2 단편 내에 포함되거나, 또는 그 반대로 포함되는 것인 폴리펩티드.
21. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 각각 제1 및 제2 항체 단일쇄 Fv (scFv) 또는 그의 단편 내에 포함되고, 상기 제1 및 제2 scFv는 링커에 의해 연결되는 것인 폴리펩티드.
22. 실시양태 13, 14, 16, 18, 19, 20, 또는 21 중의 임의의 하나에서, 링커가 항원 결합 도메인을 포함하는 한 면역글로불린의 C-말단을 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 면역글로불린의 N-말단에 연결하는 것인 폴리펩티드.
23. 실시양태 13, 14, 16, 또는 18 내지 22 중의 임의의 하나에서, 링커가 면역글로불린으로부터 기원하지 않은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 폴리펩티드.
24. 실시양태 23에 있어서, 펩티드 링커가 3 내지 50개 아미노산 길이인 폴리펩티드.
25. 실시양태 24에 있어서, 링커 내의 아미노산의 수가 3 내지 9, 10 내지 15, 16 내지 20, 21 내지 25, 26 내지 35, 36 내지 40, 41 내지 45 또는 46 내지 50개로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
26. 실시양태 24에 있어서, 링커가 35개 아미노산 길이인 폴리펩티드.
27. 실시양태 24에 있어서, 링커가 2개의 상이한 아미노산으로만 이루어지는 것인 폴리펩티드.
28. 실시양태 27에 있어서, 링커가 아미노산 글라이신 및 세린으로 이루어지는 것인 폴리펩티드.
29. 실시양태 27에 있어서, 링커가 아미노산 프롤린 및 세린 및 임의로 알라닌으로 이루어지는 것인 폴리펩티드.
30. 실시양태 23 내지 26 중의 임의의 하나에서, 링커가 알라닌으로만 이루어지는 것인 폴리펩티드.
31. 실시양태 26에 있어서, 펩티드 링커가 서열 220에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 것인 폴리펩티드.
32. 상기 실시양태 중의 임의의 하나에서, 낙타류 단일 중쇄 항체로부터 유래되거나 이를 특징으로 하는 CDR 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
33. 실시양태 9 내지 14 중의 임의의 하나에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 낙타류 단일 중쇄 항체로부터 유래되거나 이를 특징으로 하는 것인 폴리펩티드.
34. 실시양태 9 내지 14 중의 임의의 하나에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 인간화된 것을 비롯하여 서열-최적화된 그의 변이체인 폴리펩티드.
35. 상기 실시양태 중의 임의의 하나에서, CXCR2에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
36. 임의의 상기 실시양태 중의 하나에 있어서, 인간 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하는 폴리펩티드.
37. 임의의 상기 실시양태 중의 하나에 있어서, 혈청 알부민에 대해 작용하거나 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 추가의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
38. 임의의 상기 실시양태 중의 하나에 있어서, 혈청 단백질이 인간 혈청 알부민인 폴리펩티드.
39. 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 CXCR2 상의 제1 및 제2 에피토프를 인식하고, 상기 적어도 2개의 폴리펩티드는 비-펩티드 링커에 의해 연결되는 것인, 케모카인 수용체 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하는 분자.
40. 실시양태 38에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 서열 7에 제시된 아미노산의 서열로 이루어진 선형 펩티드에 결합할 수 있고, 상기 제2 항원 결합 도메인은 상기 선형 펩티드에 결합할 수 없거나 보다 낮은 친화도로 결합하는 것인 분자.
41. 실시양태 39 또는 40에 있어서, 실시양태 3 내지 22 및 32 내지 38 중의 임의의 하나에 규정된 특징을 갖는 것인 분자.
42. 실시양태 3 내지 14 또는 실시양태 22 내지 39 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 145, 165 및 185로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 145, 165 또는 185의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 단일 가변 도메인의 제1 면역글로불린이 서열 141, 161 및 181로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 141, 161 또는 181의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드 (163D2/127D1).
43. 실시양태 42에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 단일 가변 도메인의 제2 면역글로불린에서 CDR1은 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 단일 가변 도메인의 제1 면역글로불린에서 CDR4는 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 161에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
44. 실시양태 43에 있어서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열이 서열 145, 165, 185, 141, 161 또는 181에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 것인 폴리펩티드.
45 실시양태 43 또는 44에 있어서, 아미노산 서열이 서열 145, 165, 185, 141, 161 또는 181에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 것인 폴리펩티드.
46. 실시양태 43 내지 45 중의 임의의 하나에서, 단일 가변 도메인의 각각의 단량체 내의 프레임워크 영역이 카바트 넘버링에 따른 아미노산 위치 11, 37, 44, 46, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에 하나 이상의 홀마크 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
47. 실시양태 43 내지 46 중의 임의의 하나에서, FR1이 서열 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5가 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6이 서열 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7이 서열 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8이 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
48. 실시양태 47에 있어서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8이 임의의 서열 83, 104, 124, 131, 79, 100, 또는 120에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 변형된 폴리펩티드.
49. 실시양태 41 내지 48 중의 임의의 하나에서, 서열 58에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 58의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
50. 실시양태 42 내지 46 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 218에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 218에 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 216에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 216에 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
51. 실시양태 3 내지 14 또는 실시양태 22 내지 39 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 146, 166 및 186으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 146, 166 또는 188의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 141, 161 및 181로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 141, 161 또는 181의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드 (163E3/127D1).
52. 실시양태 51에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 단일 가변 도메인의 제2 면역글로불린에서 CDR1은 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 단일 가변 도메인의 제1 면역글로불린에서 CDR4는 서열 141에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 161에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 181에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
53. 실시양태 52에 있어서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열이 서열 176, 166, 186, 141, 161 또는 181에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 것인 폴리펩티드.
54. 실시양태 52 또는 53에 있어서, 아미노산 서열이 서열 146, 166, 186, 141, 161 또는 181에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 것인 폴리펩티드.
55. 실시양태 52 내지 54 중의 임의의 하나에서, 단일 가변 도메인의 각각의 단량체 내의 프레임워크 영역이 아미노산 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에 하나 이상의 홀마크 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
56. 실시양태 52 내지 55 중의 임의의 하나에서, FR1이 서열 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 125에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5가 서열 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6이 서열 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7이 서열 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8이 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
57. 실시양태 56에 있어서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8이 임의의 서열 84, 105, 125, 131, 79, 100, 또는 120에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 폴리펩티드.
58. 실시양태 51 내지 57 중의 임의의 하나에서, 서열 59에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 59의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
59. 실시양태 51 내지 58 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 217에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 217과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 216에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 216과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
60. 실시양태 3 내지 14 또는 실시양태 22 내지 39 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 146, 166 및 186으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 146, 166 또는 186의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 151, 171 및 191로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 151, 171 또는 191의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드 (163E3/54B12).
61. 실시양태 60에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR1은 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR4는 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
62. 실시양태 61에 있어서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열이 서열 146, 166, 186, 151, 171 또는 191에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 것인 폴리펩티드.
63. 실시양태 61 또는 62에 있어서, 아미노산 서열이 서열 146, 166, 186, 151, 171 또는 191에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 것인 폴리펩티드.
64. 실시양태 61 내지 63 중의 임의의 하나에서, 단일 가변 도메인의 각각의 단량체 내의 프레임워크 영역이 카바트 넘버링에 따른 아미노산 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에 하나 이상의 홀마크 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
65. 실시양태 61 내지 64 중의 임의의 하나에서, FR1이 서열 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 125에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5가 서열 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6이 서열 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7이 서열 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8이 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
66. 실시양태 65에 있어서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8이 임의의 서열 84, 105, 125, 131, 89, 110, 또는 130에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 변형된 폴리펩티드.
67. 실시양태 60 내지 66 중의 임의의 하나에서, 서열 62에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 62의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
68. 실시양태 60 내지 64 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 217에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 217과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 219에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 219와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
69. 실시양태 3 내지 14 또는 실시양태 22 내지 39 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 145, 165 및 185로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 145, 165 또는 185의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 151, 171 및 191로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 151, 171 또는 191의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드 (163D2/54B12).
70. 실시양태 69에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인 CDR1은 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR4는 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
71. 실시양태 70에 있어서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열이 서열 145, 165, 185, 151, 171, 또는 191에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 것인 폴리펩티드.
72. 실시양태 70 또는 71에 있어서, 아미노산 서열이 서열 145, 165, 185, 151, 171 또는 191에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 것인 폴리펩티드.
73. 실시양태 70 내지 72 중의 임의의 하나에서, 단일 가변 도메인의 각각의 단량체 내의 프레임워크 영역이 카바트 넘버링에 따른 아미노산 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에 하나 이상의 홀마크 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
74. 실시양태 70 내지 73 중의 임의의 하나에서, FR1이 서열 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5가 서열 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6이 서열 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7이 서열 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8이 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
75. 실시양태 74에 있어서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8이 임의의 서열 83, 104, 124, 131, 89, 110 또는 130에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 변형된 폴리펩티드.
76. 임의의 실시양태 69 내지 75에 있어서, 서열 63에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 63의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
77. 실시양태 69 내지 73 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 218에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 218과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 219에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 219와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
78. 실시양태 3 내지 14 또는 실시양태 22 내지 39 중의 임의의 하나에서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 147, 167 및 187로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 147, 167 및 187의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 146, 166 및 186로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 146, 166 및 186의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드 (2B2/163E3).
79. 실시양태 78에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR1은 서열 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 167에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR4는 서열 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
80. 실시양태 79에 있어서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열이 서열 147, 167, 187, 146, 166 또는 186에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 것인 폴리펩티드.
81. 실시양태 79 또는 80에 있어서, 아미노산 서열이 서열 147, 167, 187, 146, 166 또는 186에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 것인 폴리펩티드.
82. 실시양태 79 내지 81 중의 임의의 하나에서, 단일 가변 도메인의 각각의 단량체 내의 프레임워크 영역이 카바트 넘버링에 따른 아미노산 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에 하나 이상의 홀마크 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
83. 실시양태 79 내지 82 중의 임의의 하나에서, FR1이 서열 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5가 서열 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6이 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7이 서열 125에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8이 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
84. 실시양태 83에 있어서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8이 임의의 서열 85, 106, 126, 131, 84, 105 또는 125에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 변형된 폴리펩티드.
85. 실시양태 78 내지 84 중의 임의의 하나에서, 서열 64에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 64의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
86. 실시양태 78 내지 82 중의 임의의 하나에서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 213 또는 214에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 213 또는 214와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 217에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 217과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
87. 실시양태 3 내지 14 또는 실시양태 22 내지 39 중의 임의의 하나에서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 147, 167 및 187로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 147, 167 및 187의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제2 면역글로불린 가변 도메인이 서열 145, 165 및 185로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 145, 165 및 185의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드 (2B2/163D2).
88. 실시양태 87에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR1은 서열 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 167에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR4는 서열 145에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 165에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 185에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
89. 실시양태 88에 있어서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열이 서열 147, 167, 187, 145, 165 또는 185에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 것인 폴리펩티드.
90. 실시양태 88 또는 89에 있어서, 아미노산 서열이 서열 147, 167, 187, 145, 165 또는 185에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 것인 폴리펩티드.
91. 실시양태 88 내지 90 중의 임의의 하나에서, 단일 가변 도메인의 각각의 단량체 내의 프레임워크 영역이 카바트 넘버링에 따른 아미노산 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에 하나 이상의 홀마크 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
92. 실시양태 88 내지 91 중의 임의의 하나에서, FR1이 서열 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5가 서열 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6이 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7이 서열 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8은 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
93. 실시양태 94에 있어서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8이 임의의 서열 85, 106, 126, 131, 83, 104 또는 124에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 변형된 폴리펩티드.
94. 실시양태 87 내지 93 중의 임의의 하나에서, 서열 65에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 65의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
95. 실시양태 87 내지 91 중의 임의의 하나에서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 213 또는 214에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 213 또는 214와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 218에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 218과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
96. 실시양태 3 내지 14 또는 실시양태 22 내지 39 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 143, 163 및 183으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 143, 163 및 183의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 147, 167 및 187로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 147, 167 및 187의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드 (97A9/2B2).
97. 실시양태 96에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR1은 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR4는 서열 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 167에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 187에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
98. 실시양태 97에 있어서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열이 서열 143, 163, 183, 147, 167 또는 187에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 것인 폴리펩티드.
99. 실시양태 97 또는 98에 있어서, 아미노산 서열이 서열 143, 163, 183, 147, 167 또는 187에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 것인 폴리펩티드.
100. 실시양태 97 내지 99 중의 임의의 하나에서, 단일 가변 도메인의 각각의 단량체 내의 프레임워크 영역이 카바트 넘버링에 따른 아미노산 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에 하나 이상의 홀마크 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
101. 실시양태 97 내지 100 중의 임의의 하나에서, FR1이 서열 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 서열 133에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5가 서열 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6이 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7이 서열 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8이 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
102. 실시양태 101에 있어서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8이 임의의 서열 81, 102, 122, 133, 85, 106, 126 또는 131에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 변형된 폴리펩티드.
103. 실시양태 96 내지 102 중의 임의의 하나에서, 서열 47에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 47의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
104. 실시양태 96 내지 100 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 215에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 215와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 213 및 214에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 213 또는 214와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
105. 실시양태 3 내지 14 또는 실시양태 22 내지 39 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 143, 163 및 183으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 143, 163 및 183의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 151, 171 및 191로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 151, 171 및 191의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드 (97A9/54B12).
106. 실시양태 105에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR1은 서열 143에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR2는 서열 163에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR3은 서열 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 CDR4는 서열 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR5는 서열 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CDR6은 서열 191에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
107. 실시양태 106에 있어서, CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 또는 CDR6의 아미노산 서열이 서열 143, 163, 183, 151, 171 또는 191에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 것인 폴리펩티드.
108. 실시양태 106 또는 107에 있어서, 아미노산 서열이 서열 143, 163, 183, 151, 171 또는 191에 제시된 것과 단지 보존적 아미노산 변화에서만 상이한 것인 폴리펩티드.
109. 실시양태 106 내지 108 중의 임의의 하나에서, 단일 가변 도메인의 각각의 단량체 내의 프레임워크 영역이 카바트 넘버링에 따른 아미노산 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에 하나 이상의 홀마크 잔기를 포함하는 것인 폴리펩티드.
110. 실시양태 106 내지 109 중의 임의의 하나에서, FR1이 서열 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 아미노산 서열 133에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR5가 서열 89에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR6이 서열 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, FR7이 서열 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/하거나 FR8이 서열 131에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
111. 실시양태 110에 있어서, FR1, FR2, FR3, FR4, FR5, FR6, FR7 및 FR8이 임의의 서열 81, 102, 122, 133, 89, 110, 130 또는 131에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖도록 변형된 폴리펩티드.
112. 실시양태 105 내지 111 에 있어서, 서열 61에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 61의 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
113. 실시양태 105 내지 109 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 215에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 215와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 219에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 219와 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
114. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 113 중의 임의의 하나에서, 부분적으로 또는 완전히 인간화된 프레임워크 영역을 포함하는 서열-최적화된 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드.
115. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 114 중의 임의의 하나에서, 비-인간 영장류 CXCR2와 교차반응하는 폴리펩티드.
116. 실시양태 115에 있어서, 영장류가 시노몰거스 원숭이인 폴리펩티드.
117. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 116 중의 임의의 하나에서, 비-영장류 종으로부터의 CXCR2와 교차반응하지 않는 폴리펩티드.
118. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 117 중의 임의의 하나에서, CXC 케모카인 패밀리의 다른 수용체와 교차반응하지 않는 폴리펩티드.
119. 실시양태 1 내지 38 및 114 내지 118 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 항원 결합 도메인이 서열 8, 9, 10, 11 및 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이 내부에 존재하는 CXCR2 에피토프를 인식하는 것인 폴리펩티드.
120. 실시양태 119에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 서열 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이 내부에 존재하는 에피토프를 인식하는 것인 폴리펩티드.
121. 실시양태 119 또는 120에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인이 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이 내부에 존재하는 에피토프를 인식하는 것인 폴리펩티드.
122. 실시양태 119 내지 121 중의 임의의 하나에서, 상기 제2 항원 결합 도메인이 서열 5 또는 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이 내부에 존재하는 에피토프를 인식하는 것인 폴리펩티드.
123. 실시양태 1 내지 38 또는 실시양태 42 내지 122 중의 임의의 하나에서, 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수 (KD)로 인간 CXCR2에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드.
124. 실시양태 1 내지 38 또는 실시양태 42 내지 123 중의 임의의 하나에서, 102 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1 내지 107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1 내지 107 M-1s-1의 회합 속도 (kon 속도)로 인간 CXCR2에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드.
125. 실시양태 1 내지 38 또는 실시양태 42 내지 124 중의 임의의 하나에서, 1 s-1 내지 10-6 s-1, 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1 내지 10-6 s-1의 해리 속도 (koff 속도)로 인간 CXCR2에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드.
126. 실시양태 1 내지 38 또는 실시양태 42 내지 125 중의 임의의 하나에서, 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 인간 CXCR2에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드.
127. 실시양태 1 내지 38 또는 실시양태 42 내지 126 중의 임의의 하나에서, 20 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2에 대한 Gro-α의 결합을 억제할 수 있는 폴리펩티드.
128. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 127 중의 임의의 하나에서, 100 nM 미만의 IC50으로 인간 CXCR2를 발현하는 RBL 세포로부터 Gro-α-유도 칼슘 방출을 억제할 수 있는 폴리펩티드.
129. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 128 중의 임의의 하나에서, 50 nM 미만의 IC50으로 인간 CHO-CXCR2 막 내의 [35S]GTPγS의 Gro-α 유도 축적을 억제할 수 있는 폴리펩티드.
130. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 129 중의 임의의 하나에서, 실질적으로 단리된 형태인 폴리펩티드.
131. 실시양태 1 내지 38 및 42 내지 130 중의 임의의 하나에서, 다중 파라토프성 구축물인 폴리펩티드.
132. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 131 중의 임의의 하나에서, 상응하는 비변형된 아미노산 서열에 비해 증가된 생체내 반감기를 갖도록 변형된 폴리펩티드.
133. 실시양태 132에 있어서, 상기 증가된 반감기가 혈청 단백질 또는 그의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 소형 단백질 또는 펩티드로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 결합 단위에 의해 제공되는 것인 폴리펩티드.
134. 실시양태 133에 있어서, 폴리펩티드에 증가된 반감기를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 폴리펩티드.
135. 133에 있어서, 폴리펩티드에 증가된 반감기를 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 혈청 알부민 (예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린 (예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 폴리펩티드.
136. 실시양태 132에 있어서, 상기 증가된 반감기가 혈청 알부민 (예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린 (예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기 적합한 아미노산 서열, 또는 나노바디로 이루어지는 군 중에서 선택된 하나 이상의 다른 결합 단위에 의해 제공되는 것인 폴리펩티드.
137. 실시양태 134에 있어서, 혈청 알부민 (예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린 (예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 면역글로불린 단일 가변 도메인인 폴리펩티드.
138. 실시양태 132 내지 137 중의 임의의 하나에서, 상응하는 비변형된 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 2배, 예컨대 적어도 5배, 예를 들어 적어도 10배 또는 20배 초과로 더 큰 혈청 반감기를 갖는 폴리펩티드.
139. 임의의 실시양태 132 내지 138 중의 임의의 하나에서, 상응하는 비변형된 폴리펩티드에 비해 1 시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 갖는 폴리펩티드.
140. 실시양태 132 내지 139 중의 임의의 하나에서, 인간에서 적어도 약 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 보다 바람직하게는 적어도 48시간, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 72시간 이상; 예를 들어 적어도 5일 (예컨대 약 5 내지 10일), 바람직하게는 적어도 9일 (예컨대 약 9 내지 14일), 보다 바람직하게는 적어도 약 10일 (예컨대 약 10 내지 15일), 또는 적어도 약 11일 (예컨대 약 11 내지 16일), 보다 바람직하게는 적어도 약 12일 (예컨대 약 12 내지 18일 이상), 또는 14일 초과 (예컨대 약 14 내지 19일)의 혈청 반감기를 갖는 폴리펩티드.
141. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 140 중의 임의의 하나에서, peg화된 폴리펩티드.
142. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 140 중의 임의의 하나에서, pas화된 폴리펩티드.
143. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 140 중의 임의의 하나에서, hes화된 폴리펩티드.
144. 실시양태 36 또는 37 또는 실시양태 42 내지 143 중의 임의의 하나에서, 상기 추가의 항원 결합 도메인이 혈청 단백질에 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 nM 미만의 친화도로 결합하는 것인 폴리펩티드.
145. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
146. 서열 25 내지 43, 90 및 213 내지 219에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자.
147. 실시양태 146에 있어서, 서열 192 내지 211에 제시된 핵산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
148. 서열 44 내지 69에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
149. 실시양태 145 내지 148 중의 임의의 하나에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
150. 실시양태 145 내지 148 중의 임의의 하나에 따른 핵산 서열로부터 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 149 중의 임의의 하나에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포.
151. 실시양태 150의 숙주 세포를 배양함으로써 얻을 수 있는 1가, 2가, 다가, 이중 파라토프성 또는 다중 파라토프성 나노바디.
152. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 따른 폴리펩티드, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
153. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 폴리펩티드.
154. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 있어서, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 및 COPD 악화의 치료에 사용하기 위한 폴리펩티드.
155. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 있어서, 낭성 섬유증, 천식, 중증 천식, 천식의 악화, 알러지성 천식, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 특발성 폐 섬유증, 기도 개형, 폐쇄성 세기관지염 증후군 또는 기관지폐 이형성증의 치료에 사용하기 위한 폴리펩티드.
156. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 있어서, 아테롬성 동맥경화증, 사구체신염, 염증성 장 질환 (크론병), 혈관신생, 및 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 당뇨병성 신경병증을 포함하는 새로운 혈관 발생을 특징으로 하는 질환, 다발 경화증, 건선, 연령 관련 황반 변성 질환, 눈 베체트 질환, 포도막염, 특발성 폐 동맥 고혈압 (PAH), 가족성 PAH 및 관련 PAH를 포함하는 PAH, 만성 염증성 질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 비-소세포 암종, 결장암, 췌장암, 식도암, 난소암, 유방암, 고형 종양 및 전이, 흑색종, 간세포 암종 또는 허혈 재관류 손상의 치료에 사용하기 위한 폴리펩티드.
157. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 따른 유효량의 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 또는 COPD 악화의 치료 방법.
158. 실시양태 1 내지 37 또는 41 내지 143 중의 임의의 하나에 따른 유효량의 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 낭성 섬유증, 천식, 중증 천식, 천식의 악화, 알러지성 천식, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 특발성 폐 섬유증, 기도 개형, 폐쇄성 세기관지염 증후군 또는 기관지폐 이형성증으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 병태의 치료 방법.
159. 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 따른 유효량의 폴리펩티드를 대상체에게 투여함으로써, 아테롬성 동맥경화증, 사구체신염, 염증성 장 질환 (크론병), 혈관신생, 및 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 당뇨병성 신경병증을 포함하는 새로운 혈관 발생을 특징으로 하는 질환, 다발 경화증, 건선, 연령 관련 황반 변성 질환, 눈 베체트 질환, 포도막염, 특발성 폐 동맥 고혈압 (PAH), 가족성 PAH 및 관련 PAH를 포함하는 PAH, 만성 염증성 질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 비-소세포 암종, 결장암, 췌장암, 식도암, 난소암, 유방암, 고형 종양 및 전이, 흑색종, 간세포 암종 및 허혈 재관류 손상으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 병태의 치료 방법.
160. 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 또는 COPD 악화 치료용 의약의 제조에 있어서 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 따른 폴리펩티드의 용도.
161. 천식, 중증 천식, 천식의 악화, 알러지성 천식, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 특발성 폐 섬유증, 기도 개형, 폐쇄성 세기관지염 증후군 또는 기관지폐 이형성증 치료용 의약의 제조에 있어서 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 따른 폴리펩티드의 용도.
162. 아테롬성 동맥경화증, 사구체신염, 염증성 장 질환 (크론병), 혈관신생, 및 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 당뇨병성 신경병증을 포함하는 새로운 혈관 발생을 특징으로 하는 질환, 다발 경화증, 건선, 연령 관련 황반 변성 질환, 눈 베체트 질환, 포도막염, 특발성 폐 동맥 고혈압 (PAH), 가족성 PAH 및 관련 PAH를 포함하는 PAH, 만성 염증성 질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 비-소세포 암종, 결장암, 췌장암, 식도암, 난소암, 유방암, 고형 종양 및 전이, 흑색종, 간세포 암종 또는 허혈 재관류 손상 치료용 의약의 제조에 있어서 실시양태 1 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에 따른 폴리펩티드의 용도.
163. 실시양태 1 내지 38 중의 임의의 하나에서, 실시양태 49, 58, 67, 76, 85, 94, 103 또는 112 중 임의의 하나에 따른 폴리펩티드의 CXCR2에 대한 결합을 교차차단할 수 있는 폴리펩티드.
164. 실시양태 39 내지 41 중의 임의의 하나에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인이 실시양태 1 내지 22, 32 내지 38 또는 42 내지 144 중의 임의의 하나에서 상기 도메인에 제시된 임의의 특징을 포함하는 것인 분자.
165. 실시양태 164에 있어서, 실시양태 106 내지 135 중의 임의의 특징을 보이는 분자.
166. 실시양태 49, 58, 67, 76, 85, 94, 103 또는 112 중의 임의의 하나에 따른 폴리펩티드의 CXCR2에 대한 결합을 교차차단할 수 있는, CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
167. 실시양태 3 내지 14 및 22 내지 39에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23727에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23726에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
168. 실시양태 167에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23727에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역 및 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23726에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
169. 실시양태 168에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 220에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커에 의해 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 연결되는 것인 폴리펩티드.
170. 실시양태 3 내지 14 및 22 내지 39에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23725에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23726에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
171. 실시양태 170에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23725에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역 및 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23726에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
172. 실시양태 171에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 220에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커에 의해 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 연결되는 것인 폴리펩티드.
173. 실시양태 3 내지 14 및 22 내지 39에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23725에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23728에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
174. 실시양태 173에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23725에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역 및 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23728에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
175. 실시양태 174에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 220에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커에 의해 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 연결되는 것인 폴리펩티드.
176. 실시양태 3 내지 14 및 22 내지 39에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23727에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23728에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
177. 실시양태 176에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23727에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역 및 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23728에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
178. 실시양태 177에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 220에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커에 의해 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 연결되는 것인 폴리펩티드.
179. 실시양태 3 내지 14 및 22 내지 39에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23723에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23725에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
180. 실시양태 179에 있어서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23723에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역 및 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23725에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
181. 실시양태 180에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 220에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커에 의해 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 연결되는 것인 폴리펩티드.
182. 실시양태 3 내지 14 및 22 내지 39에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23723에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23727에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
183. 실시양태 182에 있어서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23723에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역 및 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23727에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
184. 실시양태 183에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 220에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커에 의해 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 연결되는 것인 폴리펩티드.
185. 실시양태 3 내지 14 및 22 내지 39에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23724에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23723에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
186. 실시양태 185에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23724에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역 및 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23723에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
187. 실시양태 186에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 220에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커에 의해 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 연결되는 것인 폴리펩티드.
188. 실시양태 3 내지 14 및 22 내지 39에 있어서, 실시양태 14에 제시된 구조를 포함하고, 여기서 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23724에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 기탁된 플라스미드 DSM 23728에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 CDR 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
189. 실시양태 188에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23724에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역 및 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 기탁된 플라스미드 DSM 23728에 의해 코딩되는 카바트 넘버링에 따른 아미노산 서열을 갖는 FR 영역을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
190. 실시양태 189에 있어서, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열 220에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커에 의해 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인에 연결되는 것인 폴리펩티드.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> CHEMOKINE RECEPTOR BINDING POLYPEPTIDES <130> PAT054087 <160> 248 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Asp Phe Asn Met Glu Ser Asp Ser Phe Glu Asp Phe Trp Lys 1 5 10 15 Gly Glu Asp Leu Ser Asn Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Pro Pro Phe 20 25 30 Leu Leu Asp Ala Ala Pro Cys Glu Pro Glu Ser Leu Glu Ile Asn Lys 35 40 45 Tyr Phe Val Val Ile Ile Tyr Ala Leu Val Phe Leu Leu Ser Leu Leu 50 55 60 Gly Asn Ser Leu Val Met Leu Val Ile Leu Tyr Ser Arg Val Gly Arg 65 70 75 80 Ser Val Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu 85 90 95 Phe Ala Leu Thr Leu Pro Ile Trp Ala Ala Ser Lys Val Asn Gly Trp 100 105 110 Ile Phe Gly Thr Phe Leu Cys Lys Val Val Ser Leu Leu Lys Glu Val 115 120 125 Asn Phe Tyr Ser Gly Ile Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ser Val Asp Arg 130 135 140 Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Arg Thr Leu Thr Gln Lys Arg Tyr 145 150 155 160 Leu Val Lys Phe Ile Cys Leu Ser Ile Trp Gly Leu Ser Leu Leu Leu 165 170 175 Ala Leu Pro Val Leu Leu Phe Arg Arg Thr Val Tyr Ser Ser Asn Val 180 185 190 Ser Pro Ala Cys Tyr Glu Asp Met Gly Asn Asn Thr Ala Asn Trp Arg 195 200 205 Met Leu Leu Arg Ile Leu Pro Gln Ser Phe Gly Phe Ile Val Pro Leu 210 215 220 Leu Ile Met Leu Phe Cys Tyr Gly Phe Thr Leu Arg Thr Leu Phe Lys 225 230 235 240 Ala His Met Gly Gln Lys His Arg Ala Met Arg Val Ile Phe Ala Val 245 250 255 Val Leu Ile Phe Leu Leu Cys Trp Leu Pro Tyr Asn Leu Val Leu Leu 260 265 270 Ala Asp Thr Leu Met Arg Thr Gln Val Ile Gln Glu Thr Cys Glu Arg 275 280 285 Arg Asn His Ile Asp Arg Ala Leu Asp Ala Thr Glu Ile Leu Gly Ile 290 295 300 Leu His Ser Cys Leu Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe Ile Gly Gln Lys 305 310 315 320 Phe Arg His Gly Leu Leu Lys Ile Leu Ala Ile His Gly Leu Ile Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Leu Pro Lys Asp Ser Arg Pro Ser Phe Val Gly Ser Ser 340 345 350 Ser Gly His Thr Ser Thr Thr Leu 355 360 <210> 2 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Asp Leu Ser Asn Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Pro Pro Phe 1 5 10 15 Leu Leu Asp Ala Ala Pro Cys Glu Pro Glu Ser Leu Glu Ile Asn Lys 20 25 30 Tyr Phe Val Val Ile Ile Tyr Ala Leu Val Phe Leu Leu Ser Leu Leu 35 40 45 Gly Asn Ser Leu Val Met Leu Val Ile Leu Tyr Ser Arg Val Gly Arg 50 55 60 Ser Val Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu 65 70 75 80 Phe Ala Leu Thr Leu Pro Ile Trp Ala Ala Ser Lys Val Asn Gly Trp 85 90 95 Ile Phe Gly Thr Phe Leu Cys Lys Val Val Ser Leu Leu Lys Glu Val 100 105 110 Asn Phe Tyr Ser Gly Ile Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ser Val Asp Arg 115 120 125 Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Arg Thr Leu Thr Gln Lys Arg Tyr 130 135 140 Leu Val Lys Phe Ile Cys Leu Ser Ile Trp Gly Leu Ser Leu Leu Leu 145 150 155 160 Ala Leu Pro Val Leu Leu Phe Arg Arg Thr Val Tyr Ser Ser Asn Val 165 170 175 Ser Pro Ala Cys Tyr Glu Asp Met Gly Asn Asn Thr Ala Asn Trp Arg 180 185 190 Met Leu Leu Arg Ile Leu Pro Gln Ser Phe Gly Phe Ile Val Pro Leu 195 200 205 Leu Ile Met Leu Phe Cys Tyr Gly Phe Thr Leu Arg Thr Leu Phe Lys 210 215 220 Ala His Met Gly Gln Lys His Arg Ala Met Arg Val Ile Phe Ala Val 225 230 235 240 Val Leu Ile Phe Leu Leu Cys Trp Leu Pro Tyr Asn Leu Val Leu Leu 245 250 255 Ala Asp Thr Leu Met Arg Thr Gln Val Ile Gln Glu Thr Cys Glu Arg 260 265 270 Arg Asn His Ile Asp Arg Ala Leu Asp Ala Thr Glu Ile Leu Gly Ile 275 280 285 Leu His Ser Cys Leu Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe Ile Gly Gln Lys 290 295 300 Phe Arg His Gly Leu Leu Lys Ile Leu Ala Ile His Gly Leu Ile Ser 305 310 315 320 Lys Asp Ser Leu Pro Lys Asp Ser Arg Pro Ser Phe Val Gly Ser Ser 325 330 335 Ser Gly His Thr Ser Thr Thr Leu 340 <210> 3 <211> 355 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 3 Met Gln Ser Phe Asn Phe Glu Asp Phe Trp Glu Asn Glu Asp Phe Ser 1 5 10 15 Asn Tyr Ser Tyr Ser Ser Asp Leu Pro Pro Ser Leu Pro Asp Val Ala 20 25 30 Pro Cys Arg Pro Glu Ser Leu Glu Ile Asn Lys Tyr Phe Val Val Ile 35 40 45 Ile Tyr Ala Leu Val Phe Leu Leu Ser Leu Leu Gly Asn Ser Leu Val 50 55 60 Met Leu Val Ile Leu His Ser Arg Val Gly Arg Ser Ile Thr Asp Val 65 70 75 80 Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Met Ala Asp Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu 85 90 95 Pro Ile Trp Ala Ala Ala Lys Val Asn Gly Trp Ile Phe Gly Thr Phe 100 105 110 Leu Cys Lys Val Val Ser Leu Leu Lys Glu Val Asn Phe Tyr Ser Gly 115 120 125 Ile Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val 130 135 140 His Ala Thr Arg Thr Leu Thr Gln Lys Arg Tyr Leu Val Lys Phe Val 145 150 155 160 Cys Leu Ser Ile Trp Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu 165 170 175 Leu Phe Arg Arg Thr Val Tyr Leu Thr Tyr Ile Ser Pro Val Cys Tyr 180 185 190 Glu Asp Met Gly Asn Asn Thr Ala Lys Trp Arg Met Val Leu Arg Ile 195 200 205 Leu Pro Gln Thr Phe Gly Phe Ile Leu Pro Leu Leu Ile Met Leu Phe 210 215 220 Cys Tyr Gly Phe Thr Leu Arg Thr Leu Phe Lys Ala His Met Gly Gln 225 230 235 240 Lys His Arg Ala Met Arg Val Ile Phe Ala Val Val Leu Ile Phe Leu 245 250 255 Leu Cys Trp Leu Pro Tyr His Leu Val Leu Leu Ala Asp Thr Leu Met 260 265 270 Arg Thr Arg Leu Ile Asn Glu Thr Cys Gln Arg Arg Asn Asn Ile Asp 275 280 285 Gln Ala Leu Asp Ala Thr Glu Ile Leu Gly Ile Leu His Ser Cys Leu 290 295 300 Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe Ile Gly Gln Lys Phe Arg His Gly Leu 305 310 315 320 Leu Lys Ile Leu Ala Thr His Gly Leu Ile Ser Lys Asp Ser Leu Pro 325 330 335 Lys Asp Ser Arg Pro Ser Phe Val Gly Ser Ser Ser Gly His Thr Ser 340 345 350 Thr Thr Leu 355 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 4 Met Gln Ser Phe Asn Phe Glu Asp Phe Trp Glu Asn Glu Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 5 Cys Thr Leu Met Arg Thr Arg Leu Ile Asn Glu Thr Leu Gln Arg Arg 1 5 10 15 Asn Cys <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 6 Cys Arg Arg Thr Val Tyr Leu Thr Tyr Ile Ser Pro Val Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Asp Met Gly Asn Asn Thr Ala Leu Trp Cys 20 25 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Asp Phe Asn Met Glu Ser Asp Ser Phe Glu Asp Phe Trp Lys 1 5 10 15 Gly Glu Asp <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Asp Leu Ser Asn Tyr Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu 1 5 10 15 Leu Asp Ala Ala Pro Cys Glu Pro Glu Ser Leu Glu Ile Asn Lys 20 25 30 <210> 9 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Phe Arg Arg Thr Val Tyr Ser Ser Asn Val Ser Pro Ala Cys Tyr Glu 1 5 10 15 Asp Met Gly Asn Asn Thr Ala Asn Trp Arg 20 25 <210> 10 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Cys Arg Arg Thr Val Tyr Ser Ser Asn Val Ser Pro Ala Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Asp Met Gly Asn Asn Thr Ala Asn Trp Cys 20 25 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Thr Leu Met Arg Thr Gln Val Ile Gln Glu Thr Cys Glu Arg Arg 1 5 10 15 Asn His <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Cys Thr Leu Met Arg Thr Gln Val Ile Gln Glu Thr Leu Glu Arg Arg 1 5 10 15 Asn Cys <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 13 ggctgagctg ggtggtcctg g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 14 ggctgagttt ggtggtcctg g 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 15 ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23 <210> 16 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 16 catttgagtt ggcctagccg gccatggcag aggtgcagct ggtggagtct ggggg 55 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 17 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 18 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 19 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 19 tcagtaacct ggatcccccg ccaccgctgc ctccaccgcc gctacccccg ccaccgctgc 60 ctccaccgcc tgaggagacg gtgacctg 88 <210> 20 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 20 aggttactga ggatccggcg gtggaggcag cggaggtggg ggctctggtg gcgggggtag 60 cgaggtgcag ctggtggagt ctgg 84 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 21 gaggtgcaat tggtggagtc tggg 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 22 tgaggagacg gtgacctggg tccc 24 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 23 tcttggatcc gaggtgcagc tggtggagtc tggg 34 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 24 accgcctccg gaggagaccg tgacctgggt ccc 33 <210> 25 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Gly Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Val Arg Gly Thr Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 26 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Arg Ile Gly Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Ser Gly Gln Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Val Ser Arg Ser Gly Gly Ser Thr Asp Ile Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr 85 90 95 Ala His Thr Ser Ser Tyr Ser Asn Trp Arg Val Tyr Asn Asn Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Gly Thr Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Val Ile Thr Ser Gly Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Tyr Asn 85 90 95 Val Glu Thr Val Val Gly Ala Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Gly Asn Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Lys Ile Thr Arg Gly Gly Ala Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ile Leu Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Tyr Asn 85 90 95 Val Asp Gly Gly Pro Ser Gln Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Tyr Trp Gly Leu Thr Leu Arg Leu Trp Met Pro Pro His Arg 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 30 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ile Phe Arg Leu Ser 20 25 30 Gly Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gln Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Leu Thr Lys Asp Gly Thr Leu His Tyr Ala Asp Pro Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Glu Asn Thr Trp Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Thr Gly Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 31 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Gly Thr Ile Arg 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Leu Ile Thr Ser Thr Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Gly Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Tyr Asn 85 90 95 Ile Glu Thr Leu Arg Arg Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Lys Ser Gly Gly Asn Thr His Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Arg Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Arg Thr Asn Pro Lys Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Arg Ser 20 25 30 Ala Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Trp Gly Gly Asp Asn Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Tyr Arg Gly Gly Ala Ala Val Ala Gly Trp Glu Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Leu Ala Tyr Tyr 20 25 30 Thr Val Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Arg Thr Asp Cys Lys Lys Gly Arg Val Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 35 Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Asn Tyr Tyr 20 25 30 Val Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Thr Arg Gly Ser Met Thr Lys Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu His Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Pro Arg Gly Ser Ser Trp Ser Phe Ser Ser Gly Gly Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 36 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ile Phe Arg Leu Ser 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Thr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Ala Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Ser Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu 65 70 75 80 His Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Gly Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 37 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Met His Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Val Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Ser Phe Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Pro Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp His Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ile Asp Ala Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp Thr Gln Arg Ala Arg Thr 100 105 110 Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 40 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val 35 40 45 Ala Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gly Tyr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Val Ala Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Ser Leu Ser Gly Ser Asp Tyr Leu Gly Thr Asn Leu Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met 85 90 95 Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ile Asp Ala Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp Thr Gln Arg Ala Arg Thr 100 105 110 Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg Ile 180 185 190 Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu 195 200 205 Val Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ile Asp Ala Val 210 215 220 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr 225 230 235 240 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 Asn Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp Thr Gln Arg Ala Arg 260 265 270 Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 285 <210> 45 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ile Phe Arg Leu Ser 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Thr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Ala Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Ser Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu 65 70 75 80 His Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Gly Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 145 150 155 160 Gly Gly Ser Val Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ile Phe Arg 165 170 175 Leu Ser Ala Leu Gly Trp Thr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Ala Arg Glu 180 185 190 Trp Val Ala Gly Ile Asn Ser Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Pro 195 200 205 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile 210 215 220 Tyr Leu His Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 Cys Ala Ser Gly Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 245 250 255 Ser <210> 46 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met 85 90 95 Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly 165 170 175 Ser Ile Val Arg Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly 180 185 190 Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn 195 200 205 Tyr Ile Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr 210 215 220 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 225 230 235 240 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp 245 250 255 Thr Gln Arg Ala Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 260 265 270 Thr Val Ser Ser 275 <210> 47 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ile Asp Ala Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp Thr Gln Arg Ala Arg Thr 100 105 110 Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile 180 185 190 Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu 195 200 205 Val Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val 210 215 220 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr 225 230 235 240 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 Met Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 260 265 270 Thr Val Ser Ser 275 <210> 48 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met 85 90 95 Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly 165 170 175 Ile Ile Phe Arg Leu Ser Ala Leu Gly Trp Thr Arg Gln Gly Pro Gly 180 185 190 Lys Ala Arg Glu Trp Val Ala Gly Ile Asn Ser Asp Gly Thr Thr Asn 195 200 205 Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 210 215 220 Lys Asn Thr Ile Tyr Leu His Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr 225 230 235 240 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln 245 250 255 Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 49 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ile Phe Arg Leu Ser 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Thr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Ala Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Ser Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu 65 70 75 80 His Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Gly Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro 145 150 155 160 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr 165 170 175 Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 180 185 190 Leu Val Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser 195 200 205 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met 210 215 220 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 Cys Met Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 245 250 255 Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 50 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ile Asp Ala Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp Thr Gln Arg Ala Arg Thr 100 105 110 Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 165 170 175 Gly Ser Val Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ile Phe Arg Leu 180 185 190 Ser Ala Leu Gly Trp Thr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Ala Arg Glu Trp 195 200 205 Val Ala Gly Ile Asn Ser Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val 210 215 220 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr 225 230 235 240 Leu His Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 Ala Ser Gly Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 51 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ile Phe Arg Leu Ser 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Thr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Ala Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Ser Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu 65 70 75 80 His Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Gly Lys Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 145 150 155 160 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg 165 170 175 Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu 180 185 190 Leu Val Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ile Asp Ala 195 200 205 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val 210 215 220 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 Cys Asn Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp Thr Gln Arg Ala 245 250 255 Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 52 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met 85 90 95 Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn Ala Met Gly Trp 145 150 155 160 Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Val Arg Arg Thr 165 170 175 Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Leu Asp Asp Arg 210 215 220 Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 53 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Met His Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Val Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 165 170 175 Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val 195 200 205 Phe Tyr Thr Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 210 215 220 Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 225 230 235 240 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr 245 250 255 Leu Gly His Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 260 265 270 Ser Ser <210> 54 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Met His Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Val Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly 165 170 175 Arg Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser 195 200 205 Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 210 215 220 Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser 245 250 255 Phe Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 55 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Ala 180 185 190 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 195 200 205 Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val Lys 210 215 220 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu 225 230 235 240 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 245 250 255 Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala Tyr 260 265 270 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 56 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn Ala 180 185 190 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 195 200 205 Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala 210 215 220 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 225 230 235 240 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp Gly 260 265 270 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 57 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Gly 180 185 190 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile 195 200 205 Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly 210 215 220 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 225 230 235 240 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 245 250 255 Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 58 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys Val 180 185 190 Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val Ala 195 200 205 Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Met His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly 210 215 220 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 225 230 235 240 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Val 245 250 255 Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 260 265 270 Ser Ser <210> 59 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys Val Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile 195 200 205 Arg Leu Ser Gly Asn Met His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Lys Ala Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Val Asn Ile 245 250 255 Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 60 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Gly 180 185 190 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile 195 200 205 Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val Lys Gly Arg 210 215 220 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met 225 230 235 240 Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp 245 250 255 Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala Tyr Trp Gly 260 265 270 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 61 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ile Asp Ala Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp Thr Gln Arg Ala Arg Thr 100 105 110 Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ile 180 185 190 Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu 195 200 205 Val Ala Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val 210 215 220 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Pro Thr Met Tyr 225 230 235 240 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 245 250 255 His Ala Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg Trp Gly 260 265 270 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 62 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Thr 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn Thr Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala Arg 195 200 205 Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Pro Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Ala Gly Thr 245 250 255 Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg Trp Gly Gln Gly Thr Gln 260 265 270 Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 63 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn Thr 180 185 190 Met Gly Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 195 200 205 Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 210 215 220 Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Pro Thr Met Tyr Leu Gln 225 230 235 240 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Ala 245 250 255 Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 64 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met 85 90 95 Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly 165 170 175 Arg Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser 195 200 205 Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 210 215 220 Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser 245 250 255 Phe Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 65 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met 85 90 95 Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 165 170 175 Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val 195 200 205 Phe Tyr Thr Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 210 215 220 Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 225 230 235 240 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr 245 250 255 Leu Gly His Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 260 265 270 Ser Ser <210> 66 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn Ala Met Gly 180 185 190 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Val Arg Arg 195 200 205 Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Leu Asp Asp 245 250 255 Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 67 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn Ala 180 185 190 Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Val 195 200 205 Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys Gly 210 215 220 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu Gln 225 230 235 240 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Leu 245 250 255 Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 260 265 270 Ser Ser <210> 68 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Pro Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Gly Trp Phe 180 185 190 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp 195 200 205 Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Gly 245 250 255 Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 260 265 270 Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 69 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences of multivalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Pro Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Gly Trp Phe 180 185 190 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp 195 200 205 Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240 Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Lys Asp 245 250 255 Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 70 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fr1 <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 71 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fr1 <400> 71 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Arg Ile Gly Ser 20 25 30 <210> 72 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp 20 25 30 <210> 73 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ile Phe Arg 20 25 30 <210> 74 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 75 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser 20 25 30 <210> 76 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Leu Ala 20 25 30 <210> 77 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 77 Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Asn 20 25 30 <210> 78 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 78 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ile Phe Arg 20 25 30 <210> 79 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp 20 25 30 <210> 80 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Ser Phe Arg 20 25 30 <210> 81 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 81 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg 20 25 30 <210> 82 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 83 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 84 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser 20 25 30 <210> 85 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr 20 25 30 <210> 86 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 86 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Gly Thr 20 25 30 <210> 87 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Gly Asn 20 25 30 <210> 88 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Gly Thr 20 25 30 <210> 89 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 90 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monovalent anti-CXCR2 Nanobodies <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Pro Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 91 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 91 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val Ser 1 5 10 <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 92 Trp Tyr Arg Gln Val Ser Gly Gln Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 93 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 94 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gln Arg Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 95 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 95 Trp Phe Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 96 Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 97 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 97 Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 98 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 98 Trp Phe Arg Gln Ala Gln Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 99 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 99 Trp Thr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Ala Arg Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 100 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 100 Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val Ala 1 5 10 <210> 101 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 101 Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 102 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 102 Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 103 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val Ala 1 5 10 <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 104 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 105 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 105 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 106 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 106 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Val 1 5 10 <210> 107 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 107 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 108 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 109 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 109 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 110 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 110 Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 111 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 111 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Thr 20 25 30 <210> 112 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 112 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Ala 20 25 30 <210> 113 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 113 Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 114 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 114 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Glu Asn Thr Trp Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Asn Thr 20 25 30 <210> 115 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 115 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Arg Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 116 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 116 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 117 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 117 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 118 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 118 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu His 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 119 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 119 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu His 1 5 10 15 Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser 20 25 30 <210> 120 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 120 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Val 20 25 30 <210> 121 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 121 Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Pro Thr Met Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Ala 20 25 30 <210> 122 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 122 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala 20 25 30 <210> 123 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 123 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Val Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 124 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 124 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 125 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 125 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 126 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 126 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ala Lys Lys Thr Met Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Leu 20 25 30 <210> 127 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 127 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Tyr Asn Val 20 25 30 <210> 128 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 128 Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ile Leu Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Tyr Asn Val 20 25 30 <210> 129 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 129 Arg Phe Thr Ile Gly Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Tyr Asn Ile 20 25 30 <210> 130 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 130 Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Pro Thr Met Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Ala 20 25 30 <210> 131 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 131 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 132 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 132 Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 133 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 133 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 134 Asp Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 135 Leu Ser Gly Met Ala 1 5 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 136 Asn Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 137 Arg Ser Ala Met Gly 1 5 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 138 Tyr Tyr Thr Val Gly 1 5 <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 139 Tyr Tyr Val Met Ala 1 5 <210> 140 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 140 Leu Ser Ala Leu Gly 1 5 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 141 Phe Lys Val Met Gly 1 5 <210> 142 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 142 Ile Asn Thr Met Gly 1 5 <210> 143 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 143 Ile Asn Thr Met Gly 1 5 <210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 144 Ser Leu Ser Met Gly 1 5 <210> 145 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 145 Asp Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 146 Ser Asn Ala Met Gly 1 5 <210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 147 Ile Asn Ala Met Gly 1 5 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 148 Ile Asn Ala Met Gly 1 5 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 149 Ile Asn Ala Met Gly 1 5 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 150 Ile Arg Ala Met Gly 1 5 <210> 151 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 151 Ile Asn Thr Met Gly 1 5 <210> 152 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 152 Ala Ile Asn Ala Gly Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 153 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 153 Val Ser Arg Ser Gly Gly Ser Thr Asp Ile Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 154 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 154 Cys Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 155 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 155 Val Leu Thr Lys Asp Gly Thr Leu His Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 156 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 156 Ala Ile Asn Lys Ser Gly Gly Asn Thr His Tyr Ala Gly Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 157 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 157 Gly Ile Ser Trp Gly Gly Asp Asn Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 158 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 158 Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 159 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 159 Ala Ile Ser Thr Arg Gly Ser Met Thr Lys Tyr Ser Asp Ser Val Gln 1 5 10 15 Gly <210> 160 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 160 Gly Ile Asn Ser Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 161 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 161 Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Met His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 162 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 162 Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 163 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 163 Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ile Asp Ala Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 164 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 164 Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gly Tyr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 165 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 165 Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 166 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 166 Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 167 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 167 Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 168 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 168 Val Ile Thr Ser Gly Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 169 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 169 Lys Ile Thr Arg Gly Gly Ala Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 170 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 170 Leu Ile Thr Ser Thr Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 171 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 171 Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 172 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 172 Val Arg Gly Thr Ala Arg Asp Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 173 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 173 His Thr Ser Ser Tyr Ser Asn Trp Arg Val Tyr Asn Asn Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 174 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 174 Tyr Trp Gly Leu Thr Leu Arg Leu Trp Met Pro Pro His Arg Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 175 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 175 Gly Arg Tyr 1 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 176 Ser Arg Thr Asn Pro Lys Pro Asp Tyr 1 5 <210> 177 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 177 Arg Tyr Arg Gly Gly Ala Ala Val Ala Gly Trp Glu Tyr 1 5 10 <210> 178 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 178 Asp Arg Arg Thr Asp Cys Lys Lys Gly Arg Val Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 <210> 179 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 179 Asp Pro Arg Gly Ser Ser Trp Ser Phe Ser Ser Gly Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 180 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 180 Gly Lys Tyr 1 <210> 181 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 181 Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr 1 5 <210> 182 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 182 Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp His 1 5 10 <210> 183 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 183 Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp Thr Gln Arg Ala Arg Thr Gly 1 5 10 15 Asn Tyr <210> 184 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 184 Asp Ser Leu Ser Gly Ser Asp Tyr Leu Gly Thr Asn Leu Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 185 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 185 Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 186 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 186 Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 187 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 187 Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr 1 5 <210> 188 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 188 Glu Thr Val Val Gly Ala Val Tyr 1 5 <210> 189 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 189 Asp Gly Gly Pro Ser Gln Asn Tyr 1 5 <210> 190 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 190 Glu Thr Leu Arg Arg Asn Tyr 1 5 <210> 191 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 191 Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg 1 5 10 <210> 192 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 192 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acctactgga tgtattgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctcgactg ggtctcagct attaatgctg gtggtgatag cacatactat 180 gcagaccccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acaacaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac acggccctgt attactgtgc gaccgtacga 300 ggcacagctc gtgacttgga ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357 <210> 193 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 193 gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgcac tctctggaag gatcggcagt atcaacgcca tgggctggta tcgccaggtt 120 tcaggacaac agcgcgagtt ggtcgcagta agcaggagcg gaggtagcac agacattgct 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg gcaagaacac agtgtatctg 240 cagatggaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgttatgc tcatacttca 300 agctatagta attggcgagt ctacaataac gactactggg gccaggggac ccaggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 194 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 194 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactt 60 acctgtgcag cctctggacg catcggcact atcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120 ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagtt attactagtg gtggtaggat agactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac ggtgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actataatgt agaaacggta 300 gtgggtgccg tctactgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348 <210> 195 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 195 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggaag gatgggcaat atcaatgcca tgggctggta tcgccaggct 120 ccagggaagg agcgcgagtt ggtcgcaaaa attactaggg gtggtgcgat aacctatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatcgcc agagacaata ttctgaacac ggcgtatctg 240 caaatgaacg acctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt attataatgt agatgggggg 300 cccagtcaaa actactgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctca 348 <210> 196 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 196 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcgat gattatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120 ccagggaagg agcgtgagag ggtctcatgt attagtggta gtgatggtag cacatactat 180 gcagactccg tcaagggccg attcaccatc tccagtgaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcaaatga acaacctgaa acccgaggac acggccgttt attattgtgc agcatattgg 300 ggactaacgc tcaggctatg gatgcccccc caccggtatg actactgggg ccaggggacc 360 caggtcaccg tctcctca 378 <210> 197 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 197 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagcctc 60 tcctgtgcag cctctggact tatcttcaga ctcagtggca tggcctggta tcgccaggct 120 ccggggaggc agcgcgagtg ggtcgcagtg cttaccaaag atggtaccct acactatgca 180 gaccccgtga agggccgatt caccatctcc agaaacaacg ccgagaacac gtggtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccatctatt actgtaatac gggccgttac 300 tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tca 333 <210> 198 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 198 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc actgagactc 60 tcctgtgcag cctctggaac catcggcacg atcagagcca tgggctggta ccgccaggct 120 ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcattg attactagta ctggtaggat aaactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccattgga agagacaatg ccaagaacac ggcgtatctg 240 caaatgaaca acctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actataatat cgaaacacta 300 cgacgtaact actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345 <210> 199 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 199 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg cacctttagt aactatgcca tgggctggtt ccgccaggcc 120 acagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attaacaaga gtggtgggaa cacacactat 180 gcaggctccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctagggac acggccgttt attactgtgc agcgtcgcgg 300 actaacccta agcctgacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354 <210> 200 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 200 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg ctccttcagt cgcagtgcca tgggctggct ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgtgaatt tgtagcaggt attagctggg gtggtgataa ctcatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa caccgtgtct 240 ctacaaatga acagcctgaa acctcaggac acggccgttt attactgtgc agcaagatac 300 cggggaggcg cggcagtagc tggttgggag tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 201 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 201 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatc cactttggcc tattataccg taggctggtt ccgccgggcc 120 ccagggaagg agcgcgaggg gatctcatgt attagtagta gtgatggtag cacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa tacggtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc ggctgacaga 300 cgtaccgact gtaaaaaggg tagagtcggt tctggttcct ggggccaggg gacccaggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 202 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 202 aaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggg ctggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggacg cgccttcaat tactatgtca tggcctggtt ccgccaggct 120 caagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attagcacgc gtggtagtat gacaaagtat 180 tcagactccg tgcagggccg gttcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcacatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt attactgtgc agcagaccct 300 cgcggcagta gctggtcatt ttcgtccggg ggttatgact actggggcca ggggacccag 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 203 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 203 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tgtgagactc 60 tcctgtgtag cctctggaat catcttcaga ctcagtgcgt tgggttggac acgccagggt 120 ccaggaaagg cgcgcgagtg ggtcgcaggt attaacagtg atggtacgac caactacgcc 180 gaccccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac gatatatctg 240 cacatggaca tgctgaaacc tgaggatacg gccgtctatt actgtgcctc cggaaagtac 300 cggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tca 333 <210> 204 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 204 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggagtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggaag caccttcgat ttcaaagtca tgggctggta ccgccagcct 120 ccagggaagc agcgcgaggg ggtcgcagcg attaggctta gtggtaacat gcactatgca 180 gagtccgtga agggccgatt caccatctcc aaagccaacg ccaagaacac agtgtatctg 240 caaatgaaca gcctgagacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaaggt gaacattcgg 300 ggccaggact actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345 <210> 205 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 205 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgacgctc 60 tcctgtgcag tctctggaag ctccttcaga atcaatacca tgggctggta ccgccgggct 120 ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagct cgtgatagag gtggttacat aaactatgta 180 gattccgtga agggccgatt caccgtctcc agagacaacg ccaagcccac aatgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt attgtcatgc cgggacccaa 300 gatcggacgg gtcggaattt cgaccactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 <210> 206 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 206 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggaag catcgtcaga attaatacca tgggctggta ccgccagact 120 ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagat attaccagtg gtggtaacat aaactatata 180 gacgccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaaca ccaagaacac ggtgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgc agagatcgtt 300 gttctggtgg gagtttggac ccagcgtgcg cggaccggca actactgggg ccaggggacc 360 caggtcaccg tctcctca 378 <210> 207 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 207 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg cacgttcagt agcttgtcca tgggctggtt ccgccaggct 120 ccggggaagg agcgtgcctt tgtagcagcg cttactcgaa atggtggtta cagatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagacg tcgccaagaa gaccttatat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtct attactgtgc agcagatagt 300 cttagtggta gtgactactt aggaaccaac ctagactact ggggccaggg gacccaggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 208 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 208 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt gactatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct attacgtgga atggtggtag agtattttat 180 actgcctccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgatgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agcagataaa 300 gacagacgta ctgactatct agggcacccc gttgcctact ggggccaggg gacccaggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 209 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 209 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttggtgcagc ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggacg catcttcagt agcaatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcggcc attacctgga ggagtggcgg tagcgcgtac 180 tatgcagact ccgcgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaacacggtg 240 tatttgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gacacggccg tttattattg tgcagctggt 300 ggtagttcct ggttaagttt tccgccggac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 210 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 210 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagag ttggtgcagc cgggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggaag catcttaact atcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120 ccagggaagc agcgcgagtt ggtagtccgt aggactaggg gtggtagtac aacgtatcaa 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc gcagacattg ccaagaaaac gatgtatctc 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaagacacg gccgtctatt actgtatgct agatgaccgt 300 gggggtgtct actggggtca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345 <210> 211 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NUCLEIC ACID ENCODING MONOVALENT NANOBODY <400> 211 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgacgctc 60 tcctgtgcag tctctggaag caccttcaga atcaatacca tgggctggta ccgccgggct 120 ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagct cgtgatagag gtggttacat aaactatgta 180 gattccgtga agggccgatt caccgtctcc agagacaacg ccaagcccac aatgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt attgtcatgc cgggacccaa 300 gatcggacgg gtcggaattt cgaccgctgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 <210> 212 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 <210> 213 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of sequence-optimised variants <400> 213 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ser Lys Lys Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu 85 90 95 Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 214 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of sequence-optimised variants <400> 214 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Val Arg Arg Thr Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ser Lys Asn Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu 85 90 95 Leu Asp Asp Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 215 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of sequence-optimised variants <400> 215 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp Thr Gln Arg Ala Arg Thr 100 105 110 Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 216 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of sequence-optimised variants <400> 216 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Arg His Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Val Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 217 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of sequence-optimised variants <400> 217 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 218 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of sequence-optimised variants <400> 218 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 219 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences of sequence-optimised variants <400> 219 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Pro Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 220 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE LINKER <400> 220 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 221 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of sequence-optimised biparatopic <400> 221 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Arg His Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Val Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 165 170 175 Arg Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser 195 200 205 Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 210 215 220 Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser 245 250 255 Phe Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 222 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of sequence-optimised biparatopic <400> 222 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Arg His Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Val Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 165 170 175 Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val 195 200 205 Phe Tyr Thr Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 210 215 220 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 225 230 235 240 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr 245 250 255 Leu Gly His Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 260 265 270 Ser Ser <210> 223 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of sequence-optimised biparatopic <400> 223 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Pro Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu 145 150 155 160 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Gly Trp Phe 180 185 190 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp 195 200 205 Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Gly 245 250 255 Ser Ser Trp Leu Ser Phe Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 260 265 270 Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 224 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of sequence-optimised biparatopic <400> 224 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Pro Thr Met Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His 85 90 95 Ala Gly Thr Gln Asp Arg Thr Gly Arg Asn Phe Asp Arg Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu 145 150 155 160 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Gly Trp Phe 180 185 190 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp 195 200 205 Asn Gly Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240 Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Lys Asp 245 250 255 Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Gly His Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 260 265 270 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 275 <210> 225 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of sequence-optimised biparatopic <400> 225 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Arg His Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Val Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 165 170 175 Arg Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser 195 200 205 Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 210 215 220 Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Gly Ser Ser Trp Leu Ser 245 250 255 Phe Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 305 310 315 320 Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 325 330 335 Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 340 345 350 Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala 355 360 365 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr 370 375 380 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 385 390 395 400 Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr 405 410 415 Leu Val Thr Val Ser Ser 420 <210> 226 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of sequence-optimised biparatopic <400> 226 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Arg His Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Val Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 165 170 175 Ser Ile Val Arg Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn 195 200 205 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 210 215 220 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 225 230 235 240 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ile Val Val Leu Val Gly Val Trp 245 250 255 Thr Gln Arg Ala Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 260 265 270 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 275 280 285 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 290 295 300 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 305 310 315 320 Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 325 330 335 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 340 345 350 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp 355 360 365 Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 370 375 380 Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu 385 390 395 400 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser 405 410 415 Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 420 425 <210> 227 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of sequence-optimised biparatopic <400> 227 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp Phe Lys 20 25 30 Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Arg His Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95 Val Asn Ile Arg Gly Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 165 170 175 Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Gly Arg Val 195 200 205 Phe Tyr Thr Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 210 215 220 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 225 230 235 240 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Lys Asp Arg Arg Thr Asp Tyr 245 250 255 Leu Gly His Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 260 265 270 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 305 310 315 320 Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 325 330 335 Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 340 345 350 Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu 355 360 365 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 370 375 380 Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 385 390 395 400 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln 405 410 415 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 420 <210> 228 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of sequence-optimised biparatopic <400> 228 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 229 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 229 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Thr 20 25 30 <210> 230 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 230 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Val Arg 20 25 30 <210> 231 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 231 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Asp 20 25 30 <210> 232 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 232 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser 20 25 30 <210> 233 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 233 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 234 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR1 <400> 234 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 235 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 235 Asp Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 236 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 236 Ala Ile Arg Leu Ser Gly Asn Arg His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 237 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 <400> 237 Ala Ile Thr Trp Arg Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 238 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 238 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ser Lys Lys Thr Met Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Leu 20 25 30 <210> 239 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 239 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ser Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Leu 20 25 30 <210> 240 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 240 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala 20 25 30 <210> 241 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 241 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Val 20 25 30 <210> 242 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 242 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 243 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 243 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 244 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR3 <400> 244 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Pro Thr Met Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Ala 20 25 30 <210> 245 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR4 <400> 245 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 246 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 246 Thr Tyr Trp Met Tyr 1 5 <210> 247 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FR2 <400> 247 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val Ala 1 5 10 <210> 248 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 <400> 248 Ile Asn Ala Met Gly 1 5

Claims (1)

  1. 적어도 2개의 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 케모카인 수용체 CXCR2에 대해 작용하거나 그에 결합하고, CXCR2 상의 제1 에피토프를 인식하는 제1 항원 결합 도메인 및 CXCR2 상의 제2 에피토프를 인식하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 또는 COPD 악화를 치료하기 위한 용도.
KR1020157011185A 2010-11-08 2011-11-07 Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드 KR101832040B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41108310P 2010-11-08 2010-11-08
US61/411,083 2010-11-08
PCT/EP2011/069571 WO2012062713A1 (en) 2010-11-08 2011-11-07 Cxcr2 binding polypeptides

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137014687A Division KR101650995B1 (ko) 2010-11-08 2011-11-07 Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150051245A true KR20150051245A (ko) 2015-05-11
KR101832040B1 KR101832040B1 (ko) 2018-04-04

Family

ID=45001722

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137014687A KR101650995B1 (ko) 2010-11-08 2011-11-07 Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드
KR1020157011185A KR101832040B1 (ko) 2010-11-08 2011-11-07 Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137014687A KR101650995B1 (ko) 2010-11-08 2011-11-07 Ｃｘｃｒ２ 결합 폴리펩티드

Country Status (26)

Country Link
US (3) US8591896B2 (ko)
EP (3) EP3578568A3 (ko)
JP (2) JP5933573B2 (ko)
KR (2) KR101650995B1 (ko)
CN (1) CN103328512B (ko)
AR (1) AR083784A1 (ko)
AU (4) AU2011328246B2 (ko)
BR (1) BR112013011003B1 (ko)
CA (2) CA2817132A1 (ko)
CL (1) CL2013001168A1 (ko)
CO (1) CO6761351A2 (ko)
CR (1) CR20130202A (ko)
CU (1) CU24111B1 (ko)
EA (2) EA037063B1 (ko)
ES (2) ES2970234T3 (ko)
GT (1) GT201300113A (ko)
IL (1) IL225897B (ko)
MA (1) MA34711B1 (ko)
MX (2) MX343085B (ko)
NZ (1) NZ610075A (ko)
PE (1) PE20140772A1 (ko)
SG (1) SG189981A1 (ko)
TW (2) TWI619811B (ko)
UA (1) UA115027C2 (ko)
UY (1) UY33714A (ko)
WO (1) WO2012062713A1 (ko)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA037063B1 (ru) 2010-11-08 2021-02-01 Аблинкс Н.В. Cxcr2-связывающие полипептиды
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
US20160060347A1 (en) * 2013-04-17 2016-03-03 Morphosys Ag Antibodies targeting specifically human cxcr2
CN103396482B (zh) * 2013-05-17 2016-08-10 东南大学 一种前白蛋白纳米抗体、其编码序列及应用
WO2015063331A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Synthetic single domain antibody
WO2015189162A1 (en) * 2014-06-09 2015-12-17 Theranyx Single-domain antibodies directed against a cys-loop receptor and methods for obtaining them
WO2017220990A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 antibodies
KR20230173731A (ko) * 2017-01-30 2023-12-27 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 1가 항-프로페르딘 항체 및 항체 단편
EP3585816A4 (en) * 2017-02-27 2020-12-30 Monash University CXCR2 ANTIBODIES AND THEIR USES
KR20200089286A (ko) 2017-11-16 2020-07-24 노파르티스 아게 조합 요법
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
AU2019312576A1 (en) 2018-08-01 2021-02-25 Cephalon, LLC Anti-CXCR2 antibodies and uses thereof
JP2022514315A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与計画及び薬剤組み合わせ
JP7483732B2 (ja) 2019-02-15 2024-05-15 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソ－５－（ピペリジン－４－イル）イソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
JP7488826B2 (ja) 2019-02-15 2024-05-22 ノバルティス アーゲー 置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
JP2022547018A (ja) * 2019-09-04 2022-11-10 シャンハイテック ユニバーシティ 抗ｃｘｃｒ２抗体およびその使用
CA3165399A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
US20230321067A1 (en) 2020-06-23 2023-10-12 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
US20240068004A1 (en) * 2022-08-15 2024-02-29 Mbrace Therapeutics, Inc. Cell-free methods of producing antibodies to intracellular targets
WO2024133935A1 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Ablynx Nv Protein-based conjugation carriers
WO2024170756A1 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Ablynx N.V. Polypeptides binding to the neonatal fc receptor

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
ES2149772T5 (es) 1991-03-29 2008-02-16 Genentech, Inc. Receptores humanos pf4a y su utilizacion.
US5440021A (en) * 1991-03-29 1995-08-08 Chuntharapai; Anan Antibodies to human IL-8 type B receptor
US5374506A (en) 1991-09-13 1994-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Amino acid sequence for a functional human interleukin-8 receptor
CA2137558A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Wayne A. Marasco Method of intracellular binding of target molecules
EP2192131A1 (en) 1992-08-21 2010-06-02 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
CA2162878A1 (en) 1993-06-09 1994-12-22 Leon Gerardus Joseph Frenken Process for producing fusion proteins comprising scfv fragments by a transformed mould
US6091639A (en) 1993-08-27 2000-07-18 Kabushiki Kaisha Toshiba Non-volatile semiconductor memory device and data programming method
US6448379B1 (en) 1993-09-14 2002-09-10 Chiron Corporation IL8 inhibitors
WO1995022618A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
AU7298398A (en) 1996-11-19 1998-06-10 Sangstat Medical Corporation Enhanced effects for hapten conjugated therapeutics
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
EP1027439B1 (en) 1997-10-27 2010-03-17 Bac Ip B.V. Multivalent antigen-binding proteins
BR9907950A (pt) 1998-02-19 2001-12-18 Xcyte Therapies Inc Composições e processos para regulagem deativação de linfócitos
EP0967284A1 (en) 1998-05-28 1999-12-29 Pfizer Limited Phosphodiesterases
GB9824632D0 (en) 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds
AU779162B2 (en) 1999-02-05 2005-01-06 Rijksuniversiteit Leiden Method of modulating metabolite biosynthesis in recombinant cells
DE1100895T1 (de) 1999-03-15 2001-09-06 The University Of British Columbia, Vancouver Abc1 polypeptide und verfahren und reagenzien zur modulation des cholesterolgehalts
AU777461B2 (en) 1999-06-18 2004-10-14 Gilead Palo Alto, Inc. Compositions and methods for increasing cholesterol efflux and raising HDL using ATP binding cassette transporter protein ABC1
AU6322900A (en) 1999-08-02 2001-02-19 Keygene N.V. Method for generating resistance against cgmmv in plants, genetic constructs for use in said method, and cgmmv-resistant plants obtained via said method
GB9922124D0 (en) 1999-09-17 1999-11-17 Pfizer Ltd Phosphodiesterase enzymes
DE19955408A1 (de) 1999-11-18 2001-05-23 Bayer Ag GABA-B-Rezeptoren
CA2390691C (en) 1999-12-24 2016-05-10 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
EP1268554A2 (de) * 2000-03-31 2003-01-02 IPF Pharmaceuticals GmbH Diagnostik- und arzneimittel zur untersuchung des zelloberflächenproteoms von tumor- und entzündungszellen sowie zur behandlung von tumorerkrankungen und entzündlichen erkrankungen vorzugsweise mit hilfe einer spezifischen chemokinrezeptor-analyse und der chemokinrezeptor-ligand-interaktion
CA2405557C (en) 2000-04-12 2013-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US6741957B1 (en) 2000-07-21 2004-05-25 Daimlerchrysler Corporation Analytical tire model for vehicle durability and ride comfort analysis
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
KR100927261B1 (ko) 2001-01-17 2009-11-18 트루비온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질
US7211395B2 (en) 2001-03-09 2007-05-01 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US20030017150A1 (en) 2001-03-14 2003-01-23 Torphy Theodore J. Chronic obstructive pulmonary disease-related immunglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
WO2003014960A2 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
US20030064053A1 (en) 2001-08-31 2003-04-03 Shengjiang Liu Multivalent protein conjugate with multiple ligand-binding domains of receptors
US7253007B2 (en) 2001-11-30 2007-08-07 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
US7442512B2 (en) * 2001-11-30 2008-10-28 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
KR100599789B1 (ko) 2001-12-03 2006-07-12 삼성에스디아이 주식회사 방열효율이 향상된 플라즈마 디스플레이 장치 및 그 제조방법
CA2471645A1 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Immunoconjugates useful for treatment of tumours
EP2135879A3 (en) 2002-06-28 2010-06-23 Domantis Limited Ligand
US7004940B2 (en) 2002-10-10 2006-02-28 Ethicon, Inc. Devices for performing thermal ablation having movable ultrasound transducers
BRPI0315666B8 (pt) 2002-10-23 2021-05-25 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd dna de a34 e a33 do tipo 3, proteínas, seus anticorpos e métodos de tratamento usando os mesmos
US20060263774A1 (en) 2002-11-01 2006-11-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP2006520584A (ja) 2002-11-08 2006-09-14 アブリンクス エン．ヴェー． 安定化単一ドメイン抗体
AU2003286004A1 (en) 2002-11-08 2004-06-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor
ES2374068T3 (es) 2002-12-03 2012-02-13 Ucb Pharma, S.A. Ensayo para identificar células productoras de anticuerpos.
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
ES2373947T3 (es) 2002-12-16 2012-02-10 Genmab A/S Anticuerpos monoclonales humanos contra interleucina 8 (il-8).
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
KR101025143B1 (ko) 2002-12-31 2011-04-01 넥타르 테라퓨틱스 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
DK1639011T3 (da) * 2003-06-30 2009-02-16 Domantis Ltd Pegylerede enkelt-domæne antistoffer (dAb)
WO2005018629A1 (en) 2003-08-12 2005-03-03 Yarbrough William M Treatment for acne vulgaris and method of use
EP1658500B1 (en) 2003-08-20 2012-04-18 UCB Pharma, S.A. Methods for obtaining antibodies
WO2005103702A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with cxc chemokine receptor 2 (cxcr2)
US20060008601A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Zeik Douglas B Flexible laminate having an integrated pressure release valve
SI2311874T1 (sl) 2004-07-22 2017-12-29 Erasmus University Medical Center Rotterdam Department of Cell Biology and Genetics Vezavne molekule
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
CA2583017A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as alzheimer's disease
WO2006040154A2 (en) 2004-10-14 2006-04-20 Dublin City University Prokaryotic two hybrid system
NO322440B1 (no) 2004-10-19 2006-10-09 Per-Yngve Monsen Fremgangsmate og datasystem for ervervelse av kunder
CA2595682A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
EP2172484A3 (en) 2005-05-18 2010-05-19 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins
CN101213214B (zh) 2005-05-20 2014-06-25 埃博灵克斯股份有限公司 针对冯威勒布兰特因子的单一结构域vhh抗体
CA2617539A1 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Washington University In St. Louis Phosphospecific chemokine receptor antibodies
EP2495257A3 (en) 2005-08-19 2012-10-17 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007112940A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Ablynx N.V. Albumin-derived amino acid sequence, use thereof for increasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic compounds and entities, and constructs comprising the same
WO2007118670A1 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Ablynx N.V. Dp-78-like nanobodies
CN101070346A (zh) * 2006-05-08 2007-11-14 陈正贤 一种制备双功能抗体的方法
WO2008000279A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Aida Centre, S.L. Blister package integrating rfid based tags
CA2656620C (en) 2006-07-04 2018-03-13 Genmab A/S Cd20 binding molecules for the treatment of copd
AU2007285695B2 (en) 2006-08-18 2012-05-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling
US7943310B2 (en) 2006-08-30 2011-05-17 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods for assessing response to therapy in subjects having ulcerative colitis
WO2008028977A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US20100034194A1 (en) 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
EP2086998B1 (en) 2006-10-11 2011-12-07 Ablynx N.V. Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the ph, compounds comprising the same, and use thereof
US20100062004A1 (en) 2006-12-19 2010-03-11 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders
EP2238156B1 (en) 2008-01-29 2014-10-01 Ablynx N.V. Methods to stabilize proteins and polypeptides
NL2001374C2 (nl) 2008-03-13 2009-09-15 Securo B V Werkwijze voor het machinaal vervaardigen van een samenstel van een eerste flexibel vel en een tweede flexibel vel.
EP2285833B1 (en) * 2008-05-16 2014-12-17 Ablynx N.V. AMINO ACID SEQUENCES DIRECTED AGAINST CXCR4 AND OTHER GPCRs AND COMPOUNDS COMPRISING THE SAME
US9005963B2 (en) * 2008-10-14 2015-04-14 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against cellular receptors for viruses and bacteria
CN102257003B (zh) * 2008-12-19 2017-04-05 埃博灵克斯股份有限公司 用于产生针对细胞相关抗原如p2x7、cxcr7或cxcr4的免疫球蛋白的基因免疫
MX2011007049A (es) 2009-02-24 2011-08-03 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Metodos para identificar inmunoligadores de los antegenos de la superficie celular.
EA037063B1 (ru) 2010-11-08 2021-02-01 Аблинкс Н.В. Cxcr2-связывающие полипептиды

Also Published As

Publication number Publication date
TW201233795A (en) 2012-08-16
CO6761351A2 (es) 2013-09-30
MX2022013520A (es) 2022-11-16
US9127067B2 (en) 2015-09-08
TW201736401A (zh) 2017-10-16
BR112013011003B1 (pt) 2021-12-07
AU2016234907A1 (en) 2016-10-20
MX343085B (es) 2016-10-24
EP3575321A1 (en) 2019-12-04
TWI619811B (zh) 2018-04-01
CN103328512A (zh) 2013-09-25
CL2013001168A1 (es) 2014-04-04
JP5933573B2 (ja) 2016-06-15
GT201300113A (es) 2015-06-02
EA037063B1 (ru) 2021-02-01
AU2011328246A1 (en) 2013-05-23
WO2012062713A1 (en) 2012-05-18
MX2013005186A (es) 2013-07-03
EP2638068B1 (en) 2018-12-26
CU24111B1 (es) 2015-08-27
KR20130108414A (ko) 2013-10-02
TWI619730B (zh) 2018-04-01
NZ610075A (en) 2015-03-27
US20120183549A1 (en) 2012-07-19
AU2020217351A1 (en) 2020-09-03
ES2723775T3 (es) 2019-09-02
KR101832040B1 (ko) 2018-04-04
JP2016174611A (ja) 2016-10-06
MA34711B1 (fr) 2013-12-03
EP3578568A3 (en) 2020-01-08
IL225897B (en) 2019-03-31
UA115027C2 (uk) 2017-09-11
US20140050736A1 (en) 2014-02-20
EP3575321B1 (en) 2023-07-26
PE20140772A1 (es) 2014-07-03
IL225897A0 (en) 2013-06-27
US20170101476A1 (en) 2017-04-13
EP2638068A1 (en) 2013-09-18
EA201390666A1 (ru) 2013-11-29
KR101650995B1 (ko) 2016-08-25
UY33714A (es) 2012-06-29
EA202092589A2 (ru) 2021-03-31
ES2970234T3 (es) 2024-05-27
JP2013545456A (ja) 2013-12-26
US8591896B2 (en) 2013-11-26
AU2018275016B2 (en) 2020-07-09
CU20130066A7 (es) 2013-09-27
CA2817132A1 (en) 2012-05-18
AU2018275016A1 (en) 2019-01-03
AU2011328246B2 (en) 2016-06-30
BR112013011003A2 (pt) 2016-08-23
AR083784A1 (es) 2013-03-20
US10174118B2 (en) 2019-01-08
JP6294382B2 (ja) 2018-03-14
SG189981A1 (en) 2013-06-28
CA3239880A1 (en) 2012-05-18
EA202092589A3 (ru) 2021-06-30
EP3578568A2 (en) 2019-12-11
CR20130202A (es) 2013-06-28
CN103328512B (zh) 2017-04-05
AU2020217351B2 (en) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020217351B2 (en) CXCR2 binding polypeptides
US11466089B2 (en) Chemokine receptor binding polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant