TW201736401A - 趨化細胞素受體結合多肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於針對或特異性結合於趨化細胞素受體CXCR2之多肽，且詳言之關於能夠調節來自CXCR2之信號轉導的多肽。本發明亦關於能夠表現本發明多肽的核酸、載體及宿主細胞，包含該等多肽之醫藥組合物，及以該等多肽及組合物於治療涉及CXCR2功能異常之疾病的用途。

Description

趨化細胞素受體結合多肽
本發明係關於針對或特異性結合於趨化細胞素受體CXCR2之多肽且詳言之關於能夠調節來自CXCR2之信號轉導的多肽。本發明亦關於能夠表現本發明之多肽的核酸、載體及宿主細胞，包含該等多肽之醫藥組合物，及該等多肽及組合物用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)及涉及CXCR2功能異常之其他疾病的用途。
慢性阻塞性肺病(COPD)為用於描述特徵為氣流受限之多種病症的術語，其在大多數情況下為進行性的且與肺對毒性粒子之異常發炎性反應相關，其中肺薄壁組織之破壞導致氣管功能衰退(Barnes PJ等人，2003,Chronic obstructive pulmonary disease：molecular and cellular mechanisms.Eur.Respir J, 22,672-688；Barnes PJ等人，2004,Mediators of chronic obstructive pulmonary disease.Pharmacol.Rev. 56,515-548)。儘管遺傳及環境因素造成COPD的出現，但吸菸為最重要的單一原因，其中復發性肺感染導致肺功能發生進行性衰退。只有及早實施戒菸才可減慢疾病進展，但在隨後發生明顯症狀後戒菸的作用極小。若干種共病病狀與COPD相關，諸如哮喘、心血管疾病、抑鬱症及肌肉萎縮(Mannino DM及Buist S,2007 Global burden of COPD：risk factors,prevalence and future trends.Lancet,370,765-773)。
趨化細胞素在趨化因子中佔主要地位且因此在協調COPD肺之慢 性發炎及其在急性惡化期間之進一步擴大中具有關鍵作用。趨化細胞素IL-8(CXCL8)、GROα(CXCL1)及ENA-78(CXCL5)之生物學活性由兩個細胞表面受體群體CXCR1及CXCR2介導，其存在於白血球及遍佈全身之許多其他細胞類型上。白血球之遷移主要經由CXCR2介導，CXCR2結合若干種配體，包括IL-8、GROα、GROβ、GROγ、ENA78及GCP-2。相比之下，CXCR1由IL-8選擇性活化且在較小程度上由GCP-2選擇性活化。仍不清楚活體內人類嗜中性白血球趨化性是否由一種或兩種受體介導。
CXCR2與CXCR1在胺基酸層面上共有78%同源性且兩種受體以不同分佈模式存在於嗜中性白血球上。CXCR2在各種細胞及組織(包括CD8+ T細胞、NK、單核細胞、肥大細胞、上皮、內皮、平滑肌，及中樞神經系統中之許多細胞類型)上的表現表明此受體在兩種組成性病狀下及在多種急性及慢性疾病之病理生理學中具有廣泛功能作用。CXCR2活化可刺激受體與鳥嘌呤核苷酸結合蛋白之Gi家族偶合，此轉而又刺激細胞內肌醇磷酸鹽之釋放，刺激細胞內Ca2+增加，及藉由ERK1/2依賴性機制刺激與向趨化細胞素梯度之定向細胞遷移相關的細胞內蛋白質的磷酸化。一旦活化，CXCR2經磷酸化且經由抑制蛋白/動力蛋白依賴性機制快速內化，導致受體去敏。此過程類似於對於大部分其他GPCR所觀察到的，但促效劑誘導之CXCR2內化的速率及程度大於對於CXCR1所觀察到的(Richardson RM,Pridgen BC,Haribabu B,Ali H,Synderman R.1998 Differential cross-regualtion of the human chemokine receptors CXCR1 and CXCR2.Evidence for time-dependent signal generation.J Biol.Chem,273,23830-23836)。
IL-8長久以來被暗指為COPD嗜中性發炎之介體(Keatings VM等人，1996,Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma.Am.J.Respir.Crit.Care Med. 153,530-534；Yamamoto C等人1997 Airway inflammation in COPD assessed by sputum levels of interleukin-8.Chest,112,505-510)。在來自COPD患者之支氣管、小氣管及肺薄壁組織的活檢中，存在T細胞浸潤及許多嗜中性白血球之增加，尤其在氣管腔中(Hogg JC等人，2004,The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease.N.Eng.J.Med. 350,2645-2653)。嗜中性白血球在COPD患者之肺中有所增加且此與疾病嚴重程度有關(Keatings VM等人，1996,Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma.Am.J.Respir.Crit.Care Med. 153,530-534)。另外，TNFα之含量在COPD患者之痰中有所升高且此會誘導來自氣管上皮細胞之IL-8(Keatings)。與正常吸菸者及非吸菸者相比，GROα濃度在COPD患者之被誘導的痰及支氣管肺泡灌洗(BAL)流體中顯著升高(Traves SL等人2002,Increased levels of the chemokines GROα and MCP-1 in sputum samples from patients with COPD.Thorax,57,50-595；Pesci A.等人1998,Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with COPD.Eur Respir J. 12,380-386)。GROα由肺泡巨噬細胞及氣管上皮細胞回應於TNFα刺激而分泌且選擇性活化CXCR2，其對於嗜中性白血球及單核細胞具有趨化性。單核細胞對COPD患者體內GROα的趨化反應增加，其可能與此等細胞中CXCR2之周轉或再循環增加有關(Traves SL等人，2004,Specific CXC but not CC chemokines cause elevated monocyte migration in COPD：a role for CXCR2,J Leukoc.Biol. 76,441-450)。病毒性及細菌性肺感染通常導致COPD患者之嚴重惡化，其特徵在於氣管中之嗜中性白血球數目增加(Wedzicha JA,Seemungal TA.,2007,COPD exacerbations：defining their cause and prevention,Lancet 370(9589)：786-96)。COPD急性嚴重惡化之患者的 支氣管活檢體具有顯著增加量之ENA-78、IL-8及CXCR2 mRNA表現(Qiu Y等人，2003,Biopsy neutrophilia,neutrophil chemokine and receptor gene expression in severe exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease.Am.J.Respir.Crit.Care.Med.168,968-975)，且痰具有增加之嗜中性白血球計數(Bathoorn E,Liesker JJw,Postma DS等人，Change in inflammation in out-patient COPD patients from stable phase to a subsequent exacerbation,(2009)Int J COPD,4(1)：101-9)，表明此受體在COPD與此疾病之嚴重惡化中皆有潛在作用。支氣管活檢試樣中存在CXCR2 mRNA之表現增加，其與組織嗜中性白血球之存在有關(Qiu 2003)。ENA-78主要來源於上皮細胞，且在COPD惡化期間上皮細胞中之ENA-78表現顯著增加(Qiu 2003)。因為IL-8、GROα及ENA-78之濃度在COPD氣管中有所增加，且所有三種配體均經由CXCR2傳導信號，所以用選擇性拮抗劑阻斷此常見受體將為此疾病之有效消炎策略。
COPD緩慢且進行性地發展，且傳統上使用諸如用力呼氣量(FEV1)之肺活量量測的肺功能測試估計疾病進展。具有<50%預計FEV1之患者歸類為重度。肺功能與死亡率密切相關，因為將近35%之重度COPD患者在12年內死於該疾病，而僅5%之輕度至中度患者如此。COPD為全球第四大主要死亡原因(World Health Organization(WHO),World Health Report,Geneva,2000。可得自URL：http：//www.who.int/whr/2000/en/whr00_annex_en.pdf)，且預計在未來幾十年內其發病率及死亡率會進一步上升(Lopez AD,Shibuya K,Rao C等人，2006,Chronic obstructive pulmonary disease：current burden and future projections,Eur Respir J,27(2),397-412)。惡化為不健康螺旋下降之關鍵因素且主要造成絕大多數COPD住院(BTS(英國胸科協會),2006, Burden of Lung Disease Report，第2版，http：//www.brit-thoracic.org.uk/Portals/0/Library/BTS%20Publications/burdeon of_lung_disease2007.pdf)。症狀定義之惡化之平均年速率為2.3，且保健定義之惡化之平均年速率為2.8(O'Reilly JF,Williams AE,Holt K等人，2006,Prim Care Respir J.15(6)：346-53)。對患者惡化之早期診斷及改良控制以及改良預防將有助於降低此等入院對已緊張之資源造成的壓力。用於COPD之可用治療主要為緩解性的，且不存在停止與疾病相關之肺功能衰退或氣管進行性破壞的可用療法。諸如短效及長效β-腎上腺素激導性支氣管擴張劑、吸入型抗膽鹼激導性劑(蕈毒鹼拮抗劑)及吸入型皮質類固醇之當前治療可用於治療疾病之症狀及惡化。當前皮質類固醇療法之主要侷限性在於，當患者顯示對皮質類固醇之抗性，使得此等藥物之消炎作用失活時，致使其無效。顯然，對於防止COPD進展之新穎藥物仍存在極大未滿足之醫學需要。趨化細胞素受體拮抗劑為吸引人的COPD療法，因為在COPD中遷移之發炎性細胞由多種趨化細胞素協調，因此用LMW拮抗劑阻斷趨化細胞素受體可為此疾病之有效消炎策略。COPD之關鍵特點為正常吸菸者中所見之發炎性反應的擴大，因此療法之目的不為完全抑制發炎性細胞浸潤，而是使其降低至無COPD之正常吸菸者中所見之程度。藉由特異性地起作用，抗-CXCR2將避免與類固醇相關之一般免疫抑制，CXCR1活性之保存將允許基線嗜中性白血球活化，其在COPD及CF中對於宿主防禦較為重要。大多數COPD藥物目前藉由吸入來投與以減少全身性副作用，然而，因為趨化細胞素拮抗劑作用於在循環發炎性細胞中表現之受體，所以全身性投藥將為最佳。此將提供一種到達COPD中受影響之小氣管及肺薄壁組織的有效方法。
與細胞激素及白細胞介素受體形成對比，趨化細胞素受體屬於7TM-GPCR之高度『可藥化』超家族。儘管如此，與基於具有小肽或 生物胺配體之GPCR的經驗所預期的相比，尋找有效拮抗劑之早期嘗試遇到的困難更大。對集中於趨化細胞素-受體拮抗劑之小分子藥物發現程序的努力開始逐漸地瞭解小分子充當拮抗劑所需之趨化細胞素受體及結構元件的特質。有趣地，CC-趨化細胞素-受體拮抗劑(如由經鑑別之基本上獨特化學物質系列之編號表示)之結構多樣性顯著高於CXC-趨化細胞素-受體拮抗劑，此表明發現拮抗劑之相對困難度可在兩類受體之間不同。
一般而言，趨化細胞素受體已證明為難以拮抗之標靶且已盡最大努力來鑑別有效的選擇性CXCR2拮抗劑。1998年描述了第一種低分子量CXCR2拮抗劑，自此以後，已開發多種非競爭性別位CXCR2拮抗劑，其中若干種現已進行至臨床試驗。然而，顯然需要更好且更有效的CXCR2功能拮抗劑。
在最近大約十年中，免疫球蛋白類分子之臨床效用已有了極大的擴展。其對於標靶具有特異性且可使用重組技術對其進行工程改造，因此開發用於疾病之高度定向治療存在巨大潛力。許多類型之免疫球蛋白分子及經修飾之免疫球蛋白分子可能經適當地工程改造，包括習知四鏈抗體、Fab及F(ab)2片段、單域抗體(D(ab))、單鏈Fv及奈米抗體。此等內容將在本文中結合關於經構築以針對CXCR2之至少兩個抗原決定基的多肽的發明來進一步論述。
因此，本發明之一目的在於提供一種預防或治療慢性阻塞性肺病或COPD及與趨化細胞素受體CXCR2之功能異常相關之其他疾病的新方法。
本發明之另一目的在於提供一種治療或預防COPD及與CXCR2功能異常相關之其他疾病的方法，其為免疫療法。
本發明之另一目的在於提供一種包含免疫球蛋白CDR之多肽，其為CXCR2信號轉導之拮抗劑。
本發明係關於一種包含至少兩個免疫球蛋白抗原結合域之多肽，該多肽針對或結合於趨化細胞素受體CXCR2，其中該多肽包括識別CXCR2上之第一抗原決定基的第一抗原結合域及識別CXCR2上之第二抗原決定基的第二抗原結合域。本發明之較佳多肽包含能夠結合於由SEQ ID NO.7所示之胺基酸序列組成之線性肽的第一抗原結合域及不能夠結合於該線性肽或以較低親和力結合於該線性肽之第二抗原結合域。SEQ ID NO.7為人類CXCR2之開頭19個N端胺基酸。本發明之較佳多肽為雙互補位多肽。如本文中所使用，術語「雙互補位」意謂多肽包含識別同一蛋白質標靶上之兩個不同抗原決定基的兩個抗原結合域。然而，多互補位多肽(亦即含有識別同一標靶蛋白質上之三個、四個或四個以上抗原決定基的抗原結合域)包涵於本發明之範疇內，雙互補位或多互補位多肽及多價多肽(亦即亦具有識別一或多種其他標靶蛋白質之抗原結合域)亦涵蓋於本發明之範疇內。
在本發明之較佳多肽中，包含第一抗原結合域之胺基酸序列及包含第二抗原結合域之胺基酸序列由連接子區域連接。如本文更詳細地論述，該連接子可能或可能不為免疫球蛋白來源，但較佳為肽。
在本發明之尤其較佳多肽中，該第一抗原結合域包含於第一免疫球蛋白單一可變域中且該第二抗原結合域包含於第二免疫球蛋白單一可變域中。該第一免疫球蛋白單一可變域及該第二免疫球蛋白單一可變域中之至少一者可為VL域或為其片段或可為VH域或為其片段。第一及第二抗原結合域分別包含於VL域或其片段中或第一及第二抗原結合域分別包含於VH域或其片段中的多肽包涵於本發明中。本發明之多肽可在單分子中包含VL與VH胺基酸序列或其片段。
在其他較佳實施例中，第一及第二抗原結合域包含於為域抗體(dAb)之第一及第二免疫球蛋白單一可變域中。在一最佳實施例中， 該第一抗原結合域及該第二抗原結合域中之至少一者及較佳兩者包含於免疫球蛋白單一可變域中，該等免疫球蛋白單一可變域為來自可獲自駱駝類(Camelid)或為至少一個人類化取代已併入構架區中之人類化形式之重鏈抗體的單一重鏈的VHH域或其片段。
來自可獲自駱駝類之類型之單一重鏈抗體的具有VHH胺基酸序列或其片段或變異體的免疫球蛋白單一可變域在本文中可替代性地稱為「VHH域」或其片段或「奈米抗體」。必須指出Nanobody®、Nanobodies®及Nanoclone®為Ablynx N.V之註冊商標。
在本發明之多肽中，各抗原結合域包含至少一個如本文所定義之CDR及較佳兩個或三個CDR。在本發明之較佳多肽中，免疫球蛋白單一可變域之較佳結構為VHH域或奈米抗體且具有以下結構：FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR
其中CDR及FR如本文進一步所定義。
本發明之較佳雙互補位奈米抗體具有以下結構之一：
i)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
ii)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--連接子--HLE
iii)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--HLE--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第一抗原結合域(線性SEQ ID No 7結合物)，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第二抗原域(線性SEQ ID No7非結合物)，且若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第二抗原域(線性SEQ ID No 7非結合物)，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第一抗原結合域(線性SEQ ID No.7結合物)且HLE為提供延長之活體內半衰期的結合單 元。
以上較佳雙互補位奈米抗體之片段或變異體由本發明包涵，包括CDR及FR為駱駝類來源之實施例或一或多個FR具有至少一個人類化取代且較佳完全人類化之實施例。
本發明之尤其較佳雙互補位奈米抗體為本文中稱為163D2/127D1、163E3/127D1、163E3/54B12、163D2/54B12、2B2/163E3、2B2/163D2、97A9/2B2及97A9/54B12之彼等奈米抗體，其胺基酸序列展示於表13中，且尤其為FR包括如本文所定義且諸如關於組分奈米抗體展示於表32中之序列最佳化胺基酸取代的變異體。
本發明之其他尤其較佳雙互補位奈米抗體為表33中所示者。
本發明之多肽為CXCR2信號轉導之調節劑且阻斷、降低或抑制CXCR2活性。其可以小於20nM之IC50抑制天然配體(例如Gro-α)與人類CXCR2之結合。較佳地，本發明之多肽及尤其本發明之雙互補位奈米抗體能夠交叉阻斷CXCR2與上述163D2/127D1、163E3/127D1、163E3/54B12、163D2/54B12、2B2/163E3、2B2/163D2、97A9/2B2及97A9/54B12中之一或多者的結合。
本文所述之本發明亦包涵單價多肽構建嵌段，其用於構築雙互補位或多互補位或多價奈米抗體。較佳單價奈米抗體為具有表9、表34中所示之胺基酸序列或至少一個構架區與表9或表34中所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的各多肽。較佳單價奈米抗體為表9中所示者，且在構架區中具有至少一個序列最佳化取代，諸如表32或表34中所示者。尤其較佳為稱為137B7之單價奈米抗體及其序列最佳化形式。
本發明之較佳多肽結合於包含SEQ ID No.1(CXCR2)之胺基酸F11、F14及W15的抗原決定基。在本發明之較佳雙互補位多肽(諸如雙互補位奈米抗體)中，第二抗原結合域結合於人類CXCR2之外環內 的抗原決定基(SEQ ID No.1之胺基酸殘基106-120、184-208及274-294)。在本發明之一個實施例中，該抗原決定基為構形抗原決定基。在本發明之一實施例中，該抗原決定基包含SEQ ID No.1之胺基酸殘基W112、G115、I282及T285。
本發明亦涵蓋編碼本發明之任何多肽的核酸分子以及編碼其片段之核酸，諸如編碼包含於雙互補位奈米抗體中之個別奈米抗體之核酸。包含本發明之核酸的載體及包含該等載體且能夠表現本發明之多肽的宿主細胞亦包涵於本發明中。
在另一態樣中，本發明係關於包含本發明之多肽以及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。因為本發明之多肽能夠阻斷、抑制或降低CXCR2之活性，所以其適用於治療來自CXCR2之異常信號轉導起作用的疾病。該等疾病可包括動脈粥樣硬化、絲球體腎炎、發炎性腸病(克羅恩氏病(Crohn's))、血管生成、多發性硬化症、牛皮癬、年齡相關黃斑變性疾病、眼部貝切特氏病(Ocular Behcet Disease)、葡萄膜炎、非小細胞癌、結腸癌、胰臟癌、食道癌、黑色素瘤、肝細胞癌或局部缺血灌注損傷。該等疾病亦可包括呼吸道病狀，諸如囊腫性纖維化、重度哮喘、哮喘惡化、過敏性哮喘、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、特發性肺纖維化、氣管重塑、阻塞性細支氣管炎症候群或支氣管肺發育不良。
在一尤其較佳實施例中，本發明之多肽用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)或COPD惡化，其特徵在於白血球遷移，尤其嗜中性白血球遷移至肺薄壁組織及其後續破壞，該遷移經由CXCR2信號傳導介導。本發明之多肽阻斷、抑制或降低CXCR2活性的能力使其成為用於預防或治療此疾病之極佳候選者。
對於治療人類，本發明之多肽較佳針對或特異性結合於人類CXCR2。然而，較佳地，若該多肽可與靈長類動物CXCR2(尤其食蟹 獼猴(Cynomolgus monkey)CXCR2)交叉反應，則可對該等猴子進行適當毒性測試。若涵蓋獸醫用途，則本發明之多肽可針對或特異性結合於來自其他物種之CXCR2同源物。
本發明之其他態樣將自本文中之進一步論述而變得明晰。
定義
在本發明之描述、實例及申請專利範圍中：
a)除非另外指示或定義，否則所有所用術語均具有其在此項技術中之常見含義，此為熟習此項技術者所瞭解。例如參考如下所提及之標準手冊。Sambrook等人，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；F.Ausubel等人編，「Current protocols in molecular biology」,Green Publishing and Wiley Interscience,New York (1987)；Lewin,「Genes II」,John Wiley & Sons,New York,N.Y.,(1985)；Old等人，「Principles of Gene Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering」，第2版，University of California Press,Berkeley,CA(1981)；Roitt等人，「Immunology」(第6版),Mosby/Elsevier,Edinburgh(2001)；Roitt等人，Roitt's Essential Immunology，第10版Blackwell Publishing,UK(2001)；及Janeway等人，「Immunobiology」(第6版),Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,New York(2005)。
b)除非另外指示，否則術語「免疫球蛋白」或「免疫球蛋白序列」無論本文中用於指重鏈抗體或習知4鏈抗體均用作通用術語以包括全尺寸抗體、其個別鏈以及其所有部分、域或其片段(包括(但不限於)抗原結合域或片段，分別諸如VHH域或VH/VL域)。另外，除非上下文需要更有限制的解釋，否則如本文中所使用(例如在類似「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「可變域序列」、「VHH序列」或「蛋 白質序列」之術語中)，術語「序列」一般應理解為包括相關胺基酸序列以及編碼其之核酸序列或核苷酸序列。
c)除非另外指示，否則術語「免疫球蛋白單一可變域」用作通用術語以包括(但不限於)抗原結合域或片段，分別諸如VHH域或VH或VL域。術語抗原結合分子或抗原結合蛋白可互換使用且亦包括術語奈米抗體。免疫球蛋白單一可變域進一步為輕鏈可變域序列(例如VL序列)或重鏈可變域序列(例如VH序列)；更特定言之，其可為來源於習知四鏈抗體之重鏈可變域序列或來源於重鏈抗體之重鏈可變域序列。因此，免疫球蛋白單一可變域可為域抗體、或適合用作域抗體之免疫球蛋白序列、單域抗體、或適合用作單域抗體之免疫球蛋白序列、「dAb」、或適合用作dAb之免疫球蛋白序列或奈米抗體，包括(但不限於)VHH序列。本發明包括不同來源之免疫球蛋白序列，包含小鼠、大鼠、兔子、驢、人類及駱駝類免疫球蛋白序列。免疫球蛋白單一可變域包括全人類、人類化、另外序列最佳化或嵌合免疫球蛋白序列。免疫球蛋白單一可變域及免疫球蛋白單一可變域之結構可視為(但不限於)包含四個構架區或「FR」，其在此項技術中及本文中分別稱為「構架區1」或「FR1」；「構架區2」或「FR2」；「構架區3」或「FR3」；及「構架區4」或「FR4」；該等構架區雜有三個互補決定區或「CDR」，其在此項技術中分別稱為「互補決定區1」或「CDR1」；「互補決定區2」或「CDR2」；及「互補決定區3」或「CDR3」。
d)除非另外指示，否則未特定詳細描述之所有方法、步驟、技術及操作均可以本身已知之方式進行且已以本身已知之方式進行，如熟習此項技術者所瞭解。例如亦參考本文所提及之標準手冊及一般背景技術及其中所引用之其他參考文獻；以及例如參考以下評述：Presta,Adv.Drug Deliv.Rev.2006,58(5-6)：640-56；Levin及Weiss,Mol. Biosyst.2006,2(1)：49-57；Irving等人，J.Immunol.Methods,2001,248(1-2),31-45；Schmitz等人，Placenta,2000,21增刊A,S106-12；Gonzales等人，Tumour Biol.,2005,26(1),31-43，其描述蛋白質工程改造技術，諸如親和成熟及改良蛋白質(諸如免疫球蛋白)之特異性及其他所需性質的其他技術。
e)胺基酸殘基將根據標準三字母或單字母胺基酸密碼來指示。
f)出於比較兩個或兩個以上核苷酸序列之目的，第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間的「序列一致性」百分數可藉由將[第一核苷酸序列中與第二核苷酸序列中之相應位置的核苷酸一致之核苷酸數目]除以[第一核苷酸序列中之核苷酸總數]並乘以[100%]來計算或測定，其中與第一核苷酸序列相比第二核苷酸序列中之核苷酸的各缺失、插入、取代或添加視為單一核苷酸(位置)之差異；或使用適合之電腦演算法或技術來計算或測定。兩個或兩個以上核苷酸序列之間的序列一致性程度可使用用於序列比對之已知電腦演算法(諸如NCBI Blast v2.0)，使用標準設置來計算。用於測定序列一致性程度之一些其他技術、電腦演算法及設置例如描述於WO 04/037999、EP 0 967 284、EP 1 085 089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185及GB 2 357 768-A中。通常，出於根據上文所概述之計算方法測定兩個核苷酸序列之間的「序列一致性」百分數之目的，具有最大核苷酸數目之核苷酸序列將作為「第一」核苷酸序列，且另一核苷酸序列將作為「第二」核苷酸序列。
g)出於比較兩個或兩個以上胺基酸序列之目的，第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之間的「序列一致性」百分數(本文中亦稱為「胺基酸一致性」)可藉由將[第一胺基酸序列中與第二胺基酸序列中之相應位置的胺基酸殘基一致之胺基酸殘基數目]除以[第一胺基酸序列中之胺基酸殘基總數]乘以[100%]來計算或測定，其中與第一胺基酸序 列相比第二胺基酸序列中之胺基酸殘基的各缺失、插入、取代或添加視為單一胺基酸殘基(位置)之差異，亦即如如本文所定義之「胺基酸差異」；或使用適合之電腦演算法或技術來計算或測定。出於根據上文所概述之計算方法測定兩個胺基酸序列之間的「序列一致性」百分數之目的，具有最大胺基酸殘基數目之胺基酸序列將作為「第一」胺基酸序列，且另一胺基酸序列將作為「第二」胺基酸序列。
此外，在測定兩個胺基酸序列之間的序列一致性程度時，熟習此項技術者可考慮所謂「保守性」胺基酸取代，如以下v)中所揭示。
應用於本文所述之多肽的任何胺基酸取代亦可根據由Schulz等人，Principles of Protein Structure,Springer-Verlag,1978開發之不同物種之同源蛋白質之間的胺基酸變化頻率之分析，由Chou及Fasman,Biochemistry 13：211,1974及Adv.Enzymol.,47：45-149,1978開發之結構形成潛在性之分析，及由Eisenberg等人，Proc.Nad.Acad Sci.USA 81：140-144,1984，Kyte & Doolittle；J Molec.Biol.157：105-132,198 1及Goldman等人，Ann.Rev.Biophys.Chem.15：321-353,1986開發之蛋白質中疏水性模式之分析，所有該等文學均以全文引用的方式併入本文中。關於奈米抗體之一級及二級結構，來自美洲駝(Llama)之VHH域的晶體結構例如由Desmyter等人，Nature Structural Biology，第3卷，9,803(1996)，Spinelli等人，Natural Structural Biology(1996)；3,752-757及Decanniere等人，Structure，第7卷，4,361(1999)給出。
h)當比較兩個胺基酸序列時，術語「胺基酸差異」係指與第二序列相比，第一序列之位置上的單一胺基酸殘基之插入、缺失或取代；應瞭解兩個胺基酸序列可含有一個、兩個或兩個以上該等胺基酸差異。
i)當核苷酸序列或胺基酸序列視為分別「包含」另一核苷酸序列或胺基酸序列，或「基本上由另一核苷酸序列或胺基酸序列組成」 時，此可意謂後者核苷酸序列或胺基酸序列已分別併入先提及之核苷酸序列或胺基酸序列中，但更通常，此一般意謂先提及之核苷酸序列或胺基酸序列在其序列中分別包含核苷酸或胺基酸殘基之延伸段，該延伸段分別具有與後者序列相同之核苷酸序列或胺基酸序列，此與先提交之序列實際上如何產生或獲得(其可例如藉由本文所述之任何適合方法來獲得)無關。藉助於非限制性實例，當本發明之雙互補位免疫球蛋白單一可變域(例如奈米抗體)視為包含CDR序列時，此可意謂該CDR序列已併入本發明之雙互補位奈米抗體中，但更通常，此一般意謂本發明之雙互補位奈米抗體在其序列中含有具有與該CDR序列相同之胺基酸序列的胺基酸殘基延伸段，此與雙互補位奈米抗體如何產生或獲得無關。亦應注意，當後者胺基酸序列具有特定生物或結構功能時，其較佳具有與先提及之胺基酸序列基本上相同、類似或等效的生物或結構功能(換言之，先提及之胺基酸序列較佳使得後者序列能夠進行基本上相同、類似或等效的生物或結構功能)。舉例而言，當本發明之雙互補位奈米抗體視為分別包含CDR序列或構架序列時，CDR序列及構架較佳能夠在該雙互補位奈米抗體中分別充當CDR序列或構架序列。此外，當核苷酸序列視為包含另一核苷酸序列時，先提及之核苷酸序列較佳使得當其表現為表現產物(例如多肽)時，由後者核苷酸序列編碼之胺基酸序列形成該表現產物之一部分(換言之，後者核苷酸序列與先提及之較大核苷酸序列存在於同一閱讀框架中)。
j)當核酸序列或胺基酸序列與在該來源或培養基中其通常所締合之至少一種其他組分(諸如另一核酸序列、另一蛋白質/多肽、另一生物組分或大分子或至少一種污染物、雜質或次要組分)分離時，其視為「(呈)基本上分離(形式)」，例如與其天然生物來源及/或獲得其之反應介質或培養基相比。詳言之，當核酸序列或胺基酸序列純化至少2倍，尤其至少10倍，更尤其至少100倍，且至多1000倍或更多時，其 視為「基本上分離」。「呈基本上分離形式」之核酸序列或胺基酸序列較佳基本上為均質的，如使用適合之技術所測定，諸如適合之層析技術，諸如聚丙烯醯胺-凝膠電泳；
k)如本文中所使用，術語「抗原結合域」係指免疫球蛋白中包含至少一個CDR且具有識別標靶抗原決定子或抗原決定基之構形的胺基酸序列。
l)術語「抗原決定子」及「抗原決定基」亦可在本文中可互換使用，係指標靶CXCR2中由抗原結合域識別之胺基酸序列，無論呈直鏈或非線性構形。
m)可(特異性)結合於特定抗原決定子、抗原決定基、抗原或蛋白質(或其至少一部分、片段或抗原決定基)、對於其具有親和力及/或對於其具有特異性之本發明之多肽(例如如本文所述之雙互補位奈米抗體或其片段)視為「針對(against)」或「針對(directed against)」該抗原決定子、抗原決定基、抗原或蛋白質。
n)術語「特異性」係指本發明之多肽的特定抗原結合域可結合的不同類型之抗原或抗原決定子的數目。抗原結合蛋白對於任何特定抗原/抗原決定基之特異性可根據親和力及/或親合力來測定，如WO 08/020079(以引用的方式併入本文中)之第53-56頁上所述，該案亦描述用於量測多肽與相關抗原或抗原決定基之間的結合之一些較佳技術。通常，在各抗原結合蛋白(諸如本發明之多肽)中，各抗原結合域可各以10-5至10-12莫耳/公升或更小且較佳10-7至10-12莫耳/公升或更小且更佳10-8至10-12莫耳/公升之解離常數(KD)(亦即以105至1012公升/莫耳或更大且較佳107至1012公升/莫耳或更大且更佳108至1012公升/莫耳之締合常數(KA))獨立地結合於其抗原/抗原決定基。大於104莫耳/公升之任何KD值(或低於104M-1公升/莫耳之任何KA值)一般視為指示非特異性結合。較佳地，本發明之雙互補位多肽將以小於500nM，較 佳小於200nM，更佳小於10nM，諸如小於500pM之親和力結合於所需抗原。本發明之多肽與CXCR2之特異性結合可以本身已知之任何適合方式方式測定，包括例如史卡查分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合分析，諸如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夾層競爭分析，及其此項技術中本身已知之不同變化形式；以及本文中所提及之其他技術。如熟習此項技術者所瞭解，且如WO 08/020079之第53-56頁上所述，解離常數可為實際或表觀解離常數。測定解離常數之方法為熟習此項技術者所瞭解，且例如包括WO 08/020079之第53-56頁上所提及之技術。
o)本發明之多肽(尤其本發明之雙互補位奈米抗體)的半衰期一般可定義為活體內本發明之多肽的血清濃度降低50%所用之時間，例如由於多肽降解及/或多肽因天然機制清除或螯合。本發明之多肽的活體內半衰期可以本身已知之任何方式測定，諸如藉由藥物動力學分析。適合之技術為熟習此項技術者所瞭解，且可例如一般如WO 08/020079之第57頁上的段落o)中所述。如WO 08/020079之第57頁上其中亦提及，半衰期可使用諸如t1/2-α、t1/2-β及曲線下面積(AUC)之參數來表示。例如參考以下實驗部分，以及標準手冊，諸如Kenneth,A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinete analysis：A Practical Approach(1996)。亦參考「Pharmacokinetics」,M Gibaldi及D Perron,由Marcel Dekker出版，第2修訂版(1982)。術語「半衰期延長」或「延長之半衰期」係指t1/2-β之增加，有或無t1/2-α及/或AUC或兩者之增加。
p)在本發明之情形下，如使用適合之活體外、細胞或活體內分析所量測，「阻斷、降低或抑制」CXCR2之活性可意謂與在相同分析中在相同條件下但在本發明之多肽不存在下CXCR2之活性相比，使 CXCR2之相關或預期生物學活性的活性阻斷、降低或抑制至少1%，較佳至少5%，諸如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或90%或更多。
如熟習此項技術者所瞭解，抑制亦可包括與相同條件但不存在本發明之多肽相比，實現CXCR2對於一或多種其配體或結合搭配物之親和力、親合力、特異性及/或選擇性的降低，及/或實現CXCR2對於CXCR2存在之培養基或環境中之一或多種條件(諸如pH值、離子強度、輔因子之存在等)之敏感性的降低。如熟習此項技術者所瞭解，此亦可以任何適合之方式及/或使用本身已知之任何適合分析來測定，此視所涉及之標靶或抗原而定。
q)如本文中所使用，「調節」可意謂CXCR2之別位調節；及/或減少或抑制CXCR2與一種其配體之結合及/或與天然配體競爭結合於CXCR2。調節可例如亦包括實現關於CXCR2之摺疊或構形或關於其改變其構形(例如結合配體後)、與其他(次)單元締合或解離之能力。調節可例如亦包括實現CXCR2轉運其他化合物或充當其他化合物(諸如離子)之通道之能力的變化。
本發明之多肽(尤其本發明之雙互補位奈米抗體)對CXCR2活性的調節(尤其抑制或降低)可為可逆或不可逆的，但出於藥物學及藥理學目的，通常將為可逆方式。
r)當本發明之多肽結合於CXCR2之親和力(如上文所述且適當地以KD值、KA值、Koff速率及/或Kon速率表示)為其結合第二標靶或多肽之親和力的至少10倍，諸如至少100倍且較佳至少1000倍且至多10,000倍或更大時，其視為與第二標靶或抗原相比「對於CXCR2具有特異性」。舉例而言，本發明之多肽結合CXCR2之KD值可為其結合於另一標靶或多肽或其抗原決定基之KD的至少1/10，諸如至少1/100且較佳至少1/1000，諸如1/10,000或甚至更小。
s)術語「交叉阻斷(cross-block)」、「交叉阻斷(cross-blocked)」及「交叉阻斷(cross-blocking)」在本文中可互換使用以意謂免疫球蛋白單一可變域或多肽干擾本發明之其他免疫球蛋白單一可變域或多肽與特定標靶結合之能力。本發明之免疫球蛋白單一可變域或多肽能夠干擾與另一標靶之結合的程度(且因此根據本發明其可視為交叉阻斷)可使用競爭結合分析來測定。一種尤其適合之定量交叉阻斷分析使用基於FACS或ELISA之方法來量測本發明之經標記(例如標記His、放射性或螢光標記)之免疫球蛋白單一可變域或多肽與其他結合劑之間就其結合於標靶而言的競爭。實驗部分一般描述適合於判定結合分子是否交叉阻斷或能夠交叉阻斷本發明之免疫球蛋白單一可變域或多肽之基於FACS及ELISA-移位的分析。應瞭解該分析可用於本文所述之免疫球蛋白單一可變域或其他結合劑中之任一者。因此，一般而言，本發明之交叉阻斷胺基酸序列或其他結合劑為如下者：在以上交叉阻斷分析中將結合於標靶以使得在分析期間及在本發明之第二胺基酸序列或其他結合劑存在下，所記錄之本發明之免疫球蛋白單一可變域或多肽的移位為待測試之潛在交叉阻斷劑(例如其他抗體片段、VHH、dAb或類似VH/VL變異體)所達成之最大理論移位的50%至100%。
t)若本發明之多肽對於兩種不同抗原或抗原決定子(諸如來自兩種不同哺乳動物物種之血清白蛋白或CXCR2，諸如人類及食蟹獼猴)具有特異性(如本文所定義)，則其視為對於此等不同抗原或抗原決定子具有交叉反應性。
u)如本文所定義，保守性胺基酸變化係指胺基酸殘基經具有類似化學結構之另一胺基酸殘基置換且對多肽之功能、活性或其他生物性質具有極小影響或基本上無影響的胺基酸取代。該等保守性胺基酸取代為此項技術所熟知，例如自WO 04/037999、GB-A-3 357 768、WO 98/49185、WO 00/46383及WO 01/09300已知；且該等取代之(較佳)類 型及/或組合可根據來自WO 04/037999以及WO 98/49185及其中所引用之其他參考文獻的相關教示進行選擇。
該等保守性取代較佳為以下各組(a)-(e)中之一種胺基酸經同一組中之另一種胺基酸殘基取代：(a)小脂族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及GIy；(b)極性、帶負電殘基及其(不帶電)醯胺：Asp、Asn、GIu及GIn；(c)極性、帶正電殘基：His、Arg及Lys；(d)大脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(e)芳族殘基：Phe、Tyr及Trp。
尤其較佳保守性取代如下：Ala變為GIy或變為Ser；Arg變為Lys；Asn變為GIn或變為His；Asp變為GIu；Cys變為Ser；GIn變為Asn；GIu變為Asp；GIy變為Ala或變為Pro；His變為Asn或變為GIn；Ile變為Leu或變為Val；Leu變為Ile或變為Val；Lys變為Arg、變為GIn或變為GIu；Met變為Leu、變為Tyr或變為Ile；Phe變為Met、變為Leu或變為Tyr；Ser變為Thr；Thr變為Ser；Trp變為Tyr；Tyr變為Trp；及/或Phe變為Val、變為Ile或變為Leu。
v)如本文中所使用，CDR為本發明之多肽的互補決定區。CDR為單獨或結合一或多個其他CDR與本發明之多肽識別的抗原或抗原決定基形成互補性之胺基酸延伸段。藉由某些編號慣例鑑別胺基酸序列中之CDR。關於申請專利範圍及本文特定描述，使用Kabat編號。
w)如本文中所使用，FR為構架區(有時稱為FW)。構架區為側接一或多個CDR且支持其呈校正三維構形以供抗原或抗原決定基識別之胺基酸延伸段。FR對於標靶抗原或抗原決定基不具特異性，但對於其所存在之免疫球蛋白分子的物種來源或類型具有特異性。如本文中詳細地論述，在本發明之多肽中，存在待工程改造為不同於免疫球蛋白來源(例如駱駝類)所適用之構架序列的構架區之胺基酸序列範疇。
x)如本文中所使用，CXCR2係指至少存在於白血球表面上之細胞激素受體且其天然存在之配體可為Gro-α、Gro-β、Gro-γ、IL-8、ENA-78或GCP-2。一般而言，CXCR2在本文中係指在不考慮來源物種之情況下展現CXCR2功能之任何蛋白質。然而，如本文中所使用，人類CXCR2係指包含SEQ ID No 1所示之胺基酸序列或其任何對偶基因變異體或直系同源物的蛋白質且食蟹獼猴CXCR2係指包含SEQ ID No 3所示之胺基酸序列或其任何對偶基因變異體或直系同源物的蛋白質。
y)如本文中所使用，「序列最佳化」係指有助於胺基酸序列中之取代、插入或缺失以用於鞏固天然序列中可能不存在之特定性質或結構特徵之目的。該等取代、插入或缺失可進行例如用於化學穩定之目的、用於改良製造能力、用於避免焦麩醯胺酸形成或氧化或異構化。可用於本發明之雙互補位多肽(尤其雙互補位奈米抗體)的達成該等性質最佳化之方法描述於WO 2009/095235中，該案以引用的方式併入本文中。序列最佳化技術可亦進行用於以如本文所述之方式人類化本發明之雙互補位多肽之目的。因此，無論本文使用序列最佳化(sequence optimisation)、序列最佳化(sequence optimising)或序列最佳化(sequenced-optimised)，此涵蓋對人類化取代或插入及對部分或完全人類化雙互補位多肽，較佳雙互補位奈米抗體之特別提及。
圖1展示當在漸增濃度之奈米抗體下量測本發明之兩種奈米抗體及雙互補位奈米抗體阻斷自用促效劑Gro-α刺激之CHO-CXCR2膜釋放[35S]GTPγS之能力時所獲得之反應曲線。
圖1a展示奈米抗體54B12(表9中之SEQ ID No 90)之結果，圖1b展示奈米抗體163E3(表9中之SEQ ID No 42)之結果且圖1c展示雙互補位奈米抗體54B12/163E3(表13中之SEQ ID No 68)之結果。
如前所述，在其第一態樣中，本發明提供一種包含至少兩個免疫球蛋白抗原結合域之多肽，該多肽針對或結合於趨化細胞素受體CXCR2，其中該多肽包括識別CXCR2上之第一抗原決定基的第一抗原結合域及識別CXCR2上之第二抗原決定基的第二抗原結合域。
本發明之較佳多肽包含能夠結合於由SEQ ID No 7所示之胺基酸序列組成之線性肽的第一抗原結合域及不能夠結合於該線性肽或以較低親和力結合於該線性肽之第二抗原結合域。SEQ ID No 7為人類CXCR2之開頭19個N端胺基酸。
在一個實施例中，該第一抗原結合域識別包含CXCR2之胺基酸1至19或在該等胺基酸中之第一抗原決定基且該第二抗原結合域識別CXCR2上在胺基酸1至19外之第二抗原決定基。
第一及第二抗原結合域可包含於免疫球蛋白類分子之一或多個胺基酸序列特徵中。舉例而言，彼等肽或多肽可各包含由連接子連接之習知四鏈抗體。詳言之，本發明之多肽可為該第一抗原結合域及該第二抗原結合域分別包含各包含兩個重鏈及兩個輕鏈之第一及第二抗體中且該第一抗體及該第二抗體由連接子連接之多肽。或者，該第一抗原結合域及該第二抗原結合域可包含於包含兩個重鏈及兩個輕鏈之單一抗體中。
在本發明之一替代實施例中，第一及第二抗原結合域包含於為重鏈抗體之胺基酸序列中，且詳言之，本發明之多肽可為該第一抗原結合域包含於第一重鏈抗體中且該第二抗原結合域包含於第二重鏈抗體中且該第一重鏈抗體及該第二重鏈抗體由連接子連接之多肽。該等重鏈抗體可獲自駱駝類家族且在自然界中包含恰好兩個重鏈，其各具有恆定區及可變區。該第一結合域及該第二結合域包含於包含兩個重鏈之單一重鏈抗體中之多肽亦由本發明涵蓋。
在另一替代性實施例中，包含第一及第二結合域之肽或多肽可為單鏈Fv(scFv)。此等多肽包含VL與VH域之線性融合物。因此，本發明之多肽可為該第一抗原結合域及該第二抗原結合域分別包含於第一及第二抗體單鏈Fv(scFv)片段中且該第一scFv片段及該第二scFv片段由連接子連接之多肽。
在另一替代方案中，第一及第二抗原結合域可包含於習知四鏈抗體之一或多個Fab或F(ab)2片段中。Fab片段包含來自習知抗體之一個重鏈及一個輕鏈的每一者之一個恆定域及一個可變域。F(ab)2片段包含由習知抗體之鉸鏈區的一部分連接之兩個Fab片段。詳言之，本發明之多肽可為該第一抗原結合域及該第二抗原結合域分別包含於第一抗體Fab或F(ab)2片段及第二抗體Fab或F(ab)2片段中且該第一Fab或F(ab)2片段及該第二Fab或F(ab)2片段由連接子連接之多肽。在該實施例中，該第一抗原結合域可包含於抗體Fab片段中且該第二抗原結合域包含於F(ab)2片段中或反之亦然。
在本發明之一較佳實施例中，第一抗原結合域包含於第一免疫球蛋白單一可變域中且該第二抗原結合域包含於第二免疫球蛋白單一可變域中。
本發明之此實施例的一特定實例為第一及第二抗原結合域包含於稱為d(ab)之域抗體中。d(ab)包含來自習知抗體之單VL或VH域。因此，本發明之多肽可為該第一抗原結合域及該第二抗原結合域包含於第一及第二域抗體(dAb)中且該第一dAb及該第二dAb由連接子連接之多肽。該第一dAb及該第二dAb可為抗體VL片段或抗體VH片段。在該實施例中，該第一抗原結合域可包含於VL片段中且該第二抗原結合域可包含於VH片段中或反之亦然。
關於(單)域抗體之一般描述，亦參考EP 0 368 684。關於術語「dAb」，例如參考Ward等人(Nature 1989 Oct 12；341(6242)：544- 6)，Holt等人，Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及例如WO 06/030220、WO 06/003388及Domantis Ltd之其他公開專利申請案。亦應注意，儘管在本發明之情形下為次佳，因為其並非哺乳動物來源，但單域抗體或單一可變域可來源於某些鯊魚物種(例如所謂「IgNAR域」，參見例如WO 05/18629)。
該重鏈抗體之單鏈的可變區稱為VHH域且包含稱為奈米抗體之抗體片段。奈米抗體可包含整個VHH域或其片段。關於重鏈抗體及其可變域之一般描述，參考WO08/020079之第59頁上所提及之先前技術及國際申請案WO06/040153之第41至43頁上所提及的參考文獻清單。 VHH域具有許多獨特結構特徵及功能性質，其使得分離之VHH域(以及基於其且具有與天然存在之VHH域具有相同結構及功能特徵的奈米抗體)及含有其之多肽高度有利地成為功能性抗原結合域或多肽。詳言之，VHH域(其本身「設計」為功能性結合於不存在輕鏈可變域或無與輕鏈可變域之任何相互作用的抗原)及奈米抗體可充當單一、相對小、結合功能性抗原之結構單元、域或蛋白質。如本文中所使用，術語奈米抗體不僅涵蓋天然存在之VHH域及其片段，而且涵蓋如本文中詳細論述之其變異體及衍生物。
在本發明之最佳實施例中，本發明之雙互補位多肽為該第一抗原結合域包含於第一奈米抗體中且該第二抗原結合域包含於第二奈米抗體中且該第一奈米抗體及該第二奈米抗體由連接子連接之多肽。
VHH域之結構可如下表示；FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR
且本發明之雙互補位多肽可具有以下結構之一：
i)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
ii)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4- FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--連接子--HLE
iii)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--HLE--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第一抗原結合域(線性SEQ ID No 7結合物)，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第二抗原域(線性SEQ ID No 7非結合物)，且若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第二抗原域(線性SEQ ID No 7非結合物)，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第一抗原結合域(線性SEQ ID No.7結合物)且HLE為提供延長之活體內半衰期的結合單元。
因此，如本文中所使用，「本發明之雙互補位奈米抗體」係指包含由連接子連接之兩種單一奈米抗體之多肽。
然而，本發明之雙互補位奈米抗體可在各奈米抗體中包括僅一個CDR。倘若如此，較佳CDR為CDR3及/或CDR6。然而，本發明之雙互補位奈米抗體可在N端奈米抗體中包括CDR1或CDR2或CDR3或CDR1及CDR2或CDR1及CDR3或CDR2及CDR3或CDR1及CDR2及CDR3且在C端奈米抗體中包括任一以下組合：CDR4或CDR5或CDR6或CDR4及CDR5或CDR4及CDR6或CDR5及CDR6或CDR4及CDR5及CDR6。如上文所指示，本發明之雙互補位奈米抗體可包含CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5及CDR6中之全部，各CDR側接FR。
FR可具有與駱駝類來源一致之胺基酸序列。然而，在較佳實施例中，一或多個FR具有至少一個序列最佳化胺基酸取代且較佳一或多個且更佳所有FR部分或完全經人類化。以下更詳細地論述用於序列最佳化之取代。
本文亦提及，在第一及第二抗原結合域包含於不為奈米抗體但在如上文所論述之習知抗體的域或片段(例如人類抗體、域或片段)中之 第一及第二免疫球蛋白單一可變域中的本發明之實施例中，有可能修飾其中具有至少一個駱駝類化取代之CDR且視情況產生完全駱駝類化CDR。
如本文進一步所述，單一奈米抗體中之胺基酸殘基總數可在110-120個之範圍內，較佳為112-115個，且最佳為113個。然而，應注意奈米抗體之部分、片段、類似物或衍生物(如本文進一步所述)關於其長度及/或尺寸不受特別限制，只要該等部分、片段、類似物或衍生物滿足本文所概述之其他要求且亦較佳適合於本文所述之目的即可。
如本文進一步所述，根據由Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD，刊物第91期)給出之用於VH域的通用編號來對奈米抗體之胺基酸殘基編號，如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000年6月23日；240(1-2)：185-195之文章(參見例如此公開案之圖2)中應用於來自駱駝類之VHH域，且因此，奈米抗體之FR1可包含位置1-30之胺基酸殘基，奈米抗體之CDR1可包含位置31-35之胺基酸殘基，奈米抗體之FR2可包含位置36-49之胺基酸，奈米抗體之CDR2可包含位置50-65之胺基酸殘基，奈米抗體之FR3可包含位置66-94之胺基酸殘基，奈米抗體之CDR3可包含位置95-102之胺基酸殘基，且奈米抗體之FR4可包含位置103-113之胺基酸殘基。在本發明之較佳雙互補位奈米抗體中，N端奈米抗體可具有以上給出之位置的FR及CDR且在C端奈米抗體中奈米抗體之FR5可包含位置1-30之胺基酸殘基，奈米抗體之CDR4可包含位置31-35之胺基酸殘基，奈米抗體之FR6可包含位置36-49之胺基酸，奈米抗體之CDR5可包含位置50-65之胺基酸殘基，奈米抗體之FR7可包含位置66-94之胺基酸殘基，奈米抗體之CDR6可包含位置95-102之胺基酸殘基，且奈米抗體之FR8可包含位置103-113之胺基酸殘基。
然而，應瞭解抗體及尤其奈米抗體中之CDR及FR可藉由替代Kabat之編號系統來鑑別。此等系統包括Chothia、IMGT及AHo系統。根據此等替代編號系統鑑別表9、13、19、32、33及34中所鑑別之任一胺基酸序列之CDR或FR的位置可藉由分析序列來達成。出於此目的，可能必須參考以下網站：http：//www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/(Chothia)；http：//imgt.cines.fr(IMGT)及http：//www.bio.uzh.ch/antibody/index.html(AHo)。具體而言，在本文所述之本發明之較佳雙互補位奈米抗體中，CDR 1、2、3、4、5或6可由替代Kabat之此等編號系統中之一者來定義，但仍將在本發明之範疇內。
本發明之一些奈米抗體的Chotia CDR展示於表35中。
奈米抗體可為所謂「VH3類」(亦即與VH3類之人類生殖系序列(諸如DP-47、DP-51或DP-29)具有高度序列同源性之奈米抗體)，該等奈米抗體較佳用於構築本發明之雙互補位奈米抗體。然而，應注意，如例如WO 07/118670中所述，任何類型之針對CXCR2之奈米抗體及例如屬於所謂「VH4類」之奈米抗體(亦即與VH4類之人類生殖系序列(諸如DP-78)具有高度序列同源性之奈米抗體)可用於構築本發明之雙互補位奈米抗體。
連接一或多種包含本發明之第一及第二抗原結合域的肽或多肽之連接子分子可能或可能不為免疫球蛋白來源。當本發明之多肽為雙互補位免疫球蛋白單一可變域，例如奈米抗體時，連接子將一個包含抗原結合域之免疫球蛋白單一可變域的C端連接於另一個包含抗原結合域之免疫球蛋白單一可變域的N端。
適合用於將第一與第二抗原結合域連接在一起、尤其將兩種奈米抗體連接在一起之用於本發明之雙互補位多肽中的間隔子或連接子為熟習此項技術者所瞭解，且一般可為此項技術中用於連接胺基酸序列之任何連接子或間隔子。較佳地，該連接子或間隔子適合用於構築欲 用於藥物用途之蛋白質或多肽。
舉例而言，連接子可為適合之胺基酸序列，及尤其為具有1至50個，較佳1至30個，諸如1至10個胺基酸殘基之胺基酸序列。該等胺基酸序列之一些較佳實例包括gly-ser連接子，例如類型(glyxsery)z，例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如WO 99/42077中所述；及本文所提及之Ablynx的申請案中所述之GS30、GS15、GS9及GS7連接子(參見例如WO 06/040153及WO 06/122825)；以及鉸鏈樣區域，諸如天然存在之重鏈抗體或類似序列之鉸鏈區(諸如WO 94/04678中所述)。
一些其他可能連接子為聚丙胺酸(諸如AAA)，以及連接子GS30(WO 06/122825中之SEQ ID NO：85)及GS9(WO 06/122825中之SEQ ID NO：84)。
本發明之較佳連接子為長度為3至50個胺基酸之肽連接子，例如長度為3至9個、10至15個、16至20個、21至25個、26至35個、36至40個、41至45個或46至50個胺基酸之連接子。在本發明之一個實施例中，肽連接子長度為35個胺基酸。連接子可僅由兩種不同胺基酸組成。如前所述，此等胺基酸可為甘胺酸及絲胺酸。或者，其可為脯胺酸及絲胺酸。
在本發明之一些實施例，尤其本發明之雙互補位奈米抗體中，肽連接子由以下胺基酸序列組成：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No 220)。
其他適合之連接子一般包含有機化合物或聚合物，尤其適合用於藥物用途之蛋白質中的彼等有機化合物或聚合物。舉例而言，使用聚(乙二醇)部分連接抗體域，參見例如WO 04/081026。
因此，在另一態樣中，本發明係關於一種包含至少兩種多肽之分子，該分子針對或結合於趨化細胞素受體CXCR2，其中第一多肽包 含第一免疫球蛋白抗原結合域且第二多肽包含第二免疫球蛋白抗原結合域，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域識別CXCR2上之第一及第二抗原決定基且其中該至少兩種多肽由非肽連接子連接。
較佳地，在本發明之態樣中，第一抗原結合域能夠結合於由SEQ ID No 7所示之胺基酸序列組成之線性肽且第二抗原結合域不能夠結合於該線性肽或以較低親和力結合於該線性肽。較佳地，第一抗原決定基包含CXCR2之胺基酸1至19或在該等胺基酸內且第二抗原決定基在CXCR2之胺基酸1至19外。
較佳地，在本發明之此態樣中，第一及第二抗原結合域包含於免疫球蛋白單一可變域中，其中該第一免疫球蛋白單一可變域及該第二免疫球蛋白單一可變域較佳為奈米抗體且尤其為本文具體所述之奈米抗體中之任一者。
在本文所述之本發明之所有態樣中，連接子之基本性質在於其具有允許第一及第二抗原結合域結合於CXCR2上之其各別抗原決定基的長度及構形。
所用之連接子亦可賦予本發明之多肽一或多種其他有利性質或功能，及/或提供一或多個用於形成衍生物及/或用於連接官能基之位點(例如如本文對於本發明之雙互補位奈米抗體的衍生物所述)。舉例而言，含有一或多個帶電胺基酸殘基之連接子(參見國際申請案WO 08/020079之第48頁上的表A-2)可提供改良之親水性性質，然而形成或含有小抗原決定基或標記之連接子可用於偵測、鑑別及/或純化之目的。此外，根據本文之揭示內容，熟習此項技術者將能夠視情況在一些有限常規實驗後判定用於本發明之特定多肽中之最佳連接子。
最後，當兩個或兩個以上連接子用於本發明之多肽中時，此等連接子可相同或不同。此外，根據本文之揭示內容，熟習此項技術者將能夠視情況在一些有限常規實驗後判定用於本發明之特定多肽中之最 佳連接子。
通常，為了便於表現及產生，本發明之多肽將為線性多肽。然而，本發明在其最廣泛意義上並不限於此。舉例而言，當本發明之多肽包含三種或三種以上奈米抗體時，有可能藉由使用具有三個或三個以上「臂」之連接子來連接該等奈米抗體，其中各「臂」連接於奈米抗體，以得到「星形」構築體。儘管通常為次佳，但亦有可能使用圓形構築體。
詳言之，可製備兩種或兩種以上奈米抗體與如上文所鑑別之一或多個連接子的任何排列。舉例而言，可設想雙互補位、雙特異性奈米抗體，其包含兩個針對或結合於CXCR2之免疫球蛋白結合域及一或多個針對或結合於人類血清白蛋白(HSA)之免疫球蛋白結合域，該HSA結合域可包含於在任何位置(例如在兩種結合CXCR2之奈米抗體之間)經由如本文所定義之連接子連接於結合CXCR2之奈米抗體的奈米抗體中。
本發明者已製備本發明之雙互補位多肽。多價及雙互補位抗-CXCR2奈米抗體之胺基酸序列展示於本文實例中之表13中。在此等胺基酸序列中，本發明之尤其較佳多肽為表13中稱為以下之雙互補位奈米抗體：163D2-127D1、163E3-127D1、163E3-54B12、163D2-54B12、2B2-163E3、2B2-163D2、97A9-2B2、97A9-54B12、127D1-163D2、127D1-163E3、2B2-97A9、54B12-163D2、54B12-163E3、163D2-2B2及163E3,-2B2以及127D1-97A9、54B12-97A9及97A9-127D1及其序列最佳化變異體。所有此等雙互補位奈米抗體均包含第一奈米抗體，其包含能夠結合於由SEQ ID No 7所示之胺基酸序列(CXCR2之胺基酸1-19)組成之線性肽的第一抗原結合域；及第二奈米抗體，其包含不能夠結合於該線性肽或以較低親和力結合於該線性肽之第二抗原結合域(參見表8)。根據本發明，尤其較佳為163D2- 127D1、163E3-127D1、163E3-54B12、163D2-54B12、2B2-163E3、2B2-163D2、97A9-2B2及97A9-54B12。
1)163D2-127D1(SEQ ID No 58)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 145、165及185組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 145、165或185之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 141、161及181組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 141、161或181之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第二奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列，且其中在該第一奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 161所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、185、141、161或181所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸一致性、或至少85%或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、185、141、161或181中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 83所 示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 104所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 124所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 79所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 100所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 120所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 83、104、124、131、79、100或120中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 58所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 58之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 58所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 58具有至少80%胺基酸序列一致性或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 58所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表28中適合 於163D2奈米抗體及表26中適合於127D1奈米抗體之彼等取代。較佳地，163D2奈米抗體包含SEQ ID No 218所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 218具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且127D1奈米抗體包含SEQ ID No 216所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 216具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
2)163E3-127D1(SEQ ID No 59)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 146、166及186組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 146、166或186之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 141、161及181或與SEQ ID No 141、161或181之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第二奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 166所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列，且其中在該第一奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 161所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，或 CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 146、166、186、141、161或181所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 146、165、186、141、161或181中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 84所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 105所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 125所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 79所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 100所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 120所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 84、105、125、131、79、100或120中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 59所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 59之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、或至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的一個實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 59所示之胺基酸序列或與SEQ ID 59具有至少80%一致性、或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 59所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表24中適合於163E3奈米抗體及表26中適合於127D1奈米抗體之彼等取代。較佳地，163E3奈米抗體包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 217具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且127D1奈米抗體包含SEQ ID No 216所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 216具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
3)163E3/54B12(SEQ ID No 62)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 146、166及186組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 146、166或186之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 151、171及191或與SEQ ID No 151、171或191之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第二奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 166所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列，且其中在該第一奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6與SEQ ID No 146、166、186、151、171或191所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸一致性，較佳至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 146、166、186、151、171、191中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
根據本發明之此態樣，FR1包含SEQ ID No 84所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 105所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 125所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 89所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 110所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 130所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 84、105、125、131、89、100或130中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、或至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在一較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 62所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 62之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性之胺基酸序列。
在一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 62所示之胺基酸序列或與SEQ ID 62具有至少80%一致性或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制GRO-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 62所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表24中適合於163E3奈米抗體及表30中適合於51B12奈米抗體之彼等取代。較佳地，163E3奈米抗體包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 217具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且54B12奈米抗體包含SEQ ID No 219所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 219具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 212至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
4)163D2/54B12(SEQ ID No 63)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 145、165及185組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 145、165或185之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 151、171及191或與SEQ ID No 151、171或191之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6與SEQ ID No 145、165、185、151、171或191所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%，較佳至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、151、171或191中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列Id之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
根據本發明之此態樣，FR1包含SEQ ID No 83所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 104所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 124所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 89所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 110所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 130所示之胺基酸序列及/或 FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 83、104、124、131、89、100或130中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 63所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 63之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性之多肽。
在一個較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 63所示之胺基酸序列或與SEQ ID 63具有至少80%一致性，或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於2.0E-09M之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 63所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表28中適合於163D2奈米抗體及表30中適合於54B12奈米抗體之彼等取代。較佳地，163D2奈米抗體包含SEQ ID No 218所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 218具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且54B12奈米抗體包含SEQ ID No 219所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 219具有至少80%、至少85%、至少90%或至 少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
5)2B2/163E3(SEQ ID No 64)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中該第一奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 147、167及187組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 147、167或187之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 146、166及186或與SEQ ID No 146、166或186之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 147所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 167所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 187所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 166所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6與SEQ ID No 147、167、187、164、146或186所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%，較佳至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 147、167、187、146、166或186所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列Id之不 同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
根據本發明之態樣，FR1包含SEQ ID No 85所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 106所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 126所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 84所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 105所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 125所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 85、106、126、131、84、105或125中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 64所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 64之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性之多肽。
本發明之雙互補位奈米抗體的一較佳實施例包含SEQ ID No 64所示之胺基酸序列或與SEQ ID 64具有至少80%胺基酸一致性，或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 64所示之CDR序列，但在構架區中經修飾 以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表20中適合於2B2奈米抗體及表24中適合於163E2奈米抗體之彼等取代。較佳地，2B2奈米抗體包含SEQ ID No 213或214所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 213或214具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且163E3奈米抗體包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 217具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
6)2B2/163D2(SEQ ID No 65)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中該第一奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 147、167及187組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 147、167或187之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 145、165及185或與SEQ ID No 145、165或185之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 147所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 167所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 187所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 165所示之 胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6與SEQ ID No 147、167、187、145、165或185所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 147、167、187、145、165或185所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列Id之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
根據本發明之此態樣，FR1包含SEQ ID No 85所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 106所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 126所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 83所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 104所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 124所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 85、106、126、131、83、104或124中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
本發明之較佳雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 65所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 65之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性之多肽。
本發明之雙互補位奈米抗體的一較佳實施例包含SEQ ID No 65所 示之胺基酸序列或與SEQ ID 65具有至少80%胺基酸一致性，或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 65所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表20中適合於2B2奈米抗體及表28中適合於163D2奈米抗體之彼等取代。較佳地，2B2奈米抗體包含SEQ ID No 213或214所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 213或214具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且163D2奈米抗體包含SEQ ID No 218所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 218具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
7)97A9/2B2(SEQ ID No 47)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 143、163及183組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 143、163或183之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 147、167及187或與SEQ ID No 147、167或187之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構： FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第二奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 163所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列，且其中在該第一奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 147所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 167所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 187所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6與SEQ ID No 143、163、183、147、167或187所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 143、163、183、147、167或187所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列Id之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
根據本發明之態樣，FR1包含SEQ ID No 81所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 102所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 122所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 133所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 85所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 106所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 126所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 81、102、122、133、85、106、126或131中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含 SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
較佳雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 47所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 47之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性之多肽。
在一尤其較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 47所示之胺基酸序列或與SEQ ID 47具有至少80%胺基酸一致性，或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 47所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表22中適合於97A9奈米抗體及表20中適合於2B2奈米抗體之彼等取代。較佳地，97A9奈米抗體包含SEQ ID No 215所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 215具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且2B2奈米抗體包含SEQ ID No 213或214所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 213或SEQ ID No 214具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
8)97A9/54B12(SEQ ID No 61)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 143、163及183組成之群 的胺基酸序列或與SEQ ID No 143、163或183之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 151、171及191或與SEQ ID No 151、171或191之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第二奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 163所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列，且其中在該第一奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6與SEQ ID No 143、163、183、151、171或191所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 143、163、183、151、171或191所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列Id之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
根據本發明之此態樣，FR1包含SEQ ID No 81所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 102所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 122所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 133所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 89所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 110所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 130所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8 之胺基酸序列可與SEQ ID No 81、102、122、133、89、110、130或131中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在一較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 61所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 61之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸一致性之多肽。
在一尤其較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 61所示之胺基酸序列或與SEQ ID 61之胺基酸序列具有至少80%一致性，或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 61所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表22中適合於97A9奈米抗體及表30中適合於54B12奈米抗體之彼等取代。較佳地，97A9奈米抗體包含SEQ ID No 215所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 215具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且54B12奈米抗體包含SEQ ID No 219所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 219具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列， 其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
9)127D1/163D2(SEQ ID No 53)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第一奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 141、161及181組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 141、161或181之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 145、165及185組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 145、165或185之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 161所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 141、161、181、145、165或185所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性、或至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、185、141、161或181中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 79所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 100所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 120所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 83所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 104所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 124所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 79、100、120、131、83、104或124中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 53所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 53之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 53所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 53或與其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 54所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表26中適合 於127D1奈米抗體及表28中適合於163D2奈米抗體之彼等取代。較佳地，127D1奈米抗體包含SEQ ID No 216所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 216具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且163D2奈米抗體包含SEQ ID No 218所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 218具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
10)127D1/163E3(SEQ ID No 54)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第一奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 141、161及181組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 141、161或181之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 146、166及186組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 146、166或186之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 161所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 166所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列，或其中 CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 146、166、186、141、161或181所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性、或至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 146、166、186、141、161或181中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FRI包含SEQ ID No 79所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 100所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 120所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 84所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 105所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 125所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 79、100、120、131、84、105或125中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 54所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 54之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 54所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 54具有至少80%胺基酸序列一致性或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 54所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表26中適合於127D1奈米抗體及表24中適合於163E3奈米抗體之彼等取代。較佳地，127D1奈米抗體包含SEQ ID No 216所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 216具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且163E3奈米抗體包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 217具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
11)127D1/97A9(SEQ ID No 37及39)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第一奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 141、161及181組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 141、161或181之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 143、163及183組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 143、163或183之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 161所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 163所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 141、161、181、143、163或183所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性、或至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 141、161、181、143、163或183中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 79所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 100所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 120所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 81所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 102所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 122所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 133所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 79、100、120、131、81、102、122或133中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含含SEQ ID No 37所示之胺基酸序列的第一抗原結合域及含SEQ ID No 39所示之胺基酸序列的第二抗原結合域或與SEQ ID No 37及39所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 37及39所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 37及39或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 37及39所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表26中適合於127D1奈米抗體及表22中適合於97A9奈米抗體之彼等取代。較佳地，127D1奈米抗體包含SEQ ID No 216所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 216具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且97A9奈米抗體包含SEQ ID No 215所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 215具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類 CXCR2之結合。
12)2B2/97A9(SEQ ID No 46)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第一奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 147、167及187組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 147、167或187之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 143、163及183組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 143、163或183之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 147所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 167所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 187所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 163所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 147、167、187、143、163或183所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性、或至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 147、167、187、143、163或183中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 85所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 106所示之胺基酸序列，FR3包 含SEQ ID No 126所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 81所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 102所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 122所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 133所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 85、106、126、131、81、102、122或133中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 46所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 46之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 46所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 46具有至少80%胺基酸序列一致性或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 46所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表20中適合於2B2奈米抗體及表22中適合於97A9奈米抗體之彼等取代。較佳地， 2B2奈米抗體包含SEQ ID No 213或214所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 213或214具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且97A9奈米抗體包含SEQ ID No 215所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 215具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
13)54B12/163D2(SEQ ID No 69)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第一奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 151、171及191組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 151、171或191之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 145、165及185組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 145、165或185之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 151、171、191、145、165或185所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性、或至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 151、171、191、145、165或185中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 89所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 110所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 130所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 83所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 104所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 124所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 89、110、130、131、83、104或124中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 69所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 69之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 69所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 69具有至少80%胺基酸序列一致性或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 69所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表30中適合於54B12奈米抗體及表28中適合於163D2奈米抗體之彼等取代。較佳地，54B12奈米抗體包含SEQ ID No 219所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 219具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且163D2奈米抗體包含SEQ ID No 218所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 218具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
14)54B12/163E3(SEQ ID No 68)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第一奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 151、171及191組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 151、171或191之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 146、166及186組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 146、166或186之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構： FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 166所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 151、171、191、146、166或186所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性、或至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 151、171、191、146、166或186中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 89所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 110所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 130所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 84所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 105所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 125所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 89、110、130、131、84、105或125中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 68所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 68之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 68所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 68具有至少80%胺基酸序列一致性或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 68所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表30中適合於54B12奈米抗體及表24中適合於163E3奈米抗體之彼等取代。較佳地，54B12奈米抗體包含SEQ ID No 219所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 219具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且163E3奈米抗體包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 217具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
15)54B12/97A9(SEQ ID No 90及39)
本發明之此實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第一奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 141、161及181組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 141、161或181之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 143、163及183組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 143、163或183之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第一奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 161所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，且其中在該第二奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 163所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 141、161、181、143、163或183所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性、或至少85%、或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 141、161、181、143、163或183中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 89所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 110所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 130所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 81所示之胺基酸序列，FR6包含 SEQ ID No 102所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 122所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 89、110、130、131、81、102或122中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 90及39所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 90及39之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 90及39所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 90及39或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 90及39所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表30中適合於54B12奈米抗體及表22中適合於97A9奈米抗體之彼等取代。較佳地，54B12奈米抗體包含SEQ ID No 90及39所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 90及/或39具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95% 胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且97A9奈米抗體包含SEQ ID No 215所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 215具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
16)97A9/127D1(SEQ ID No 39及37)
本發明之此等實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 143、163及183組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 143、163或183之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 141、161及181組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 141、161或181之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第二奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 163所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列，且其中在該第一奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 161所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 143、163、183、141、161或181所示之胺基酸序列中之任一者具有至少8。%胺基酸一致性、或至少85%或至少90%或至少95%胺基酸 序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 143、163、183、141、161或181中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 81所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 102所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 122所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 133所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 79所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 100所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 120所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 81、102、122、133、79、100、122或131中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 39及37所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 39及/或37之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 39及37所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 39及/或37或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序 列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 39及37所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表22中適合於97A9奈米抗體及表26中適合於97A9奈米抗體之彼等取代。較佳地，97A9奈米抗體包含SEQ ID No 39及37所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 39及37具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且127D1奈米抗體包含SEQ ID No 216所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 216具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
17)163D2/2B2(SEQ ID No 67)
本發明之此等實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 145、165及185組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 145、165或185之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 147、167及187組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 147、167或187之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第二奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列，且其中在該第一奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 147所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 167所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 187所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、185、147、167或187所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸一致性、或至少85%或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、185、147、167或187中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 83所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 104所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 124所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 85所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 106所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 126所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 83、104、124、131、85、106或126中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可 包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 67所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 67之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 67所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 67具有至少80%胺基酸序列一致性或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 67所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表28中適合於163D2奈米抗體及表20中適合於2B2奈米抗體之彼等取代。較佳地，163D2奈米抗體包含SEQ ID No 218所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 218具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且2B2奈米抗體包含SEQ ID No 213或214所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 213或214之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
18)163E3/2B2(SEQ ID No 66)
本發明之此等實施例係關於一種雙互補位奈米抗體，其中如上文所定義之該第二奈米抗體包括至少一個包含選自由SEQ ID No 146、 166及186組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 146、166或186之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一奈米抗體包括至少一個選自由SEQ ID No 147、167及187組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 147、167或187之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。
較佳地，雙互補位奈米抗體包含以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接子--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中在該第二奈米抗體中CDR1包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 166所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列，且其中在該第一奈米抗體中CDR4包含SEQ ID No 147所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 167所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 187所示之胺基酸序列，或其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 146、166、186、147、167或187所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%胺基酸一致性、或至少85%或至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
胺基酸序列與SEQ ID No 147、167、186、147、167或187中之任一者所示者之不同可僅為保守性胺基酸變化。胺基酸序列與以上任一序列ID之不同可僅為一個、兩個或三個胺基酸。
在本發明之此態樣的一較佳實施例中，FR1包含SEQ ID No 84所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 105所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 125所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 85所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 106所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 126所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
在替代方案中，FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列可與SEQ ID No 84、105、125、131、85、106或126中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性。
舉例而言，在本發明之此態樣中，FR1及/或FR4可包含SEQ ID No 70至89中之任一者所示之胺基酸序列，FR2及/或FR5可包含SEQ ID No 91至110中之任一者所示之胺基酸序列，FR3及/或FR6可包含SEQ ID No 111至130中之任一者所示之胺基酸序列且FR4及/或FR8可包含SEQ ID No 131至133中之任一者所示之胺基酸序列。
在本發明之此態樣的一尤其較佳實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 66所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 66之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
在本發明之此態樣的另一實施例中，雙互補位奈米抗體包含SEQ ID No 66所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 66具有至少80%胺基酸序列一致性或與根據Kabat編號之其構架區具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，該雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
在本發明之此態樣的另一較佳實施例中，本發明之雙互補位奈米抗體實質上包含SEQ ID No 66所示之CDR序列，但在構架區中經修飾以包括一或多個序列最佳化取代，較佳一或多個鑑別為如表24中適合於163E3奈米抗體及表20中適合於2B2奈米抗體之彼等取代。較佳地，163E3奈米抗體包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 217具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且2B2奈米抗體包含SEQ ID No 213或214所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 213或214之任一者具有至少80%、至少 85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。舉例而言，此等奈米抗體之構架區可具有根據Kabat編號之構架區FR1、FR2、FR3或FR4的序列，其以SEQ ID No 213至219中之任一者展示於表32中。較佳地，該序列最佳化雙互補位奈米抗體可以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
如本文已論述，希望本發明之較佳雙互補位奈米抗體(包括稱為163D2/127D1、163E3/127D1、163E3/54B12、163D2/54B12、2B2/163E3、2B2/163D2、97A9/2B2、97A9/54B12、127D1/163D2、127D1/163E3、127D1/97A9、2B2/97A9、54B12/163D2、54B12/163E3、54B12/97A9、97A9/127D1、163D2/2B2或163E3/2B2之特定實施例及其變異體)在其構架區中具有至少一個序列最佳化胺基酸取代且該等構架區可例如部分或完全經人類化。希望序列最佳化之程度導致雙互補位奈米抗體至少關於構架區與SEQ ID No 58、59、62、63、64、65、47、61、53、54、46、69、68、67或66具有80%至90%序列一致性。
本發明之實施例進一步包含如下多肽，其中第一抗原結合域選自SEQ ID No.213、214、216及219或與此等序列中之一者具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，且第二抗原結合域選自SEQ ID No.215、217及218或與此等序列中之一者具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
在本發明之一個實施例中，多肽包含該第二免疫球蛋白單一可變域，在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 236所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，且進一步包含該第一免疫球蛋白單一可變域，在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 237所示之胺基 酸序列且CDR6包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 141、236、181、146、237或186所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，多肽包含與SEQ ID No 141、236、181、146、237或186所示者之不同僅為保守性胺基酸變化的胺基酸序列。
在另一實施例中，多肽包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域選自SEQ ID No.216或與SEQ ID No.216具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，且第二抗原結合域選自SEQ ID No.217或與SEQ ID No.217具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
在另一實施例中，多肽包含SEQ ID No.221。
在本發明之一個實施例中，多肽包含該第二免疫球蛋白單一可變域，在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 236所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，且進一步包含該第一免疫球蛋白單一可變域，在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 141、236、181、145、165或185所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，多肽包含與SEQ ID No 141、236、181、145、165或185所示者之不同僅為保守性胺基酸變化的胺基酸序列。
在另一實施例中，多肽包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域選自SEQ ID No.216或與SEQ ID No.216具有至少80%，諸如至少 90%、例如至少95%一致性之多肽，且第二抗原結合域選自SEQ ID No.218或與SEQ ID No.218具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
在另一實施例中，多肽包含SEQ ID No.222。
在本發明之一個實施例中，多肽包含該第二免疫球蛋白單一可變域，在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 236所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列，且進一步包含該第一免疫球蛋白單一可變域，在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 235所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 141、236、181、143、235或183所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，多肽包含與SEQ ID No 141、236、181、143、235或183所示者之不同僅為保守性胺基酸變化的胺基酸序列。
在另一實施例中，多肽包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域選自SEQ ID No.216或與SEQ ID No.216具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，且第二抗原結合域選自SEQ ID No.215或與SEQ ID No.215具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，該等抗原結合域由具有SEQ ID No.220之連接子分隔。
在本發明之一個實施例中，多肽包含該第二免疫球蛋白單一可變域，在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列，且進一步包含該第一免疫球 蛋白單一可變域，在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 237所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 151、171、191、146、237或186所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，多肽包含與SEQ ID No 151、171、191、146、237或186所示者之不同僅為保守性胺基酸變化的胺基酸序列。
在另一實施例中，多肽包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域選自SEQ ID No.219或與SEQ ID No.219具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，且第二抗原結合域選自SEQ ID No.217或與SEQ ID No.217具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
在另一實施例中，多肽包含SEQ ID No.223。
在本發明之一個實施例中，多肽包含該第二免疫球蛋白單一可變域，在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列，且進一步包含該第一免疫球蛋白單一可變域，在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 151、171、191、145、165或185所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，多肽包含與SEQ ID No 151、171、191、145、165或185所示者之不同僅為保守性胺基酸變化的胺基酸序列。
在另一實施例中，多肽包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域選自SEQ ID No.219或與SEQ ID No.219具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，且第二抗原結合域選自SEQ ID No.218或與SEQ ID No.218具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
在另一實施例中，多肽包含SEQ ID No.224。
在本發明之一個實施例中，多肽包含該第二免疫球蛋白單一可變域，在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列，且進一步包含該第一免疫球蛋白單一可變域，在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 235所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No 151、171、191、143、235或183所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，多肽包含與SEQ ID No 151、171、191、143、235或183所示者之不同僅為保守性胺基酸變化的胺基酸序列。
在另一實施例中，多肽包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域選自SEQ ID No.219或與SEQ ID No.219具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，且第二抗原結合域選自SEQ ID No.215或與SEQ ID No.215具有至少80%，諸如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，該等抗原結合域由具有SEQ ID No.220之連接子分隔。
關於本發明之較佳實施例的以上論述，應瞭解，儘管其具體而言係關於雙互補位奈米抗體，但本發明亦關於針對或結合CXCR2之雙 互補位多肽，其中第一及第二結合域包含於習知四鏈抗體、重鏈抗體、單鏈Fv、Fab或Fab(2)中，但其具有以上較佳實施例之一或多種功能或結構特徵。
亦明確揭示第一及第二抗原結合域包含於免疫球蛋白單一可變域(諸如VL域、VH域、(dAb)及VHH域及其片段)中之實施例，其具有各以上實施例之一或多種功能或結構特徵。
在另一態樣中，本發明提供多肽，且詳言之免疫球蛋白單一可變域，諸如VHH域或奈米抗體，其對於CXCR2結合之單價且其為用於本發明之雙互補位多肽的構建嵌段並可視為其產生過程中之中間物。較佳單價免疫球蛋白單一可變域為具有表9中所示之SEQ ID No 25至43及90的彼等多肽或與SEQ ID No 25至43及90中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
較佳單價多肽為稱為137B7且包含SEQ ID No 36所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 36具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的多肽。在一較佳實施例中，SEQ ID No 36之構架區具有一或多個序列最佳化胺基酸取代。其他較佳單價多肽為稱為127D1、2B2、54B12、97A9、163D2及163E3之多肽，包括在構架區中經序列最佳化之多肽。
舉例而言，127D1可包含SEQ ID No 37之胺基酸序列，其中已形成如表26中所預期之一或多個序列最佳化胺基酸取代且多肽較佳包含SEQ ID No 216所示之胺基酸序列。
2B2可包含SEQ ID No 43之胺基酸序列，其中已形成如表20中所預期之一或多個序列最佳化取代且多肽包含SEQ ID No 213或214所示之胺基酸序列。
54B12可包含SEQ ID No 90，其中已形成如表30中所預期之一或多個序列最佳化取代且多肽較佳包含SEQ ID No 219所示之胺基酸序 列。
97A9可包含SEQ ID No 39，其中已形成如表22中所預期之一或多個序列最佳化取代且多肽較佳包含SEQ ID No.215所示之胺基酸序列。
163D2可包含SEQ ID No 41之胺基酸序列，其中已形成如表28中所預期之一或多個序列最佳化取代且多肽較佳包含SEQ ID No 218所示之胺基酸序列。
163E3可包含SEQ ID No.42所示之胺基酸序列，其中已形成如表24中所預期之一或多個序列最佳化取代且多肽較佳包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列。
本發明之此態樣中亦包涵單價多肽，詳言之免疫球蛋白單一可變域，諸如奈米抗體，其能夠交叉阻斷CXCR2與具有SEQ ID No 58、59、62、63、64、65、47或61中之任一者所示之胺基酸序列的多肽之結合。
上述任一較佳單價奈米抗體及尤其137B7可用於本文所述之應用，例如用於治療COPD。
本發明之雙互補位多肽、尤其上述較佳雙互補位免疫球蛋白單一可變域(包括其所有駱駝類化及人類化形式)為CXCR2之調節劑且尤其抑制CXC2信號轉導。
較佳地，本發明之雙互補位多肽、尤其雙互補位免疫球蛋白單一可變域中之CDR序列及FR序列使得其：- 以10-5至10-12莫耳/公升或更小且較佳10-7至10-12莫耳/公升或更小且更佳10-8至10-12莫耳/公升之解離常數(KD)(亦即以105至1012公升/莫耳或更大且較佳107至1012公升/莫耳或更大且更佳108至1012公升/莫耳之締合常數(KA))結合於CXCR2；及/或使得其： - 以102M-1s-1至約107M-1s-1，較佳介於103M-1s-1與107M-1s-1之間，更佳介於104M-1s-1與107M-1s-1之間，諸如介於105M-1s-1與107M-1s-1之間的kon速率結合於人類CXCR2；及/或使得其：- 以介於1s-1(t1/2=0.69s)與10-6s-1之間(提供t1/2為多天之接近不可逆複合物)，較佳介於10-2s-1與10-6s-1之間，更佳介於10-3s-1與10-6s-1之間，諸如介於10-4s-1與10-6s-1之間的koff速率結合於人類CXCR2。
較佳地，本發明之多肽及雙互補位免疫球蛋白單一可變域中存在之CDR序列及FR序列使得其以小於500nM，較佳小於200nM，更佳小於10nM，諸如小於500pM之親和力結合於CXCR2。
詳言之，如本文實例中所示，本發明之較佳雙互補位奈米抗體能夠以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。本發明之較佳雙互補位奈米抗體亦可以小於100nM之IC50抑制促效劑誘導(Gro-α)之自帶有CXCR2之RBL細胞釋放Ca。本發明之較佳雙互補位奈米抗體亦可以小於50nM之IC50抑制促效劑誘導(Gro-α)之[35S]GTPγS在CXCR2-CHO膜中的積累。本發明之較佳雙互補位奈米抗體亦可以小於1nm之IC50抑制人類白血球在曝露於Gro-α後之形狀改變或以小於2nm之IC50抑制食蟹獼猴白血球形狀改變。
根據本發明之一最佳態樣，本發明之雙互補位多肽(諸如雙互補位免疫球蛋白單一可變域，例如如本文所述之奈米抗體)將交叉阻斷具有SEQ ID No 1之胺基酸序列的CXCR2多肽與SEQ ID No 58、59、62、63、64、65、47或61所示之任何或所有多肽的結合。交叉阻斷可藉由熟習此項技術者熟知之任何方法來量測。
對於藥物用途而言，本發明之多肽較佳針對人類CXCR2，例如包含SEQ ID No 1所示之胺基酸序列的多肽；然而，對於獸醫目的而 言，本發明之多肽較佳針對來自待治療物種之CXCR2，或至少與來自待治療物種之CXCR2具有交叉反應性。
此外，本發明之雙互補位多肽可視情況且除至少兩個用於結合CXCR2之抗原結合域外含有一或多個用於結合其他抗原決定基、抗原、蛋白質或標靶之其他結合位點或域。
本發明之多肽及包含其之組合物的功效可使用任何適合之活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或本身已知之動物模型或其任何組合來測試，該等分析適合於指示多肽可適用於治療COPD或涉及CXCR2信號轉導異常之任何其他疾病。適合之分析及動物模型為熟習此項技術者所瞭解。
此外，根據本發明，針對人類CXCR2之多肽可能或可能不展示與來自一或多種其他溫血動物物種之CXCR2的交叉反應性。然而，較佳地，本發明之針對人類CXCR2的多肽將展示與來自一或多種其他靈長類動物物種(諸如(但不限於)來自獼猴屬(Macaca)之猴(諸如及尤其為食蟹獼猴(cynomologus monkey)(食蟹猴(Macaca fascicularis))及/或恆河猴(rhesus monkey)(恆河猴(Macaca mulatta)))及狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))之CXCR2的交叉反應性以用於毒性測試目的。較佳交叉反應性為與來自食蟹獼猴之CXCR2的交叉反應性。可能需要與通常用於疾病動物模型中(例如小鼠、大鼠、兔子、豬或狗)及尤其用於與CXCR2相關之疾病及病症動物模型中之一或多種動物物種的交叉反應性。就此而言，熟習此項技術者應瞭解，自藥物開發觀點來看，該交叉反應性(若存在)可具有優點，因為其允許在該等疾病模型中測試針對人類CXCR2之胺基酸序列及多肽。
一般而言，與來自多種哺乳動物物種之CXCR2交叉反應的本發明之多肽通常將有利於用於獸醫應用中，因為其將允許在多種物種中使用同一多肽。
較佳地，本發明之雙互補位多肽不與CXCR1或CXCR4交叉反應。
在本發明之雙互補位多肽中，至少一個抗原結合位點可針對相互作用位點，亦即CXCR2將與另一分子(例如其天然配體)相互作用之位點。
本發明之雙互補位多肽(例如免疫球蛋白單一可變域)可使得第二抗原結合域不結合SEQ ID No 7之線性肽，識別包含本文中如SEQ ID No 8、9、10、11或12所示之肽或在該肽中之抗原決定基。另外，第一抗原結合域可識別包含SEQ ID No 7之肽或在該肽中之抗原決定基。
在本發明之與食蟹獼猴CXCR2交叉反應的實施例中，第一抗原結合域亦識別包含SEQ ID No 4之肽或在該肽中之抗原決定基。在該實施例中第二抗原結合域可識別包含SEQ ID No 5或6之肽或在該肽中之抗原決定基。
在本發明之範疇內亦提供一定類型之雙互補位多肽、尤其雙互補位奈米抗體，其一般將結合於CXCR2之所有天然存在或合成的類似物、變異體、突變體、對偶基因、部分及片段；或至少結合於CXCR2之含有一或多個抗原決定子或抗原決定基的彼等類似物、變異體、變異體、對偶基因、部分及片段，該等抗原決定子或抗原決定基基本上與本發明之多肽在CXCR2中(例如SEQ ID No 1之野生型CXCR2中)所結合之抗原決定子或抗原決定基相同。在該情況下，本發明之多肽可以與本發明之多肽結合於(野生型)CXCR2的上述親和力及特異性相同或不同(亦即高或低)之親和力及/或特異性結合於該等類似物、變異體、突變體、對偶基因、部分及片段。
此外，如熟習此項技術者所瞭解，雙互補位多肽結合於CXCR2之親合力高於相應單抗原結合域多肽。
在本文所論述之各種治療情況下使用本發明之雙互補位多肽、尤其雙互補位免疫球蛋白單一可變域之部分、片段、類似物、突變體、變異體、對偶基因及/或衍生物亦在本發明之範疇內，其限制條件為其始終包括等效於完整多肽之相關功能域。該等部分、片段、類似物、突變體、變異體、對偶基因或衍生物可具有上文關於本發明之雙互補位多肽所述的所有功能特徵。
在另一態樣中，本發明係關於一種雙互補位多肽，視情況為雙互補位免疫球蛋白單一可變域，其視情況進一步包含一或多種其他基團、殘基、部分或結合單元。該等其他基團、殘基、部分、結合單元或胺基酸序列可能或可能不向本發明之多肽提供其他功能且可能或可能不改良其性質。
舉例而言，該等其他基團、殘基、部分或結合單元可為一或多種其他胺基酸序列，以使得本發明為(融合)蛋白或(融合)多肽。在一較佳但非限制性態樣中，該一或多種其他基團、殘基、部分或結合單元為免疫球蛋白序列。甚至更佳地，該一或多種其他基團、殘基、部分或結合單元選自由域抗體、適合用作域抗體之胺基酸序列、單域抗體、適合用作單域抗體之胺基酸序列、「dAb」、適合用作dAb之胺基酸序列或奈米抗體組成之群。
或者，該等基團、殘基、部分或結合單元可例如為化學基團、殘基、部分，其可能或可能本身不具有生物學及/或藥理學活性。舉例而言，如本文進一步所述，該等基團可連接於本發明之一或多種多肽以得到本發明之多肽的「衍生物」。
在該等構築體中，本發明之一或多種多肽及一或多種基團、殘基、部分或結合單元可直接彼此連接及/或經由一或多個適合之連接子或間隔子連接。舉例而言，當一或多種基團、殘基、部分或結合單元為胺基酸序列時，連接子亦可為胺基酸序列，以使得所得構築體為 融合(蛋白)或融合(多肽)。
如自以上及本文其他描述應瞭解，此意謂本發明之雙互補位多肽可用作形成本發明之其他多肽的「構建嵌段」，亦即藉由適當地將其與其他基團、殘基、部分或結合單元組合，以形成如本文所述之多互補位且視情況多價或多特異性、二價/多價且雙特異性/多特異性的構築體。
本發明之此態樣的多肽一般可藉由如下方法來製備，該方法包含至少一個適當地視情況經由一或多個適合之連接子將本發明之一或多種多肽連接於一或多種其他基團、殘基、部分或結合單元之步驟。
在本發明之一個特定態樣中，本發明之雙互補位多肽經修飾以與本發明之相應未經修飾之多肽相比具有延長之半衰期。一些較佳多肽將為熟習此項技術者根據本文其他揭示內容而變得清楚，且例如包含經化學修飾以延長其半衰期(例如藉助於聚乙二醇化、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸化(pasylation)或羥乙基澱粉化(hesylation))的本發明之胺基酸序列或多肽；本發明之多肽可包含至少一個用於結合於血清蛋白(諸如血清白蛋白)之其他結合位點；或本發明之多肽可包含至少一個連接於至少一個延長本發明之多肽的半衰期之部分(及尤其至少一個胺基酸序列)之胺基酸序列。包含該等半衰期延長部分或胺基酸序列之本發明之多肽的實例包括適當地連接於一或多種血清蛋白或其片段(諸如(人類)血清白蛋白或其適合之片段)或一或多種可結合於血清蛋白之結合單元(例如域抗體、適合用作域抗體之胺基酸序列、單域抗體、適合用作單域抗體之胺基酸序列、「dAb」、適合用作dAb之胺基酸序列或奈米抗體，其可結合於血清蛋白，諸如血清白蛋白(諸如人類血清白蛋白)、血清免疫球蛋白(諸如IgG)或轉鐵蛋白)的多肽；連接於Fc部分(諸如人類Fc)或其適合之部分或片段的多肽。連接於一或多種可結合於血清蛋白(諸如(但不限於)WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489及2006年12月5日申請之Ablynx N.V.之名稱為「Peptides capable of binding to serum proteins」的美國臨時申請案(亦參見PCT/EP2007/063348)中所述之蛋白質及肽)之小蛋白質或肽的本發明之多肽亦併入本發明中。
最廣泛用於延長藥物蛋白質之半衰期及/或降低藥物蛋白質之免疫原性的技術之一包含連接適合之藥理學上可接受之聚合物，諸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(諸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般，可使用任何適合形式之聚乙二醇化，諸如此項技術中用於抗體及抗體片段(包括(但不限於)(單)域抗體及scFv)之聚乙二醇化；例如參考Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese及Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003),Harris及Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.,2,(2003)及WO 04/060965。用於蛋白質聚乙二醇化之各種試劑亦可購得，例如購自Nektar Therapeutics,USA。
較佳地，使用定點聚乙二醇化，尤其經由半胱胺酸殘基(參見例如Yang等人，Protein Engineering,16,10,761-770(2003)。舉例而言，出於此目的，PEG可連接於天然存在於本發明之雙互補位奈米抗體中的半胱胺酸殘基。本發明之雙互補位多肽可經修飾以適當地引入一或多個用於連接PEG之半胱胺酸殘基，或包含一或多個用於連接PEG之半胱胺酸殘基的胺基酸序列可與雙互補位多肽之N及/或C端融合，全部使用熟習此項技術者本身已知之蛋白質工程改造技術。
較佳地，對於本發明之雙互補位免疫球蛋白單一可變域及多肽，將PEG用於大於5000，諸如大於10,000及小於200,000，諸如小於100,000、例如在20,000-80,000範圍內之分子量。
聚乙二醇化可應用於免疫球蛋白可變域中之一者或兩者及/或任何肽連接子區域。適合之聚乙二醇化技術描述於EP 1639011中。
作為PEG之替代物，半衰期可藉由稱為羥乙基澱粉化之技術來延 長，該技術涉及將羥乙基澱粉(HES)衍生物連接於本發明之多肽。所用之羥乙基澱粉為衍生自糯玉米澱粉之支鏈澱粉，其藉助於酸水解進行修飾以調整分子量且其中葡萄糖殘基經羥乙基化。其他詳情可獲自Pavisic R，等人，Int J Pharm(2010)3月15日，387(1-2)：110-9。
一般，具有延長之半衰期的本發明之多肽的半衰期較佳為本發明之相應多肽本身之半衰期的至少1.5倍，較佳至少2倍，諸如至少5倍、例如至少10倍或大於20倍。舉例而言，與本發明之相應多肽本身相比，具有延長之半衰期的本發明之多肽的半衰期可延長大於1小時，較佳大於2小時，更佳大於6小時，諸如大於12小時、或甚至大於24、48或72小時。
在本發明之一較佳態樣中，與本發明之相應多肽本身相比，本發明之該等多肽的血清半衰期延長大於1小時，較佳大於2小時，更佳大於6小時，諸如大於12小時、或甚至大於24、48或72小時。
在本發明之另一較佳態樣中，本發明之多肽在人體內展現至少約12小時，較佳至少24小時，更佳至少48小時，甚至更佳至少72小時或更久之血清半衰期。舉例而言，本發明之多肽的半衰期可為至少5天(諸如約5至10天)，較佳至少9天(諸如約9至14天)，更佳至少約10天(諸如約10至15天)或至少約11天(諸如約11至16天)，更佳至少約12天(諸如約12至18天或更久)或大於14天(諸如約14至19天)。
本發明進一步係關於製備或產生如本文所述之本發明之多肽、核酸、宿主細胞及組合物的方法。
一般，此等方法可包含以下步驟：a)提供多肽之組、集合或文庫；及b)在該多肽之組、集合或文庫中篩選可結合於CXCR2及/或對於CXCR2具有親和力之胺基酸序列；及c)分離可結合於CXCR2及/或對於CXCR2具有親和力之胺基酸序 列。
多肽之組、集合或文庫可為免疫球蛋白序列(如本文所述)之組、集合或文庫，諸如天然免疫球蛋白序列之組、集合或文庫；合成或半合成免疫球蛋白序列之組、集合或文庫；及/或已經受親和成熟之免疫球蛋白序列之組、集合或文庫。
此外，在該方法中，多肽之組、集合或文庫可為重鏈可變域(諸如VH域或VHH域)或輕鏈可變域之組、集合或文庫。舉例而言，多肽之組、集合或文庫可為域抗體或單域抗體之組、集合或文庫，或可為能夠充當域抗體或單域抗體之胺基酸序列之組、集合或文庫。
在此方法之一較佳態樣中，多肽之組、集合或文庫可為免疫球蛋白序列免疫之組、集合或文庫，例如來源於哺乳動物，例如已適當地用CXCR2或用基於其或來源於其之適合抗原決定子(諸如其抗原性部分、片段、區域、域、環或其他抗原決定基)免疫接種的美洲駝。
在以上方法中，肽或多肽之組、集合或文庫可在噬菌體、噬菌粒、核糖體或適合之微生物(諸如酵母)上呈現，以有助於篩選。適合於呈現及篩選胺基酸序列(之組、集合或文庫)之方法、技術及宿主生物體為熟習此項技術者所瞭解，例如根據本文其他揭示內容。亦參考Hoogenboom,Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)之評述。
在另一態樣中，產生用於構築本發明之雙互補位多肽之多肽的方法包含至少以下步驟：a)提供表現多肽之細胞的集合或樣品；b)篩選該細胞之集合或樣品中表現可結合於CXCR2及/或對於CXCR2具有親和力之多肽的細胞；及c)(i)分離該多肽；或(ii)自該細胞分離編碼該多肽之核酸序列，隨後表現該多肽。
舉例而言，當所需多肽為免疫球蛋白序列時，細胞之集合或樣品 可例如為B細胞之集合或樣品。此外，在此方法中，細胞之樣品可來源於哺乳動物，例如已適當地用CXCR2或用基於其或來源於其之適合抗原決定子(諸如其抗原性部分、片段、區域、域、環或其他抗原決定基)免疫接種的美洲駝。在一個特定態樣中，該抗原決定子可為細胞外部分、區域、域、環或其他細胞外抗原決定基。
在製備本文所鑑別之本發明之較佳雙互補位奈米抗體中，用表現人類CXCR2之哺乳動物細胞、表現食蟹獼猴CXCR2之哺乳動物細胞、編碼全長人類CXCR2之DNA、編碼△1-17人類CXCR2之DNA、編碼食蟹獼猴CXCR2之DNA及表5中所示之肽免疫接種美洲駝。
如熟習此項技術者所瞭解，如上文所述之篩選方法可以任何適合之方式進行。例如參考EP 0 542 810、WO 05/19824、WO 04/051268及WO 04/106377。步驟b)之篩選較佳使用諸如FACS之流動式細胞測量技術來進行。為此，例如參考Lieby等人，Blood，第97卷，第12期，3820(2001)。
在另一態樣中，產生用於構築本發明之多肽的針對CXCR2之多肽的方法可包含至少以下步驟：a)提供編碼該多肽之核酸序列之組、集合或文庫；b)在該核酸序列之組、集合或文庫中篩選編碼可結合於CXCR2及/或對於CXCR2具有親和力之胺基酸序列的核酸序列；及c)分離該核酸序列，隨後表現該多肽。
在該方法中，編碼多肽之核酸序列之組、集合或文庫可例如為編碼天然免疫球蛋白序列之組、集合或文庫的核酸序列之組、集合或文庫；編碼合成或半合成免疫球蛋白序列之組、集合或文庫的核酸序列之組、集合或文庫；及/或編碼經受親和成熟之免疫球蛋白序列之組、集合或文庫的核酸序列之組、集合或文庫。
此外，在該方法中，核酸序列之組、集合或文庫可編碼重鏈可變 域(諸如VH域或VHH域)或輕鏈可變域之組、集合或文庫。舉例而言，核酸序列之組、集合或文庫可編碼域抗體或單域抗體之組、集合或文庫，或可編碼能夠充當域抗體或單域抗體之胺基酸序列之組、集合或文庫。
在此方法之一較佳態樣中，核酸序列之組、集合或文庫可為核酸序列之免疫組、集合或文庫，例如來源於已適當地用CXCR2或用基於其或來源於其之適合抗原決定子(諸如其抗原性部分、片段、區域、域、環或其他抗原決定基)免疫接種的哺乳動物。在一個特定態樣中，該抗原決定子可為細胞外部分、區域、域、環或其他細胞外抗原決定基。
在產生本發明之多肽中，用如以上所解釋之抗原免疫接種美洲駝。
在以上方法中，核苷酸序列之組、集合或文庫可在噬菌體、噬菌粒、核糖體或適合之微生物(諸如酵母)上呈現，以有助於篩選。適合於呈現及篩選編碼胺基酸序列之核苷酸序列(之組、集合或文庫)的方法、技術及宿主生物體為熟習此項技術者所瞭解，例如根據本文其他揭示內容。亦參考Hoogenboom,Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)之評述。
在另一態樣中，產生可用於本發明之雙互補位多肽中的針對CXCR2之多肽的方法可包含至少以下步驟：a)提供編碼該多肽之核酸序列之組、集合或文庫；b)在該核酸序列之組、集合或文庫中篩選編碼可結合於CXCR2及/或對於CXCR2具有親和力且被交叉阻斷或交叉阻斷本發明之雙互補位奈米抗體(例如由SEQ ID NO 58、59、62、63、64、65、47或61編碼者)之胺基酸序列的核酸序列；及c)分離該核酸序列，隨後表現該多肽。
本發明亦關於藉由以上方法或者藉由包含以上方法中之一者及另外至少以下步驟的方法所獲得之雙互補位多肽：測定該免疫球蛋白序列之核苷酸序列或胺基酸序列；及以本身已知之方式，諸如藉由在適合之宿主細胞或宿主生物體中表現或藉由化學合成及由其構築雙互補位多肽來表現或合成該胺基酸序列。
如熟習此項技術者所瞭解及以下更詳細地論述，以上方法可以任何適合之方式進行。例如參考EP 0 542 810、WO 05/19824、WO 04/051268及WO 04/106377。舉例而言，步驟b)之篩選較佳使用諸如FACS之流動式細胞測量技術來進行。為此，例如參考Lieby等人，Blood，第97卷，第12期，3820。尤其參考Ablynx N.V之國際申請案WO 06/079372中所述之所謂「NanocloneTM」技術。
獲得針對CXCR2之VHH序列或奈米抗體序列的另一技術包括適當地免疫接種能夠表現重鏈抗體之轉殖基因哺乳動物(亦即以產生免疫反應及/或針對CXCR2之重鏈抗體)，自含有(編碼)該等VHH序列或奈米抗體序列(之核酸序列)之該轉殖基因哺乳動物獲得適合之生物樣品(諸如血液樣品、血清樣品或B細胞樣品)，接著由該樣品開始，使用本身已知之任何適合技術(諸如本文所述之任何方法或融合瘤技術)產生針對CXCR2之VHH序列。舉例而言，出於此目的，可使用表現重鏈抗體之小鼠及WO 02/085945、WO 04/049794及WO 06/008548及Janssens等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年10月10日；103(41)：15130-5中所述之其他方法及技術。舉例而言，該等表現重鏈抗體之小鼠可表現具有任何適合之(單一)可變域，諸如來自天然來源之(單一)可變域(例如人類(單一)可變域、駱駝類(單一)可變域或鯊魚(單一)可變域)以及例如合成或半合成(單一)可變域的重鏈抗體。
其他適合於由天然存在之VH序列開始或較佳由VHH序列開始而獲得用於本發明中之奈米抗體及/或編碼其之核酸的方法及技術為熟習 此項技術者所瞭解，且可例如包括本文所提及之WO 08/00279A之第64頁上所提及的技術。
VHH域或奈米抗體之特徵可為其FR中之一或多個「標誌殘基」。該等標誌殘基為表徵FR來自駱駝類(例如美洲駝)來源之彼等殘基。因此，標誌殘基為取代，較佳人類化取代所需之標靶。
根據Kabat編號，標誌殘基可位於奈米抗體中之位置11、37、44、45、47、83、84、103、104或108。該等構架序列及替代性標誌殘基(之適合組合)之非限制性實例在WO 2008/020079之第65至98頁上給出，該等頁數以全文引用的方式併入本文中。此項技術中已知之其他人類化或部分人類化序列亦涵蓋及包涵於本發明中。
如本文中已論述，與天然存在之人類VH域的相應構架區相比，及尤其與DP-47之相應構架區相比，用於本發明中之奈米抗體可在至少一個構架區中具有至少「一個胺基酸差異」(如本文所定義)。更特定言之，根據本發明之一個非限制性態樣，與天然存在之人類VH域的相應構架區相比，及尤其與DP-47之相應構架區相比，奈米抗體可在至少一個標誌殘基(包括位置108、103及/或45之殘基)中具有至少「一個胺基酸差異」(如本文所定義)。通常，與天然存在之VH域相比，奈米抗體將在FR2及/或FR4中之至少一者中及尤其在FR2及/或FR4中之至少一個標誌殘基(同樣包括位置108、103及/或45之殘基)中具有至少一個該胺基酸差異。
此外，本發明之人類化奈米抗體可如本文所定義，但其限制條件為與天然存在之VHH域的相應構架區相比，其在至少一個構架區中具有至少「一個胺基酸差異」(如本文所定義)。更特定言之，根據本發明之一個非限制性態樣，人類化或者序列最佳化奈米抗體可如本文所定義，但其限制條件為與天然存在之VHH域的相應構架區相比，其在至少一個標誌殘基(包括位置108、103及/或45之殘基)中具有至少「一 個胺基酸差異」(如本文所定義)。通常，與天然存在之VHH域相比，人類化或者序列最佳化奈米抗體將在FR2及/或FR4中之至少一者中及尤其在FR2及/或FR4中之至少一個標誌殘基(亦包括位置108、103及/或45之殘基)處具有至少一個該胺基酸差異。
如自本文揭示內容應瞭解，使用如本文所定義之本發明之免疫球蛋白單一可變域的天然或合成類似物、突變體、變異體、對偶基因、同源物及直系同源物(本文中共同稱為「類似物」)及尤其SEQ ID NO 58、59、62、63、64、65、47、61、53、54、46、69、68、67或66之雙互補位奈米抗體的類似物亦在本發明之範疇內。
一般，與如本文所定義之本發明之免疫球蛋白單一可變域相比，在該等類似物中，可置換、缺失及/或添加一或多個胺基酸殘基。該等取代、插入或缺失可在一或多個構架區中及/或在一或多個CDR中產生。當該等取代、插入或缺失在一或多個構架區中產生時，其可在一或多個標誌殘基處及/或在構架殘基中之一或多個其他位置產生，但標誌殘基處之取代、插入或缺失一般次佳(除非此等取代為如本文所述之適合的人類化取代)。
藉助於非限制性實例，取代可例如為保守性取代(如本文所述)及/或胺基酸殘基可經天然存在於另一VHH域中相同位置之另一胺基酸殘基置換(關於該等取代之一些非限制性實例參見WO 2008/020079)，但本發明一般並不限於此。因此，改良例如用於本發明之雙互補位奈米抗體中之奈米抗體的性質或至少不會自本發明之所需性質或自所需性質之平衡或組合降低過多(亦即降低至奈米抗體或雙互補位奈米抗體不再適合於其預期用途之程度)的任一種或多種取代、缺失或插入或其任何組合包括於本發明之範疇內。熟習此項技術者一般將能夠根據本文揭示內容及視情況在有限程度之常規實驗(其可例如包括引入有限量之可能取代且測定其對由此獲得之奈米抗體的性質之影響)後判 定及選擇適合之取代、缺失或插入，或其適合之組合。
舉例而言，且視用於表現本發明之雙互補位奈米抗體或多肽的宿主生物體而定，該等缺失及/或取代可以使得移除一或多個用於轉譯後修飾之位點(諸如一或多個糖基化位點)的方式進行設計，如其將在熟習此項技術者之能力範圍內。或者，取代或插入可經設計以引入一或多個用於連接官能基(如本文所述)之位點，例如允許定點聚乙二醇化(亦如本文所述)。
一般在本文中，出於鞏固天然序列中不存在之特定性質或結構特徵之目的而促進胺基酸序列中之取代、插入或缺失(包括「人類化」取代)稱為「序列最佳化」。就此而言，必須提及本文定義部分之(y)項。
類似物較佳使得其可以如本文所定義之對於本發明之雙互補位奈米抗體的親和力(適當地量測及/或以KD值(實際或表觀)、KA值(實際或表觀)kon速率及/或koff速率或者IC50值表示，如本文進一步所述)結合於CXCR2。
類似物較佳亦使得其保留如本文所述之雙互補位奈米抗體之良好性質。
此外，根據一個較佳態樣，類似物與SEQ ID No 58、59、62、63、64、65、47、61、53、54、46、69、68、67或66之雙互補位奈米抗體中之一者的序列一致性程度為至少70%，較佳至少80%，更佳至少90%，諸如至少95%或99%或更大；及/或與其具有較佳至多20個，較佳至多10個，甚至更佳至多5個，諸如4、3、2或僅1個胺基酸差異(如本文所定義)。
此外，類似物之構架序列及CDR較佳使得其與如本文所定義較佳態樣一致。一般而言，如本文所述，類似物將具有(a)位置108之Q；及/或(b)位置45之帶電胺基酸或半胱胺酸殘基，及較佳位置44之E，及 更佳位置44之E及位置45之R；及/或(c)位置103之P、R或S。
本發明之雙互補位VHH域或奈米抗體的一類較佳類似物已經人類化(亦即與天然存在之奈米抗體的序列相比)。如所提及，該人類化一般包括用存在於人類VH域(諸如人類VH3域)中相同位置之胺基酸殘基置換天然存在之VHH序列中的一或多個胺基酸殘基。儘管有人類化取代之其他組合，但熟習此項技術者將可自奈米抗體序列與天然存在之人類VH域序列之間的比較及自如本文所揭示之WO 2008/020079之揭示內容而了解除了本文表20、22、24、26、28及30中具體揭示者以外之其他可能人類化取代之實例。
一般，由於人類化，免疫球蛋白單一可變域(尤指本發明之奈米抗體)可變得更「類似人類」，而仍保留如本文所述之本發明之奈米抗體的有利性質。因此，該等人類化奈米抗體可具有若干優點，諸如比相應天然存在之VHH域相降低之免疫原性。此外，根據本文揭示內容及視情況在有限程度之常規實驗後，熟習此項技術者將能夠產生人類化取代或適合之人類化取代組合，其在一方面由人類化取代提供之有利性質與另一方面天然存在之VHH域的有利性質之間進行最佳化或達到所需或適合之平衡。
用於併入本發明之雙互補位奈米抗體中的奈米抗體可適當地在構架殘基中進行人類化，諸如在一或多個標誌殘基(如本文所定義)處或在一或多個其他構架殘基(亦即非標誌殘基)處或其任何適合之組合。用於「P,R,S-103組」或「KERE組」之奈米抗體的一個較佳人類化取代為Q108變為L108。「GLEW類」之奈米抗體亦可藉由Q108變為L108之取代而經人類化，其限制條件為至少一個其他標誌殘基含有駱駝類(駱駝類化)取代(如本文所定義)。舉例而言，如上文所提及，一類尤其較佳之人類化奈米抗體具有位置44-47之GLEW或類似GLEW之序列；位置103之P、R或S(及尤其R)，及位置108之L。
人類化及其他類似物及編碼其之核酸序列可依本身已知之任何方式提供，例如使用WO 08/020079之第103及104頁上所提及的一或多種技術。
如本文所提及，熟習此項技術者亦應瞭解，本發明之免疫球蛋白單一可變域(包括其類似物)可由人類VH序列(亦即胺基酸序列或相應核苷酸序列)(例如由人類VH3序列，諸如DP-47、DP-51或DP-29)開始設計及/或製備，亦即藉由引入一或多個駱駝類化取代(亦即將該人類VH域之胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基變為存在於VHH域中相應位置之胺基酸殘基)，以得到本發明之奈米抗體的序列及/或對所得序列賦予奈米抗體之有利性質。同樣地，此點一般可使用前述段落中所提及之各種方法及技術，使用人類VH域之胺基酸序列及/或核苷酸序列作為起始點來進行。
一些較佳、但非限制性駱駝類化取代可來源於WO 2008/020079。亦應瞭解，與一或多個其他胺基酸位置之取代相比，該一或多個標誌殘基處之駱駝類化取代一般將對所需性質具有更大影響，儘管兩者及其任何適合之組合均包括於本發明之範疇內。舉例而言，有可能引入一或多個已賦予至少一些所需性質之駱駝類化取代，接著引入進一步改良該等性質及/或賦予其他有利性質之其他駱駝類化取代。此外，熟習此項技術者一般將能夠根據本文揭示內容及視情況在有限程度之常規實驗(其可例如包括引入有限量之可能駱駝類化取代且判定是否獲得或改良(亦即與原始VH域相比)免疫球蛋白單一可變域之有利性質)後，判定及選擇適合之駱駝類化取代或適合之駱駝類化取代組合。然而，一般，該等駱駝類化取代較佳使得所得胺基酸序列至少含有(a)位置108之Q；及/或(b)位置45之帶電胺基酸或半胱胺酸殘基以及較佳位置44之E，及更佳位置44之E及位置45之R；及/或(c)位置103之P、R或S；及視情況存在之一或多個其他駱駝類化取 代。更佳地，駱駝類化取代使得其產生用於本發明中之免疫球蛋白單一可變域及/或其類似物(如本文所定義)，諸如人類化類似物及/或較佳為如前述段落中所定義之類似物。
諸如奈米抗體之免疫球蛋白單一可變域亦可藉由合併自然界中稀有、但結構上與VH域摺疊相容之取代而來源於VH域。舉例而言，但無限制，此等取代可包括以下一或多者：位置35之Gly，位置37之Ser、Val或Thr，位置39之Ser、Thr、Arg、Lys、His、Asp或Glu或位置45之His，位置47之Trp、Leu、Val、Ala、Thr或Glu，位置50之S或R。(Barthelemy等人J Biol Chem.2008 Feb 8；283(6)：3639-54.Epub 2007年11月28日)
本發明亦包含本發明之雙互補位多肽的衍生物。該等衍生物一般可藉由修飾及尤其藉由化學及/或生物學(例如酶促)修飾本發明之雙互補位多肽及/或形成本發明之雙互補位多肽的一或多個胺基酸殘基來獲得。
該等修飾之實例以及多肽序列中可以該方式修飾之胺基酸殘基的實例(亦即蛋白質主鏈上，但較佳側鏈上)、可用於引入該等修飾之方法及技術及該等修飾之潛在用途及優點為熟習此項技術者所瞭解。
舉例而言，該修飾可包括將一或多種官能基、殘基或部分引入(例如藉由共價連接或以其他適合之方式)本發明之雙互補位多肽中或本發明之雙互補位多肽上，及尤其一或多種賦予本發明之雙互補位多肽一或多種所需性質或功能的官能基、殘基或部分。該等官能基之實例為熟習此項技術者所瞭解。
舉例而言，該等修飾可包含引入(例如藉由共價鍵或以任何其他適合之方式)一或多種如下官能基：延長本發明之多肽的半衰期、增加其溶解度及/或吸收，降低本發明之多肽的免疫原性及/或毒性，消除或削弱本發明之多肽的任何不當副作用，及/或賦予本發明之雙互 補位奈米抗體及/或多肽的其他有利性質及/或減少其非所需性質；或上述兩者或兩者以上之任何組合。該等官能基及用於引入其之技術的實例為熟習此項技術者所瞭解，且一般可包含此項技術中已知之所有官能基以及本身已知用於修飾藥物蛋白質、及尤其用於修飾抗體或抗體片段(包括ScFv及單域抗體)之官能基及技術，關於此例如參考Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack Publishing Co.,Easton,PA(1980)。該等官能基可例如連接直接(例如共價)於本發明之雙互補位多肽，或視情況經由適合之連接子或間隔子連接，如熟習此項技術者亦清楚。
另一通常次佳修飾包含N-連接或O-連接糖基化，通常為共轉譯及/或轉譯後修飾之一部分，此視用於表現本發明之雙互補位奈米抗體或多肽的宿主細胞而定。
另一修飾可包含引入一或多種可偵測標記或其他產生信號之基團或部分，此視經標記之多肽或奈米抗體的預期用途而定。適合於連接、使用及偵測其之標記及技術為熟習此項技術者所瞭解，且例如包括(但不限於)螢光標記、磷光標記、化學發光標記、生物發光標記、放射性同位素、金屬、金屬螯合物、金屬陽離子、發色團及酶，諸如WO 08/020079之第109頁上所提及者。其他適合之標記為熟習此項技術者所瞭解，且例如包括可使用NMR或ESR光譜學偵測之部分。
本發明之該等經標記之雙互補位奈米抗體及多肽可例如用於活體外、活體內或當場分析(包括本身已知之免疫分析，諸如ELISA、RIA、EIA及其他「夾心分析」等)以及活體內診斷及成像目的，此視特定標記之選擇而定。
如熟習此項技術者所瞭解，另一修飾可包括引入螯合基，例如用於螯合以上所提及之金屬或金屬陽離子中之一者。適合之螯合基例如包括(但不限於)二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸 (EDTA)。
另一修飾可包含引入作為特定結合對(諸如生物素-抗生蛋白(鏈菌素)結合對)之一部分的官能基。該官能基可用於將本發明之雙互補位多肽或奈米抗體連接於結合於結合對之另一半的另一蛋白質、多肽或化合物，亦即經由形成結合對。舉例而言，本發明之雙互補位奈米抗體可與生物素結合，且連接於與抗生蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合之另一蛋白質、多肽、化合物或載體。舉例而言，該結合之雙互補位奈米抗體可用作報導因子，例如在產生可偵測信號之藥劑與抗生蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合的診斷系統中。該等結合對可例如亦用於將本發明之雙互補位奈米抗體結合於載體，包括適合於藥物目的之載體。一個非限制性實例為Cao及Suresh,Journal of Drug Targetting,8,4,257(2000)所述之脂質體調配物。該等結合對亦可用於將治療活性劑連接於本發明之奈米抗體。
對於一些應用，尤其對於希望殺死表現本發明之雙互補位多肽或免疫球蛋白單一可變域所針對之CXCR2標靶的細胞(例如在治療癌症時)或減少或減慢該細胞之生長及/或增殖的應用，本發明之雙互補位多肽亦可連接於毒素或毒性殘基或部分。可連接於本發明之雙互補位多肽以提供例如細胞毒性化合物之毒性部分、化合物或殘基的實例為熟習此項技術者所瞭解且可例如見於以上所引用之先前技術及/或本文其他描述中。一個實例為WO 03/055527中所述之所謂ADEPTTM技術。
其他潛在化學及酶促修飾為熟習此項技術者所瞭解。該等修飾亦可引入用於研究目的(例如研究功能活性關係)。例如參考Lundblad及Bradshaw,Biotechnol.Appl.Biochem.,26,143-151(1997)。
較佳地，衍生物使得其以如本文所定義之對於本發明之雙互補位奈米抗體的親和力(適當地量測及/或以KD值(實際或表觀)、KA值(實際 或表觀)、kon速率及/或koff速率，或者IC50值，如本文進一步所述)表示)結合於CXCR2。
如上文所提及，本發明亦關於基本上由本發明之至少一種雙互補位多肽組成或包含其之蛋白質或多肽。「基本上由...組成」意謂本發明之多肽的胺基酸序列完全與本發明之雙互補位多肽的胺基酸序列相同或對應於如下本發明之多肽的胺基酸序列，其在雙互補位多肽之胺基酸序列的胺基端、羧基端或同時在胺基端與羧基端添加有有限量之胺基酸殘基，諸如1-20個胺基酸殘基、例如1-10個胺基酸殘基及較佳1-6個胺基酸殘基，諸如1、2、3、4、5或6個胺基酸殘基。
該等胺基酸殘基可能或可能不會改變、變更或者影響多肽之(生物學)性質且可能或可能不會向其添加其他功能。舉例而言，該等胺基酸殘基：
- 可包含N端Met殘基，例如由於在異源宿主細胞或宿主生物體中表現。
- 可形成引導雙互補位多肽在合成後自宿主細胞分泌之信號序列或前導序列。適合之分泌性前導肽為熟習此項技術者所瞭解，且可如本文進一步所述。通常，該前導序列將連接於雙互補位多肽之N端；
- 可形成允許雙互補位多肽針對及/或穿透或進入特定器官、組織、細胞、或細胞之部分或區室及/或允許雙互補位多肽穿透或穿過諸如細胞膜、細胞層(諸如上皮細胞層)、腫瘤(包括實體腫瘤)或血腦屏障之生物屏障的序列或信號。該等胺基酸序列之實例為熟習此項技術者所瞭解且包括WO 08/020079之第112頁上的段落c中所提及者。
- 可形成「標記」，例如允許或有助於純化雙互補位奈米抗體(例如使用針對該序列或殘基之親和力技術)之胺基酸序列或殘基。隨後，可移除該序列或殘基(例如藉由化學或酶促裂解)以得到雙互補位多肽序列(出於此目的，該標記可視情況經由可裂解連接子序列連接 於雙互補位多肽序列或含有可裂解基元)。該等殘基之一些較佳、但非限制性實例為多種組胺酸殘基、麩胱甘肽殘基及真菌標記(參見例如WO 06/12282之SEQ ID NO：31)。
- 可為經官能化及/或可充當用於連接官能基之位點的一或多個胺基酸殘基。適合之胺基酸殘基及官能基為熟習此項技術者所瞭解且包括(但不限於)本文對於本發明之雙互補位多肽或奈米抗體的衍生物所提及之胺基酸殘基及官能基。
根據另一態樣，本發明之雙互補位多肽包含本發明之雙互補位奈米抗體，其在其胺基端、羧基端或同時在其胺基端與羧基端與至少一種其他肽或多肽融合，亦即以便提供包含本發明之該雙互補位奈米抗體及一或多種其他肽或多肽的融合蛋白。該融合物亦在本文中稱為「奈米抗體融合物」。
較佳地，其他肽或多肽使得其賦予本發明之雙互補位奈米抗體或多肽一或多種所需性質或功能。
舉例而言，其他肽或多肽亦可提供另一結合位點，該結合位點可針對任何所需蛋白質、多肽、抗原、抗原決定子或抗原決定基(包括(但不限於)本發明之雙互補位多肽所針對的相同蛋白質、多肽、抗原、抗原決定子或抗原決定基，或不同蛋白質、多肽、抗原、抗原決定子或抗原決定基)。
該等肽或多肽之實例為熟習此項技術者所瞭解，且一般可包含用於基於習知抗體及其片段(包括(但不限於)ScFv及單域抗體)之肽融合物中之所有胺基酸序列。例如參考Holliger及Hudson,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136(2005)之評述。
舉例而言，該肽或多肽可為如下胺基酸序列：與本發明之多肽本身相比，延長半衰期、增加溶解度或吸收，降低免疫原性或毒性，消除或削弱不當副作用，及/或賦予本發明之多肽的其他有利性質及/或 減少其非所需性質。該等肽及多肽之一些非限制性實例為血清蛋白(諸如人類血清白蛋白)(參見例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如由循環抗體識別之半抗原，參見例如WO 98/22141)。
詳言之，此項技術已描述，將免疫球蛋白片段(諸如VH域)連接於血清白蛋白或其片段可用於延長半衰期。參考WO 00/27435及WO 01/077137。根據本發明，本發明之雙互補位多肽，較佳雙互補位奈米抗體較佳直接連接於血清白蛋白(或其適合之片段)或經由適合之連接子連接，及尤其經由適合之連接肽連接以使得本發明之多肽可表現為基因融合物(蛋白質)。根據一個特定態樣，本發明之雙互補位奈米抗體可連接於血清白蛋白中至少包含血清白蛋白之域III或其部分的片段。例如參考Ablynx N.V之WO 07/112940。
或者，如本文已論述，其他肽或多肽可提供針對血清蛋白(例如人類血清白蛋白或另一血清蛋白，諸如IgG)之另一結合位點或結合單元，以在血清中延長半衰期。該等胺基酸序列例如包括下文所述之奈米抗體，以及WO 91/01743、WO 01/45746及WO 02/076489中所述之小肽及結合蛋白及WO 03/002609及WO 04/003019中所述之dAb。亦參考Harmsen等人，Vaccine,23(41)；4926-42,2005，以及EP 0 368 684，以及Ablynx N.V.之WO 08/028977、WO 08/043821、WO 08/043822及2006年12月5日申請之Ablynx N.V.之名稱為「Peptides capable of binding to serum proteins」的美國臨時申請案(亦參見PCT/EP2007/063348)。
該等肽或多肽可尤其針對血清白蛋白(且更尤其針對人類血清白蛋白)及/或針對IgG(且更尤其針對人類IgG)。舉例而言，該等胺基酸序列可為針對(人類)血清白蛋白之胺基酸序列及可結合於(人類)血清白蛋白上與血清白蛋白結合於FcRn無關之胺基酸殘基的胺基酸序列(參見例如WO 06/0122787)及/或能夠結合於血清白蛋白上不會形成血 清白蛋白之域III之一部分之胺基酸殘基的胺基酸序列(亦參見例如WO 06/0122787)；具有或可提供延長之半衰期的胺基酸序列(參見例如Ablynx N.V.之WO 08/028977)；與來自至少一種哺乳動物物種及尤其至少一種靈長類動物物種(諸如(但不限於)來自獼猴屬之猴(諸如及尤其為食蟹獼猴(食蟹猴)及/或恆河猴(rhesus monkey)(恆河猴(Macaca mulatta)))及狒狒(豚尾狒狒))之血清白蛋白交叉反應且針對人類血清白蛋白的胺基酸序列，亦參考WO 08/028977；可以pH值非依賴性方式結合於血清白蛋白之胺基酸序列(參見例如Ablynx N.V.之名稱為「Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH,compounds comprising the same,and uses thereof」的WO 08/043821)及/或為條件性結合物之胺基酸序列(參見例如Ablynx N.V.之名稱為「Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner」的WO 08/043822)。
根據另一態樣，一或多種其他肽、多肽或蛋白質序列可包含習知4鏈抗體(及尤其人類抗體)及/或重鏈抗體之一或多個部分、片段或域。舉例而言，儘管通常次佳，但本發明之雙互補位奈米抗體可連接於習知(較佳人類)VH或VL域或VH或VL域之天然或合成類似物，亦視情況經由連接子序列(包括(但不限於)其他(單)域抗體，諸如Ward等人所述之dAb)。
雙互補位多肽或奈米抗體亦可視情況經由連接子序列連接於一或多個(較佳人類)CH1、CH2及/或CH3域。舉例而言，連接於適合之CH1域的雙互補位奈米抗體可例如與適合之輕鏈一起用於產生類似於習知Fab片段或F(ab')2片段之抗體片段/結構，但其中習知VH域中之一者或(在F(ab')2片段之情況下)一者或兩者已經本發明之雙互補位奈米抗體置換。此外，兩種雙互補位多肽可連接於CH3域(視情況經由連接子)以得到具有活體內延長之半衰期的構築體。
根據本發明之多肽的一個特定態樣，本發明之一或多種雙互補位多肽或奈米抗體可連接(視情況經由適合之連接子或鉸鏈區)於一或多個恆定域(例如2或3個可用作Fc部分之一部分/形成Fc部分之恆定域)，Fc部分及/或一或多個賦予本發明之多肽一或多種效應功能及/或可賦予結合於一或多個Fc受體之能力的抗體部分、片段或域。舉例而言，出於此目的，且不限於此，一或多種其他肽或多肽可包含抗體之一或多個CH2及/或CH3域，諸如來自重鏈抗體(如本文所述)且更佳來自習知人類4鏈抗體；及/或可形成Fc區(之一部分)，例如來自IgG(例如來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，來自IgE或來自另一人類Ig(諸如IgA、IgD或IgM)。舉例而言，WO 94/04678描述包含駱駝類VHH域或其人類化衍生物之重鏈抗體(亦即奈米抗體)，其中駱駝科(Camelidae)CH2及/或CH3域已經人類CH2及CH3域置換，以得到由各包含奈米抗體及人類CH2及CH3域(但無CH1域)之2個重鏈組成的免疫球蛋白，該免疫球蛋白具有由CH2及CH3域提供之效應功能且該免疫球蛋白可在任何輕鏈不存在下起作用。可適當地連接於本發明之奈米抗體以提供效應功能的其他胺基酸序列為熟習此項技術者所瞭解，且可基於所需效應功能進行選擇。例如參考WO 04/058820、WO 99/42077、WO 02/056910及WO 05/017148，以及Holliger及Hudson(見上)之評述。本發明之多肽(例如奈米抗體)與Fc部分之偶合亦可導致與本發明之相應多肽相比半衰期延長。對於一些應用，使用賦予延長之半衰期而無任何生物學顯著效應功能之Fc部分及/或恆定域(亦即CH2及/或CH3域)亦可為適合或甚至較佳的。包含一或多種雙互補位多肽(諸如奈米抗體)及一或多個恆定域且具有活體內延長之半衰期的其他適合構築體為熟習此項技術者所瞭解，且可例如包含視情況經由連接子序列連接於CH3域之兩種奈米抗體。一般，具有延長之半衰期的任何融合蛋白或衍生物較佳將具有大於50kD之分子量，其為用於腎吸收之截斷值。
在另一個特定、但非限制性態樣中，為了形成本發明之多肽，本發明之一或多種胺基酸序列可連接(視情況經由適合之連接子或鉸鏈區)於自締合為二聚體之趨勢減小(或基本上無)(亦即與天然存在於習知4鏈抗體中之恆定域相比)之天然存在、合成或半合成恆定域(或類似物、變異體、突變體、部分或其片段)。該等單體(亦即不會自締合)Fc鏈變異體或其片段為熟習此項技術者所瞭解。舉例而言，Helm等人，J Biol Chem 1996 271 7494描述可用於本發明之多肽鏈中的單體Fcε鏈變異體。
此外，該等單體Fc鏈變異體較佳使得其仍能夠結合於補體或相關Fc受體(視得到其之Fc部分而定)，及/或使得其仍具有得到其之Fc部分的一些或所有效應功能(或在降低之程度上仍適合於預期用途)。或者，在本發明之該多肽鏈中，單體Fc鏈可用於賦予多肽鏈延長之半衰期，在該情況下單體Fc鏈亦可無或基本上無效應功能。
其他肽或多肽亦可形成引導本發明之雙互補位奈米抗體或多肽在合成後自宿主細胞分泌(例如得到本發明之多肽的前、原或前原形式，此視用於表現本發明之多肽的宿主細胞而定)之信號序列或前導序列。
其他肽或多肽亦可形成如下序列或信號：允許本發明之雙互補位奈米抗體或多肽針對及/或穿透或進入特定器官、組織、細胞、或細胞之部分或區室，允許本發明之雙互補位奈米抗體或多肽穿透或穿過生物屏障，諸如細胞膜、細胞層(諸如上皮細胞層)、腫瘤(包括實體腫瘤)或血腦屏障。該等胺基酸序列之適合實例為熟習此項技術者所瞭解，且例如包括(但不限於)WO 08/020079之第118頁上所提及者。對於一些應用，尤其對於希望殺死表現本發明之雙互補位多肽所針對之標靶的細胞(例如在治療癌症時)或減少或減慢該細胞之生長及/或增殖的應用，本發明之雙互補位多肽亦可連接於(細胞)毒性蛋白質或多 肽。可連接於本發明之奈米抗體以得到例如本發明之細胞毒性多肽的該等毒性蛋白質及多肽之實例為熟習此項技術者所瞭解且可例如見於以上所引用之先前技術中及/或本文其他描述中。一個實例為WO 03/055527中所述之所謂ADEPTTM技術。
根據一個視情況存在、但非限制性態樣，該一或多種其他肽或多肽包含至少一種其他奈米抗體，以得到包含至少三種，諸如四種、五種或五種以上奈米抗體之本發明之多肽，其中該等奈米抗體可視情況經由一或多個連接子序列(如本文所定義)連接。
最後，本發明之雙互補位多肽可含有兩種或兩種以上奈米抗體及一或多種其他肽或多肽(如本文所提及)亦在本發明之範疇內。
關於含有兩個或兩個以上VHH域之多價及多特異性多肽及其製備，亦參考Conrath等人，J.Biol.Chem.，第276卷，10.7346-7350,2001；Muyldermans,Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001),277-302；以及例如WO 96/34103及WO 99/23221。本發明之一些特定多特異性及/或多價多肽的一些其他實例可見於本文所提及之Ablynx N.V.之申請案中。
本發明之多特異性多肽的一個較佳實例包含至少一種本發明之雙互補位奈米抗體及至少一種提供延長之半衰期的奈米抗體。該等奈米抗體可例如為針對血清蛋白及尤其人類血清蛋白(諸如人類血清白蛋白)、甲狀腺素-結合蛋白、(人類)轉鐵蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白(諸如IgG、IgE或IgM)或針對WO 04/003019中所列之血清蛋白中之一者的奈米抗體。在此等奈米抗體中，可結合於血清白蛋白(及尤其人類血清白蛋白)或IgG(及尤其人類IgG，參見例如Muyldermans(見上)之評述中所述之奈米抗體VH-1)之奈米抗體尤為較佳(但例如對於利用小鼠或靈長類動物之實驗，可分別使用針對小鼠血清白蛋白(MSA)或來自該靈長類動物之血清白蛋白或與其交叉反應之奈米抗體。然而， 對於藥物用途，針對人類血清白蛋白或人類IgG之奈米抗體通常將為較佳。提供延長之半衰期且可用於本發明之多肽中的奈米抗體包括WO 04/041865、WO 06/122787及Ablynx N.V.之其他專利申請案(諸如上文所提及者)中所述之針對血清白蛋白的奈米抗體。
舉例而言，提供延長之半衰期以用於本發明中之一些較佳奈米抗體包括可結合於(人類)血清白蛋白上與血清白蛋白結合於FcRn無關之胺基酸殘基的奈米抗體(參見例如WO 06/0122787)；能夠結合於血清白蛋白上不會形成血清白蛋白之域III之一部分之胺基酸殘基的奈米抗體(參見例如WO 06/0122787)；具有或可提供延長之半衰期的奈米抗體(參見例如本文所提及之Ablynx N.V之WO 08/028977)；與來自至少一種哺乳動物物種及尤其至少一種靈長類動物物種(諸如(但不限於)來自獼猴屬之猴(諸如及尤其為食蟹獼猴(食蟹猴)及/或恆河猴(rhesus monkey)(恆河猴(Macaca mulatta)))及狒狒(豚尾狒狒))之血清白蛋白交叉反應且針對人類血清白蛋白之奈米抗體(參見例如Ablynx N.V之WO 08/028977)；可以pH值非依賴性方式結合於血清白蛋白奈米抗體(參見例如本文所提及之Ablynx N.V.之WO 2008/043821)及/或為條件性結合物之奈米抗體(參見例如Ablynx N.V.之WO 08/043822)。
提供延長之半衰期且可用於本發明之多肽中的一些尤其較佳奈米抗體包括WO 06/122787中所揭示之奈米抗體ALB-1至ALB-10(參見表II及III)，其中ALB-8(WO 06/122787中之SEQ ID NO：62)尤為較佳。
根據本發明之一特定態樣，除該兩種或兩種以上奈米抗體外，本發明之多肽含有至少一種針對人類血清白蛋白之奈米抗體。
此外，可添加至本發明之雙互補位多肽中或連接於其或與其融合的其他肽或多肽包括由脯胺酸、丙胺酸及絲胺酸(PAS序列)構成之聚合物。PAS序列可包含200-600個殘基且使得流體動力學體積顯著增加，從而導致血漿半衰期延長。本發明之雙互補位多肽的血清半衰期 亦可藉由如Schellenbrger等人，(2009),Nature Biotechnology 27，第12期，第1186-1190頁中所述，與稱為XTEN之864個胺基酸之多肽融合來得到延長。
一般而言，具有延長之半衰期且含有本發明之一或多種雙互補位奈米抗體的本發明之任何多肽，及本發明之雙互補位奈米抗體之任何衍生物或具有延長之半衰期的該等多肽之任何衍生物的半衰期較佳為本發明之相應奈米抗體本身的至少1.5倍，較佳至少2倍，諸如至少5倍、例如至少10倍或大於20倍。舉例而言，與本發明之相應奈米抗體本身相比，具有延長之半衰期的該衍生物或多肽的半衰期可延長大於1小時，較佳大於2小時，更佳大於6小時，諸如大於12小時、或甚至大於24、48或72小時。
在本發明之一較佳、但非限制性態樣中，該等衍生物或多肽在人體內可展現至少約12小時，較佳至少24小時，更佳至少48小時，甚至更佳至少72小時或更久之血清半衰期。舉例而言，該等衍生物或多肽之半衰期可為至少5天(諸如約5至10天)，較佳至少9天(諸如約9至14天)，更佳至少約10天(諸如約10至15天)或至少約11天(諸如約11至16天)，更佳至少約12天(諸如約12至18天或更久)或大於14天(諸如約14至19天)。
本發明之多特異性多肽的另一較佳、但非限制性實例包含至少一種本發明之雙互補位奈米抗體及至少一種如下奈米抗體：該奈米抗體將本發明之多肽導向及/或允許本發明之多肽穿透或進入特定器官、組織、細胞、或細胞之部分或區室，及/或允許奈米抗體穿透或穿過諸如細胞膜、細胞層(諸如上皮細胞層)、腫瘤(包括實體腫瘤)或血腦屏障之生物屏障。該等奈米抗體之實例包括針對所需器官、組織或細胞之特異性細胞表面蛋白質、標記物或抗原決定基(例如與腫瘤細胞相關之細胞表面標記物)的奈米抗體，及WO 02/057445及WO 06/040153中所述之靶向腦之單域抗體片段，其中FC44(WO 06/040153之SEQ ID NO：189)及FC5(WO 06/040154之SEQ ID NO：190)為較佳實例。
在本發明之多肽中，該兩種或兩種以上奈米抗體及該一或多種多肽可直接彼此連接(如例如WO 99/23221中所述)及/或可經由一或多個適合之間隔子或連接子彼此連接，或其任何組合。
根據本發明之一個態樣，如本文所定義，本發明之多肽呈基本上分離形式。
本發明之胺基酸序列、雙互補位奈米抗體、多肽及核酸可以本身已知之方式製備，如熟習此項技術者自本文其他描述所瞭解。舉例而言，本發明之雙互補位奈米抗體及多肽可以本身已知用於製備抗體及尤其用於製備抗體片段(包括(但不限於)(單)域抗體及ScFv片段)之任何方式製備。一些製備胺基酸序列、奈米抗體、多肽及核酸之較佳、但非限制性方法包括本文所述之方法及技術。
如熟習此項技術者所瞭解，一種尤其適用於製備本發明之雙互補位奈米抗體及/或多肽的方法一般包含以下步驟：i)在適合之宿主細胞或宿主生物體(本文中亦稱為「本發明之宿主」)中或在另一適合之表現系統中表現編碼本發明之該雙互補位奈米抗體或多肽的核酸(本文中亦稱為「本發明之核酸」)，視情況隨後：ii)分離及/或純化由此獲得之本發明之該雙互補位奈米抗體或多肽。
詳言之，該方法可包含以下步驟：i)在使得本發明之該宿主表現及/或產生至少一種本發明之雙互補位奈米抗體及/或多肽的條件下培養及/或維持本發明之宿主，視情況隨後： ii)分離及/或純化由此獲得之本發明之雙互補位奈米抗體或多肽。
在另一態樣中，本發明係關於一種編碼本發明之多肽(或其適合之片段)的核酸分子。該核酸在本文中亦將稱為「本發明之核酸」且可例如呈基因構築體之形式，如本文進一步所述。
在較佳實施例中，本發明提供一種核酸分子，其編碼選自由與表9及32之特定個別奈米抗體有關之SEQ ID No 25至43、90及SEQ ID No 213至219所示之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列。或者，本發明之核酸分子包含編碼SEQ ID No 44至69之多價及雙互補位奈米抗體構築體的核酸分子。此外，本發明之核酸分子包含具有與表18中所鑑別之奈米抗體有關之SEQ ID No 192至211之核酸序列的分子。
本發明之核酸可呈單股或雙股DNA或RNA之形式，且較佳呈雙股DNA之形式。舉例而言，本發明之核苷酸序列可為基因組DNA、cDNA或合成DNA(諸如具有已經特別調整以在預期宿主細胞或宿主生物體中表現的密碼子用法的DNA)。
根據本發明之一個態樣，如本文所定義，本發明之核酸呈基本上分離形式。
本發明之核酸亦可呈載體形式，存在於載體中及/或為載體之一部分，該載體例如為質體、黏質體或YAC，其亦可呈基本上分離形式。
本發明之核酸可根據關於本文所給之本發明多肽的胺基酸序列的資訊以本身已知之方式製備或獲得，及/或可自適合之天然來源分離。為提供類似物，可例如使編碼天然存在之VHH域的核苷酸序列經受定點突變誘發，以提供編碼該類似物之本發明之核酸。此外，如熟習此項技術者所瞭解，為製備本發明之核酸，若干個核苷酸序列(諸如至少一種編碼本發明之多肽的核苷酸序列，及例如編碼一或多個連 接子之核酸)可以適合之方式連接在一起。
用於產生本發明之核酸的技術為熟習此項技術者所瞭解且可例如包括(但不限於)自動DNA合成；定點突變誘發；組合兩個或兩個以上天然存在及/或合成序列(或其兩個或兩個以上部分)，引入導致截短表現產物進行表現之突變；引入一或多個限制性位點(例如形成可容易使用適合之限制酶消化及/或接合的序列盒及/或區域)，及/或藉助於PCR反應，使用一或多個「錯配」引子，使用例如天然存在形式之CXCR2的序列作為模板來引入突變。此等及其他技術為熟習此項技術者所瞭解，且亦參考標準手冊，諸如上文所提及至Sambrook等人及Ausubel等人，以及以下實例。
本發明之核酸亦可呈基因構築體之形式，存在於其中及/或為其之一部分。該等基因構築體一般包含至少一種本發明之核酸，其視情況連接於本身已知之基因構築體的一或多個元件，例如一或多個適合之調控元件(諸如適合之啟動子、增強子、終止子等)及本文所提及之基因構築體的其他元件。包含至少一種本發明之核酸的該等基因構築體在本文中亦將稱為「本發明之基因構築體」。
本發明之基因構築體可為DNA或RNA，且較佳為雙股DNA。本發明之基因構築體亦可呈適合於轉型預期宿主細胞或宿主生物體之形式，呈適合於整合於預期宿主細胞之基因組DNA中的形式，或呈適合於在預期宿主生物體中非依賴性複製、維持及/或遺傳之形式。舉例而言，本發明之基因構築體可呈載體形式，例如質體、黏質體、YAC、病毒載體或轉座子。詳言之，該載體可為表現載體，亦即可提供活體外及/或活體內(例如在適合之宿主細胞、宿主生物體及/或表現系統中)表現之載體。
在一較佳但非限制性態樣中，本發明之基因構築體包含：i)至少一種本發明之核酸；其可操作地連接於 ii)一或多個調控元件，諸如啟動子及視情況存在之適合終止子；以及視情況存在之iii)本身已知之基因構築體的一或多個其他元件；其中術語「可操作地連接(operably connected)」及「可操作地連接(operably linked)」具有WO 08/020079之第131-134頁上所給出的含義；且其中「調控元件」、「啟動子」、「終止子」及「其他元件」如WO 08/020079之第131-134頁上所述；且其中基因構築體可進一步如WO 08/020079之第131-134頁上所述。
本發明之核酸及/或本發明之基因構築體可用於使宿主細胞或宿主生物體轉型，亦即用於表現及/或產生本發明之雙互補位奈米抗體或多肽。適合之宿主或宿主細胞為熟習此項技術者所瞭解，且可例如為任何適合之真菌、原核或真核細胞或細胞株或任何適合之真菌、原核或真核生物生物體，例如WO 08/020079之第134及135頁上所述者；以及本身已知用於表現及產生抗體及抗體片段(包括(但不限於)(單)域抗體及ScFv片段)之所有其他宿主或宿主細胞，其為熟習此項技術者所瞭解。亦參考上文所引用之一般背景技術，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人，(1998)，見上；Riechmann及Muyldermans,(1999)，見上；van der Linden,(2000)，見上；Thomassen等人，(2002)，見上；Joosten等人，(2003)，見上；Joosten等人，(2005)，見上；及本文所引用之其他參考文獻。
本發明之雙互補位奈米抗體及多肽亦可引入多細胞生物體之一或多種細胞、組織或器官中並在其中表現，例如用於預防性及/或治療性目的(例如作為基因療法)，如WO 08/020079之第135及136頁上及WO 08/020079中所引用之其他參考文獻中進一步描述。
對於奈米抗體在細胞中之表現，其亦可表現為所謂「內抗體(intrabody)」，如例如WO 94/02610、WO 95/22618及US-A-7004940； WO 03/014960；Cattaneo,A.& Biocca,S.(1997)Intracellular Antibodies：Development and Applications.Landes and Springer-Verlag；及Kontermann,Methods 34,(2004),163-170中所述。
本發明之雙互補位奈米抗體及多肽亦可例如在轉殖基因哺乳動物之乳汁中產生，例如在兔子、母牛、山羊或綿羊之乳汁中(關於用於將轉殖基因引入哺乳動物之一般技術，參見例如US-A-6,741,957、US-A-6,304,489及US-A-6,849,992)，在植物或植物之部分(包括(但不限於)其葉、花、果實、種子、根或塊莖)中(例如在菸草、玉米、大豆或紫花苜蓿中)或在例如蠶(silkworm)家蠶(Bombix mori)之蛹中產生。
此外，本發明之雙互補位奈米抗體及多肽亦可在無細胞表現系統中表現及/或產生，且該等系統之適合實例為熟習此項技術者所瞭解。一些較佳、但非限制性實例包括在小麥胚芽系統中、在兔子網狀紅血球溶解物中或在大腸桿菌Zubay系統中表現。
如上文所提及，使用雙互補位多肽及奈米抗體之優點之一在於基於其之多肽可經由在適合之細菌系統中表現來製備，且適合之細菌表現系統、載體、宿主細胞、調控元件等為熟習此項技術者所瞭解，例如根據以上所引用之參考文獻。然而，應注意本發明在其最廣泛意義上並不限於在細菌系統中表現。
較佳地，在本發明中，使用提供呈適合於藥物用途之形式的本發明之多肽之(活體內或活體外)表現系統(諸如細菌表現系統)，且該等表現系統亦為熟習此項技術者所瞭解。如亦為熟習此項技術者所瞭解，適合於藥物用途的本發明之多肽可使用肽合成技術來製備。
對於以工業規模產生，用於(工業)產生雙互補位奈米抗體或含有奈米抗體之蛋白質治療劑的較佳異源宿主包括大腸桿菌、甲醇酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(S.cerevisiae)之菌株，其適合於大規模表現/產生/醱酵，及尤其適合於大規模藥物(亦即GMP級)表現/產生/醱 酵。該等菌株之適合實例為熟習此項技術者所瞭解。該等菌株及產生/表現系統亦可購自諸如Biovitrum(Uppsala,Sweden)之公司。
或者，哺乳動物細胞株、尤其中國倉鼠卵巢(CHO)細胞可用於大規模表現/產生/醱酵，及尤其用於大規模藥物表現/產生/醱酵。此外，該等表現/產生系統亦可購自上文所提及一些公司。
特定表現系統之選擇將部分視某些轉譯後修飾，更尤其糖基化之要求而定。需要或要求糖基化之含有奈米抗體之重組蛋白質的產生將需要使用具有糖基化所表現之蛋白質之能力的哺乳動物表現宿主。就此而言，熟習此項技術者應瞭解，所獲得之糖基化模式(亦即所連接殘基之種類、數目及位置)將視用於表現之細胞或細胞株而定。較佳地，使用人類細胞或細胞株(亦即產生基本上具有人類糖基化模式之蛋白質)或使用可提供基本上及/或功能上與人類糖基化相同或至少模擬人類糖基化之糖基化模式的另一哺乳動物細胞株。一般，諸如大腸桿菌之原核宿主不具有糖基化蛋白質之能力，且使用諸如酵母之低等真核生物通常導致與人類糖基化不同之糖基化模式。然而，應瞭解所有上述宿主細胞及表現系統可用於本發明，此視待獲得之所需雙互補位奈米抗體或多肽而定。
因此，根據本發明之一個態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽經糖基化。根據本發明之另一非限制性態樣，本發明之胺基酸序列、奈米抗體或多肽未經糖基化。
根據本發明之一個較佳、但非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽在細菌細胞、尤其適合於大規模藥物產生之細菌細胞(諸如上文所提及之菌株細胞)中產生。
根據本發明之另一較佳、但非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽在酵母細胞、尤其適合於大規模藥物產生之酵母細胞(諸如上文所提及之物種細胞)中產生。
根據本發明之另一較佳、但非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽在哺乳動物細胞中、尤其在人類細胞或人類細胞株細胞中及更尤其在適合於大規模藥物產生之人類細胞或人類細胞株細胞(諸如上文所提及之細胞株)中產生。
如WO 08/020079之第138及139頁上進一步描述，當使用在宿主細胞中表現來產生本發明之雙互補位奈米抗體及多肽時，此等多肽在細胞內(例如在細胞溶質、胞間質或包涵體中)產生，接著自宿主細胞分離且視情況進一步純化；或可在細胞外(例如在培養宿主細胞之培養基中)產生，接著自培養基分離且視情況進一步純化。因此，根據本發明之一個非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽為已在細胞內產生且已自宿主細胞及尤其自細菌細胞或自細菌細胞中之包涵體分離的胺基酸序列、奈米抗體或多肽。根據本發明之另一非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽為已在細胞外產生且已自培養宿主細胞之培養基分離的奈米抗體或多肽。
用於此等宿主細胞之一些較佳、但非限制性啟動子包括WO 08/020079之第139及140頁上所述者。
用於此等宿主細胞之一些較佳、但非限制性分泌性序列包括WO 08/020079之第139及140頁上所述者。
適合於使本發明之宿主或宿主細胞轉型的技術為熟習此項技術者所瞭解且可視預期宿主細胞/宿主生物體及待使用之基因構築體而定。亦參考上文所提及之手冊及專利申請案。
轉型後，可進行偵測及選擇已成功地用本發明之核苷酸序列/基因構築體轉型之彼等宿主細胞或宿主生物體的步驟。此可例如為基於本發明之基因構築體中存在之可選擇標記物的選擇步驟或包括偵測本發明之多肽(例如使用特異性抗體)的步驟。
經轉型之宿主細胞(其可呈穩定細胞株之形式)或宿主生物體(其可 呈穩定突變株或菌株之形式)形成本發明之其他態樣。
較佳地，此等宿主細胞或宿主生物體使得其表現或(至少)能夠表現(例如在適合之條件下)本發明之雙互補位奈米抗體或多肽(且在宿主生物體之情況下：在其至少一種細胞、部分、組織或器官中表現)。本發明亦包括本發明之宿主細胞或宿主生物體的其他世代、子代及/或後代，其可例如藉由細胞分裂或藉由有性或無性繁殖來獲得。
為產生/獲得本發明之胺基酸序列的表現，經轉型之宿主細胞或經轉型之宿主生物體一般可在使得表現/產生本發明之(所需)雙互補位奈米抗體或多肽之條件下保持、維持及/或培養。適合之條件為熟習此項技術者所瞭解且通常將視所用宿主細胞/宿主生物體，以及控制本發明之(相關)核苷酸序列表現的調控元件而定。此外，參考上文在關於本發明之基因構築體的段落中所提及之手冊及專利申請案。
一般，適合之條件可包括使用適合之培養基，存在適合之食物來源及/或適合之營養物，使用適合之溫度，及視情況存在適合之誘導因子或化合物(例如當本發明之核苷酸序列受誘導性啟動子之控制時)；其全部均可由熟習此項技術者選擇。此外，在該等條件下，本發明之多肽可以組成性方式、以瞬時方式或僅當適當誘導時表現。
熟習此項技術者亦清楚，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽可(首先)以未成熟形式(如上文所提及)產生，接著可進行轉譯後修飾，此視所用宿主細胞/宿主生物體而定。此外，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽可經糖基化，此亦視所用宿主細胞/宿主生物體而定。
本發明之雙互補位奈米抗體或多肽接著可使用本身已知之蛋白質分離及/或純化技術，自宿主細胞/宿主生物體及/或自培養該宿主細胞或宿主生物體之培養基分離，該等技術諸如(製備型)層析及/或電泳技術、示差沈澱技術、親和力技術(例如使用與本發明之胺基酸序列、奈米抗體或多肽融合的特異性、可裂解胺基酸序列)及/或製備型免疫 技術(亦即使用針對待分離之胺基酸序列的抗體)。
一般，對於藥物用途，本發明之多肽可調配為醫藥製劑或組合物，其包含本發明之至少一種多肽及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及/或佐劑，及視情況存在之一或多種其他醫藥活性多肽及/或化合物。藉助於非限制性實例，該調配物可呈適合於以下投藥途徑之形式：經口投藥，非經腸投藥(諸如藉由靜脈內、肌肉內或皮下注射或靜脈內輸注)，局部投藥，藉由吸入(例如經由霧化器、定劑量吸入器(MDI)或乾粉吸入器(DPI)或經由鼻途徑)、藉由皮膚貼片、藉由植入物、藉由栓劑、、藉由舌下途徑投藥等。該等適合之投藥形式(其可為固體、半固體或液體，視投藥方式而定)以及用於製備其之方法及載劑為熟習此項技術者所瞭解且在本文中進一步描述。
因此，在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其含有本發明之至少一種雙互補位多肽，較佳至少一種雙互補位免疫球蛋白單一可變域及更佳至少一種本發明之雙互補位奈米抗體，及至少一種適合之載劑、稀釋劑或賦形劑(亦即適合於藥物用途)，及視情況存在之一或多種其他活性物質。
一般，本發明之雙互補位多肽可以本身已知之任何適合方式調配及投與，關於此例如參考以上所引用之一般背景技術(及尤其WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867及WO 08/020079)以及標準手冊，諸如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，Mack Publishing Company,USA(1990),Remington,the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams and Wilkins(2005)；或the Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel編),Wiley,Weinheim,2007(參見例如第252-255頁)。
舉例而言，本發明之雙互補位多肽可以本身已知用於習知抗體及 抗體片段(包括ScFv及雙功能抗體)及其他醫藥活性蛋白質之任何方式調配及投與。該等調配物及用於製備其之方法為熟習此項技術者所瞭解，且例如包括適合於非經腸投藥(例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、管腔內、動脈內或鞘內投藥)或用於局部(亦即經皮或皮內)投藥之製劑。
用於非經腸投藥之製劑可例如為適合於輸注或注射之無菌溶液、懸浮液、分散液或乳液。適合於該等製劑之載劑或稀釋劑例如包括(但不限於)WO 08/020079之第143頁上所提及者。通常，水性溶液或懸浮液將為較佳。
本發明之雙互補位多肽包括雙互補位免疫球蛋白單一可變域且奈米抗體亦可使用基因療法傳遞方法來投與。參見例如美國專利第5,399,346號，其以全文引用的方式併入本文中。使用基因療法傳遞方法，用編碼本發明之雙互補位多肽的基因轉染之初級細胞可另外用組織特異性啟動子轉染以靶向特定器官、組織、移植物、腫瘤或細胞且可另外用信號及穩定序列轉染以用於亞細胞定位表現。
因此，本發明之雙互補位多肽、免疫球蛋白單一可變域及奈米抗體與醫藥學上可接受之媒劑(諸如惰性稀釋劑或可吸收之可食用載劑)一起可全身投與，例如經口投與。其可密封於硬殼或軟殼明膠膠囊中，可壓縮為錠劑，或可直接併入患者膳食食物中。對於經口治療投藥，本發明之雙互補位多肽可為與一或多種賦形劑組合且以可攝取錠劑、頰內錠劑、糖衣錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片及其類似物之形式使用。該等組合物及製劑應含有至少0.1%本發明之雙互補位多肽、免疫球蛋白單一可變域或奈米抗體。當然，其在組合物及製劑中之百分數可改變且宜為特定單位劑型之重量的約2%至約60%。該等治療有用組合物中之本發明之雙互補位多肽使得將獲得有效劑量。
錠劑、糖衣錠、丸劑、膠囊及其類似物亦可含有黏合劑、賦形 劑、崩解劑、潤滑劑及甜味劑或芳香劑，例如WO 08/020079之第143-144頁上所提及者。當單位劑型為膠囊時，除以上類型之物質外，其可含有液體載劑，諸如植物油或聚乙二醇。各種其他物質可以包衣形式存在或另外改良固體單位劑型之物理形式。舉例而言，錠劑、丸劑或膠囊可塗有明膠、蠟、蟲膠或糖及其類似物。糖漿或酏劑可含有本發明之雙互補位奈米抗體及多肽、作為甜味劑之蔗糖或果糖、作為防腐劑之對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、染料及調味劑(諸如櫻桃或橙子調味劑)。當然，用於製備任何單位劑型之任何物質應為醫藥學上可接受的且在所用量下實質上無毒。另外，本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變域及多肽可併入持續釋放製劑及裝置中。
用於經口投藥之製劑及調配物亦可具備腸溶衣，其將使得本發明之構築體抵抗胃環境並進入腸道。一般而言，用於經口投藥之製劑及調配物可適當地調配用於傳遞至胃腸道之任何所需部分。另外，適合之栓劑可用於傳遞至胃腸道中。
本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變域及多肽亦可藉由輸注或注射經靜脈內或腹膜內投與，如WO 08/020079之第144及145頁上進一步描述。
對於局部投藥，本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變域及多肽可以純形式施用，亦即當其為液體時施用。然而，一般需要以結合皮膚學上可接受之載劑的組合物或調配物形式將其投與皮膚，該載劑可為固體或液體，如WO 08/020079之第145頁上進一步描述。
一般，本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變域及多肽在液體組合物(諸如洗劑)中之濃度將為0.1-25wt-%，較佳約0.5-10wt-%。在半固體或固體組合物(諸如凝膠或散劑)中之濃度將為約0.1-5 wt-%，較佳約0.5-2.5wt-%。
用於治療所需之本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變域及多肽的量將不僅隨所選特定雙互補位奈米抗體或多肽而變化，並且隨投藥途徑、待治療之病狀性質及患者之年齡及情況而變化，並最終將由主治醫師或臨床醫師酌定。此外，本發明之雙互補位奈米抗體及多肽的劑量視標靶細胞、腫瘤、組織、移植物或器官而變化。
所需劑量宜以單次劑量或分次劑量提供，以適當時間間隔投與，例如每天兩次、三次、四次或四次以上亞劑量。亞劑量自身可進一步例如分成許多個別疏鬆間隔之投藥；諸如自吹入器多次吸入或藉由將複數滴施用於眼中。
投藥方案可包括長期每天治療。「長期」意謂至少兩週且較佳數週、數月或數年之持續時間。在此劑量範圍內之必要調節可由一般技術者僅使用本文教示所給出之常規實驗來判定。參見Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.，第4版),Mack Publishing Co.,Easton,PA。劑量亦可由個別醫師在任何併發症之情況下進行調整。
在其另一態樣中，本發明係關於一種治療涉及CXCR2信號轉導功能異常之疾病或病狀的方法，其藉由投與有效量之本發明之多肽或醫藥組合物及較佳本發明之雙互補位免疫球蛋白單一可變域或奈米抗體或含有其之組合物來進行。如本文所論述，CXCR2信號轉導介導罹患慢性阻塞性肺病(COPD)之患者的肺中之發炎反應，從而破壞肺薄壁組織。白血球(在患有COPD之患者的肺中可見數目增加)之遷移由該等細胞之表面上且結合若干配體(包括IL-8、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、EMA78及GCP-2)的CXCR2介導。肺中之嗜中性白血球數目增加與疾病之嚴重程度有關。此外，Gro-α濃度在COPD患者之誘導痰及支氣管灌洗(BAL)流體中顯著升高。因此，預期CXCR2拮抗作用預防、治療或減輕此疾病之痛苦症狀。
因此，本發明係關於預防或治療COPD或COPD惡化之方法，其包含投與本發明之雙互補位多肽(諸如雙互補位免疫球蛋白單一可變域或奈米抗體)及尤其為其醫藥組合物。本發明亦關於該雙互補位多肽(包括雙互補位奈米抗體)及含有其之組合物用於治療COPD及COPD惡化的用途。
熟練閱讀者將顯而易見，本發明之雙互補位多肽、尤其雙互補位免疫球蛋白單一可變域或奈米抗體及其組合物亦適用於治療涉及CXCR2信號轉導功能異常之其他疾病，例如其他呼吸道病狀，諸如囊腫性纖維化、重度哮喘、哮喘惡化、過敏性哮喘、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、特發性肺纖維化、氣管重塑、阻塞性細支氣管炎症候群或支氣管肺發育異常。
可由本發明之雙互補位多肽(例如雙互補位免疫球蛋白單一可變域或奈米抗體及其醫藥組合物)預防或治療的其他疾病及病狀為動脈粥樣硬化、絲球體腎炎、發炎性腸病(克羅恩氏病)、血管生成及特徵為新血管形成之疾病(包括黃斑變性、糖尿病性視網膜病及糖尿病性神經病)、多發性硬化症、牛皮癬、年齡相關黃斑變性疾病、眼部貝切特氏病、葡萄膜炎、肺動脈高血壓(PAH)(包括特發性PAH、家族性PAH及相關PAH)、慢性發炎性疾病、類風濕性關節炎、骨關節炎、非小細胞癌、結腸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、乳癌、實體腫瘤及轉移、黑色素瘤、肝細胞癌或局部缺血再灌注損傷。
可由本發明之雙互補位多肽(例如雙互補位免疫球蛋白單一可變域或奈米抗體及其醫藥組合物)預防或治療的其他疾病及病狀為鐮狀細胞病之溶血性輸液誘發性血管阻塞危險、局部缺血/再灌注損傷、急性中風/心肌梗塞、閉鎖性頭部損傷、創傷後發炎及胰島素抗性糖尿病。
對於以上方法，本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可 變域及/或多肽及/或包含其之組合物可以任何適合之方式投與，此視待使用之特定醫藥調配物或組合物而定。因此，本發明之雙互補位奈米抗體及/或多肽及/或包含其之組合物可例如經口、腹膜內(例如靜脈內、皮下、肌肉內或經由繞過胃腸道之任何其他投藥途徑))、鼻內、經皮、局部、藉助於栓劑、藉由吸入投與，此亦視待使用之特定醫藥調配物或組合物而定。一般而言，對於COPD，吸入並非較佳途徑。臨床醫師將能夠選擇適合之投藥途徑及待用於該投藥之適合之醫藥調配物或組合物，此視個別患者需求而定。
本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變域及/或多肽及/或包含其之組合物係根據適合於預防及/或治療待預防或治療之疾病或病症的治療方案來投與。臨床醫師一般將能夠確定適合之治療方案，此視諸如以下之因素而定：待預防或治療之疾病或病症，待治療疾病之嚴重程度及/或其症狀之嚴重程度，待使用之本發明之特定雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變域或多肽，待使用之特定投藥途徑及醫藥調配物或組合物，患者之年齡、性別、體重、膳食、一般狀況，及臨床醫師所熟知之類似因素。
一般，對於預防及/或治療本文所提及之疾病及病症、尤其COPD，投藥量將視待使用之本發明之特定雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變域或多肽的效力，所使用之特定投藥途徑及特定醫藥調配物或組合物而定。一般，其投藥量將為每天每公斤體重1公克至0.01微克，較佳每天每公斤體重0.1公克至0.1微克，諸如每天每公斤體重約1、10、100或1000微克，以單次日劑量連續(例如藉由輸注)投與或以白天多次分次劑量投與。臨床醫師一般將能夠確定適合之日劑量，此視本文所提及之因素而定。亦應瞭解，在特定情況下，臨床醫師可選擇偏離此等量，例如根據以上所列舉之因素及其專家判斷。
本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變域及多肽亦可 與一或多種其他醫藥活性化合物或成分組合使用，亦即作為組合治療方案，其可能或可能不產生協同效應。此外，臨床醫師將能夠根據以上所列舉之因素及其專家判斷選擇該等其他化合物或成分，以及適合之組合治療方案。
舉例而言，有可能將本發明之雙互補位多肽(諸如雙互補位奈米抗體)與用於COPD之習知治療組合，諸如短效及長效β-腎上腺素激導性支氣管擴張劑、吸入型抗膽鹼激導性劑(蕈毒鹼拮抗劑)及吸入型皮質類固醇。
如臨床醫師所瞭解，根據本發明所用之治療方案的有效性可以本身已知用於所涉及疾病或病症之任何方式來測定及/或遵循。臨床醫師亦將能夠在適當時及根據不同情況改變或調節特定治療方案，以達成所需治療作用，避免、限制或減少不當副作用，及/或在一方面達成所需治療作用與另一方面避免、限制或減少非所需副作用之間達成適當平衡。
一般，將遵循治療方案直至達成所需治療作用為止及/或只要維持所需治療作用即可。此外，此可由臨床醫師判定。
待治療之個體可為任何溫血動物，但尤其為哺乳動物，且更尤其為人類。如熟習此項技術者所瞭解，待治療之個體將尤其為罹患本文所提及之疾病及病症或處於該等疾病及病症之風險中的人。
本發明現將藉助於以下非限制性較佳態樣、實例及圖來作進一步描述。
本文所提及之所有公開案均以引用的方式併入本文中。
寄存資訊
於2010年6月15日在DSMZ-Deutsche SammlUng von Mikroorganismen and Zallkulturem GmbH,Inhoffenstrasse,7B,D-38124,Braunschweig,Germany by Novartis Pharma AG,Switzerland產 生具有編碼表32中所示之序列最佳化奈米抗體之多肽的插入物的質體DNA的六個寄存物。該等寄存物符合1997年4月28日之國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Proceddure)且具有如下寄存編號：
1.人類及食蟹獼猴CXCR2選殖
pcDNA3.1(+)(Invitrogen，V790-20)經設計用於在各種哺乳動物細胞株中高水準、組成性表現。其含有人類細胞巨大病毒即刻-早期啟動子、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號、用於哺乳動物細胞之新黴素選擇標記物及安比西林(ampicillin)抗性基因以用於在大腸桿菌中選擇。
pVAX1(Invitrogen，V260-20)為經設計用於DNA疫苗之質體載體。其含有人類細胞巨大病毒即刻-早期啟動子、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號及卡那黴素(kanamycin)抗性基因以用於在大腸桿菌中選擇。
2.建立表現人類及食蟹獼猴CXCR2之CHO、CaKi、RBL及HEK293T細胞株
CHO-K1△1-17人類CXCR2(N端3×HA標記)
使用Amaxa電穿孔系統(程序U 23，在溶液T中)用質體pcDNA3.1_3xHA-△1-17-hCXCR2轉染CHO-K1細胞。自轉染後第二天在選擇壓力(1000αg/mL G418)下保持經轉染之細胞池。八天後，使用標記FMAT Blue之人類GRO-α鑑別人類CXCR2陽性群體。根據製造 商之說明書，使用FMAT Blue單功能反應性染料套組(Applied Biosystems,4328408)對人類Gro-α進行FMAT Blue標記(Biosource,PHC1063)。使用FACSaria(BD Biosciences)將單細胞分選於96孔細胞培養盤中。在FACSarray(BD Biosciences)裝置上使用標記FMAT Blue之人類GRO-α測試生長純系之△1-17人類CXCR2表現。選擇具有最高表現之CHO-K1純系(MCF值為9000)。
HEK293T食蟹獼猴CXCR2
使用FuGene HD轉染劑(Roche)用質體pcDNA3.1_cCXCR2轉染HEK293T細胞。轉染後兩天，在FACSarray(BD Biosciences)裝置上使用50nM標記FMAT Blue之GRO-α測試細胞之cCXCR2表現。進一步使用具有良好表現之細胞(MCF值為約12000)。
RBL-2H3食蟹獼猴CXCR2
根據製造商之方案，藉由電穿孔(Amaxa Biosystems)，使在37℃/5%CO2下生長且通常在補充有1×非必需胺基酸、0.15%碳酸氫鈉、1mM丙酮酸鈉及15%胎牛血清(Invitrogen)之MEM伊格爾培養基(Eagle media)(Invitrogen)中繼代培養的大鼠嗜鹼性血球白血病細胞(RBL-2H3)進行核轉染。在37℃/5%CO2下培育經轉染之細胞，且轉染後24小時，藉由添加遺傳黴素(Geneticin)至1mg/mL之最終濃度來起始抗生素選擇。在選擇培養基中使經轉染之細胞生長並繼代培養3-5天，隨後藉由連續稀釋於96孔盤中來進行單細胞分選。約兩週後，擴增活性生長群落且隨後分析cynoCXCR2轉錄物表現。接著進一步擴增陽性純系以供分析。
CHO-Trex(HA)3-huCXCR2及(HA)3huCCR9-CXCR2雜合物
在37℃下在含有2mM L-麩醯胺酸且補充有10%無四環素胎牛血清(FBS)(Biosera)、1%青黴素(Penicillin)/鏈黴素(Streptomycin)及10μg/mL殺稻瘟菌素(Blasticidin)之漢姆氏F12培養基(Ham's F12 medium) 中以單層培養物維持中國倉鼠卵巢T-Rex(T-RexTM-CHO，Invitrogen，#R718-07)。此四環素調節表現(T-RexTM)細胞株穩定表現四環素抑制因子(TetR)。接著使用核轉染程序(細胞株核轉染儀套組T，Amaxa Biosystem，程序U-23)產生表現兩種CXCR2構築體之穩定細胞株。在37℃/5%CO2下培育經轉染之細胞，且在轉染後48小時用300μg/mL博來黴素(Zeocin)處理。在博來黴素存在下培養細胞幾週以允許選擇陽性轉化體，隨後使用Mo-Flo FACS分選儀進行單細胞分選。兩週後，擴增活性生長群落，同時維持於其博來黴素濃度為300μg/mL之正常培養基中。
3.人類Gro-a、食蟹獼猴Gro-a、人類IL-8、人類ENA-78
4.肽
表示人類及食蟹獼猴CXCR2之不同N端及細胞外環(EL)延伸段的肽係自Bachem定購(表5)。在以「環狀」表示之肽中，第一及最後胺基酸經半胱胺酸殘基置換且野生型序列之天然存在的內部半胱胺酸經白胺酸殘基置換。此等肽經由兩側半胱胺酸殘基環化。
5.免疫接種
用表現人類CXCR2之哺乳動物細胞對三隻美洲駝免疫接種七至九次且用表現食蟹獼猴CXCR2之哺乳動物細胞給一隻美洲駝免疫接種六次。在此療程後為投與四次混合於(不)完全傅氏佐劑((in)complete Freund's Adjuvant)中之肽-匙孔螺血氰蛋白(KLH)結合物混合物，該肽表示人類與食蟹獼猴CXCR2之細胞外環2號及3號(參見表5)。用編碼自pVAX1表現之人類全長CXCR2或△1-17 CXCR2的DNA給八隻其他美洲駝免疫接種四至五次，隨後投與一次表現人類全長CXCR2之哺乳動物細胞。用編碼自pVAX1表現之食蟹獼猴CXCR2的DNA給三隻其他美洲駝免疫接種四次，隨後投與一次表現食蟹獼猴CXCR2之哺乳動物細胞。在投與每種抗原後四天及八天取得免疫血液及淋巴結樣品。
6.文庫構建
cDNA樣品由免疫血液及淋巴結樣品之總RNA製劑製成。在單步RT-PCR反應中，使用引子ABL051、ABL052及ABL003，自所有經人 類或食蟹獼猴CXCR2免疫接種之美洲駝的cDNA樣品擴增編碼奈米抗體之核苷酸序列。引子序列展示於表6中。自凝膠分離自樣品中之IgG2及IgG3 cDNA擴增之700bp擴增子且隨後用作使用含有SfiI限制酶位點之ABL050引子及ABL003引子之嵌套式PCR反應中的模板。隨後用SfiI及BstEII(天然存在於VHH基因之FR4中)消化PCR產物且接合於噬菌粒載體pAX50之相應限制性位點中，在大腸桿菌TG-1中電穿孔後獲得文庫。pAX50為來源於pUC119之表現載體，其含有LacZ啟動子、大腸桿菌噬菌體pIII蛋白編碼序列、安比西林或羧苄青黴素(carbenicillin)抗性基因、多選殖位點及gen3前導序列。與Nanobody®編碼序列同框，載體編碼C端c-myc標記及(His)6標記。噬菌粒載體允許產生將個別奈米抗體表現為具有geneIII產物之融合蛋白的噬菌體粒子。
7.選擇
使用呈現CXCR2抗原決定基之肽、膜萃取物及全細胞選擇在噬菌體表面上表現之上述pAX50奈米抗體文庫。
使用肽進行選擇係在捕捉於塗有中性鏈親和素(Pierce，31000)之Maxisorp微量滴定盤(Nunc，430341)上之0-1000nM生物素標記肽(參見表5)上培育噬菌體文庫。或者，在溶液狀態下將噬菌體文庫與10nM生物素標記肽一起培育，隨後將肽-噬菌體複合物捕捉於塗有抗生蛋白鏈菌素之Dynabeads(Invitrogen，112-06D)上。使用補充有1%酪蛋白之PBS進行阻斷。添加由文庫製備之噬菌體且培育1小時(在補充有0.1%酪蛋白及0.1%吐溫(tween)20之PBS中)。(用補充有0.05%吐溫20之PBS)洗去未結合之噬菌體；藉由添加胰蛋白酶(1mg/mL於PBS中)來溶離結合之噬菌體15分鐘。基本上如上文所述進行第二輪選擇。
藉由用由表現人類CXCR2之細胞製備的50μg/mL(總蛋白質)膜萃取物(Perkin Elmer，ES-145-M400UA及6110524400UA)塗佈免疫試管(Nunc，444474)進行使用膜萃取物之選擇。作為陰性對照組，同時塗佈由表現人類FPR1之CHO細胞製備的膜萃取物(Perkin Elmer，6110527400UA)。使用補充有4%Marvel脫脂奶粉之PBS進行阻斷。培育噬菌體2小時(在補充有1%Marvel之PBS中)。用PBS洗去未結合之噬菌體；藉由添加胰蛋白酶(1mg/ml於PBS中)來溶離結合之噬菌體15分鐘。基本上如上文所述進行第二輪選擇。在一些情況下，藉由將噬菌體預吸附於連續試管或塗有對照膜萃取物之孔上來特定地消耗結合於無關細胞背景抗原決定基之噬菌體。接著，在溶液狀態下在對照膜 萃取物存在下在經塗佈之人類CXCR2膜萃取物上進行培育。在其他實驗中，在一或兩輪對肽之選擇後進行一輪對膜萃取物之選擇，或反之亦然。
在另一組實驗中，將1至5百萬表現人類或食蟹獼猴CXCR2之哺乳動物細胞與噬菌體文庫一起在補充有10%FBS及1%Marvel脫脂奶粉之PBS中培育。使用未轉型之細胞株作為陰性對照組。用PBS洗去未結合之噬菌體；藉由添加胰蛋白酶(1mg/ml於PBS中)來溶離結合之噬菌體15分鐘。基本上如上文所述進行第二輪，但細胞株背景與第一輪不同。
在其他實驗中，將噬菌體與膜萃取物或表現CXCR2之哺乳動物細胞一起在溶液狀態下在1μM肽(參見表5)存在下培育，以消耗表現結合於由此等肽表示之區域的奈米抗體之噬菌體。
8.製備周質萃取物
使溶離之噬菌體感染指數生長之TG-1細胞，接著塗於含有羧苄青黴素之LB瓊脂盤上。分析羧苄青黴素抗性純系中插入物之存在且驗證陽性純系之序列。使所關注之純系在補充有羧苄青黴素之TB培養基中生長且藉由添加IPTG來誘導表現。在37℃下使表現持續4小時，隨後將細胞離心。將冷凍隔夜之來自大腸桿菌表現培養物的細胞集結塊溶解於PBS(1/10之原始培養體積)中且在4℃下在輕輕震盪條件下培育1小時。接著，再次離心細胞且儲存含有分泌於周質間隙中之蛋白質的上清液。
9.篩選
在FACS上分析周質提取物(如上文所述)與Gro-α競爭結合於人類CXCR2。在4℃下將2×105個細胞與周質提取物於FACS緩衝液(PBS+10%胎牛血清(Sigma，F7524))中之½稀釋液一起培育30分鐘。接著，添加等體積之含6nM標記FMAT Blue之人類Gro-α的FACS緩衝液且在 4℃下在黑暗中再持續培育30分鐘。接著用FACS緩衝液洗滌細胞三次且最後再懸浮於FACS緩衝液中。用碘化丙啶(Sigma，P4170)將死細胞染色。接著在FACSarray(BD Biosciences)上分析樣品。表7列出周質提取物顯示與Gro-α競爭結合於人類CXCR2之奈米抗體。
在另一設置下，藉由ELISA分析周質提取物與人類1至19肽之結合。用中性鏈親和素塗佈MaxiSorb盤(Nunc，430341)兩小時，隨後阻斷1小時(PBS、1%酪蛋白)。接著將100nM生物素標記人類1至19肽添加至此等盤中1小時(PBS、0.1%酪蛋白、0.05%吐溫20)，隨後與周質提取物之10倍稀釋液一起培育1小時。洗去未結合之周質提取物(補充 有0.05%吐溫20之PBS)且使用小鼠抗-myc(Roche，11667149001)、隨後兔子抗-小鼠-HRP結合物(Dakocytomation，P0260)偵測結合之奈米抗體。表8總結抗-CXCR2奈米抗體相對於無關對照奈米抗體之結合信號的比率。
10.序列
單價奈米抗體之主要表徵
11.單價奈米抗體之構築
用MfeI及BstEII消化藉由對功能噬菌粒純系進行PCR，使用Fwd-EVQL-MfeI及Rev-TVSS-BstEII引子(表1)所獲得之含有DNA片段之奈米抗體，接合於pAX100載體中且轉移至大腸桿菌TG-1勝任細胞中。pAX100為來源於pUC119之表現載體，其含有LacZ啟動子、卡那黴素抗性基因、多選殖位點及OmpA前導序列。與奈米抗體編碼序列同框，載體編碼C端c-myc標記及His6標記。分析卡那黴素抗性純系中插入物之存在且驗證陽性純系之序列。
12.小規模表現
使含有編碼所關注之奈米抗體的表現載體之TG-1細胞在含有TB培養基加上100μg/ml卡那黴素之baffled震盪燒瓶中生長且藉由添加1mM IPTG來誘導表現。在37℃下使表現持續4小時。收集細胞後，製備周質提取物且藉由固定金屬親和層析(HisTrap FF Crude，GE Healthcare)，隨後去鹽(HiPrep 26/10，GE Healthcare)或凝膠過濾層析(Superdex 75 HR16/10，GE Healthcare)在PBS中純化標記His6之奈米抗體。
13.配體競爭分析
在對人類及食蟹獼猴CXCR2之FACS配體競爭分析中針對3nM標記FMAT Blue之Gro-α滴定經純化之單價抗-CXCR2奈米抗體(表10)。 對於人類CXCR2，阻斷效力之範圍介於兩位數nM與次nM之間，而對於食蟹獼猴CXCR2，其範圍介於一位數nM與兩位數nM之間。
14.使用重組細胞株之功能分析
(1)量測促效劑誘導之細胞內鈣釋放(FLIPR)
將表現人類或食蟹獼猴CXCR2受體之RBL細胞接種於96孔盤中且在37℃下培育隔夜。在實驗當天，在37℃下對細胞加載Fluo-4染料，隨後與經純化之單價抗-CXCR2奈米抗體一起培育30分鐘。最後，使用螢光成像培養盤讀取器(FLIPR)添加GRO-α，隨後偵測對應於細胞內鈣釋放之螢光信號。使用表現人類CXCR1之L2071細胞進行選擇性分析。分析方案仍與對於CXCR2所述的相同，但使用IL-8作為促效劑。平均IC50值之總結展示於表11中，另外，所測試之奈米抗體均不顯示在所測試濃度(1μM最大濃度)之CXCR1受體下促效劑誘導之細胞內鈣釋放的任何抑制。
(2)量測促效劑刺激之[ 35 S]GTPγS積累
將經純化之單價抗-CXCR2奈米抗體與GRO-α、GDP、SPA珠粒及由表現人類CXCR2受體之CHO細胞製備之CHO-CXC2膜一起在96孔 盤中培育60分鐘。在此之後添加[35S]GTPγS並再培育60分鐘。最後，離心該等盤，隨後在Topcount上進行讀取。平均IC50值之總結展示於表11中。
15.使用初級嗜中性白血球之功能分析
(1)人類嗜中性白血球全血形狀變化分析(hWBSC)
供體為未經全身藥物治療之健康正常志願者(Novartis Horsham供體組)。以1mL EDTA與9mL血液之比率收集用52mM EDTA(無菌)抗凝之全血。在室溫下收集血液且在使用之前預升溫至37℃。在室溫下將80μL全血與CXCR2奈米抗體預培養10分鐘(每劑反應10點(0.03-1.144×10-7μM))，隨後用趨化細胞素刺激；將10μL rhGROα(2nM，近似EC70濃度)添加至除了無化合物之所有孔中，向其中添加10μL形狀變化分析緩衝液。輕輕地震盪樣品且在37℃下再培育5分鐘。接著將試管置於冰上且添加250μL冰冷之最佳化CellFixTM溶液，輕輕地震盪試管且再培育5分鐘，隨後將1.4mL 1×氯化銨溶解溶液添加至所有 試管中並再在冰上靜置20分鐘。紅血球溶解後，在FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)上分析樣品。藉由前向散射/側向散射(FSC/SSC)設閘，隨後為使用來自第一圖之閘控顆粒球的FSC/FL-2圖來鑑別細胞群體。在FL-2圖上將嗜中性白血球與嗜伊紅血球區分，因為後者具有較高自發螢光。各樣品計數5000個事件。
(2)人類嗜中性白血球趨化性分析
供體為未經全身藥物治療之健康正常志願者(Novartis Horsham供體組)。以1mL EDTA與9mL血液之比率收集用52mM EDTA(無菌)抗凝之全血。使用標準方案分離白血球：將4%葡聚糖添加至20mL抗凝血中，輕輕地混合，接著在冰上培育30分鐘，使得紅血球沈降。接著使含有周邊血液單核細胞(PMN)之上清液在Ficoll-Paque®密度梯度上分層且在18℃下在300×g下離心25分鐘。將富含PMN之部分再懸浮於500μL 1×PBS中且使用低滲休克進行紅血球溶解。將20mL冰冷、無菌、無內毒素蒸餾水添加至離心塊中且使溶解進行30-40秒，隨後添加20mL 2×PBS。輕輕地混合樣品且在18℃下在300×g下離心10分鐘，獲得顆粒球。將顆粒球離心塊再懸浮於500μL 1×PBS中且用50mL×1PBS洗滌兩次。將顆粒球離心塊再懸浮於RPMI 1640(pH 7.4)加上2.5%FBS中，計數並稀釋至2e6/mL之最終濃度。使用具有來自Becton Dickinson之3μm PET膜的transwell盤量測遷移。簡言之，將6nM GROα(EC80-EC100)添加至該盤之底部孔(每孔1000μL)中，隨後將多孔插入物降低至適當位置，接著將已在室溫下與不同濃度之奈米抗體(對於單價為0.13-1000nM或對於雙互補位為0.6pM-30nM)一起預培育30分鐘之PMN添加至該插入物中(每孔500μL)。接著在37℃下培育盤90分鐘，使用FACSCalibur流式細胞儀對已遷移至底部腔室中之細胞進行計數。流式細胞儀設定為在FSC/FL-2圖上對R2閘中之事件數目進行計數，各樣品持續20秒之設定時間。
(3)獼猴嗜中性白血球至血形狀變化分析(CynoWBSC)
以1mL檸檬酸鈉與9mL血液之比率用3.8%檸檬酸鈉(無菌)抗凝取自前臂或腿部之靜脈血液。在室溫下收集血液且在使用之前預升溫至37℃。在室溫下將80μL全血與CXCR2奈米抗體預培養10分鐘(每劑反應10點(0.03-1.144×10-7μM))，隨後用趨化細胞素刺激；將10μL rhGROα(30nM，近似EC70-90濃度)添加至除了無化合物之所有孔中，向其中添加10μL形狀變化分析緩衝液。輕輕地震盪樣品且在37℃下再培育5分鐘。接著將試管置於冰上且添加250μL冰冷之最佳化CellFixTM溶液，輕輕地震盪試管且再培育5分鐘，隨後將2mL溶解緩衝液(Sigma Aldrich #R7757)添加至所有試管中且再在冰上靜置40-60分鐘。紅血球溶解後，在FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)上分析樣品。藉由前向散射/側向散射(FSC/SSC)設閘，隨後使用來自第一圖之閘控顆粒球的FSC/FL-2圖來鑑別細胞群體。在FL-2圖上將嗜中性白血球與嗜伊紅血球區分，因為後者具有較高自發螢光。各樣品計數5000個事件。
多價奈米抗體
16.二價奈米抗體之構築
使用兩種方法構築二價奈米抗體。
對編碼單價構建嵌段之質體DNA進行PCR擴增。使用Fwd-EVQL-MfeI及編碼GlySer連接子之一部分的反向引子擴增N端構建嵌段，然而使用編碼GlySer連接子之其餘部分的正向引子及Rev-TVSS-BstEII擴增C端構建嵌段(表6)。用MfeI及BamHI消化N端片段，用BamHI及BstII消化C端片段；接著將此等片段同時接合於pAX100載體中且轉移至大腸桿菌TG-1勝任細胞中。
或者，對編碼單價構建嵌段之質體DNA進行不同PCR擴增。使用Fwd-EVQL-MfeI及Rev-TVSS-BspEI擴增N端構建嵌段，然而使用Fwd-EVQL-BamHI及Rev-TVSS-BstEII擴增C端構建嵌段(表6)。用MfeI及BamHI消化N端片段，用BspEI及BstII消化C端片段。將N端片段接合(MfeI-BspEI)於含有關於GlySer連接子之編碼資訊的pAX100衍生物中，且轉移至大腸桿菌TG-1勝任細胞中。製備來自此轉型混合物之質體DNA且用BspEI及BstEII消化，接著將C端片段接合於pAX100載體中且轉移至大腸桿菌TG-1勝任細胞中。
分析卡那黴素抗性純系中插入物之存在且驗證陽性純系之序列。
17.多價抗-CXCR2奈米抗體之序列
18.配體競爭分析
在對人類及食蟹獼猴CXCR2之FACS配體競爭分析中針對3nM標記FMAT Blue之Gro-α滴定多價抗-CXCR2奈米抗體(表14)。對於人類CXCR2，阻斷效力之範圍介於兩位數nM與次nM之間，而對於食蟹獼猴CXCR2，其範圍介於一位數nM與兩位數nM之間。
19.使用重組細胞株之功能分析
(1)量測促效劑誘導之細胞內鈣釋放(FLIPR)
將表現人類或食蟹獼猴CXCR2受體之RBL細胞接種於96孔盤中且在37℃下培育隔夜。在實驗當天，在37℃下對細胞加載Fluo-4染料，隨後與經純化之多價抗-CXCR2奈米抗體一起培育30分鐘。最後，使用螢光成像培養盤讀取器(FLIPR)添加GRO-α，隨後偵測對應於細胞內鈣釋放之螢光信號。使用表現人類CXCR1之L2071細胞以IL-8作為促效劑及內源性表現人類CXCR4之CEM細胞以SDF-1作為促效劑進行選擇性分析，但分析方案仍與對於CXCR2所述的相同。平均IC50值之總結展示於表15中，另外，所測試之奈米抗體均不顯示在所測試濃度(1μM最大濃度)之CXCR1或CXCR4下促效劑誘導之細胞內鈣釋放的任何抑制。
(2)量測促效劑刺激之[ 35 S]GTPγS積累
將經純化之多價抗-CXCR2奈米抗體與促效劑(GRO-α、IL-8或ENA-78)、GDP、SPA珠粒及由表現人類CXCR2受體之CHO細胞製備之CHO-CXC2膜一起在96孔盤中培育60分鐘。在此之後添加並再培育60分鐘。最後，離心該等盤，隨後在Topcount上進行讀取。平均IC50值之總結展示於表15中。
表15-在使用重組細胞株量測細胞內鈣釋放之功能分析中經純化
表16-在[ 35 S]GTPγS在人類CHO-CXCR2細胞膜中積累之功能分
(3)判定抗-CXCR2奈米抗體之作用機制的Schild分析
使用IL-8及GRO-α之[35S]GTPγS積累分析進行Schild分析。此分析形式允許在添加[35S]GTPγS前促效劑與奈米抗體得到平衡，且因此，應避免可導致機制之錯誤解釋的半平衡之任何假像。為此，在遞增濃度之奈米抗體存在下測定此促效劑濃度反應曲線。兩種單價奈米抗體54B12及163E3及所得多價奈米抗體之資料作為實例給出且展示於圖1中。該資料顯示GRO-α之濃度反應曲線，但當使用IL-8時觀察到類似資料。
單價奈米抗體54B12及163E3皆顯示別位作用機制，但對抑制促 效劑之作用不同。54B12及其他1-19結合物之別位機制藉由在低奈米抗體濃度下促效劑濃度反應曲線平行向右位移來例示，其在遞增濃度之奈米抗體存在下並不進一步向右位移(圖1(a))。在最大促效劑反應不減弱之情況下此作用之可飽和性質指示對促效劑親和力之別位作用。相比之下，163E3及其他非1-19結合物之別位機制藉由在較高奈米抗體濃度下促效劑濃度反應曲線之平行向右位移以及最大促效劑反應減輕來例示(圖1(b))。此作用可為可飽和，但在所用濃度下未觀察到此作用，然而，關鍵觀察結果為最大促效劑反應減輕，此指示對促效劑功效之別位作用。最後，多價奈米抗體54B12-163E3組合兩種別位機制以對促效劑濃度反應曲線產生作用，其藉由在低得多的奈米抗體濃度下平行向右位移及最大促效劑反應之明顯減弱來例示(圖1(c))。
別位調節劑之目前定義為其結合於不同於促效劑(正構配體)結合位點之位點且正構配體與別位調節劑同時結合於受體。儘管發明者目前無資料證實此情況且不希望受理論束縛，但不咸信奈米抗體結合位點不同於促效劑結合位點，而是結合位點重疊。儘管Schild分析資料表明此等奈米抗體為CXCR2之別位調節劑，但資料亦無法顯示促效劑與奈米抗體同時結合於受體。
20.功能分析-NSC
與部分15中所述相同之方法
leadpanel-CDR+FR CXCR2 Kabat
21.序列最佳化-CXCR2拮抗劑多肽
熱位移分析(TSA)：將5μl經純化之單價奈米抗體(80mg/ml)與5μl螢光探針Sypro Orange(Invitrogen,Carlsbad,CA，目錄號S6551)混合(最終濃度10×)於10μl緩衝液(100mM磷酸鹽、100mM硼酸鹽、100mM檸檬酸鹽、115mM NaCl，在範圍為3.5至9之不同pH值下進行緩衝)中。接著在LightCycler 480II機器(Roche,Basel,Switzerland)中將樣品以4.4℃/s自37℃加熱至90℃，隨後使其以2.2℃/s冷卻至37℃。熱誘導之展開後，使蛋白質之疏水性斑曝露於Sypro Orange結合物，導致螢光強度增加。螢光強度曲線之一階導數的拐點用作熔融溫度(Tm)之度量。(Ericsson等人2006(Annals of Biochemistry,357：289-298))。
差示掃描熱量測定(DSC)：根據製造商之說明書在Auto-Cap VP-DSC(MicroCal-GE Healthcare)上進行實驗。在30℃至95℃之溫度範圍內在1℃/min之加熱速率下進行奈米抗體(0.25mg/mL)之熔融溫度測定。減去適當基線後獲得最終熱分析圖。軟體驅動(Origin 7.0)峰值偵測得到相應熔融溫度。
強制氧化：在室溫下且在黑暗中使奈米抗體樣品(1mg/mL)接觸含10mM H2O2之PBS四小時，同時使用無H2O2之對照樣品作平行實驗，隨後使用Zeba去鹽旋轉管柱(0.5mL)(Thermo Scientific)將緩衝液換為PBS。接著在70℃下藉助於RPC，在1200系列機器(Agilent Technologies)上，在Zorbax 300SB-C3管柱(Agilent Technologies)上分析受力樣品及對照樣品。藉由與主要蛋白質峰值相比測定由於氧化應力所產生之預峰的峰面積%來定量奈米抗體之氧化。
2B2序列最佳化
將親本2B2之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5生殖系比對(表20)。相對於人類生殖系序列之胺基酸差異由字母表示，一致胺基酸由點表示。選擇加下劃線之胺基酸差異轉化為人類對應物，而使其 他不受影響。
由2B2、CXCR20059及CXCR20063產生經純化之單價物質，接著在對人類CXCR2與食蟹獼猴CXCR2之FACS配體競爭分析及促效劑誘導之細胞內鈣釋放(FLIPR)分析中進行表徵。另外，在熱位移分析(TSA)中或藉助於差示掃描熱量測定(DSC)測定變異體之熔融溫度(表21)。CXCR20059及CXCR20063中之M93L突變消除親本2B2對強制氧化之敏感性。
97A9序列最佳化
將親本97A9之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5生殖系比對(表22)。相對於人類生殖系序列之胺基酸差異由字母表示，一致胺基酸由點表示。選擇加下劃線之胺基酸差異轉化為人類對應物，而使其他不受影響。
由97A9及CXCR20061產生經純化之單價物質，接著在對人類 CXCR2與食蟹獼猴CXCR2之FACS配體競爭分析及促效劑誘導之細胞內鈣釋放(FLIPR)分析中進行表徵。另外，在熱位移分析(TSA)中測定變異體之熔融溫度(表23)。
163E3序列最佳化
將親本163E3之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5生殖系比對(表24)。相對於人類生殖系序列之胺基酸差異由字母表示，一致胺基酸由點表示。選擇加下劃線之胺基酸差異轉化為人類對應物，而使其他不受影響。
由163E3及CXCR20076產生經純化之單價物質，接著在對人類CXCR2與食蟹獼猴CXCR2之FACS配體競爭分析及促效劑誘導之細胞內鈣釋放(FLIPR)分析中進行表徵。另外，在熱位移分析(TSA)中測定變異體之熔融溫度(表25)。
127D1序列最佳化
將親本127D1之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5生殖系比對(表26)。相對於人類生殖系序列之胺基酸差異由字母表示，一致胺基酸由點表示。選擇加下劃線之胺基酸差異轉化為人類對應物，而使其他不受影響。
由127D1及CXCR20079產生經純化之單價物質，接著在對人類CXCR2與食蟹獼猴CXCR2之FACS配體競爭分析及促效劑誘導之細胞內鈣釋放(FLIPR)分析中進行表徵。另外，在熱位移分析(TSA)中測定變異體之熔融溫度(表27)。CXCR20079中之M57R突變消除親本127D1對強制氧化之敏感性。
163D2序列最佳化
將親本163D2之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5生殖系比對(表28)。相對於人類生殖系序列之胺基酸差異由字母表示，一致胺基酸由點表示。選擇加下劃線之胺基酸差異轉化為人類對應物，而使其他不受影響。
由163D2及CXCR20086產生經純化之單價物質，接著在對人類 CXCR2與食蟹獼猴CXCR2之FACS配體競爭分析及促效劑誘導之細胞內鈣釋放(FLIPR)分析中進行表徵。另外，在熱位移分析(TSA)中測定變異體之熔融溫度(表29)。
54B12序列最佳化
將親本54B12之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5生殖系比對(表30)。相對於人類生殖系序列之胺基酸差異由字母表示，一致胺基酸由點表示。選擇加下劃線之胺基酸差異轉化為人類對應物，而使其他不受影響。
經純化之單價物質由54B12、CXCR20103及CXCR2104產生，接著在對人類CXCR2與食蟹獼猴CXCR2之FACS配體競爭分析及促效劑誘導之細胞內鈣釋放(FLIPR)分析中進行表徵。另外，在熱位移分析(TSA)中測定變異體之熔融溫度(表31)。
表32-序列最佳化變異體之胺基酸序列
22.抗原決定基定位
由Integral Molecular Inc.,3711 Market street,Suite 900,Philadelphia,PA,USA,www.integralmolecular.com使用其鳥槍突變誘發技術(Shotgun Mutagenesis Technology)進行奈米抗體之抗原決定基定位。
鳥槍突變誘發技術概述
鳥槍突變誘發使用專利高產量細胞表現技術，其能夠在真核細胞中表現及分析突變標靶蛋白質之大型文庫。為分析功能之變化，使蛋白質中之每個殘基個別地突變，通常突變為多種其他胺基酸。使蛋白質在標準哺乳動物細胞株中表現，因此即使需要真核生物轉譯或轉譯後加工之困難蛋白質亦可進行定位。
用於抗原決定基定位之命名法如下：RDHBC 792=CXCR20079
RDHBC 793=CXCR20061
RDHBC 792=CXCR20076。
使用如下鳥槍突變誘發以單胺基酸解析度定位抗-CXCR2抗體RD-HBC792(CXCR20079)、RD-HBC793CXCR220061)及RD-HBC794(CXCR20076)之抗原決定基。
親本構築體：將未經標記之親本基因選殖至高表現載體中，定序且藉由免疫偵測法驗證表現。奈米抗體最佳化：藉由分析394孔微量培養盤中之一組奈米抗體稀釋液，以鳥槍突變誘發形式使奈米抗體之偵測最佳化。選擇各奈米抗體之最佳濃度用於篩選突變文庫。完成突變文庫且使各胺基酸位置突變為保守性及非保守性變化，包括每個殘基突變為Ala取代。測試文庫之表面表現且藉由免疫偵測法一式三份篩選奈米抗體結合。針對奈米抗體結合損失分析文庫，鑑別關鍵殘基且進行定位。
親本構築體表現：藉由免疫發光及免疫螢光以384孔形式對瞬時表現之野生型親本構築體進行免疫偵測。對於所有實驗，使用液體處理機器人來進行細胞轉染及免疫染色所涉及之液體處理步驟，以確保精確度及高實驗再現性。
表36.用於測試親本質體之實驗參數。
結論：使用對照MAb及多株血清偵測野生型親本構築體之穩定表面表現及總表現，因此野生型親本構築體可用於鳥槍突變誘發。免疫發光分析顯示高信號：背景及低可變性且將用於定位研究。
使用定位奈米抗體使免疫偵測法最佳化。使用經野生型受體或僅含載體之質體瞬時轉染之細胞以384孔形式進行免疫偵測。被選擇用於進一步定位研究之濃度係基於具有高信號：背景及低可變性之近最大信號。
用於篩選突變文庫之最終分析條件
結論：確定用於3種CXCR2奈米抗體之免疫偵測及抗原決定基定位之最終條件。最佳化條件以鳥槍突變誘發形式導致高信號：背景及低可變性，且因此可用於在高信賴度下進行抗原決定基定位。抗原決 定基定位包含應用本文所確定之相同分析條件，但使用受體變異體之突變文庫。
鑑別奈米抗體抗原決定基之關鍵殘基
抗原決定基資訊之其他分析
藉由鳥槍突變誘發定位所鑑別之關鍵胺基酸定義3種CXCR2 MAb之結合位點。MAb RD HBC792定位於CXCR2之N端區域，且最接近關鍵殘基表明抗原決定基在本質上為線性。MAb RD HBC793及RD HBC794似乎結合主要由CXCR2之ECL1及ECL3形成的構形複雜的抗原決定基。已知形成使細胞外環保持在趨化細胞素受體中適當位置之兩個二硫橋鍵的細胞外Cys殘基的突變亦消除MAb 793及794之結合，因此咸信不直接與抗原決定基相互作用有關。793及794之抗原決定基明顯重疊，但兩者之間的細微差異顯而易見。
實施例
1.一種包含至少兩個免疫球蛋白抗原結合域之多肽，該多肽針對或結合於趨化細胞素受體CXCR2，其中該多肽包括識別CXCR2上之第一抗原決定基的第一抗原結合域及識別CXCR2上之第二抗原決定基的第二抗原結合域。
2.如實施例1之多肽，其中該第一抗原結合域能夠結合於由 SEQ ID No.7所示之胺基酸序列組成之線性肽且該第二抗原結合域不能夠結合於該線性肽或以較低親和力結合於該線性肽。
3.如實施例1或實施例2之多肽，其中該第一抗原結合域包含於抗體之第一免疫球蛋白單一可變域中且該第二抗原結合域包含於抗體之第二免疫球蛋白單一可變域中。
4.如實施例3之多肽，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域中之至少一者包含於抗體VL域或其片段中。
5.如實施例3之多肽，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域中之至少一者包含於抗體VH域或其片段中。
6.如實施例4或5之多肽，其中該第一抗原結合域包含於VL域或其片段中且該第二抗原結合域包含於VH域或其片段中。
7.如實施例4或5之多肽，其中該第一抗原結合域包含於VH域或其片段中且該第二抗原結合域包含於VL域或其片段中。
8.如實施例3至7中任一者之多肽，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域包含於第一及第二域抗體(dAb)中。
9.如實施例3或實施例5之多肽，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域中之至少一者包含於來自可獲自駱駝類之重鏈抗體之單一重鏈的VHH域或其片段中，或為其序列最佳化變異體，包括人類化變異體。
10.如實施例9之多肽，其中該等抗原結合域分別包含於來自來源於駱駝類之重鏈抗體之單一重鏈的VHH域或其片段中，或為其序列最佳化變異體，包括人類化變異體。
11.如實施例9或10之多肽，其中各VHH序列或其片段包括一個、兩個或三個CDR。
12.如實施例9至11中任一者之多肽，其中各VHH序列具有結構：FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR。
13.如前述實施例中任一者之多肽，其中該至少兩個抗原結合域由連接子連接。
14.如實施例3至13中任一者之多肽，其具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--LINKER--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8
其中若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含該第一抗原結合域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含該第二抗原域，且若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含該第二抗原域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含該第一抗原結合域。
15.如實施例1或2之多肽，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域分別包含於重鏈抗體中。
16.如實施例1或2之多肽，其中該第一抗原結合域包含於第一重鏈抗體之單鏈中且該第二抗原結合域包含於第二重鏈抗體之單鏈中，其中該第一重單鏈抗體及該第二重單鏈抗體由連接子連接。
17.如實施例1或2之多肽，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域分別包含於由兩個重鏈及兩個輕鏈組成之抗體中。
18.如實施例1或2之多肽，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域分別包含於各包含兩個重鏈及兩個輕鏈之第一抗體及第二抗體中，其中該第一抗體及該第二抗體由連接子連接。
19.如實施例1或2之多肽，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域分別包含於第一及第二抗體Fab或F(ab)2片段中且其中該第一Fab或F(ab)2片段及該第二Fab或F(ab)2片段由連接子連接。
20.如實施例19之多肽，其中該第一抗原結合域包含於抗體Fab片段中且該第二抗原結合域包含於F(ab)2片段中或反之亦然。
21.如實施例1或2之多肽，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域分別包含於第一及第二抗體單鏈Fv(scFv)或其片段中且其中 該第一scFv及該第二scFv由連接子連接。
22.如實施例13、14、16、18、19、20或21中任一者之多肽，其中該連接子將包含抗原結合域之一個免疫球蛋白之C端連接於包含抗原結合域之第二免疫球蛋白之N端。
23.如實施例13、14、16、18至22中任一者之多肽，其中該連接子為包含非免疫球蛋白來源之胺基酸序列的肽。
24.如實施例23之多肽，其中該肽連接子之長度介於3個與50個胺基酸之間。
25.如實施例24之多肽，其中該連接子中胺基酸之數目係選自3至9個、10至15個、16至20個、21至25個、26至35個、36至40個、41至45個或46至50個。
26.如實施例24之多肽，其中該連接子之長度為35個胺基酸。
27.如實施例24之多肽，其中該連接子僅由兩種不同胺基酸構成。
28.如實施例27之多肽，其中該連接子由胺基酸甘胺酸及絲胺酸構成。
29.如實施例27之多肽，其中該連接子由胺基酸脯胺酸及絲胺酸及視情況存在之丙胺酸構成。
30.如實施例23至26中任一者之多肽，其中該連接子僅由丙胺酸構成。
31.如實施例26之多肽，其中該肽連接子由SEQ ID No 220所示之胺基酸序列組成。
32.如前述實施例中任一者之多肽，其包括來源於駱駝類單一重鏈抗體或駱駝類單一重鏈抗體所特有的CDR胺基酸序列。
33.如實施例9至14中任一者之多肽，其中構架區之胺基酸序列來源於駱駝類單一重鏈抗體或為駱駝類單一重鏈抗體所特有。
34.如實施例9至14中任一者之多肽，其中構架區之胺基酸序列為其序列最佳化變異體，包括人類化變異體。
35.如前述實施例中任一者之多肽，其特異性結合於CXCR2。
36.如前述實施例中任一者之多肽，其針對或結合於人類CXCR2。
37.如前述實施例中任一者之多肽，其包括至少一個針對或特異性結合於血清蛋白之其他抗原結合域。
38.如前述實施例中任一者之多肽，其中該血清蛋白為人類血清白蛋白。
39.一種包含至少兩種多肽之分子，該分子針對或結合於趨化細胞素受體CXCR2，其中第一多肽包含第一免疫球蛋白抗原結合域且第二多肽包含第二免疫球蛋白抗原結合域，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域識別CXCR2上之第一及第二抗原決定基且其中該至少兩種多肽由非肽連接子連接。
40.如實施例38之分子，其中該第一抗原結合域能夠結合於由SEQ ID No.7所示之胺基酸序列組成的線性肽且該第二抗原結合域不能夠結合該線性肽或以低親和力結合於該線性肽。
41.如實施例39或40之分子，其具有如實施例3至22及32至38中任一者中所定義之特點。
42.如實施例3至14或實施例22至39中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包括至少一個包含選自由SEQ ID No 145、165及185組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 145、165或185之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包括至少一個包含選自由SEQ ID No 141、161及181組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 141、161或181之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列的CDR。 (163D2/127D1)
43.如實施例42之多肽，其包含如實施例14之結構，其中在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列，且其中在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 161所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列。
44.如實施例43之多肽，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之該等胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、185、141、161或181中之任一者具有至少80%胺基酸一致性。
45.如實施例43或44之多肽，其中該等胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、185、141、161或181所示者之不同僅為保守性胺基酸變化。
46.如實施例43至45中任一者之多肽，其中單一可變域之每一單體中的構架區包含根據Kabat編號之胺基酸位置11、37、44、46、47、83、84、103、104及108的一或多個標誌殘基。
47.如實施例43至46中任一者之多肽，其中FR1包含SEQ ID No 83所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 104所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 124所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 79所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 100所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 120所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
48.如實施例47之多肽，其經修飾以使得FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列與SEQ ID No 83、104、124、131、79、100或120中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80% 胺基酸一致性。
49.如實施例41至48中任一者之多肽，其包含SEQ ID No 58所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 58之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性的多肽。
50.如實施例42至46中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No.218所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO.218具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列且該第一免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID NO.216所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO.216具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列。
51.如實施例3至14或實施例22至39中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包括至少一個包含選自由SEQ ID No 146、166及186組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 146、166或186之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包括至少一個選自由SEQ ID No 141、161及181或與SEQ ID No 141、161或181之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。(163E3/127D1)
52.如實施例51之多肽，其包含如實施例14之結構，其中在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 166所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列，且其中在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 141所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 161所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 181所示之胺基酸序列。
53.如實施例52之多肽，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之該等胺基酸序列與SEQ ID No 146、166、186、141、161或186中之任一者具有至少80%胺基酸一致性。
54.如實施例52或53之多肽，其中該等胺基酸序列與SEQ ID No 146、166、186、141、161或181所示者之不同僅為保守性胺基酸變化。
55.如實施例52至54中任一者之多肽，其中單一可變域之每一單體中的構架區包含根據Kabat編號之胺基酸位置11、37、45、45、47、83、84、103、104及108的一或多個標誌殘基。
56.如實施例52至55中任一者之多肽，其中FR1包含SEQ ID No 84所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 105所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 125所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 79所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 100所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 120所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
57.如實施例56之多肽，其經修飾以使得FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列與SEQ ID No 84、105、125、131、79、100或120中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性。
58.如實施例51至57中任一者之多肽，其包含SEQ ID No 59所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 59之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性的多肽。
59.如實施例51至58中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 217具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 216所示之胺基酸序列或與SEQ ID No.216具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列。
60.如實施例3至14或實施例22至39中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包括至少一個包含選自由SEQ ID No 146、 166及186組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 146、166或186之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包括至少一個選自由SEQ ID No 151、171及191或與SEQ ID No 151、171或191之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。(163E3/54B12)
61.如實施例60之多肽，其包含如實施例14之結構，其中在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 166所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列，且其中在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列。
62.如實施例61之多肽，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之該等胺基酸序列與SEQ ID No 146、166、186、151、171或191中之任一者具有至少80%胺基酸一致性。
63.如實施例61或62之多肽，其中該等胺基酸序列與SEQ ID No 146、166、186、151、171或191所示者之不同僅為保守性胺基酸變化。
64.如實施例61至63中任一者之多肽，其中單一可變域之每一單體中的構架區包含根據Kabat編號之胺基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104及108的一或多個標誌殘基。
65.如實施例61至64中任一者之多肽，其中FR1包含SEQ ID No 84所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 105所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 125所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 89所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 110所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 130所示 之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
66.如實施例65之多肽，其經修飾以使得FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列與SEQ ID No 84、105、125、131、89、110或130中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性。
67.如實施例60至66中任一者之多肽，其包含SEQ ID No 62所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 62之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性的多肽。
68.如實施例60至64中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO.217具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 219所示之胺基酸序列或與SEQ ID No.219具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列。
69.如實施例3至14或實施例22至39中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包括至少一個包含選自由SEQ ID No 145、165及185組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 145、165或185之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包括至少一個選自由SEQ ID No 151、171及191或與SEQ ID No 151、171或191之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。(163D2/54B12)
70.如實施例69之多肽，其包含如實施例14之結構，其中在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列，且其中在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序 列。
71.如實施例70之多肽，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之該等胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、185、151、171或191中之任一者具有至少80%胺基酸一致性。
72.如實施例70或71之多肽，其中該等胺基酸序列與SEQ ID No 145、165、185、151、171或191所示者之不同僅為保守性胺基酸變化。
73.如實施例70至72中任一者之多肽，其中單一可變域之每一單體中的構架區包含根據Kabat編號之胺基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104及108的一或多個標誌殘基。
74.如實施例70至73中任一者之多肽，其中FR1包含SEQ ID No 83所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 104所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 124所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 89所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 110所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 130所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
75.如實施例74之多肽，其經修飾以使得FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列與SEQ ID No 83、104、124、131、89、110或130中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性。
76.如實施例69至75中任一者之多肽，其包含SEQ ID No 63所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 63之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性的多肽。
77.如實施例69至73中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 218所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 218具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單 一可變域包含SEQ ID No 219所示之胺基酸序列或與任一SEQ ID No 219具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列。
78.如實施例3至14或實施例22至39中任一者之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域包括至少一個包含選自由SEQ ID No 147、167及187組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 147、167或187之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包括至少一個選自由SEQ ID No 146、166及186或與SEQ ID No 146、166或186之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。(2B2/163E3)
79.如實施例78之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第一免疫球蛋白單一可變域CDR1包含SEQ ID No 147所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 167所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 187所示之胺基酸序列，且其中該第二免疫球蛋白單一可變域CDR4包含SEQ ID No 146所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 166所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 186所示之胺基酸序列。
80.如實施例79之多肽，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之該等胺基酸序列與SEQ ID No 147、167、187、146、166或186中之任一者具有至少80%胺基酸一致性。
81.如實施例79或80之多肽，其中該等胺基酸序列與SEQ ID No 147、167、187、146、166或186所示者之不同僅為保守性胺基酸變化。
82.如實施例79至81中任一者之多肽，其中單一可變域之每一單體中的構架區包含根據Kabat編號之胺基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104及108的一或多個標誌殘基。
83.如實施例79至82中任一者之多肽，其中FR1包含SEQ ID No 85所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 106所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 126所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 84所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 105所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 125所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
84.如實施例83之多肽，其經修飾以使得FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列與SEQ ID No 85、106、126、131、84、105或125中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性。
85.如實施例78至84中任一者之多肽，其包含SEQ ID No 64所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 64之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性的多肽。
86.如實施例78至82中任一者之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 213或214所示之胺基酸序列或與任一SEQ ID No 213或214具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 217所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 217具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
87.如實施例3至14或實施例22至39中任一者之多肽，其中該一第免疫球蛋白單一可變域包括至少一個包含選自由SEQ ID No 147、167及187組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 147、167或187之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包括至少一個選自由SEQ ID No 145、165及185或與SEQ ID No 145、165或185之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。(2B2/163D2)
88.如實施例87之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第一免疫球蛋白單一可變域CDR1包含SEQ ID No 147所示之胺基酸序 列，CDR2包含SEQ ID No 167所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 187所示之胺基酸序列，且其中該第二免疫球蛋白單一可變域CDR4包含SEQ ID No 145所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 165所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 185所示之胺基酸序列。
89.如實施例88之多肽，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之該等胺基酸序列與SEQ ID No 147、167、187、145、165或185中之任一者具有至少80%胺基酸一致性。
90.如實施例88或89之多肽，其中該等胺基酸序列與SEQ ID No 147、167、187、145、165或185所示者之不同僅為保守性胺基酸變化。
91.如實施例88至90中任一者之多肽，其中單一可變域之每一單體中的構架區包含根據Kabat編號之胺基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104及108的一或多個標誌殘基。
92.如實施例88至91中任一者之多肽，其中FR1包含SEQ ID No 85所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 106所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 126所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 83所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 104所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 124所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
93.如實施例94之多肽，其經修飾以使得FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列與SEQ ID No 85、106、126、131、83、104或124中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性。
94.如實施例87至93中任一者之多肽，其包含SEQ ID No 65所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 65之胺基酸序列具有至少80%胺基酸 一致性的多肽。
95.如實施例87至91中任一者之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No.213或214所示之胺基酸序列或與任一SEQ ID No.213或214具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No.218所示之胺基酸序列或與SEQ ID No.218具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列。
96.如實施例3至14或實施例22至39中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包括至少一個包含選自由SEQ ID No 143、163及183組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 143、163或183之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包括至少一個選自由SEQ ID No 147、167及187或與SEQ ID No 147、167或187之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。(97A9/2B2)
97.如實施例96之多肽，其包含如實施例14之結構，其中在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 163所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列，且其中在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 147所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 167所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 187所示之胺基酸序列。
98.如實施例97之多肽，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之該等胺基酸序列與SEQ ID No 143、163、183、147、167或187中之任一者具有至少80%胺基酸一致性。
99.如實施例97或98之多肽，其中該等胺基酸序列與SEQ ID No 143、163、183、147、167或187所示者之不同僅為保守性胺基酸變化。
100.如實施例97至99中任一者之多肽，其中單一可變域之每一單體中的構架區包含根據Kabat編號之胺基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104及108的一或多個標誌殘基。
101.如實施例97至100中任一者之多肽，其中FR1包含SEQ ID No 81所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 102所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 122所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 133所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 85所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 106所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 126所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
102.如實施例101之多肽，其經修飾以使得FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列與SEQ ID No 81、102、122、133、85、106、126或131中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性。
103.如實施例96至102中任一者之多肽，其包含SEQ ID No 47所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 47之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性的多肽。
104.如實施例96至100中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 215所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 215具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No.213及214所示之胺基酸序列或與SEQ ID No.213或214具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列。
105.如實施例3至14或實施例22至39中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包括至少一個包含選自由SEQ ID No 143、163及183組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID No 143、163或183之胺基酸序列具有至少80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的CDR，且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包括至少一個選自由SEQ ID No 151、171及191或與SEQ ID No 151、171或191之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列組成之群的CDR。(97A9/54B12)
106.如實施例105之多肽，其包含如實施例14之結構，其中在該第二免疫球蛋白單一可變域中CDR1包含SEQ ID No 143所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No 163所示之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID No 183所示之胺基酸序列，且其中在該第一免疫球蛋白單一可變域中CDR4包含SEQ ID No 151所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No 171所示之胺基酸序列且CDR6包含SEQ ID No 191所示之胺基酸序列。
107.如實施例106之多肽，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之該等胺基酸序列與SEQ ID No 143、163、183、151、171或191中之任一者具有至少80%胺基酸一致性。
108.如實施例106或107之多肽，其中該等胺基酸序列與SEQ ID No 143、163、183、151、171或191所示者之不同僅為保守性胺基酸變化。
109.如實施例106至108中任一者之多肽，其中單一可變域之每一單體中的構架區包含根據Kabat編號之胺基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104及108的一或多個標誌殘基。
110.如實施例106至109中任一者之多肽，其中FR1包含SEQ ID No 81所示之胺基酸序列，FR2包含SEQ ID No 102所示之胺基酸序列，FR3包含SEQ ID No 122所示之胺基酸序列，FR4包含SEQ ID No 133所示之胺基酸序列，FR5包含SEQ ID No 89所示之胺基酸序列，FR6包含SEQ ID No 110所示之胺基酸序列，FR7包含SEQ ID No 130所示之胺基酸序列及/或FR8包含SEQ ID No 131所示之胺基酸序列。
111.如實施例110之多肽，其經修飾以使得FR1、FR2、FR3、FR4、FR5、FR6、FR7及FR8之胺基酸序列與SEQ ID No 81、102、 122、133、89、110、130或131中之任一者所示之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性。
112.如實施例105至111中任一者之多肽，其包含SEQ ID No 61所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 61之胺基酸序列具有至少80%胺基酸一致性的多肽。
113.如實施例105至109中任一者之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 215所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 215具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含SEQ ID No 219所示之胺基酸序列或與SEQ ID No 219具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列。
114.如實施例1至38或42至113中任一者之多肽，其包含序列最佳化構架區，包括部分或完全人類化構架區。
115.如實施例1至38或42至114中任一者之多肽，其與非人類靈長類動物CXCR2交叉反應。
116.如實施例115之多肽，其中該靈長類動物為食蟹獼猴。
117.如實施例1至38或42至116中任一者之多肽，其不與來自非靈長類動物物種之CXCR2交叉反應。
118.如實施例1至38或42至117中任一者之多肽，其不與CXC趨化細胞素家族之其他受體交叉反應。
119.如實施例1至38及114至118中任一者之多肽，其中該第二抗原結合域識別包含選自由SEQ ID No 8、9、10、11及12所示之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列或在該等胺基酸序列中之CXCR2抗原決定基。
120.如實施例119之多肽，其中該第一抗原結合域識別包含SEQ ID No 7所示之胺基酸序列或在該胺基酸序列中之抗原決定基。
121.如實施例119或120之多肽，其中該第一抗原結合域識別包 含SEQ ID No 4所示之胺基酸序列或在該胺基酸序列中之抗原決定基。
122.如實施例119至121中任一者之多肽，其中該第二抗原結合域識別包含SEQ ID No 5或6所示之胺基酸序列或在該等胺基酸序列中之抗原決定基。
123.如實施例1至38或實施例42至122中任一者之多肽，其可以10-5至10-12莫耳/公升或更小且較佳10-7至10-12莫耳/公升或更小且更佳10-8至10-12莫耳/公升之解離常數(KD)特異性結合於人類CXCR2。
124.如實施例1至38或實施例42至123中任一者之多肽，其可以介於102M-1s-1至約107M-1s-1之間，較佳介於103M-1s-1與107M-1s-1之間，更佳介於104M-1s-1與107M-1s-1之間，諸如介於105M-1s-1與107M-1s-1之間的締合速率(kon速率)特異性結合於人類CXCR2。
125.如實施例1至38或實施例42至124中任一者之多肽，其可以介於1s-1與10-6s-1之間，較佳介於10-2s-1與10-6s-1之間，更佳介於10-3s-1與10-6s-1之間，諸如介於10-4s-1與10-6s-1之間的解離速率(koff速率)特異性結合於人類CXCR2。
126.如實施例1至38或實施例42至125中任一者之多肽，其可以小於500nM，較佳小於200nM，更佳小於10nM，諸如小於500pM之親和力特異性結合於人類CXCR2。
127.如實施例1至38或實施例42至126中任一者之多肽，其能夠以小於20nM之IC50抑制Gro-α與人類CXCR2之結合。
128.如實施例1至38或42至127中任一者之多肽，其能夠以小於100nM之IC50抑制Gro-α誘導之自表現人類CXCR2之RBL細胞釋放鈣。
129.如實施例1至38或42至128中任一者之多肽，其能夠以小於50nM之IC50抑制Gro-α誘導之[35S]GTPγS在人類CHO-CXCR2膜中的積 累。
130.如實施例1至38或42至129中任一者之多肽，其中該多肽呈實質上分離形式。
131.如實施例1至38及42至130中任一者之多肽，其為多互補位構築體。
132.如實施例1至38或42至131中任一者之多肽，其經修飾以與相應未經修飾之胺基酸序列相比具有延長之活體內半衰期。
133.如實施例132之多肽，其中該延長之半衰期係由一或多種選自由血清蛋白或其片段、可結合於血清蛋白之結合單元、Fc部分及可結合於血清蛋白之小蛋白質或肽組成之群的結合單元提供。
134.如實施例133之多肽，其中提供該多肽延長之半衰期的該一或多種其他結合單元係選自由人類血清白蛋白或其片段組成之群。
135.如實施例133之多肽，其中提供該多肽延長之半衰期的該一或多種其他結合單元係選自由可結合於血清白蛋白(諸如人類血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(諸如IgG)之結合單元組成之群。
136.如實施例132之多肽，其中該延長之半衰期係由一或多種選自由以下組成之群的其他結合單元提供：域抗體、適合用作域抗體之胺基酸序列、單域抗體、適合用作單域抗體之胺基酸序列、「dAb」、適合用作dAb之胺基酸序列或奈米抗體，該一或多種其他結合單元可結合於血清白蛋白(諸如人類血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(諸如IgG)。
137.如實施例134之多肽，其為可結合於血清白蛋白(諸如人類血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(諸如IgG)之免疫球蛋白單一可變域。
138.如實施例132至137中任一者之多肽，其血清半衰期為相應未經修飾之多肽的半衰期之至少1.5倍，較佳至少2倍，諸如至少5倍、例如至少10倍或大於20倍。
139.如實施例132至138中任一者之多肽，其與該相應未經修飾之多肽相比血清半衰期延長大於1小時，較佳大於2小時，更佳大於6小時，諸如大於12小時、或甚至大於24、48或72小時。
140.如實施例132至139中任一者之多肽，其在人類體內之血清半衰期為至少約12小時，較佳至少24小時，更佳至少48小時，甚至更佳至少72小時或更久；例如至少5天(諸如約5至10天)，較佳至少9天(諸如約9至14天)，更佳至少約10天(諸如約10至15天)或至少約11天(諸如約11至16天)，更佳至少約12天(諸如約12至18天或更久)或大於14天(諸如約14至19天)。
141.如實施例1至38或42至140中任一者之多肽，其經聚乙二醇化。
142.如實施例1至38或42至140中任一者之多肽，其經脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸化。
143.如實施例1至38或42至140中任一者之多肽，其經羥乙基澱粉化。
144.如實施例36或37或實施例42至143中任一者之多肽，其中該另一抗原結合域以小於500nM，較佳小於200nM，更佳小於10nM，諸如小於500nM之親和力結合血清蛋白。
145.一種核酸分子，其編碼如實施例1至38或42至144中任一者之多肽。
146.一種核酸分子，其編碼包含選自由SEQ ID No 25至43、90及213至219所示之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之免疫球蛋白單一可變域。
147.如實施例146之核酸分子，其包含選自由SEQ ID No 192至211所示之核酸序列組成之群的核苷酸序列。
148.一種核酸分子，其編碼包含選自由SEQ ID No 44至69所示 之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之多肽。
149.一種表現載體，其包含如實施例145至148中任一者之核酸分子。
150.一種宿主細胞，其能夠自如實施例1至38或42至149中任一者之核酸序列表現如實施例145至148中任一者之多肽。
151.一種單價、二價、多價、雙互補位或多互補位奈米抗體，其可藉由培養如實施例150之宿主細胞來獲得。
152.一種醫藥組合物，其包含如實施例1至38或42至144中任一者之多肽及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
153.如實施例1至38或42至144中任一者之多肽，其用作藥劑。
154.如實施例1至38或42至144中任一者之多肽，其用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)及COPD惡化。
155.如實施例1至38或42至144中任一者之多肽，其用於治療囊腫性纖維化、哮喘、重度哮喘、哮喘惡化、過敏性哮喘、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、特發性肺纖維化、氣管重塑、阻塞性細支氣管炎症候群或支氣管肺發育不良。
156.如實施例1至38或42至144中任一者之多肽，其用於治療動脈粥樣硬化；絲球體腎炎；發炎性腸病(克羅恩氏病)；血管生成及特徵為新血管形成之疾病，包括黃斑變性、糖尿病性視網膜病及糖尿病性神經病；多發性硬化症；牛皮癬；年齡相關黃斑變性疾病；眼部貝切特氏病；葡萄膜炎；肺動脈高血壓(PAH)，包括特發性PAH、家族性PAH及相關PAH；慢性發炎性疾病；類風濕性關節炎；骨關節炎；非小細胞癌；結腸癌；胰臟癌；食道癌；卵巢癌；乳癌；實體腫瘤及轉移；黑色素瘤；肝細胞癌或局部缺血再灌注損傷。
157.一種治療慢性阻塞性肺病(COPD)或(COPD)惡化之方法，其包含向個體投與有效量之如實施例1至38或42至144中任一者之多肽。
158.一種治療選自由以下組成之群的病狀之方法：囊腫性纖維化、哮喘、重度哮喘、哮喘惡化、過敏性哮喘、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、特發性肺纖維化、氣管重塑、阻塞性細支氣管炎症候群或支氣管肺發育不良，該方法包含向個體投與有效量之如實施例1至37或41至143中任一者之多肽。
159.一種治療選自由以下組成之群的病狀之方法：動脈粥樣硬化；絲球體腎炎；發炎性腸病(克羅恩氏病)；血管生成及特徵為新血管形成之疾病，包括黃斑變性、糖尿病性視網膜病及糖尿病性神經病；多發性硬化症；牛皮癬；年齡相關黃斑變性疾病；眼部貝切特氏病；葡萄膜炎；肺動脈高血壓(PAH)，包括特發性PAH、家族性PAH及相關PAH；慢性發炎性疾病；類風濕性關節炎；骨關節炎；非小細胞癌；結腸癌；胰臟癌；食道癌；卵巢癌；乳癌；實體腫瘤及轉移；黑色素瘤；肝細胞癌及局部缺血再灌注損傷，該方法藉由向個體投與有效量之如實施例1至38或42至144中任一者之多肽來進行。
160.一種如實施例1至38或42至144中任一者之多肽的用途，其用於製造供治療慢性阻塞性肺病(COPD)或COPD惡化之藥劑。
161.一種如實施例1至38或42至144中任一者之多肽的用途，其用於製造供治療哮喘、重度哮喘、哮喘惡化、過敏性哮喘、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、特發性肺纖維化、氣管重塑、阻塞性細支氣管炎症候群或支氣管肺發育不良之藥劑。
162.一種如實施例1至38或42至144中任一者之多肽的用途，其用於製造供治療以下疾病之藥劑：動脈粥樣硬化；絲球體腎炎；發炎性腸病(克羅恩氏病)；血管生成及特徵為新血管形成之疾病，包括黃斑變性、糖尿病性視網膜病及糖尿病性神經病；多發性硬化症；牛皮癬；年齡相關黃斑變性疾病；眼部貝切特氏病；葡萄膜炎；肺動脈高血壓(PAH)，包括特發性PAH、家族性PAH及相關PAH；慢性發炎性 疾病；類風濕性關節炎；骨關節炎；非小細胞癌；結腸癌；胰臟癌；食道癌；卵巢癌；乳癌；實體腫瘤及轉移；黑色素瘤；肝細胞癌或局部缺血再灌注損傷。
163.如實施例1至38中任一者之多肽，其能夠交叉阻斷CXCR2與如實施例49、58、67、76、85、94、103或112中任一者之多肽的結合。
164.如實施例39至41中任一者之分子，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域包含如實施例1至22、32至38或42至144中之任一者中關於該等域所闡述之任一特點。
165.如實施例164之分子，其展現如實施例106至135之任一特點。
166.一種多肽，其包含至少一個針對或結合於CXCR2之免疫球蛋白單一可變域，該多肽能夠交叉阻斷CXCR2與如實施例49、58、67、76、85、94、103或112中任一者之多肽的結合。
167.如實施例3至14及22至39之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23727編碼的CDR胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23726編碼的CDR胺基酸序列。
168.如實施例167之多肽，其進一步包含在該第二免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23727編碼的胺基酸序列之FR區且在該第一免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23726編碼的胺基酸序列之FR區。
169.如實施例168之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域由具有SEQ ID No 220所示之胺基酸序列的肽連接子連接於該第一免疫球蛋白單一可變域。
170.如實施例3至14及22至39之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23725編碼的CDR胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23726編碼的CDR胺基酸序列。
171.如實施例170之多肽，其進一步包含在該第二免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23725編碼的胺基酸序列之FR區且在該第一免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23726編碼的胺基酸序列之FR區。
172.如實施例171之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域由具有SEQ ID No 220所示之胺基酸序列的肽連接子連接於該第一免疫球蛋白單一可變域。
173.如實施例3至14及22至39之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23725編碼的CDR胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23728編碼的CDR胺基酸序列。
174.如實施例173之多肽，其進一步包含在該第二免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23725編碼的胺基酸序列之FR區且在該第一免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23728編碼的胺基酸序列之FR區。
175.如實施例174之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域由具有SEQ ID No 220所示之胺基酸序列的肽連接子連接於該第一免疫球蛋白單一可變域。
176.如實施例3至14及22至39之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存 質體DSM 23727編碼的CDR胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23728編碼的CDR胺基酸序列。
177.如實施例176之多肽，其進一步包含在該第二免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23727編碼的胺基酸序列之FR區且在該第一免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23728編碼的胺基酸序列之FR區。
178.如實施例177之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域由具有SEQ ID No 220所示之胺基酸序列的肽連接子連接於該第一免疫球蛋白單一可變域。
179.如實施例3至14及22至39之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23723編碼的CDR胺基酸序列且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23725編碼的CDR胺基酸序列。
180.如實施例179之多肽，其進一步包含在該第一免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23723編碼的胺基酸序列之FR區且在該第二免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23725編碼的胺基酸序列之FR區。
181.如實施例180之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域由具有SEQ ID No 220所示之胺基酸序列的肽連接子連接於該第一免疫球蛋白單一可變域。
182.如實施例3至14及22至39之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23723編碼的CDR胺基酸序列且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23727編碼的CDR胺基 酸序列。
183.如實施例182之多肽，其進一步包含在該第一免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23723編碼的胺基酸序列之FR區且在該第二免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23727編碼的胺基酸序列之FR區。
184.如實施例183之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域由具有SEQ ID No 220所示之胺基酸序列的肽連接子連接於該第一免疫球蛋白單一可變域。
185.如實施例3至14及22至39之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23724編碼的CDR胺基酸序列且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23723編碼的CDR胺基酸序列。
186.如實施例185之多肽，其進一步包含在該第二免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23724編碼的胺基酸序列之FR區且在該第一免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23723編碼的胺基酸序列之FR區。
187.如實施例186之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域由具有SEQ ID No 220所示之胺基酸序列的肽連接子連接於該第一免疫球蛋白單一可變域。
188.如實施例3至14及22至39之多肽，其包含如實施例14之結構，其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23724編碼的CDR胺基酸序列且其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23728編碼的CDR胺基酸序列。
189.如實施例188之多肽，其進一步包含在該第二免疫球蛋白單 一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23724編碼的胺基酸序列之FR區且在該第一免疫球蛋白單一可變域中之具有根據Kabat編號之由寄存質體DSM 23728編碼的胺基酸序列之FR區。
190.如實施例189之多肽，其中該第二免疫球蛋白單一可變域由具有SEQ ID No 220所示之胺基酸序列的肽連接子連接於該第一免疫球蛋白單一可變域。
<110> 瑞士商諾華公司
<120> 趨化細胞素受體結合多肽
<130> PAT054087
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<212> PRT
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<213> 人工序列
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<223> 編碼單價奈米抗體之核酸
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<223> 編碼單價奈米抗體之核酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 編碼單價奈米抗體之核酸
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<210> 211
<211> 360
<212> DNA
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<220>
<223> 編碼單價奈米抗體之核酸
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<213> 智人
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<212> PRT
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<220>
<223> 序列最佳化之變體之胺基酸序列
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之變體之胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之變體之胺基酸序列
<400> 215
<210> 216
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之變體之胺基酸序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之變體之胺基酸序列
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<212> PRT
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<223> 序列最佳化之變體之胺基酸序列
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<211> 120
<212> PRT
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<220>
<223> 序列最佳化之變體之胺基酸序列
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<210> 220
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子
<400> 220
<210> 221
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之雙互補位多肽之胺基酸序列
<400> 221
<210> 222
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之雙互補位多肽之胺基酸序列
<400> 222
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<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之雙互補位多肽之胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 序列最佳化之雙互補位多肽之胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之雙互補位多肽之胺基酸序列
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<211> 426
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<220>
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<400> 226
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<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之雙互補位多肽之胺基酸序列
<400> 227
<210> 228
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列最佳化之雙互補位多肽之胺基酸序列
<400> 228
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
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<211> 30
<212> PRT
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<220>
<223> FR1
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<210> 231
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
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<211> 30
<212> PRT
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<220>
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<210> 234
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
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<210> 235
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 236
<210> 237
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 238
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
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<210> 242
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 242
<210> 243
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 243
<210> 244
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 244
<210> 245
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR4
<400> 245
<210> 246
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 246
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 247
<210> 248
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 248

Claims (1)

  1. 一種多肽，其能夠交叉阻斷CXCR2與包含至少兩個免疫球蛋白抗原結合域之多肽的結合，該多肽針對或結合於趨化細胞素受體CXCR2，其中該多肽包括：包含於第一免疫球蛋白單一可變域中並識別CXCR2上之第一抗原決定基且能夠結合於由SEQ ID No.7所示之胺基酸序列組成之線性肽的第一抗原結合域；及包含於第二免疫球蛋白單一可變域中並識別CXCR2上之第二抗原決定基且不能夠結合於該線性肽或以較低親和力結合於該線性肽的第二抗原結合域，且其中該多肽包含SEQ ID No.221或222。
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