CN114144194A - 一种包含il13的融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含白介素(13)和调节性细胞因子的融合蛋白，所述调节性细胞因子是例如选自白介素(4)、白介素(10)、白介素(27)、白介素(33)、转化生长因子β(1)、转化生长因子β(2)和白介素13的白介素；涉及编码此类融合蛋白的核酸分子、包含此类核酸分子的载体和包含此类核酸分子或此类载体的宿主细胞。本发明进一步涉及生产此类融合蛋白的方法。所述融合蛋白或编码所述融合蛋白的基因疗法载体可用于预防或治疗以病理性疼痛、慢性疼痛、神经炎症和/或神经变性为特征的病症。
Description
交叉引用
本申请要求荷兰专利申请号2022982和荷兰专利申请号2022984的优先权，其中的每一个均通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明属于神经免疫学和药理学领域，特别是用于治疗慢性疼痛、神经炎症和神经变性疾病以及炎性疾病。本发明特别涉及包含白介素13(IL13)和调节性细胞因子(例如但不限于选自以下的白介素：白介素4(IL4)、白介素10(IL10)、白介素27(IL27)、白介素33(IL33)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)和IL13本身)不物理融合在一起或通过接头序列物理融合在一起的新型融合蛋白。特别地，本发明提供了一种IL4/IL13、IL10/IL13、IL27/IL13、IL33/IL13、TGFβ1/IL13、TGFβ2/IL13或IL13/IL13融合蛋白，其相比于单个细胞因子的组合，或相比于IL4和IL10的融合蛋白具有优异的镇痛、神经保护和抗炎活性。本发明还提供了编码融合蛋白的核酸序列，例如IL4/IL13融合蛋白、IL10/IL13融合蛋白、IL27/IL13融合蛋白、IL33/IL13融合蛋白、TGFβ1/IL13融合蛋白、TGFβ2/IL13融合蛋白或IL13/IL13融合蛋白，包含此类核酸序列的表达载体，被改变以包含编码IL4/IL13融合蛋白、IL10/IL13融合蛋白、IL27/IL13融合蛋白、IL33/IL13融合蛋白、TGFβ1/IL13融合蛋白、TGFβ2/IL13融合蛋白、IL/13/IL13融合蛋白的核酸序列的宿主细胞或宿主生物体，和融合蛋白本身。本发明进一步提供了使用含有此类核酸序列的细胞或生物体产生IL4/IL13、IL10/IL13、IL27/IL13、IL33/IL13、TGFβ1/IL13、TGFβ2/IL13或IL13/IL13融合蛋白的方法。还提供了包含本发明的核酸序列的转基因生物。本发明还涉及包含例如IL4/IL13或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13融合蛋白的药物组合物。最后，本文教导了IL4/IL13或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13融合蛋白作为药物的用途，特别是用于预防和/或治疗慢性疼痛和以神经炎症、神经变性或炎症为特征的病症的用途。
背景技术
慢性疼痛影响数百万人并且构成现代医学中最大的未满足需求1-4。2016年，估计有20.4％的美国成年人(5000万)患有慢性疼痛，8.0％的美国成年人(1960万)患有高影响性慢性疼痛5。阿片类药物和非甾体抗炎药(NSAID)构成了对抗疼痛的主要药物类别。然而，这些镇痛药(“止痛药”)通常无效且具有严重的副作用(成瘾、胃肠道出血、心血管等)。据估计，约50％的慢性疼痛患者(约占总人口的约5％-10％)没有得到足够的疼痛缓解6。
具有慢性疼痛的人患有自发性疼痛、痛觉过敏(对有害刺激的疼痛体验加剧)和异常性疼痛(由正常的非疼痛刺激引起的疼痛)。疼痛有多种原因并且来自不同解剖水平的生物过程7-10：产生触发神经末梢区域中感觉神经末梢的刺激物；将动作电位传递到脊髓的周围感觉神经元的刺激、敏化和功能障碍；脊髓背角中的神经元和神经胶质细胞，其中周围神经元的动作电位通过突触传递到脊髓疼痛神经元；最后是脑的中枢机制。所有这些过程对不同类型慢性疼痛的贡献各不相同。根据这种贡献，疼痛分为几种类型，包括伤害性疼痛、周围和中枢神经性疼痛以及混合型疼痛。临床上使用的镇痛药，只针对一个层面的疼痛：NSAID减少神经末梢区域中伤害性刺激的产生，而阿片类药物抑制中枢机制。再加上它们臭名昭著的毒副作用，这就解释了这些镇痛药的临床疗效有限。
近十年来，越来越清楚的是，疼痛信号并没有直接传递到脑，而是由涉及脊髓神经胶质细胞和感觉神经元的神经炎症过程调节。众所周知，细胞因子可以协调免疫和炎症过程，并且在控制疼痛方面也至关重要。促炎细胞因子增强炎症并促进疼痛，而调节性(例如抗炎)细胞因子抑制炎症。促炎细胞因子和调节细胞因子之间的平衡决定了体内炎症反应的结果11。虽然促炎细胞因子的疼痛促进作用是众所周知的12，但关于调节性细胞因子在疼痛中的作用的知识是有限的13。阻断TGFβ、IL10、IL4和IL13等调节性细胞因子会严重损害暂时性炎性痛觉过敏14和化学疗法诱导的异常性疼痛15的消退，证明内源调节性细胞因子在缓解疼痛中的关键作用。细胞因子的这种作用远远超出了减轻炎症的范畴，并且与仅具有有限镇痛作用的抗炎药如皮质类固醇16,17有根本不同。值得注意的是，不仅神经胶质细胞受细胞因子调节，感觉神经元本身也可以直接对细胞因子作出反应。事实上，感觉神经元表达所有调节性细胞因子的受体，尽管在神经元亚群之间的表达不同18。由周围炎症或神经损伤引起的疼痛与脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞(其通过增强脊髓疼痛信号传递来促进疼痛)的激活有关19-22。
考虑到神经炎症在慢性疼痛中的作用，调节性细胞因子可能会在多个层面上针对疼痛。事实上，它们通过减少炎症来抑制对伤害感受器的刺激，它们抑制感觉神经元的敏化和功能障碍，并且它们通过减弱神经胶质细胞对促炎介质的产生来防止脊髓中疼痛通路的激活21,22。然而，使用独立调节性细胞因子(如IL10或IL13)或抗炎细胞因子(IL1受体拮抗剂)治疗的镇痛效果有限19，可能是因为最佳镇痛活性需要各种调节性细胞因子的协同作用，并且因为由于肾脏的快速清除，它们的生物利用度相对较差。因此，已经提出了使用IL4和IL10的融合蛋白用调节性细胞因子消退慢性疼痛的新策略19,23。鞘内施用镇痛药是疼痛治疗中的常见做法，因为这会降低镇痛药的剂量并降低其毒性24。鞘内注射IL4/IL10融合蛋白针对各种不同类型疼痛减轻小鼠模型中的疼痛19。值得注意的是，IL4/IL10融合蛋白的三次重复鞘内施用导致爪部炎症诱导的疼痛持续缓解(例如，完全和永久消退慢性疼痛，如伤害性疼痛)，而不调节周围炎症本身19。有趣的是，IL4/IL10融合蛋白的功效优于独立的野生型细胞因子，甚至优于这些细胞因子的组合19。
在神经性疼痛19和骨关节炎疼痛模型25中也观察到了IL4/IL10融合蛋白对疼痛的消退。然而，IL4/IL10融合蛋白对神经性疼痛和骨关节炎疼痛的影响可能是短暂的，即使在多次注射后也是如此。因此，需要提供具有长期镇痛作用的用于预防或治疗神经性疼痛和骨关节炎疼痛的分子。
发明内容
本公开提供了靶向神经炎症和神经变性并对慢性神经性疼痛具有持久作用的单一分子。该分子可用于治疗具有不同病因的其中慢性疼痛、神经炎症和/或神经变性起作用的各种疾病或障碍。本公开提供包含直接或间接连接至调节性细胞因子的白介素13(IL13)的融合蛋白。
在一些方面，本文公开了包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于治疗有需要的受试者的神经病变的用途。
在一些方面，本文公开了包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于治疗有需要的受试者的疼痛的用途。
在一些方面，本文公开了包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于治疗有需要的受试者的神经变性或神经炎症的用途。
在一些方面，本文公开了包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于治疗有需要的受试者的炎症的用途。
在一些方面，本文公开了包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于促进有需要的受试者的神经保护的用途。
在一些方面，本文公开了包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于调节神经系统细胞中的信号传导通路的活性的用途。
在一些实施方案中，调节性细胞因子选自白介素4(IL4)、白介素10(IL10)、白介素33(IL33)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)和另外的白介素13(IL13)。在一些实施方案中，调节性细胞因子是IL4。在一些实施方案中，调节性细胞因子是IL10。在一些实施方案中，调节性细胞因子是IL33。在一些实施方案中，调节性细胞因子是白介素27(IL27)。在一些实施方案中，调节性细胞因子是TGFβ1。在一些实施方案中，调节性细胞因子是TGFβ2。在一些实施方案中，调节性细胞因子是另外的IL13。在一些实施方案中，IL13包含野生型IL13。在一些实施方案中，IL13是哺乳动物IL13。在一些实施方案中，IL13是人IL13。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含野生型调节性细胞因子。在一些实施方案中，调节性细胞因子是哺乳动物调节性细胞因子。在一些实施方案中，调节性细胞因子是人调节性细胞因子。在一些实施方案中，白介素27包含白介素27α(IL27A)。在一些实施方案中，IL27A包含相对于SEQ ID NO:36的L134C置换。在一些实施方案中，IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)。在一些实施方案中，IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α2(IL-13Rα2)。在一些实施方案中，IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素4受体α(IL-4Rα)。在一些实施方案中，调节性细胞因子氨基酸序列是以与野生型调节性细胞因子相当的亲和力结合调节性细胞因子受体的所有亚基的衍生序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子氨基酸序列是激活调节性细胞因子的天然受体的衍生序列。在一些实施方案中，IL13包含与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL13包含选自SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL13包含相对于选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含与选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:45的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含相对于选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL13和调节性细胞因子共价连接。在一些实施方案中，IL13和调节性细胞因子通过接头连接。在一些实施方案中，IL13的C末端与细胞因子的N末端连接，任选地通过接头连接。在一些实施方案中，IL13的N末端与细胞因子的C末端连接，任选地通过接头连接。在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，一个或多个化学修饰选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化。在一些实施方案中，蛋白质构建体包含亲和标签。在一些实施方案中，神经病变是创伤后周围神经病变、术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、化学疗法诱导的神经病变、多神经病变、单神经病变、多发性单神经病变、颅神经病变、主要运动神经病变、主要感觉神经病变、感觉运动神经病变、自主神经病变、特发性神经病变、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、舌咽神经痛、枕神经痛、阴部神经痛、非典型性三叉神经痛、坐骨神经痛、臂神经丛病变或肋间神经痛。在一些实施方案中，神经病变与疼痛、麻木、虚弱、灼热、萎缩、刺痛、抽搐或其组合相关。在一些实施方案中，所述疼痛是慢性疼痛。在一些实施方案中，疼痛是病理性疼痛、炎症性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛。在一些实施方案中，疼痛是内脏伤害性疼痛、非内脏伤害性疼痛、周围神经性疼痛、中枢神经性疼痛或其组合。在一些实施方案中，疼痛是矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、化学疗法相关的疼痛、化学疗法诱导的异常性疼痛、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、腰痛、癌症疼痛或慢性内脏痛。在一些实施方案中，疼痛与以下有关：肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后周围神经病变、术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法诱导的神经病变、多发性硬化、化学疗法诱导的神经变性、复杂性局部疼痛综合征、骨关节炎、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多神经病变或肌萎缩侧索硬化。在一些实施方案中，疼痛与以下有关：阿尔珀斯病、蛛网膜炎、关节纤维化、共济失调性脑瘫、自身免疫性萎缩性胃炎、淀粉样变性、hATTR淀粉样变性、缺血性坏死、背痛、贝敦氏症、贝赛特氏病(综合征)、突破性疼痛、口灼伤综合征、滑囊炎、伴有皮质下梗死和脑白质病的中枢性常染色体显性动脉病(Cadasil)、脑缺血、脑-眼-面-骨骼综合征(COFS)、腕管综合征、马尾综合征、中枢性疼痛综合征、脑瘫、脑脊液(CSF)泄漏、宫颈狭窄、腓骨肌萎缩症(CMT)疾病、慢性功能性腹痛(CFAP)、慢性胰腺炎、肺萎陷(气胸)、皮质基底节变性、挤压性损伤、角膜神经性疼痛、挤压综合征、椎间盘退变疾病、皮肌炎、痴呆、肌张力障碍、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、子宫内膜异位症、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征(EMS)、红斑性肢痛症、腰椎手术失败综合征(FBSS)、纤维肌痛、弗里德赖希共济失调症、额颞痴呆、舌咽神经痛、生长痛、椎间盘突出、脑积水、肋间神经痛、间质性膀胱炎、青少年皮炎、膝部损伤、腿痛、路易体痴呆症、腰痛血尿综合征、莱姆病、感觉异常性股痛、线粒体病、混合性痴呆、运动神经元病(MND)、单肢肌萎缩、多系统萎缩(MSA)、肌炎、颈痛、枕神经痛、骨质疏松、横纹肌溶解、佩吉特病、牧师特纳综合征(Parsonage Turner Syndrome)、骨盆痛、周围神经病变、幻肢痛、神经挟捏、足底筋膜炎、风湿性多肌痛、多肌炎、疝修补术后疼痛综合征、乳房切除术后疼痛综合征、中风后疼痛、开胸术后疼痛综合征、脊髓灰质炎后综合征、原发性侧索硬化、银屑病关节炎、阴部神经痛、神经根病、不宁腿综合征、类风湿关节炎(RA)、骶髂关节功能障碍、结节病、舒曼脊柱后凸症(Scheuemann’s Kyphosis Disease)、坐骨神经痛、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA)、带状疱疹、痉挛性斜颈、奥迪氏括约肌功能障碍(Sphincter of Oddi Dysfunction)、脊髓损伤、椎管狭窄、脊髓空洞症、塔洛夫囊肿(Tarlov Cysts)、脊髓栓系综合征、胸廓出口综合征(TOS)、TMJ障碍、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、血管疼痛、外阴痛、颈椎过度屈伸或其组合。在一些实施方案中，神经变性或神经炎症包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、脊髓小脑共济失调或脊髓性肌萎缩。在一些实施方案中，炎症包括慢性炎症。在一些实施方案中，炎症包括局部炎症或全身炎症。在一些实施方案中，炎症与以下有关：炎症肠病、肠易激综合征、骨关节炎、类风湿关节炎、肾小球肾炎、脓毒症、成人呼吸窘迫综合征、皮炎、结节病、过敏性炎症、银屑病、强直性脊椎关节炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、痛风、同种异体移植、异种移植、自身免疫性疾病、斯耶格伦氏病(Sjogren’s disease)、灼伤、创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、缺血再灌注损伤、细胞因子或其他治疗性单克隆抗体的体内施用诱导的毒性。在一些实施方案中，神经纤维退行减少。在一些实施方案中，神经纤维损失减少。在一些实施方案中，神经纤维密度的维持得以促进。在一些实施方案中，神经纤维再生长得以促进。在一些实施方案中，中枢神经系统的神经保护得以促进。在一些实施方案中，周围神经系统的神经保护得以促进。在一些实施方案中，表皮内神经纤维损失减少。在一些实施方案中，神经元功能障碍减少。在一些实施方案中，融合蛋白引发比等量的IL13、调节性细胞因子或其组合更大程度的治疗效果。在一些实施方案中，融合蛋白引发比等量的IL13、调节性细胞因子或其组合更长持续时间的治疗效果。在一些实施方案中，融合蛋白存在于包含融合蛋白和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。在一些实施方案中，药物组合物呈单位剂型。在一些实施方案中，融合蛋白以约50μg/mL至约100mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，融合蛋白被配制用于以约0.5μg/kg体重至约1mg/kg体重之间的剂量施用。在一些实施方案中，融合蛋白被配制用于以控释制剂施用。在一些实施方案中，融合蛋白被配制用于通过以下施用：肠胃外、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内或器官实质内途径。在一些实施方案中，神经系统细胞是神经元。在一些实施方案中，神经系统细胞是中枢神经系统细胞。在一些实施方案中，神经系统细胞是周围神经系统细胞。在一些实施方案中，神经元是感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是躯体感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是内脏感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是伤害感受器。在一些实施方案中，神经元是自主神经元。在一些实施方案中，神经系统细胞是神经胶质细胞。在一些实施方案中，神经系统细胞是小胶质细胞。在一些实施方案中，神经系统细胞是浸润细胞。在一些实施方案中，神经系统细胞是浸润巨噬细胞。在一些实施方案中，信号通路在促炎介质的存在下被调节。
在一些方面，本文公开了一种治疗有需要的受试者的神经病变的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
在一些方面，本文公开了一种治疗有需要的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
在一些方面，本文公开了一种治疗有需要的受试者的神经变性或神经炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
在一些方面，本文公开了一种治疗有需要的受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
在一些方面，本文公开了一种促进有需要的受试者的神经保护的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
在一些方面，本文公开了一种调节神经系统细胞中的信号传导通路活性的方法，所述方法包括使所述神经系统细胞与融合蛋白接触，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节性细胞因子选自白介素4(IL4)、白介素10(IL10)、白介素33(IL33)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)和另外的白介素13(aIL13)。在一些实施方案中，调节性细胞因子是IL4。在一些实施方案中，调节性细胞因子是IL10。在一些实施方案中，调节性细胞因子是IL33。在一些实施方案中，调节性细胞因子是白介素27(IL27)。在一些实施方案中，调节性细胞因子是TGFβ1。在一些实施方案中，调节性细胞因子是TGFβ2。在一些实施方案中，调节性细胞因子是aIL13。在一些实施方案中，IL13包含野生型IL13。在一些实施方案中，IL13是哺乳动物IL13。在一些实施方案中，IL13是人IL13。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含野生型调节性细胞因子。在一些实施方案中，调节性细胞因子是哺乳动物调节性细胞因子。在一些实施方案中，调节性细胞因子是人调节性细胞因子。在一些实施方案中，白介素27包含白介素27α(IL27A)。在一些实施方案中，IL27A包含相对于SEQ ID NO:36的L134C置换。在一些实施方案中，IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)。在一些实施方案中，IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α2(IL-13Rα2)。在一些实施方案中，IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素4受体α(IL-4Rα)。在一些实施方案中，调节性细胞因子氨基酸序列是以与野生型调节性细胞因子相当的亲和力结合调节性细胞因子受体的所有亚基的衍生序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子氨基酸序列是激活调节性细胞因子的天然受体的衍生序列。在一些实施方案中，IL13包含与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL13包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL13包含相对于选自SEQID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含相对于选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL13和调节性细胞因子共价连接。在一些实施方案中，IL13和调节性细胞因子通过接头连接。在一些实施方案中，IL13的C末端与细胞因子的N末端连接，任选地通过接头连接。在一些实施方案中，IL13的N末端与细胞因子的C末端连接，任选地通过接头连接。在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，一个或多个化学修饰选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化。在一些实施方案中，蛋白质构建体包含亲和标签。在一些实施方案中，神经病变是创伤后周围神经病变、术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、化学疗法诱导的神经病变、多神经病变、单神经病变、多发性单神经病变、颅神经病变、主要运动神经病变、主要感觉神经病变、感觉运动神经病变、自主神经病变、特发性神经病变、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、舌咽神经痛、枕神经痛、阴部神经痛、非典型性三叉神经痛、坐骨神经痛、臂神经丛病变或肋间神经痛。在一些实施方案中，神经病变与以下有关：疼痛、麻木、虚弱、灼热、萎缩、刺痛、抽搐或其组合。在一些实施方案中，所述疼痛是慢性疼痛。在一些实施方案中，所述疼痛是神经性疼痛、伤害性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛。在一些实施方案中，疼痛是内脏伤害性疼痛、非内脏伤害性疼痛、周围神经性疼痛、中枢神经性疼痛或其组合。在一些实施方案中，疼痛是矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、化学疗法相关的疼痛、化学疗法诱导的异常性疼痛、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、腰痛、癌症疼痛或慢性内脏痛。在一些实施方案中，疼痛与以下有关：肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后周围神经病变、术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法诱导的神经病变、多发性硬化、化学疗法诱导的神经变性、复杂性局部疼痛综合征、骨关节炎、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多神经病变或肌萎缩侧索硬化。在一些实施方案中，疼痛与以下有关：阿尔珀斯病、蛛网膜炎、关节纤维化、共济失调性脑瘫、自身免疫性萎缩性胃炎、淀粉样变性、hATTR淀粉样变性、缺血性坏死、背痛、贝敦氏症、贝赛特氏病(综合征)、突破性疼痛、口灼伤综合征、滑囊炎、伴有皮质下梗死和脑白质病的中枢性常染色体显性动脉病(Cadasil)、脑缺血、脑-眼-面-骨骼综合征(COFS)、腕管综合征、马尾综合征、中枢性疼痛综合征、脑瘫、脑脊液(CSF)泄漏、宫颈狭窄、腓骨肌萎缩症(CMT)疾病、慢性功能性腹痛(CFAP)、慢性胰腺炎、肺萎陷(气胸)、皮质基底节变性、挤压性损伤、角膜神经性疼痛、挤压综合征、椎间盘退变疾病、皮肌炎、痴呆、肌张力障碍、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、子宫内膜异位症、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征(EMS)、红斑性肢痛症、腰椎手术失败综合征(FBSS)、纤维肌痛、弗里德赖希共济失调症、额颞痴呆、舌咽神经痛、生长痛、椎间盘突出、脑积水、肋间神经痛、间质性膀胱炎、青少年皮炎、膝部损伤、腿痛、路易体痴呆症、腰痛血尿综合征、莱姆病、感觉异常性股痛、线粒体病、混合性痴呆、运动神经元病(MND)、单肢肌萎缩、多系统萎缩(MSA)、肌炎、颈痛、枕神经痛、骨质疏松、横纹肌溶解、佩吉特病、牧师特纳综合征(Parsonage Turner Syndrome)、骨盆痛、周围神经病变、幻肢痛、神经挟捏、足底筋膜炎、风湿性多肌痛、多肌炎、疝修补术后疼痛综合征、乳房切除术后疼痛综合征、中风后疼痛、开胸术后疼痛综合征、脊髓灰质炎后综合征、原发性侧索硬化、银屑病关节炎、阴部神经痛、神经根病、不宁腿综合征、类风湿关节炎(RA)、骶髂关节功能障碍、结节病、舒曼脊柱后凸症(Scheuemann’s Kyphosis Disease)、坐骨神经痛、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA)、带状疱疹、痉挛性斜颈、奥迪氏括约肌功能障碍(Sphincterof Oddi Dysfunction)、脊髓损伤、椎管狭窄、脊髓空洞症、塔洛夫囊肿(Tarlov Cysts)、脊髓栓系综合征、胸廓出口综合征(TOS)、TMJ障碍、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、血管疼痛、外阴痛、颈椎过度屈伸或其组合。在一些实施方案中，神经变性或神经炎症包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、脊髓小脑共济失调或脊髓性肌萎缩。在一些实施方案中，炎症包括慢性炎症。在一些实施方案中，炎症包括局部炎症或全身炎症。在一些实施方案中，炎症与以下有关：炎症肠病、肠易激综合征、骨关节炎、类风湿关节炎、肾小球肾炎、脓毒症、成人呼吸窘迫综合征、皮炎、结节病、过敏性炎症、银屑病、强直性脊椎关节炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、痛风、同种异体移植、异种移植、自身免疫性疾病、斯耶格伦氏病(Sjogren’s disease)、灼伤、创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、缺血再灌注损伤、细胞因子或其他治疗性单克隆抗体的体内施用诱导的毒性。在一些实施方案中，指示了IL13治疗。在一些实施方案中，指示了IL4、IL10、IL27、IL33、TGFβ1或TGFβ2治疗。在一些实施方案中，该方法减少神经纤维退行。在一些实施方案中，该方法减少神经纤维损失。在一些实施方案中，该方法促进神经纤维密度的维持。在一些实施方案中，该方法促进神经纤维再生长。在一些实施方案中，该方法促进中枢神经系统中的神经保护。在一些实施方案中，该方法促进周围神经系统中的神经保护。在一些实施方案中，该方法减少表皮内神经纤维损失。在一些实施方案中，该方法减少神经元功能障碍。在一些实施方案中，施用融合蛋白引发比施用等量的IL13、调节性细胞因子或其组合更大程度的治疗效果。在一些实施方案中，施用融合蛋白引发比施用等量的IL13、调节性细胞因子或其组合更长持续时间的治疗效果。在一些实施方案中，如通过在紫杉醇诱导的神经病变小鼠模型中对von Frey毛的机械敏感性测量的，施用导致与单独或组合施用相当量的IL13和调节性细胞因子相比更高程度的疼痛缓解。在一些实施方案中，融合蛋白存在于包含融合蛋白和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。在一些实施方案中，组合物呈单位剂型。在一些实施方案中，融合蛋白以约50μg至约100mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，融合蛋白以约0.5μg至1mg/kg体重的剂量施用。在一些实施方案中，融合蛋白以控释制剂施用。在一些实施方案中，融合蛋白通过以下施用：肠胃外、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内或器官实质内途径。在一些实施方案中，神经系统细胞是神经元。在一些实施方案中，神经系统细胞是中枢神经系统细胞。在一些实施方案中，神经系统细胞是周围神经系统细胞。在一些实施方案中，神经元是感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是躯体感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是内脏感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是伤害感受器。在一些实施方案中，神经元是自主神经元。在一些实施方案中，神经系统细胞是神经胶质细胞。在一些实施方案中，神经系统细胞是小胶质细胞。在一些实施方案中，神经系统细胞是浸润细胞。在一些实施方案中，神经系统细胞是浸润巨噬细胞。在一些实施方案中，信号通路在促炎介质的存在下被调节。
在一些方面，本文公开了一种融合蛋白，其包含作为野生型IL13序列的白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
在一些方面，本文公开了一种融合蛋白，其包含白介素13(IL13)氨基酸序列和作为野生型序列的调节性细胞因子氨基酸序列。
在一些方面，本文公开了一种融合蛋白，其包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列，其中IL13氨基酸序列是IL13衍生序列，所述IL13衍生序列以与野生型白介素13序列相当的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)、白介素13受体α2(IL-13Rα2)和白介素4受体α(IL-4Rα)。
在一些方面，本文公开了一种融合蛋白，其包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列，其中该调节性细胞因子氨基酸序列是衍生序列，该衍生序列以与野生型调节性细胞因子相当的亲和力结合该野生型调节性细胞因子结合的所有受体亚基。
在一些实施方案中，调节性细胞因子选自白介素4(IL4)、白介素10(IL10)、白介素33(IL33)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)和另外的白介素13(aIL13)。在一些实施方案中，调节性细胞因子是IL4。在一些实施方案中，调节性细胞因子是IL10。在一些实施方案中，调节性细胞因子是IL33。在一些实施方案中，调节性细胞因子是白介素27(IL27)。在一些实施方案中，调节性细胞因子是TGFβ1。在一些实施方案中，调节性细胞因子是TGFβ2。在一些实施方案中，调节性细胞因子是另外的白介素13(aIL13)。在一些实施方案中，IL13是哺乳动物IL13。在一些实施方案中，IL13是人IL13。在一些实施方案中，IL13包含野生型IL13。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含野生型调节性细胞因子。在一些实施方案中，调节性细胞因子是哺乳动物调节性细胞因子。在一些实施方案中，调节性细胞因子是人调节性细胞因子。在一些实施方案中，白介素27包含白介素27α(IL27A)。在一些实施方案中，IL27A包含相对于SEQ ID NO:36的L134C置换。在一些实施方案中，IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)。在一些实施方案中，IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α2(IL-13Rα2)。在一些实施方案中，IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素4受体α(IL-4Rα)。在一些实施方案中，调节性细胞因子氨基酸序列是以与野生型调节性细胞因子相当的亲和力结合调节性细胞因子受体的所有亚基的衍生序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子氨基酸序列是激活调节性细胞因子的天然受体的衍生序列。在一些实施方案中，IL13包含与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL13包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL13包含相对于选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含与选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节性细胞因子包含相对于选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL13和调节性细胞因子共价连接。在一些实施方案中，IL13和调节性细胞因子通过接头连接。在一些实施方案中，IL13的C末端与细胞因子的N末端连接，任选地通过接头连接。在一些实施方案中，IL13的N末端与细胞因子的C末端连接，任选地通过接头连接。在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，一个或多个化学修饰选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化。在一些实施方案中，蛋白质构建体包含亲和标签。在一些实施方案中，提供了编码融合蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子经过密码子优化以在细胞中表达。在一些实施方案中，核酸分子是载体。在一些实施方案中，细胞包含核酸。在一些实施方案中，融合蛋白存在于还包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。在一些实施方案中，核酸载体存在于还包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。在一些实施方案中，药物组合物呈单位剂型。在一些实施方案中，融合蛋白以约50μg至约100mg/mL的量存在于药物组合物中。在一些实施方案中，融合蛋白被配制用于以约0.5μg至1mg/kg体重的剂量施用。在一些实施方案中，融合蛋白被配制用于作为控释制剂施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于通过以下施用：肠胃外、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内或器官实质内途径。在一些实施方案中，将有效量的药物组合物施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，通过包括在允许产生融合蛋白的条件下培养细胞来产生融合蛋白，其中该细胞包含多核苷酸序列。在一些实施方案中，收获融合蛋白。在一些实施方案中，从收获的培养基中纯化融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白用于将白介素13受体与调节性细胞因子受体交联。
在一些方面，本文公开了一种融合蛋白，其包含白介素13和选自白介素4、白介素10、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2和白介素13的白介素。
在一些实施方案中，白介素13和选自白介素4、白介素10、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2和白介素13的所述白介素通过接头序列连接。在一些实施方案中，白介素13与选自白介素4、白介素10、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2和白介素13的白介素的N末端融合。在一些实施方案中，选自白介素4、白介素10、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2和白介素13的白介素与白介素13的N末端融合。在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化。在一些实施方案中，白介素13是人白介素13。在一些实施方案中，白介素4为人白介素4，和/或所述白介素10为人白介素10，和/或所述白介素33为人白介素33，和/或所述转化生长因子β1为人转化生长因子β1，和/或所述转化生长因子β2是人转化生长因子β2。在一些实施方案中，融合蛋白由存在于核酸分子中的多核苷酸编码。在一些实施方案中，核酸分子存在于载体中。在一些实施方案中，核酸分子存在于宿主细胞中。在一些实施方案中，融合蛋白通过包括以下步骤的方法制备：在允许产生融合蛋白的条件下培养宿主细胞，任选地，从条件培养基中纯化融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白存在于还包含药学上可接受的载剂的药物组合物中。在一些实施方案中，融合蛋白用作药物。在一些实施方案中，融合蛋白用于预防或治疗以慢性疼痛、神经炎症或神经变性为特征的病症。在一些实施方案中，该病症的进一步特征在于内脏或非内脏伤害性疼痛、周围或中枢神经性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛、神经炎症和/或神经变性。在一些实施方案中，该病症选自矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后或手术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、疼痛性周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法相关的疼痛、化学疗法诱导的异常性疼痛、复杂性局部疼痛综合征、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、多发性硬化、腰痛、骨关节炎、癌症疼痛、慢性内脏痛、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病和帕金森病、亨廷顿病和/或肌萎缩侧索硬化或多发性硬化。在一些实施方案中，融合蛋白用于预防或治疗哺乳动物如人的临床病症，白介素13适用于该病症。在一些实施方案中，融合蛋白用于预防或治疗哺乳动物例如人的临床病症，白介素4和/或白介素10和/或白介素33和/或白介素27和/或转化生长因子β1和/或转化生长因子β2适用于该病症。
在某些方面，本文公开了一种基因疗法载体，其包含编码白介素13和选自白介素4、白介素10、白介素27、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2、和白介素13的白介素的一种或多种核苷酸序列，用于预防或治疗以慢性疼痛、神经炎症和/或神经变性为特征的病症。
在一些实施方案中，该病症的进一步特征在于内脏或非内脏伤害性疼痛、周围或中枢神经性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛、神经炎症和/或神经变性。在一些实施方案中，该病症选自矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后或手术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、疼痛性周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法相关的疼痛、化学疗法诱导的异常性疼痛、复杂性局部疼痛综合征、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、多发性硬化、腰痛、骨关节炎、癌症疼痛、慢性内脏痛、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病和帕金森病、亨廷顿病和/或肌萎缩侧索硬化或多发性硬化。
在一些方面，本发明涉及一种融合蛋白，其包含至少2、3、4、优选2种选自白介素13(IL13)、白介素4(IL4)、白介素10(IL10)、白介素27(IL27)、白介素33(IL33)、转化生长因子β1(TGFβ1)和转化生长因子β2(TGFβ2)的调节性(例如抗炎)白介素。
优选地，本发明涉及包含IL13和另一种，即第二白介素/细胞因子(优选选自IL4、IL10、IL27、IL33、TGFβ1、TGFβ2和IL13本身)的融合蛋白。
在一个实施方案中，所述IL13和选自IL4、IL10、IL27、IL33、TGFβ1、TGFβ2或IL13本身的所述白介素通过接头连接。
在一个实施方案中，选自IL4、IL10、IL27、IL33、TGFβ1、TGFβ2或IL13本身的白介素与IL13的N末端融合。
在另一个实施方案中，IL13与选自IL4、IL10、IL27、IL33、TGFβ1、TGFβ2或IL13本身的白介素的N末端融合。
在一个实施方案中，所述融合蛋白进一步包含一个或多个化学修饰。所述化学修饰可以选自：
糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化。
在一个实施方案中，所述IL13是人IL13。
在一个实施方案中，所述IL4是人IL4。
在一个实施方案中，所述IL10是人IL10。
在一个实施方案中，所述IL27是人IL27。
在一个实施方案中，所述IL33是人IL33。
在一个实施方案中，所述TGFβ1是人TGFβ1。
在一个实施方案中，所述TGFβ2是人TGFβ2
在第二方面，本发明涉及包含编码本文教导的融合蛋白的多核苷酸的核酸分子。
在另一方面，本发明涉及包含本文教导的核酸分子的载体。
在一个方面，本发明涉及包含本文教导的核酸分子或本文教导的载体的宿主细胞。
在一个方面，本发明提供了一种产生如本文教导的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：在允许产生如本文所教导的融合蛋白的条件下培养如本文所教导的宿主细胞；并且任选地，回收融合蛋白。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文教导的融合蛋白和药学上可接受的载剂或赋形剂。
本发明还涉及如本文所教导的融合蛋白用作药物的用途，例如用于预防或治疗以病理性疼痛、慢性疼痛、神经炎症、神经变性和/或局部或全身炎症为特征的病症。就此而言，“慢性”可被视为持续至少1、2、3、4、5、6、10或12个月，甚至至少1、2、3、4或5年。所述病症的特征在于内脏或非内脏炎症性疼痛、内脏或非内脏伤害性疼痛、周围或中枢神经性疼痛、混合型伤害性-神经性疼痛、神经炎症和/或神经变性和/或可以选自矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后或手术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、疼痛性周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法相关的疼痛、化学疗法诱导的异常性疼痛、化学疗法诱导的周围神经病变、复杂性局部疼痛综合征、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、多发性硬化、腰痛、骨关节炎、癌症疼痛、慢性内脏痛、纤维肌痛、风湿性多肌痛、慢性广泛疼痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病和帕金森病、亨廷顿病和/或肌萎缩侧索硬化或多发性硬化。
在一个方面，本发明涉及本文教导的融合蛋白用于预防或治疗哺乳动物例如人的临床病症的用途，其中IL4或IL13适用于该病症。
本发明还涉及如本文教导的融合蛋白用于预防或治疗哺乳动物例如人的临床病症的用途，其中IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2适用于该病症。
最后，本发明教导了用于预防或治疗以慢性疼痛、神经炎症、神经变性和/或局部或全身炎症为特征的病症的载体。所述病症的特征在于内脏或非内脏伤害性疼痛、周围或中枢神经性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛、神经炎症和/或神经变性和/或可以选自矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后或手术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、疼痛性周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法相关的疼痛、复杂性局部疼痛综合征、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、多发性硬化、腰痛、骨关节炎、癌症疼痛、慢性内脏痛、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病和帕金森病、亨廷顿病和/或肌萎缩侧索硬化或多发性硬化。
附图说明
本公开的特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下阐述其中利用了本公开的原理的说明性实施方案以及附图的详细描述，可以更好地理解本公开的特征和优点，所述附图是：
图1.需要调节性(例如抗炎)细胞因子来消退化学疗法引起的疼痛。小鼠在第0天和第2天腹膜内注射2mg/kg紫杉醇以诱导短暂的疼痛性化学疗法引起的多发性神经病变。从第6天起，小鼠每天接受鞘内注射针对内源性IL4(n＝4；空心向下三角形)或IL13(n＝4；实心向上三角形)的中和抗体，持续5天(每次注射5μg抗体)。作为对照，将同种型IgG鞘内注射到用紫杉醇治疗的小鼠中(n＝3；带空心圆圈的虚线)。作为另一个对照，小鼠用媒剂而不是紫杉醇和对照IgG预处理(n＝3；带实心圆圈的实线)。随着时间的推移，通过使用vonFrey毛发测量对触摸的机械敏感性来跟踪疼痛样行为。请注意，较低的50％阈值表示灵敏度增加。数据代表平均值和平均值的标准误差。抗IL13 IgG与对照IgG处理的小鼠之间的统计差异表示为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。抗IL4 IgG与对照IgG处理的小鼠之间的统计差异表示为x p<0.05，xx p<0.01。
图2.IL13减弱紫杉醇诱导的神经元损伤。初级感觉神经元被培养并用紫杉醇(1μM)处理过夜，以诱导神经元损伤，该神经元损伤通过测量β3-微管蛋白染色后的神经突长度来量化。在用化疗药物治疗期间添加媒剂(-)或单个细胞因子(50ng/ml)，并测量神经元的平均长度。数据代表在至少2个实验中测量的>10个细胞的以微米为单位的神经突长度的平均值和平均值的标准误差。
图3.重组IL4/IL13融合蛋白的表征。His标记的IL4/IL13融合蛋白在HEK293细胞中表达，使用HIS-Select镍亲和色谱进行纯化，并使用高压尺寸排阻色谱(HP-SEC)进行分析。HP-SEC谱表明均质单体制剂。插图显示十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析起始材料(加载)、流通(FT)、洗涤缓冲液(洗涤)和His标签纯化柱的洗脱物。凝胶用考马斯蓝染色。请注意，IL4/IL13融合蛋白在37kDa处作为成片条带迁移。
图4.IL4/IL13融合蛋白缓解紫杉醇诱导的持续性机械性异常性疼痛。在第0、2、4和6天(X轴上的灰色符号)对C57BL/6小鼠腹腔注射紫杉醇(8mg/kg)以诱导持续化学疗法诱导的多发性神经病变。IL4/IL13融合蛋白(0.3[空心圆]、1[空心三角形]或3μg/小鼠[空心正方形]；n＝4/组)或媒剂(n＝4)在第8天鞘内施用，并且机械性异常性疼痛的过程随着时间的推移使用von Frey毛发进行跟踪。数据表示为平均值±SEM。用双向ANOVA随后Tukey多重比较检验分析数据的统计。0.3μg IL4/IL13融合蛋白相比于媒剂，分别地，*、**、***＝p<0.05、p<0.01和0.001。3μg IL4/IL13融合蛋白相比于媒剂，&,＝p<0.05。1μg IL4/IL13融合蛋白相比于媒剂，x＝p<0.05。
图5.与IL4/IL10融合蛋白相比，IL4/IL13融合蛋白对小鼠中疼痛性紫杉醇诱导的神经病变具有更持久的影响。小鼠每隔一天接受4次8mg/kg紫杉醇的腹腔注射(X轴上的灰色符号)，以诱导持续的、疼痛的、化学疗法诱导的多发性神经病变。在第8天，小鼠接受单次鞘内注射IL4/IL13融合蛋白(0.7μg；空心圆，n＝4)、IL4/IL10融合蛋白(0.7μg；空心三角形，n＝3)、野生型IL4和IL13的组合(0.35μg/细胞因子；空心正方形，n＝4)或媒剂(实心圆，n＝4)。使用von Frey毛发测试了疼痛样行为(见图1)。请注意，IL4/IL13融合蛋白的单次施用导致疼痛的持续缓解(例如，永久消退疼痛)，而IL4/IL10融合蛋白在该实验中具有持续2天的临时效果。
图6.IL4/IL13融合蛋白保护小鼠免受紫杉醇诱导的神经损伤。小鼠每隔一天接受4次8mg/kg紫杉醇的腹腔注射，以诱导持续的、疼痛的、化学疗法诱导的多发性神经病变。在第8天，它们用单次鞘内注射IL4/IL13融合蛋白(0.7μg)或媒剂进行治疗。在第15天，通过使用神经元标记PGP9.5的免疫荧光可视化确定爪皮肤中表皮内神经纤维的长度。显示了未用化疗药物治疗(黑色柱子；n＝4)或注射紫杉醇并随后用媒剂(-；n＝6)或IL4/IL3融合蛋白(IL4-13；n＝4)治疗的小鼠的数据。
图7.IL4/IL13融合蛋白比IL4/IL10融合蛋白或IL4和IL13的组合更好地保护培养的神经元免受化学疗法诱导的损伤。初级感觉神经元在紫杉醇(1μM)存在下培养过夜，以诱导神经元损伤，其通过测量β3-微管蛋白染色后的神经突长度来量化。在与化疗药物孵育期间以等摩尔浓度添加媒剂(-)或IL4/IL13融合蛋白(IL4-13)、IL4/IL10融合蛋白(IL4-10)或IL4和IL13的组合(IL4+IL13)。显示在没有紫杉醇和细胞因子的情况下培养的神经元进行比较(黑色柱子)。
图8.IL4/IL13治愈奥沙利铂诱导的小鼠多发性神经病变，而IL4或IL13仅具有部分暂时效果。将奥沙利铂(3mg/kg)每天腹膜内注射到小鼠中进行5天，然后是5天不治疗，以及另外5天的奥沙利铂治疗周期(X轴上的灰色符号)。在最后一次奥沙利铂注射后的第一天，动物接受鞘内注射IL4/IL13融合蛋白(0.3μg；空心圆，n＝4)或野生型细胞因子(0.15μg；n＝4，对于IL4为矩形，对于IL13为三角形)；或仅媒剂(实心圆)。疼痛用von Frey测试进行测量。
图9.IL4/IL13融合蛋白，但不是IL4和IL13的组合，保护培养的神经元免受奥沙利铂诱导的损伤。培养初级感觉神经元并用奥沙利铂(5μg/ml)处理过夜。然后通过测量β3-微管蛋白染色后的神经突长度来量化神经元损伤。在与化疗药物孵育期间以等摩尔浓度添加媒剂(-)或IL4/IL13融合蛋白或IL4和IL13的组合(IL4+IL13)。显示在没有奥沙利铂和细胞因子的情况下培养的神经元进行比较(黑色柱子)。
图10.IL10、IL4、IL13、IL33、IL27、TGFβ1和TGFβ2的细胞因子受体亚基在人和小鼠的背根神经节中表达。为了评估本发明融合蛋白靶向的细胞因子受体是否由感觉系统表达，Ray等人(Pain2018；159:1325-1345)从数据库中提取了背根神经节和脊髓中IL10、IL4、IL13、IL33、IL27、TGFβ1和TGFβ2的细胞因子受体亚基的RNAseq数据，该数据库可在https://www.utdallas.edu/bbs/painneurosciencelab/sensoryomics/drgtxome/？go得到。RNA测序数据表示为每百万的转录本。为了比较，还给出了全血中受体表达的数据。
图11.融合蛋白的表征。在非还原和还原条件下，在4-12％梯度NuPageTM聚丙烯酰胺凝胶上分析纯化的融合蛋白，并通过考马斯蛋白染色观察条带。
图12.本公开的两种IL4/IL13融合蛋白保护神经元免受化学疗法诱导的神经元损伤。在紫杉醇(1μM)和不同浓度的每种融合蛋白或等摩尔剂量的IL13或未连接的细胞因子的组合存在的情况下，将初级感觉神经元培养24小时。计算了对紫杉醇诱导的神经突长度减少的抑制。标记为IL4/IL13的融合蛋白包含SEQ ID NO:4。标记为IL4/IL13SKP的融合蛋白包含SEQ ID NO:16。数据显示为平均值±
SEM。使用双向ANOVA混合效应分析随后进行Tukey多重比较检验分析数据。
图13.IL10/IL13保护神经元免受化学疗法诱导的神经元损伤。在紫杉醇(1μM)和不同浓度的每种融合蛋白或等摩尔剂量的IL13或未连接的细胞因子的组合存在的情况下，将初级感觉神经元培养24小时。计算了对紫杉醇诱导的神经突长度减少的抑制。数据显示为平均值±SEM。使用双向ANOVA混合效应分析随后进行Tukey多重比较检验分析数据。
图14.IL13/IL13和IL27/IL13对化学疗法诱导的神经元损伤的保护作用。在紫杉醇(1μM)和不同浓度的每种融合蛋白或等摩尔剂量的IL13存在下，将初级感觉神经元培养24小时。计算了对紫杉醇诱导的神经突长度减少的抑制。数据显示为平均值±SEM。使用双向ANOVA混合效应分析随后进行Tukey多重比较检验分析数据。
图15.与未连接的细胞因子的组合相比，本公开的含有IL13的融合蛋白在背根神经节(DRG)细胞中引发不同的激酶活性谱。进行了PamGene激酶活性分析，以在IL4/IL13融合蛋白、IL4+IL13(未连接的细胞因子的组合)和媒剂施用后评估从具有持续紫杉醇诱导的周围神经病变的小鼠分离的腰椎DRG匀浆中的全局蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。在鞘内施用IL4/IL13融合蛋白、细胞因子组合或媒剂(PBS)后60分钟评估激酶组学谱。显示了基于IL4/IL13、IL4+IL13和媒剂处理的小鼠与原初小鼠(未处理；无紫杉醇，无鞘内注射)之间的单向ANOVA分析差异地磷酸化的肽。黑色表示没有显著变化，而颜色表示磷酸化减少。
图16.与未连接的细胞因子的组合相比，用IL4/IL13处理的雌性小鼠背根神经节(DRG)细胞中改变的激酶活性。进行了PamGene激酶活性分析，以在IL4/IL13融合蛋白或IL4+IL13(未连接的细胞因子的组合)施用后评估从具有持续紫杉醇诱导的CIPN的雌性小鼠分离的腰椎DRG匀浆中的全局蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。该图显示了从差异磷酸化的肽底物(这是通过来自IL4/IL13融合蛋白处理的雌性和IL4+IL13处理的雌性(每组n＝3只动物)的样品之间的未配对t-检验比较而鉴定)推断出的预测的上游激酶。该图按照最高的特异性得分在顶部，最低的特异性得分在底部进行排序。
图17.与未连接的细胞因子的组合相比，用IL4/IL13处理的雄性小鼠背根神经节(DRG)细胞中改变的激酶活性。进行了PamGene激酶活性分析，以在IL4/IL13融合蛋白或IL4+IL13(未连接的细胞因子的组合)施用后评估从具有持续紫杉醇诱导的CIPN的雄性小鼠分离的腰椎DRG匀浆中的全局蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。该图显示了从差异磷酸化的肽底物(这是通过来自IL4/IL13融合蛋白处理的雄性和IL4+IL13处理的雄性(每组n＝3只动物)的样品之间的未配对t-检验比较而鉴定)推断出的预测的上游激酶。该图按照最高的特异性得分在顶部，最低的特异性得分在底部进行排序。
图18A-18D.IL4/IL13、IL10/IL13、IL27/IL13和IL13/IL13融合蛋白的尺寸排阻色谱。对本公开的IL4/IL13、IL10/IL13、IL27/IL13和IL13/IL13融合蛋白进行尺寸排阻色谱。图18A：包含SEQ ID NO:16的IL4/IL13融合蛋白的尺寸排阻色谱。图18B：包含SEQ ID NO:20的IL13/IL13融合蛋白的尺寸排阻色谱。图18C：包含SEQ ID NO:19的IL27/IL13融合蛋白的尺寸排阻色谱。图18D：包含SEQ ID NO:17的IL10/IL13融合蛋白的尺寸排阻色谱。
具体实施方式
一般定义
术语“核酸分子”(或“核酸序列”、“多核苷酸”或“核苷酸序列”)是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，特别是编码本发明的蛋白质的DNA。“分离的核酸序列”是指不再处于分离它的自然环境中的核酸序列，例如细菌宿主细胞中或植物核或质体基因组中的核酸序列。
术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，是指由一个或多个氨基酸链组成的分子，不涉及特定的作用模式、大小、三维结构或来源。“分离的蛋白质”用于指不再处于其自然环境中的蛋白质，例如体外或重组哺乳动物、细菌或植物宿主细胞中的蛋白质。
术语“融合蛋白”是指具有来自或源自两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的蛋白质或多肽。融合蛋白还可以包括来自或源自分离的蛋白质的氨基酸部分之间的连接区或氨基酸接头。融合蛋白还指具有来自或衍生自两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的分子，所述蛋白质非共价结合或通过化学交联剂连接(例如，共价连接)，带有或不带有间隔区。融合蛋白可以是多肽构建体。
术语IL4、IL10、IL13、IL27、IL33、TGFβ1和TGFβ2优选地指这些各个细胞因子的野生型序列，和/或其能够结合至少一种它们各自的细胞因子受体或受体亚基(例如，优选至少两种)的突变变体。
术语“TGFβ”、“TGFβ1/2”和“TGFβ(1或2)”用于指TGFβ1和/或TGFβ2。
术语“IL4/IL13融合蛋白”是指至少包含IL4和IL13(其任选地通过接头彼此偶联)的融合多肽。融合蛋白可包含另外的多肽序列，例如信号序列、His标签、一个或多个靶向序列、抗体Fc片段、细胞外基质结合多肽或其任何组合。
术语“IL10/IL13融合蛋白”是指至少包含IL10和IL13(其任选地通过接头彼此偶联)的融合多肽。融合蛋白可包含另外的多肽序列，例如信号序列、His标签、一个或多个靶向序列或抗体Fc片段、细胞外基质结合多肽或其任何组合。
术语“IL33/IL13融合蛋白”是指至少包含IL33和IL13(其任选地通过接头彼此偶联)的融合多肽。融合蛋白可包含另外的多肽序列，例如信号序列、His标签、一个或多个靶向序列或抗体Fc片段、细胞外基质结合多肽或其任何组合。
术语“TGFβ1/IL13融合蛋白”是指至少包含TGFβ1和IL13(其任选地通过接头彼此偶联)的融合多肽。融合蛋白可包含另外的多肽序列，例如信号序列、His标签、一个或多个靶向序列或抗体Fc片段、细胞外基质结合多肽或其任何组合。
术语“TGFβ2/IL13融合蛋白”是指至少包含TGFβ2和IL13(其任选地通过接头彼此偶联)的融合多肽。融合蛋白可包含另外的多肽序列，例如信号序列、His标签、一个或多个靶向序列或抗体Fc片段、细胞外基质结合多肽或其任何组合。
术语“IL13/IL13融合蛋白”是指包含至少两个IL13分子(其任选地通过接头彼此偶联)的融合多肽。融合蛋白可包含另外的多肽序列，例如信号序列、His标签、一个或多个靶向序列或抗体Fc片段、细胞外基质结合多肽或其任何组合。
如本文所用，“接头”意指用于偶联两个蛋白质或多肽(即IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ或IL13)和IL13)的多肽。接头通常是一段氨基酸，例如主要是甘氨酸和/或丝氨酸。在一个实施方案中，接头是一段氨基酸，其长度为最多100个氨基酸，例如从约2、5、7、10、15个氨基酸至最高达约15、20、25、30、35、50、75或100个氨基酸，优选主要包含丝氨酸和甘氨酸残基。
如本文所用，“白介素-13”(IL13)优选指任何哺乳动物IL13，例如人IL13、小鼠IL13，或其活性物种或变体(例如等位基因变体)、(功能性)片段或衍生物。
如本文所用，“白介素-4”(IL4)优选指任何哺乳动物IL4，例如人IL4、小鼠IL4，或其活性物种或变体(例如等位基因变体)、(功能性)片段或衍生物。
如本文所用，“白介素-10”(IL10)优选指任何哺乳动物IL10，例如人IL10、小鼠IL10，或其活性物种或变体(例如等位基因变体)、(功能性)片段或衍生物。
如本文所用，“白介素-27”(IL27)可指任何哺乳动物IL27，例如人IL27、小鼠IL27，或其活性物种或变体(例如等位基因变体)、(功能性)片段或衍生物。在一些情况下，IL27是指IL27亚基α(IL27A)，例如人IL27A。在一些情况下，IL27是指IL27亚基β(IL27B)，例如人IL27B。在一些情况下，IL27是指IL27A和IL27B。
如本文所用，“白介素-33”(IL33)优选指任何哺乳动物IL33，例如人IL33、小鼠IL33，或其活性物种或变体(例如等位基因变体)、(功能性)片段或衍生物。
如本文所用，“转化生长因子β1”(TGFβ1)优选指任何哺乳动物TGFβ1，例如人TGFβ1、小鼠TGFβ1，或其活性物种或变体(例如等位基因变体)、(功能性)片段或衍生物。
如本文所用，“转化生长因子β2”(TGFβ2)优选指任何哺乳动物TGFβ2，例如人TGFβ2、小鼠TGFβ2，或其活性物种或变体(例如等位基因变体)、(功能性)片段或衍生物。
在描述细胞因子时，术语“野生型”是指具有天然存在并由给定物种的种系基因组编码的氨基酸序列的细胞因子。物种可以具有一个野生型序列，或两个或更多个野生型序列(例如，具有一个规范野生型序列和一个或多个非规范野生型序列)。野生型细胞因子序列可以包括相对于由开放阅读框编码的序列在N和/或C末端截短的序列。野生型细胞因子序列可以是成熟形式的细胞因子，其已被加工以去除N末端和/或C末端残基。野生型细胞因子可缺乏信号肽或可包括信号肽(例如，可将信号肽添加到野生型细胞因子的N末端)。
当描述细胞因子时，术语“衍生物”是指具有与野生型序列相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列的细胞因子，例如，相对于野生型序列含有一个或多个氨基酸插入、缺失或置换。细胞因子衍生物结合野生型细胞因子的相应天然受体的至少一个亚基并引发信号传导和/或细胞因子活性。细胞因子衍生物的结合亲和力、信号传导和/或细胞因子活性可以与相应的野生型细胞因子相同或不同。
与本发明的融合蛋白(或其变体或片段)相关的“功能性”是指展示IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2或其他调节性细胞因子，例如抗炎性细胞因子)和IL13功能性的能力，例如，与至少一个受体亚基结合的能力，该受体亚基与野生型细胞因子结合。
评估这些细胞因子的功能活性的测定是本领域技术人员众所周知的。例如，IL4和IL10的功能测定是在抗IL10抗体26存在下，脂多糖(LPS)诱导的全血中TNF释放。IL13的功能测定是TF1人红白血病细胞27的增殖。IL33的功能测定是肥大细胞系MC/9产生IL6。TGFβ1或TGFβ2的测定是抑制小鼠T细胞系HT-2的IL4依赖性生长。IL27的功能测定可以包括由LPS刺激的THP-1巨噬细胞产生IL6。
术语“基因”是指可操作地连接至合适的调节区(例如启动子)的包含区域(转录区)的DNA序列，该区域在细胞中转录成RNA分子(例如mRNA)。因此，基因可以包含几个可操作地连接的序列，例如启动子、包含例如涉及翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)、内含子和包括例如转录终止位点的3'非翻译序列。
“基因的表达”是指这样的过程，其中与适当的调节区，特别是启动子可操作地连接的DNA区被转录成具有生物活性的RNA，即能够被翻译成具有生物活性的蛋白质或肽(或活性肽片段)的RNA。“多肽的表达”另外是指将mRNA翻译成蛋白质产物的过程，该蛋白质产物可以被分泌也可以被不分泌。
如本文所用，术语“启动子”是指核酸序列，其功能是控制一个或多个基因的转录，位于基因转录起始位点转录方向的上游，并在结构上通过以下鉴定：存在依赖于DNA的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接调节启动子的转录量的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子是生理上(例如通过某些化合物的外部应用)或发育上调节的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中具有活性。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件以功能关系的连接。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，核酸是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或转录调控序列影响编码序列的转录，则它与编码序列可操作地连接。可操作地连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的。
“核酸构建体”或“载体”在本文中被理解为是指使用重组DNA技术产生的人造核酸分子，其用于将外源DNA递送到宿主细胞中。载体通常包含更多的遗传元件以促进它们在分子克隆中的应用，例如可选择标记或多个克隆位点(见下文)。
“序列同一性”和“序列相似性”可以通过使用全局或局部比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定。当序列(当通过例如程序GAP或BESTFIT使用默认参数进行最佳比对时)共享至少某个最小百分比的序列同一性(如下文所定义)时，它们可以被称为“基本相同”或“基本相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上比对，最大化匹配数量并最小化缺口数量。通常，使用GAP默认参数，缺口创建罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,915-919)。序列比对和序列同一性百分比的得分可以使用计算机程序确定，例如GCG Wisconsin Package,版本10.3,可获自Accelrys Inc.,9685Scranton Road,SanDiego,CA 92121-3752USA,或EmbossWin版本2.10.0(使用程序“needle”)。可替代地，可以通过使用诸如FASTA、BLAST等算法对数据库进行搜索来确定相似性或同一性百分比。优选地，序列同一性是指在整个序列长度上的序列同一性。
“宿主细胞”或“重组宿主细胞”或“转化的细胞”是指由至少一种核酸分子，尤其是包含编码所需蛋白质的核酸分子的核酸分子产生的新个体细胞(或生物体)的术语。宿主细胞优选为哺乳动物细胞、植物细胞或细菌细胞。宿主细胞可以含有本发明的核酸分子或载体作为染色体外(附加体)复制分子，或更优选地，包括整合到宿主细胞基因组中的本发明的核酸分子或载体。
术语“可选择标记”是本领域普通技术人员熟悉的术语，在本文中用于描述在表达时可用于选择含有可选择标记的一个或多个细胞的任何遗传实体。可选择标记基因产物赋予例如抗生素抗性或营养需求。
术语“神经系统细胞”是指在中枢神经系统或周围神经系统内发现的细胞。神经系统细胞可以是神经元、中枢神经系统细胞、周围神经系统细胞、胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、施万细胞、卫星神经胶质细胞、少突胶质细胞、浸润性细胞、浸润性免疫细胞、浸润性骨髓细胞、浸润性淋巴细胞、浸润性巨噬细胞、浸润性中性粒细胞、浸润性淋巴细胞、浸润性T细胞、浸润性B细胞或浸润性自然杀伤细胞。神经元可以是例如感觉神经元、躯体感觉神经元、内脏感觉神经元、伤害感受器和/或自主神经元。
在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其动词的变化以其非限制性意义使用以表示包括该词之后的项，但不排除未特别提及的项。它还涵盖更具限制性的动词“组成”。此外，通过不定冠词“一个”或“一种”对要素的引用并不排除存在多个要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且唯一要素。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常表示“至少一个(种)”。进一步理解的是，当在本文中提及“序列”时，通常指的是具有特定亚单位(例如氨基酸)序列的实际物理分子。
本发明的蛋白质、核酸序列、载体和宿主细胞
本发明人提供了一种融合蛋白，其包含任选地通过接头物理融合在一起的IL13蛋白和调节性细胞因子，例如选自IL4、IL10、IL27、IL33、TGFβ1、TGFβ2或IL13本身的蛋白。本公开的调节性细胞因子包括但不限于IL4、IL10、IL13、IL27、IL33、TGFβ1和TGFβ2。特别地，发现本发明的融合蛋白在治疗本文公开的病症(例如神经性疼痛)中具有优于其各个对应物即单独的调节性细胞因子(例如IL4或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)和IL13的活性。具体而言，发现在鞘内给药时，本发明的融合蛋白对神经性疼痛具有持久的镇痛作用，并消除与化学疗法诱发的神经病变相关的异常性疼痛。发明人意外地观察到，本发明的融合蛋白的这种镇痛作用比之前描述的IL4和IL1019,23,26的融合蛋白的镇痛作用持续时间更长。出人意料的是，本发明的融合蛋白还改善了化学疗法相关的神经变性。在与化疗药物孵育后，它可以防止体外神经突缩短，并且在这种作用方面比IL4和IL10的融合蛋白，或IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)和IL13的组合更有效。后一个出人意料的发现表明融合蛋白相比于其单个细胞因子或这些细胞因子的组合具有独特的作用。在体内，本发明的融合蛋白在施用化疗药物后减弱了表皮内神经纤维的减少。
在本发明的一个实施方案中，提供了IL4/IL13融合蛋白或IL10/IL13融合蛋白或IL27/IL13融合蛋白或IL33/IL13融合蛋白或TGFβ1/IL13融合蛋白或TGFβ2/IL13或IL13/IL13融合蛋白(包括其变体、衍生物和片段)的核酸序列和氨基酸序列。IL4/IL13融合蛋白或IL10/IL13融合蛋白或IL27/IL13融合蛋白或IL33/IL13融合蛋白，以及其衍生物、功能片段和变体，展示IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)活性以及IL13活性。
在一些情况下，本文公开的融合蛋白包含两个细胞因子，C1和C2，并以C1/C2或C1-C2的格式提及。细胞因子出现的顺序没有限制并且不一定推断细胞因子的方向。例如，C1/C2或C1-C2可以包括在C2的C末端侧或在C2的N末端侧的细胞因子C1。类似地，除非另有说明，否则称为C1/C2的细胞因子可以与称为C2/C1的细胞因子相同。
在一个方面，提供了包含IL4(或IL10或IL13或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)和IL13的融合蛋白。
白介素13
本文公开的融合蛋白可包含与调节性细胞因子或其变体或衍生物可操作地连接或直接或间接融合的IL13蛋白或其变体、衍生物或片段。IL13蛋白优选为哺乳动物IL13蛋白，例如人IL13或小鼠IL13。代表人IL13的氨基酸序列的非限制性实例在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中列出。IL13的变体包括例如优选在整个长度上与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:9-15中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如100％氨基酸序列同一性的蛋白。氨基酸序列同一性优选通过使用Needleman和Wunsch算法和如上定义的GAP默认参数的双序列比对确定。其变体、衍生物和片段还包括具有IL13活性的蛋白质，其通过一个或多个氨基酸置换、缺失或插入衍生自具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9-15中任一项的氨基酸序列的多肽。优选地，此类蛋白质包含从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多至最高达约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL13(例如，IL13变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL13序列(例如，野生型IL13序列)可包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少或至少50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL13(例如，IL13变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL13序列(例如，野生型IL13序列)可包括至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45或至多50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL13序列(例如，IL13变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL13序列(例如，野生型IL13序列)可包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL13序列(例如，IL13变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL13序列(例如野生型IL13序列)可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换、缺失或插入。氨基酸置换可以是保守的或非保守的置换。一个或多个氨基酸置换、缺失或插入可以在N末端、C末端、氨基酸序列内或其组合。氨基酸置换、缺失或插入可以是连续的、非连续的或其组合。
本公开的IL13可以包含野生型IL13序列。野生型IL13序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:2和9-15。SEQ ID NO:12可以是本公开的规范野生型IL13序列。
本公开的IL13可以包含具有一个或多个氨基酸置换的IL13变体、衍生物或其片段。例如，IL13变体、衍生物或其片段可以在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12的位置L10、E12、R11、I14、E15、E16、V18、R65、S68、R86、D87、T88、K89、D98、L101、L103、K104、K105、L106、F107、R108、R111、F114、N113或其组合包含氨基酸置换。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含以下置换：L10F；L10I；L10V；L10A；L10D；L10T；L10H；R11S；R11N；R11H；R11L；R11I；I14L；I14F；I14V；I14M；V18L；V18F；V18I；E12A；R65D；R86K；R86T；R86M；D87E；D87K；D87R；D87G；D87S；T88S、T88I；T88K；T88R；K89R；K89T；K89M；L101F；L101I；L101Y；L101H；L101N；K104R；K104T；K104M；K105T；K105A；K105R；K105E；F107L；F107I；F107V；F107M；R108K；R108T；R108M；E12K、E12I、E12C、E12S、E12R、E12Y、E12D、E15K、E16K、R65D、S68D、D98K、L101A、L103A、K104D、K105D、L106A、F107Y、R108D、R111D、F114D、N113D，或其组合。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10H、R86T、D87G、T88R和R108K。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10A、V18F、R86K、D87K、K89R、L101I、K104R和R108K。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R和K105T。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10V、K89R、L101N、K105E和R108T。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10D、R11I、V18I、R86K、D87K、K89R和R108K。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A和R108K。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10V、K89R、L101N、K105E和R108T。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换R11S、I14M、T88S、L101N、K105A和R108K。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10H、R11L、V18I、R86K、D87E、K89R、L101N、K105T和R108K。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10H、R86T、D87G、T88R和R108K。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10A、V18F、R86K、D87K、K89R、L101I、K104R和R108K。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10T或L10D；R11I；V18I；R86K；D87K或D87G；T88S；K89R；L101Y；K104R；K105T；和R108K。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10A或L10V；R86T；D87G；T88K；K89R；L101N；K104R；K105A或K105E；和R108K或R108T。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R和K105T。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R和K105T。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R和K105T。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10V或L10I；D87S；T88S；K89R；L101H或L101F；K104R；和K105T。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10I；V18I；R86T；D87G；T88S；K89R；L101Y、L101H；K104R；和K105A。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换L10V；V18I；D87S；T88S；L101F；K104R；和K105T。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQID NO:12包含置换V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R和K105A。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A和F107M。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换E12K和S68D。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换E12K和R108D。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换E12K和R111D。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换E12Y和R65D。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQID NO:12包含置换E12Y和S68D。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换E12K、R65D和S68D。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换E12Y、R65D和S68D。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12包含置换E12K、R65D、S68D和R111D。
在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:12在位置L10、E12、R11、I14、E15、E16、V18、R65、S68、R86、D87、T88、K89、D98、L101、L103、K104、K105、L106、F107、R108、R111、F114或N113处不包含置换。在一些实施方案中，IL13变体、衍生物或其片段不包含L10F；L10I；L10V；L10A；L10D；L10T；L10H；R11S；R11N；R11H；R11L；R11I；I14L；I14F；I14V；I14M；V18L；V18F；V18I；E12A；R65D；R86K；R86T；R86M；D87E；D87K；D87R；D87G；D87S；T88S、T88I；T88K；T88R；K89R；K89T；K89M；L101F；L101I；L101Y；L101H；L101N；K104R；K104T；K104M；K105T；K105A；K105R；K105E；F107L；F107I；F107V；F107M；R108K；R108T；R108M；E12K、E12I、E12C、E12S、E12R、E12Y、E12D、E15K、E16K、R65D、S68D、D98K、L101A、L103A、K104D、K105D、L106A、F107Y、R108D、R111D、F114D或N113D置换。
在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段以与野生型IL13序列大约相当的亲和力结合IL13受体亚基。相当的亲和力可以是与野生型IL13序列相比亲和力增加例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。相当的亲和力可以是与野生型IL13序列相比亲和力降低例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。
例如，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13大约相当的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)、白介素13受体α2(IL-13Rα2)、白介素4受体α(IL-4Rα)，或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13大约相当的亲和力结合IL-13Rα1。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13大约相当的亲和力结合IL-13Rα2。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13序列大约相当的亲和力结合IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13大约相当的亲和力结合IL-13Rα1和IL-13Rα2。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13大约相当的亲和力结合IL-13Rα1和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13大约相当的亲和力结合IL-13Rα2和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13大约相当的亲和力结合IL-13Rα1、IL-13Rα2和IL-4Rα。
在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至少相当的亲和力结合IL13受体亚基。例如，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至少相当的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)、白介素13受体α2(IL-13Rα2)、白介素4受体α(IL-4Rα)，或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至少相当的亲和力结合IL-13Rα1。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至少相当的亲和力结合IL-13Rα2。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至少相当的亲和力结合IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至少相当的亲和力结合IL-13Rα1和IL-13Rα2。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至少相当的亲和力结合IL-13Rα1和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至少相当的亲和力结合IL-13Rα2和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至少相当的亲和力结合IL-13Rα1、IL-13Rα2和IL-4Rα。
在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至多相当的亲和力结合IL13受体亚基。例如，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至多相当的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)、白介素13受体α2(IL-13Rα2)、白介素4受体α(IL-4Rα)，或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至多相当的亲和力结合IL-13Rα1。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至多相当的亲和力结合IL-13Rα2。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至多相当的亲和力结合IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至多相当的亲和力结合IL-13Rα1和IL-13Rα2。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至多相当的亲和力结合IL-13Rα1和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至多相当的亲和力结合IL-13Rα2和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL13至多相当的亲和力结合IL-13Rα1、IL-13Rα2和IL-4Rα。
在一些实施方案中，IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL13序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-13Rα1结合。在一些实施方案中，IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL13序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-13Rα1结合。
在一些实施方案中，IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL13序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-13Rα2结合。在一些实施方案中，IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL13序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-13Rα2结合。
在一些实施方案中，IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL13序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-4Rα结合。在一些实施方案中，IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL13序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-4Rα结合。
在一些实施方案中，本公开的IL13或IL13变体、衍生物或其片段可以激活天然IL13受体。天然IL13受体可以是例如包含IL-13Rα1亚基和IL-4Rα亚基的受体。
白介素4
本文公开的融合蛋白可包含与白介素13或其变体或衍生物可操作地连接或直接或间接融合的IL4蛋白或其变体、衍生物或片段。IL4蛋白优选为哺乳动物IL4蛋白，例如人IL4或小鼠IL4。IL4的氨基酸序列的非限制性实例在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:26-28中列出。IL4的变体包括例如优选在整个长度上与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:26-28中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如100％氨基酸序列同一性的蛋白。氨基酸序列同一性优选通过使用Needleman和Wunsch算法和如上定义的GAP默认参数的双序列比对确定。变体还包括具有IL4活性的蛋白质，其通过一个或多个氨基酸置换、缺失或插入衍生自具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:26-28中任一项的氨基酸序列的多肽。优选地，此类蛋白质包含从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多至最高达约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸置换、缺失或插入。在一些实施方案中，本公开的IL4(例如，IL4变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL4序列(例如，野生型IL4序列)可包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少或至少50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL4(例如，IL4变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL4序列(例如，野生型IL4序列)可包括至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45或至多50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL4序列(例如，IL4变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL4序列(例如，野生型IL4序列)可包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL4序列(例如，IL4变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL4序列(例如野生型IL4序列)可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换、缺失或插入。氨基酸置换可以是保守的或非保守的置换。一个或多个氨基酸置换、缺失或插入可以在N末端、C末端、氨基酸序列内或其组合。氨基酸置换、缺失或插入可以是连续的、非连续的或其组合。
本公开的IL4可以包含野生型IL4序列。野生型IL4序列的非限制性实例包括SEQID NO:1和26-28。本公开的规范野生型IL4序列可以是SEQ ID NO:1。
本公开的IL4可以包含具有一个或多个氨基酸置换的IL4变体、衍生物或其片段。例如，IL4变体、衍生物或其片段可以在SEQ ID NO:1的位置K117、T118、R121、E122、Y124、S125、S128、S129或其组合处包含氨基酸置换。在一些实施方案中，IL4变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:1包含以下置换：K117R、T118V、R121Q、R121D、R121K、R121E、E122S、Y124W、Y124F、Y124D、S125F、S128G、S129A、S125R或其组合。在一些实施方案中，IL4变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:1包含置换K117R、T118V、R121Q、E122S、Y124W、S125F、S128G和S129A。在一些实施方案中，IL4变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:1包含置换R121D和Y124D。
在一些实施方案中，IL4变体、衍生物或其片段在相对于SEQ ID NO:1在位置K117、T118、R121、E122、Y124、S125、S128或S129处不包含置换。在一些实施方案中，IL4变体、衍生物或其片段不包含K117R、T118V、R121Q、R121D、R121K、R121E、E122S、Y124W、Y124F、Y124D、S125F、S128G、S125R或S129A置换。
在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段以与野生型IL4序列大约相当的亲和力结合IL4受体亚基。相当的亲和力可以是与野生型IL4序列相比亲和力增加例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。相当的亲和力可以是与野生型IL4序列相比亲和力降低例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。
例如，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以例如与野生型IL4大约相当的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)、共同γ链、白介素4受体α(IL-4Rα)，或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4大约相当的亲和力结合IL-13Rα1。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4大约相当的亲和力结合共同γ链。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4序列大约相当的亲和力结合IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4大约相当的亲和力结合IL-13Rα1和共同γ链。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4大约相当的亲和力结合IL-13Rα1和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4大约相当的亲和力结合共同γ链和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4大约相当的亲和力结合IL-13Rα1、共同γ链和IL-4Rα。
在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段以至少与野生型IL4序列相当的亲和力结合IL4受体亚基。例如，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至少相当的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)、共同γ链、白介素4受体α(IL-4Rα)，或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL4或其IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至少相当的亲和力结合IL-13Rα1。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至少相当的亲和力结合共同γ链。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4序列至少相当的亲和力结合IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL4或其IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至少相当的亲和力结合IL-13Rα1和共同γ链。在一些实施方案中，本公开的IL4或其IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至少相当的亲和力结合IL-13Rα1和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至少相当的亲和力结合共同γ链和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至少相当的亲和力结合IL-13Rα1、共同γ链和IL-4Rα。
在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段以与野生型IL4序列至多相当的亲和力结合IL4受体亚基。例如，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至多相当的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)、共同γ链、白介素4受体α(IL-4Rα)，或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至多相当的亲和力结合IL-13Rα1。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至多相当的亲和力结合共同γ链。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4序列至多相当的亲和力结合IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL4或其IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至多相当的亲和力结合IL-13Rα1和共同γ链。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至多相当的亲和力结合IL-13Rα1和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至多相当的亲和力结合共同γ链和IL-4Rα。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL4至多相当的亲和力结合IL-13Rα1、共同γ链和IL-4Rα。
在一些实施方案中，IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL4序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-13Rα1结合。在一些实施方案中，IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL4序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-13Rα1结合。
在一些实施方案中，IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL4序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与共同γ链结合。在一些实施方案中，IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL4序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与共同γ链结合。
在一些实施方案中，IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL4序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-4Rα结合。在一些实施方案中，IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL4序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-4Rα结合。
在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段可以激活天然IL4受体。天然IL4受体可以是例如包含IL-13Rα1亚基和IL-4Rα亚基或共同γ链亚基和IL-4Rα亚基的受体。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段当存在于融合蛋白中时可激活天然IL4受体。在一些实施方案中，本公开的IL4或IL4变体、衍生物或其片段在作为不属于融合蛋白的一部分的多肽存在时可激活天然IL4受体，但当存在于融合蛋白中时不激活天然IL4受体。
在一些实施方案中，本公开的多肽不包含IL4。在一些实施方案中，本公开的多肽不包含SEQ ID NO:1。
白介素10
融合蛋白可包含与白介素10或其变体或衍生物可操作地连接或直接或间接融合的IL10蛋白或其变体、衍生物或片段。IL10蛋白优选为哺乳动物IL10蛋白，例如人IL10或小鼠IL10。代表IL10的一个氨基酸序列在SEQ ID NO:5中列出。IL10的变体包括例如优选在整个长度上与SEQ ID NO:5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如100％氨基酸序列同一性的蛋白。氨基酸序列同一性优选通过使用Needleman和Wunsch算法和如上定义的GAP默认参数的双序列比对确定。其变体、衍生物和片段还包括具有IL10活性的蛋白质，其通过一个或多个氨基酸置换、缺失或插入衍生自具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。优选地，此类蛋白质包含从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多至最高达约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL10(例如，IL10变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL10序列(例如，野生型IL10序列)可包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少或至少50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL10(例如，IL10变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL10序列(例如，野生型IL10序列)可包括至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45或至多50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL10序列(例如，IL10变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL10序列(例如，野生型IL10序列)可包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL10序列(例如，IL10变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL10序列(例如野生型IL10序列)可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换、缺失或插入。氨基酸置换可以是保守的或非保守的置换。一个或多个氨基酸置换、缺失或插入可以在N末端、C末端、氨基酸序列内或其组合。氨基酸置换、缺失或插入可以是连续的、非连续的或其组合。
本公开的IL10可以包含野生型IL10序列。野生型IL10序列的非限制性实例是SEQID NO:5。SEQ ID NO:5可以是本公开的规范野生型IL10序列。
本公开的IL10可以包含具有一个或多个氨基酸置换的IL10变体、衍生物或其片段。例如，IL10变体、衍生物或其片段可包含在SEQ ID NO:5的位置I87、A89、H109、R110、F111、Y153、M156或其组合处的氨基酸置换。在一些实施方案中，IL10变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:5包含以下置换：M156、F111S、I87A、I87G、A89D、Hl09D、R110D、Yl53D、Ml56D、A89D、Hl09E、R110E、Yl53E、Ml56E或其组合。
在一些实施方案中，IL10变体、衍生物或其片段在相对于SEQ ID NO:5的位置I87、A89、H109、R110、F111、Y153或M156处不包含置换。在一些实施方案中，IL10变体、衍生物或其片段不包含M156、F111S、I87A、I87G、A89D、Hl09D、R110D、Yl53D、Ml56D、A89D、Hl09E、R110E、Yl53E或Ml56E置换。
在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段以与野生型IL10序列大约相当的亲和力结合IL10受体亚基。相当的亲和力可以是与野生型IL10序列相比亲和力增加例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。相当的亲和力可以是与野生型IL10序列相比亲和力降低例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。
例如，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10大约相当的亲和力结合白介素10受体1(IL-10R1)、白介素10受体2(IL-10R2)或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10大约相当的亲和力结合IL-10R1。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10大约相当的亲和力结合IL-10R2。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10大约相当的亲和力结合IL-10R1和IL-10R2。
在一些实施方案中，本公开的IL10或其IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至少相当的亲和力结合IL10受体亚基。例如，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至少相当的亲和力结合IL-10R1、IL-10R2或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至少相当的亲和力结合IL-10R1。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至少相当的亲和力结合IL-10R2。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至少相当的亲和力结合IL-10R1和IL-10R2。
在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至多相当的亲和力结合IL10受体亚基。例如，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至多相当的亲和力结合IL-10R1、IL-10R2或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至多相当的亲和力结合IL-10R1。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至多相当的亲和力结合IL-10R2。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL10至多相当的亲和力结合IL-10R1和IL-10R2。
在一些实施方案中，IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL10序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-10R1结合。在一些实施方案中，IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL10序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-10R1结合。
在一些实施方案中，IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL10序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-10R2结合。在一些实施方案中，IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL10序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-10R2结合。
在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段可以激活天然IL10受体。天然IL10受体可以是例如包含IL-10R1亚基和IL-10R2亚基的受体。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段当存在于融合蛋白中时可激活天然IL10受体。在一些实施方案中，本公开的IL10或IL10变体、衍生物或其片段在作为不属于融合蛋白的一部分的多肽存在时可激活天然IL10受体，但当存在于融合蛋白中时不激活天然IL10受体。
在一些实施方案中，本公开的多肽不包含IL10。在一些实施方案中，本公开的多肽不包含SEQ ID NO:5。
白介素33
融合蛋白可包含与白介素13或其变体或衍生物可操作地连接或直接或间接融合的IL33蛋白或其变体、衍生物或片段。IL33蛋白优选为哺乳动物IL33蛋白，例如人IL33或小鼠IL33。代表IL33的氨基酸序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:29-34。IL33的变体包括例如优选在整个长度上与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:29-34中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如100％氨基酸序列同一性的蛋白。氨基酸序列同一性优选通过使用Needleman和Wunsch算法和如上定义的GAP默认参数的双序列比对确定。其变体、衍生物和片段还包括具有IL33活性的蛋白质，其通过一个或多个氨基酸置换、缺失或插入衍生自具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:29-34中任一项的氨基酸序列的多肽。优选地，此类蛋白质包含从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多至最高达约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL33(例如，IL33变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL33序列(例如，野生型IL33序列)可包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少或至少50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL33(例如，IL33变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL33序列(例如，野生型IL33序列)可包括至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45或至多50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL33序列(例如，IL33变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL33序列(例如，野生型IL33序列)可包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL33序列(例如，IL33变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL33序列(例如野生型IL33序列)可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换、缺失或插入。氨基酸置换可以是保守的或非保守的置换。一个或多个氨基酸置换、缺失或插入可以在N末端、C末端、氨基酸序列内或其组合。氨基酸置换、缺失或插入可以是连续的、非连续的或其组合。
本公开的IL33可以包含野生型IL33序列。野生型IL33序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:6和29-34。SEQ ID NO:6可以是规范的野生型IL33序列。
本公开的IL33可以包含具有一个或多个氨基酸置换的IL33变体、衍生物或其片段。例如，IL33变体、衍生物或其片段可以包含在SEQ ID NO:6的位置I263处的氨基酸置换。在一些实施方案中，IL33变体、衍生物或其片段包含相对于SEQ ID NO:6为I263M的置换。
在一些实施方案中，IL33变体、衍生物或其片段在相对于SEQ ID NO:6的位置I263处不包含置换。在一些实施方案中，IL33变体、衍生物或其片段不包含I263M置换。
在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段以与野生型IL33序列大约相当的亲和力结合IL33受体亚基。相当的亲和力可以是与野生型IL33序列相比亲和力增加例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。相当的亲和力可以是与野生型IL33序列相比亲和力降低例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。
例如，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33大约相当的亲和力结合ST2(IL1RL1)、IL1RAP或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33大约相当的亲和力结合ST2。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33大约相当的亲和力结合IL1RAP。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33大约相当的亲和力结合ST2和IL1RAP。
在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至少相当的亲和力结合IL33受体亚基。例如，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至少相当的亲和力结合ST2、IL1RAP或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至少相当的亲和力结合ST2。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至少相当的亲和力结合IL1RAP。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至少相当的亲和力结合ST2和IL1RAP。
在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至多相当的亲和力结合IL33受体亚基。例如，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至多相当的亲和力结合ST2、IL1RAP或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至多相当的亲和力结合ST2。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至多相当的亲和力结合IL1RAP。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL33至多相当的亲和力结合ST2和IL1RAP。
在一些实施方案中，IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL33序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与ST2结合。在一些实施方案中，IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL33序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与ST2结合。
在一些实施方案中，IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL33序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL1RAP结合。在一些实施方案中，IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL33序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL1RAP结合。
在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段可以激活天然IL33受体。天然IL33受体可以是例如包含ST2亚基和IL1RAP亚基的受体。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段当存在于融合蛋白中时可激活天然IL33受体。在一些实施方案中，本公开的IL33或IL33变体、衍生物或其片段在作为不属于融合蛋白的一部分的多肽存在时可激活天然IL33受体，但当存在于融合蛋白中时不激活天然IL33受体。
转化生长因子β1
融合蛋白可包含与白介素13或其变体或衍生物可操作地连接或直接或间接融合的TGFβ1蛋白或其变体、衍生物或片段。TGFβ1蛋白优选为哺乳动物TGFβ1蛋白，例如人TGFβ1或小鼠TGFβ1。代表TGFβ1的氨基酸序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:21。TGFβ1的变体包括例如优选在整个长度上与SEQ ID NO:7(整个或下划线部分)或SEQ IDNO:21具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如100％氨基酸序列同一性的蛋白。氨基酸序列同一性优选通过使用Needleman和Wunsch算法和如上定义的GAP默认参数的双序列比对确定。其变体、衍生物或片段还包括具有TGFβ1活性的蛋白质，其通过一个或多个氨基酸置换、缺失或插入衍生自具有SEQ ID NO:7或SEQID NO:21的氨基酸序列的多肽。优选地，此类蛋白质包含从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多至最高达约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ1(例如，TGFβ1变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的TGFβ1序列(例如，野生型TGFβ1序列)可包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少或至少50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ1(例如，TGFβ1变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的TGFβ1序列(例如，野生型TGFβ1序列)可包括至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45或至多50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ1序列(例如，TGFβ1变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的TGFβ1序列(例如，野生型TGFβ1序列)可包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ1序列(例如，TGFβ1变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的TGFβ1序列(例如野生型TGFβ1序列)可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换、缺失或插入。氨基酸置换可以是保守的或非保守的置换。一个或多个氨基酸置换、缺失或插入可以在N末端、C末端、氨基酸序列内或其组合。氨基酸置换、缺失或插入可以是连续的、非连续的或其组合。
本公开的TGFβ1可以包含野生型TGFβ1序列。野生型TGFβ1序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:7和21。规范的TGFβ1序列可以是SEQ ID NO:21。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段以与野生型TGFβ1序列大约相当的亲和力结合TGFβ1受体亚基。相当的亲和力可以是与野生型TGFβ1序列相比亲和力增加例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。相当的亲和力可以是与野生型TGFβ1序列相比亲和力降低例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。
例如，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1大约相当的亲和力结合转化生长因子β受体1(TGFβR1)、转化生长因子β受体2(TGFβR2)、活化素受体样激酶1(ALK-1)、活化素受体样激酶2(ALK-2)或它们的组合。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1大约相当的亲和力结合TGFβR1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1大约相当的亲和力结合TGFβR2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1序列大约相当的亲和力结合ALK-1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1序列大约相当的亲和力结合ALK-2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1序列大约相当的亲和力结合TGFβR1、TGFβR2、ALK-1和ALK-2。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1至少相当的亲和力结合转化生长因子β受体1(TGFβR1)、转化生长因子β受体2(TGFβR2)、活化素受体样激酶1(ALK-1)、活化素受体样激酶2(ALK-2)或它们的组合。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1至少相当的亲和力结合TGFβR1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1至少相当的亲和力结合TGFβR2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1序列至少相当的亲和力结合ALK-1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1序列至少相当的亲和力结合ALK-2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1序列至少相当的亲和力结合TGFβR1、TGFβR2、ALK-1和ALK-2。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1至多相当的亲和力结合转化生长因子β受体1(TGFβR1)、转化生长因子β受体2(TGFβR2)、活化素受体样激酶1(ALK-1)、活化素受体样激酶2(ALK-2)或它们的组合。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1至多相当的亲和力结合TGFβR1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1至多相当的亲和力结合TGFβR2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或其TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1序列至多相当的亲和力结合ALK-1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1序列至多相当的亲和力结合ALK-2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ1序列至多相当的亲和力结合TGFβR1、TGFβR2、ALK-1和ALK-2。
在一些实施方案中，TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型TGFβ1序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与TGFβR1、TGFβR2、ALK-1或ALK-2结合。在一些实施方案中，TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型TGFβ1序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与TGFβR1、TGFβR2、ALK-1或ALK-2结合。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段可以激活天然TGFβ1受体。天然TGFΒ1受体可以是例如包含TGFβR1亚基和TGFβR2亚基的受体。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段当存在于融合蛋白中时可激活天然TGFβ1受体。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1或TGFβ1变体、衍生物或其片段在作为不属于融合蛋白的一部分的多肽存在时可激活天然TGFβ1受体，但当存在于融合蛋白中时不激活天然TGFβ1受体。
转化生长因子β2
融合蛋白可包含与白介素13或其变体或衍生物可操作地连接或直接或间接融合的TGFβ2蛋白或其变体、衍生物或片段。TGFβ2蛋白优选为哺乳动物TGFβ2蛋白，例如人TGFβ2或小鼠TGFβ2。代表TGFβ2的氨基酸序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:35。TGFβ2的变体包括例如优选在整个长度上与SEQ ID NO:8(整个或下划线部分)、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:35具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如100％氨基酸序列同一性的蛋白。氨基酸序列同一性优选通过使用Needleman和Wunsch算法和如上定义的GAP默认参数的双序列比对确定。其变体、衍生物和片段还包括具有TGFβ2活性的蛋白质，其通过一个或多个氨基酸置换、缺失或插入衍生自具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:35的氨基酸序列的多肽。优选地，此类蛋白质包含从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多至最高达约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ2(例如，TGFβ2变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的TGFβ2序列(例如，野生型TGFβ2序列)可包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少或至少50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ2(例如，TGFβ2变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的TGFβ2序列(例如，野生型TGFβ2序列)可包括至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45或至多50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ2序列(例如，TGFβ2变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的TGFβ2序列(例如，野生型TGFβ2序列)可包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ2序列(例如，TGFβ2变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的TGFβ2序列(例如野生型TGFβ2序列)可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换、缺失或插入。氨基酸置换可以是保守的或非保守的置换。一个或多个氨基酸置换、缺失或插入可以在N末端、C末端、氨基酸序列内或其组合。氨基酸置换、缺失或插入可以是连续的、非连续的或其组合。
本公开的TGFβ2可以包含野生型TGFβ2序列。野生型TGFβ2序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:8、22和35。SEQ ID NO:22可以是本公开的规范野生型TGFβ2序列。
本公开的TGFβ2可以包含具有一个或多个氨基酸置换的TGFβ2变体、衍生物或其片段。例如，TGFβ2变体、衍生物或其片段可以在SEQ ID NO:22的位置R18、P36或其组合处包含氨基酸置换。在一些实施方案中，TGFβ2变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:22包含R18C、P36H或其组合的置换。在一些实施方案中，TGFβ2、其片段或衍生物相对于SEQ ID NO:22包含置换R18C和P36H。
在一些实施方案中，TGFβ2变体、衍生物或其片段在相对于SEQ ID NO:22的位置R18或P36处不包含置换。在一些实施方案中，TGFβ2变体、衍生物或其片段不包含R18C或P36H置换。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段以与野生型TGFβ2序列大约相当的亲和力结合TGFβ2受体亚基。相当的亲和力可以是与野生型TGFβ2序列相比亲和力增加例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。相当的亲和力可以是与野生型TGFβ2序列相比亲和力降低例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。
例如，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2大约相当的亲和力结合转化生长因子β受体1(TGFβR1)、转化生长因子β受体2(TGFβR2)、活化素受体样激酶1(ALK-1)、活化素受体样激酶2(ALK-2)或它们的组合。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2大约相当的亲和力结合TGFβR1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2大约相当的亲和力结合TGFβR2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2序列大约相当的亲和力结合ALK-1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2序列大约相当的亲和力结合ALK-2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2序列大约相当的亲和力结合TGFβR1、TGFβR2、ALK-1和ALK-2。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2至少相当的亲和力结合转化生长因子β受体1(TGFβR1)、转化生长因子β受体2(TGFβR2)、活化素受体样激酶1(ALK-1)、活化素受体样激酶2(ALK-2)或它们的组合。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2至少相当的亲和力结合TGFβR1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以至少与野生型TGFβ2相当的亲和力结合TGFβR2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2序列至少相当的亲和力结合ALK-1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2序列至少相当的亲和力结合ALK-2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2序列至少相当的亲和力结合TGFβR1、TGFβR2、ALK-1和ALK-2。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2至多相当的亲和力结合转化生长因子β受体1(TGFβR1)、转化生长因子β受体2(TGFβR2)、活化素受体样激酶1(ALK-1)、活化素受体样激酶2(ALK-2)或它们的组合。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2至多相当的亲和力结合TGFβR1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2至多相当的亲和力结合TGFβR2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2序列至多相当的亲和力结合ALK-1。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2序列至多相当的亲和力结合ALK-2。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以与野生型TGFβ2序列至多相当的亲和力结合TGFβR1、TGFβR2、ALK-1和ALK-2。
在一些实施方案中，TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型TGFβ2序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与TGFβR1、TGFβR2、ALK-1或ALK-2结合。在一些实施方案中，TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型TGFβ2序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与TGFβR1、TGFβR2、ALK-1或ALK-2结合。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段可以激活天然TGFβ2受体。天然TGFβ2受体可以是例如包含TGFβR1亚基和TGFβR2亚基的受体。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段当存在于融合蛋白中时可激活天然TGFβ2受体。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2或TGFβ2变体、衍生物或其片段在作为不属于融合蛋白的一部分的多肽存在时可激活天然TGFβ2受体，但当存在于融合蛋白中时不激活天然TGFβ2受体。
白介素27
融合蛋白可包含与白介素13或其变体或衍生物可操作地连接或直接或间接融合的IL27蛋白或其变体、衍生物或片段。IL27蛋白优选为哺乳动物IL27蛋白，例如人IL27或小鼠IL27，或其变体、衍生物或片段。本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可包含IL27A亚基、IL27B(EBI3)亚基或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL27包含IL27A亚基。在一些实施方案中，本公开的IL27包含如下公开的变体IL27A亚基(例如，如SEQ ID NO:18中提供的)。在一些实施方案中，本公开的IL27包含IL27B亚基。
代表IL27A的氨基酸序列的实例在SEQ ID NO:36中列出。代表IL27B的氨基酸序列的实例在SEQ ID NO:45中列出。IL27的变体包括例如优选在整个长度上与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:45具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如100％氨基酸序列同一性的蛋白。氨基酸序列同一性优选通过使用Needleman和Wunsch算法和如上定义的GAP默认参数的双序列比对确定。其变体、衍生物和片段还包括具有IL27活性的蛋白质，其通过一个或多个氨基酸置换、缺失或插入衍生自具有SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:45的氨基酸序列的多肽。优选地，此类蛋白质包含从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多至最高达约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL27(例如，IL27变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL27序列(例如，野生型IL27序列)可包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少或至少50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL27(例如，IL27变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL27序列(例如，野生型IL27序列)可包括至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25、至多30、至多35、至多40、至多45或至多50个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL27序列(例如，IL27变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL27序列(例如，野生型IL27序列)可包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25个氨基酸置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，本公开的IL27序列(例如，IL27变体、衍生物或其片段)相对于本文公开的IL27序列(例如野生型IL27序列)可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换、缺失或插入。氨基酸置换可以是保守的或非保守的置换。一个或多个氨基酸置换、缺失或插入可以在N末端、C末端、氨基酸序列内或其组合。氨基酸置换、缺失或插入可以是连续的、非连续的或其组合。
本公开的IL27可以包含野生型IL27序列。野生型IL27序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:36(IL27A)和SEQ ID NO:45(IL27B)。SEQ ID NO:36可以是规范的野生型IL27序列。在一些实施方案中，本公开的IL27序列相对于野生型IL27序列包含一个置换。
本公开的IL27变体、衍生物或其片段的实例是可以作为功能性免疫调节单体蛋白分泌的IL27变体序列，例如，一种IL27A变体、衍生物或其片段，其可以分泌并作为功能性免疫调节单体蛋白发挥作用，而无需与IL27B(EBI3)亚基结合。可以引入一个或多个氨基酸置换、缺失或插入以产生这样的分子。SEQ ID NO:18是本公开的IL27变体、衍生物或其片段的实例，相对于SEQ ID NO:36(其是包含信号肽的序列中的L162C)包含一个氨基酸置换L134C，并且可以作为功能性免疫调节单体蛋白分泌。
本公开的IL27可以包含具有一个或多个氨基酸置换的IL27变体、衍生物或其片段。例如，IL27变体、衍生物或其片段可包含在SEQ ID NO:36的位置F132、N132、L134、P135、E136、E137、L152、L153、P154或其组合处的氨基酸置换。在一些实施方案中，IL27变体、衍生物或其片段相对于SEQ ID NO:36包含如下置换：F132C、N132C、L134C、P135C、E136C、E137C、L152C、L153C、P154C、F132D、N132D、L134D、P135D、E136D、E137D、L152D、L153D、P154D、F132E、N132E、L134E、P135E、E136E、E137E、L152E、L153E、P154E、F132R、N132R、L134R、P135R、E136R、E137R、L152R、L153R、P154R、F132K、N132K、L134K、P135K、E136K、E137K、L152K、L153K、P154K、S31A、L91P或其组合。
在一些实施方案中，IL27变体、衍生物或其片段在相对于SEQ ID NO:36的位置F132、N132、L134、P135、E136、E137、L152、L153或P154处不包含置换。在一些实施方案中，IL27变体、衍生物或其片段不包含F132C、N132C、L134C、P135C、E136C、E137C、L152C、L153C、P154C、F132D、N132D、L134D、P135D、E136D、E137D、L152D、L153D、P154D、F132E、N132E、L134E、P135E、E136E、E137E、L152E、L153E、P154E、F132R、N132R、L134R、P135R、E136R、E137R、L152R、L153R、P154R、F132K、N132K、L134K、P135K、E136K、E137K、L152K、L153K、P154K、S31A或L91P置换。
在一些实施方案中，本公开的IL27或其IL27变体、衍生物或其片段以与野生型IL27序列大约相当的亲和力结合IL27受体亚基。相当的亲和力可以是与野生型IL27序列相比亲和力增加例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。相当的亲和力可以是与野生型IL27序列相比亲和力降低例如小于约10、小于约5、小于约2、小于约1.9、小于约1.8、小于约1.7、小于约1.6、小于约1.5、小于约1.4倍、小于约1.3倍、小于约1.2倍或小于约1.1倍。
例如，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27大约相当的亲和力结合白介素27受体α(IL-27RA)、gp130或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27大约相当的亲和力结合IL-27RA。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27大约相当的亲和力结合gp130。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27大约相当的亲和力结合IL-27RA和gp130。
在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27至少相当的亲和力结合IL27受体亚基。例如，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或片段可以以与野生型IL27至少相当的亲和力结合IL-27RA、gp130或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27至少相当的亲和力结合IL-27RA。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27至少相当的亲和力结合gp130。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27至少相当的亲和力结合IL-27RA和gp130。
在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27至多相当的亲和力结合IL27受体亚基。例如，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或片段可以以与野生型IL27至多相当的亲和力结合IL-27RA、gp130或其组合。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27至多相当的亲和力结合IL-27RA。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27至多相当的亲和力结合gp130。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以与野生型IL27至多相当的亲和力结合IL-27RA和gp130。
在一些实施方案中，IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL27序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-27RA结合。在一些实施方案中，IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL27序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与IL-27RA结合。
在一些实施方案中，IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL27序列增加至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力gp130 A结合。在一些实施方案中，IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以以相对于野生型IL27序列降低至少约1.5倍、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍的亲和力与gp130结合。
在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段可以激活天然IL27受体。天然IL27受体可以是例如包含IL-27RA亚基和gp130亚基的受体。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段当存在于融合蛋白中时可激活天然IL27受体。在一些实施方案中，本公开的IL27或IL27变体、衍生物或其片段在作为不属于融合蛋白的一部分的多肽存在时可激活天然IL27受体，但当存在于融合蛋白中时不激活天然IL27受体。
融合蛋白
本公开提供了包含直接或间接连接至调节性细胞因子例如IL4、IL10、IL27、IL33、TGFβ1、TGFβ2或另一个IL13的白介素13(IL13)的融合蛋白。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可以与细胞表面存在的受体结合并与约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个或约12个受体亚基(例如，多肽链)形成复合物。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可以与细胞表面上存在的受体结合并与至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个受体亚基(例如，多肽链)形成复合物。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可以与存在于细胞表面的受体结合并与至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个或至多12个受体亚基(例如，多肽链)形成复合物。
融合蛋白中的IL4(或IL10或IL13或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)和IL13可以或可以不通过接头，例如接头序列，或通过化学间隔区连接。
接头可以是肽。接头可包含接头序列，例如接头肽序列。接头序列的长度可以是，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸残基。
如本文所述的接头可包括柔性接头或刚性接头。柔性接头可以具有包含甘氨酸和丝氨酸残基区段的序列。甘氨酸和丝氨酸残基的小尺寸提供了灵活性，并允许连接的功能结构域移动。丝氨酸或苏氨酸的掺入可以通过与水分子形成氢键来保持接头在水溶液中的稳定性，从而减少接头和蛋白质部分之间不利的相互作用。柔性接头还可以包含另外的氨基酸(如苏氨酸和丙氨酸)以保持柔性，以及极性氨基酸(如赖氨酸和谷氨酰胺)以提高溶解度。
柔性接头可包含SEQ ID NO:3。柔性接头可包含SEQ ID NO:37(GGGS)的重复序列，例如SEQ ID NO:37的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复序列。柔性接头可包含SEQ ID NO:38(GGGGS)的重复序列，例如SEQ ID NO:38的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复序列。也可以使用几种其他类型的柔性接头，包括SEQ ID NO:40(KESGSVSSEQLAQFRSLD)和SEQ ID NO:41(EGKSSGSGSESKST)。也可以使用SEQ ID NO:42(GSAGSAAGSGEF)接头，其中大的疏水残基被最小化以保持在水溶液中的良好溶解度。可以调整柔性接头的长度以允许正确折叠或实现融合蛋白的最佳生物活性。
刚性接头可具有例如α螺旋结构。α-螺旋刚性接头可以用作蛋白质结构域之间的间隔序列。刚性接头可包含SEQ ID NO:43(EAAAK)的重复序列，例如SEQ ID NO:43的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复序列。刚性接头可包含SEQ ID NO:44(EAAAR)的重复序列，例如SEQID NO:44的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复序列。刚性接头可具有富含脯氨酸的序列(XP)n，其中X表示丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或任何氨基酸。非螺旋接头中脯氨酸的存在可以增加刚度，并允许有效分离蛋白质结构域。
本公开的接头可以包括非肽接头，例如化学接头。例如，本公开的两个氨基酸序列可以通过化学接头连接。本公开的每个化学接头可以是亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、亚环烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基，其中任何一个任选地被取代。在一些实施方案中，本公开的化学接头可以是酯、醚、酰胺、硫醚或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，接头可以颠倒化合物中氨基酸序列的顺序，例如，使得通过接头连接的氨基酸序列是头对头的，而不是头对尾的。此类接头的非限制性实例包括二羧酸的二酯，例如草酰二酯、丙二酰二酯、琥珀酰二酯、戊二酰二酯、己二酰二酯、庚二酰二酯、富马酰二酯、马来酰二酯、邻苯二甲酰二酯、间苯二甲酰二酯和对苯二甲酰二酯。此类接头的非限制性实例包括二羧酸的二酰胺，例如草酰二酰胺、丙二酰二酰胺、琥珀酰二酰胺、戊二酰二酰胺、己二酰二酰胺、庚二酰二酰胺、富马酰二酰胺、马来酰二酰胺、邻苯二甲酰二酰胺、间苯二甲酰二酰胺和对苯二甲酰二酰胺。此类接头的非限制性实例包括二氨基接头的二酰胺，例如乙二胺、1,2-二(甲基氨基)乙烷、1,3-二氨基丙烷、1,3-二(甲基氨基)丙烷、1,4-二(甲基氨基)丁烷、1,5-二(甲基氨基)戊烷、1,6-二(甲基氨基)己烷和哌嗪(pipyrizine)。任选取代基的非限制性实例包括羟基、巯基、卤素、氨基、硝基、亚硝基、氰基、叠氮基、亚砜基、砜基、磺酰胺基、羧基、甲醛基、亚胺基、烷基、卤代烷基、烯基、卤代烯基、炔基、卤代炔基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷基、芳基烷氧基、杂环基、酰基、酰氧基、氨基甲酸酯基、酰胺基、脲基、环氧基和酯基。
在一些实施方案中，多肽序列的N末端可连接至另一多肽的N末端。在一些实施方案中，多肽序列的C末端可以连接到另一多肽的C末端。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白不包含接头。
氨基酸可包括遗传编码地和非遗传编码地存在的氨基酸。氨基酸可包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。氨基酸可以是L型或D型。置换可包括保守和/或非保守氨基酸置换。保守氨基酸置换可以是一个氨基酸置换为具有相似生化特性(例如，电荷、大小和/或疏水性)的另一个氨基酸。非保守氨基酸置换可以是一个氨基酸置换为具有不同生化特性(例如，电荷、大小和/或疏水性)的另一个氨基酸。保守氨基酸变化可以是例如对多肽的二级或三级结构影响最小的置换。保守氨基酸变化可以是从一个亲水性氨基酸到另一个亲水性氨基酸的氨基酸变化。亲水性氨基酸可包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。保守氨基酸变化可以是从一个疏水性氨基酸到另一个亲水性氨基酸的氨基酸变化。疏水性氨基酸可包括Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)、Tyr(Y)、和Pro(P)。保守氨基酸变化可以是从一个酸性氨基酸到另一个酸性氨基酸的氨基酸变化。酸性氨基酸可包括Glu(E)和Asp(D)。保守氨基酸变化可以是从一个碱性氨基酸到另一个碱性氨基酸的氨基酸变化。碱性氨基酸可包括His(H)、Arg(R)和Lys(K)。保守氨基酸变化可以是从一个极性氨基酸到另一个极性氨基酸的氨基酸变化。极性氨基酸可包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。保守氨基酸变化可以是从一个非极性氨基酸到另一个非极性氨基酸的氨基酸变化。非极性氨基酸可包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。保守氨基酸变化可以是从一个芳香族氨基酸到另一个芳香族氨基酸的氨基酸变化。芳香族氨基酸可包括Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。保守氨基酸变化可以是从一个脂肪族氨基酸到另一个脂肪族氨基酸的氨基酸变化。脂肪族氨基酸可包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。在一些实施方案中，保守氨基酸置换是以下组之一内从一个氨基酸到另一个氨基酸的氨基酸变化：组I：ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；组II：cys、ser、tyr、thr；组III：val、ile、leu、met、ala、phe；组IV：lys、arg、his；组V：phe、tyr、trp、his；和组VI：asp、glu。
另外的氨基酸序列可以存在于本发明融合蛋白的N末端和/或C末端，例如，促进纯化的亲和标签。例如，多组氨酸标签、GST标签、FLAG标签、CBP标签、HA标签或Myc标签可存在于C末端或N末端以促进纯化。在一些实施方案中，例如在纯化后，从本公开的融合蛋白去除亲和标签。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白不包含亲和标签，(例如，融合蛋白可以通过其他方法纯化)。另外或可替代地，本发明的融合蛋白可以任选地包含另外的蛋白质部分，例如能够靶向的部分，例如包含一个或多个抗体Fc区的蛋白质部分。在一些实施方案中，融合蛋白包含抗体Fc区。在一些实施方案中，融合蛋白包含细胞外基质结合多肽。
IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)可位于IL13的N末端，或可位于IL13的C末端。在一个优选的实施方案中，IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)分子位于IL13分子的N末端。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白基本上由任选地通过接头序列连接的IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)和IL13组成。
在一个实施方案中，如通过测量β3-微管蛋白染色后的神经突长度量化的那样，本发明的融合蛋白防止或减少对在奥沙利铂或紫杉醇存在下过夜培养的初级感觉神经元的神经元损伤。
在合适的实施方案中，本发明的融合蛋白以单体形式存在、纯化成单体形式和/或以单体形式使用。在一个实施方案中，它具有30至37kDa的分子量。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白以多聚体形式存在、纯化成多聚体形式和/或以多聚体形式使用，例如二聚体形式或四聚体形式。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白以单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任意组合存在、纯化成单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任意组合和/或作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任意组合使用。二聚体、三聚体、四聚体或多聚体可包含共价或非共价结合的亚基。
在一些实施方案中，本公开的IL4/IL13融合蛋白作为单体存在、纯化成单体和/或作为单体使用。在一些实施方案中，本公开的IL4/IL13融合蛋白作为二聚体存在、纯化成二聚体和/或作为二聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL4/IL13融合蛋白以三聚体存在、纯化成三聚体和/或作为三聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL4/IL13融合蛋白以四聚体存在、纯化成四聚体和/或作为四聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL4/IL13融合蛋白以多聚体存在、纯化成多聚体和/或作为多聚体使用。在一些实施方案中，IL4/IL13融合蛋白作为单体和二聚体存在、纯化成单体和二聚体和/或作为单体和二聚体使用。在一些实施方案中，IL4/IL13融合蛋白作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合存在，纯化成单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合和/或作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合使用。
在一些实施方案中，本公开的IL10/IL13融合蛋白作为单体存在、纯化成单体和/或作为单体使用。在一些实施方案中，本公开的IL10/IL13融合蛋白作为二聚体存在、纯化成二聚体和/或作为二聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL10/IL13融合蛋白以三聚体存在、纯化成三聚体和/或作为三聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL10/IL13融合蛋白以四聚体存在、纯化成四聚体和/或作为四聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL10/IL13融合蛋白以多聚体存在、纯化成多聚体和/或作为多聚体使用。在一些实施方案中，10/IL13融合蛋白作为单体和二聚体存在、纯化成单体和二聚体和/或作为单体和二聚体使用。在一些实施方案中，IL10/IL13融合蛋白作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合存在，纯化成单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合和/或作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合使用。
在一些实施方案中，本公开的IL13/IL13融合蛋白作为单体存在、纯化成单体和/或作为单体使用。在一些实施方案中，本公开的IL13/IL13融合蛋白作为二聚体存在、纯化成二聚体和/或作为二聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL13/IL13融合蛋白作为三聚体存在、纯化成三聚体和/或作为三聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL13/IL13融合蛋白作为四聚体存在、纯化成四聚体和/或作为四聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL13/IL13融合蛋白作为多聚体存在、纯化成多聚体和/或作为多聚体使用。在一些实施方案中，IL10/IL13融合蛋白作为单体和二聚体存在、纯化成单体和二聚体和/或作为单体和二聚体使用。在一些实施方案中，IL10/IL13融合蛋白作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合存在、纯化成单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合和/或作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合使用。
在一些实施方案中，本公开的IL27/IL13融合蛋白作为单体存在、纯化成单体和/或作为单体使用。在一些实施方案中，本公开的IL27/IL13融合蛋白作为二聚体存在、纯化成二聚体和/或作为二聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL27/IL13融合蛋白作为三聚体存在、纯化成三聚体和/或作为三聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL27/IL13融合蛋白作为四聚体存在、纯化成四聚体和/或作为四聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL27/IL13融合蛋白作为多聚体存在、纯化成多聚体和/或作为多聚体使用。在一些实施方案中，IL27/IL13融合蛋白作为单体和二聚体存在、纯化成单体和二聚体和/或作为单体和二聚体使用。在一些实施方案中，IL27/IL13融合蛋白作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合存在，纯化成单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合和/或作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合使用。
在一些实施方案中，本公开的IL33/IL13融合蛋白作为单体存在、纯化成单体和/或作为单体使用。在一些实施方案中，本公开的IL33/IL13融合蛋白作为二聚体存在、纯化成二聚体和/或作为二聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL33/IL13融合蛋白作为三聚体存在、纯化成三聚体和/或作为三聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL33/IL13融合蛋白作为四聚体存在、纯化成四聚体和/或作为四聚体使用。在一些实施方案中，本公开的IL33/IL13融合蛋白作为多聚体存在、纯化成多聚体和/或作为多聚体使用。在一些实施方案中，IL33/IL13融合蛋白作为单体和二聚体存在、纯化成单体和二聚体和/或作为单体和二聚体使用。在一些实施方案中，IL33/IL13融合蛋白作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合存在，纯化成单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合和/或作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任何组合使用。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ1/IL13融合蛋白作为单体存在、纯化成单体和/或作为单体使用。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1/IL13融合蛋白作为二聚体存在、纯化成二聚体和/或作为二聚体使用。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1/IL13融合蛋白作为三聚体存在、纯化成三聚体和/或作为三聚体使用。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1/IL13融合蛋白作为四聚体存在、纯化成四聚体和/或作为四聚体使用。在一些实施方案中，本公开的TGFβ1/IL13融合蛋白作为多聚体存在、纯化成多聚体和/或作为多聚体使用。在一些实施方案中，TGFβ1/IL13融合蛋白作为单体和二聚体存在、纯化成单体和二聚体和/或作为单体和二聚体使用。在一些实施方案中，TGFβ1/IL13融合蛋白作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任意组合存在，纯化成单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任意组合和/或作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任意组合使用。
在一些实施方案中，本公开的TGFβ2/IL13融合蛋白作为单体存在、纯化成单体和/或作为单体使用。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2/IL13融合蛋白作为二聚体存在、纯化成二聚体和/或作为二聚体使用。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2/IL13融合蛋白作为三聚体存在、纯化成三聚体和/或作为三聚体使用。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2/IL13融合蛋白作为四聚体存在、纯化成四聚体和/或作为四聚体使用。在一些实施方案中，本公开的TGFβ2/IL13融合蛋白作为多聚体存在、纯化成多聚体和/或作为多聚体使用。在一些实施方案中，TGFβ2/IL13融合蛋白作为单体和二聚体存在、纯化成单体和二聚体和/或作为单体和二聚体使用。在一些实施方案中，TGFβ2/IL13融合蛋白作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任意组合存在，纯化成单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任意组合和/或作为单体、二聚体、三聚体、四聚体、多聚体或其任意组合使用。
制备方法
本发明的融合蛋白可以通过技术人员常规的技术制备。例如，它可以使用通过培养的连续细胞系产生重组融合蛋白的技术来制备。例如，可以使用重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生本发明的融合蛋白。
例如，为了表达本发明的融合蛋白，可以通过标准分子生物学技术制备编码本发明融合蛋白的核酸分子。本发明的核酸分子优选与转录调控序列如启动子和任选的3’非翻译区可操作地连接。本发明的核酸分子可以插入载体，例如表达载体，使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和转录调控序列。可以通过常规方法将编码本发明融合蛋白的核酸分子插入到表达载体中。本发明的核酸分子或载体可进一步包括编码信号肽的核苷酸序列，其可促进融合蛋白从宿主细胞分泌。所述编码信号肽的核苷酸序列可以与本发明的核酸分子可操作地连接。优选地，所述信号肽位于本发明融合蛋白的氨基末端，因此，编码所述信号肽的核苷酸序列可以位于编码本发明融合蛋白的核酸分子的5’。信号肽可以是细胞因子信号肽或来自非细胞因子蛋白的信号肽。成熟形式的融合蛋白上可能不存在信号肽。启动子可以是组成型的或诱导型的。载体可包含用于选择携带载体的宿主细胞的可选择标记。当载体是可复制载体时，载体可包含复制起点。
本发明的融合蛋白可以通过化学合成从头合成(使用例如由Applied Biosystems提供的肽合成仪)或可以通过表达编码融合蛋白、片段衍生物或变体的核酸序列由重组宿主细胞产生。变体和片段优选是功能性的，即，它们结合至少一个、两个、三个、四个或所有相应的膜受体或受体亚基并具有IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)和/或IL13活性，优选IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)和IL13活性。
IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)和IL13的功能活性，以及包含IL4(或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2)和IL13的融合蛋白的功能活性可以使用本领域技术人员已知的常规方法确定。例如，IL4以及包含IL4(或IL10)和IL13的融合蛋白的功能性的合适测定是任选地在抗IL10抗体的存在下，全血中的脂多糖(LPS)诱导的细胞因子释放(IL1、IL6、IL8、TNFα)。功能活性还可以通过评估在存在或不存在针对融合蛋白的细胞因子部分或其受体的阻断性抗体的情况下将靶细胞与融合蛋白一起孵育时细胞内信号传导通路的激活来确定。
在另一方面，提供了编码任何上述融合蛋白的分离的核酸序列，例如cDNA、基因组DNA和RNA序列。由于遗传密码的简并性，不同的核酸序列可以编码相同的氨基酸序列。编码本发明的融合蛋白的任何核酸序列在本文中称为“IL4/IL13(或IL10/IL13、IL27/IL13、IL33/IL13、TGFβ1/IL13、TGFβ2/IL13、IL13/IL13)编码核酸序列”。所提供的核酸序列包括重组的、人工的或合成的核酸序列。可以理解，当序列被描述为DNA序列而提到RNA时，RNA分子的实际碱基序列是相同的，其中区别是胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)替代。本发明的核酸序列特别适用于表达本发明的IL4/IL13(或IL10/IL13、IL27/IL13、IL33/IL13、TGFβ1/IL13、TGFβ2/IL13、IL13/IL13)融合蛋白，适用于生产这些蛋白质，或适用于基因治疗目的。
编码本发明的IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白的核酸序列，特别是DNA序列可插入产生(例如，大量)IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13，或IL13/IL13)融合蛋白的表达载体。合适的载体包括但不限于线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒、RNA载体、病毒载体等。病毒载体的非限制性实例包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子。
除了编码IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白的核酸分子和调控序列，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见例如，Axel等人的US 4,399,216、US 4,634,665和US 5,179,017)。例如，通常可选择标记基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。最后，除了编码本发明融合蛋白的核酸序列之外，重组表达载体还可包含编码糖基转移酶的基因。
在另一方面，本发明涉及包含本发明核酸序列的宿主细胞，或包含本发明核酸序列的核酸构建体或载体。宿主细胞可以是任何宿主细胞。宿主细胞可以选自原核细胞和真核细胞。宿主细胞也可以是细胞系，例如原核细胞系或真核细胞系。宿主细胞优选为动物细胞或细胞系，例如哺乳动物细胞或细胞系。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中表达。用于表达本发明融合蛋白的优选哺乳动物宿主细胞包括与DHFR可选择标记一起使用的CHO细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于(Urlaub等人，1980)，NS/0骨髓瘤细胞，COS细胞，HEK293细胞，PER.C6细胞，SP2.0细胞或其他细胞。当包含编码本发明的融合蛋白的核酸序列的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，本发明的融合蛋白可以通过以下来产生：将宿主细胞培养足以允许融合蛋白在宿主细胞中表达，或更优选地允许融合蛋白分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中的时间段。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收本发明的融合蛋白。
可替代地，编码本发明融合蛋白的核酸序列可以在其他表达系统中表达，所述其他系统包括原核细胞，例如微生物，例如大肠杆菌，或藻类表达系统、昆虫细胞表达系统或无细胞蛋白质合成系统。此外，本发明的融合蛋白可以在转基因非人动物中产生，例如在来自绵羊和兔的奶或来自母鸡的蛋中，或在转基因植物中产生。
可以通过本领域已知的任何标准技术将本发明的核酸序列引入宿主细胞。为了表达本发明的融合蛋白，可以通过标准技术将编码融合蛋白的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、lipofectamine转染和冻干法转染等。分泌本发明的融合蛋白的细胞系可以通过测定培养上清液中融合蛋白的存在来鉴定。优选的筛选程序包括两个连续的步骤，第一个是鉴定分泌融合蛋白的细胞系，第二个是确定融合蛋白的质量(例如融合蛋白抑制由LPS或其他Toll样受体激动剂刺激的血细胞产生细胞因子的能力)、糖基化模式等。
为了在宿主细胞中最佳表达，编码本公开的融合蛋白(例如，IL4/IL13或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13融合蛋白)可以通过使密码子使用适应宿主细胞基因中最优选的密码子使用来进行密码子优化。在专利和科学文献中可以找到几种将密码子使用修改为宿主细胞偏好的密码子使用的技术。密码子使用修饰的确切方法对于本发明并不重要。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于检测IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白编码DNA或RNA序列的PCR引物和/或探针和试剂盒。可以合成来自样品的用于扩增IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白编码DNA的简并或特异性PCR引物对(参见Dieffenbach and Dveksler(1995)PCR Primer:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,和McPherson等人(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,第一版,Springer Verlag,德国)。例如，IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白编码核酸序列(或互补链)的9、10、11、12、13、14、15、16、18个或更多个连续核苷酸)的任何一段可用作引物或探针。同样，IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白编码核酸序列的DNA片段可用作杂交探针。IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白编码核酸序列的检测试剂盒可包含IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白编码核酸序列的特异性引物和/或IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白编码核酸序列的特异性探针，和相关的方案以使用引物或探针特异性地检测样品中IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白编码核酸序列。例如，此类检测试剂盒可用于确定宿主细胞是否已用本发明的特异性IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白编码核酸序列转化。由于遗传密码的简并性，在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下，某些氨基酸密码子可以被其他密码子替换。
在一个方面，本发明涉及产生本公开的融合蛋白(例如IL4/IL13或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13融合蛋白)的方法，所述方法包括以下步骤：在允许产生融合蛋白(例如，IL4/IL13或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13融合蛋白)的条件下培养本发明的宿主细胞；并且任选地，回收融合蛋白。技术人员将能够常规选择允许产生IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白的条件。另外，本领域技术人员将能够回收使用常规方法产生的融合蛋白，所述常规方法包括但不限制于，色谱方法(包括但不限制于尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱、金属结合等等)，免疫沉淀、HPLC、高速离心、沉淀和差异溶解和提取。如上所述，可以通过向融合蛋白添加例如His标签来促进融合蛋白的回收或纯化。
药物组合物
在一个方面，本发明涉及包含本发明的融合蛋白和药学上可接受的载剂的药物组合物。
药物组合物可以用药学上可接受的载剂或稀释剂以及任何其他已知的辅助剂和赋形剂根据常规技术来配制(例如，如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第19版,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995中所述)。
术语“药学上可接受的载剂”是指载剂或赋形剂，它们本质上是无毒和非治疗性的。此类赋形剂的实例是但不限于盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液。
药物组合物可以通过任何合适的途径和方式施用。本领域技术人员将理解，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。
根据本发明的药物组合物可以根据常规程序进行配制以供任何途径施用，优选肠胃外施用。组合物可以是液体制剂的形式，例如口服或无菌肠胃外溶液或悬浮液。
本发明的药物组合物包括适合任何形式的肠胃外施用的药物组合物。
在一个实施方案中，药物组合物经肠胃外施用。
如本文所用，短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常是通过注射，并包括通过但不限制于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内和器官实质内，例如，注射和输注。
在一个实施方案中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注施用。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白通过皮下注射以结晶形式施用。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则可考虑将其用于本发明的药物组合物中。优选地，载剂适用于肠胃外施用，例如静脉内或皮下注射或输注。
药物组合物通常必须在生产和储存条件下是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。可用于本发明药物组合物中的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，如橄榄油和可注射的有机酯，如乙酸乙酯。恰当的流动性可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的粒径来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：视需要将活性化合物以所需量与例如如上文所列举成分中的一种或组合并入适当溶剂中，之后进行灭菌微孔过滤。通常，分散体通过以下来制备：将活性化合物并入含有基本分散介质和例如来自上文所列举的那些的所需其他成分的无菌媒剂中。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从活性成分加上任何另外的所需成分的事先经无菌过滤的溶液产生所述活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。
取决于施用途径，活性化合物，即IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白，可以用材料包被，以保护它免受酸和其他可能使化合物失活的自然条件的影响。例如，化合物可以在合适的载剂例如脂质体中施用于受试者。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等人，1984)。
本发明的融合蛋白也可以与载剂一起制备，这些载剂将防止融合蛋白快速释放，如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备此类制剂的方法是是本领域技术人员通常已知的。参见，例如，Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,纽约,1978。
本公开的药物组合物可以是本文所述的任何药物化合物与其他化学组分(如载剂、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂)的组合。药物组合物有助于将化合物施用于生物体。
用于施用的药物制剂可以包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。活性化合物的悬浮液可以制备成油性注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加该悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂以允许制备高浓度溶液。活性成分可以是粉末形式，以便在使用前用合适的载剂，例如无菌无热原水配制。
在实施本文提供的治疗方法或用途时，将治疗有效量的本文所述化合物以药物组合物施用于患有待治疗的疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(如人)。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力以及其他因素而广泛变化。
药物组合物可以使用一种或多种药学上可接受的载剂(包含赋形剂和助剂，它们促进了将这些活性化合物加工成药学上可使用的制剂)来配制。可以根据所选择的施用途径来修饰制剂。包含本文所述化合物的药物组合物可通过例如混合、溶解、乳化、包封、包埋或压缩过程来制备。
药物组合物可以包括至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂、以及呈游离碱或药学上可接受的盐形式的本文所述的化合物。药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
制备组合物(其包含本文所述的化合物)的方法包括用一种或多种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载剂配制化合物，以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括例如粉末、可分散颗粒和扁囊剂。液体组合物包括例如其中溶解有化合物的溶液、包含化合物的乳液或包含含有本文公开的化合物的脂质体、胶束或纳米颗粒的溶液。半固体组合物包括例如凝胶、悬浮液和乳膏。组合物可以是液体溶液或悬浮液、适合在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或作为乳液。这些组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和其它药学上可接受的添加剂。
适用于本公开的剂型的非限制性实例包括液体、粉末、凝胶、纳米悬浮液、纳米颗粒、微凝胶、水性或油性悬浮液、乳液及其任何组合。
适用于本公开的药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括粘合剂、崩解剂、抗粘剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、抗微生物剂、滚圆剂(spheronization agent)及其任何组合。
药学上可接受的载剂的非限制性实例包括盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。在一些实施方案中，溶液的pH可为约5至约8，并且可为约7至约7.5。其他载剂包括缓释制剂，例如含有该化合物的固体疏水聚合物的半透性基质。基质可以是成型制品的形式，例如薄膜、脂质体、微粒或微胶囊。
所公开的组合物的pH值可以在约3至约12的范围内。组合物的pH可以是例如约3至约4、约4至约5、约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9、约9至约10、约10至约11或约11至约12个pH单位。组合物的pH可为例如约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个pH单位。组合物的pH可以是例如至少3、至少4、至少5、至少6、至少6.2、至少6.4、至少6.6、至少6.8、至少7、至少7.2、至少7.4、至少7.6、至少7.8、至少8、至少9、至少10、至少11或至少12个pH单位。组合物的pH可以是例如至多3、至多4、至多5、至多6、至多6.2、至多6.4、至多6.6、至多6.8、至多7、至多7.2、至多7.4、至多7.6、至多7.8、至多8、至多9、至多10、至多11或至多12个pH单位。本文公开的药物制剂可具有约5.5至约8.5的pH。
本公开的制剂可包含糖、醇、抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。这些组合物还可包含防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以防止微生物对主题化合物的作用。还希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来延长可注射药物形式的吸收。如果需要，可以在使用前用例如等渗盐水溶液或葡萄糖溶液稀释制剂。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含与药学上可接受的载剂和/或赋形剂例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲液、防腐剂和其他蛋白质混合的治疗有效量的化合物(例如融合蛋白)。示例性的试剂包括辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、葡聚糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏和汉克氏溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯和乙二醇。
在一些实施方案中，本文公开的药物制剂可包含：(i)本文公开的化合物或融合蛋白；(ii)缓冲液；(iii)非离子洗涤剂；(iv)张力剂；和(v)稳定剂。在一些实施方案中，本文公开的药物制剂是稳定的液体药物制剂。
对于固体组合物，固体载剂包括例如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。
药物载剂或赋形剂可以是溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，其是生理相容性的。载剂可以适合通过本文公开的途径(例如，肠胃外)施用。
本发明的组合物可以是例如立即释放形式或控释制剂。可以配制立即释放制剂以允许化合物快速起作用。立即释放制剂的非限制性实例包括易溶解的制剂。控释制剂可以是一种药物制剂，其经过调整使得活性剂的释放速率和释放曲线可以与生理和时间治疗要求相匹配，或者可替代地，已经配制为以程序化速率实现活性剂的释放。控释制剂的非限制性实例包括颗粒剂、延迟释放颗粒剂、水凝胶(例如合成或天然来源的)、其他胶凝剂(例如形成凝胶的膳食纤维)、基于基质的制剂(例如包含聚合物材料的制剂，该聚合物材料具有分散于其中的至少一种活性成分)、基质内的颗粒剂、聚合物混合物和颗粒团。
在一些实施方案中，本公开的制剂包含热稳定剂，例如糖或糖醇，例如蔗糖、山梨糖醇、甘油、海藻糖或甘露糖醇，或其任何组合。在一些实施方案中，稳定剂是糖。在一些实施方案中，糖是蔗糖、甘露醇或海藻糖。
药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可以例如在Remington：The Science andPractice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.,编辑,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,纽约,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，其中每一个的全文通过引用并入。
药物组合物可以以局部方式施用，例如通过将化合物直接注射到器官中，任选地以贮库或缓释制剂或植入物的形式。药物组合物可以以快速释放制剂的形式、以延长释放制剂的形式或以中等释放制剂的形式提供。快速释放形式可以提供立即释放。延长释放制剂可提供控释或缓释。
在一些实施方案中，泵可用于递送药物组合物。在一些实施方案中，笔式递送装置可用于例如皮下递送本公开的组合物。此类的笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置可使用包含本文公开的药物组合物的可更换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物已被施用并且药筒是空的，则空药筒可以容易地被丢弃并替换为包含药物组合物的新药筒。然后可以重复使用笔式递送装置。一次性笔没有可更换的药筒。相反，一次性的笔式递送装置预装有保持在装置内的储液器中的药物组合物。一旦储液器内的药物组合物被排空，就丢弃整个装置。
本文所述的药物组合物可以是适合于精确剂量的单次施用的单位剂型。在单位剂型中，制剂可以分成含有适量的一种或多种化合物、融合蛋白和/或治疗剂的单位剂量。单位剂量可以是包含离散量的制剂的包装形式。非限制性实例是包装好的注射剂、小瓶和安瓿。本文公开的水性悬浮液组合物可以包装在单剂量的不可重新封闭的容器中。可以将多剂量的可重新封闭的容器例如与防腐剂一起使用或不与防腐剂一起使用。本文公开的注射制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿中或在具有防腐剂的多剂量容器中。
在一些实施方案中，本文公开的药物制剂是可包含约50μg/mL至约100mg/mL融合蛋白的液体制剂。制剂可包含例如至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少200μg/mL、至少300μg/mL、至少400μg/mL、至少500μg/mL、至少600μg/mL、至少700μg/mL、至少800μg/mL、至少900μg/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少20mg/mL，或至少50mg/mL。在一些实施方案中，制剂可包含至多100μg/mL、至多200μg/mL、至多300μg/mL、至多400μg/mL、至多500μg/mL、至多600μg/mL、至多700μg/mL、至多800μg/mL、至多900μg/mL、至多1mg/mL、至多10mg/mL、至多20mg/mL或至多50mg/mL。
可以调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，如由治疗情况的紧急状态所指示的，可以施用单次推注，可以随着时间施用几个分开的剂量，或可以按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物特别有利，以易于施用和剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待被治疗的受试者的单元剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生与所需药用载剂相关的所期望疗效的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格受指示于并直接依赖于以下各项：(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，以及(b)针对个体治疗敏感性配制这种活性化合物的技术中固有的局限性。
在本发明的药物组合物中的IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白的实际剂量水平可以改变，以获得一定量的IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白，所述量对特定受试者(例如，患者)、组合物和施用方式有效(“有效量”)实现期望的治疗反应，而对受试者(例如，患者)没有毒性。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、排泄速率、治疗持续时间、与所用特定组合物组合的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史、以及医学领域中已知的类似因素。
在一个实施方案中，本发明的IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白可以作为静脉注射或短时间输注，在另一个实施方案中，它们通过长时间(例如超过24小时)缓慢连续输注施用，以减少毒副作用。
在又一个实施方案中，本发明的IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白可以作为维持疗法施用，例如每周一次，持续6个月或更长时间。
在另一个实施方案中，本发明的IL4/IL13(或IL10/IL13或IL27/IL13或IL33/IL13或TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13或IL13/IL13)融合蛋白可作为鞘内注射施用。并且在又另一个实施方案中，它们通过允许连续或重复施用的鞘内或脊柱内药物递送系统施用。
可以在疾病或病症发生之前、期间或之后施用本文所述的治疗剂，并且施用含有治疗剂的组合物的时间可以变化。例如，组合物可用作预防剂，并可连续施用于具有病症或疾病倾向的受试者以减少疾病或病症发生的可能性。组合物可以在症状出现期间或在症状出现后尽快施用给受试者。初始施用可以通过任何可行的途径，例如通过使用本文描述的任何制剂的本文描述的任何途径。在检测到或怀疑疾病或病症发作后，可在切实可行的情况下尽快施用治疗剂，并持续治疗该疾病所需的时间长度，例如约1个月至约3个月。每个受试者的治疗时长可能不同。
剂量可以基于融合蛋白/千克受试者体重的量。融合蛋白的剂量可以是至少约0.5μg/kg、1μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、550μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、650μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、750μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、850μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg或1mg/kg。融合蛋白的剂量可以是至多约1μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μμg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、550μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、650μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、750μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、850μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg或1mg/kg。
在一些实施方案中，剂量可以是至少约1ng、至少10ng、至少100ng、至少500ng、至少1μg、至少5μg、至少10μg、至少50μg、至少100μg、至少500μg、至少1mg、至少5mg、至少10mg、至少50mg或至少100mg。剂量可以是至多约1ng、至多10ng、至多100ng、至多500ng、至多1μg、至多5μg、至多10μg、至多50μg、至多100μg、至多500μg、至多至多1mg、至多5mg、至多10mg、至多50mg或至多100mg。
剂量可以参考融合蛋白的血浆浓度或局部浓度来确定。融合蛋白的目标血浆浓度或局部浓度可以是至少约1pM、至少约10pM、至少约20pM、至少约30pM、至少约40pM、至少约50pM、至少约60pM、至少约70pM、至少约80pM、至少约90pM、至少约100pM、至少约200pM、至少约300pM、至少约400pM、至少约500pM、至少约600pM、至少约700pM、至少约800pM、至少约900pM、至少约1nM、至少约2nM、至少约3nM、至少约4nM、至少约5nM、至少约6nM、至少约7nM、至少约8nM、至少约9nM、至少约10nM、至少约20nM、至少约30nM、至少约40nM、至少约50nM、至少约60nM、至少约70nM、至少约80nM、至少约90nM、至少约100nM、至少约200nM、至少约300nM、至少约400nM、至少约500nM、至少约600nM、至少约700nM、至少约800nM、至少约900nM、至少约1μM、至少约10μM或至少约100μM。融合蛋白的目标血浆浓度或局部浓度可以是至多约1nM、至多约10nM、至多约100nM、至多约1μM、至多约10μM、至多约100μM或至多约1mM。
只要临床需要，融合蛋白的施用可以持续。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可以施用多于1天、多于1周、多于1个月、多于2个月、多于3个月、多于4个月、多于5个月、多于6个月、多于7个月、多于8个月、多于9个月、多于10个月、多于11个月、多于12个月、多于13个月、多于14个月、多于15个月、多于16个月、多于17个月、多于18个月、多于19个月、多于20个月、多于21个月、多于22个月、多于23个月或多于24个月。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白施用少于1周、少于1个月、少于2个月、少于3个月、少于4个月、少于5个月、少于6个月、少于7个月、少于8个月、少于9个月、少于10个月、少于11个月、少于12个月、少于13个月、少于14个月、少于15个月、少于16个月、少于17个月、少于18个月、少于19个月、少于20个月、少于21个月、少于22个月、少于23个月或少于24个月。
在一些实施方案中，融合蛋白在一个治疗周期内可以施用于受试者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在一些实施方案中，治疗周期为7天、14天、21天或28天长。在一些实施方案中，治疗周期是1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、11个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月、36个月、37个月、38个月、39个月、40个月、41个月、42个月、43个月、44个月、45个月、46个月、47个月、48个月、49个月、50个月、51个月、52个月、53个月、54个月、55个月、56个月、57个月、58个月、59个月或60个月。
在一些实施方案中，每1、2、3、4、5、6、7或8周向受试者施用一次融合蛋白。
治疗用途
在另一方面，本发明涉及本发明的融合蛋白或编码其的核酸用作药物的用途。
在一个方面，本发明涉及融合蛋白或编码其的核酸用于治疗疼痛，例如慢性疼痛的用途。“慢性”可能意味着疼痛持续超过2周或超过1、3、6、12个月，甚至超过1、2、4、6年。疼痛可包括由中枢神经系统、周围神经系统或其组合介导的疼痛。疼痛的非限制性类型包括伤害性疼痛、周围神经性疼痛、中枢神经性疼痛和混合类型的疼痛。
神经病变会导致疼痛。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可用于治疗神经病变。神经病变可与疼痛、麻木、虚弱或其组合有关。
特别地，发现本发明的融合蛋白对小鼠中与化学疗法相关型神经病变和神经变性相关的异常性疼痛具有持久的镇痛作用。此外，融合蛋白在体外和体内防止化学疗法诱导的神经变性。因此，本发明的融合蛋白或编码其的核酸可用于预防和治疗神经性疼痛。因此，融合蛋白可能特别适用于治疗神经病变(例如化学疗法引起的神经病变)、和其他形式的周围神经性疼痛，例如带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后或手术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、疼痛性周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法相关的疼痛、复杂性局部疼痛综合征等。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可用于治疗术后认知功能障碍。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可用于治疗与癌症或化学疗法相关的病症，例如化学疗法诱发的神经病变、化学疗法相关的疼痛、化学脑、癌症相关的认知障碍、癌症相关的认知功能障碍。在一些实施方案中，该病症与用于治疗以下的化学疗法有关：急性白血病、星形细胞瘤、胆管癌(胆管上皮癌)、骨癌、乳腺癌、脑干胶质瘤、细支气管肺泡细胞肺癌、肾上腺癌、肛门区域的癌症、膀胱癌、内分泌系统癌症、食道癌、头颈癌、肾癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、胸膜/腹膜癌、唾液腺癌、小肠癌、甲状腺癌、输尿管癌、尿道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌、肾盂癌、阴道癌、外阴癌、宫颈癌、慢性白血病、结肠癌、结直肠癌、皮肤黑素瘤、室管膜瘤、表皮样瘤、尤因氏肉瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、恶性血液病、肝细胞癌(肝癌)、肝细胞瘤、霍奇金病、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤、肺癌、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、肌肉癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经元癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、小儿恶性肿瘤、垂体腺瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、软组织肉瘤、神经鞘瘤、皮肤癌、脊柱轴肿瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、子宫癌或肿瘤及其转移，包括任何上述癌症的难治性版本或其任意组合。
在进一步的实施方案中，本发明的融合蛋白或编码其的核酸可用于治疗中枢神经性障碍(包括脊髓损伤、中风后疼痛和多发性硬化)的疼痛和神经变性。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可用于治疗术后认知功能障碍。
在另一方面，本发明涉及本发明的融合蛋白或编码其的核酸用于治疗慢性混合型伤害性疼痛和神经性疼痛，例如腰痛、骨关节炎、癌症疼痛、慢性内脏痛、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征等的用途。
在又一方面，本发明的融合蛋白或编码其的核酸可用于治疗矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、肠易激综合征、炎症性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎等。
在一个实施方案中，用本发明的融合蛋白治疗的病症的特征在于疼痛并且可以选自伤害性疼痛、神经性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛。
在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白或编码其的核酸可用于预防慢性疼痛。特别地，融合蛋白可用于预防接受化学疗法的癌症患者的神经性疼痛和神经变性。
在另一方面，本发明涉及本发明的融合蛋白用于预防或治疗哺乳动物如人的临床病症的用途，其中白介素13适用于该病症。
在另一方面，本发明涉及本发明的融合蛋白用于预防或治疗哺乳动物例如人的临床病症的用途，其中白介素4或白介素10或27或IL33或TGFβ1或TGFβ2适用于该病症。
根据一个实施方案，本文教导的融合蛋白可用于抑制由于中枢神经系统中的神经胶质细胞和神经元细胞、浸润性免疫细胞或其任何组合的活化而引起的神经炎症。
因此，本发明的融合蛋白可用于制备通过抑制体内神经胶质细胞和神经元细胞的活化来减轻神经炎症反应的药物。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白或编码其的核酸可用作独立药物。在另一个实施方案中，它们与其他药物组合使用。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白与镇痛剂例如对乙酰氨基酚/扑热息痛、非甾体抗炎药(NSAID)或阿片样物质组合施用。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可以与NSAID例如阿司匹林、布洛芬、萘普生、塞来昔布、酮咯酸或双氯芬酸组合使用。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可以与特定的COX-2抑制剂例如塞来昔布
罗非昔布或依托考昔组合使用。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可以与皮质类固醇例如地塞米松或糖类固醇(例如氢化可的松和泼尼松)组合使用。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白与促炎细胞因子的拮抗剂(例如，抗体衍生物或其与TNF-α结合的其他分子(例如阿达木单抗、依那西普)、与IL-17结合的其他分子(例如苏金单抗)、与IL-23结合的其他分子(例如古塞库单抗、替曲吉珠单抗(ildrakizumab))，或与IL-12和Il-23结合的其他分子(例如，优特克单抗)组合施用。在一些实施方案中，融合蛋白与透明质酸组合施用。多种治疗剂可以以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，本发明的化合物与另一种药物组合施用、在另一种药物之前或之后施用。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白或编码其的核酸可用于治疗阿尔珀斯病、蛛网膜炎、关节纤维化、共济失调性脑瘫、自身免疫性萎缩性胃炎、淀粉样变性、hATTR淀粉样变性、缺血性坏死、背痛、贝敦氏症、贝赛特氏病(综合征)、突破性疼痛、口灼伤综合征、滑囊炎、伴有皮质下梗死和脑白质病的中枢性常染色体显性动脉病(Cadasil)、脑缺血、脑-眼-面-骨骼综合征(COFS)、腕管综合征、马尾综合征、中枢性疼痛综合征、脑瘫、脑脊液(CSF)泄漏、宫颈狭窄、腓骨肌萎缩症(CMT)疾病、慢性功能性腹痛(CFAP)、慢性胰腺炎、肺萎陷(气胸)、皮质基底节变性、挤压性损伤、角膜神经性疼痛、挤压综合征、椎间盘退变疾病、皮肌炎、痴呆、肌张力障碍、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、子宫内膜异位症、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征(EMS)、红斑性肢痛症、腰椎手术失败综合征(FBSS)、纤维肌痛、弗里德赖希共济失调症、额颞痴呆、舌咽神经痛、生长痛、椎间盘突出、脑积水、肋间神经痛、间质性膀胱炎、青少年皮炎、膝部损伤、腿痛、路易体痴呆症、腰痛血尿综合征、莱姆病、感觉异常性股痛、线粒体病、混合性痴呆、运动神经元病(MND)、单肢肌萎缩、多系统萎缩(MSA)、肌炎、颈痛、枕神经痛、骨质疏松、横纹肌溶解、佩吉特病、牧师特纳综合征(Parsonage Turner Syndrome)、骨盆痛、周围神经病变、幻肢痛、神经挟捏、足底筋膜炎、风湿性多肌痛、多肌炎、疝修补术后疼痛综合征、乳房切除术后疼痛综合征、中风后疼痛、开胸术后疼痛综合征、脊髓灰质炎后综合征、原发性侧索硬化、银屑病关节炎、阴部神经痛、神经根病、不宁腿综合征、类风湿关节炎(RA)、骶髂关节功能障碍、结节病、舒曼脊柱后凸症(Scheuemann’s KyphosisDisease)、坐骨神经痛、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA)、带状疱疹、痉挛性斜颈、奥迪氏括约肌功能障碍(Sphincter of Oddi Dysfunction)、脊髓损伤、椎管狭窄、脊髓空洞症、塔洛夫囊肿(Tarlov Cysts)、脊髓栓系综合征、胸廓出口综合征(TOS)、TMJ障碍、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、血管疼痛、外阴痛、颈椎过度屈伸或其组合。
本公开的融合蛋白或编码其的核酸的可用于治疗神经病变。神经病变的非限制性实例包括创伤后周围神经病变、术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、化学疗法诱导的神经病变、多神经病变、单神经病变、多发性单神经病变、颅神经病变、主要运动神经病变、主要感觉神经病变、感觉运动神经病变、自主神经病变、特发性神经病变、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、舌咽神经痛、枕神经痛、阴部神经痛、非典型性三叉神经痛、坐骨神经痛、臂神经丛病变或肋间神经痛。神经病变可与例如疼痛、麻木、虚弱、灼热、萎缩、刺痛、抽搐或其组合相关。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白或编码其的核酸可用于治疗自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性实例包括急性播散性脑脊髓炎、急性运动轴索神经病、艾迪生氏病(Addison's disease)、痛性肥胖症、成人斯蒂尔病、斑秃、强直性脊柱炎、抗肾小球基底膜肾炎、抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎、抗-N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性脑炎、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性多内分泌综合征2型、自身免疫性多内分泌综合征3型、自身免疫性孕酮皮炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛同心性硬化、白塞氏病、比克斯塔夫脑炎(Bickerstaff's encephalitis)、大疱性类天疱疮、乳糜泻、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变、变应性肉芽肿血管炎、瘢痕性类天疱疮、科根综合征(Cogan syndrome)、冷凝集素病、复杂性局部疼痛综合征、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、盘状红斑狼疮、子宫内膜异位症、肌健端炎、与肌健端炎相关的关节炎、嗜酸性食管炎、嗜酸性筋膜炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症、伊文氏综合征(Evans syndrome)、费尔蒂综合征(Felty syndrome)、纤维肌痛、胃炎、妊娠期类天疱疮、巨细胞动脉炎、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、格林·巴利综合征、桥本脑病、桥本甲状腺炎、过敏性紫癜、化脓性汗腺炎、特发性扩张型心肌病、特发性炎性脱髓鞘疾病、IgA肾病、IgG4相关的全身性疾病、包涵体肌炎、炎性肠病(IBD)、中间葡萄膜炎、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、川崎病、兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA疾病、狼疮性肾炎、狼疮性血管炎、莱姆病、美尼尔氏综合征、显微镜下结肠炎、显微镜下多血管炎、混合性结缔组织病、角膜侵蚀性溃疡、硬斑病、穆夏-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化、重症肌无力、心肌炎、肌炎、视神经脊髓炎、神经性肌强直、眼阵挛肌阵挛综合征、视神经炎、奥德氏甲状腺炎(Ord'sthyroiditis)、回文风湿病、亚急性小脑变性、帕里罗姆伯格综合征(Parry Rombergsyndrome)、牧师-特纳综合征、与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病、寻常型天疱疮、恶性贫血、急性痘疮样苔藓样糠疹、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性免疫缺陷、原发性硬化性胆管炎、进行性炎性神经病变、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象(Raynaud’sphenomenon)、反应性关节炎、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎、类风湿脉管炎、结节病、施尼茨勒综合征(Schnitzler syndrome)、硬皮病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克综合征(Susac's syndrome)、西登哈姆舞蹈病(Sydenhamchorea)、交感性眼炎、系统性红斑狼疮、全身性硬皮病、血小板减少症、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、荨麻疹、荨麻疹性血管炎、血管炎和白癜风。
在一些实施方案中，本公开的融合蛋白或编码其的核酸可用于治疗炎症。在一些实施方案中，炎症是慢性炎症。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可用于治疗与以下相关的炎症：炎性肠病、肠易激综合征、骨关节炎、类风湿关节炎、肾小球肾炎、脓毒症、成人呼吸窘迫综合征、皮炎、结节病、过敏性炎症、银屑病、强直性脊椎关节炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、痛风、同种异体移植、异种移植、自身免疫性疾病、斯耶格伦氏病、灼伤、创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、缺血再灌注损伤、细胞因子或其他治疗性单克隆抗体的体内施用诱导的毒性。在一些实施方案中，炎症是慢性炎症。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白可用于治疗炎性肠病、肠易激综合征、骨关节炎、类风湿关节炎、肾小球肾炎、脓毒症、成人呼吸窘迫综合征、皮炎、结节病、过敏性炎症、银屑病、强直性脊椎关节炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、痛风、同种异体移植、异种移植、自身免疫性疾病、斯耶格伦氏病(Sjogren’s disease)、灼伤、创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、缺血再灌注损伤、细胞因子或其他治疗性单克隆抗体的体内施用诱导的毒性。
在一些实施方案中，融合蛋白用于治疗病症，其中所述病症不是癌症。
治疗(预防性或治疗性)通常由肠胃外、优选鞘内、关节内、静脉内、肌肉内或皮下施用本发明的融合蛋白或编码其的核酸组成。剂量和施用方案将取决于所针对的神经炎症和神经变性的抑制程度。通常，所给定的融合蛋白的量将在0.5μg至1mg/kg体重的范围内。可以通过测量施用后靶向的身体隔室中的细胞因子水平(IL13、IL4或IL10或IL27或IL33或TGFβ1或TGFβ2，或其组合)来确定或调整剂量。剂量也可以通过测量患者的神经炎症来确定，例如通过小胶质细胞的正电子发射断层扫描(PET)成像。
对于肠胃外施用，融合蛋白或编码其的核酸优选配制成与药学上可接受的肠胃外媒剂组合的可注射形式。此类媒剂是本领域众所周知的，实例包括盐水、葡萄糖溶液、林格氏溶液和含有少量人血清白蛋白的溶液。
通常，本发明的融合蛋白可以以约50μg至约100mg/ml的浓度配制在此类媒剂中。
基因疗法
本发明的核酸构建体或载体可用作治疗上述病症的基因治疗剂。
因此，在一个方面，本发明涉及用于预防或治疗以以下为特征的病症的上述载体：内脏或非内脏伤害性疼痛、周围或中枢神经性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛、神经炎症和/或神经变性，优选地，其中所述病症可选自矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后或手术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、疼痛性周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法相关的疼痛、复杂性局部疼痛综合征、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、多发性硬化、腰痛、骨关节炎、癌症疼痛、慢性内脏痛、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病和帕金森病、亨廷顿病和/或肌萎缩侧索硬化或多发性硬化。在一些实施方案中，病症可能是阿尔珀斯病、蛛网膜炎、关节纤维化、共济失调性脑瘫、自身免疫性萎缩性胃炎、淀粉样变性、hATTR淀粉样变性、缺血性坏死、背痛、贝敦氏症、贝赛特氏病(综合征)、突破性疼痛、口灼伤综合征、滑囊炎、伴有皮质下梗死和脑白质病的中枢性常染色体显性动脉病(Cadasil)、脑缺血、脑-眼-面-骨骼综合征(COFS)、腕管综合征、马尾综合征、中枢性疼痛综合征、脑瘫、脑脊液(CSF)泄漏、宫颈狭窄、腓骨肌萎缩症(CMT)疾病、慢性功能性腹痛(CFAP)、慢性胰腺炎、肺萎陷(气胸)、皮质基底节变性、挤压性损伤、角膜神经性疼痛、挤压综合征、椎间盘退变疾病、皮肌炎、痴呆、肌张力障碍、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、子宫内膜异位症、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征(EMS)、红斑性肢痛症、腰椎手术失败综合征(FBSS)、纤维肌痛、弗里德赖希共济失调症、额颞痴呆、舌咽神经痛、生长痛、椎间盘突出、脑积水、肋间神经痛、间质性膀胱炎、青少年皮炎、膝部损伤、腿痛、路易体痴呆症、腰痛血尿综合征、莱姆病、感觉异常性股痛、线粒体病、混合性痴呆、运动神经元病(MND)、单肢肌萎缩、多系统萎缩(MSA)、肌炎、颈痛、枕神经痛、骨质疏松、横纹肌溶解、佩吉特病、牧师特纳综合征(Parsonage Turner Syndrome)、骨盆痛、周围神经病变、幻肢痛、神经挟捏、足底筋膜炎、风湿性多肌痛、多肌炎、疝修补术后疼痛综合征、乳房切除术后疼痛综合征、中风后疼痛、开胸术后疼痛综合征、脊髓灰质炎后综合征、原发性侧索硬化、银屑病关节炎、阴部神经痛、神经根病、不宁腿综合征、类风湿关节炎(RA)、骶髂关节功能障碍、结节病、舒曼脊柱后凸症(Scheuemann’s Kyphosis Disease)、坐骨神经痛、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA)、带状疱疹、痉挛性斜颈、奥迪氏括约肌功能障碍(Sphincterof Oddi Dysfunction)、脊髓损伤、椎管狭窄、脊髓空洞症、塔洛夫囊肿(Tarlov Cysts)、脊髓栓系综合征、胸廓出口综合征(TOS)、TMJ障碍、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、血管疼痛、外阴痛、急性播散性脑脊髓炎、急性视神经炎、横贯性脊髓炎、视神经脊髓炎或颈椎过度屈伸。
如本文较早所述，本发明涉及一种融合蛋白，其包含至少2、3、4、优选2种选自白介素13(IL13)、白介素4(IL4)、白介素10(IL10)、白介素27(IL27)、白介素33(IL33)、转化生长因子β1(TGFβ1)和转化生长因子β2(TGFβ2)的调节性(例如抗炎)白介素。因此，当在本公开中提及“IL13”时，其可以由转化生长因子β1(TGFβ1)或转化生长因子β2(TGFβ2)代替。类似地，当在本公开中提及“IL4”时，这可以由转化生长因子β1(TGFβ1)或转化生长因子β2(TGFβ2)代替。本公开因此还包括IL13/TGFβ1或IL13/TGFβ2的融合蛋白。此外，本公开包括IL4/TGFβ1或IL4/TGFβ2的融合蛋白。此外，本公开包括IL10/TGFβ1或IL10/TGFβ2的融合蛋白。
现在将参考以下实施例说明本发明，这些实施例阐述了特别有利的实施方案。然而，应当注意，这些实施方案是说明性的并且不应被解释为以任何方式限制本发明。
实施例
动物
所有动物实验均按照国际准则进行，并事先得到乌得勒支大学医学中心(University Medical Centre Utrecht)实验动物委员会的批准。使用8至16周龄的雄性和雌性C57BL/6小鼠进行实验。进行行为实验的观察者对治疗不知情。
材料与方法
IL4/IL13融合蛋白的表达和纯化.L4/13融合蛋白HEK293细胞根据标准程序用含有转基因的载体瞬时转染(Y Derocher等人,Nucleic Acids Research 2002,第30卷,no2,e9)。简言之，编码本发明的IL4/IL13融合蛋白序列的合成cDNA(GeneArt，ThermoFisherScientific)(参见SEQ ID NO:4，该序列的N末端插入了6-His标签)被克隆到含有胱抑素信号序列的表达载体中。然后用表达载体转染HEK293E细胞，并用携带针对β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶5(SIAT9；智人)的转基因的载体共转染，以优化唾液酸对聚糖的加帽。如前所述，将细胞在含有0.9％灵长类和约0.04％v/v胎牛血清的FreeStyle培养基(Invitrogen)中培养19,26。在转染后第4天收集细胞悬浮液并以435x g离心5分钟。将上清液通过HIS-Select镍亲和凝胶(Sigma-Aldrich)以纯化重组IL4/IL13融合蛋白。洗脱级分在4℃用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析过夜。
蛋白质测定.Bradford(Bio-Rad)、BCA(Thermo Scientific)和Qubit 1.0(ThermoScientific)用于确定洗脱级分和透析级分中的蛋白质含量。所有蛋白质测定均根据制造商的方案进行。
ELISA.基于单个细胞因子的量确定融合蛋白的量，用ELISA(IL4 Pelipair ELISA试剂盒，Sanquin；IL13，DuoSet ELISA，R&D Systems)测量。根据制造商的说明进行ELISA。浓度是基于融合蛋白与单个细胞因子相比的理论分子量计算的。
SDS-Page和蛋白质印迹.在12％聚丙烯酰胺SDS-Page凝胶(Bio-Rad)上分离HIS-Select镍亲和色谱纯化(加载、流通、洗涤、洗脱/透析)的级分并转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用IL4抗体(Santa Cruz，SC-13555)染色。
高性能尺寸排阻色谱(HP-SEC).为了确定其分子量和同质性，IL4/IL13融合蛋白用高性能尺寸排阻色谱(HP-SEC)进行分析。凝胶过滤(BioSuite 125 4μm UHR SEC柱；Waters；Cat#186002161)在高性能液相色谱系统(Shimadzu)上进行，使用含有0.5M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液作为流动相。在运行之前使用甲状腺球蛋白、牛血清蛋白、碳酸酐酶、肌球蛋白和核糖核酸酶的蛋白质混合物校准柱。将50μl 20μg/ml的纯化的IL4/IL13融合蛋白注入并以0.35ml/min的流速和在35bar压力下在柱上分离。
体外化学疗法诱导的神经毒性评估.如前所述培养背根神经节(DRG)神经元27。简而言之，解剖出成年小鼠DRG神经元，随后在含有无Ca2+和Mg2+的HBSS、5mM HEPES、10mM葡萄糖、XI型胶原酶(5mg/ml)和分散酶(10mg/ml)的酶混合物中消化1小时，然后在含有10％v/v热灭活胎牛血清的DMEM中机械研磨。细胞以800rpm离心5min，重悬于含有4.5g/L葡萄糖、4mM L-谷氨酰胺、110mg/L丙酮酸钠、10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素(10,000 IU/ml)、1％谷氨酰胺(glutamax)的DMEM中，并在紫杉醇(1uM)或奥沙利铂(5ug/ml)存在下在24孔板中孵育24小时以诱导神经毒性。IL4/IL10融合蛋白(100ng/mL)、IL4/IL13融合蛋白(100ng/mL)、IL4和IL13(各50ng/mL)、IL4(50ng/mL)、IL10(50ng/mL)和IL13(50ng/mL)与化疗剂一起加入。作为对照，细胞也在没有化疗药物或细胞因子的情况下进行培养，以及仅在化疗药物存在的情况下进行培养。用4％多聚甲醛固定后，细胞用兔抗小鼠βIII-微管蛋白(ab18207，1:1000；Abcam)染色。使用Zeiss Axio Lab A1显微镜(Zeiss–Oberkochen，德国)观察神经突，并使用随机采样方法，在10x放大倍数下对每个载玻片制作至少10张图像。使用ImageJ插件Simple Neurite Tracer76测量神经突的长度。对于三个单独的初级感觉培养物，在组之间比较每个条件下至少五个神经元的每个神经元的神经突长度的平均值。
化学疗法诱导的多发性神经病变和异常性疼痛的评估.为了诱导暂时性化学疗法引起的多发性神经病变(CIPN)，在第0天和第2天腹膜内注射紫杉醇(2mg/kg，CaymanChemical Company)。为了诱导持续性紫杉醇诱导的CIPN，在第0、2、4和6天腹膜内注射紫杉醇(8mg/kg，Cayman Chemical Company)。为了诱导持续性奥沙利铂诱导的多发性神经病变，小鼠接受了两个治疗周期，每个周期由以下组成：每天5次腹膜内注射3mg/kg奥沙利铂(Tocris)，其中无治疗间隔为5天。
使用von Frey毛发测量后爪中的有害机械敏感性(Stoelting，Wood Dale，USA)。结果表示为使用上下法的50％缩爪阈值29。在一些实验中，在第15天爪皮肤中表皮内神经纤维的长度是通过用神经元标记PGP9.5对皮肤活检组织进行免疫荧光染色来确定的。所有实验均以盲法进行。
统计分析.除非另有说明，否则所有数据均表示为平均值±SEM。通过单向或双向ANOVA(如果合适，重复测量)然后进行适当的事后检验分析数据的统计显著性。p<0.05的p值被认为是显著的。
实施例1.内源性IL4和IL13是紫杉醇诱导的瞬时痛觉过敏的正常消退所必需的。
为了研究调节性(例如抗炎)细胞因子对化学疗法诱导的多发性神经病变恢复的可能作用，使用了紫杉醇引起的疼痛的瞬时疼痛模型15。在第0天和第2天，小鼠接受了2次低剂量(2mg/kg)紫杉醇注射。从化学疗法治疗开始后第6天到第10天，小鼠每天接受鞘内注射针对IL4、IL13或对照IgG抗体的中和抗体(每次注射5μg抗体；图1)。接受紫杉醇的小鼠在化学疗法的第一天开始出现机械性痛觉过敏，并在治疗终止一周后自发消退(图1)。在鞘内注射针对IL4或IL13的中和抗体的动物中，痛觉过敏的消退被延迟并持续至少2周。这些数据表明内源性产生的IL4和IL13是化学疗法治疗后正常疼痛消退所必需的(图1)。
实施例2.IL4、IL10和IL13的神经保护作用。
为了评估调节性(例如，抗炎)细胞因子是否具有神经保护特性，从背根神经节分离的感觉神经元与紫杉醇连同IL4、IL10或IL13培养过夜，如方法中所述。通过使用βIII-微管蛋白染色测量神经突长度来评估神经毒性。紫杉醇(1μM)减少了神经突长度，其中约50％显示紫杉醇损坏的感觉神经元。在与紫杉醇培养期间添加IL13防止紫杉醇诱导的对神经突长度的负面影响，而IL10和IL4则没有(图2)。
实施例3.重组IL4/13融合蛋白的表征。
具有N末端6His标签的人IL4/IL13融合蛋白(参见SEQ ID NO:4)通过瞬时转染HEK293细胞产生并如方法中所述纯化。在HP-SEC上，纯化的IL4/IL13融合蛋白作为单峰迁移，表观质量为40kDa(图3)。还在SDS-PAGE和考马斯染色上分析制备物。检测到作为具有约37kDa的分子量的成片条带迁移的均质制剂(图3中的插图)。
实施例4.IL4/IL13融合蛋白治愈紫杉醇诱导的持续性多发性神经病变。
在持续性紫杉醇诱导的疼痛性神经病变模型中评估了IL4/IL13融合蛋白抑制化学疗法诱导的痛觉过敏的潜力30。从第0天到第6天，小鼠每隔一天接受4次紫杉醇注射(8mg/kg)。紫杉醇诱导的机械痛觉过敏在第一次注射后的第一天开始，并在化学疗法治疗停止后持续至少3周。最后一次紫杉醇注射后两天，小鼠鞘内注射3种不同剂量的包含SEQ ID NO:4的IL4/IL13融合蛋白(0.3、1和3μg/小鼠)(图4)。所有三种剂量的IL4/IL13融合蛋白都显著减轻了紫杉醇诱导的多发性神经病变。重要的是，机械性痛觉过敏的几乎正常化持续了至少一周，证明了IL4/IL13融合蛋白在长期消退化学疗法诱导的多发性神经病变方面的潜力。
实施例5.IL4/IL13融合蛋白的效力优于IL4/IL10融合蛋白或IL4和IL13组合疗法，以治愈化学疗法诱导的多发性神经病变。
接下来评估IL4/IL13融合蛋白是否比IL4/IL10融合蛋白或IL4和IL13的组合更好地抑制紫杉醇诱导的多发性神经病变。从第0天到第6天，每隔一天注射4次紫杉醇(8mg/kg)后，小鼠出现了紫杉醇诱导的疼痛性多发性神经病变。IL4/IL13融合蛋白(包含SEQ ID NO:4)抑制紫杉醇诱导的机械超敏反应至少1周，而野生型IL4和IL13的组合或IL4/IL10融合蛋白仅抑制紫杉醇诱导的机械超敏反应1-2天(图5)。IL4/IL13融合蛋白对紫杉醇诱导的持续性异常性疼痛的抑制与爪皮肤中紫杉醇诱导的表皮内神经纤维损失减少有关(图6)。
为了评估IL4/IL13融合蛋白是否在体外保护免受紫杉醇诱导的神经毒性，我们测量了在有或没有融合蛋白时的紫杉醇存在下培养的小鼠感觉神经元的神经突长度。与对照组相比，紫杉醇对神经突长度具有显著的负面影响(图7)。同时存在IL4/IL10融合蛋白或IL4和IL13的组合对神经突长度具有中等的有益影响。然而，培养物中IL4/IL13融合蛋白的存在显著阻止了紫杉醇诱导的神经毒性(图7)。因此，这些数据共同证明了IL4/IL13融合蛋白比IL4/IL10融合蛋白或IL4和IL13的组合具有出乎意料的优越效果，以保护神经元免受化疗药物紫杉醇的毒性作用。特别是融合蛋白相对于组合的优越性是出人意料的，因为体外系统不受蛋白质从作用位点的不同清除的影响。相反，数据指出了IL4/IL13融合蛋白在神经保护方面的独特作用。
实施例6.IL4/IL13融合蛋白还治愈奥沙利铂诱导的多发性神经病变。
研究了IL4/IL13融合蛋白的神经保护作用对于紫杉醇诱导的神经毒性是否是独特的，或者神经保护作用是否针对更广泛的化学疗法诱导的多发性神经病变。使用基于铂的化疗药物奥沙利铂在小鼠中诱导毒性神经病变。每天注射奥沙利铂5次，间隔5天不进行腹腔注射，进行两个周期诱导机械性异常性疼痛持续至少3周(图8)。在最后一次奥沙利铂注射后的第二天鞘内注射IL4/IL13融合蛋白(包含SEQ ID NO:4)显著减少了机械性异常性疼痛，持续4天(图8)。鞘内注射野生型IL4或野生型IL13暂时抑制奥沙利铂诱导的机械性异常性疼痛约1天，这明显短于IL4/IL13融合蛋白的作用。类似地，体外IL4/IL13融合蛋白保护免受奥沙利铂诱导的神经毒性，而IL4和IL13的组合则没有(图9)。因此，这些数据表明IL4/IL13融合蛋白保护免受化学疗法诱导的神经毒性和化学疗法诱导的多发性神经病变。
实施例7.IL10/IL13和IL33/IL13融合蛋白
此外，考虑了IL10/IL13融合蛋白或IL33/IL13融合蛋白是否在本文公开的医学适应症中具有治疗效果。出人意料的是，通过施用IL10/IL13融合蛋白使IL10受体和IL13受体交联，或通过施用IL33/IL13融合蛋白使IL33受体和IL13受体交联，可导致与施用IL4/IL10融合蛋白相比的，尤其是在神经性疼痛模型中的更强和更持久的治疗效果。
实施例8.细胞因子受体在背根神经节和脊髓中的表达
解决了本发明融合蛋白靶向的细胞因子受体是否由感觉系统表达。为了分析这一点，Ray等人(Pain 2018；159:1325-1345)从数据库中提取了背根神经节和脊髓中的IL10、IL4、IL13、IL27、TGFβ1和TGFβ2受体的RNAseq数据，该数据库可在https://www.utdallas.edu/bbs/painneurosciencelab/sensoryomics/drgtxome/？go得到。RNA测序揭示了人和小鼠的背根神经节和脊髓中IL10、IL4、IL13、IL27、TGFβ1和TGFβ2的受体链的表达(图10；数据表示为每百万的转录本)。
实施例9.本公开的融合蛋白
该实施例验证了本公开的含IL13融合蛋白的非限制性实施例的设计和产生。
设计了本公开的包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:14的IL4/IL13融合蛋白。使用SEQID NO:3接头将SEQ ID NO:1连接到SEQ ID NO:14，产生SEQ ID NO:16。将六组氨酸标签添加到N末端，融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。含有SEQ ID NO:16的融合蛋白在N末端具有IL4，并且在图11、图12和图18A中标记为IL4/IL13SKP。
设计了本公开的包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:14的IL10/IL13融合蛋白。使用SEQ ID NO:3接头将SEQ ID NO:5连接到SEQ ID NO:14，产生SEQ ID NO:17。将六组氨酸标签添加到N末端，融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。含有SEQ ID NO:17的融合蛋白在N末端含有IL13并在图11、图13和图18D中标记为IL13/IL10。
设计了本公开的包含SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:14的IL27/IL13融合蛋白。使用SEQ ID NO:3接头将SEQ ID NO:18连接到SEQ ID NO:14，产生SEQ ID NO:19。将六组氨酸标签添加到N末端，融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。含有SEQ ID NO:19的融合蛋白在N末端含有IL13并在图11、图14和图18C中标记为IL13/IL27-A。
设计了本公开的包含两个拷贝的SEQ ID NO:14的IL13/IL13融合蛋白。使用SEQID NO:3接头将SEQ ID NO:14连接到SEQ ID NO:14的第二个拷贝，产生SEQ ID NO:20。将六组氨酸标签添加到N末端，融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
IL4/IL13、IL10/IL13、IL27/IL13和IL13/IL13融合蛋白按照如下公开的纯化。尺寸排阻色谱表明，含有SEQ ID NO:16的IL4/IL13融合蛋白作为单峰迁移(图18A)，IL13/IL13融合蛋白(含有SEQ ID NO:20)作为单峰迁移(图18B)。
对于IL27/IL13(IL13/IL27-A)，鉴定了重组蛋白的两个峰，它们在凝胶过滤后分别合并(图18C)。池1是较高分子量池。池2具有较低的分子量，并被选择用于进一步评估。不希望受任何特定理论的束缚，池1可包含多聚化和/或聚集形式的蛋白质，而池2可包含纯蛋白质(例如，单体)
对于IL10/IL13(IL13/IL10)，鉴定了重组蛋白的两个峰，它们在凝胶过滤后分别合并(图18D)。池1代表高分子量池，池2代表低分子量池。不希望受任何特定理论的束缚，IL10/IL13池1可包含分子的二聚体形式，并且IL10/IL13池2可包含IL10/IL13的单体形式。
如图11所示，在还原和非还原条件下，在4-12％梯度聚丙烯酰胺NuPageTM凝胶上分析纯化的蛋白质，并通过考马斯蛋白染色观察条带。
含有IL13的融合蛋白的表达和纯化.本公开的含有IL13的融合蛋白是通过HEK293E细胞的瞬时转染产生的。用含有编码含IL13的融合蛋白序列之一的转基因的pUPE表达载体转染细胞。为了进行纯化，在每个含有IL13的蛋白质的N末端克隆了六组氨酸亲和标签。转染后六天，通过低速离心(10分钟，1000x g)然后高速离心(10分钟，4000x g)收获含有重组蛋白的条件培养基。
通过固定化金属亲和色谱(IMAC)通过His标签纯化蛋白质。简而言之，重组蛋白与0.5ml Nickel
excel在20℃结合。通过离心收获含有结合的蛋白质的Nickel
excel并转移到重力流柱中。通过用含有0和10mM咪唑的IMAC缓冲液(500mM氯化钠，25mM Tris，pH＝8.2)洗涤柱来去除非特异性结合的蛋白质。用含有500mM咪唑的IMAC缓冲液洗脱蛋白质。收集2.5ml的级分并合并含有重组蛋白的级分。条件培养基和未结合的IMAC组分通过
毛细管电泳进行分析。使用Amicon 10kDa旋转过滤器将IMAC池浓缩至2–4ml。通过离心(10分钟18000x g，4℃)去除聚集体。
使用已在PBS中平衡的Superdex200 16/600柱，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质。通过
毛细管电泳分析含有蛋白质的级分，并合并含有重组蛋白质的级分。通过0.22μm注射器过滤器过滤对蛋白质池进行灭菌，并在-80℃下将产品储存在1ml小瓶中。
蛋白质测定：通过测量280nm(DropSense16，Trinean)的吸光度并使用BCA(ThermoScientific)蛋白质测定，以分光光度法确定蛋白质浓度。所有蛋白质测定均根据制造商的方案进行。
SDS-Page：在还原和非还原条件下，在4-12％聚丙烯酰胺NuPageTM聚丙烯酰胺凝胶上分析纯化的蛋白质。蛋白质条带通过考马斯蛋白染色可视化。
实施例10.含IL13的融合蛋白对紫杉醇诱导的感觉神经元损伤的神经保护作用
为了阐明其中IL13与其他调节性细胞因子(如IL4、IL10、IL13或IL27)相连接的各种融合蛋白的潜在的神经保护作用，在体外紫杉醇诱导的感觉神经元损伤测定中测试了融合蛋白。在紫杉醇(1μM)和不同浓度的每种融合蛋白或等摩尔剂量的IL13或未连接的细胞因子的组合存在的情况下，将小鼠的初级感觉神经元培养24小时。
DRG神经元的培养:如前所述培养DRG(Nat.Commun.4,1682(2013))。简而言之，将DRG解剖并置于冰冷的解剖培养基(HBSS w/o Ca2+和Mg2+、5mM HEPES和10mM葡萄糖)上。解剖后，切割轴突，用过滤的酶混合物(HBSS w/o Ca2+和Mg2+、5mM HEPES、10mM葡萄糖、5mg/mlXI型胶原酶(Sigma)和10mg/ml分散酶(Gibco))代替解剖培养基。将DRG在酶混合物中在37℃和5％CO2孵育30分钟。随后，酶混合物用热灭活的胎牛血清(FBS，Sigma)灭活。细胞在37℃的5％CO2培养箱中在Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco)涂覆的玻璃盖玻片中培养，所述培养基包含10％FBS(Gibco)、2mmol/L谷氨酰胺(Gibco)、在聚-L-赖氨酸(0.01mg/ml，Sigma)上的10,000IU/ml青霉素-链霉素(Gibco)和层粘连蛋白(0.02mg/ml，Sigma)。在接下来的1-2天使用细胞。
刺激用于神经突长度测量:培养24小时后，DRG神经元单独用紫杉醇(1μM)(n＝11)或在不同浓度的IL13融合蛋白(0.12nM，n＝6；0.6nM或3nM，n＝11)或等摩尔剂量的单个细胞因子(n＝6)存在下处理24小时(n值代表测试每种条件的动物数量)。使用β3-微管蛋白染色使神经突可视化，而使用NeuN染色确定感觉神经元的数量。对于每只动物，评估了2-3个孔(细胞因子：每个浓度2个孔；紫杉醇或对照：3个孔)，每孔拍摄5张照片。对于每张照片，每个感觉神经元的神经突长度被确定并平均为每个动物和条件的单个值。根据以下公式计算1只小鼠的每个小鼠培养物的紫杉醇诱导的神经突长度损失的百分比抑制((μ对照-μ紫杉醇)-(μ对照-X细胞因子))/(μ对照-μ紫杉醇)*100(其中μ是在所有样品中平均化的每个神经元的神经突长度，X是每个单独样品的神经突长度)。
β3-微管蛋白和NeuN染色：细胞在4％PFA中固定10分钟，用含有0.05％Tween-20的PBS透化，然后在封闭缓冲液(1％BSA和含有0.05％Tween-20和0.01％triton的PBS中的5％正常驴血清)中孵育1小时。细胞与兔抗β3微管蛋白(抗-βIII微管蛋白抗体-神经元标记，ab18207，1:1500，Abcam，Cambridge，UK)和NeuN(抗-NeuN抗体克隆A60，MAB377，1:500)Sigma Aldrich(Merck)，Darmstadt，德国)在4℃下孵育过夜，然后洗涤和用AF488缀合的驴抗兔和568缀合的驴抗小鼠二抗(Thermofisher，1:500)进行孵育然后是DAPI(1:5000，Sigma)染色，然后用FluorSave试剂(Millipore)将切片安装在载玻片上。
使用Olympus IX83显微镜(Olympus)拍摄图像。使用CellSens软件(Olympus)和ImageJ(NIH)，使用NeuralNetrics宏(Pani G等人，MorphoNeuroNet:An automated methodfor dense neurite network analysis.Cytom Part A.2014年2月；85(2):188–99)分析图片。使用的其他插件是Olympus Viewer插件(Olympus)。使用细胞感知软件根据NeuN染色自动计数神经元的数量。使用ImageJ(Fiji)中的NeuralNetric宏确定神经突长度。
结果
与对照培养的感觉神经元相比，紫杉醇使神经突长度减少了约67％。
图12说明了两种IL4/IL13融合蛋白相比于单独的IL13或IL4和IL13的组合的神经保护作用的比较。Il13剂量依赖性地抑制紫杉醇诱导的神经突长度减少，其中在3nM的浓度下最大约9％(图12)。在任何测试浓度下，IL4和IL13的组合均未显著抑制紫杉醇诱导的神经突长度。
标记为IL4/IL13的融合蛋白包含SEQ ID NO:4。标记为IL4/IL13SKP的融合蛋白包含SEQ ID NO:16。IL13位于这些构建体的C末端。IL4/IL13剂量依赖性地抑制紫杉醇诱导的神经突长度减少，其中在3nM时最大作用为35％(图12)。IL4/IL13比IL4和IL13组合或单独IL13显著更好地抑制紫杉醇诱导的神经突长度减少，其中与IL13相比，在3nM的浓度下抑制程度高约4倍(图12)。替代性的IL4/IL13融合蛋白IL4/IL13SKP在所有测试浓度下抑制紫杉醇诱导的神经突长度减少的程度与IL4/IL13相似(图12)。IL4/IL13SKP(SEQ ID NO:16)中使用的IL13蛋白质序列(SEQ ID NO:14)在N末端包含另外的丝氨酸，在C末端附近包含精氨酸而不是谷氨酰胺(SEQ ID NO:14中的位置112)。尽管存在这些蛋白质序列差异，但包含IL4和IL13的两种融合蛋白均比单独的IL4和IL13以及IL4+IL13的组合显示出优异的神经保护作用。数据显示为平均值±SEM。使用双向ANOVA混合效应分析随后进行Tukey多重比较检验分析数据。
图13说明了两个IL10/IL13融合蛋白池与等摩尔浓度的单独IL13或IL10和IL13组合的神经保护作用的比较。IL10/IL13融合蛋白包含SEQ ID NO:17，其中IL13位于N末端。该融合蛋白的池在图中被称为IL13/IL10池1和IL13/IL10池2。在所有测试剂量下，IL13/IL10池1显著抑制紫杉醇诱导的神经突长度减少，范围从0.12nM时的15％到3nM时的28％(图13)。IL13/IL10池2还浓度依赖性地保护神经元免受紫杉醇诱导的神经突长度减少。重要的是，IL13/IL10池1和IL13/IL10池2比IL13或IL10和IL13组合在3nM时显著更好地预防紫杉醇诱导的神经元损伤(图13)。数据显示为平均值±SEM。使用双向ANOVA混合效应分析随后进行Tukey多重比较检验分析数据。
图14提供了IL13/IL13融合蛋白和IL27/IL13融合蛋白相比于单独IL13的神经保护作用的比较。IL13/IL13融合蛋白包含SEQ ID NO:20。IL13/IL13融合蛋白在0.12nM时将紫杉醇诱导的神经突长度减少抑制约10％，这明显优于该浓度时的IL13。然而，随着浓度的增加，IL13/IL13没有提供更多的神经保护作用(图14)。
IL27/IL13融合蛋白包含SEQ ID NO:19(其中IL13位于蛋白的N末端)，在图14中称为IL13/IL27-A池2。该融合蛋白包括IL13和IL27A的分泌型突变蛋白(Müller等人，2019)。测试如上所述产生的IL27/IL13的池2。在0.6nM时，IL27/IL13抑制紫杉醇诱导的神经元损伤，其中最大抑制作用约为21％。在此浓度下，IL27/IL13的表现优于IL13。在3nM时，IL13和IL27/IL13的神经保护作用没有显著差异。数据显示为平均值±SEM。使用双向ANOVA混合效应分析随后进行Tukey多重比较检验分析数据。
这些数据表明，包含IL13和调节性细胞因子的多个融合蛋白可有效降低神经毒性，包括包含不同IL13序列、不同调节性细胞因子的融合蛋白，并且IL13在融合蛋白的N末端或C末端。多个融合蛋白表现出相比于单独的IL13的优越性，以及相比于IL13和调节性细胞因子的组合的优越性。
实施例11.与未连接的细胞因子的组合相比，本公开的含有IL13的融合蛋白引发不同的激酶活性谱
动物：所有动物实验均按照国际准则进行，并事先得到乌得勒支大学医学中心实验动物委员会的批准。用8-14周龄的雄性和雌性野生型(WT)C57BL/6小鼠进行实验。
紫杉醇诱导的CIPN：在第0、2、4和6天，给动物腹膜内注射8mg/kg紫杉醇(用Cremophor:EtOH 1:1稀释；注射体积为40μl/10g体重)。在第8天，动物接受了鞘内(i.t.)注射IL4/IL13融合蛋白(0.3μg)、IL4+IL13(各0.15μg)或媒剂。IL4/IL13融合蛋白是包含SEQID NO:4的融合蛋白。
药物和施用：IL4/IL13是通过用带有双CMV启动子的pcDNA3.1-neo表达载体(Invitrogen；Carlsbad，CA)瞬时转染HEK293F细胞产生的。该载体包含两个转基因：编码IL4/IL13融合蛋白的cDNA和编码β-半乳糖苷-2,3-唾液酸转移酶的cDNA，以优化用唾液酸对聚糖加帽。IL4/IL13在N末端含有6-His标签，并通过HIS-Select镍亲和凝胶(Sigma)纯化。IL4/IL13浓度用IL4 ELISA试剂盒(IL-4Pelipair ELISA试剂盒；Sanquin)和二辛可宁酸蛋白质测定(BCA Pierce蛋白质测定试剂盒，ThermoFisher Scientific)来确定。不同化合物的鞘内(i.t.)注射(5μl/小鼠)如前所述(J Neurosci 30,2138-2149,2010)在轻度异氟醚/O2麻醉下进行。在第一次注射紫杉醇后第8天鞘内注射IL4/IL13(0.3μg/小鼠)或等摩尔剂量(每只小鼠各0.15μg)的重组人HEK产生的IL4(Sigma)和IL13(2bsciences)。
激酶活性分析：在鞘内注射IL4/IL13融合蛋白、IL4+IL13或媒剂后一小时处死动物，然后立即分离DRG。使用补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物(Pierce)的M-PER哺乳动物提取缓冲液(Pierce)均质化腰椎DRG。使用Bradford测定法(Bio-Rad)测定蛋白质浓度。使用针对
12的酪氨酸激酶
(PTK)阵列(PamGeneInternational B.V.)进行激酶活性分析。对于PTK阵列，每个阵列使用7.5μg蛋白质裂解物。使用
软件(PamGene International B.V.)进行图像量化和统计分析。使用
软件进行上游激酶分析，并使用Kinexus phosphonet富集文件(http://www.phosphonet.ca/)进行肽激酶映射。
结果
为了以公正的方式阐明感觉神经元中的下游信号传导，进行了PamGene激酶活性分析，以在IL4/IL13融合蛋白、IL4+IL13(未连接的细胞因子的组合)和媒剂施用后评估从具有持续紫杉醇诱导的CIPN的小鼠分离的腰椎DRG匀浆中的全局蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。在鞘内施用IL4/IL13融合蛋白、细胞因子组合或媒剂(PBS)后60分钟评估激酶组学谱。还包括原初小鼠(即未用紫杉醇或IL4/IL13融合蛋白处理)。
图15说明了基于IL4/IL13、IL4+IL13和媒剂处理的小鼠与原初小鼠(未处理；无紫杉醇，无鞘内注射)之间的单向ANOVA分析差异地磷酸化的肽。黑色表示没有显著变化，而颜色表示磷酸化减少。对IL4/IL13处理相比于IL4加IL13处理的小鼠和媒剂处理的小鼠的DRG匀浆中被PTK差异磷酸化的肽的分析表明，在用融合蛋白处理后，总共有19种肽被独特磷酸化。
对IL4/IL13处理的雄性和雌性小鼠相比于IL4加IL13处理的小鼠的DRG匀浆中被PTK差异磷酸化的肽的分析表明，在两性中，与细胞因子的组合相比，不同激酶的活性受IL4/IL13的影响不同(图16和图17)。
在来自用IL4/IL13融合蛋白处理的雌性小鼠的DRG中，与用IL4和IL13的组合处理的雌性小鼠相比，几种激酶的活性降低(图16)。该图显示了从
上差异磷酸化的肽底物(这是通过来自IL4/IL13融合蛋白处理的雌性和IL4+IL13处理的雌性(每组n＝3只动物)的样品之间的未配对t-检验比较而鉴定)推断出的预测上游激酶。受影响的前5种预测推定激酶(根据敏感性和特异性评分的总和)是：ITK、RET、TYK2、FER和ERBB4。
在雄性小鼠中，独特的激酶活性显著增加(图17)。该图显示了从
上差异磷酸化的肽底物(这是通过来自IL4/IL13融合蛋白处理的雄性和IL4+IL13处理的雄性(每组n＝3只动物)的样品之间的未配对t检验比较而鉴定)推断出的预测的上游激酶。受影响的前5个预测推定激酶是：LTK、RYK、ALK、AXL和BLK。
这些数据表明，与未连接的IL4加IL13的组合相比，IL4/IL13独特地调节激酶组。
实施例12.本公开的另外融合蛋白
该实施例验证了本公开的含IL13融合蛋白的非限制性实施例的设计和产生。
设计了本公开的包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:14的IL33/IL13融合蛋白。使用SEQ ID NO:3接头将SEQ ID NO:6连接到SEQ ID NO:14，产生SEQ ID NO:23。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，将六组氨酸标签添加到N末端，融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
设计了本公开的包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:14的TGFβ1/IL13融合蛋白。使用SEQ ID NO:3接头将SEQ ID NO:21连接到SEQ ID NO:14，产生SEQ ID NO:24。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，将六组氨酸标签添加到N末端，融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
设计了本公开的包含SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:14的TGFβ2/IL13融合蛋白。使用SEQ ID NO:3接头将SEQ ID NO:22连接到SEQ ID NO:14，产生SEQ ID NO:25。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，将六组氨酸标签添加到N末端，融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
设计了另外的IL4/IL13融合蛋白，其中SEQ ID NO:2或9-15(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个与SEQ ID NO:1或26-28(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个直接或通过本文公开的接头(例如，SEQ ID NO:3或37-44中的任何一个，或其多个)连接。融合蛋白以两个方向设计，例如，IL4位于IL13的C末端侧，或IL4位于IL13的N末端侧。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，亲和标签被添加到每个融合蛋白的N末端和/或C末端，并且融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
设计了另外的IL10/IL13融合蛋白，其中SEQ ID NO:2或9-15(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个与SEQ ID NO:5(或其变体、衍生物或片段)直接或通过本文公开的接头(例如，SEQ ID NO:3或37-44中的任何一个，或其多个)连接。融合蛋白以两个方向设计，例如，IL10位于IL13的C末端侧，或IL10位于IL13的N末端侧。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，亲和标签被添加到每个融合蛋白的N末端和/或C末端，并且融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
设计了另外的IL27/IL13融合蛋白，其中SEQ ID NO:2或9-15(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个与SEQ ID NO:18、36、45或其组合(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个直接或通过本文公开的接头(例如，SEQ ID NO:3或37-44中的任何一个，或其多个)连接。融合蛋白以两个方向设计，例如，IL27位于IL13的C末端侧，或IL27位于IL13的N末端侧。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，亲和标签被添加到每个融合蛋白的N末端和/或C末端，并且融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
设计了另外的IL33/IL13融合蛋白，其中SEQ ID NO:2或9-15(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个与SEQ ID NO:6或29或34(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个直接或通过本文公开的接头(例如，SEQ ID NO:3或37-44中的任何一个，或其多个)连接。融合蛋白以两个方向设计，例如，IL33位于IL13的C末端侧，或IL33位于IL13的N末端侧。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，亲和标签被添加到每个融合蛋白的N末端和/或C末端，并且融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
设计了另外的IL13/IL13融合蛋白，其中SEQ ID NO:2或9-15(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个与SEQ ID NO:2或9-15(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个直接或通过本文公开的接头(例如，SEQ ID NO:3或37-44中的任何一个，或其多个)连接。融合蛋白以两个方向设计，例如，第一IL13位于第二IL13的C末端侧，或第一IL13位于第二IL13的N末端侧。第一IL13和第二IL13可以相同也可以不同。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，亲和标签被添加到每个融合蛋白的N末端和/或C末端，并且融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
设计了另外的TGFβ1/IL13融合蛋白，其中SEQ ID NO:2或9-15(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个与SEQ ID NO:7或21(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个直接或通过本文公开的接头(例如，SEQ ID NO:3或37-44中的任何一个，或其多个)连接。融合蛋白以两个方向设计，例如，TGFβ1位于IL13的C末端侧，或TGFβ1位于IL13的N末端侧。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，亲和标签被添加到每个融合蛋白的N末端和/或C末端，并且融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
设计了另外的TGFβ2/IL13融合蛋白，其中SEQ ID NO:2或9-15(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个与SEQ ID NO:8、22或35(或其变体、衍生物或片段)中的任何一个直接或通过本文公开的接头(例如，SEQ ID NO:3或37-44中的任何一个，或其多个)连接。融合蛋白以两个方向设计，例如，TGFβ2位于IL13的C末端侧，或TGFβ2位于IL13的N末端侧。融合蛋白是如本文所公开的那样产生的。例如，亲和标签被添加到每个融合蛋白的N末端和/或C末端，并且融合蛋白通过如下公开的HEK293E细胞的瞬时转染产生。
本公开的含有IL13的融合蛋白是通过HEK293E细胞的瞬时转染产生的。用含有编码含IL13的融合蛋白序列之一的转基因的pUPE表达载体转染细胞。为了进行纯化，在每个含有IL13的蛋白质的N末端克隆了六组氨酸亲和标签。转染后六天，通过低速离心(10分钟，1000x g)然后高速离心(10分钟，4000x g)收获含有重组蛋白的条件培养基。
通过固定化金属亲和色谱(IMAC)通过His标签纯化蛋白质。简而言之，重组蛋白与0.5ml Nickel
excel在20℃结合。通过离心收获含有结合的蛋白质的Nickel
excel并转移到重力流柱中。通过用含有0和10mM咪唑的IMAC缓冲液(500mM氯化钠，25mM Tris，pH＝8.2)洗涤柱来去除非特异性结合的蛋白质。用含有500mM咪唑的IMAC缓冲液洗脱蛋白质。收集2.5ml的级分。合并含有重组蛋白的级分。条件培养基和未结合的IMAC组分通过
毛细管电泳进行分析。使用Amicon 10kDa旋转过滤器将IMAC池浓缩至2–4ml。通过离心(10分钟18000x g，4℃)去除聚集体。
使用已在PBS中平衡的Superdex200 16/600柱，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质。通过
毛细管电泳分析含有蛋白质的级分，并合并含有重组蛋白质的级分。使用0.22μm注射器过滤器过滤对蛋白质池进行灭菌，并在-80℃下将产品储存在1ml小瓶中。
蛋白质测定：通过测量280nm(DropSense16，Trinean)的吸光度并使用BCA(ThermoScientific)蛋白质测定，以分光光度法确定各批次中的蛋白质浓度。
SDS-Page：在还原和非还原条件下，在4-12％聚丙烯酰胺NuPageTM聚丙烯酰胺凝胶上分析纯化的蛋白质。蛋白质条带通过考马斯蛋白染色可视化。
实施例13.本公开的融合蛋白的神经保护作用
进行测定以评估含IL13的融合蛋白是否具有神经保护特性，例如，抑制紫杉醇诱导的神经突长度减少。对本文公开的任何融合蛋白进行测定，例如包含IL13和调节性细胞因子例如本公开的IL4/IL13、IL10/IL13、IL13/IL13、IL27/IL13、IL33/IL13、TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13的融合蛋白。
DRG神经元的培养：如前所述培养DRG(Nat.Commun.4,1682(2013))。简而言之，将DRG解剖并置于冰冷的解剖培养基(HBSS w/o Ca2+和Mg2+、5mM HEPES和10mM葡萄糖)上。解剖后，切割轴突，用过滤的酶混合物(HBSS不含Ca2+和Mg2+、5mM HEPES、10mM葡萄糖、5mg/mlXI型胶原酶(Sigma)和10mg/ml分散酶(Gibco))代替解剖培养基。将DRG在酶混合物中在37℃和5％CO2孵育30分钟。随后，酶混合物用热灭活的胎牛血清(FBS，Sigma)灭活。细胞在37℃的5％CO2培养箱中在Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco)涂覆的玻璃盖玻片中培养，所述培养基包含10％FBS(Gibco)、2mmol/L谷氨酰胺(Gibco)、在聚-L-赖氨酸(0.01mg/ml，Sigma)上的10,000IU/ml青霉素-链霉素(Gibco)和层粘连蛋白(0.02mg/ml，Sigma)。在接下来的1-2天使用细胞。
治疗和神经突长度测量：培养24小时后，DRG神经元用单独紫杉醇(1μM)或在不同浓度的IL13融合蛋白(例如，0.12nM、0.6nM或3nM)或等摩尔剂量的存在于融合蛋白中的单个细胞因子的存在下处理24小时。使用β3-微管蛋白染色使神经突可视化，而使用NeuN染色确定感觉神经元的数量。拍摄照片并且对于每张照片，确定每个感觉神经元的神经突长度。神经突长度平均为每个动物和条件的单个值。根据以下公式计算1只小鼠的每个小鼠培养物的紫杉醇诱导的神经突长度损失的百分比抑制((μ对照-μ紫杉醇)-(μ对照-X细胞因子))/(μ对照-μ紫杉醇)*100(其中μ是在所有样品中平均化的每个神经元的神经突长度，X是每个单独样品的神经突长度)。
β3-微管蛋白和NeuN染色：细胞在4％PFA中固定10分钟，用含有0.05％Tween-20的PBS透化，然后在封闭缓冲液(1％BSA和含有0.05％Tween-20和0.01％triton的PBS中的5％正常驴血清)中孵育1小时。细胞与兔抗β3微管蛋白(抗-βIII微管蛋白抗体-神经元标记，ab18207，1:1500，Abcam，Cambridge，UK)和NeuN(抗-NeuN抗体克隆A60，MAB377，1:500)Sigma Aldrich(Merck)，Darmstadt，德国)在4℃下孵育过夜，然后洗涤和用AF488缀合的驴抗兔和568缀合的驴抗小鼠二抗(Thermofisher，1:500)进行孵育然后是DAPI(1:5000，Sigma)染色，然后用FluorSave试剂(Millipore)将切片安装在载玻片上。
使用Olympus IX83显微镜(Olympus)拍摄图像。使用CellSens软件(Olympus)和ImageJ(NIH)，使用NeuralNetrics宏(Pani G等人MorphoNeuroNet:An automated methodfor dense neurite network analysis.Cytom Part A.2014年2月；85(2):188–99)分析图片。使用的其他插件是Olympus Viewer插件(Olympus)。使用细胞感知软件根据NeuN染色自动计数神经元的数量。使用ImageJ(Fiji)中的NeuralNetric宏确定神经突长度。确定本公开的含有IL13的融合蛋白抑制紫杉醇诱导的神经突长度减少的能力，并与每种融合蛋白的未连接细胞因子的组合进行比较。
实施例14.本公开的融合蛋白的体内评估
进行测定以评估含IL13的融合蛋白是否可以治疗例如疼痛、化学疗法诱导的多发性神经病变(CIPN)、疼痛、神经纤维损失和异常性疼痛。对本文公开的任何融合蛋白进行测定，例如包含IL13和调节性细胞因子例如本公开的IL4/IL13、IL10/IL13、IL13/IL13、IL27/IL13、IL33/IL13、TGFβ1/IL13或TGFβ2/IL13的融合蛋白。
为了诱导暂时性化学疗法引起的多发性神经病变(CIPN)，在第0天和第2天腹膜内注射紫杉醇(2mg/kg，Cayman Chemical Company)到C57BL/6小鼠中。为了诱导持续性紫杉醇诱导的CIPN，在第0、2、4和6天腹膜内注射紫杉醇(8mg/kg，Cayman Chemical Company)。为了诱导持续性奥沙利铂诱导的多发性神经病变，小鼠接受了两个治疗周期，每个周期由以下组成：每天5次腹膜内注射3mg/kg奥沙利铂(Tocris)，其中无治疗间隔为5天。为了诱导炎性痛觉过敏，小鼠的双后爪接受足底内注射溶解在盐水溶液(NaCl 0.9％)中的20μlλ-角叉菜胶(2％(w/v)，Sigma-Aldrich)。在其他动物中，使用慢性挤压性损伤(CCI)和保留性神经损伤(SNI)模型。
使用von Frey毛发测量后爪中的有害机械敏感性(Stoelting，Wood Dale，USA)。结果表示为使用上下法的50％缩爪阈值。热痛觉过敏是通过使用Hargreaves测试(IITCLife Science)确定热退潜伏时间来评估的。在一些实验中，在第15天爪皮肤中表皮内神经纤维的长度是通过用神经元标记PGP9.5对皮肤活检组织进行免疫荧光染色来确定的。所有实验均以盲法进行。
将含有IL13的融合蛋白施用于小鼠，例如通过在轻度异氟醚/O2麻醉下鞘内注射，或通过本文公开的另一种途径。确定本公开的含IL13的融合蛋白抑制神经病变、痛觉过敏和表皮内神经纤维损失的能力，并将其与每种融合蛋白的未连接细胞因子的组合进行比较。
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序列表
SEQ ID NO:1–人IL4的氨基酸序列
HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS
SEQ
ID NO:2–人IL13的氨基酸序列
PGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN
SEQ ID NO:3–合适接头的氨基酸序列
GSGGGGSGT
SEQ ID NO:4–IL4/IL13融合蛋白的氨基酸序列(接头序列加下划线)
HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSSGSGGGGSGTPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN
SEQ ID NO:5–人IL10的氨基酸序列
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO:6–人IL33的氨基酸序列
MKPKMKYSTNKISTAKWKNTASKALCFKLGKSQQKAKEVCPMYFMKLRSGLMIKKEACYFRRETTKRPSLKTGRKHKRHLVLAACQQQSTVECFAFGISGVQKYTRALHDSSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
SEQ ID NO:7–人未成熟和成熟(下划线)TGFβ1的氨基酸序列：
MPPSGLRLLPLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYI DFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVE QLSNMIVRSCKCS
SEQ ID NO:8–人未成熟和成熟(下划线)TGFβ2的氨基酸序列:
MHYCVLSAFLILHLVTVALSLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSETVCPVVTTPSGSVGSLCSRQSQVLCGYLDAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGA CPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
SEQ ID NO:9–人IL13的氨基酸序列
GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN
SEQ ID NO:10–人IL13的氨基酸序列
SPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN
SEQ ID NO:11–人IL13的氨基酸序列
LTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN
SEQ ID NO:12–人IL13的氨基酸序列
PGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ ID NO:13–人IL13的氨基酸序列
GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ ID NO:14–人IL13的氨基酸序列
SPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ ID NO:15–人IL13的氨基酸序列
LTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ ID NO:16-IL4/IL13融合蛋白的氨基酸序列
HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSSGSGGGGSGTSPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ ID NO:17–IL10/IL13融合蛋白的氨基酸序列
SPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNGSGGGGSGTSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO:18–IL27AL162C的氨基酸序列
FPRPPGRPQLSLQELRREFTVSLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHALLGGLGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNCPEEEEEEEEEEEEERKGLLPGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQP
SEQ ID NO:19–IL27/IL13融合蛋白的氨基酸序列
SPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNGSGGGGSGT
FPRPPGRPQLSLQELRREFTVSLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHALLGGLGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNCPEEEEEEEEEEEEERKGLLPGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQP
SEQ ID NO: 20–IL13/IL13融合蛋白的氨基酸序列
SPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNGSGGGGSGTSPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ ID NO:21–成熟TGFβ1的氨基酸序列
ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
SEQ ID NO:22–成熟TGFβ2的氨基酸序列
ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
SEQ ID NO: 23–IL33/IL13融合蛋白的氨基酸序列
MKPKMKYSTNKISTAKWKNTASKALCFKLGKSQQKAKEVCPMYFMKLRSGLMIKKEACYFRRETTKRPSLKTGRKHKRHLVLAACQQQSTVECFAFGISGVQKYTRALHDSSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSETGSGGGGSGTSPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ ID NO:24–TGFβ1/IL13融合蛋白的氨基酸序列
ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCSGSGGGGSGTSPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ ID NO: 25:TGFβ2/IL13融合蛋白的氨基酸序列
ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCSGSGGGGSGTSPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ ID NO:26人IL4的氨基酸序列
HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS
SEQ ID NO:27–人IL4的氨基酸序列
HKRDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS
SEQ ID NO:28人IL4的氨基酸序列
HKRDITLQEIIKTLNSLTEQKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS
SEQ ID NO:29–人IL33的氨基酸序列
AFGISGVQKYTRALHDSSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
SEQ ID NO:30–人IL33的氨基酸序列
SGVQKYTRALHDSSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
SEQ ID NO:31–人IL33的氨基酸序列
HDSSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
SEQ ID NO:32–人IL33的氨基酸序列
MKPKMKYSTNKISTAKWKNTASKALCFKLGKSQQKAKEVCPMYFMKLRSGLMIKKEACYFRRETTKRPSLKTGRKHKRHLVLAACQQQSTVECFAFGISGVQKYTRALHDSSITDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
SEQ ID NO:33–人IL33的氨基酸序列
MKPKMKYSTNKISTAKWKNTASKALCFKLGKSQQKAKEVCPMYFMKLRSGLMIKKEACYFRRETTKRPSLKTGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
SEQ ID NO:34–人IL33的氨基酸序列
MKPKMKYSTNKISTAKWKNTASKALCFKLGNKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET
SEQ ID NO:35–未成熟TGFβ2的氨基酸序列
MHYCVLSAFLILHLVTVALSLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS
SEQ ID NO:36–IL27A的氨基酸序列
FPRPPGRPQLSLQELRREFTVSLHLARKLLSEVRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHALLGGLGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNLPEEEEEEEEEEEEERKGLLPGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQP
SEQ ID NO:37–接头序列
GGGS
SEQ ID NO:38–接头序列
GGGGS
SEQ ID NO:40–接头序列
KESGSVSSEQLAQFRSLD
SEQ ID NO:41–接头序列
EGKSSGSGSESKST
SEQ ID NO:42–接头序列
GSAGSAAGSGEF
SEQ ID NO:43–接头序列
EAAAK
SEQ ID NO:44–接头序列
EAAAR
SEQ ID NO:45–IL27B的氨基酸序列
RKGPPAALTLPRVQCRASRYPIAVDCSWTLPPAPNSTSPVSFIATYRLGMAARGHSWPCLQQTPTSTSCTITDVQLFSMAPYVLNVTAVHPWGSSSSFVPFITEHIIKPDPPEGVRLSPLAERQLQVQWEPPGSWPFPEIFSLKYWIRYKRQGAARFHRVGPIEATSFILRAVRPRARYYVQVAAQDLTDYGELSDWSLPATATMSLGK
序列表
<110> 斯纳凯恩制药私人有限责任公司
<120> 一种包含IL13的融合蛋白
<130> P33747PC00
<160> 44
<170> 专利版本3.5
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser
1 5 10 15
Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile
20 25 30
Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala
35 40 45
Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg
50 55 60
Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile
65 70 75 80
Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser
115 120 125
Ser
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser
20 25 30
Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu
35 40 45
Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln
50 55 60
Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe
65 70 75 80
Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val
85 90 95
Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe
100 105 110
Asn
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr
1 5
<210> 4
<211> 251
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser
1 5 10 15
Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile
20 25 30
Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala
35 40 45
Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg
50 55 60
Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile
65 70 75 80
Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser
115 120 125
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Pro Gly Pro Val Pro Pro
130 135 140
Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln
145 150 155 160
Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn
165 170 175
Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val
180 185 190
Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe
195 200 205
Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg
210 215 220
Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His
225 230 235 240
Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe Asn
245 250
<210> 5
<211> 160
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 6
<211> 270
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1 5 10 15
Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Gly Leu Met Ile Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr
50 55 60
Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Arg Lys His Lys Arg His Leu
65 70 75 80
Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Ser Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe
85 90 95
Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser
100 105 110
Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr
115 120 125
Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu
130 135 140
Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu
145 150 155 160
Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly
165 170 175
Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe
180 185 190
Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys
195 200 205
Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His
210 215 220
Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile
225 230 235 240
Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu
245 250 255
Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
260 265 270
<210> 7
<211> 390
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr
20 25 30
Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
35 40 45
Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser
50 55 60
Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu
85 90 95
Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu
100 105 110
Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr
115 120 125
His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val
130 135 140
Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu
145 150 155 160
Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn
165 170 175
Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser
180 185 190
Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu
195 200 205
Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr
225 230 235 240
Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro
245 250 255
Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser
275 280 285
Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys
290 295 300
Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn
305 310 315 320
Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr
325 330 335
Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala
340 345 350
Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr
355 360 365
Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val
370 375 380
Arg Ser Cys Lys Cys Ser
385 390
<210> 8
<211> 442
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met His Tyr Cys Val Leu Ser Ala Phe Leu Ile Leu His Leu Val Thr
1 5 10 15
Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe
20 25 30
Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro
50 55 60
Pro Glu Val Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Leu Leu Gln Glu
65 70 75 80
Lys Ala Ser Arg Arg Ala Ala Ala Cys Glu Arg Glu Arg Ser Asp Glu
85 90 95
Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Tyr Lys Ile Asp Met Pro Pro Phe Phe
100 105 110
Pro Ser Glu Thr Val Cys Pro Val Val Thr Thr Pro Ser Gly Ser Val
115 120 125
Gly Ser Leu Cys Ser Arg Gln Ser Gln Val Leu Cys Gly Tyr Leu Asp
130 135 140
Ala Ile Pro Pro Thr Phe Tyr Arg Pro Tyr Phe Arg Ile Val Arg Phe
145 150 155 160
Asp Val Ser Ala Met Glu Lys Asn Ala Ser Asn Leu Val Lys Ala Glu
165 170 175
Phe Arg Val Phe Arg Leu Gln Asn Pro Lys Ala Arg Val Pro Glu Gln
180 185 190
Arg Ile Glu Leu Tyr Gln Ile Leu Lys Ser Lys Asp Leu Thr Ser Pro
195 200 205
Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Ser Lys Val Val Lys Thr Arg Ala Glu Gly
210 215 220
Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Ala Val His Glu Trp Leu His
225 230 235 240
His Lys Asp Arg Asn Leu Gly Phe Lys Ile Ser Leu His Cys Pro Cys
245 250 255
Cys Thr Phe Val Pro Ser Asn Asn Tyr Ile Ile Pro Asn Lys Ser Glu
260 265 270
Glu Leu Glu Ala Arg Phe Ala Gly Ile Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Thr
275 280 285
Ser Gly Asp Gln Lys Thr Ile Lys Ser Thr Arg Lys Lys Asn Ser Gly
290 295 300
Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser Tyr Arg Leu Glu
305 310 315 320
Ser Gln Gln Thr Asn Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Ala Ala Tyr
325 330 335
Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg Pro Leu Tyr Ile
340 345 350
Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly
355 360 365
Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr Leu Trp Ser Ser
370 375 380
Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Pro
385 390 395 400
Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp Leu Glu Pro Leu
405 410 415
Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gln Leu Ser
420 425 430
Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
435 440
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu
1 5 10 15
Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met
20 25 30
Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg
50 55 60
Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser
65 70 75 80
Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys
85 90 95
Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe Asn
100 105 110
<210> 10
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
20 25 30
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
35 40 45
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
50 55 60
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
65 70 75 80
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
85 90 95
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln
100 105 110
Phe Asn
<210> 11
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser
1 5 10 15
Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn
20 25 30
Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu
35 40 45
Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser
50 55 60
Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys
65 70 75 80
Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp
85 90 95
Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu
100 105 110
Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe Asn
115 120
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser
20 25 30
Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu
35 40 45
Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln
50 55 60
Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe
65 70 75 80
Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val
85 90 95
Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe
100 105 110
Asn
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu
1 5 10 15
Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met
20 25 30
Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg
50 55 60
Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser
65 70 75 80
Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys
85 90 95
Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
100 105 110
<210> 14
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
20 25 30
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
35 40 45
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
50 55 60
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
65 70 75 80
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
85 90 95
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg
100 105 110
Phe Asn
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser
1 5 10 15
Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn
20 25 30
Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu
35 40 45
Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser
50 55 60
Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys
65 70 75 80
Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp
85 90 95
Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu
100 105 110
Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
115 120
<210> 16
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 16
His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser
1 5 10 15
Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile
20 25 30
Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala
35 40 45
Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg
50 55 60
Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile
65 70 75 80
Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser
115 120 125
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Pro Gly Pro Val Pro
130 135 140
Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr
145 150 155 160
Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile
165 170 175
Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn
180 185 190
Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly
195 200 205
Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val
210 215 220
Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu
225 230 235 240
His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
245 250
<210> 17
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 17
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
20 25 30
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
35 40 45
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
50 55 60
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
65 70 75 80
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
85 90 95
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg
100 105 110
Phe Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Pro Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn
130 135 140
Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe
145 150 155 160
Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu
165 170 175
Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile
180 185 190
Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro
195 200 205
Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu
210 215 220
Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys
225 230 235 240
Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu
245 250 255
Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr
260 265 270
Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
275 280
<210> 18
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 18
Phe Pro Arg Pro Pro Gly Arg Pro Gln Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg
1 5 10 15
Arg Glu Phe Thr Val Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu
20 25 30
Val Arg Gly Gln Ala His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu Pro Gly Val
35 40 45
Asn Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Gly Glu Gln Leu Pro Asp Val Ser Leu
50 55 60
Thr Phe Gln Ala Trp Arg Arg Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ile Ser Thr Thr Leu Gln Pro Phe His Ala Leu Leu Gly Gly Leu Gly
85 90 95
Thr Gln Gly Arg Trp Thr Asn Met Glu Arg Met Gln Leu Trp Ala Met
100 105 110
Arg Leu Asp Leu Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu
115 120 125
Ala Ala Gly Phe Asn Cys Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
130 135 140
Glu Glu Glu Glu Arg Lys Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala
145 150 155 160
Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Ser Thr Tyr
165 170 175
Arg Leu Leu His Ser Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Glu
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Ser Lys Ala Gly His Ser Val Trp Pro Leu Gly Phe
195 200 205
Pro Thr Leu Ser Pro Gln Pro
210 215
<210> 19
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 19
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
20 25 30
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
35 40 45
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
50 55 60
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
65 70 75 80
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
85 90 95
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg
100 105 110
Phe Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Phe Pro Arg Pro Pro
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Gly Arg Pro Gln Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Phe Thr Val
130 135 140
Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu Val Arg Gly Gln Ala
145 150 155 160
His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu Pro Gly Val Asn Leu Tyr Leu Leu
165 170 175
Pro Leu Gly Glu Gln Leu Pro Asp Val Ser Leu Thr Phe Gln Ala Trp
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Arg Arg Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe Ile Ser Thr Thr Leu
195 200 205
Gln Pro Phe His Ala Leu Leu Gly Gly Leu Gly Thr Gln Gly Arg Trp
210 215 220
Thr Asn Met Glu Arg Met Gln Leu Trp Ala Met Arg Leu Asp Leu Arg
225 230 235 240
Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu Ala Ala Gly Phe Asn
245 250 255
Cys Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Arg
260 265 270
Lys Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Leu Gln Gly Pro Ala
275 280 285
Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Ser Thr Tyr Arg Leu Leu His Ser
290 295 300
Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Glu Leu Leu Leu Leu Ser
305 310 315 320
Lys Ala Gly His Ser Val Trp Pro Leu Gly Phe Pro Thr Leu Ser Pro
325 330 335
Gln Pro
<210> 20
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 20
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
20 25 30
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
35 40 45
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
50 55 60
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
65 70 75 80
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
85 90 95
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg
100 105 110
Phe Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Pro Gly Pro Val
115 120 125
Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile
130 135 140
Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser
145 150 155 160
Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile
165 170 175
Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser
180 185 190
Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His
195 200 205
Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu
210 215 220
Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
225 230 235
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu
50 55 60
Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys
1 5 10 15
Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu
50 55 60
Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser
65 70 75 80
Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro
85 90 95
Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 23
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 23
Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1 5 10 15
Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Gly Leu Met Ile Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr
50 55 60
Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Arg Lys His Lys Arg His Leu
65 70 75 80
Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Ser Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe
85 90 95
Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser
100 105 110
Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr
115 120 125
Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu
130 135 140
Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu
145 150 155 160
Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly
165 170 175
Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe
180 185 190
Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys
195 200 205
Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His
210 215 220
Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile
225 230 235 240
Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu
245 250 255
Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr
275 280 285
Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln
290 295 300
Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr
305 310 315 320
Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly
325 330 335
Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro
340 345 350
His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr
355 360 365
Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys
370 375 380
Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
385 390
<210> 24
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 24
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu
50 55 60
Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro
115 120 125
Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln
130 135 140
Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn
145 150 155 160
Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val
165 170 175
Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe
180 185 190
Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg
195 200 205
Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His
210 215 220
Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
225 230 235
<210> 25
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 25
Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys
1 5 10 15
Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu
50 55 60
Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser
65 70 75 80
Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro
85 90 95
Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro
115 120 125
Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln
130 135 140
Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn
145 150 155 160
Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val
165 170 175
Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe
180 185 190
Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg
195 200 205
Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His
210 215 220
Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn
225 230 235
<210> 26
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser
1 5 10 15
Leu Thr Glu Gln Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala
20 25 30
Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg
35 40 45
Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile
50 55 60
Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu
65 70 75 80
Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe
85 90 95
Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser
100 105 110
Ser
<210> 27
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
His Lys Arg Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser
1 5 10 15
Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile
20 25 30
Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala
35 40 45
Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg
50 55 60
Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile
65 70 75 80
Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser
115 120 125
Ser
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
His Lys Arg Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser
1 5 10 15
Leu Thr Glu Gln Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala
20 25 30
Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg
35 40 45
Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile
50 55 60
Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu
65 70 75 80
Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe
85 90 95
Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser
100 105 110
Ser
<210> 29
<211> 176
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Ala Phe Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu
20 25 30
Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser
35 40 45
Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys
50 55 60
Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly
65 70 75 80
Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys
85 90 95
Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His
100 105 110
Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn
115 120 125
Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val
130 135 140
Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser
145 150 155 160
Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
165 170 175
<210> 30
<211> 172
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser Ile Thr
1 5 10 15
Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn
20 25 30
Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr
35 40 45
Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser
50 55 60
Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp
65 70 75 80
Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu
85 90 95
His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys
100 105 110
Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn
115 120 125
Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val
130 135 140
Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu
145 150 155 160
Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
165 170
<210> 31
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
His Asp Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala
1 5 10 15
Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp
20 25 30
Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys
35 40 45
Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu
50 55 60
Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro
65 70 75 80
Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu
85 90 95
Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu
100 105 110
His Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro
115 120 125
Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val
130 135 140
Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser
145 150 155 160
Glu Thr
<210> 32
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1 5 10 15
Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Gly Leu Met Ile Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr
50 55 60
Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Arg Lys His Lys Arg His Leu
65 70 75 80
Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Ser Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe
85 90 95
Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser
100 105 110
Ile Thr Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser
115 120 125
Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu
130 135 140
Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe
165 170 175
Val Leu His Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr
180 185 190
Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile
195 200 205
Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys
210 215 220
Leu Ser Glu Thr
225
<210> 33
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1 5 10 15
Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Gly Leu Met Ile Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr
50 55 60
Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr
65 70 75 80
Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu
85 90 95
Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu
100 105 110
Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser
115 120 125
Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu
130 135 140
Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe
165 170 175
Val Leu His Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr
180 185 190
Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile
195 200 205
Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys
210 215 220
Leu Ser Glu Thr
225
<210> 34
<211> 144
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1 5 10 15
Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Asn Lys
20 25 30
Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly
35 40 45
Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys
50 55 60
Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His
65 70 75 80
Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn
85 90 95
Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val
100 105 110
Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser
115 120 125
Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
130 135 140
<210> 35
<211> 414
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Met His Tyr Cys Val Leu Ser Ala Phe Leu Ile Leu His Leu Val Thr
1 5 10 15
Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe
20 25 30
Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro
50 55 60
Pro Glu Val Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Leu Leu Gln Glu
65 70 75 80
Lys Ala Ser Arg Arg Ala Ala Ala Cys Glu Arg Glu Arg Ser Asp Glu
85 90 95
Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Tyr Lys Ile Asp Met Pro Pro Phe Phe
100 105 110
Pro Ser Glu Asn Ala Ile Pro Pro Thr Phe Tyr Arg Pro Tyr Phe Arg
115 120 125
Ile Val Arg Phe Asp Val Ser Ala Met Glu Lys Asn Ala Ser Asn Leu
130 135 140
Val Lys Ala Glu Phe Arg Val Phe Arg Leu Gln Asn Pro Lys Ala Arg
145 150 155 160
Val Pro Glu Gln Arg Ile Glu Leu Tyr Gln Ile Leu Lys Ser Lys Asp
165 170 175
Leu Thr Ser Pro Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Ser Lys Val Val Lys Thr
180 185 190
Arg Ala Glu Gly Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Ala Val His
195 200 205
Glu Trp Leu His His Lys Asp Arg Asn Leu Gly Phe Lys Ile Ser Leu
210 215 220
His Cys Pro Cys Cys Thr Phe Val Pro Ser Asn Asn Tyr Ile Ile Pro
225 230 235 240
Asn Lys Ser Glu Glu Leu Glu Ala Arg Phe Ala Gly Ile Asp Gly Thr
245 250 255
Ser Thr Tyr Thr Ser Gly Asp Gln Lys Thr Ile Lys Ser Thr Arg Lys
260 265 270
Lys Asn Ser Gly Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser
275 280 285
Tyr Arg Leu Glu Ser Gln Gln Thr Asn Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu
290 295 300
Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg
305 310 315 320
Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His
325 330 335
Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr
340 345 350
Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn
355 360 365
Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp
370 375 380
Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile
385 390 395 400
Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
405 410
<210> 36
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Phe Pro Arg Pro Pro Gly Arg Pro Gln Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg
1 5 10 15
Arg Glu Phe Thr Val Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu
20 25 30
Val Arg Gly Gln Ala His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu Pro Gly Val
35 40 45
Asn Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Gly Glu Gln Leu Pro Asp Val Ser Leu
50 55 60
Thr Phe Gln Ala Trp Arg Arg Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ile Ser Thr Thr Leu Gln Pro Phe His Ala Leu Leu Gly Gly Leu Gly
85 90 95
Thr Gln Gly Arg Trp Thr Asn Met Glu Arg Met Gln Leu Trp Ala Met
100 105 110
Arg Leu Asp Leu Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu
115 120 125
Ala Ala Gly Phe Asn Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
130 135 140
Glu Glu Glu Glu Arg Lys Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala
145 150 155 160
Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Ser Thr Tyr
165 170 175
Arg Leu Leu His Ser Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Glu
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Ser Lys Ala Gly His Ser Val Trp Pro Leu Gly Phe
195 200 205
Pro Thr Leu Ser Pro Gln Pro
210 215
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 37
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 38
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 39
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 40
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 41
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 42
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 43
Glu Ala Ala Ala Arg
1 5
<210> 44
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> -
<400> 44
Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Cys Arg
1 5 10 15
Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp Cys Ser Trp Thr Leu Pro Pro
20 25 30
Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser Phe Ile Ala Thr Tyr Arg Leu
35 40 45
Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp Pro Cys Leu Gln Gln Thr Pro
50 55 60
Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp Val Gln Leu Phe Ser Met Ala
65 70 75 80
Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Trp Gly Ser Ser Ser
85 90 95
Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro
100 105 110
Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu Arg Gln Leu Gln Val Gln
115 120 125
Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro Glu Ile Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly Ala Ala Arg Phe His Arg Val
145 150 155 160
Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile Leu Arg Ala Val Arg Pro Arg
165 170 175
Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val Ala Ala Gln Asp Leu Thr Asp Tyr Gly
180 185 190
Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr Ala Thr Met Ser Leu Gly
195 200 205
Lys
Claims (241)
1.一种包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于治疗有需要的受试者的神经病变的用途。
2.一种包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于治疗有需要的受试者的疼痛的用途。
3.一种包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于治疗有需要的受试者的神经变性或神经炎症的用途。
4.一种包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于治疗有需要的受试者的炎症的用途。
5.一种包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于促进有需要的受试者的神经保护的用途。
6.一种包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列的融合蛋白用于调节神经系统细胞中的信号传导通路的活性的用途。
7.用于根据权利要求1-6中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子选自白介素4(IL4)、白介素10(IL10)、白介素33(IL33)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)和另外的白介素13(IL13)。
8.用于根据权利要求1-6中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是IL4。
9.用于根据权利要求1-6中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是IL10。
10.用于根据权利要求1-6中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是IL33。
11.用于根据权利要求1-6中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是白介素27(IL27)。
12.用于根据权利要求1-6中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是TGFβ1。
13.用于根据权利要求1-6中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是TGFβ2。
14.用于根据权利要求1-6中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是另外的IL13。
15.用于根据权利要求1-14中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13包含野生型IL13。
16.用于根据权利要求1-15中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13是哺乳动物IL13。
17.用于根据权利要求1-16中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13是人IL13。
18.用于根据权利要求1-17中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子包含野生型调节性细胞因子。
19.用于根据权利要求1-18中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是哺乳动物调节性细胞因子。
20.用于根据权利要求1-19中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是人调节性细胞因子。
21.用于根据权利要求11-20中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述白介素27包含白介素27α(IL27A)。
22.用于根据权利要求11-21中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL27A包含相对于SEQ ID NO:36的L134C置换。
23.用于根据权利要求1-22中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)。
24.用于根据权利要求1-23中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α2(IL-13Rα2)。
25.用于根据权利要求1-24中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素4受体α(IL-4Rα)。
26.用于根据权利要求1-25中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子氨基酸序列是以与野生型调节性细胞因子相当的亲和力结合所述调节性细胞因子的受体的所有亚基的衍生序列。
27.用于根据权利要求1-26中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子氨基酸序列是激活所述调节性细胞因子的天然受体的衍生序列。
28.用于根据权利要求1-27中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13包含与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
29.用于根据权利要求1-27中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13包含选自SEQID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的氨基酸序列。
30.用于根据权利要求1-27中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13包含相对于选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。
31.用于根据权利要求1-30中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
32.用于根据权利要求1-30中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
33.用于根据权利要求1-30中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子包含相对于选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。
34.用于根据权利要求1-33中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13和所述调节性细胞因子共价连接。
35.用于根据权利要求1-34中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13和所述调节性细胞因子通过接头连接。
36.用于根据权利要求1-35中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13的C末端与所述细胞因子的N末端连接，任选地通过接头连接。
37.用于根据权利要求1-35中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述IL13的N末端与所述细胞因子的C末端连接，任选地通过接头连接。
38.用于根据权利要求1-37中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含一个或多个化学修饰。
39.用于根据权利要求1-38中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述一个或多个化学修饰选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化。
40.用于根据权利要求1-39中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述蛋白质构建体包含亲和标签。
41.用于根据权利要求1或7-40中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经病变是创伤后周围神经病变、术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、化学疗法诱导的神经病变、多神经病变、单神经病变、多发性单神经病变、颅神经病变、主要运动神经病变、主要感觉神经病变、感觉运动神经病变、自主神经病变、特发性神经病变、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、舌咽神经痛、枕神经痛、阴部神经痛、非典型性三叉神经痛、坐骨神经痛、臂神经丛病变或肋间神经痛。
42.用于根据权利要求1和7-41中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经病变与疼痛、麻木、虚弱、灼热、萎缩、刺痛、抽搐或其组合相关。
43.用于根据权利要求2和7-40中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述疼痛是慢性疼痛。
44.用于根据权利要求2、7-40和43中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述疼痛是病理性疼痛、炎症性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛。
45.用于根据权利要求2、7-40和43-44中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述疼痛是内脏伤害性疼痛、非内脏伤害性疼痛、周围神经性疼痛、中枢神经性疼痛或其组合。
46.用于根据权利要求2、7-40和43-45中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述疼痛是矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、化学疗法相关疼痛、化学疗法诱导的异常性疼痛、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、腰痛、癌症疼痛或慢性内脏痛。
47.用于根据权利要求2、7-40和43-45中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述疼痛与以下有关：肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后周围神经病变、术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法诱导的神经病变、多发性硬化、化学疗法诱导的神经变性、复杂性局部疼痛综合征、骨关节炎、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多神经病变或肌萎缩侧索硬化。
48.用于根据权利要求2、7-40和43-45中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述疼痛与以下有关：阿尔珀斯病、蛛网膜炎、关节纤维化、共济失调性脑瘫、自身免疫性萎缩性胃炎、淀粉样变性、hATTR淀粉样变性、缺血性坏死、背痛、贝敦氏症、贝赛特氏病(综合征)、突破性疼痛、口灼伤综合征、滑囊炎、伴有皮质下梗死和脑白质病的中枢性常染色体显性动脉病(Cadasil)、脑缺血、脑-眼-面-骨骼综合征(COFS)、腕管综合征、马尾综合征、中枢性疼痛综合征、脑瘫、脑脊液(CSF)泄漏、宫颈狭窄、腓骨肌萎缩症(CMT)疾病、慢性功能性腹痛(CFAP)、慢性胰腺炎、肺萎陷(气胸)、皮质基底节变性、挤压性损伤、角膜神经性疼痛、挤压综合征、椎间盘退变疾病、皮肌炎、痴呆、肌张力障碍、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、子宫内膜异位症、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征(EMS)、红斑性肢痛症、腰椎手术失败综合征(FBSS)、纤维肌痛、弗里德赖希共济失调症、额颞痴呆、舌咽神经痛、生长痛、椎间盘突出、脑积水、肋间神经痛、间质性膀胱炎、青少年皮炎、膝部损伤、腿痛、路易体痴呆症、腰痛血尿综合征、莱姆病、感觉异常性股痛、线粒体病、混合性痴呆、运动神经元病(MND)、单肢肌萎缩、多系统萎缩(MSA)、肌炎、颈痛、枕神经痛、骨质疏松、横纹肌溶解、佩吉特病、牧师特纳综合征、骨盆痛、周围神经病变、幻肢痛、神经挟捏、足底筋膜炎、风湿性多肌痛、多肌炎、疝修补术后疼痛综合征、乳房切除术后疼痛综合征、中风后疼痛、开胸术后疼痛综合征、脊髓灰质炎后综合征、原发性侧索硬化、银屑病关节炎、阴部神经痛、神经根病、不宁腿综合征、类风湿关节炎(RA)、骶髂关节功能障碍、结节病、舒曼脊柱后凸症、坐骨神经痛、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA)、带状疱疹、痉挛性斜颈、奥迪氏括约肌功能障碍、脊髓损伤、椎管狭窄、脊髓空洞症、塔洛夫囊肿、脊髓栓系综合征、胸廓出口综合征(TOS)、TMJ障碍、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、血管疼痛、外阴痛、颈椎过度屈伸或其组合。
49.用于根据权利要求3和7-40中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经变性或神经炎症包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、脊髓小脑共济失调或脊髓性肌萎缩。
50.用于根据权利要求4和7-40中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述炎症包含慢性炎症。
51.用于根据权利要求4、7-40和50中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述炎症包含局部炎症或全身炎症。
52.用于根据权利要求4、7-40和50-51中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述炎症与以下有关：炎症肠病、肠易激综合征、骨关节炎、类风湿关节炎、肾小球肾炎、脓毒症、成人呼吸窘迫综合征、皮炎、结节病、过敏性炎症、银屑病、强直性脊椎关节炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、痛风、同种异体移植、异种移植、自身免疫性疾病、斯耶格伦氏病、灼伤、创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、缺血再灌注损伤、细胞因子或其他治疗性单克隆抗体的体内施用诱导的毒性。
53.用于根据权利要求1-5和7-52中任一项所述用途的融合蛋白，其中神经纤维退行减少。
54.用于根据权利要求1-5和7-53中任一项所述用途的融合蛋白，其中神经纤维损失减少。
55.用于根据权利要求1-5和7-54中任一项所述用途的融合蛋白，其中神经纤维密度的维持得以促进。
56.用于根据权利要求1-5和7-55中任一项所述用途的融合蛋白，其中神经纤维长再生得以促进。
57.用于根据权利要求1-5和7-56中任一项用途的融合蛋白，其中中枢神经系统的神经保护得以促进。
58.用于根据权利要求1-5和7-57中任一项所述用途的融合蛋白，其中周围神经系统的神经保护得以促进。
59.用于根据权利要求1-55和7-58中任一项所述用途的融合蛋白，其中表皮内神经纤维损失减少。
60.用于根据权利要求1-59中任一项所述用途的融合蛋白，其中神经元功能障碍减少。
61.用于根据权利要求1-5和7-60中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白引发比等量的所述IL13、所述调节性细胞因子或其组合更大程度的治疗效果。
62.用于根据权利要求1-5和7-61中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白引发比等量的所述IL13、所述调节性细胞因子或其组合更长持续时间的治疗效果。
63.用于根据权利要求1-62中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白存在于包含所述融合蛋白和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。
64.用于根据权利要求63所述用途的融合蛋白，其中所述药物组合物呈单位剂型。
65.用于根据权利要求63-64中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白以约50μg/mL至约100mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。
66.用于根据权利要求63-65中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白被配制用于以约0.5μg/kg体重至约1mg/kg体重之间的剂量施用。
67.用于根据权利要求63-66中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白被配制用于以控释制剂施用。
68.用于根据权利要求63-67中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白被配制用于通过以下施用：肠胃外、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内或器官实质内途径。
69.用于根据权利要求6-40中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经系统细胞是神经元。
70.用于根据权利要求6-40中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经系统细胞是中枢神经系统细胞。
71.用于根据权利要求6-40中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经系统细胞是周围神经系统细胞。
72.用于根据权利要求69所述用途的融合蛋白，其中所述神经元是感觉神经元。
73.用于根据权利要求69所述用途的融合蛋白，其中所述神经元是躯体感觉神经元。
74.用于根据权利要求69所述用途的融合蛋白，其中所述神经元是内脏感觉神经元。
75.用于根据权利要求69所述用途的融合蛋白，其中所述神经元是伤害感受器。
76.用于根据权利要求69所述用途的融合蛋白，其中所述神经元是自主神经元。
77.用于根据权利要求6-40和70-71中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经系统细胞是神经胶质细胞。
78.用于根据权利要求6-40和70-71中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经系统细胞是小胶质细胞。
79.用于根据权利要求6-40和70-71中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经系统细胞是浸润细胞。
80.用于根据权利要求6-40和70-71中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述神经系统细胞是浸润巨噬细胞。
81.用于根据权利要求6-40和69-81中任一项所述用途的融合蛋白，其中所述信号传导通路在促炎介质的存在下被调节。
82.一种治疗有需要的受试者的神经病变的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
83.一种治疗有需要的受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
84.一种治疗有需要的受试者的神经变性或神经炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
85.一种治疗有需要的受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
86.一种促进有需要的受试者的神经保护的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
87.一种调节神经系统细胞中的信号传导通路活性的方法，所述方法包括使所述神经系统细胞与融合蛋白接触，所述融合蛋白包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
88.根据权利要求82-87中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子选自白介素4(IL4)、白介素10(IL10)、白介素33(IL33)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)和另外的白介素13(aIL13)。
89.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子是IL4。
90.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子是IL10。
91.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子是IL33。
92.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子是白介素27(IL27)。
93.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子是TGFβ1。
94.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子是TGFβ2。
95.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子是aIL13。
96.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述IL13包含野生型IL13。
97.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述IL13是哺乳动物IL13。
98.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述IL13是人IL13。
99.根据权利要求82-98中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子包含野生型调节性细胞因子。
100.根据权利要求82-99中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子是哺乳动物调节性细胞因子。
101.根据权利要求82-99中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子是人调节性细胞因子。
102.根据权利要求82-87和96-101中任一项所述的方法，其中所述白介素27包含白介素27α(IL27A)。
103.根据权利要求82-87和96-101中任一项所述的方法，其中所述IL27A包含相对于SEQ ID NO:36的L134C置换。
104.根据权利要求82-103中任一项所述的方法，其中所述IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)。
105.根据权利要求82-104中任一项所述的方法，其中所述IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α2(IL-13Rα2)。
106.根据权利要求82-105中任一项所述的方法，其中所述IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素4受体α(IL-4Rα)。
107.根据权利要求82-98和100-106中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子氨基酸序列是以与野生型调节性细胞因子相当的亲和力结合所述调节性细胞因子的受体的所有亚基的衍生序列。
108.根据权利要求82-98和100-107中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子氨基酸序列是激活所述调节性细胞因子的天然受体的衍生序列。
109.根据权利要求82-95和97-108中任一项所述的方法，其中所述IL13包含与选自SEQID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
110.根据权利要求82-109中任一项所述的方法，其中所述IL13包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的氨基酸序列。
111.根据权利要求82-95和97-109中任一项所述的方法，其中所述IL13包含相对于选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。
112.根据权利要求82-111中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
113.根据权利要求82-106和109-112中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
114.根据权利要求82-106和109-113中任一项所述的方法，其中所述调节性细胞因子包含相对于选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。
115.根据权利要求82-114中任一项所述的方法，其中所述IL13和所述调节性细胞因子共价连接。
116.根据权利要求82-115中任一项所述的方法，其中所述IL13和所述调节性细胞因子通过接头连接。
117.根据权利要求82-115中任一项所述的方法，其中所述IL13的C末端与所述细胞因子的N末端连接，任选地通过接头连接。
118.根据权利要求82-115中任一项所述的方法，其中所述IL13的N末端与所述细胞因子的C末端连接，任选地通过接头连接。
119.根据权利要求82-118中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白进一步包含一个或多个化学修饰。
120.根据权利要求82-119中任一项所述的方法，其中所述一个或多个化学修饰选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化。
121.根据权利要求82-120中任一项所述的方法，其中所述蛋白质构建体包含亲和标签。
122.根据权利要求82和88-121中任一项所述的方法，其中所述神经病变是创伤后周围神经病变、术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、化学疗法诱导的神经病变、多神经病变、单神经病变、多发性单神经病变、颅神经病变、主要运动神经病变、主要感觉神经病变、感觉运动神经病变、自主神经病变、特发性神经病变、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、舌咽神经痛、枕神经痛、阴部神经痛、非典型性三叉神经痛、坐骨神经痛、臂神经丛病变或肋间神经痛。
123.根据权利要求82和88-122中任一项所述的方法，其中所述神经病变与疼痛、麻木、虚弱、灼热、萎缩、刺痛、抽搐或其组合相关。
124.根据权利要求83和88-121中任一项所述的方法，其中所述疼痛是慢性疼痛。
125.根据权利要求83、88-121和124中任一项所述的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛、伤害性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛。
126.根据权利要求83、88-121和124中任一项所述的方法，其中所述疼痛是内脏伤害性疼痛、非内脏伤害性疼痛、周围神经性疼痛、中枢神经性疼痛或其组合。
127.根据权利要求83、88-121和124中任一项所述的方法，其中所述疼痛是矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、化学疗法相关疼痛、化学疗法诱导的异常性疼痛、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、腰痛、癌症疼痛或慢性内脏痛。
128.根据权利要求83、88-121和124-127中任一项所述的方法，其中所述疼痛与以下有关：肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后周围神经病变、术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法诱导的神经病变、多发性硬化、化学疗法诱导的神经变性、复杂性局部疼痛综合征、骨关节炎、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多神经病变或肌萎缩侧索硬化。
129.根据权利要求83、88-121和124-127中任一项所述的方法，其中所述疼痛与以下有关：阿尔珀斯病、蛛网膜炎、关节纤维化、共济失调性脑瘫、自身免疫性萎缩性胃炎、淀粉样变性、hATTR淀粉样变性、缺血性坏死、背痛、贝敦氏症、贝赛特氏病(综合征)、突破性疼痛、口灼伤综合征、滑囊炎、伴有皮质下梗死和脑白质病的中枢性常染色体显性动脉病(Cadasil)、脑缺血、脑-眼-面-骨骼综合征(COFS)、腕管综合征、马尾综合征、中枢性疼痛综合征、脑瘫、脑脊液(CSF)泄漏、宫颈狭窄、腓骨肌萎缩症(CMT)疾病、慢性功能性腹痛(CFAP)、慢性胰腺炎、肺萎陷(气胸)、皮质基底节变性、挤压性损伤、角膜神经性疼痛、挤压综合征、椎间盘退变疾病、皮肌炎、痴呆、肌张力障碍、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、子宫内膜异位症、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征(EMS)、红斑性肢痛症、腰椎手术失败综合征(FBSS)、纤维肌痛、弗里德赖希共济失调症、额颞痴呆、舌咽神经痛、生长痛、椎间盘突出、脑积水、肋间神经痛、间质性膀胱炎、青少年皮炎、膝部损伤、腿痛、路易体痴呆症、腰痛血尿综合征、莱姆病、感觉异常性股痛、线粒体病、混合性痴呆、运动神经元病(MND)、单肢肌萎缩、多系统萎缩(MSA)、肌炎、颈痛、枕神经痛、骨质疏松、横纹肌溶解、佩吉特病、牧师特纳综合征、骨盆痛、周围神经病变、幻肢痛、神经挟捏、足底筋膜炎、风湿性多肌痛、多肌炎、疝修补术后疼痛综合征、乳房切除术后疼痛综合征、中风后疼痛、开胸术后疼痛综合征、脊髓灰质炎后综合征、原发性侧索硬化、银屑病关节炎、阴部神经痛、神经根病、不宁腿综合征、类风湿关节炎(RA)、骶髂关节功能障碍、结节病、舒曼脊柱后凸症、坐骨神经痛、脊髓小脑共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩(SMA)、带状疱疹、痉挛性斜颈、奥迪氏括约肌功能障碍、脊髓损伤、椎管狭窄、脊髓空洞症、塔洛夫囊肿、脊髓栓系综合征、胸廓出口综合征(TOS)、TMJ障碍、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、血管疼痛、外阴痛、颈椎过度屈伸或其组合。
130.根据权利要求84和88-121中任一项所述的方法，其中所述神经变性或神经炎症包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、脊髓小脑共济失调或脊髓性肌萎缩。
131.根据权利要求85和88-121中任一项所述的方法，其中所述炎症包含慢性炎症。
132.根据权利要求85、88-121和131中任一项所述的方法，其中所述炎症包含局部炎症或全身炎症。
133.根据权利要求85、88-121和131中任一项所述的方法，其中所述炎症与以下有关：炎症肠病、肠易激综合征、骨关节炎、类风湿关节炎、肾小球肾炎、脓毒症、成人呼吸窘迫综合征、皮炎、结节病、过敏性炎症、银屑病、强直性脊椎关节炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、痛风、同种异体移植、异种移植、自身免疫性疾病、斯耶格伦氏病、灼伤、创伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病、体外透析和血液氧合、缺血再灌注损伤、细胞因子或其他治疗性单克隆抗体的体内施用诱导的毒性。
134.根据权利要求82-133中任一项所述的方法，其中指示了IL13治疗。
135.根据权利要求82-134中任一项所述的方法，其中指示了IL4、IL10、IL27、IL33、TGFβ1或TGFβ2治疗。
136.根据权利要求82-86和88-135中任一项所述的方法，其中所述方法减少神经纤维退行。
137.根据权利要求82-86和88-135中任一项所述的方法，其中所述方法减少神经纤维损失。
138.根据权利要求82-86和88-135中任一项所述的方法，其中所述方法促进神经纤维密度的维持。
139.根据权利要求82-86和88-135中任一项所述的方法，其中所述方法促进神经纤维再生长。
140.根据权利要求82-86和88-135中任一项所述的方法，其中所述方法促进所述中枢神经系统中的神经保护。
141.根据权利要求82-86和88-135中任一项所述的方法，其中所述方法促进所述周围神经系统中的神经保护。
142.根据权利要求82-86和88-135中任一项所述的方法，其中所述方法减少表皮内神经纤维损失。
143.根据权利要求82-86和88-135中任一项所述的方法，其中所述方法减少神经元功能障碍。
144.根据权利要求82-86和88-143中任一项所述的方法，其中施用所述融合蛋白引发比施用等量的所述IL13、所述调节性细胞因子或其组合更大程度的治疗效果。
145.根据权利要求82-86和88-144中任一项所述的方法，其中施用所述融合蛋白引发比施用等量的所述IL13、所述调节性细胞因子或其组合更长持续时间的治疗效果。
146.根据权利要求82-86和88-144中任一项所述的方法，其中如通过在紫杉醇诱导的神经病变小鼠模型中对von Frey毛发的机械敏感性测量的，施用导致与单独或组合施用相当量的所述IL13和所述调节性细胞因子相比更高程度的疼痛缓解。
147.根据权利要求82-146中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白存在于包含所述融合蛋白和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。
148.根据权利要求147所述的方法，其中所述组合物呈单位剂型。
149.根据权利要求147-148中任一项的方法，其中所述融合蛋白以约50μg/mL至约100mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。
150.根据权利要求82-86和88-149中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白以约0.5μg至1mg/kg体重的剂量施用。
151.根据权利要求82-86和88-150中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白以控释制剂施用。
152.根据权利要求82-86和88-151中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白通过以下施用：肠胃外、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内或器官实质内途径。
153.根据权利要求87-121中任一项的方法，其中所述神经系统细胞是神经元。
154.根据权利要求87-121和153中任一项所述的方法，其中所述神经系统细胞是中枢神经系统细胞。
155.根据权利要求87-121和153中任一项所述的方法，其中所述神经系统细胞是周围神经系统细胞。
156.根据权利要求153-155中任一项所述的方法，其中所述神经元是感觉神经元。
157.根据权利要求153-155中任一项所述的方法，其中所述神经元是躯体感觉神经元。
158.根据权利要求153-155中任一项所述的方法，其中所述神经元是内脏感觉神经元。
159.根据权利要求153-155中任一项所述的方法，其中所述神经元是伤害感受器。
160.根据权利要求153-155中任一项所述的方法，其中所述神经元是自主神经元。
161.根据权利要求87-121和154-155中任一项所述的方法，其中所述神经系统细胞是神经胶质细胞。
162.根据权利要求87-121和154-155中任一项所述的方法，其中所述神经系统细胞是小胶质细胞。
163.根据权利要求87-121和154-155中任一项所述的方法，其中所述神经系统细胞是浸润细胞。
164.根据权利要求87-121和154-155中任一项所述的方法，其中所述神经系统细胞是浸润巨噬细胞。
165.根据权利要求87-121和153-164中任一项所述的方法，其中所述信号传导通路在促炎介质的存在下被调节。
166.一种融合蛋白，其包含作为野生型IL13序列的白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列。
167.一种融合蛋白，其包含白介素13(IL13)氨基酸序列和作为野生型序列的调节性细胞因子氨基酸序列。
168.一种融合蛋白，其包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列，其中所述IL13氨基酸序列是IL13衍生序列，所述IL13衍生序列以与野生型白介素13序列相当的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)、白介素13受体α2(IL-13Rα2)和白介素4受体α(IL-4Rα)。
169.一种融合蛋白，其包含白介素13(IL13)氨基酸序列和调节性细胞因子氨基酸序列，其中所述调节性细胞因子氨基酸序列是衍生序列，所述衍生序列以与野生型调节性细胞因子相当的亲和力结合所述野生型调节性细胞因子结合的所有受体亚基。
170.根据权利要求166-169中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子选自白介素4(IL4)、白介素10(IL10)、白介素33(IL33)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)和另外的白介素13(aIL13)。
171.根据权利要求166-169中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是IL4。
172.根据权利要求166-169中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是IL10。
173.根据权利要求166-169中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是IL33。
174.根据权利要求166-169中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是白介素27(IL27)。
175.根据权利要求166-169中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是TGFβ1。
176.根据权利要求166-169中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是TGFβ2。
177.根据权利要求166-169中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是另外的白介素13(aIL13)。
178.根据权利要求166-177中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13是哺乳动物IL13。
179.根据权利要求166-178中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13是人IL13。
180.根据权利要求167和169-179中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13包含野生型IL13。
181.根据权利要求166、168和170-180中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子包含野生型调节性细胞因子。
182.根据权利要求166-181中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是哺乳动物调节性细胞因子。
183.根据权利要求166-182中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子是人调节性细胞因子。
184.根据权利要求174和178-183中任一项所述的融合蛋白，其中所述白介素27包含白介素27α(IL27A)。
185.根据权利要求174和178-184中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL27A包含相对于SEQ ID NO:36的L134C置换。
186.根据权利要求167、169-179和181-185中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α1(IL-13Rα1)。
187.根据权利要求167、169-179和181-186中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素13受体α2(IL-13Rα2)。
188.根据权利要求167、169-179和181-187中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13以与野生型IL13相比增加不到两倍和减少不到两倍的亲和力结合白介素4受体α(IL-4Rα)。
189.根据权利要求166、168、170-180和182-188中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子氨基酸序列是以与野生型调节性细胞因子相当的亲和力结合所述调节性细胞因子的受体的所有亚基的衍生序列。
190.根据权利要求166、168、170-180和182-189中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子氨基酸序列是激活所述调节性细胞因子的天然受体的衍生序列。
191.根据权利要求166-190中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13包含与选自SEQID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
192.根据权利要求166、167和169-191中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的氨基酸序列。
193.根据权利要求167-179和181-191中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13包含相对于选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9-15中的任一个的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。
194.根据权利要求166-193中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
195.根据权利要求166-168、170-188和191-194中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
196.根据权利要求166、168-180和182-194中任一项所述的融合蛋白，其中所述调节性细胞因子包含相对于选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:26-28中任一个、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:29-34中任一个、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:45的序列具有1至10个氨基酸缺失、插入、置换或其组合的氨基酸序列。
197.根据权利要求166-196中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13和所述调节性细胞因子共价连接。
198.根据权利要求166-197中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13和所述调节性细胞因子通过接头连接。
199.根据权利要求166-198中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13的C末端与所述细胞因子的N末端连接，任选地通过接头连接。
200.根据权利要求166-198中任一项所述的融合蛋白，其中所述IL13的N末端与所述细胞因子的C末端连接，任选地通过接头连接。
201.根据权利要求166-200中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含一个或多个化学修饰。
202.根据权利要求201所述的融合蛋白，其中所述一个或多个化学修饰选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化。
203.根据权利要求166-202中任一项所述的融合蛋白，其中所述蛋白质构建体包含亲和标签。
204.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求166-203中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸序列。
205.根据权利要求204所述的核酸分子，其中所述多核苷酸经过密码子优化以在所述细胞中表达。
206.一种核酸载体，其包含根据权利要求204或权利要求205所述的多核苷酸序列。
207.一种细胞，其包含根据权利要求204或权利要求205所述的核酸。
208.一种药物组合物，其包含根据权利要求166-203中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。
209.一种药物组合物，其包含根据权利要求206所述的核酸载体和药学上可接受的赋形剂。
210.根据权利要求208或权利要求209所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈单位剂型。
211.根据权利要求208-210中任一项所述的药物组合物，其中所述融合蛋白以约50μg/mL至约100mg/mL存在于所述药物组合物中。
212.根据权利要求208-211中任一项所述的药物组合物，其中所述融合蛋白被配制用于以约0.5μg/kg至1mg/kg体重的剂量施用。
213.根据权利要求208-212中任一项所述的药物组合物，其中所述融合蛋白被配制用于作为控释制剂施用。
214.根据权利要求208-213中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于通过以下施用：肠胃外、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、胸骨内、脑内、眼内、病灶内、脑室内、脑池内或器官实质内途径。
215.一种治疗有需要的受试者的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求208-214中任一项所述的药物组合物。
216.一种产生融合蛋白的方法，所述方法包括在允许产生所述融合蛋白的条件下培养细胞，其中所述细胞包含权利要求204或权利要求205所述的多核苷酸序列。
217.根据权利要求216所述的方法，所述方法进一步包括收获所述融合蛋白。
218.根据权利要求216所述的方法，所述方法进一步包括从收获的培养基中纯化所述融合蛋白。
219.一种融合蛋白，其包含白介素13和选自白介素4、白介素10、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2和白介素13的白介素。
220.根据权利要求219所述的融合蛋白，其中所述白介素13和选自白介素4、白介素10、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2和白介素13的所述白介素通过接头序列连接。
221.根据权利要求219-220中任一项所述的融合蛋白，其中所述白介素13与选自白介素4、白介素10、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2和白介素13的所述白介素的N末端融合。
222.根据权利要求219-220中任一项所述的融合蛋白，其中选自白介素4、白介素10、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2和白介素13的所述白介素与所述白介素13的N末端融合。
223.根据权利要求219-222中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含一个或多个化学修饰。
224.根据权利要求223所述的融合蛋白，其中所述化学修饰选自糖基化、岩藻糖基化、唾液酸化和聚乙二醇化。
225.根据权利要求219-224中任一项所述的融合蛋白，其中所述白介素13是人白介素13。
226.根据权利要求219-225中任一项所述的融合蛋白，其中所述白介素4是人白介素4，和/或所述白介素10是人白介素10，和/或所述白介素33是人白介素33，和/或所述转化生长因子β1是人转化生长因子β1，和/或所述转化生长因子β2是人转化生长因子β2。
227.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求219-226之一所述的融合蛋白的多核苷酸。
228.一种载体，其包含权利要求227所述的核酸分子。
229.一种宿主细胞，其包含根据权利要求227所述的核酸分子或根据权利要求228所述的载体。
230.用于产生根据权利要求219-226中任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
-在允许产生根据权利要求219-226中任一项所述的融合蛋白的条件下培养根据权利要求229所述的宿主细胞；
-任选地，从条件培养基中纯化所述融合蛋白。
231.一种药物组合物，其包含根据权利要求219-226中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载剂。
232.根据权利要求219-226中任一项所述的融合蛋白用作药物的用途。
233.根据权利要求219-226中任一项所述的融合蛋白用于预防或治疗特征在于慢性疼痛、神经炎症或神经变性的病症的用途。
234.用于根据权利要求233所述用途的融合蛋白，其中所述病症的进一步特征在于内脏或非内脏伤害性疼痛、周围或中枢神经性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛、神经炎症和/或神经变性。
235.用于如权利要求233或权利要求234所述用途的融合蛋白，其中所述病症选自矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后或手术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、疼痛性周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法相关的疼痛、化学疗法诱导的异常性疼痛、复杂性局部疼痛综合征、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、多发性硬化、腰痛、骨关节炎、癌症疼痛、慢性内脏痛、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病和帕金森病、亨廷顿病和/或肌萎缩侧索硬化或多发性硬化。
236.根据权利要求219-226中任一项所述的融合蛋白用于预防或治疗哺乳动物例如人的临床病症的用途，其中白介素13适用于所述病症。
237.根据权利要求219-226中任一项所述的融合蛋白用于预防或治疗哺乳动物例如人的临床病症的用途，其中白介素4和/或白介素10和/或白介素33和/或白介素27和/或转化生长因子β1和/或转化生长因子β2适用于所述病症。
238.一种基因疗法载体，其包含编码白介素13和选自白介素4、白介素10、白介素27、白介素33、转化生长因子β1、转化生长因子β2、和白介素13的白介素的一种或多种核苷酸序列，用于预防或治疗以慢性疼痛、神经炎症和/或神经变性为特征的病症。
239.根据权利要求239所述的基因疗法载体，其中所述病症的进一步特征在于内脏或非内脏伤害性疼痛、周围或中枢神经性疼痛或混合型伤害性-神经性疼痛、神经炎症和/或神经变性。
240.根据权利要求238或权利要求239所述的基因疗法载体，其中所述病症选自矫形外科手术后疼痛、肌肉骨骼痛、肠易激综合征、炎性肠病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、创伤后或手术后周围神经病变、糖尿病性周围神经病变、炎症性周围神经病变、HIV相关神经病变、疼痛性周围神经病变、神经卡压综合征、化学疗法相关的疼痛、化学疗法诱导的异常性疼痛、复杂性局部疼痛综合征、脊髓损伤后疼痛、中风后疼痛、多发性硬化、腰痛、骨关节炎、癌症疼痛、慢性内脏痛、纤维肌痛、风湿性多肌痛、肌筋膜痛综合征、阿尔茨海默病和帕金森病、亨廷顿病和/或肌萎缩侧索硬化或多发性硬化。
241.根据权利要求166-203中任一项所述的融合蛋白用于将白介素13受体与调节性细胞因子受体交联的用途。
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