PT1538206E

PT1538206E - Método para a síntese química e construção completa de genes e genomas

Info

Publication number: PT1538206E
Application number: PT05005266T
Authority: PT
Inventors: A Evans Glen
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Priority date: 1997-09-16
Filing date: 1998-09-16
Publication date: 2010-04-12
Also published as: CY1110163T1; EP1538206A3; US20030165946A1; AU9393398A; EP1015576B1; EP1538206A2; WO1999014318A1; ES2340857T3; ATE294860T1; PT1015576E; ATE462004T1; US6521427B1; ES2243007T3; EP1015576A1; DE69830065D1; DE69830065T2; DK1538206T3; EP1538206B1; DK1015576T3; DE69841578D1

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA A SÍNTESE QUÍMICA E CONSTRUÇÃO COMPLETA DE GENES E GENOMAS" 1. Campo da Invenção A presente invenção refere-se, geralmente, aos campos da síntese oligonucleotídica. De um modo mais particular, a mesma refere-se à construção de genes e genomas de organismos artificiais completamente sintéticos. 2. Descrição de Técnica Relacionada A investigação e aplicações comerciais actuais em biologia molecular são baseadas em ADN recombinante, desenvolvido nos anos 1970. Uma faceta crítica do ADN recombinante é a clonagem molecular em plasmídeos, coberta pela patente seminal de Cohen e Boyer (Patente U.S. 4740470 "Biologically functional molecular chimeras"). Esta patente ensina um método para o "corte e remoção/união" de moléculas de ADN baseado em endonucleases de restrição, a introdução destas moléculas "recombinantes" em células hospedeiras e a sua replicação nos hospedeiros bacterianos. Esta técnica é a base de toda a clonagem molecular para investigação e fins comerciais, efectuada durante os últimos 20 anos e a base do campo da biologia molecular e genética. 1 A tecnologia do ADN recombinante é uma poderosa tecnologia, porém está limitada em utilidade a modificações de sequências de ADN existentes que são modificadas através de 1) sitios de clivagem de restrição enzimática, 2) iniciadores PAC para amplificação, 3) mutagénese especifica do sitio e outras técnicas. A criação de uma molécula inteiramente nova ou a modificação substancial de moléculas existentes, é extremamente demorada, dispendiosa, requer múltiplas e complexos passos e, em alguns casos, é impossível. A tecnologia do ADN recombinante não permite a criação de moléculas, genes, genomas ou organismos inteiramente artificiais, mas apenas modificações de organismos de ocorrência natural. A biotecnologia actual para produção industrial, para concepção e desenvolvimento de fármacos, para potenciais aplicações de desenvolvimento de vacinas e terapia genética e para utilização agrícola e ambiental de ADN recombinante, depende de organismos e moléculas de ADN de ocorrência natural. Criar ou manipular funções novas ou invulgares, ou modificar organismos para utilização especializada (tal como a produção de uma hormona humana), requer manipulações substancialmente complexas, demoradas e difíceis de moléculas de ADN de ocorrência natural. Em alguns casos, as alterações ao ADN de ocorrência natural são tão complexas que, na prática, não são possíveis. Deste modo, há uma necessidade de tecnologia que permita a criação de novas moléculas de ADN numa único passo, sem requerer a utilização de qualquer ADN recombinante ou de ocorrência natural existente. WOSNICK MA et al. refere-se à síntese química e expressão total em E. coli de um gene da glutationo-transferase (GST) de milho (GENE, vol. 76, 1984, páginas 153-160). L.D. BELL et al. 2 refere-se à síntese química, clonagem e expressão em células de mamífero de um gene codificando para o activador do plasminogénio do tipo de tecido humano (GENE, vol. 63, 1988, páginas 155-163). M.D. EDGE et al. refere-se à síntese total de um gene de interferão de leucócito humano (NATURE, vol. 292, 20 de Agosto de 1981 (1981-08-20), páginas 756-762). L. FERRETTI et al. refere-se à síntese total de um gene para a rodopsina de bovino (PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 83, Fevereiro de 1996 (1996-02), páginas 599-603). LASHKARI D A et al. refere-se a um sintetizador oligonucleotídico multiplex automatizado e desenvolvimento de síntese de ADN de alto rendimento a baixo custo (PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 92, n° 17, 15 de Agosto de 1995 (1995-08-15), páginas 7912-7915) . L.E. SINDELAR E J.M. JAKLEVIC descrevem a síntese de ADN de alto rendimento num formato multicanal (NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 23, n° 6, 1995, páginas 982-987). S. RAINER et al. descreve o MerMade, um sintetizador oligodesoxirribonucleotídico para produção oligonucleotídica de alto rendimento em placas de 96 poços duplas (GENOME RESEARCH, vol. 8, n° 7, Julho de 1998 (1998-07), páginas 741-747). O documento EP 0385410 refere-se a um método para formação de um oligonucleótido, compreendendo os passos de síntese de um par de oligonucleotidos complementares, ligação do par de oligonucleotidos nas porções de sequências de bases complementares; e polimerização de bases de ácido nucleico sobre o par de oligonucleotidos resultante. O documento EP 0316018 ensina a modificação de uma sequência de ADN por digestão de uma sequência de ADN vector com uma enzima de restrição, remoção de quaisquer nucleótidos não desejados, tratamento do vector clivado com exonuclease III, de modo a criar extremidades coesivas 5', mistura com o vector assim tratado de um número par 3 de nucleótidos de cadeia simples de sequência sentido e anti-sentido alternada que alternadamente codifica ou é complementar às sequências desejadas no ADN produto e cujos oligonucleótidos de cadeia simples têm extremidades que se sobrepõem e são complementares a extremidades do(s) oligonucleótido(s) adjacente(s) e/ou extremidades coesivas 5' de vector clivado. 0 documento W09412632 refere-se a um método de sintese de ácido nucleico por uma reacção de polimerização em cadeia, efectuada numa série de iniciadores de sobreposição que abrangem a totalidade do comprimento do ácido nucleico a ser sintetizado. 0 documento WO 9000626 refere-se à construção de montagem de fase sólida de biopolímeros através de construção de sequências de biopolímeros mais curtas, por exemplo, construção de genes a partir de oligonucleótidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção aborda as limitações em manipulações de ácido nucleico recombinante actuais proporcionando um meio rápido, eficiente, para a produção de praticamente qualquer sequência de ácidos nucleicos, incluindo genes, segmentos cromossómicos e genomas inteiros. Em virtude desta abordagem se basear numa abordagem completamente sintética, não existem quaisquer limitações, tal como a disponibilidade de ácidos nucleicos existentes, para impedir a construção até de segmentos muito grandes de ácidos nucleicos. A invenção proporciona um método para a síntese de um polinucleótido de cadeia dupla sem a utilização de qualquer ADN recombinante ou de ocorrência natural existente, compreendendo os passos de 4 a) produção de um primeiro conjunto de oligonucleótidos correspondendo à totalidade da cadeia mais do referido polinucleótido de cadeia dupla; b) produção de um segundo conjunto de oligonucleótidos correspondendo à totalidade da cadeia menos do referido polinucleótido de cadeia dupla; e c) emparelhamento dos referidos primeiro e segundo conjuntos de oligonucleótidos; em que o passo (c) compreende os passos de i. emparelhamento do oligonucleótido 5' terminal do referido primeiro conjunto de oligonucleótidos com o oligonucleótido 3' terminal do referido segundo conjunto de oligonucleótidos, ii. emparelhamento do oligonucleótido mais 5' terminal seguinte do referido primeiro conjunto de oligonucleótidos com o produto do passo (i), iii. emparelhamento do oligonucleótido mais 3' terminal seguinte do referido segundo conjunto de oligonucleótidos com o produto do passo (ii), iv. repetição do processo até que todos os oligonucleótidos dos referidos primeiro e segundo conjuntos de oligonucleótidos tenham sido emparelhados, 5 em que cada dos referidos oligonucleótidos do referido segundo conjunto de oligonucleótidos se sobrepõe e híbrida com dois oligonucleótidos complementares do referido primeiro conjunto de oligonucleótidos, excepto que dois oligonucleótidos numa extremidade 5' ou 3' do referido polinucleótido de cadeia dupla se irão hibridar com apenas um oligonucleótido complementar. A invenção proporciona, adicionalmente, um método de síntese de um polinucleótido de cadeia dupla, compreendendo: (a) emparelhamento de um oligonucleótido 5' terminal com um oligonucleótido 3' terminal de um polinucleótido de cadeia dupla, de modo a produzir um primeiro produto emparelhado e adicionando, directamente, um oligonucleótido mais 5' terminal seguinte do referido polinucleótido de cadeia dupla ao referido primeiro produto emparelhado, sob condições suficientes para emparelhamento, de modo a produzir um segundo produto emparelhado, o referido oligonucleótido mais terminal seguinte tendo um comprimento de, pelo menos, cerca de 25 bases e (b) repetição do passo (a) uma ou mais vezes, de modo a produzir, sequencialmente, um polinucleótido de cadeia dupla. É proporcionado um método para a construção de um segmento de ADN de cadeia dupla compreendendo os passos de (i) proporcionar dois conjuntos de oligonucleótidos de cadeia simples, em que (a) o primeiro conjunto compreende a totalidade da cadeia mais do referido segmento de ADN, (b) o segundo conjunto compreende a totalidade da cadeia menos do referido segmento de ADN e (c) cada dos referidos primeiro conjunto de oligonucleótidos sendo complementar a dois oligonucleótidos do referido segundo conjunto de oligonucleótidos, (ii) emparelhamento do referido primeiro e referido segundo conjuntos de oligonucleótidos e (iii) tratamento dos referidos 6 oligonucleótidos emparelhados com uma enzima de ligação. Etapas adicionais proporcionam a síntese dos conjuntos oligonucleotídicos e a transformação de células hospedeiras com o segmento de ADN resultante.

Em formas de realização particulares, o segmento de ADN tem 100, 200, 300, 40, 800, 100, 1500, 200, 4000, 8000, 10000, 12000, 18000, 20000, 40000, 80000; 100000, 10% 107, 108, 109 ou mais pares de bases em comprimento. De facto, está contemplado que os métodos da presente invenção irão ser capazes de criar genomas artificiais inteiros, de comprimentos comparáveis a genomas bacterianos, de levedura, virais, de mamífero, anfíbios, de répteis, aviários conhecidos. Em formas de realização mais particulares, o segmento de ADN é um gene codificando uma proteína de interesse. Adicionalmente, o segmento de ADN pode incluir elementos não codificantes, tais como origens de replicação, telómeros, promotores, estimuladores, sinais de iniciação e terminação de transcrição e tradução, intrões, sítios de união de exões, componentes de suporte de cromatina e outras sequências reguladoras. O segmento de ADN pode compreender múltiplos genes, segmentos cromossómicos, cromossomas e até genomas inteiros. Os segmentos de ADN podem ser derivados de sequências procarióticas ou eucarióticas, incluindo bacterianas, de levedura, virais, de mamífero, anfíbias, de répteis, aviárias, vegetais, archebacteria e outros organismos vivos contendo ADN.

Os conjuntos oligonucleotídicos são, de um modo preferido, oligonucleótidos compreendidos entre cerca de 15 e 100 bases e, de um modo mais preferido, entre cerca de 20 e 50 bases. Comprimentos específicos incluem mas não estão limitados a 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 7 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 . 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100 . Dependendo do tamanho, a sobrepos. ição entre os oligonucleótidos dos dois conjuntos pode ser concebida para ser entre 5 e 75 bases por par oligonucleotídico.

Os oligonucleótidos são, de um modo preferido, tratados com polinucleótido cinase, por exemplo, T4 polinucleótido cinase. A actividade de cinase pode ser realizada antes da mistura do conjunto oligonucleotídico ou após, mas antes do emparelhamento. Após o emparelhamento, os oligonucleótidos são tratados com uma enzima tendo uma função de ligação. Por exemplo, uma ADN ligase tipicamente irá ser empregue para esta função. Contudo, a topoisomerase que nao requer fosforilaçao em 5', é rápida e opera à temperatura ambiente e pode ser utilizada em vez da ligase. É proporcionado um método para a construção de um segmento de ADN de cadeia dupla compreendendo os passos de (i) proporcionar dois conjuntos de oligonucleótidos de cadeia simples, em que (a) o primeiro conjunto compreende a totalidade da cadeia mais do referido segmento de ADN, (b) o segundo conjunto compreende a totalidade da cadeia menos do referido segmento de ADN e (c) cada dos referidos primeiro conjunto de oligonucleótidos sendo complementar a dois oligonucleótidos do referido segundo conjunto de oligonucleótidos, (ii) emparelhamento de pares de oligonucleótidos complementares, de modo a produzir um conjunto de primeiros produtos emparelhados, em que cada par compreende um oligonucleótido de cada dos referidos primeiro e segundo conjuntos de oligonucleótidos, 8 (iii) emparelhamento de pares de primeiros produtos emparelhados tendo sequências complementares, de modo a produzir um conjunto de segundos produtos emparelhados, (iv) repetição do processo até que todos os produtos emparelhados tenham sido emparelhados num único segmento de ADN e (v) tratamento dos referidos produtos emparelhados com enzima de ligação. É proporcionado um método para a construção de um segmento de ADN de cadeia dupla compreendendo os passos de (i) proporcionar dois conjuntos de oligonucleótidos de cadeia simples, em que (a) o primeiro conjunto compreende a totalidade da cadeia mais do referido segmento de ADN, (b) o segundo conjunto compreende a totalidade da cadeia menos do referido segmento de ADN e (c) cada dos referidos primeiro conjunto de oligonucleótidos sendo complementar a dois oligonucleótidos do referido segundo conjunto de oligonucleótidos, (ii) emparelhamento do referido oligonucleótido 5' terminal do referido primeiro conjunto de oligonucleótidos com oligonucleótido 3' terminal do referido segundo conjunto de oligonucleótidos, (iii) emparelhamento do oligonucleótido mais 5' terminal seguinte do referido primeiro conjunto de oligonucleótidos com o produto do passo (ii), (iv) emparelhamento do oligonucleótido mais 3' terminal seguinte do referido segundo conjunto de oligonucleótidos com o produto do passo (iii), (v) repetição do processo até que todos os oligonucleótidos dos referidos primeiro e segundo conjuntos tenham sido emparelhados e (vi) tratamento dos referidos oligonucleótidos emparelhados com enzima de ligação. Passos adicionais proporcionam a síntese dos conjuntos oligonucleotídicos e a transformação de células hospedeiras com o segmento de ADN resultante. Numa forma de realização preferida, o oligonucleótido 5' terminal do primeiro conjunto é 9 ligado a um suporte, processo que pode incluir o passo adicional de remoção do segmento de ADN do suporte. 0 suporte pode ser qualquer suporte conhecido na técnica, por exemplo, uma placa de microtitulação, um filtro, esférulas de poliestireno, tabuleiro de poliestireno, esférulas magnéticas, agarose e semelhantes.

As condições de emparelhamento podem ser ajustadas com base na particular estratégia utilizada para emparelhamento, no tamanho e composição dos oligonucleótidos e na extensão de sobreposição entre os oligonucleótidos dos primeiro e segundo conjuntos. Por exemplo, se a totalidade de oligonucleótidos for misturada entre si antes do emparelhamento, é conduzido o aquecimento da mistura a 80 °C, seguido de emparelhamento lento, durante 1 a 12 h. Deste modo, o emparelhamento pode ser conduzido durante cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9 ou cerca de 10 h. Contudo, noutras formas de realização, o tempo de emparelhamento pode ser tão longo como 24 h.

Com o auxilio de um computador, a requerente é capaz de dirigir a síntese de uma combinação vector/gene utilizando um sintetizador oligonucleotídico de alto rendimento, como preparado para oligonucleótidos componentes de sobreposição. Os oligonucleótidos são construídos utilizando uma estratégia de construção combinatória robótica e a construção ligada utilizando ADN ligase ou topoisomerase, seguido de transformação numa estirpe hospedeira adequada. Numa particular forma de realização, esta invenção produz um conjunto de estirpes bacterianas contendo um vector de expressão viável para todos os genes numa região definida do genoma. Noutras formas de realização, está também contemplado um sistema vector de expressão de levedura ou baculovírus, de modo a permitir a 10 expressão de cada gene numa região cromossómica num hospedeiro eucariótico. Ainda noutra forma de realização, a presente invenção permite a um especialista na técnica elaborar uma estratégia de "gene de concepção", em gue um gene ou genomas ou virtualmente qualquer estrutura pode ser facilmente concebida, sintetizada e expressa. Deste modo, eventualmente a tecnologia aqui descrita pode ser empregue para produzir genomas inteiros para introdução em células hospedeiras para a criação de organismos vivos de concepção inteiramente artificial.

Em formas de realização especificas, a presente invenção proporciona um método para a síntese de um polinucleótido competente para replicação, de cadeia dupla, em que o polinucleótido compreende uma origem de replicação, uma primeira região codificante e um primeiro elemento regulador dirigindo a expressão da primeira região codificante.

Adicionalmente, o método pode compreender, adicionalmente, 0 passo de amplificação do polinucleótido de cadeia dupla. Em formas de realização específicas, o polinucleótido de cadeia dupla compreende 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10 x 103, 20 x 103, 30 x 103, 40 x 103, 50 x 103, 60 x 103, 70 x 103, 80 x 103, 90 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109 ou 1 x 1010 pares de bases em comprimento. O primeiro elemento regulador pode ser um promotor. Em determinadas formas de realização, o polinucleótido de cadeia dupla compreende, adicionalmente, um segundo elemento regulador, sendo o segundo elemento regulador um sinal de poliadenilação. Ainda em mais formas de realização, o polinucleótido de cadeia dupla compreende uma pluralidade de regiões codificantes e uma pluralidade de elementos reguladores. Especificamente, está contemplado que as regiões codificantes codificam produtos que 11 compreendem uma via bioquímica. Em formas de realização particulares, a via bioquímica é a glicólise. De um modo mais particular, está contemplado que as regiões codificantes codificam enzimas seleccionadas do grupo consistindo em hexocinase, fosfo-hexose isomerase, fosfofrutocinase-1, aldolase, triose-fosfato isomerase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, fosfoglicerato cinase, fosfoglicerato mutase, enolase e enzimas de piruvato cinase da via glicolítica.

Noutras formas de realização, a via bioquímica é a síntese lipídica, síntese de cofactor. Estão particularmente contempladas a síntese de ácido lipóico, síntese de riboflavina, síntese nucleotídica. 0 nucleótido pode ser uma purina ou uma pirimidina.

Em determinadas outras formas de realização, está contemplado que as regiões codificantes codificam enzimas envolvidas num processo celular seleccionado do grupo consistindo em divisão celular, chaperone, destoxificação, secreção peptídica, metabolismo energético, função reguladora, replicação de ADN, transcrição, processamento de ARN e modificação de ARNt. Em formas de realização preferidas, o metabolismo energético é a fosforilação oxidativa.

Está contemplado que o polinucleótido de cadeia dupla é um ADN ou um ARN. Em formas de realizaçao preferidas, 0 polinucleótido de cadeia dupla pode ser um cromossoma. 0 polinucleótido de cadeia dupla pode ser uma construção de expressão. Especificamente, a construção de expressão pode ser uma construção de expressão bacteriana, uma construção de expressão de mamífero ou uma construção de expressão virai. Em particulares formas de realização, o polinucleótido de cadeia 12 dupla compreende um genoma seleccionado do grupo consistindo em genoma bacteriano, genoma de levedura, genoma virai, genoma de mamífero, genoma de anfíbio e genoma aviário.

Naquelas formas de realização, nas quais o genoma é um genoma virai, o genoma virai pode ser seleccionado do grupo consistindo em retrovírus, adenovírus, vírus da vacínia, herpesvírus e vírus adeno-associado. A presente invenção pode ser utilizada para a produção de uma partícula virai. 0 método pode ser utilizado para a produção de um genoma artificial, em que o cromossoma compreende todas as regiões codificantes e elementos reguladores verificados num cromossoma natural correspondente. Em formas de realização específicas, o cromossoma natural correspondente é um genoma mitocondrial humano. Noutras formas de realização, o cromossoma natural correspondente é um genoma de cloroplasto. 0 método pode ser utilizado para a produção de um sistema genético artificial, em que o sistema compreende todas as regiões codificantes e elementos reguladores verificados numa via bioquímica natural correspondente. Uma tal via bioquímica irá, provavelmente, possuir um grupo de enzimas que serialmente metaboliza um composto. Em formas de realização particularmente preferidas, a via bioquímica compreende as actividades requeridas para a glicólise. Noutras formas de realização, a via bioquímica compreende as enzimas requeridas para o transporte de electrões. Ainda noutras formas de realização adicionais, a via bioquímica compreende as actividades enzimáticas requeridas para a fotossíntese. 13

Outros objectivos, características e vantagens da presente invenção irão tornar-se evidentes a partir da descrição detalhada que se segue. A descrição detalhada e exemplos específicos, embora indicando formas de realização preferidas da invenção, são proporcionados apenas a título de ilustração.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os seguintes desenhos fazem parte da descrição e são incluídos de modo a demonstrar, adicionalmente, determinados aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem compreendida por referência a um ou mais destes desenhos, em combinação com a descrição detalhada de formas de realização específicas aqui apresentadas. FIG. 1. Fluxograma do paradigma do Parque Jurássico para a construção de organismos sintéticos e remontagem de organismos vivos. FIG. 2. Fluxograma da estratégia da genética sintética e construção de organismos. FIG. 3. Fluxograma da estratégia de oito passos para a construção combinatória de oligonucleótidos em genes ou genomas completos.

FIG. 4A-FIG. 4C. Concepção do plasmídeo synlux4. A sequência de 4800 está anotada com as localizações dos genes lux A+B, neomicina/canamicina fosfotransferase e sequências pUC19. 14 FIG. 5A-FIG. 5F. Lista de oligonucleótidos componentes derivados da sequência de Synlux4 na Figura 4A-FIG. 4C. FIG. 6A-FIG. 6B. Esquema para a construção combinatória de plasmideos sintéticos a partir de oligonucleótidos componentes. FIG. 7A-FIG. 7G. Programa SynGene para a produção de oligonucleótidos de sobreposição, suficientes para a reconstrução do gene ou plasmídeo.

DESCRIÇÃO DE FORMAS DE REALIZAÇÃO ILUSTRATIVAS A sequência completa de genomas complexos, incluindo o genoma humano, torna possível à genética, as abordagens funcionais de grande escala. A presente invenção delineia uma nova abordagem para a utilização de resultados de informação de sequência genómica, por síntese génica dirigida por computador, baseada em computação sobre a base de dados genómica humana. Especificamente, a invenção descreve a síntese química e re-síntese de genes para a transferência destes genes para dentro de células hospedeiras adequadas. A presente invenção proporciona métodos que podem ser utilizados para sintetizar de novo segmentos de ADN que codificam conjuntos de genes, sejam genes de ocorrência natural, expressos a partir de construções promotoras naturais ou artificiais, ou genes artificiais derivados de sequências de ADN sintéticas que codificam elementos de sistemas biológicos que realizam uma função ou atribuição especificada de um organismo artificial, assim como genomas inteiros. Na produção de tais 15 sistemas e genomas, a presente invenção proporciona a síntese de um polinucleótido competente para replicação, de cadeia dupla, em que o polinucleótido tem uma origem de replicação, uma primeira região codificante e um primeiro elemento regulador dirigindo a expressão da primeira região codificante. Por competente para replicação, significa que o polinucleótido é capaz de dirigir a sua própria replicação. Deste modo, está previsto que o polinucleótido irá possuir todos os sinais actuando em eis, requeridos para facilitar a sua própria síntese. A esse respeito, o polinucleótido irá ser semelhante a um plasmídeo ou um vírus, de modo a que após colocado dentro de uma célula, seja capaz de ser replicado por uma combinação das funções polinucleotídicos e celulares.

Deste modo, utilizando as técnicas da presente invenção, um especialista na técnica pode criar um genoma artificial que é capaz codificar todas as actividades requeridas para a sustentar a sua própria existência. Estão também contemplados sistemas genéticos artificiais que são capazes de codificar enzimas e actividades de uma particular via bioquímica. Num tal sistema, irá ser desejável ter todas as actividades presentes, de modo a que a via bioquímica completa possa operar. A co-expressão de um conjunto de enzimas requerido para uma via particular constitui um sistema genético ou biológico completo. Por exemplo, a co-expressão das enzimas envolvidas na glicólise, constitui um sistema genético completo para a produção de energia na forma de ATP a partir de glucose. Tais sistemas para a produção de energia podem incluir grupos de enzimas que, naturalmente ou artificialmente, metabolizam em série um conjunto de compostos.

Os tipos de vias bioquímicas incluiriam mas não estão limitados àqueles para a biossíntese de grupos prostéticos de 16 cofactores e transportadores (síntese de lipoato, síntese de riboflavina, síntese de nucleótido piridina); a biossíntese dos envelopes celulares (membranas, lipoproteínas, porinas, polissacáridos de superfície, lipopolissacáridos, antigénios e estruturas de superfície); processos celulares incluindo divisão celular, chaperones, destoxificação, secreção proteica, metabolismo intermediário central (produção de energia por meio de compostos de fósforo e outros); metabolismo energético incluindo aeróbio, anaeróbio, interconversões de força motora de protões de ATP, transporte de electrões, via de glicólise da triose fosfato, piruvato desidrogenase, metabolismo do açúcar; purina, síntese de nucleótido pirimidina, incluindo síntese de 2'desoxirribonucleótido, interconversão de nucleótido e nucleósido, resgate de nucleósido e nucleótidos, biossíntese e conversão de açúcar-nucleótido; funções reguladoras incluindo controlos transcricional e traducional, replicação de ADN incluindo degradação de ADN, replicação de ADN, modificação de restrição, recombinação e reparação; transcrição incluindo degradação de ADN, ARN polimerase dependente de ADN e factores de transcrição; processamento de ARN; tradução incluindo aminoacilo ARNt sintetases, degradação de péptidos e glicopéptidos, modificação proteica, síntese e modificação ribossómica, modificação de ARNt; factores de tradução, proteínas de transporte e ligação incluindo aminoácido, péptido, amino hidrato de carbono, álcool orgânico, ácido orgânico e transporte catiónico; e outros sistemas para a adaptação, função específica ou sobrevivência de um organismo artificial. 17 A. Definições

Segmento de ADN - um pedaço linear de ADN tendo uma região de cadeia dupla e extremidades tanto 5' como 3'; o segmento pode ser de qualquer comprimento suficientemente longo para ser criado pela hibridação de, pelo menos, dois oligonucleótidos tendo regiões complementares.

Oligonucleótidos - pequenos segmentos de ADN, de cadeia simples ou de cadeia dupla, compreendidos pelas bases nucleotidicas A, T, G e C ligadas através de ligações fosfato; os oligonucleótidos tipicamente variam desde cerca de 10 a 100 pares de bases.

Cadeia mais - por convenção, a cadeia simples de um ADN de cadeia dupla que começa com a extremidade 5' à esquerda de como se lê a sequência.

Cadeia menos - por convenção, a cadeia simples de um ADN de cadeia dupla que começa com a extremidade 3' à esquerda de como se lê a sequência.

Complementar - se dois ácidos nucleicos tiverem, pelo menos, uma porção das suas sequências, quando lida na direcção oposta (5'->3'; 3'-»5'), que emparelha nucleótidos sequenciais no seguinte modo: A-T, G-C, T-A, G-C.

Conjuntos oligonucleotídicos - uma pluralidade de oligonucleótidos que, em conjunto, compreendem a sequência de uma cadeia mais ou menos de um segmento de ADN. 18

Produtos emparelhados - dois ou mais oligonucleótidos tendo regiões complementares, onde forem permitidas, sob condições convenientes, a emparelhar produzindo, desse modo, regiões de cadeia dupla. B. A Presente Invenção A presente invenção descreve métodos para possibilitar a criação de moléculas de ADN, genomas e organismos vivos artificiais inteiros, com base apenas na informação, sem o requisito de genes, moléculas de ADN ou genomas existentes.

Os métodos da presente invenção são representados em diagrama na FIG. 1 e FIG. 2 e envolvem, geralmente, os seguintes passos. Geralmente, utilizando software de computador simples, compreendendo conjuntos de partes de genes e elementos funcionais, é possível construir um polinucleótido virtual no computador. Este polinucleótido consiste numa fiada de bases de ADN, G, A, T ou C, compreendendo, por exemplo, um genoma artificial inteiro numa fiada linear. Para a transferência do gene sintético para dentro de, por exemplo, células bacterianas, o polinucleótido deverá conter a sequência para uma origem de replicação bacteriana (tal como pBR322). Para a transferência para dentro de células eucarióticas, deverá conter a origem de replicação de um vírus, cromossoma ou componente subcelular de mamífero, tal como mitocôndria.

A seguir à construção, o software de computador simples é, depois, utilizado para decompor a sequência genómica num conjunto de oligonucleótidos de sobreposição de comprimento especificado. Isto resulta num conjunto de sequências de ADN 19 mais curtas que se sobrepõem, de modo a abranger o genoma inteiro em conjuntos de sobreposição. Tipicamente, um gene de 1000 pares de bases seria decomposto em 20 100- meros, onde 10 destes compreendem uma cadeia e 10 destes compreendem a outra cadeia. Estes seriam seleccionados de modo a se sobreporem em cada cadeia em 25 a 50 pares de bases.

Este passo é seguido de direcção da síntese química de cada dos conjuntos de sobreposição de oligonucleótidos, utilizando um sintetizador de tipo matriz e química do fosfoamidito, resultando numa matriz de oligómeros sintetizados. O passo seguinte é equilibrar a concentração de cada oligómero e agregar os oligómeros, de modo que uma única mistura contenha concentrações iguais de cada. Os oligonucleótidos misturados são tratados com T4 polinucleótido cinase, de modo a fosforilar os oligonucleótidos em 5'. 0 passo seguinte é efectuar um passo de emparelhamento "lenta", de modo a co-emparelhar a totalidade dos oligómeros na sequência do gene ou genoma prevista. Isto é realizado por aquecimento da mistura a 80 °C deixando, depois, arrefecer a mesma lentamente, à temperatura ambiente, ao longo de várias horas. A mistura de oligonucleótidos é, depois, tratada com T4 ADN ligase (ou, alternativamente, topoisomerase), de modo a ligar os oligonucleótidos. Os oligonucleótidos são, depois, transferidos para dentro de células hospedeiras competentes. A técnica anterior representa uma estratégia de construção "combinatória", onde todos os oligonucleótidos são co-emparelhados conjuntamente por emparelhamento lento baseado em temperatura. Uma variação nesta estratégia que pode ser mais adequada para genes ou genomas muito longos, tal como superiores a 5000 pares de bases de comprimento final, é como se segue. 20

Utilizando software de computador simples, compreendendo conjuntos de partes de genes e elementos funcionais, um gene ou genoma virtual é construído no computador. Este gene ou genoma consiste numa fiada de bases de ADN, G, A, T ou C, compreendendo o genoma inteiro numa fiada linear. Para a transferência do gene sintético para dentro de células bacterianas, o mesmo deverá conter a sequência para uma origem de replicação bacteriana (tal como pBR322). 0 passo seguinte é efectuar uma reacção de ligação de cadeia utilizando uma nova adição de oligonucleótido a cada passo. Com este processo, o primeiro oligonucleótido na cadeia é conjugado a um suporte sólido (tal como uma esférula de agarose). 0 segundo é adicionado juntamente com ADN ligase e é efectuada reacção de emparelhamento e ligação e as esférulas são lavadas. 0 segundo oligonucleótido de sobreposição da cadeia oposta é adicionado, emparelhado e a ligação efectuada. 0 terceiro oligonucleótido é adicionado e a ligação efectuada. Este processo é replicado até que todos os oligonucleótidos sejam adicionados e ligados. Este processo é mais bem efectuado para sequências longas utilizando um dispositivo automatizado. A sequência de ADN é removida do suporte sólido, uma ligação final (é circular) é efectuada e a molécula transferida para dentro de células hospedeiras.

Alternativamente, está contemplado que, se a cinética de ligação permitir, todos os oligonucleótidos podem ser colocados numa mistura e a ligação deixada prosseguir. Ainda noutra forma de realização, pode ser preparada uma série de polinucleótidos mais pequenos por ligação de 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 oligonucleótidos numa sequência e adicionando esta a outra 21 sequência compreendendo um número semelhante de partes oligonucleotídicas. A reacção em cadeia da ligase ("LCR") é divulgada no documento EPO N° 320308. Na LCR, são preparados dois pares de sondas complementares e, na presença da sequência alvo, cada par irá ligar-se a cadeias complementares opostas do alvo, de modo a que sejam contíguos. Na presença de uma ligase, os dois pares de sondas irão ligar-se, de modo a formar uma única unidade. Por ciclização de temperatura, como em PCR™, as unidades ligadas unidas dissociam-se do alvo e, depois, servem como "sequências alvo" para ligação de pares de sondas em excesso. A Patente U.S. 4883750 descreve um método semelhante a LCR para ligação de pares de sondas a uma sequência alvo. As secções seguintes descrevem estes métodos de forma mais detalhada. C. Ácidos Nucleicos A presente invenção divulga a síntese artificial de genes. Numa forma de realização da presente invenção, os genes artificiais podem ser transferidos para dentro de células, de modo a conferirem uma função particular como unidades discretas ou como parte de cromossomas ou genoma artificiais. Irá ser, geralmente, preferido conceber oligonucleótidos tendo segmentos de 15 a 100 nucleótidos, 25 a 200 nucleótidos ou se desejado até mais longos. Tais fragmentos podem ser facilmente preparados sintetizando, directamente, o fragmento por meios químicos, como se descrevem a seguir.

Consequentemente, as sequências nucleotídicas da invenção podem ser utilizadas pela sua capacidade para selectivamente 22 formarem moléculas dúplices com segmentos complementares de genes ou ARNs ou para proporcionarem iniciadores para amplificação de ADN ou ARN a partir de tecidos. Dependendo da aplicação prevista, irá desejar-se empregar condições variáveis de hibridação, de modo a alcançar-se graus variáveis de selectividade de hibridação. Tipicamente, é favorecida a elevada selectividade.

Para aplicações requerendo elevada selectividade, tipicamente irá desejar-se empregar condições relativamente estringentes, de modo a formar os híbridos, e. g., irão seleccionar-se condições salinas relativamente baixas e/ou condições de temperatura relativamente elevadas, tal como proporcionadas por cerca de 0,02 M a cerca de 0,10 M de NaCl a temperaturas de cerca de 50 °C a cerca de 70 °C. Tais condições de elevada estringência toleram poucos, se é que toleram, erros de emparelhamento entre o oligonucleótido e o molde ou cadeia alvo. É entendido, geralmente, que as condições podem ser tornadas mais estringentes pela adição de quantidades crescentes de formamida.

Para determinadas aplicações, por exemplo, por analogia a substituição de nucleótidos por mutagénese dirigida pontual, é entendido que podem ser utilizadas condições de estringência inferiores. Sob estas condições, a hibridação pode ocorrer, mesmo se as sequências de sonda e cadeia alvo não sejam perfeitamente complementares, mas estejam desemparelhadas numa ou mais posições. As condições podem ser tornadas menos estringentes por aumento da concentração de sal e diminuição de temperatura. Por exemplo, uma condição de estringência média poderia ser proporcionada por cerca de 0,1 a 0,25 M de NaCl, a temperaturas de cerca de 3 7 °C a cerca de 55 °C, enquanto uma 23 condição de estringência baixa poderia ser proporcionada por cerca de 0,15 M a cerca de 0,9 M de sal, a temperaturas variando entre cerca de 20 °C a cerca de 55 °C. Deste modo, as condições de hibridação podem ser facilmente manipuladas, dependendo dos resultados desejados.

Em determinadas formas de realização, será vantajoso determinar a hibridação de oligonucleótidos por utilização como um marcador. Uma ampla variedade de meios indicadores apropriados é conhecida na técnica, incluindo ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos ou outros, tais como avidina/biotina, que são capazes de ser detectados. Em formas de realização preferidas, pode desejar-se empregar um marcador fluorescente ou uma cauda enzimática, tais como urease, fosfatase alcalina ou peroxidase, em vez de reagentes radioactivos ou outros ambientalmente indesejáveis. No caso de caudas enzimáticas, são conhecidos substratos indicadores colorimétricos que podem ser empregues para proporcionar um meio de detecção visível ao olho humano ou espectrofotometricamente, de modo a identificar se ocorreu hibridação específica com oligonucleótido complementar.

Em formas de realização envolvendo uma fase sólida, por exemplo, o primeiro oligonucleótido é adsorvido ou de outro modo afixado a uma matriz ou superfície seleccionada. Este ácido nucleico fixo, de cadeia simples é, depois, submetido a hibridação com os oligonucleótidos complementares sob as condições desejadas. As condições seleccionadas irão, também, depender das circunstâncias particulares baseadas nos particulares critérios requeridos (dependendo, por exemplo, do teor de G+C, tipo de ácido nucleico alvo, fonte de ácido nucleico, tamanho de sonda de hibridação, etc.). A seguir à lavagem da superfície hibridada, de modo a remover oligonucleótidos não especificamente ligados, a hibridação pode ser detectada, ou até quantificada, pelo marcador.

Para aplicações nas quais os segmentos de ácidos nucleicos da presente invenção são incorporados em vectores, tais como plasmídeos, cosmídeos ou vírus, estes segmentos podem ser combinados com outras sequências de ADN, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de restrição enzimática, sítios de múltipla clonagem, outros segmentos codificantes e semelhantes, de modo a que o seu comprimento total possa variar consideravelmente. Está contemplado que pode ser empregue um fragmento de ácido nucleico de praticamente qualquer comprimento, com o comprimento total sendo, de um modo preferido, limitado pela facilidade de preparação e utilização no protocolo de ADN recombinante pretendido.

Os segmentos de ADN codificando um gene específico podem ser introduzidos em células hospedeiras recombinantes e empregues para expressão de uma proteína estrutural ou reguladora específica. Alternativamente, através da aplicação de técnicas de engenharia genética, podem ser empregues subporções ou derivados de genes seleccionados. As regiões a montante contendo regiões reguladoras, tal como regiões promotoras, podem ser isoladas e subsequentemente empregues para expressão do gene seleccionado.

Os ácidos nucleicos empregues podem codificar construções anti-sentido que se hibridam, sob condições intracelulares, a um ácido nucleico de interesse. 0 termo "construção anti-sentido" pretende referir-se a ácidos nucleicos, de um modo preferido, oligonucleótidos, que são complementares às sequências de bases 25 de um ADN alvo. Os oligonucleótidos anti-sentido, quando introduzidos numa célula alvo, ligam-se de um modo especifico ao seu ácido nucleico alvo e interferem com a transcrição, processamento de ARN, transporte, tradução e/ou estabilidade. As construções anti-sentido podem ser concebidas para se ligarem ao promotor e outras regiões de controlo, exões, intrões ou até fronteiras exão-intrão de um gene.

Outras sequências com graus inferiores de homologia estão, também, contempladas. Por exemplo, poderia ser concebida uma construção anti-sentido que tivesse regiões limitadas de elevada homologia mas contivesse, também, uma região não homóloga (e. g., uma ribozima) . Estas moléculas, embora tendo homologia inferior a 50%, iriam ligar-se a sequências alvo sob condições apropriadas.

Em determinadas formas de realização, pode desejar-se empregar construções anti-sentido que incluam outros elementos, por exemplo, aqueles que incluem pirimidinas de propino C-5. Foi demonstrado que os oligonucleótidos que contêm análogos de propino C-5 de uridina e citidina se ligam a ARN com elevada afinidade e são potentes inibidores anti-sentido de expressão génica (Wagner et al., 1993).

De acordo com a presente invenção, irão ser produzidos segmentos de ADN de uma variedade de tamanhos. Estes segmentos de ADN serão, por definição, moléculas lineares. Como tal, estas tipicamente irão ser modificadas antes de utilização adicional. Estas modificações incluem, numa forma de realização, a restrição dos segmentos, de modo a produzir uma ou mais "extremidades coesivas" compatíveis com extremidades complementares de outras moléculas, incluindo aquelas em 26 vectores capazes de suportarem a replicaçao do segmento de ADN. Esta manipulação facilita a "clonagem" dos segmentos.

Tipicamente, a clonagem envolve a utilização de endonucleases de restrição que clivam em sítios particulares dentro de cadeias de ADN, de modo a preparar um segmento de ADN para transferência para dentro de um veículo de clonagem. A ligação das extremidades compatíveis (que incluem extremidades rombas) utilizando uma ADN ligase completa a reacção. Dependendo da situação, o veículo de clonagem pode compreender uma porção de ADN relativamente pequena, comparativamente com o inserto. Alternativamente, o veículo de clonagem pode ser extremamente complexo e incluir uma variedade de características que irão afectar a replicação e função do segmento de ADN. Em determinadas formas de realização, pode ser introduzido um raro sítio de corte dentro da extremidade da sequência polinucleotídica.

Os veículos de clonagem incluem plasmídeos, tais como a série pUC, vectores Bluescript™ e uma variedade de outros veículos com sítios de clonagem polivalentes, marcadores seleccionáveis e origens de replicação. Em virtude da natureza da presente invenção, os veículos de clonagem podem incluir moléculas complexas, tais como fagemídeos e cosmídeos que albergam pedaços de ADN relativamente grandes. Adicionalmente, a produção de cromossomas artificiais e até genomas. A seguir à clonagem num vector adequado, a construção é, depois, transferida para dentro de uma célula hospedeira compatível. Uma variedade de diferentes técnicas de transferência génica é descrita noutra parte neste documento. 27

Segue-se a cultura das células hospedeiras para a finalidade pretendida (amplificação, expressão, subclonagem).

No presente pedido, o termo "construção de expressão" tenciona incluir um particular tipo de veículo de clonagem contendo um ácido nucleico codificando para um produto génico, no qual parte ou totalidade da sequência codificando o ácido nucleico é capaz de ser transcrita. 0 transcrito pode ser traduzido numa proteína, porém não necessita de o ser. Deste modo, em determinadas formas de realização, expressão inclui tanto a transcrição de um gene e a tradução de um ARN num produto génico. Noutras formas de realização, expressão apenas inclui transcrição do ácido nucleico, por exemplo, de modo a gerar construções anti-sentido.

Em formas de realização preferidas, o ácido nucleico está sob o controlo transcricional de um promotor. Um "promotor" refere-se a uma sequência de ADN reconhecida pela maquinaria sintética da célula ou maquinaria sintética introduzida, requerida para iniciar a transcrição específica de um gene. A expressão "sob controlo transcricional" significa que o promotor está na localização e orientação correctas em relação ao ácido nucleico, de modo a controlar a iniciação de ARN polimerase e expressão do gene. 0 termo, promotor, será aqui utilizado para referir um grupo de módulos de controlo transcricional que estão aglomerados em torno do sítio de iniciação para a ARN polimerase II. Muita da reflexão sobre de que modo os promotores estão organizados, deriva de análises de diversos promotores virais, incluindo aqueles para a timidina cinase (tk) de HSV e unidades de transcrição precoce de SV40. Estes estudos, aumentados por 28 trabalho mais recente, demonstraram que os promotores são compostos por módulos funcionais discretos, cada consistindo em, aproximadamente, 7-20 pb de ADN e contendo um ou mais sítios de reconhecimento para proteínas activadoras ou repressoras transcricionais.

Pelo menos um módulo em cada promotor funciona para posicionar o sítio de iniciação para a síntese de ARN. O exemplo mais bem conhecido disto é a caixa TATA, porém em alguns promotores carecendo de uma caixa TATA, tais como o promotor para o gene da terminal desoxinucleotidil transferase de mamífero e o promotor para os genes tardios de SV40, um elemento discreto sobrejacente ao próprio sítio de iniciação ajuda a fixar o local de iniciação.

Elementos promotores adicionais regulam a frequência de iniciação transcricional. Tipicamente, estes localizam-se na região 30-110 pb a montante do sitio de iniciação, embora se tenha demonstrado que um determinado número de promotores contém, também, elementos funcionais a jusante do sítio de iniciação. O espaçamento entre elementos promotores frequentemente é flexível, de modo que a função promotora seja conservada quando os elementos são invertidos ou movidos em relação uns aos outros. No promotor tk, o espaçamento entre elementos promotores pode ser aumentado para 50 pb de distância, antes da actividade começar a baixar. Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar, co-operativamente ou independentemente, para activarem a transcrição. Não se considera que o particular promotor que é empregue para controlar a expressão de um ácido nucleico seja crítico, 29 desde que seja capaz de expressar o ácido nucleico na célula visada. Deste modo, se for visada uma célula humana, é preferido posicionar a região codificante de ácido nucleico adjacente e sob o controlo de um promotor que seja capaz de ser expresso numa célula humana. De um modo geral, um tal promotor poderá incluir um promotor humano ou virai. Promotores preferidos incluem aqueles derivados de HSV. Outra forma de realização preferida é o promotor controlado pela tetraciclina.

Em várias outras formas de realização, podem ser utilizados o promotor do gene precoce imediato do citomegalovirus humano (CMV), o promotor precoce de SV40 e a repetição terminal longa do virus do sarcoma de Rous, de modo a obter-se expressão de alto nivel de transgenes. Para se alcançar a expressão de um transgene está, também, contemplada a utilização de outros promotores fágicos, virais ou de mamífero, celulares ou bacterianos que são bem conhecidos na técnica, desde que os níveis de expressão sejam suficientes para um dado objectivo. Está previsto que, no contexto da presente invenção, podem ser empregues quaisquer elementos/promotores. Abaixo, está uma lista de promotores virais, promotores/estimuladores celulares e promotores/estimuladores indutíveis que poderiam ser utilizados em combinação com o ácido nucleico codificando um gene de interesse numa construção de expressão. Elementos estimuladores/promotores contemplados para utilização com a presente invenção incluem mas não estão limitados a Cadeia Pesada de Imunoglobulina, Cadeia Leve de Imunoglobulina, Receptor de Células T, HLA DQ α e DQ β, β-Interf erão, Interleucina-2, Receptor de Interleucina-2, MHC Classe II 5, HLA-DRa MHC Classe II, β-Actina, Creatina Cinase Muscular, Pré-albumina (Transtirretina), Elastase I, Metalotioneína, Colagenase, Gene de Albumina, α-Fetoproteína, i-Globina, 30 β-Globina, e-fos, c-HA-ras, Insulina, Molécula de Adesão Celular Neural (NCAM), al-Antitripsina, H2B (TH2B) Histona, Colagénio de Murganho ou Tipo I, Proteínas Reguladas por Glucose (GRP94 e GRP78), Hormona do Crescimento de Rato, Amilóide A Sérica (SAA) Humana, Troponina I (TN I), Factor de Crescimento Derivado de Plaquetas, Distrofia Muscular de Duchenne, SV40, Polioma, Retrovírus, Vírus do Papiloma, Vírus da Hepatite B, Vírus da Imunodeficiência Humana, Citomegalovírus, Vírus da Leucemia do Macaco Gibão. Os elementos promotores indutíveis e os seus indutores associados estão listados na Tabela 2 abaixo. Esta lista não pretende ser exaustiva de todos os elementos possíveis envolvidos na promoção da expressão de transgenes mas ser, meramente, exemplificativa destes. Adicionalmente, para dirigir a expressão do gene poderia ser, também, utilizada qualquer combinação de promotor/estimulador (de acordo com a Base de Dados de Promotores Eucarióticos EPDB). Se for proporcionada a polimerase bacteriana apropriada, as células eucarióticas podem manter a transcrição citoplasmática de determinados promotores bacterianos como parte do complexo de distribuição ou como uma construção de expressão genética adicional.

Os estimuladores foram originalmente detectados como elementos genéticos que aumentavam a transcrição a partir de um promotor localizado numa posição distante na mesma molécula de ADN. Esta capacidade para actuarem ao longo de uma grande distância teve pouco precedente em estudos clássicos de regulação de transcrição procariótica. 0 trabalho subsequente demonstrou que as regiões de ADN com actividade estimuladora estão organizadas de forma muito semelhante aos promotores. Isto é, são compostas por muitos elementos individuais, cada um deles liga-se a um ou mais proteínas transcricionais. 31 A distinção básica entre estimuladores e promotores é operativa. Uma região estimuladora, como um todo, deve ser capaz de estimular a transcrição à distância; isto não necessita ser verdadeiro de uma região promotora ou os seus elementos componentes. Por outro lado, um promotor deve ter um ou mais elementos que dirigem a iniciação da síntese de ARN num sítio particular e numa orientação particular, ao passo que os estimuladores não têm estas especificidades. Os promotores e estimuladores estão frequentemente em sobreposição e contíguos, parecendo ter frequentemente uma organização modular muito semelhante.

Tabela 2

Indutor Éster de Forbol (TPA) Metais pesados Gluococorticóides poli(ri)X poli(rc) Ela Éster de Forbol (TPA), H2O2

Elemento

MT II MMTV (vírus do tumor mamário de murganho) β-Interferão

Adenovírus 5 E2 c-jun

Colagenase Estromelisina SV40 Gene MX murino Gene GRP78 α-2-Macroglobulina Vimentina Gene MHC Classe I H-2kB HSP7 0 Éster de Forbol (TPA) Éster de Forbol (TPA), IL-1 Éster de Forbol (TPA)

Interferão, Vírus da Doença de Newcastle A23187 IL-6

Soro

Interferão

Ela, Antigénio T Grande de 32

Continuação

Elemento Indutor SV40 Proliferina Éster de Forbol - TPA Factor de Necrose Tumoral FMA Gene oí da Hormona Estimuladora da Tiróide Hormona da Tiróide A utilização do sistema de baculovírus irá envolver expressão de alto nível a partir do poderoso promotor de poliedro.

Irá tipicamente incluir-se um sinal de poliadenilação de modo a efectuar-se a poliadenilação conveniente do transcrito. Não se considera que a natureza do sinal de poliadenilação seja crucial à prática bem-sucedida da invenção e qualquer dessas sequências pode ser empregue. As formas de realização preferidas incluem o sinal de poliadenilação de SV40 e o sinal de poliadenilação da hormona do crescimento bovina, convenientes e conhecidos por funcionarem bem em diversas células alvo. Está, também, contemplado como um elemento da cassete de expressão um terminador. Estes elementos podem servir para estimular níveis de mensagem e para minimizar a leitura da cassete noutras sequências.

Para tradução eficiente de sequências codificantes pode ser, também, requerido um sinal de iniciação específico. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Podem ter de ser proporcionados sinais de controlo traducional exógenos, incluindo o codão de iniciação ATG. Um especialista na técnica iria facilmente ser capaz de determinar isto e proporcionar os sinais necessários. Sabe-se que o codão de 33 "em fase" iniciação deve estar "em fase" com a fase de leitura da sequência codificante desejada, de modo a garantir a tradução do inserto inteiro. Os sinais de controlo traducional exógenos e codões de iniciação podem ser naturais ou sintéticos. A eficiência de expressão pode ser estimulada pela inclusão de elementos estimuladores de transcrição apropriados (Bittner et ai., 1987).

Em determinadas formas de realização, pode ser desejável incluir regiões especializadas, conhecidas como telómeros, na extremidade de uma sequência genómica. Os telómeros são sequências repetidas verificadas em extremidades cromossómicas e sabe-se desde há muito que os cromossomas com extremidades truncadas são instáveis, tendem a fundir-se com outros cromossomas e são, de outro modo, perdidos durante a divisão celular. Alguns dados sugerem que os telómeros interagem com o complexo de nucleoproteína e a matriz nuclear. Um papel putativo para os telómeros inclui a estabilização de cromossomas e blindagem das extremidades de enzimas degradativas.

Outro papel possível para os telómeros é na replicação. De acordo com a presente doutrina, a replicação de ADN requer iniciação a partir de curtos iniciadores de ARN emparelhados à extremidade 3' do molde. 0 resultado deste mecanismo é um "problema de replicação de extremidade", no qual a região correspondente ao iniciador de ARN não é replicada. Ao longo de muitas divisões celulares, isto irá resultar no truncamento progressivo do cromossoma. Pensa-se que os telómeros podem proporcionar um tampão contra este efeito, pelo menos, até que eles próprios sejam eliminados por este efeito. Uma estrutura adicional a ser incluída em segmentos de ADN é um centrómero. 34

Em determinadas formas de realização da invenção, a distribuição de um ácido nucleico numa célula pode ser identificada in vitro ou in vivo por inclusão de um marcador na construção de expressão. 0 marcador iria resultar numa alteração identificável para a célula transfectada, permitindo fácil identificação da expressão.

Pode utilizar-se um determinado número de sistemas de selecção, incluindo mas não limitados a timidina cinase do virus herpes simplex (Wigler et al., 1977), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (Szybalska et al., 1962) e os genes da adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., 1980), em células tk~, hgprt~ ou aprt~, respectivamente. Também, a resistência a antimetabolitos pode ser utilizada como a base de selecção para dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., 1980; 0'Hare et al., 1981); gpt, a qual confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan et al., 1981); neo, a qual confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981); e hygro, a qual confere resistência à higromicina.

Habitualmente, a inclusão de um marcador de selecção de fármaco auxilia na clonagem e na selecção de transformantes, por exemplo, neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol. Alternativamente, podem ser empregues enzimas, tais como timidina cinase (tk) do virus herpes simplex (eucariótico) ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT) (procariótico). Os marcadores imunológicos, também, podem ser empregues. Não se considera que o marcador seleccionável empregue seja importante, desde que seja capaz de ser expresso simultaneamente com o ácido nucleico codificando um produto génico. Exemplos adicionais de marcadores seleccionáveis são bem conhecidos pelo especialista na técnica. 35

Em determinadas formas de realização da invenção, a utilização de elementos de sítios internos de ligação do ribossoma (IRES) é utilizada para criar mensagens multigene ou policistrónicas. Os elementos IRES são capazes de contornar o modelo de rastreio ribossómico de tradução dependente de Cap metilado em 5' e iniciação de tradução em sítios internos (Pelletier e Sonenberg, 1988). Foram descritos elementos IRES de dois membros da família picanovírus (polio e encefalomiocardite) (Pelletier e Sonenberg, 1988), assim como um IRES de uma mensagem de mamífero (Macejak e Samow, 1991) . Os elementos IRES podem ser ligados a fases de leitura aberta heterólogas. Múltiplas fases de leitura aberta podem ser transcritas em conjunto, cada separada por um IRES, criando mensagens policistrónicas. Em virtude do elemento IRES, cada fase de leitura aberta está acessível aos ribossomas para tradução eficiente. Múltiplos genes podem ser eficientemente expressos utilizando um único promotor/estimulador para transcrever uma única mensagem.

Qualquer fase de leitura aberta heteróloga pode ser ligada aos elementos IRES. Isto inclui genes para proteínas segregadas, proteínas multisubunidade, codificadas por genes independentes, proteínas intracelulares ou membranares e marcadores seleccionáveis. Desta forma, a expressão de diversas proteínas pode ser simultaneamente manipulada numa célula com uma única construção e um único marcador seleccionável. 36 D. Proteínas Codificadas

Neste pedido, a requerente utilizou informação genética para fins criativos ou sintéticos. A sequência genómica completa irá proporcionar um catálogo de todos os genes necessários para a sobrevivência, reprodução, evolução e especiação de um organismo e, proporcionadas ferramentas de alta tecnologia adequadas, a informação genómica pode ser modificada ou até criada a partir do "nada", para sintetizar vida. Deste modo, está contemplado que uma combinação de genes de produção de energia adequados, genes reguladores e outros genes funcionais poderia ser construída, a qual seria suficiente para dotar um organismo artificial com as funcionalidades básicas, de modo a permitir a sobrevivência independente.

Para concretizar este objectivo, a presente invenção utiliza sequências de ADNc conhecidas para qualquer gene dado expressar proteínas num organismo artificial. Qualquer proteína assim expressa nesta invenção pode ser modificada para fins particulares, de acordo com métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, particulares resíduos peptídicos podem ser derivatizados ou quimicamente modificados, para alterar a resposta imunitária ou permitir a ligação do péptido a outros agentes. É, também, possível alterar particulares aminoácidos dentro dos péptidos, sem perturbar a estrutura total ou antigenicidade do péptido. Tais alterações são, por conseguinte, designadas alterações "conservativas" e tendem a basear-se na polaridade de hidrofilicidade do resíduo. 0 tamanho e/ou carga das cadeias laterais são, também, factores relevantes na determinação de que substituições são conservativas. 37

Após a determinação de toda a sequência codificante de um gene, o gene pode ser inserido dentro de um sistema de expressão apropriado. 0 gene pode ser expresso num qualquer número de diferentes sistemas de expressão de ADN recombinante, de modo a produzir grandes quantidades do produto polipeptidico que pode, depois, ser purificado e utilizado para vacinar animais, de modo a produzir anti-soros com os quais podem ser conduzidos estudos adicionais.

Exemplos de sistemas de expressão conhecidos pelos especialistas na técnica incluem bactérias, tal como E. coli, leveduras, tais como Saccharomyces cerevisia e Pichia pastoris, baculovirus e sistemas de expressão de mamífero, tais como em células COS ou CHO. Numa forma de realização, os polipéptidos são expressos em sistemas de expressão de E. coli e baculovirus. Um gene completo pode ser expresso ou, alternativamente, podem ser produzidos fragmentos do gene codificando porções de polipéptido.

Numa forma de realização, a sequência génica codificando o polipéptido é analisada, de modo a detectar putativas sequências transmembranares. Tais sequências são tipicamente muito hidrófobas e são facilmente detectadas pela utilização de software de análise de sequência padrão, tal como MacVector (IBI, New Haven, CT). Quando uma proteína recombinante é sintetizada em muitos sistemas de expressão a presença de sequências transmembranares é frequentemente prejudicial, especialmente E. coli, visto que conduz à produção de agregados insolúveis que são difíceis de renaturar na conformação nativa da proteína. A deleção de sequências transmembranares tipicamente não altera significativamente a conformação da restante estrutura proteica. 38

Além do mais, as sequências transmembranares estando, por definição, inseridas dentro de uma membrana, são inacessíveis. Por conseguinte, os anticorpos para estas sequências não irão provar ser úteis para estudos in vivo ou in situ. A deleção de sequências codificando transmembranas a partir dos genes utilizados para expressão pode ser alcançada por técnicas padrão. Por exemplo, sítios de restrição enzimática fortuitamente colocados podem ser utilizados para excisar o fragmento génico desejado ou a amplificação de tipo PCR™ pode ser utilizada para amplificar apenas a parte desejada do gene. 0 especialista na técnica irá compreender que tais alterações devem ser concebidas, de modo a não alterar a fase de leitura traducional para porções a jusante da sequência codificando a proteína.

Numa forma de realização, a análise de sequência em computador é utilizada para determinar a localização dos epitopos determinantes antigénicos principais previstos do polipéptido. 0 software capaz de efectuar esta análise está facilmente disponível comercialmente, por exemplo MacVector (IBI, New Haven, CT) . 0 software tipicamente utiliza algoritmos padrão, tais como os métodos de Kyte/Doolittle ou Hopp/Woods, para localização de sequências hidrófilas que são caracteristicamente verificadas na superfície de proteínas e, por conseguinte, é provável que actuem como determinantes antigénicos.

Após a realização desta análise, podem ser preparados polipéptidos que contenham, pelo menos, as características essenciais do determinante antigénico e que possam ser empregues na produção de anti-soros contra o polipéptido. Minigenes ou fusões génicas codificando estes determinantes podem ser 39 construídos e inseridos dentro de vectores de expressão por métodos padrão, por exemplo, utilizando a metodologia de PCR™. 0 gene ou fragmento génico codificando um polipéptido pode ser inserido dentro de um vector de expressão por técnicas de subclonagem padrão. Numa forma de realização, é utilizado um vector de expressão de E. coli que produz o polipéptido recombinante como uma proteína de fusão, permitindo a rápida purificação de afinidade da proteína. São exemplos de tais sistemas de expressão de proteínas de fusão o sistema da glutationo S-transferase (Pharmacia, Piscataway, NJ) , o sistema da proteína de ligação de maltose (NEB, Beverley, MA), o sistema FLAG (IBI, New Haven, CT) e o sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA) .

Alguns destes sistemas produzem polipéptidos recombinantes contendo apenas um pequeno número de aminoácidos adicionais que não é provável que afectem a capacidade antigénica do polipéptido recombinante. Por exemplo, o sistema FLAG e o sistema 6xHis adicionam apenas sequências curtas, sendo ambas conhecidas por serem pobremente antigénicas e que não afectam adversamente o enrolamento do polipéptido na sua conformação nativa. Outros sistemas de fusão produzem polipéptidos onde é desejável excisar o agente de fusão do polipéptido desejado. Numa forma de realização, o agente de fusão é ligado ao polipéptido recombinante por uma sequência peptídica contendo uma sequência de reconhecimento especifica para uma protease. São exemplos de sequências adequadas, as reconhecidas pela protease do Vírus Etch do Tabaco (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ou Factor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA) . 40

As células bacterianas recombinantes, por exemplo E. coli, são cultivadas em qualquer de um determinado número de meios adequados, por exemplo, LB e a expressão do polipéptido recombinante induzida por adição de IPTG aos meios ou mudança da incubação para uma temperatura superior. Após cultivo das bactérias durante um período adicional, compreendido entre 2 e 24 h, as células são recolhidas por centrifugação e lavadas, de modo a remover meios residuais. As células bacterianas são, depois, lisadas, por exemplo, por disrupção num homogeneizador celular e centrifugadas, de modo a separar os densos corpos de inclusão e membranas celulares dos componentes celulares solúveis. Esta centrifugação pode ser realizada sob condições pelas quais os densos corpos de inclusão são selectivamente enriquecidos por incorporação de açúcares, tal como sacarose, no tampão e centrifugação a uma velocidade selectiva.

Noutra forma de realização, o sistema de expressão utilizado é aquele dirigido pelo promotor de poliedro de baculovírus. 0 gene codificando o polipéptido pode ser manipulado por técnicas padrão, para facilitar a clonagem no vector de baculovírus. Um vector de baculovírus é o vector pBlueBac (Invitrogen, Sorrento, CA). 0 vector transportando o gene para o polipéptido é transfectado em células de Spodoptera frugiperda (S f 9) por protocolos padrão e as células são cultivadas e processadas para produzirem o antigénio recombinante. Ver Summers et al., A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVÍRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Agricultural Experimental Station.

Na concepção de um gene que codifica um particular polipéptido, pode ser considerado o índice hidropático de aminoácidos. A Tabela 3 proporciona uma tabela de codões, 41 mostrando os ácidos nucleicos que codificam um aminoácido particular. A importância do índice hidropático de aminoácidos no aspecto de conferir função biológica interactiva numa proteína é, geralmente, compreendida na técnica (Kyte & Doolittle, 1982) . 0 seguinte é uma discussão breve do índice hidropático de aminoácidos para utilização na presente invenção.

Tabela 3

Aminoácidos Codões

Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Ácido aspártico Asp D GAC GAU Ácido glutâmico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina Ile I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gin Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Vai V GUA GUC GUG GUU Triptofano Trp w UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU 42 É aceite que o carácter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante que, por sua vez, define a interacção da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, ADN, anticorpos, antigénios e semelhantes. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático, com base na sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte & Doolittle, 1982), estas são: Isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

Sabe-se na técnica que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou resultado hidropático semelhante e resultar, ainda, numa proteína com actividade biológica semelhante, i. e., obter-se ainda uma proteína biológica funcionalmente equivalente. Na realização de tais alterações, é preferida a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ±2, aqueles que estão dentro de ±1 são particularmente preferidos e aqueles dentro de ±0,5 são preferidos de um modo ainda mais particular. É, também, compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser tornada eficaz, com base na hidrofilicidade. A Patente U.S. 4554101, aqui incorporada por referência, refere que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade dos seus 43 aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com uma propriedade biológica da proteína.

Como descrito na Patente U.S. 4554101, os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina -0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

Compreende-se que um aminoácido possa ser substituído por outro tendo um valor de hidrofilicidade semelhante e obter-se ainda uma proteína biologicamente equivalente e imunologicamente equivalente. Em tais alterações, é preferida a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2, aqueles que estão dentro de ±1 são particularmente preferidos e aqueles dentro de ±0,5 são ainda mais particularmente preferidos.

Como delineado anteriormente, as substituições de aminoácidos são, geralmente, baseadas na semelhança relativa dos substituintes de cadeia lateral dos aminoácidos, por exemplo, na sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e semelhantes. As substituições exemplificativas que tomam em consideração diversas das características anteriores são bem conhecidas pelos especialistas na técnica e incluem: arginina a lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina. 44 E. Expressão e Distribuição de Genes I. Expressão

Depois do gene, genoma ou sistema biológico ter sido preparado de acordo com os métodos agui descritos, os polinucleótidos podem ser expressos como péptidos ou proteínas codificados do gene, genoma ou sistema biológico. A manipulação dos polinucleótidos para expressão num sistema procariótico ou eucariótico pode ser realizada por técnicas geralmente conhecidas dos especialistas na expressão recombinante. Por conseguinte, os promotores e outros elementos específicos de um sistema bacteriano, de mamífero ou outro, podem ser incluídos na seguência polinucleótídica. Considera-se gue, virtualmente, qualquer sistema de expressão possa ser empregue na expressão das sequências de ácidos nucleicos reivindicadas.

As sequências polinucleotídicas artificialmente produzidas são adequadas para expressão eucariótica, visto que a célula hospedeira irá, geralmente, processar os transcritos genómicos, de modo a produzir ARNm funcional para tradução em proteína. Considera-se que a utilização de uma versão do gene de concepção irá proporcionar vantagens, na medida em que o tamanho do gene irá ser geralmente muito mais pequeno e mais facilmente empregue para transfectar a célula visada do que um gene genómico que irá, tipicamente, ser até uma ordem de grandeza maior do que o gene de concepção. Contudo, a requerente não exclui a possibilidade de empregar uma versão genómica de um particular gene, se desejado.

Como aqui utilizados, os termos células "manipuladas" e "recombinantes" pretendem referir-se a uma célula dentro da qual 45 um polinucleótido exógeno, aqui descrito, foi introduzido. Por conseguinte, as células manipuladas são distinguíveis de células de ocorrência natural que não contêm um polinucleótido exógeno introduzido de um modo recombinante. As células manipuladas são, deste modo, células tendo um gene ou genes introduzidos através de mão humana. As células recombinantes incluem aquelas tendo polinucleótidos introduzidos e incluem, também, polinucleótidos posicionados adjacentes a um promotor não naturalmente associado ao particular gene introduzido.

De modo a expressar uma proteína ou péptido codificado recombinante, quer mutante ou de tipo selvagem, de acordo com a presente invenção, iria preparar-se um vector de expressão que compreendesse um dos ácidos nucleicos isolados reivindicados, sob o controlo de um ou mais promotores. De modo a submeter uma sequência codificante "sob o controlo de" um promotor, posiciona-se a extremidade 5' do sítio de iniciação traducional da fase de leitura, geralmente, entre cerca de 1 e 50 nucleótidos "a jusante" (i. e., a 3') do promotor escolhido. O promotor "a montante" estimula a transcrição do ADN inserido e promove a expressão da proteína recombinante codificada. É este o significado de "expressão recombinante" no contexto aqui utilizado.

Estão disponíveis muitas técnicas padrão para construir vectores de expressão contendo os ácidos nucleicos apropriados e sequências de controlo transcricional/traducional, para alcançar expressão proteica ou peptídica numa variedade de sistemas de expressão. Os tipos de células disponíveis para expressão incluem mas não estão limitados a bactérias, tais como E. coli e B. subtilis, transformadas com vectores de expressão recombinantes de ADN de fago, ADN plasmídico ou ADN de cosmídeo. 46

Determinados exemplos de hospedeiros procarióticos são a estirpe RR1 de E. coli, LE392 de E. coli, B de E. coli, x 1776 de E. coli (ATCC N° 31537) , assim como W3110 de E. coli (F-, lambda-, prototrófica, ATCC N° 273325); bacilos, tais como Bacillus subtilis; e outras enterobacteriaceae, tais como Salmonella typhimurium, Serratia marcescens e diversas espécies de Pseudomonas.

Em geral, os vectores plasmídicos contendo sequências replicão e de controlo que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira, são utilizados estes hospedeiros. 0 vector transporta, geralmente, um sítio de replicação, assim como sequências marcadoras que são capazes de proporcionar selecção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, a E. coli é frequentemente transformada utilizando o pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli. 0 plasmídeo pBR322 contém genes para resistência à ampicilina e tetraciclina e proporciona, deste modo, meios fáceis para identificação de células transformadas. 0 plasmídeo pBR322, ou outro plasmídeo ou fago microbiano, deve conter, também, ou ser modificado de modo a conter, promotores que possam ser utilizados pelo organismo microbiano para expressão das suas próprias proteínas.

Adicionalmente, os vectores fágicos contendo sequências replicão e de controlo que sejam compatíveis com o microrganismo hospedeiro, podem ser utilizados como vectores de transformação com estes hospedeiros. Por exemplo, o fago lambda GEM™-11 pode ser utilizado na preparação de um vector fágico recombinante que pode ser utilizado para transformar células hospedeiras, tal como E. coli LE392. 47

Vectores úteis adicionais incluem vectores pIN (Inouye et al., 1985); e vectores pGEX, para utilização na produção de proteínas de fusão solúveis de glutationo 5-transferase (GST) , para purificação e separação ou clivagem posterior. Outras proteínas de fusão adequadas são aquelas com β-galactosidase, ubiquitina ou semelhantes.

Os promotores que são mais geralmente utilizados na construção de ADN recombinante incluem os sistemas promotores β-lactamase (penicilinase), lactose e triptofano (trp) . Embora estes sejam os mais geralmente utilizados, foram descobertos e utilizados outros promotores microbianos e os detalhes envolvendo as suas sequências nucleotídicas foram publicados, permitindo aos especialistas na técnica ligar os mesmos, de um modo funcional, com vectores plasmídicos.

Para expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, é geralmente utilizado (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Este plasmídeo contém o gene trpl que proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura não tendo a capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N° 44076 ou PEP4-1 (Jones, 1977). A presença da lesão trpl como uma característica do genoma da célula hospedeira de levedura proporciona, depois, um ambiente eficaz para detecção da transformação por crescimento na ausência de triptofano.

Sequências promotoras adequadas em vectores de levedura incluem o promotor para a 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et al., 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato 48 mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucocinase. Na construção de plasmídeos de expressão adequados, as sequências de terminação associadas a estes genes são, também, ligadas ao vector de expressão, 3' da sequência desejada a ser expressa, de modo a proporcionar poliadenilação do ARNm e terminação.

Outros promotores adequados que têm a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, incluem a região promotora para a álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto e a supramencionada gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis por utilização de maltose e galactose.

Além de microrganismos, as culturas de células derivadas de organismos multicelulares podem ser, também, utilizadas como hospedeiros. Em principio, qualquer dessas culturas celulares é trabalhável a partir de cultura de vertebrado ou invertebrado. Além de células de mamifero, estas incluem sistemas de células de insecto infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes (e. g., baculovírus); e sistemas de células vegetais infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes (e. g., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão de plasmídeos recombinantes (e. g., plasmídeo Ti), contendo uma ou mais sequências codificantes.

Num sistema de insecto útil, o vírus da poliedrose nuclear de Autograph californica (AcNPV) é utilizado como um vector para expressar genes estranhos. 0 vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. As sequências codificantes de ácidos 49 nucleicos isoladas são clonadas em regiões não essenciais (por exemplo o gene de poliedro) do vírus e colocadas sob o controlo de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedro). A inserção bem-sucedida das sequências codificantes resulta na inactivação do gene de poliedro e produção de vírus recombinante não ocluído (i. e., vírus carecendo do revestimento proteináceo codificado pelo de gene de poliedro). Estes vírus recombinantes são, depois, utilizados para infectar células de Spodoptera frugiperda, nas quais o gene inserido é expresso (e. g., Patente U.S. N° 4215051) . São exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis as células VERO e HeLa, linhas celulares de ovário de hamster Chinês (CHO), WI38, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN e linhas celulares MDCK. Adicionalmente, pode ser escolhida uma célula hospedeira que module a expressão das sequências inseridas ou modifique e processe o produto génico no modo específico desejado. Tais modificações (e. g., glicosilação) e processamento (e. g., clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína codificada.

Diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento e modificação pós-traducional de proteínas. As linhas celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos de modo a garantir a modificação e processamento correctos da proteína estranha expressa. Os vectores de expressão para utilização em células de mamífero, geralmente, incluem uma origem de replicação (conforme necessário), um promotor localizado em frente do gene a ser expresso, juntamente com quaisquer sítios de ligação de ribossomas, sítios de excisão de ARN, sítios de poliadenilação e sequências terminadoras transcricionais necessários. A origem de 50 replicação pode ser proporcionada por construção do vector, de modo a incluir uma origem exógena, ou pode ser derivada de SV40 ou outra fonte virai (e. g., Polioma, Adeno, VSV, BPV) , ou pode ser proporcionada pelo mecanismo de replicação cromossómico da célula hospedeira. Se o vector for integrado no cromossoma da célula hospedeira, o último é frequentemente suficiente.

Os promotores podem ser derivados do genoma de células de mamífero (e. g., promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamífero (e. g., o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7.5K do vírus da vacínia). Além disso é, também, possível e pode ser desejável utilizar sequências promotoras ou de controlo normalmente associadas à sequência génica desejada, desde que tais sequências de controlo sejam compatíveis com os sistemas celulares hospedeiros.

Para tradução eficiente das sequências codificantes de ácidos nucleicos isoladas reivindicadas podem ser, também, requeridos sinais de iniciação específicos. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Podem ter de ser proporcionados adicionalmente sinais de controlo traducional exógenos, incluindo o codão de iniciação ATG. Um especialista na técnica iria facilmente ser capaz de determinar esta necessidade e proporcionar os sinais necessários. É sabido que o codão de iniciação deve estar enquadrado (ou em fase) com a fase de leitura da sequência codificante desejada, de modo a garantir a tradução do inserto inteiro. Estes sinais de controlo traducional exógenos e codões de iniciação podem ser de uma variedade de origens naturais e sintéticas. A eficiência de expressão pode ser estimulada pela inclusão de elementos estimuladores de transcrição apropriados ou terminadores de transcrição (Bittner et al., 1987). 51

Na expressão eucariótica, irá ser, também, tipicamente desejado incorporar na unidade transcricional um sitio de poliadenilação apropriado (e. g. , 5'-AATAAA-3') , se esse sitio não estiver contido dentro do segmento clonado original. Tipicamente, o sinal de adição de poli A é colocado cerca de 30 a 2000 nucleótidos "a jusante" do sitio de terminação da proteina, numa posição anterior à terminação de transcrição.

Para produção de longo prazo, de alto rendimento, de proteínas recombinantes, é preferida a expressão estável. Por exemplo, as linhas celulares que expressam, de um modo estável, construções codificando proteínas podem ser manipuladas. Em vez de se utilizarem vectores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com vectores controlados por elementos de controlo de expressão apropriados (e. g., sequências promotoras, estimuladoras, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador seleccionável. A seguir à introdução de um ADN estranho, as células manipuladas podem ser deixadas crescer, durante 1-2 dias, num meio enriquecido e ser, depois, trocadas para um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite que as células integrem, de um modo estável, o plasmídeo nos seus cromossomas e cresçam de modo a formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos dentro de linhas celulares.

Está contemplado que os ácidos nucleicos da invenção podem ser "superexpressos", i. e., expressos em níveis aumentados relativamente à sua expressão natural em células humanas, ou até relativamente à expressão de outras proteínas na célula hospedeira recombinante. Tal superexpressão pode ser avaliada 52 por uma variedade de métodos, incluindo marcação radioactiva e/ou purificação de proteína. Contudo, são preferidos métodos simples e directos, por exemplo, aqueles envolvendo SDS/PAGE e coloração proteica ou transferência de Western, seguidos de análises quantitativas, tais como rastreio densitométrico do gel ou transferência resultante. Um aumento específico no nível da proteína ou péptido recombinante, em comparação com o nível em células humanas naturais, é indicativo de superexpressão, como é uma abundância relativa da proteína específica em relação às outras proteínas produzidas pela célula hospedeira e, e. g., visível num gel. II. Distribuição

Em várias formas de realização da invenção, a construção de expressão pode compreender um vírus ou construção manipulada, derivada de um genoma virai. A capacidade de determinados vírus para entrar em células por meio de endocitose mediada por receptor e se integrarem no genoma da célula hospedeira e expressarem genes virais de um modo estável e eficiente, tornaram-os candidatos atractivos para transferência de genes estranhos para dentro de células de mamífero (Ridgeway, 1988; Nicolas e Rubenstein, 1988; Baichwal e Sugden, 1986; Temin, 1986) . Os primeiros vírus utilizados como vectores eram vírus de ADN, incluindo os papovavírus (vírus símio 40, vírus do papiloma bovino e polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal e Sugden, 1986) e adenovírus (Ridgeway, 1988; Baichwal e Sugden, 1986) e vírus adeno-associados. Os retrovírus são, também, veículos de transferência génica atractivos (Nicolas e Rubenstein, 1988; Temin, 1986) como são vírus da vaccina (Ridgeway, 1988) e vírus adeno-associado (Ridgeway, 1988). Tais vectores podem ser 53 utilizados para (i) transformar linhas celulares in vitro para efeitos de expressão de proteínas de interesse ou (ii) para transformar células in vitro ou in vivo, de modo a proporcionar polipéptidos terapêuticos num cenário de terapia génica. 0 vírus herpes simplex (HSV) é outro candidato atractivo; especialmente se for desejado neurotropismo. 0 HSV é, também, relativamente fácil de manipular e pode ser cultivado em títulos elevados. Deste modo, a distribuição não é tão problemática, tanto em termos de volumes necessários para alcançar suficiente MOI como numa necessidade diminuída para doses repetidas.

Com o recente reconhecimento de vírus da hepatite B defeituosos, foi possível ter uma perspectiva da relação estrutura-função de diferentes sequências virais. Estudos in vitro mostraram que o vírus poderia reter a capacidade de empacotamento dependente de auxiliar e transcrição reversa, não obstante a deleção de até 80% do seu genoma (Horwich et ai., 1990). Isto sugeriu que grandes porções do genoma poderiam ser substituídas com material genético estranho. O hepatotropismo e persistência (integração) eram propriedades particularmente atractivas para a transferência génica dirigida pelo fígado. Chang et ai., recentemente introduziu o gene da cloranfenicol acetiltransferase (CAT) no genoma do vírus da hepatite B de pato no local das sequências codificadoras de polimerase de superfície e pré-superfície. Foi co-transfectado com o vírus de tipo selvagem para uma linha celular de hepatoma aviário. Foram utilizados meios de cultura contendo elevados títulos do vírus recombinante para infectar hepatócitos primários de patinho. A expressão génica estável de CAT foi detectada durante, pelo menos, 24 dias após a transfecção (Chang et al., 1991). 54

Estão também contemplados pela presente invenção diversos métodos não virais para a transferência de construções de expressão para células de mamífero cultivadas. Estes incluem precipitação por fosfato de cálcio (Graham e Van Der Eb, 1973; Chen e Okayama, 1987; Rippe et al., 1990) DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporação (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), micro-injecção directa (Harland e Weintraub, 1985), lipossomas carregados com ADN (Nicolau e Sene, 1982; Fraley et al., 1979) e complexos de lipofectamina-ADN, sonicação celular (Fechheimer et al., 1987), bombardeamento génico utilizando microprojectéis de alta velocidade (Yang et al., 1990) e transfecção mediada por receptor (Wu e Wu, 1987; Wu e Wu, 1988). Algumas destas técnicas podem ser adaptadas com sucesso para utilização in vivo ou ex vivo.

Após a distribuição da construção de expressão para a célula, o ácido nucleico codificando o gene de interesse pode ser posicionado e expresso em diferentes sítios. Em determinadas formas de realização, o ácido nucleico codificando o gene pode ser integrado, de um modo estável, no genoma da célula. Esta integração pode ser na localização e orientação cognatas por meio de recombinação homóloga (substituição génica) ou pode ser integrado numa localização aleatória, não específica (aumento génico). Ainda em mais formas de realização, o ácido nucleico pode ser mantido, de um modo estável, na célula como um segmento separado, epissomal, de ADN. Tais segmentos de ácidos nucleicos ou "epissomas" codificam sequências suficientes para permitirem a manutenção e replicação independente ou em sincronização com o ciclo da célula hospedeira. De que modo a construção de expressão é distribuída para uma célula e onde na célula permanece o ácido nucleico, está dependente do tipo de construção de expressão empregue. 55

Numa forma de realização, a construção de expressão pode simplesmente consistir em ADN recombinante livre ou plasmideos. A transferência da construção pode ser realizada por quaisquer dos métodos anteriormente mencionados que, fisicamente ou quimicamente, permeabilizam a membrana celular. Isto é particularmente aplicável para transferência in vitro mas pode ser aplicado, também, para utilização in vivo. Dubensky et al., (1984) injectaram com sucesso ADN de poliomavirus na forma de precipitados de fosfato de cálcio em fígado e baço de murganhos adultos e recém-nascidos, demonstrando replicação virai activa e infecção aguda. Benvenisty e Neshif (1986) demonstraram, também, que a injecção intraperitoneal directa de plasmideos, precipitados com fosfato de cálcio, resulta na expressão dos genes transfectados. Está previsto que ADN codificando um gene de interesse possa ser, também, transferido num modo semelhante in vivo e expressar o produto génico.

Outra forma de realização da invenção para transferência de uma construção de expressão de ADN livre ou segmento de ADN para células envolve o bombardeamento de partículas. Este método depende da capacidade de acelerar microprojécteis revestidos com ADN até uma elevada velocidade, permitindo aos mesmos furarem membranas celulares e entrar nas células, sem as matar (Klein et al., 1987). Foram desenvolvidos diversos dispositivos para acelerar pequenas partículas. Um tal dispositivo depende de uma descarga de alta voltagem para gerar uma corrente eléctrica que, por sua vez, proporciona a força motora (Yang et al., 1990) . Os microprojécteis utilizados têm consistido em substâncias biologicamente inertes, tais como esférulas de tungsténio ou ouro. 56 Órgãos seleccionados, incluindo o fígado, pele e tecido muscular de ratos e murganhos foram bombardeados in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Isto pode requerer exposição cirúrgica do tecido ou células, de modo a eliminar qualquer tecido intermédio entre a pistola e o órgão alvo, i. e., tratamento ex vivo. De novo, ADN codificando um particular gene pode ser distribuído por este método e ainda ser incorporado pela presente invenção.

Numa forma de realização adicional da invenção, o segmento de ADN ou construção de expressão pode ser aprisionado num lipossoma. Os lipossomas são estruturas vesiculares, caracterizadas por uma membrana de bicamada de fosfolípido e um meio aquoso interno. Os lipossomas multilamelares têm múltiplas camadas lipídicas separadas por meio aquoso. Formam-se espontaneamente quando os fosfolípidos são suspensos num excesso de solução aquosa. Os componentes lipídicos sofrem auto-rearranjo, antes da formação de estruturas fechadas, e aprisionam água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh e Bachhawat, 1991). Estão, também, contemplados complexos lipofectamina-ADN. A distribuição e expressão de ácidos nucleicos, mediada por lipossomas de ADN in vitro, tem tido muito sucesso. Wong et al., (1980) demonstraram a praticabilidade da distribuição e expressão mediada por lipossomas de ADN estranho em embrião de galinha, células HeLa e hepatoma cultivados. Nicolau et al., (1987) concretizaram com sucesso a transferência génica mediada por lipossomas em ratos após injecção intravenosa.

Em determinadas formas de realização, o lipossoma pode ser complexado com um vírus de hemoglutinação (HVJ). Demonstrou-se 57 que este facilita a fusão com a membrana celular e promove a entrada na célula de ADN encapsulado em lipossomas (Kaneda et al., 1989). Noutras formas de realização, o lipossoma pode ser complexado ou empregue em conjunto com proteínas cromossómicas, não histonas, nucleares (HMG-1) (Kato et al., 1991). Ainda em mais formas de realização, o lipossoma pode ser complexado ou empregue em conjunto com HVJ e HMG-1. Na medida em que tais construções de expressão tenham sido empregues com sucesso na transferência e expressão de ácido nucleico in vitro e in vivo, então as mesmas são aplicáveis para a presente invenção. Se um promotor bacteriano for empregue na construção de ADN o mesmo irá, também, ser desejável para incluir dentro do lipossoma uma polimerase bacteriana apropriada.

Outras construções de expressão que podem ser empregues para distribuir um ácido nucleico, codificando um particular gene em células, são os veículos de distribuição mediados por receptores. Estes tiram partido da absorção selectiva de macromoléculas por endocitose mediada por receptor em quase todas as células eucarióticas. Em virtude da distribuição específica de tipo celular de diversos receptores, a destribuição veiculação pode ser altamente específica (Wu e Wu, 1993) .

Os veículos de direccionamento génico mediado por receptor geralmente consistem em dois componentes: um ligando específico de receptor celular e um agente de ligação de ADN. Diversos ligandos têm sido utilizados para transferência génica mediada por receptor. Os ligandos mais extensivamente caracterizados são asialoorosomucóide (ASOR) (Wu e Wu, 1987) e transferrina (Wagner et al., 1990). Recentemente, uma neoglicoproteína sintética, que reconhece o mesmo receptor que ASOR, foi utilizada como um 58 veículo de distribuição génica (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994) e o factor de crescimento epidérmico (EGF) foi, também, utilizado para distribuir genes a células de carcinoma epidermóide (Myers, documento EPO 0273085).

Noutras formas de realização, o veiculo de distribuição pode compreender um ligando e um lipossoma. Por exemplo, Nicolau et al., (1987) utilizaram lactosil-ceramida, um asialgangliósido galactose-terminal, incorporada em lipossomas e observaram um aumento na absorção do gene de insulina por hepatócitos. Deste modo, é exequível que um ácido nucleico codificando um particular gene possa ser, também, especificamente distribuído para um tipo celular, tais como células de pulmão, epiteliais ou tumorais, por qualquer número de sistemas de receptor-ligando, com ou sem lipossomas.

Em determinadas formas de realização, a transferência génica pode ser mais facilmente realizada sob condições ex vivo. A terapia génica ex vivo refere-se ao isolamento de células de um organismo, à distribuição de um ácido nucleico para as células in vitro e, depois, ao regresso das células modificadas para dentro de um organismo. Isto pode envolver a remoção cirúrgica de tecido/órgãos de um animal ou a cultura primária de células e tecidos. Anderson et al., Patente U.S. 5399346, divulga métodos terapêuticos ex vivo. F. Síntese Oligonucleotídica conhecida pelos vários mecanismos exemplo, Patentes A síntese oligonucleotídica é bem especialistas na técnica. Foram divulgados diferentes de síntese oligonucleotídica, por 59 u.s. 4659774 4816571 5141813, 5264566 4959463, 5428148, 5554744, 5574146, 5602244. A química do fosforamidito (Beaucage e Lyer, 1992) tornou-se, de longe a química de ligação mais amplamente utilizada para a síntese de oligonucleótidos. Como é bem conhecido pelos especialistas na técnica, a síntese do fosforamidito de oligonucleótidos envolve a activação de precursores monoméricos de fosforamidito nucleósido por reacção com um agente de activação, de modo a formar intermediários activados, seguida de adição sequencial dos intermediários activados à cadeia oligonucleotídica em crescimento (geralmente ancorada por uma extremidade a um suporte sólido adequado) , de modo a formar o produto oligonucleotídico.

Para a activação dos monómeros de fosforamidito nucleósido é geralmente utilizado tetrazole. O tetrazole tem um protão ácido que presumivelmente protona o azoto básico do grupo fosfina diisopropilamino fazendo, deste modo, do grupo diisopropilamino um grupo lábil. O ião tetrazólio negativamente carregado faz, depois, um ataque sobre o fosforoso trivalente, formando uma espécie tetrazólido fosforosa transiente. O grupo 5'-0H do nucleósido ligado ao suporte sólido ataca, depois, a espécie fosforosa trivalente activa, resultando na formação da ligação internucleotídica. 0 fosforoso trivalente é finalmente oxidado no fosforoso pentavalente. As patentes US listadas anteriormente descrevem outros activadores e suportes sólidos para a síntese oligonucleotídica. A síntese oligonucleotídica de alto rendimento pode ser alcançada utilizando um sintetizador. 0 Genome Science and Technology Center, como um aspecto do esforço de desenvolvimento 60 de automatização, desenvolveu recentemente um sintetizador oligonucleotídico de grande escala, de alto rendimento. Este instrumento, denotado MERMADE, é baseado num formato de placas de 96 poços e utiliza controlo robótico para efectuar síntese paralela em 192 amostras (2 placas de 96 poços) . Este dispositivo foi diversamente descrito na literatura e em apresentações, está geralmente disponível no domínio público (licenciado pela Universidade do Texas e disponível por contrato a partir da Avantec). 0 dispositivo passou por diversas gerações com parâmetros operativos diferentes. 0 dispositivo pode ser utilizado para sintetizar 192 oligonucleotidos, simultaneamente, com 99% de sucesso. Tem virtualmente 100% de sucesso para oligómeros inferiores a 60 pb; opera a níveis de síntese de 20 mM e proporciona um rendimento de produto de >99% de síntese completa. Utilizando estes sistemas, a requerente sintetizou mais de 10000 oligómeros utilizados para sequenciação, amplificação por PCR™ e aplicações de ADN recombinante. Para a maior parte das utilizações, incluindo clonagem, o sucesso da síntese é suficiente, de modo que a purificação pós-síntese não é requerida.

Após a síntese do genoma, utilizando os métodos da presente invenção, pode ser necessário rastrear as sequências para análise de função. Estão especificamente contempladas pelo presente requerente, as tecnologias de ADN baseadas em chip, tais como aquelas descritas por Hacia et ai. (1996) e Shoemaker et al. (1996). Resumidamente, estas técnicas envolvem métodos quantitativos para a análise de um grande número de genes de um modo rápido e exacto. Através da colocação de caudas oligonucleotídicas em genes ou utilizando matrizes de sondas fixas, pode empregar-se a tecnologia de chip para segregar 61 moléculas alvo como matrizes de alta densidade e rastrear estas moléculas com base na hibridação. Ver, também, Pease et al. (1994); Fodor et al. (1991). A utilização de síntese combinatória e ensaios de rastreio de alto rendimento são bem conhecidos pelos especialistas na técnica, e. g., documentos 5807754; 5807683; 5804563; 5789162; 5783384; 5770358; 5759779; 5747334; 5686242; 5198346; 5738996; 5733743; 5714320; 5663046. Estas patentes ensinam diversos aspectos dos métodos e composições envolvidos nas análises de construção e actividade de matrizes de alta densidade de diferentes polisubunidades (polinucleótidos ou polipéptidos). Como tal, está contemplado que os métodos e composições descritos nas patentes listadas anteriormente podem ser úteis no ensaio de perfis de actividade das composições da presente invenção. A presente invenção produz um polinucleótido competente para replicação. Os vírus são pedaços de ADN competentes para replicação, de ocorrência natural, na medida em que essa divulgação em relação aos vírus possa ser útil no contexto da presente invenção, o seguinte é uma divulgação de vírus. Os investigadores notam que os vírus evoluíram de modo a poderem ser capazes de distribuir ADN a diversos tecidos hospedeiros, não obstante os diversos mecanismos defensivos do corpo humano. Por esta razão, foram concebidos numerosos vectores virais concebidos por investigadores, procurando criar veículos para distribuição génica terapêutica. Alguns dos tipos de vírus que foram manipulados são listados abaixo. 62 II. Adenovírus 0 adenovírus é um vírus de ADN de cadeia dupla de 36 kB, linear, que permite a substituição de grandes pedaços de ADN adenoviral com sequências estranhas até 7 kB (Grunhaus e

Horwitz, 1992) . O ADN de adenovírus não se integra dentro do cromossoma da célula hospedeira, em virtude de o ADN adenoviral se poder replicar num modo epissomal. Além disso, os adenovírus são estruturalmente estáveis e não foi detectado qualquer rearranjo genómico após extensa amplificação. Os adenovírus podem infectar virtualmente todas as células epiteliais, independentemente do estádio do seu ciclo celular. Isto significa que os adenovírus podem infectar células em não divisão. Até agora, a infecção adenoviral parece estar ligada apenas a doença moderada, tal como a doença respiratória aguda em humanos. Este grupo de vírus pode ser obtido em elevados títulos, e. g., 109-1011 unidades de formação de halos por mL e são altamente infecciosos.

Ambas as extremidades do genoma virai contêm repetições invertidas de 100-200 pares de bases (ITR), que são elementos eis necessários para a replicação e empacotamento de ADN virai. As regiões precoce (E) e tardia (L) do genoma contêm diferentes unidades de transcrição que estão divididas pelo começo da replicação de ADN virai. A região EI (EIA e E1B) codifica proteínas responsáveis pela regulação da transcrição do genoma virai e alguns genes celulares. A expressão da região E2 (E2A e E2B) resulta na síntese das proteínas para replicação de ADN virai. Estas proteínas estão envolvidas na replicação de ADN, expressão génica tardia e desligamento da célula hospedeira (Renan, 1990). Os produtos dos genes tardios, incluindo a maioria das proteínas da cápside virai, são expressos apenas 63 após processamento significativo de um único transcrito primário, emitidos pelo promotor tardio principal (MLP). 0 MLP (localizado a 16,8 m.u.) é particularmente eficiente durante a fase tardia de infecção e todos os ARNm emitidos deste promotor possuem uma sequência condutora 5'-tripartida (TPL) que os torna ARNm preferidos para tradução. A região E3 codifica proteínas que parecem ser necessárias para a lise eficiente de células infectadas com Ad, assim como prevenção de citólise mediada por TNF e lise mediada por CTL de células infectadas. Em geral, considera-se que a região E4 codifica sete proteínas, algumas das quais activam o promotor E2. Demonstrou-se que bloqueia o transporte de ARNm hospedeiro e melhora o transporte de ARN virai para o citoplasma. Adicionalmente, o produto de E4 é responsável, em parte, pela diminuição na expressão génica precoce verificada tardiamente na infecção. 0 E4 inibe, também, a expressão de EIA e E4 (mas não E1B) durante o crescimento lítico. Algumas das proteínas de E4 são necessárias para a replicação eficiente de ADN, contudo o mecanismo para este envolvimento é desconhecido. 0 E4 está, também, envolvido em eventos pós-transcricionais na expressão génica tardia virai; i. e., excisão alternativa do condutor tripartido no crescimento lítico. Não obstante, as funções de E4 não são absolutamente requeridas para a replicação de ADN mas a sua ausência irá retardar a replicação. Outras funções incluem a regulação negativa da síntese de ADN virai, indução da reorganização subnuclear, normalmente verificada durante a infecção de adenovírus e outras funções que são necessárias para a replicação virai, acumulação de ARNm virai tardia e desligamento transcricional da célula hospedeira. II. Retrovírus

Os retrovírus são um grupo de vírus de ARN de cadeia simples, caracterizados por uma capacidade para converter o seu ARN em ADN de cadeia dupla para células infectadas por um processo de transcrição reversa (Coffin, 1990). O ADN resultante integra-se, depois, de um modo estável nos cromossomas celulares como um provírus e dirige a síntese de proteínas virais. A integração resulta na retenção das sequências génicas virais na célula receptora e suas descendentes. O genoma retroviral contém três genes, gag, pol e env que codificam para proteínas da cápside, enzima polimerase e componentes do envelope, respectivamente. Uma sequência verificada a montante do gene gag, designada componentes ψ, é construída (Mann et aí., 1983) . Quando um plasmídeo recombinante contendo um ADNc humano, juntamente com a LTR retroviral e sequências ψ é introduzido dentro desta linha celular (por precipitação por fosfato de cálcio, por exemplo), a sequência ψ permite que o transcrito de ARN do plasmídeo recombinante seja empacotado dentro de partículas virais que são, depois, segregadas para os meios de cultura (Nicolas e Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et ai., 1983). Os meios contendo os retrovírus recombinantes são, depois, recolhidos, opcionalmente concentrados, e utilizados para a transferência génica. Os vectores retrovirais são capazes de infectar uma ampla variedade de tipos de células. Contudo, a integração requer a divisão de células hospedeiras (Paskind et al., 1975) . A família dos retrovírus inclui as subfamílias dos oncovírus, os lentivírus e os spumavírus. Dois oncovírus são o vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV) e o vírus da leucemia felina (FeLV). Os lentivírus incluem vírus da imunodeficiência 65 humana (HIV), vírus da imunodeficiência símia (SIV) e vírus da imunodeficiência felina (FIV). De entres estes vírus murinos, tal como o MMLV, existe uma classificação adicional. Os vírus murinos podem ser ecotrópicos, xenotrópicos, politrópicos ou anfotrópicos. Cada classe de vírus visa diferentes receptores de superfície celular, para iniciar a infecção.

Avanços adicionais na concepção de vectores retrovirais e métodos de concentração permitiram a produção de vírus anfotrópicos e xenotrópicos, com títulos de 108 a 109 cfu/mL (Bowles et al., 1996; Irwin et ai., 1994; Jolly, 1994; Kitten et al., 1997) .

Os retrovírus recombinantes de replicação defeituosa não são patógenos agudos em primatas (Chowdhury et al., 1991). Foram aplicados com sucesso em sistemas de cultura celular para transferência do gene de CFTR e gerar secreção de Cl- activada por cAMP- numa variedade de tipos de células, incluindo epitélios de vias respiratórias humanas (Drumm et al., 1990, Olsen et al., 1992; Anderson et al., 1991; Olsen et al., 1993). Embora haja provas de respostas imunitárias às proteínas virais gag e env, estas não impedem a readministração bem-sucedida de vector (McCormack et al., 1997) . Além disso, visto que os retrovírus recombinantes não têm quaisquer produtos génicos expressos, com excepção do transgene, o risco de uma resposta inflamatória de hospedeiro, em virtude de expressão proteica virai, é limitado (McCormack et al., 1997). Quanto à preocupação envolvendo a mutagénese insercional, até à data não existem quaisquer exemplos de mutagénese insercional surgindo de qualquer ensaio humano com vectores retrovirais recombinantes. 66

Mais recentemente, foram descritos vectores de lentivírus híbridos combinando elementos de vírus da imunodeficiência humana (HIV) (Naldini et al., 1996) ou vírus da imunodeficiência felina (FIV) (Poeschla et al., 1998) e MMLV. Estes vectores transduzem células em não divisão no SNC (Naldini et al., 1996; Blomer et al., 1997), fígado (Kafri et al., 1997), músculo (Kafri et al., 1997) e retina (Miyoshi et al., 1997). Contudo, um relatório recente em modelos de xenoenxerto de epitélios de vias respiratórias humanas, sugere que em epitélios bem diferenciados, a transferência génica com lentivírus baseado em HIV de VSV-G pseudotipado é ineficiente (Goldman et al., 1997). III. Vírus Adeno-Associado

Adicionalmente, o AAV possui diversas características únicas que o tornam mais desejável do que outros vectores. Ao contrário dos retrovírus, o AAV pode infectar células em não divisão; o AAV de tipo selvagem foi caracterizado por integração, num modo específico de sítio, no cromossoma 19 de células humanas (Kotin e Berns, 1989; Kotin et al., 1990; Kotin et al., 1991; Samulski et al., 1991); e o AAV possui, também, propriedades anti-oncogénicas (Ostrove et al., 1981; Berns e Giraud, 1996). Os genomas de AAV recombinante são construídos por clonagem molecular de sequências de ADN de interesse entre as ITRs de AAV, eliminando todas as sequências codificantes do genoma de AAV de tipo selvagem. Os vectores de AAV produzidos deste modo não têm quaisquer das sequências codificantes de AAV de tipo selvagem, contudo retêm a propriedade de integração cromossómica e expressão estável dos genes recombinantes após transdução in vitro e In vivo (Berns, 1990; Berns e Bohensky, 1987; Bertran et al., 1996; Kearns et al., 1996; Ponnazhagan 67 et al., 1997a). Até recentemente, considerava-se que o AAV infectava quase todos os tipos de células e até atravessava as barreiras entre espécies. Contudo, foi agora determinado que a infecção de AAV é mediada por receptor (Ponnazhagan et al., 1996; Mizukami et al., 1996). 0 AAV utiliza um ADN linear de cadeia simples de cerca de 4700 pares de bases. Repetições terminais invertidas flanqueiam o genoma. Estão presentes dois genes dentro do genoma, dando origem a um determinado número de produtos génicos distintos. O primeiro, o gene cap, produz três proteínas virião (VP) diferentes, designadas VP-1, VP-2 e VP-3. O segundo, o gene rep, codifica quatro proteínas não estruturais (NS). Um ou mais destes produtos génicos rep é responsável por transactivar a transcrição de AAV. A sequência de AAV é proporcionada por Srivastava et al. (1983) e na Patente U.S. 5252479 (cujo texto integral é aqui especificamente incorporado por referência).

Os três promotores em AAV são designados pela sua localização, em unidades de mapa, no genoma. Estes são, da esquerda para a direita, p5, pl9 e p40. A transcrição dá origem a seis transcritos, dois iniciados em cada de três promotores, sendo excisado um de cada par. O sítio de excisão, derivado das unidades de mapa 42-46, é o mesmo para cada transcrito. As quatro proteínas não estruturais são aparentemente derivadas do mais longo dos transcritos e três proteínas virião surgem todas do transcrito mais pequeno. O AAV não está associado a qualquer estado patológico em humanos. Interessantemente, para replicação eficiente, o AAV requer funções "de auxílio" de vírus, tais como vírus herpes simplex I e II, citomegalovírus, vírus da pseudo-raiva e, 68 certamente, adenovírus. 0 mais bem caracterizado dos auxiliares é o adenovírus e demonstrou-se que muitas funções "precoces" para este vírus auxiliam na replicação de AAV. Considera-se que a expressão de baixo nível de proteínas rep de AAV mantenha a expressão estrutural de AAV em pausa e pensa-se que a infecção de vírus auxiliar remove este bloqueio. IV. Vírus da Vaccinia

Os vírus vaccinia são um género da família dos poxvírus. Os vectores de vírus da vacínia foram extensamente utilizados, em virtude da facilidade da sua construção, níveis relativamente elevados de expressão obtidos, ampla gama de hospedeiros e grande capacidade para transportar ADN. 0 vacínia contém um genoma de ADN linear de cadeia dupla de cerca de 186 kB que exibe uma marcada preferência "A-T". As repetições terminais invertidas de cerca de 10,5 kB flanqueiam o genoma. A maioria de genes essenciais parece mapear dentro da região central que é mais altamente conservada de entre os poxvírus. As fases de leitura aberta estimadas em vírus da vacínia somam de 150 a 200. Embora ambas as cadeias sejam codificantes, não é comum uma extensa sobreposição de fases de leitura. A Patente U.S. 5656465 (especificamente incorporada por referência) descreve a distribuição génica in vivo utilizando poxvírus. V. Papovavírus A família dos papovavírus inclui os papilomavírus e os poliomavírus. Os poliomavírus incluem o Vírus Símio 40 (SV40), poliomavírus e os poliomavírus humanos BKV e JCV. Os 69

papilomavírus incluem os papilomavírus bovinos e humanos. Os genomas de poliomavírus são ADN circulares de um pouco mais de 5000 bases. Os produtos génicos predominantes são três proteínas virião (VP1-3) e os antigénios T Grande e T Pegueno. Alguns têm uma proteína estrutural adicional, a agnoproteína, e outros têm um antigénio T Central. Os papilomavírus são algo maiores, aproximando-se de 8 kB

Pouco se sabe acerca dos receptores celulares para os poliomavírus, porém a infecção de polioma pode ser bloqueada por tratamento com sialidase. 0 SV40 irá ainda infectar células tratadas com sialidase, porém o JCV não pode hemoglutinar células tratadas com sialidase. Em virtude da interacção de VP1 de polioma com a superfície celular activar c-myc e c-fos, foi admitida a hipótese de que o receptor virai possa ter algumas propriedades de um receptor de factor de crescimento. Os papilomavírus são especificamente trópicos para epitélios epidermóides, embora o receptor específico não tenha sido identificado. VI. Paramixovírus A família dos paramixovírus está dividida em três géneros: paramixovírus, morbilivírus e pneumovírus. O género paramixovírus inclui o vírus da papeira e vírus Sendai, entre outros, ao passo que os morbilivírus incluem o vírus do sarampo e os pneumovírus incluem o vírus sincicial respiratório (RSV). Os genomas de paramixovírus são baseados em ARN e contêm um conjunto de seis ou mais genes, covalentemente ligados em série. O genoma tem algo mais de 15 kB em comprimento. A partícula virai tem 150-250 nm de diâmetro, com projecções "penugentas" ou 70 picos protuberantes. Estas são glicoproteínas virais que auxiliam a mediar a conjugação e entrada do virus para dentro das células hospedeiras.

Na ligação e entrada de paramixovirus está envolvida uma série especializada de proteínas. A conjugação em Paramixovirus e Morbilivírus é mediada por glicoproteínas que se ligam a receptores contendo ácido siálico. Outras proteínas ancoram o vírus por inclusão de regiões hidrófobas na camada lipídica da superfície da célula e exibem actividades de hemoglutinação e neuraminidase. Em Pnemovírus, a glicoproteína está fortemente glicosilada com ligações O-glicosídicas. Esta molécula não tem as actividades de hemoglutinação e neuraminidase dos seus parentes. VII. Herpesvirus.

Em virtude do vírus herpes simplex (HSV) ser neurotrópico, provocou interesse considerável no tratamento de distúrbios do sistema nervoso. Além do mais, a capacidade de o HSV estabelecer infecções latentes em células neuronais em não divisão sem se integrar no cromossoma da célula hospedeira ou, de outro modo, alterar o metabolismo da célula hospedeira, juntamente com a existência de um promotor que está activo durante a latência, torna o HSV um vector atractivo. E embora muita atenção se tenha focado nas aplicações neurotrópicas de HSV, este vector pode ser, também, explorado para outros tecidos, dada a sua ampla gama de hospedeiro.

Outro factor que faz do HSV um vector atractivo é o tamanho e organização do genoma. Em virtude do HSV ser de grandes 71 dimensões, a incorporação de múltiplos genes ou cassetes de expressão é menos problemática do que em outros sistemas virais mais pequenos. Adicionalmente, a disponibilidade de diferentes sequências de controlo virais com desempenho variável (temporal, resistência, etc.), torna possível controlar a expressão numa maior extensão do que em outros sistemas. É, também, uma vantagem que o vírus tenha relativamente menos mensagens excisadas, facilitando adicionalmente as manipulações genéticas. 0 HSV é, também, relativamente fácil de manipular e pode ser cultivado em títulos elevados. Deste modo, a distribuição não é tão problemática em termos de volumes necessários para alcançar suficiente MOI e numa necessidade diminuída para doses repetidas. Para uma revisão do HSV como um vector de terapia génica, ver Glorioso et al. (1995).

Os HSV, designados com subtipos 1 e 2, são vírus de envelope que estão entre os agentes infecciosos mais comuns encontrados por humanos, infectando milhões de indivíduos humanos a nível mundial. 0 genoma de grandes dimensões, complexo, de ADN de cadeia dupla, codifica para dúzias de diferentes produtos génicos, alguns dos quais derivam de transcritos excisados. Além de componentes estruturais de virião e envelope, o vírus codifica numerosas outras proteínas, incluindo uma protease, uma redutase de ribonucleótidos, uma ADN polimerase, uma proteína de ligação de ADNcs, uma helicase/primase, uma ATPase dependente de ADN, uma dUTPase e outras.

Os genes de HSV formam diversos grupos, cuja expressão é coordenadamente regulada e sequencialmente ordenada num modo de cascata (Honess e Roizman, 1974; Honess e Roizman 1975; Roizman 72

e Sears, 1995) . A expressão de genes α, o primeiro conjunto de genes a ser expresso após infecção, é estimulada pela proteína de virião número 16, ou factor de transdução α (Post et al., 1981; Batterson e Roizman, 1983; Campbell et al., 1983) . A expressão de genes β requer produtos génicos α funcionais, de um modo muito notável ICP4 que é codificado pelo gene oí4 (DeLuca et al., 1985) . Os genes γ, um grupo heterogéneo de genes codificando largamente proteínas estruturais de virião, requer o começo da síntese de ADN virai para expressão óptima (Holland et al., 1980) .

Em linha com a complexidade do genoma, o ciclo de vida de HSV é muito complicado. Além do ciclo lítico, que resulta na síntese de partículas virais e, eventualmente, morte celular, o vírus tem a capacidade para entrar num estado latente, no qual o genoma é mantido em gânglios neurais até que algum sinal, até agora indefinido, provoque uma recorrência do ciclo lítico.

Foram desenvolvidos variantes avirulentos de HSV e estão facilmente disponíveis para utilização em contextos de terapia génica (Patente U.S. 5672344). G. Exemplos

Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar as formas de realização preferidas da invenção. Deve ser entendido pelos especialistas na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo requerente para funcionarem bem na prática da invenção e podem, deste modo, ser consideradas como constituindo modos preferidos para a sua prática. Contudo, os especialistas na técnica devem, à luz da presente divulgação, entender que podem ser realizadas 73 muitas alterações nas formas de realizaçao específicas que sao divulgadas e obter-se, ainda, um resultado igual ou semelhante. EXEMPLO 1

Construção génico combinatório 0 requerente desenvolveu uma estratégia de construção oligomérico em moléculas de ADN de maiores dimensões, denotada construção combinatória. 0 processo é efectuado como se segue: pode conceber-se um plasmídeo utilizando um de um determinado número de programas informáticos, comerciais ou de domínio público, para conter os genes, promotores, selecção de fármaco, origem de replicação, etc., requeridos. 0 SynGene v.2.0 é um programa que gera uma lista de oligonucleótidos de sobreposição, suficiente para a reconstrução do gene ou plasmídeo (ver a FIG. 7A-FIG. 7G). Por exemplo, para um gene de 5000 pb, o SynGene 2.0 pode gerar duas listas de 100 componentes de 50 meros de uma cadeia e 100 componentes de 50 meros da cadeia complementar, de modo a que cada par de oligómeros se irá sobrepor em 25 pares de bases. 0 programa verifica a sequência para repetições e produz um ficheiro de entrada MERMADE que programa directamente o sintetizador oligonucleotídico. O sintetizador produz dois conjuntos de placas de 96 poços contendo os oligonucleótidos complementares. Um programa SynGene é representado na FIG. 7. Este programa é concebido para decompor um gene ou genoma de concepção em oligonucleótidos para síntese. O programa é para o gene de concepção sintético completo e é baseado num programa original para a formatação de sequências de ADN escrito pelo Dr. Glen Evans. 74 A construção combinatória é mais bem efectuado utilizando uma estação de trabalho robótica programável, tal como uma Beckman Biomek 2000. Em resumo, pares de oligómeros que se sobrepõem são misturados e emparelhados. A seguir ao emparelhamento, é gerado um conjunto mais pequeno de oligómeros dúplices. Estes são de novo emparelhados, formando um conjunto mais pequeno de oligómeros maiores. Sequencialmente, os oligómeros de sobreposição são deixados emparelhar até que todo a reconstrução esteja completo. O emparelhamento pode ser efectuado na ausência de ligase ou cada passo por ser seguida de ligação. Numa configuração, os oligómeros são emparelhados na presença de topoisomerase 2, que não requer fosforilação em 5' do oligómero, ocorre à temperatura ambiente e é uma reacção rápida (5 minutos), em oposição a ligação de 12 h, a 12 °C. A seguir aa construção completo, a molécula de ADN resultante pode ser utilizada para a sua finalidade designada, habitualmente transformação dentro de um hospedeiro bacteriano para replicação. Os passos neste ciclo são delineadas na FIG. 3.

Esta abordagem tem uma vantagem principal em relação à clonagem baseada em ADN recombinante tradicional. Embora seja tecnicamente exequível preparar virtualmente qualquer modificação ou mutação em moléculas de ADN existentes, o esforço requerido, bem como a competência técnica elevada, tornam algumas construções difíceis ou fastidiosas. Este método, embora tendo sido utilizado durante muitos anos, não é aplicável à clonagem génica automatizada ou criação em grande escala de sequências de ADN inteiramente novas. 75 EXEMPLO 2

Produção de Genes Artificiais

Num exemplo, a presente invenção irá produzir um gene conhecido de cerca de 1000 pares de bases em comprimento pelo seguinte método. Um conjunto de oligonucleótidos, cada de 50 bases, é produzido de modo a que toda a cadeia mais do gene seja representada. Um segundo conjunto de oligonucleótidos, também compreendido por 50 meros, é produzido para a cadeia menos. Contudo, este conjunto é concebido de modo a que o emparelhamento complementar com o primeiro e segundo conjuntos resulte em sobreposição de sequências "emparelhadas", i. e., cada oligonucleótido do primeiro conjunto é complementar com regiões dos dois oligonucleótidos do segundo conjunto (com a possível excepção dos oligonucleótidos terminais). A região de sobreposição é fixa em 30 bases, deixando uma extremidade protuberante de 2 0 pares de bases para cada par. O primeiro e referido segundo conjunto de oligonucleótidos são emparelhados numa única mistura e tratados com uma enzima de ligação.

Noutro exemplo, o gene a ser sintetizado tem cerca de 5000 pares de bases. Cada conjunto de oligonucleótidos é feito por cinquenta 100-meros com regiões de sobreposição, de oligonucleótidos complementares, de 75 bases, deixando "extremidades coesivas" de 25 bases. Nesta forma de realização, o oligonucleótido 5' terminal do primeiro conjunto oligonucleotídico é emparelhado com o oligonucleótido 3' terminal do segundo conjunto, de modo a formar um primeiro produto emparelhado, depois o oligonucleótido mais 5' terminal seguinte do primeiro conjunto é emparelhado com o primeiro produto emparelhado, de modo a formar um segundo produto 76 emparelhado e o processo é repetido até que todos os oligonucleótidos do referido primeiro e referido segundo conjuntos tenham sido emparelhados. A ligação dos produtos pode ocorrer entre etapas ou na conclusão de todas as hibridações.

Num terceiro exemplo, um gene de 100000 pb é sintetizado a partir de mil e 100-meros. Novamente, a sobreposição entre "pares" de oligonucleótidos mais e menos é de 75 bases, deixando uma extremidade protuberante de 25 pares de bases. Neste método, é utilizada uma abordagem combinatória, onde os pares correspondentes de oligonucleótidos parcialmente complementares são hibridados no primeiro passo. Uma segunda série de hibridação é, depois, empreendida com pares apropriadamente complementares de produtos da primeira série. Este processo é repetido um total de 10 vezes, reduzindo cada série de hibridação o número de produtos em metade. É, depois, realizada a ligação dos produtos. EXEMPLO 3

Expressão em grande escala de produtos génicos humanos

Após a caracterização do genoma humano, a análise funcional do genoma humano, baseada na sequência completa, irá requerer uma variedade de abordagens para biologia estrutural, funcional e de rede. A abordagem aqui proposta para a produção de uma série de construções de expressão representando todos os potenciais produtos génicos humanos e a construção de conjuntos de bactérias e/ou leveduras expressando estes produtos irá proporcionar uma importante via para os fundamentos da análise funcional. 77

Em segundo lugar, a abordagem aqui descrita, quando desenvolvida até ao seu óptimo teórico, irá permitir a transferência em grande escala de genes para linhas celulares ou organismos para análise funcional. 0 objectivo de longo prazo deste conceito é a criação de organismos vivos inteiramente baseados na bioinformática e processamento de informação. Obviamente, o conhecimento da sequência completa não é suficiente para entender a miríade de conceitos biológicos inerentes à vida. EXEMPLO 4

Construção de um plasmídeo sintético

Uma molécula de ADN foi concebida utilizando partes sintéticas de plasmídeos anteriormente conhecidos. Como uma demonstração desta técnica, foi concebido o plasmídeo synlux4. 0 Synlux4 consiste em 4800 pares de bases de ADN. Dentro desta sequência estão incluídas a sequência de lux A e lx B, os componentes A e B da proteína luciferase de Vibrio Fisherii, porções do plasmídeo pUC19, incluindo as sequências de origem de replicação e estabilidade de replicação, a sequência promotora e codificante para a canamicina/neomicina fosfotransferase de tn9. A sequência foi concebida num computador utilizando o Microsoft Word e Vector NTI (InforMax, Inc.) . A sequência é listada na FIG. 4A-FIG. 4C.

A seguir à concepção, um programa informático, SynGene 2.0, foi utilizado para decompor a sequência em componentes consistindo em oligonucleótidos de 50 meros de sobreposição. A 78 partir da sequência de 4800 pares de bases, foram concebidos 192 50 meros. Os oligonucleótidos componentes são listados na FIG. 5A-FIG. 5F. Estes oligonucleótidos componentes foram sintetizados utilizando um sintetizador oligonucleotidico de 96 poços feito por encomenda (Rayner, et al.) Genome Research, 8, 741-747 (1998). Os oligonucleótidos componentes foram produzidos em duas placas de microtitulação de 96 poços, contendo cada placa um conjunto de oligonucleótidos componentes. Deste modo, a placa um continha os oligos de cadeia directa e a placa 2 continha os oligos de cadeia inversa.

Os oligonucleótidos foram agrupados e as ligações efectuadas utilizando uma estação de trabalho robótica Biomek 1000 (Beckman). As transferências sequenciais de oligonucleótidos foram realizadas por pipetagem de um poço para um segundo poço da placa e uma reacção de ligação efectuada utilizando a T4 ligase. 0 padrão de construção é delineado na FIG. 6A-FIG. 6B. A seguir aa construção, a mistura de ligação resultante foi utilizada para transformar a estirpe de E. coli competente DH5a. A mistura de transformação foi plaqueada em placas de LB contendo sulfato de canamicina a 25 pg/mL e colónias recombinantes obtidas. Os clones recombinantes resultantes foram isolados, clonados e o ADN preparado. O ADN foi analisado em géis de agarose a 1% para detectar moléculas recombinantes. Demonstrou-se que os clones continham o plasmídeo de 4800 pares de bases esperado, contendo os genes lux A e B. A totalidade das composições e/ou métodos aqui divulgados e reivindicados pode ser realizada e executada, sem experimentação indevida, à luz da presente divulgação. Embora as composições e 79 métodos desta invenção tenham sido descritas em termos de formas de realização preferidas, irá ser evidente para os especialistas na técnica que podem ser aplicadas variações às composições e/ou métodos e nos passos ou na sequência de etapas do método aqui descrito. De um modo mais especifico, irá ser evidente que determinados agentes que são quimicamente e fisiologicamente aparentados podem ser substituídos com os agentes aqui descritos, enquanto os mesmos ou semelhantes resultados seriam alcançados.

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<120> MÉTODO PARA A SÍNTESE QUÍMICA E CONSTRUÇÃO COMPLETA DE GENES E GENOMAS

<130> UTFD: 572P <140> Desconhecido <141> 1998-09-16 <150> US 60/059017 <151> 1997-09-16 <160> 193 <170> Patentln Ver 2.0 <210> 1 <211> 4800 <212> ADN <213> Sequência <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Plasmideo Sintético 90 <400> 1 aagcttacct cgatttgagg acgttacaag tattactgtt aaggagcgta gattaaaaaa 60 tgaaattgaa aatgaattat tagaattggc ttaaataaac agaatcacca aaaaggaata 120 gagtatgaag tttggaaata tttgtttttc gtatcaacca ccaggtgaaa ctcataagct 180 aagtaatgga tcgctttgtt cggcttggta tcgcctcaga agagtagggt ttgatacata 240 ttggacctta gaacatcatt ttacagagtt tggtcttacg ggaaatttat ttgttgctgc 300 ggctaacctg ttaggaagaa ctaaaacatt aaatgttggc actatggggg ttgttattcc 360 gacagcacac ccagttcgac agttagaaga cgttttatta ttagatcaaa tgtcgaaagg 420 tcgttttaat tttggaaccg ttcgagggct ataccataaa gattttcgag tatttggtgt 480 tgatatggaa gagtctcgag caattactca aaatttctac cagatgataa tggaaagctt 540 acagacagga accattagct ctgatagtga ttacattcaa tttcctaagg ttgatgtata 600 tcccaaagtg tactcaaaaa atgtaccaac ctgtatgact gctgagtccg caagtacgac 660 agaatggcta gcaatacaag ggctaccaat ggttcttagt tggattattg gtactaatga 720 aaaaaaagca cagatggaac tctataatga aattgcgaca gaatatggtc atgatatatc 780 taaaatagat cattgtatga cttatatttg ttctgttgat gatgatgcac aaaaggcgca 840 agatgtttgt cgggagtttc tgaaaaattg gtatgactca tatgtaaatg cgaccaatat 900 ctttaatgat agcaatcaaa ctcgtggtta tgattatcat aaaggtcaat ggcgtgattt 960 tgttttacaa ggacatacaa acaccaatcg acgtgttgat tatagcaatg gtattaaccc 1020 tgtaggcact cctgagcagt gtattgaaat cattcaacgt gatattgatg caacgggtat 1080 tacaaacatt acatgcggat ttgaagctaa tggaactgaa gatgaaataa ttgcttccat 1140 gcgacgcttt atgacacaag tcgctccttt cttaaaagaa cctaaataaa ttacttattt 1200 gatactagag ataataagga acaagttatg aaatttggat tattttttct aaactttcag 1260 aaagatggaa taacatctga agaaacgttg gataatatgg taaagactgt cacgttaatt 1320 gattcaacta aatatcattt taatactgcc tttgttaatg aacatcactt ttcaaaaaat 1380 ggtattgttg gagcacctat taccgcagct ggttttttat tagggttaac aaataaatta 1440 catattggtt cattaaatca agtaattacc acccatcacc ctgtacgtgt agcagaagaa 1500 gccagtttat tagatcaaat gtcagaggga cgcttcattc ttggttttag tgactgcgaa 1560 agtgatttcg aaatggaatt ttttagacgt catatctcat caaggcaaca acaatttgaa 1620 gcatgctatg aaataattaa tgacgcatta actacaggtt attgtcatcc ccaaaacgac 1680 ttttatgatt ttccaaaggt ttcaattaat ccacactgtt acagtgagaa tggacctaag 1740 caatatgtat ccgctacatc aaaagaagtc gtcatgtggg cagcgaaaaa ggcactgcct 1800 ttaacattta agtgggagga taatttagaa accaaagaac gctatgcaat tctatataat 1860 aaaacagcac aacaatatgg tattgatatt tcggatgttg atcatcaatt aactgtaatt 1920 gcgaacttaa atgctgatag aagtacggct caagaagaag tgagagaata cttaaaagac 1980 tatatcactg aaacttaccc tcaaatggac agagatgaaa aaattaactg cattattgaa 2040 gagaatgcag ttgggtctca tgatgactat tatgaatcga caaaattagc agtggaaaaa 2100 acagggtcta aaaatatttt attatccttt gaatcaatgt ccgatattaa agatgtaaaa 2160 gatattattg atatgttgaa ccaaaaaatc gaaatgaatt taccataata aaattaaagg 2220 91 attagattgc ctttttgggg atcctctaga aatattttat ctgattaata tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaaaagcttc aagcactcag ggcgcaaggg ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc aaacggtgct gaccccggat gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg cgccctctgg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg tcaagatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccggg atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 92 atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 4560 cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 4620 cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 4680 agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 4740 tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 4800

<210> 2 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oliqonucleótido Sintético <400> 2

aagcttacct cqatttgagg acgttacaag tattactgtt aaggagcgta 50 <210> 3 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido

Sintético <400> 3 gattaaaaaa tgaaattgaa aatgaattat tagaattggc ttaaataaac 50

<210> 4 <211> 50 <212> ADN 93 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 4 agaatcacca aaaaggaata gagtatgaag tttggaaata tttgtttttc 50

<210> 5 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 5 gtatcaacca ccaggtgaaa ctcataagct aagtaatgga tcgctttgtt 50

<210> 6 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 6 cggcttggta tcgcctcaga agagtagggt ttgatacata ttggacctta 50 94

<210> 7 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 7 gaacatcatt ttacagagtt tggtcttacg ggaaatttat ttgttgctgc 50

<210> 8 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 8 ggctaacctg ttaggaagaa ctaaaacatt aaatgttggc actatggggg 50

<210> 9 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 95 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 9 ttgttattcc gacagcacac ccagttcgac agttagaaga cgttttatta 50

<210> 10 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 10 ttagatcaaa tgtcgaaagg tcgttttaat tttggaaccg ttcgagggct 50

<210> 11 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 11 ataccataaa gattttcgag tatttggtgt tgatatggaa gagtctcgag 50 96

<210> 12 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 12 caattactca aaatttctac cagatgataa tggaaagctt acagacagga 50

<210> 13 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 13 accattagct ctgatagtga ttacattcaa tttcctaagg ttgatgtata 50

<210> 14 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 97 <4 Ο 0> 14 tcccaaagtg tactcaaaaa atgtaccaac ctgtatgact gctgagtccg 50

<210> 15 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 15 caagtacgac agaatggcta gcaatacaag ggctaccaat ggttcttagt 50

<210> 16 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 16 tggattattg gtactaatga aaaaaaagca cagatggaac tctataatga 50

<210> 17 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 98 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 17 aattgcgaca gaatatggtc atgatatatc taaaatagat cattgtatga 50

<210> 18 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 18 cttatatttg ttctgttgat gatgatgcac aaaaggcgca agatgtttgt 50

<210> 19 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 19 cgggagtttc tgaaaaattg gtatgactca tatgtaaatg cgaccaatat 50 99

<210> 20 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 20 ctttaatgat agcaatcaaa ctcgtggtta tgattatcat aaaggtcaat 50

<210> 21 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 21 ggcgtgattt tgttttacaa ggacatacaa acaccaatcg acgtgttgat 50

<210> 22 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 100 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 22 tatagcaatg gtattaaccc tgtaggcact cctgagcagt gtattgaaat 50

<210> 23 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 23 cattcaacgt gatattgatg caacgggtat tacaaacatt acatgcggat 50

<210> 24 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético de <400> 24 ttgaagctaa tggaactgaa gatgaaataa ttgcttccat gcgacgcttt 50 101

<210> 25 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 25 atgacacaag tcgctccttt cttaaaagaa cctaaataaa ttacttattt 50

<210> 26 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 26 gatactagag ataataagga acaagttatg aaatttggat tattttttct 50

<210> 27 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 102 <4Ο0> 27 aaactttcag aaagatggaa taacatctga agaaacgttg gataatatgg 50

<210> 28 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 28 taaagactgt cacgttaatt gattcaacta aatatcattt taatactgcc 50

<210> 29 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 29 tttgttaatg aacatcactt ttcaaaaaat ggtattgttg gagcacctat 50

<210> 30 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 103 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 30 taccgcagct ggttttttat tagggttaac aaataaatta catattggtt 50 <210> 31 <211> 50

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 31 cattaaatca agtaattacc acccatcacc ctgtacgtgt agcagaagaa 50

<210> 32 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 32 gccagtttat tagatcaaat gtcagaggga cgcttcattc ttggttttag 50 104

<210> 33 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 33 tgactgcgaa agtgatttcg aaatggaatt ttttagacgt catatctcat 50

<210> 34 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 34 caaggcaaca acaatttgaa gcatgctatg aaataattaa tgacgcatta 50

<210> 35 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 105 <400> 35 actacaggtt attgtcatcc ccaaaacgac ttttatgatt ttccaaaggt 50

<210> 36 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 36 ttcaattaat ccacactgtt acagtgagaa tggacctaag caatatgtat 50

<210> 37 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido

Sintético <400> 37 ccgctacatc aaaagaagtc gtcatgtggg cagcgaaaaa ggcactgcct 50

<210> 38 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 106 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 38 ttaacattta agtgggagga taatttagaa accaaagaac gctatgcaat 50

<210> 39 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 39 tctatataat aaaacagcac aacaatatgg tattgatatt tcggatgttg 50

<210> 40 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 40 atcatcaatt aactgtaatt gcgaacttaa atgctgatag aagtacggct 50 107

<210> 41 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 41 caagaagaag tgagagaata cttaaaagac tatatcactg aaacttaccc 50

<210> 42 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 42 tcaaatggac agagatgaaa aaattaactg cattattgaa gagaatgcag 50

<210> 43 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 108 <4Ο0> 43 ttgggtctca tgatgactat tatgaatcga caaaattagc agtggaaaaa 50

<210> 44 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 44 acagggtcta aaaatatttt attatccttt gaatcaatgt ccgatattaa 50

<210> 45 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 45 agatgtaaaa gatattattg atatgttgaa ccaaaaaatc gaaatgaatt 50

<210> 46 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 109 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 46 taccataata aaattaaagg caatttctat attagattgc ctttttgggg 50

<210> 47 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 47 atcctctaga aatattttat ctgattaata agatgagaat tcactggccg 50

<210> 48 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 48 tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 50 110

<210> 49 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 49 cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 50

<210> 50 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 50 ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 50

<210> 51 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 111 <400> 51 gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 50

<210> 52 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 52 atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca 50

<210> 53 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 53 gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 50

<210> 54 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 112 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 54 tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 50

<210> 55 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido

Sintético <400> 55 tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct 50

<210> 56 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 56 cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 50 113

<210> 57 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 57 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 50

<210> 58 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 58 ttatttttct aaaaagcttc acgctgccgc aagcactcag ggcgcaaggg 50

<210> 59 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 114 <400> 59 ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct 50

<210> 60 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 60 gaccccggat gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca 50

<210> 61 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 61 agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct 50

<210> 62 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 115 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 62 agactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg 50

<210> 63 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 63 cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc 50

<210> 64 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 64 ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac 50 116

<210> 65 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oliqonucleótido Sintético <400> 65 aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt 50

<210> 66 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético < 4 0 0 > 66 ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag 50

<210> 67 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 117 <400> 67 acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg 50

<210> 68 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 68 cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc 50

<210> 69 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 69 aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 50

<210> 70 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 118 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 70 gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg 50

<210> 71 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 71 gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg 50

<210> 72 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 72 agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 50 119

<210> 73 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 73 ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 50

<210> 74 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 74 acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag 50

<210> 75 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 120 <4Ο0> 75 agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 50

<210> 76 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 76 atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 50

<210> 77 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 77 gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc 50

<210> 78 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 121 <2 2 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 78 ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 50

<210> 79 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 79 attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta 50

<210> 80 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 80 cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg 50 <210> 81 <211> 50 122

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 81 acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga 50

<210> 82 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 82 cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa 50

<210> 83 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 123 <400> 83 aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca 50

<210> 84 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 84 gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccggg catgaccaaa 50 <210> 85 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Sintético <400> 85 atcccttaac gtgagttttc gttccai <210> 86 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 124 <2 2 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 86 gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 50

<210> 87 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 87 tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 50

<210> 88 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 88 gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat 50 125

<210> 89 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 89 accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 50

<210> 90 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 90 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 50

<210> 91 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 126 <4Ο0> 91 gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 50

<210> 92 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido

Sintético <400> 92 atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 50

<210> 93 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 93 cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 50

<210> 94 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 127 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 94 cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag 50

<210> 95 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 95 gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 50

<210> 96 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 96 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 50 128 <210> 97

<211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 97 tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 50

<210> 98 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 98 catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 50

<210> 99 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 129 <4Ο0> 99 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 50

<210> 100 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 100 ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 50

<210> 101 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 101

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 50 <210> 102 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 130 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido

Sintético <400> 102 ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 50

<210> 103 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 103 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 50

<210> 104 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 104 cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 50 131 <210> 105

<211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 105 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 50

<210> 106 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 106 gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 50

<210> 107 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 132 <400> 107 accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 50

<210> 108 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 108 tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 50

<210> 109 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 109 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 50

<210> 110 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 133 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 110 tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgcccg gggtgggcga 50

<210> 111 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 111 agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccggcgtcc 50

<210> 112 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 112 cggaaaacga ttccgaagcc caacctttca tagaaggcgg cggtggaatc 50 134 <210> 113

<211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 113 gaaatctcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc atttcgaacc 50

<210> 114 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 114 ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc 50

<210> 115 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 135 <400> 115 gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc 50

<210> 116 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 116 cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc 50

<210> 117 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 117 ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 50

<210> 118 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 136 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 118 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 50

<210> 119 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 119 acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag 50

<210> 120 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 120 ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga 50 137

<210> 121 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 121 caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct 50

<210> 122 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 122 tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat 50

<210> 123 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido 138

Sintético <40 0> 124 tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 50

<210> 120 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 124

ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 50 <210> 125 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 125

tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag 50 <210> 126 <211> 50 <212> ADN 139 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 126 ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca 50

<210> 127 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 127 ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac 50

<210> 128 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 140 <4 Ο 0> 128 acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa 50 <210> 129 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição Sintético de Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 129 tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 50 <210> 130 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição Sintético de Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 130 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc 50

<210> 131 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 141 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 131 ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca 50

<210> 132 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 132 gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc 50

<210> 133 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 133 ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct atcgccatgt aagcccactg 50 142 <210> 134

<211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 134 caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg tccagatagc 50

<210> 135 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 135 ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt 50

<210> 136 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 143 <4 Ο 0> 136 tctacgtgtt ccgcttcctt tagcagccct tgcgccctga gtgcttgcgg 50

<210> 137 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 137 cagcgtgaag ctttttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 50

<210> 138 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 138 tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 50

<210> 139 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 144 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 139 taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc 50

<210> 140 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 140 ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 50

<210> 141 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 141 agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 50 145

<210> 142 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 142 cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag 50

<210> 143 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 143

cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 50 <210> 144 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido 146

Sintético <400> 144 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca 50

<210> 145 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 145 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 50

<210> 146 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 146

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt 50 <210> 147 <211> 50 <212> ADN 147 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 147 ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc tcatcttatt 50

<210> 148 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido

Sintético <400> 148 aatcagataa aatatttcta gaggatcccc aaaaaggcaa tctaatatag 50

<210> 149 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 149 aaattgcctt taattttatt atggtaaatt catttcgatt ttttggttca 50 148

<210> 150 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 150 acatatcaat aatatctttt acatctttaa tatcggacat tgattcaaag 50

<210> 151 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 151 gataataaaa tatttttaga ccctgttttt tccactgcta attttgtcga 50

<210> 152 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido 149

Sintético <40 0> 152 ttcataatag tcatcatgag acccaactgc attctcttca ataatgcagt 50

<210> 153 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 153 taattttttc atctctgtcc atttgagggt aagtttcagt gatatagtct 50

<210> 154 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 154

tttaagtatt ctctcacttc ttcttgagcc gtacttctat cagcatttaa 50 <210> 155 <211> 50 <212> ADN 150 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 155 gttcgcaatt acagttaatt gatgatcaac atccgaaata tcaataccat 50

<210> 156 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 156 attgttgtgc tgttttatta tatagaattg catagcgttc tttggtttct 50

<210> 157 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 157 aaattatcct cccacttaaa tgttaaaggc agtgcctttt tcgctgccca 50 151

<210> 158 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 158 catgacgact tcttttgatg tagcggatac atattgctta ggtccattct 50

<210> 159 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 159

cactgtaaca gtgtggatta attgaaacct ttggaaaatc ataaaagtcg 50 <210> 160 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 152 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 160 ttttggggat gacaataacc tgtagttaat gcgtcattaa ttatttcata 50

<210> 161 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 161

gcatgcttca aattgttgtt gccttgatga gatatgacgt ctaaaaaatt 50 <210> 162 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 162 ccatttcgaa atcactttcg cagtcactaa aaccaagaat gaagcgtccc 50 <210> 163 <211> 50 153

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 163 tctgacattt gatctaataa actggcttct tctgctacac gtacagggtg 50

<210> 164 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 164 atgggtggta attacttgat ttaatgaacc aatatgtaat ttatttgtta 50

<210> 165 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 154 <4 Ο 0> 165 accctaataa aaaaccagct gcggtaatag gtgctccaac aataccattt 50

<210> 166 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 166 tttgaaaagt gatgttcatt aacaaaggca gtattaaaat gatatttagt 50

<210> 167 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 167 tgaatcaatt aacgtgacag tctttaccat attatccaac gtttcttcag 50

<210> 168 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 155 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 168 atgttattcc atctttctga aagtttagaa aaaataatcc aaatttcata 50

<210> 169 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 169 acttgttcct tattatctct agtatcaaat aagtaattta tttaggttct 50

<210> 170 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 170 tttaagaaag gagcgacttg tgtcataaag cgtcgcatgg aagcaattat 50 156 <210> 171

<211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 171 ttcatcttca gttccattag cttcaaatcc gcatgtaatg tttgtaatac 50

<210> 172 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 172 ccgttgcatc aatatcacgt tgaatgattt caatacactg ctcaggagtg 50

<210> 173 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 157 <400> 173 cctacagggt taataccatt gctataatca acacgtcgat tggtgtttgt 50

<210> 174 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 174 atgtccttgt aaaacaaaat cacgccattg acctttatga taatcataac 50

<210> 175 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 175

cacgagtttg attgctatca ttaaagatat tggtcgcatt tacatatgag 50 <210> 176 <211> 50 <212> ADN 158 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 176 tcataccaat ttttcagaaa ctcccgacaa acatcttgcg ccttttgtgc 50

<210> 177 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 177 atcatcatca acagaacaaa tataagtcat acaatgatct attttagata 50

<210> 178 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 159 <4Ο Ο> 178 tatcatgacc atattctgtc gcaatttcat tatagagttc catctgtgct 50

<210> 179 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 179

tttttttcat tagtaccaat aatccaacta agaaccattg gtagcccttg 50 <210> 180 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 180

tattgctagc cattctgtcg tacttgcgga ctcagcagtc atacaggttg 50 <210> 181 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 160 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 181 gtacattttt tgagtacact ttgggatata catcaacctt aggaaattga 50

<210> 182 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido

Sintético <400> 182 atgtaatcac tatcagagct aatggttcct gtctgtaagc tttccattat 50

<210> 183 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 183 catctggtag aaattttgag taattgctcg agactcttcc atatcaacac 50 161 <210> 184

<211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 184 caaatactcg aaaatcttta tggtatagcc ctcgaacggt tccaaaatta 50

<210> 185 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 185 aaacgacctt tcgacatttg atctaataat aaaacgtctt ctaactgtcg 50

<210> 186 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético 162 <4Ο Ο> 186 aactgggtgt gctgtcggaa taacaacccc catagtgcca acatttaatg 50

<210> 187 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 187 ttttagttct tcctaacagg ttagccgcag caacaaataa atttcccgta 50

<210> 188 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 188 agaccaaact ctgtaaaatg atgttctaag gtccaatatg tatcaaaccc 50

<210> 189 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial 163 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 189 tactcttctg aggcgatacc aagccgaaca aagcgatcca ttacttagct 50

<210> 190 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 190 tatgagtttc acctggtggt tgatacgaaa aacaaatatt tccaaacttc 50

<210> 191 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 191 atactctatt cctttttggt gattctgttt atttaagcca attctaataa 50 164 <210> 192

<211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 192 ttcattttca atttcatttt ttaatctacg ctccttaaca gtaatacttg 50

<210> 193 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Oligonucleótido Sintético <400> 193 taacgtcctc aaatcgaggt aagcttcata ggctccgccc ccctgacgag 50

Lisboa, 1 de Abril de 2010 165

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a síntese de um polinucleótido de cadeia dupla sem a utilização de qualquer ADN recombinante ou de ocorrência natural existente, compreendendo os passos de a) produção de um primeiro conjunto de oliqonucleótidos correspondendo à totalidade da cadeia mais do referido polinucleótido de cadeia dupla; b) produção de um segundo conjunto de oligonucleótidos correspondendo à totalidade da cadeia menos do referido polinucleótido de cadeia dupla; e c) emparelhamento dos referidos primeiro e segundo conjuntos de oligonucleótidos; em que o passo (c) compreende os passos de i. emparelhamento do oligonucleótido 5' terminal do referido primeiro conjunto de oligonucleótidos com o oligonucleótido 3' terminal do referido segundo conjunto de oligonucleótidos, ii. emparelhamento do oligonucleótido mais 5' terminal seguinte do referido primeiro conjunto de oligonucleótidos com o produto do passo (i), iii. emparelhamento do oligonucleótido mais 3' terminal seguinte do referido segundo conjunto de oligonucleótidos com o produto do passo (ii), 1 iv. repetição do processo até que todos os oligonucleótidos dos referidos primeiro e segundo conjuntos de oligonucleótidos tenham sido emparelhados, em que cada dos referidos oligonucleótidos do referido segundo conjunto de oligonucleótidos se sobrepõe e híbrida com dois oligonucleótidos complementares do referido primeiro conjunto de oligonucleótidos, excepto que dois oligonucleótidos numa extremidade 5' ou 3' do referido polinucleótido de cadeia dupla irão hibridar com apenas um oligonucleótido complementar.
2. Método de síntese de um polinucleótido de cadeia dupla, compreendendo: (a) emparelhamento de um oligonucleótido 5' terminal com um oligonucleótido 3' terminal de um polinucleótido de cadeia dupla, de modo a produzir um primeiro produto emparelhado e adicionando, directamente, um oligonucleótido mais terminal seguinte do referido polinucleótido de cadeia dupla ao referido primeiro produto emparelhado, sob condições suficientes para emparelhamento, de modo a produzir um segundo produto emparelhado, o referido oligonucleótido mais terminal seguinte tendo um comprimento de, pelo menos, cerca de 25 bases e (b) repetição do passo (a) uma ou mais vezes, de modo a produzir, sequencialmente, um polinucleótido de cadeia dupla.
3. Método das reivindicações 1 ou 2 compreendendo, adicionalmente, os passos de tratamento dos referidos oligonucleótidos emparelhados com uma enzima de ligação, de 2 modo a produzir cadeias continuas do referido polinucleótido de cadeia dupla. Método da reivindicação 3, em que a enzima de ligação é a topoisomerase. Método da reivindicação 3, em que a enzima de ligaçao é a T4 ADN ligase. Método das reivindicações 1 ou 2 compreendendo, adicionalmente o passo de amplificação do referido polinucleótido de cadeia dupla. Método das reivindicações 1 ou 2, em que o referido polinucleótido de cadeia dupla compreende 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10xl03, 20xl03, 30xl03, 40xl03, 50xl03, 60xl03, 70xl03, 80xl03, 90xl03, lxlO5, lxlO6, lxlO7 ou lxlO8 pares de bases em comprimento. Método das reivindicações 1 ou 2, em que o referido polinucleótido de cadeia dupla compreende uma ou mais regiões codificantes e um ou mais elementos reguladores. Método das reivindicações 1 ou 2, em que o referido polinucleótido de cadeia dupla é um ADN. Método das reivindicações 1 ou 2, em que o referido polinucleótido de cadeia dupla é um ARN. em que o referido uma construção de Método das reivindicações 1 ou 2, polinucleótido de cadeia dupla é expressão.
12. Método da reivindicação 11, em que a referida construção de expressão é uma construção de expressão bacteriana.
13. Método da reivindicação 11, em que a referida construção de expressão é uma construção de expressão de mamífero.
14. Método da reivindicação 11, em que a referida construção de expressão é uma construção de expressão virai.
15. Método das reivindicações 1 ou 2, em que a referida sobreposição entre os oligonucleótidos do referido primeiro e referido segundo conjuntos de oligonucleótidos é entre 5 pares de bases e 75 pares de bases. Método i das reivindicações 1 ou 2, em que a referida sobreposição é 10 pares de bases, 15 pares de bases, 20 pares de bases, 25 pares de bases, 30 pares de bases, 35 pares de bases, 40 pares de bases, 45 pares de bases, 50 pares de bases, 55 pares de bases, 60 pares de bases, 65 pares de bases ou 70 pares de bases. Lisboa, 1 de Abril de 2010 4 Passo 1 Passo 2 Passo 3 Passo 4 1/21 INFORMAÇÃO DE SEQUÊNCIA DE ADN Determinar/conceber a sequência de ADN do genoma I Sintetizar e construir o ADN genómico I Introduzir o ADN numa célula hospedeira pluripotente enucleada 1 Introduzir a célula hospedeira num animal adoptivo mãe ORGANISMO SINTÉTICO FIG. 1 2/21 1. Concepção de genoma, contendo origem procariótica de replicação e vector de selecção de fármaco. 1 2. SynGen 2.0, decompõe o genoma em oligonucleótidos de sobreposição componentes, programa o sintetizador oligonucleotídico. i 3. Sintese química de oligonucleótido componente utilizando o sintetizador de alto rendimento MERMADE. 1 4. Construção combinatória de oligonucleótidos componentes utilizando processamento robótico. 1 5. Transformação em bactérias componentes. FIG.2