CZ298498A3 - Purifikace plazmidové DNA farmaceutické kvality - Google Patents

Description

Purifikace plazmidové DNA farmaceutické kvality

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nové metody pro purifikaci DNA. Metoda podle vynálezu umožňuje rychle purifikovat farmaceuticky použitelnou dvouvláknovou DNA. Metoda purifikace podle vynálezu zahrnuje pouze diafiltraci a chromatografie.

Dosavadní stav techniky

Techniky genové terapie a buněčné terapie zaznamenávájí výjimečný vývoj. Nicméně tyto techniky zahrnují možnost velké důležité množství farmaceuticky čisté DNA, zejména plazmidové DNA. V nových terapiích medikament je často tvořený samotnou DNA, kterou je možné připravit v přijatelném množství, izolovat ji a vhodným způsobem purifikovat k terapeutickému použití u lidí, zejména pro použití intravenózním způsobem.

Problémy týkající se množství a purifikace nejsou zahrnuty v klasických metodách izolace DNA. Metody použité v laboratoři nejsou přenosné do farmaceutického průmyslu pro purifikaci plazmidové DNA. Dvě z těchto metod, které jsou nejvíce používané jsou to metody, které poskytují nej lepší výsledky. Vycházejí ze surového bakteriálního lyzátu obohaceného plazmidovou DNA při současném vyloučení kontaminantů. Pro rozbytí bakteriální stěny se používá zejména lyzozym vaječného bílku, potom se lyzát odstředí, aby se vyloučily buněčné zbytky. Supernatant je potom podroben působení pankreatické Rnasy zvířecího původu, která umožňuje vyloučit RNA, která představuje v této etapě okolo 75% přítomných nukleových kyselin.

Proteiny jsou vysráženy směsí • · • · 4 4 4 4 · · · ·

4 · 4 · · · 4444 44 44 44 44 fenol/chloroform/isoamylalkohol. Získaný supernatant po odstřeďování je zbaven proteinů a RNA, ale obsahuje ještě velké množství chromozomální DNA, která musí být vyloučena až v následující etapě. Tato etapa spočívá v ultracentrifugaci v přítomnosti ethidiumbromidu a cloridu cesnatého. Tři typy nukleových kyselin: chromozomální DNA, plazmidová DNA a RNA mají větší nebo menší schopnost fixovat ethidiumbromid. Rozdělují se ve třech fázích ultracentrifugace v gradientu chloridu cesnatého.

Varianta tohoto protokolu spočívá v následujícím působení pankreatické Rnasy redukcí v přítomnosti alkalického detergentu, následovanou extrakcí směsí fenol/chloroform. DNA je tedy srážena ethanolem, rozpuštěna a znovu srážena polyethylenglykolem.

Tyto dvě metody, které umožňují získat roztok plazmidové DNA jsou běžně používané pro průmyslovou výrobu farmaceuticky čistého produktu. Použití enzymů zvířecího, původu způsobuje problém. Lyzozym a pankreatická Rnasa, vzhledem ke svému původu, riskují zavlečení virové kontaminace do konečného produktu. Navíc organická rozpouštědla jsou velmi toxická a musí být vyloučena jestliže se jedná o výrobek, který se má použít jako lék. Tato rozpouštědla vedou ke značnému zvýšení ceny výrobku spojenou zejména s jejich skladováním, s jejich používáním za maximálně bezpečných podmínek a s odstraněním toxických odpadů, které se vytvářejí a z důvodu obtížnosti úplného úspěšného odstranění těchto produktů v konečném roztoku. Co se týče ethidiumbromidu, je jako takový toxický, mutagenní a teratogenní a ani stopové množství nemůže být tolerováno v produktu, který je určen pro léčení. Použití rozpouštědel, toxických reaktantů, stejně jako enzymů zvířecího původu je nekompatibilní s průmyslovou metodou odpovídající dobrým postupům výroby.

Podstata vynálezu

Předložený vynález popisuje novou jednoduchou a účinnou metodu pro purifikaci DNA. Metoda popsaná v předloženém vynálezu umožňuje produkci velkého množství velmi čisté DNA. Metoda popsaná v předloženém vynálezu výhodně umožňuje vyloučit použití toxických organických rozpouštědel a použití enzymů zvířecího původu. Umožňuje také omezit počet odstřeďování a omezit slabý výtěžek zejména z důvodu etap srážení PEG, octanem amonným nebo CaCl₂. Metoda podle vynálezu umožňuje získat velké množství DNA (100 mg, lg, 10 g nebo více) bez technických obtíží. Metoda podle vynálezu pracuje s metodami kompatibilními s dobrými výrobními postupy a umožňuje získat DNA farmaceutické kvality.

První předmět vynálezu se týká postupu pro purifikaci dvouvláknové DNA, který umožňuje získat velmi rychle velké množství plazmidové DNA s farmaceutickou čistotou a zahrnuje etapu chromatografie na hydroxyapatické koloně v keramické formě. Hydroxyapatit ve formě krystalické byl již dříve známý, ale pro svoji křehkost bylo jeho použití obtížné a omezené. Keramická forma je více odolná fyzikálně i chemicky.

Upřednostňovaný způsob postupu podle vynálezu obsahuje dvě chromatografické etapy, alespoň jednu chromatografii na hydroxyapatitu.

Druhá chromatografie je výhodně chromatografie afinitní nebo iontoměničová. Tyto dvě chromatografie mohou být provedeny v jakémkoliv pořadí.

Podle způsobu provedení, zejména upřednostňovaném, postup podle vynálezu zahrnuje etapu chromatografie na koloně hydroxyapatitové a etapu afinitní chromatografie Triple-Helix. Afinitní chromatografie Triple-Helix je založena na použití nosiče, na kterém je vázán kovalentním způsobem oligonukleotid schopný tvořit hybridací triple helix • · • · • φ φ ·

se specifickou sekvencí přítomnou na uvedené DNA. Tyto dvě chromatografie mohou být provedeny v jakémkoliv pořadí.

Podle jiného způsobu provedení postup podle vynálezu zahrnuje etapu chromatografie na hydroxyapatické koloně a etapu iontoměničové chromatografie.

Postup podle vynálezu výhodně obsahuje mimo jiné etapu diafiltrace. Ta je všeobecně provedena před chromatografiemi.

Hlavní etapa postupu podle vynálezu spočívá v chromatografii na hydroxyapatické koloně.

Hydroxyapatie je komplex fosforečnanu vápenatého obsahujícího deset atomů vápníku. Keramická forma, která je stabilnější než krystalická forma, byla poskytnuta Bio-Rad Laboratories a Asahi Optical Co., Ltd. Keramická sloučenina má stejné vlastnosti jako krystalická sloučenina, ale bez fyzikálních omezení; tento materiál se spíše používá pro chromatografie pro purifikaci proteinů, oproti keramické formě má výhody a umožňuje získat velmi dobré výsledky, co se týče purifikace nukleových kyselin. Je to materiál makropórovity, sférický, chemicky a fyzikálně velmi stabilní a může být opakovaně použit pro více použití bez ztráty účinnosti. Tato keramická forma může snášet zvýšené tlaky, velmi vysoké pH, velmi rychlý průtok a organická rozpouštědla.

Chromatografie na koloně keramického hydroxyapatitu je typ chromatografie částicové, která není ze striktního hlediska ani chromatografií afinitní ani chromatografií iontoměničovou. Má vlastnosti těchto dvou typů chromatografií a může se tedy definovat jako pseudoaf initní nebo pseudoiontoměničová chromatografie.

Nukleové kyseliny se váží na hydroxyapatit na základě interakcí mezi skupinami fosfátového skeletu a vápenatými zbytky nosiče. Nukleové kyseliny mohou být eluovány různými • · t · • · způsoby za použití různé iontové síly fosfátových pufrů. Nukleové kyseliny mohou být tedy separovány od proteinů, DNA může být separována od RNA a jednovláknová DNA může být separovány od dvouvláknové DNA. RNA se váží méně pevně a mohou být eluovány pufrem relativně slabé iontové síly. Jednovláknové DNA jsou slaběji fixované než dvouvláknové DNA, které jsou pevněji vázané k nosiči a nepotřebují silnější puf r.

Biologický materiál ve fosfátovém pufru slabší ionické síly se vloží na kolonu. Nukleové kyseliny DNA a RNA se fixují. Potom je použit druhý pufr zvýšené iontové síly pro eluci RNA, která je téměř úplně vyloučen v tomto stádiu. Třetí pufr vysoké iontové síly je použit pro eluci dvouvláknové DNA, která je požadována. Použití hydroxyapatitu v metodě podle vynálezu umožňuje získat dvouvláknovou DNA, která má vysoký stupeň čistoty.

Jak je již naznačeno, způsob provedení vynálezu obsahuje mimo jiné etapu afinitní chromatografie triple-helix.

Afinitní chromatografie triple-helix spočívá v průchodu roztoku získaného na nosiči, na kterém je vázán kovalentně oligonukleotid schopný tvořit hybridací triple-helix se specifickou sekvencí přítomnou na DNA, která je určena k purifikaci (WO96/18744).

Specifická sekvence může být sekvencí přirozeně přítomnou na dvouvláknové DNA nebo sekvencí syntetickou uměle vloženou do této kyseliny. Oligonukleotidy použité v předloženém vynálezu jsou oligonukleotidy hybridující přímo s dvouvláknovou DNA. Tyto oligonukleotidy mohou obsahovat následující base:

-thymidin (T), který je schopný tvořit triplet s dubletem A.T dvouvláknové DNA (Rajagopal et al., Biochem 28 • » ♦ · • · • · ···· ···· ·············· • · ·· · · · · •«· · ·· · · ·· ·· (1989) 7859),

-adenin (A), který je schopný tvořit triplet s dubletem A.T dvouvláknové DNA

-guanin (G), který je schopný tvořit triplet s dubletem G.C dvouvláknové DNA

-protonovaný cytosin (C+), který je schopný tvořit triplet s dubletem G.C dvouvláknové DNA (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859)

-uráčil (U), který je schopný tvořit triplet s páry basí A.U nebo A.T.

Použité oligonukleotidy obsahují zejména sekvence homopyrimidinové, bohaté na cytosiny a specifickou sekvenci přítomnou na DNA, která je sekvencí homopurono-homopyrimidinovou. Přítomnost cytosinů umožňuje, že triple-helix je stabilní při kyselém pH, kde jsou cytosiny protonované a destabilizovaný v alkalickém pH, kde cytosiny jsou neutrální.

Pro umožnění tvorby triple-helix hybridací je důležité, aby oligonukleotid a specifická sekvence přítomná na dvouvláknové DNA byly komplementární. V tomto ohledu pro získání nejlepších výtěžků nejlepší selektivity se používá postup podle vynálezu, ve kterém oligonukleotid a specifická sekvence jsou úplně komplementární. Může se zejména jednat o oligonukleotid poly-CTT a specifickou sekvenci poly-GAA. Například se může uvést oligonukleotid sekvence 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(GAGG(CTT),, (SEQ ID n°l), ve které base GAGG netvoří triple-helix, ale umožňuje oddálit rameno oligonukleotidu k vázání. Může se uvést sekvence (CTT)₇ (SEQ ID n°2). Tyto oligonukleotidy jsou schopné tvořit triple-helix se specifickou sekvencí obsahující komplementární motivy (GAA). Může se jednat zejména o oblast obsahující 7, 14 nebo 17 motivů GAA, jak je popsáno v • φ · · · · φ φ • · · φ φ φ φ φ φ φ φ • φ · · ♦ · φ φ · φ • φ φ · φ φ φφ φ ·φ· · φ ·· φφ φ φ · φ φ φ φ φ · φ ·· φφ · φ příkladech.

Jinou specifickou sekvencí zájmu je sekvence:

5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3'(SEQ ID n⁰ 3)

Tato sekvence tvoří triple-helix s oligonukleotidem

5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ ID n°4) nebo

5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'(SEQ ID n°5).

V tom případě se oligonukleotid fixuje v antiparalelním směru polypurinového vlákna. Tyto triple-helixy jsou stabilní jen v přítomnosti Mg²⁺ (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-721, Beal et Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).

Jak je již naznačeno, specifická sekvence může být sekvence přirozeně přítomná na dvouvláknové DNA nebo sekvence syntetická uměle vložená do této kyseliny. Je zejména zajímavé použít oligonukleotid schopný tvořit triple-helix se sekvencí přirozeně přítomnou na dvouvláknové DNA, například na počátku replikace plazmidu nebo na značeném genu. V tomto ohledu předkladatel provedl analýzu plazmidové sekvence a ukázal, že určité oblasti této DNA, zejména v počátku replikace, mají oblasti homopurino-homopyrimidinové. Syntéza oligonukleotidů schopných tvořit triple-helix s těmito přirozenými homopurino-homopyrimidinovými oblastmi umožňuje výhodně aplikovat postup podle vynálezu na nemodifikované plazmidy, zejména plazmidy komerčního typu pUC, pBR322, pSV atd. Mezi homopurino-homopyrimidinovými sekvencemi přirozeně přítomnými na dvouvláknové DNA se mohou uvést sekvence obsahující celek nebo část sekvence

5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3'(SEQ ID n°6) přítomné na počátku replikace ColEl E. coli. V tom případě oligonukleotid tvořící triple-helix má sekvenci: 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3'(SEQ ID n°7) a fixuje se alternativně na dvě vlákna dvouhelixu, jak je popsáno (Bael et Dervan J. Am. Chem. Soc. 1992, 114,

4976-4982, Jayasena et Johnston, Nucleic Acids Res. 1992, 20,

4444

44 44 44

4 4444 4444

4 4444 4 4··

4 4 4 4 444 4 444 4 4

44 4 444

4444 44 44 44 44

5279-5288). Může se také uvést sekvence

5'-GAAAAAGGAAGAG-3'(SEQ ID n°8) genu β-laktamasy plazmidu pBR322 (Duval-Valentin et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA, 1992, 89, 504-508). Použití oligonukleotidu schopného tvořit triple-helix se sekvencí přítomnou na počátku replikace nebo na značeném genu je zejména výhodné, protože umožňuje se stejným oligonukleotidem purifikovat každou DNA obsahující výše uvedený počátek replikace nebo výše uvedený značený gen. Není tedy nutné modifikovat plazmid nebo dvouvláknovou DNA, aby byla zahrnuta do umělé specifické sekvence.

Ačkoliv sekvence úplně komplementární budou upřednostněny může být tolerováno určité nespárování mezi sekvencí oligonukleotidu a sekvencí přítomnou na DNA, což nevede k velké ztrátě afinity. Může se uvést sekvence 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3'(SEQ ID n°9) přítomná v genu β-laktamasy E. coli. V toto případě thymidin, který přerušuje sekvenci polypurinovou může být rozpoznán guaninem třetího vlákna tvořícího tak triplet ATG, který je stabilní, když je doprovázený dvěma triplety TAT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).

Podle způsobu provedení oligonukleotidy podle vynálezu obsahují sekvenci (CCT)n, sekvenci (CT)n nebo sekvenci (CTT)n, ve kterých n odpovídá hodnotám mezi 1 až 15. Je také výhodné použít sekvence typu (CT)n nebo (CTT)n. Předkladatel vskutku ukázal, že na výtěžek purifikace mělo vliv množství C v oligonukleotidu. Jak je naznačeno v příkladu 7, výtěžek purifikace se zvyšuje, když oligonukleotid obsahuje méně cytosinů. Oligonukleotidy podle vynálezu mohou také kombinovat motivy (CCT), (CT) nebo (CTT).

Použitý oligonukleotid může být přírodní (sloučeniny na přirozeném základě, nemodifikované) nebo chemicky modifikovaný. Oligonukleotid může výhodně obsahovat určité chemické modifikace umožňující zvýšit jeho rezistenci nebo jeho ochranu vůči nukleázám nebo zvýšit svou afinitu vůči • · * · • · ·· • · « «

I « · · ·· · · 4 • · 4 • · · · specifické sekvenci.

Podle předloženého vynálezu se také rozumí oligonukleotidem každé spojení nukleotidů, které podlehly modifikaci skeletu za cílem získat větší rezistenci k nukleázám. Mezi možnými modifikovanými oligonukleotidy se mohou uvést oligonukleotidy fosfothioátové, které jsou schopné tvořit triplet-helixy s DNA (Xodo et al., Nucleic Acids Res. 1994, 22, 3322-3330), stejně jako oligonukleotidy, které mají skelet formacetálový nebo methylfosfonátový (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768). Mohou se také použít oligonukleotidy syntetizované z α-anomérů nukleotidů, které tvoří také triplet-helix s DNA (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Jiná modifikace skeletu je fosforamidová vazba. Může se například uvést internukleotidová vazba N3'-P5' fosforamidu popsaná v publikaci (Gryaznov et Chen, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3143-3144), která poskytuje oligonukleotidy tvořící s DNA triplet-helix velmi stabilní. Mezi jinými modifikacemi skeletu se může také uvést použití ribonukleotidů, 2'-O-methylribosy,fosfodiesteru atd. (Sun et Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Fosfátový skelet může být nahrazen skeletem polyamidovým jako v PNA (Peptide Nucleic Acid), které mohou také tvořit triple-helixy (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500, Kim et al., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 6477-6481) nebo skeletem na základě guanidinu, jako v DNG (deoxyribonukleic guanidin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), které jsou polykationické analogy DNA, které také tvoří triple-helix.

Thymidin třetího vlákna může být také nahrazen

5-bromuracilem, čímž se zvýší afinita oligonukleotidu pro DNA (Povsic et Derva, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). Třetí vlákno může také obsahovat nepřirozené base, mezi kterými se může uvést 7-deasa-2'-deoxyxanthosin (Meligan et • · ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · ···· • · · · · · · ·· • · · ··· · ···· · • · ♦ · · · ·· ·· ·· ·« al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333),

1-(2-deoxy-p-D-ribofuranosyl)-3-methyl-5-amino-lH-pyrazolo [4,

3-d]pyrimidin-7-on (Koh et Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oxoadenin, 2-aminopurin,

2'-O-methylpseudoisocytidin nebo každá modifikace odborníky známá (viz Sun et Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356).

Jiný typ modifikace oligonukletidů je určený pro zvýšení interakce nebo/a pro zvýšení afinity mezi oligonukleotidem a specifickou sekvencí. Modifikace podle vynálezu spočívá výhodně v methylaci cytosinů oligonukleotidu. Takto methylovaný oligonukleotid má schopnost tvořit stabilní triple-helix se specifickou sekvencí v oblastech pH blízkých neutrálním hodnotám (>5) . Tyto oligonukleotidy umožňují tedy pracovat při zvýšeném pH než oligonukleotidy vedlejších oborů, totiž při pH, kde nebezpečí degradace plazmidové DNA je druhořadé.

Délka použitého oligonukleotidu v předloženém vynálezu je alespoň 3 base výhodněji obsahuje mezi 5 a 30 basemi. Výhodně se používá oligonukleotid délky o 10 basích. Délka může být odborníkem přizpůsobena, případ od případu, funkci selektivity a stability hledané interakce.

Oligonukleotidy podle vynálezu mohou být syntetizovány všemi známými technikami. Zejména mohou být připraveny prostřednictvím syntetizátoru nukleových kyselin. Může být také použita každá jiná odborníky známá metoda.

Aby se umožnila kovalentní vazba na náplň, je oligonukleotid všeobecně funkcionalizován. Může být modifikován skupinami thiolovými, aminovými nebo karboxylovými v poloze 5' nebo 3'. Přidání skupiny thiolové, aminové nebo karboxylové umožňuje například vazbu oligonukleotidu na nosič nesoucí funkce disulfidové, maleimidové, aminové, karboxylové, esterové, epoxydové,

• · · · • · · ·♦ • · · <· · ··· • · • · • · • ·

bromkyanové nebo aldehydové. Tyto vazby se tvoří vystavěním disulfidových, thioetherových, esterových, amidových nebo amonových vazeb mezi oligonukleotidem a náplní. Může být použita také každá jiná odborníky známá metoda, taková která bifunkčně váže reaktanty.

Pro zvýšení hybridace s vázaným oligonukleotidem může být výhodné, aby oligonukleotid obsahoval rameno a sekvence basí mezerník. Použití ramene umožňuje, fixovat oligonukleotid ve vybrané vzdálenosti náplně, která umožňuje zlepšit podmínky interakce s DNA. Rameno je výhodně tvořeno lineárním uhlíkovým řetězcem, obsahujícím 1 až 18, a přednostně 6 nebo 12, skupin (CH₂) a jednu aminovou, která umožňuje vazbu ke koloně. Rameno je spojeno fosfátem oligonukleotidu nebo mezerníkem tvořeným basemi, které neintervenují s hybridací. Mezerník může obsahovat purinové base. Například může mezerník obsahovat sekvence GAGG. Rameno je výhodně tvořeno uhlíkovým lineárním řetězcem, který obsahuje 6 nebo 12 uhlíkových atomů.

Pro uvedení předloženého vynálezu byly použity různé typy nosiče. Může se zejména jednat o chromatograficky funkční volně ložený nosič nebo předem vložený na koloně s plasticky funkčním povrchem nebo funkčními latexovými kuličkami, magnetický nebo nemagnetický. Jedná se především o chromatografický nosič. Například chromatografické nosiče, které mohou být použity jsou agarosa, akrylamid nebo Dextran, stejně jako jejich deriváty (jako je Sephadex, Sepharosa, Superosa, ...), polymery jako póly(styrendivinylbenzen), nebo roubovací nebo neroubovací silice. Chomatografické kolony mohou být zfunkčněny difúzí nebo perfúzí.

Pro získání lepších výtěžků purifikace je zejména výhodné použít na plazmidu sekvenci obsahující více hybridačních pozic s oligonukleotidem. Přítomnost více hybridačních pozic upřednostňuje interakce mezi uvedenou sekvencí a oligonukleotidem, což vede ke zvýšení výtěžků

4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 · 4 4 4 44 • · · · · 444 4 4449 9 44 49 · 949

494 4 44 49 44 44 purifikace. Pro oligonukleotid obsahující n opakovaných modifikací (CCT), (CT) nebo (CTT) je přednostně použita sekvence DNA obsahující alespoň n komplementárních motivů a zejména, η + 1 komplementárních motivů. Sekvence, která nese η + 1 komplementárních motivů nabízí tak dvě hybridační polohy k oligonukleotidů. Sekvence výhodně obsahuje až 11 hybridačních poloh, totiž n + 10 komplementárních motivů.

Podle jiného způsobu provedení chromatografie na koloně keramického hydroxyapatitu je následována nebo předcházena chromatografií na iontoměničové koloně. Přednostně se používá slabá iontoměničová kolona, silné ionty mají fixační vlastnosti velmi silné k DNA, v tom případě, je velmi obtížné získat produkt (výtěžek je tak nižší než 60 %). To je důvod, proč předkladatel používá slabou iontoměničovou kolonu, která nezadržuje plazmidovou DNA, ale fixuje reziduální RNA.

Jak je již naznačeno, postup podle vynálezu obsahuje výhodně etapu diafiltrace. Diafiltrace je koncentrační etapou, ve které se vyloučí voda a malé molekuly (takové jako soli, proteiny, nukleové kyseliny malé velikosti), které jsou přítomny v čistém lyzátu. Soli jsou nahrazeny fosfátovým pufrem pro chromatografii. Po diafiltraci je roztok 5 až 50 krát koncentrován než na počátku diafiltrace (koncentrační faktor závisí na objemu počátečního roztoku).

Použití diafiltrace má více výhod. Umožňuje, mezi jiným, vyhnout se použití organických rozpouštědel, jako je isopropanol, jehož použití je nezbytné při instalaci antideflagrační. Tato technika je použitelná zejména pro velmi rozdílné objemy. Stačí zvýšit povrch membrán se zvýšením určeného objemu.

Pro diafiltraci se výhodně používá přístroj, který má náplň tvořenou modifikovanou polyethersulfonovou membránou nebo modifikovanou acetylcelulózovou membránou, které umožňují regulovaný počáteční průtok. Tyto membrány jsou fl· * · ·· ♦ · •· · · · · · · fl · · fl « ···· · · · · • fl ffl flflflflfl ·«·· · • fl ·· · ··· ··· · ·· ·· ·· ·· definovány póry, které jsou v nominální hodnotě maximální velikosti molekul, které mohou projít přes uvedenou membránu. Vzhledem ke skutečné velikosti membrána, jejíž póry jsou 100 kD, umožňuje zadržet molekuly velikosti vyšší než 30 kD.

Upřednostňovaný postup podle vynálezu obsahuje následující etapy:

diafiltrace chromatografie na koloně keramického hydroxyapatitu afinitní chromatografie specifickou hybridací mezi sekvencí DNA a oligonukleotidem s tvorbou triple-helix.

Postup podle předloženého vynálezu může být použit pro purifikaci každého typu dvouvláknové DNA. Jedná se například o kružnicovou DNA, takovou jako je plazmid, který je všeobecně nesen jedním nebo více geny terapeutického zájmu. Tento plazmid může nést také počátek replikace, značený gen atd. Tento postup umožňuje také purifikovat DNA, lineární nebo kružnicovou, která nese sekvenci zájmu ze směsi obsahující DNA různých sekvencí.

DNA je produktem hostitelského mikroorganizmu modifikovaného technikami rekombinující DNA. V tomto ohledu hostitel obsahující dvouvláknovou DNA, která je předmětem zájmu, je rozmnožen a amplifikován. K tomu se používají klasické fermentační techniky, které umožňují získat silnou buněčnou denzitu. Přednostně používaná technika je technika nazvaná fed-batch, která je podrobně popsána v literatuře (Jung et al., Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 1988, 139, pl29-146, Bauer et al., Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p81-94).

Fermentace je následována lýzou buněk. Pro lýzu buněk se používá buď mechanický systém nebo systém chemický následovaný buněčnou koncentrací podle toho, zda je třeba pracovat se surovým buněčným lyzátem nebo s čistým buněčným • · • ··· · » · · · « · ··

lyzátem. Pro mechanickou lýzu se přednostně používá systém, který nedenaturuje DNA (míchání, tepelný šok, osmotický šok). Tyto metody nejsou přizpůsobeny extrakci DNA z prokaryontních buněk. Mechanické působení použité pro rozbití prokaryontních buněk denaturuje DNA. Mechanická lýza je přednostně používaná pro eukaryontní buňky, pro prokaryontní buňky se přednostně používá chemická lýza.

Prokaryontní buňky jsou lyžovány všemi odborníky známými technikami (detergenty, lyzozymy, případně kombinované s tepelným šokem, . . .) . Přednostně se používá směs NaOH a SDS. Během tohoto působení se pH pohybuje okolo 12. pH lyzátu takto získaného je potom znovu upraveno na hodnotu 6, což způsobí srážení proteinů části chromozomální DNA a RNA. Tato sráženina se odstraní odstředěním.

Upřednostňovaný způsob provedení vynálezu spočívá především v podrobení buněk, které obsahují dvouvláknovou DNA určenou k purifikaci, chemické lýze, která umožňuje získat čistý lyzát. Takto získaný čistý lyzát se podrobí diafiltraci a takto získaný koncentrát je chromatografován na koloně keramického hydroxyapatitu.

Buněčný lyzát může být lyzát prokaryontních nebo eukaryontních buněk.

Co se týče prokaryontních buněk, mohou se uvést například bakterie E. coli, B. subtilis, S. typhimurium nebo Streptomyces. Co se týče eukaryontních buněk, mohou se uvést zvířecí buňky, kvasinky, houby, atd., zejména kvasinky Kluyveromyces nebo Saccharomyces nebo buňky COS, CHO, C127, NIH3T3, atd.

Postup podle vynálezu je zejména výhodný, protože umožňuje získat rychle a jednoduše plazmidovou DNA vysoké čistoty. Jak je naznačeno v příkladech, postup umožňuje účinně separovat požadovanou plazmidovou DNA od složek kontaminantů jako jsou fragmenty chromozomální DNA, RNA,

endotoxiny, proteiny, nukleasy, atd. Postup podle vynálezu umožňuje zejména získat preparát dvouvláknové DNA, zejména plazmidové, prakticky bez chromozomální DNA (<0,5%) . Mimoto přípravky získaných DNA obsahují velmi malé množství endotoxinů (<50 EU/mg), což je slučitelné s farmaceutickým použitím.

Předkladatel překvapivě ukázal, že kombinace těchto dvou výše popsaných etap, chromatografie na koloně Hydroxyapatie, která následuje nebo předchází chromatografií Triple-Helix, umožňuje získat preparát plazmidové DNA, který obsahuje chromozomální DNA v hodnotách 0,01 %. Vynález se také týká přípravy plazmidové DNA, která má obsah chromozomální DNA nižší nebo rovný 0,01 %.

Vynález se také týká přípravy plazmidové DNA, která má obsah endotoxinů nižší nebo rovný 50 EU/mg, zejména nižší než 10 EU/mg. Obsah endotoxinů je tedy nižší než je autorizovaný obsah, který je 350 EU/injekci pro člověka vážícího 70 kg (EU znamená Endotoxin Unit a je rovný 100 pg).

Předložený vynález popisuje tedy kompozice obsahující plazmidovou DNA farmaceuticky použitelnou zejména v genové nebo buněčné terapii in vivo nebo ex vivo. V tomto ohledu vynález má za předmět vynálezu farmaceutickou kompozici, která obsahuje dvouvláknovou DNA lineární nebo plazmidovou, připravenou podle popsaného postupu.

Kompozice mohou obsahovat plazmidovou DNA holou nebo spojenou s přenosným vektorem takovým, jako jsou lipozomy, nanočástice, kationické lipidy, polymery, proteiny nebo rekombinantní viry, atd.

Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.

• · • ·

Materiál a metody

1. Konstrukce plazmidu pXL2784

V příkladech, které následují se použilo specifického plazmidu pXL2784. Tento plazmid obsahuje kazetu obsahující promotor Cytomegalovirus, gen kódující luciferasu a homopurino-homopyrimidinovou sekvenci (GAA)₁₇. Konstrukce tohoto plazmidu je dále popsána. Je evidentní, že postup podle vynálezu není omezený pouze na popsaný plazmid.

1.1 Popis plazmidu pXL2784

Plazmid je konstruován z plazmidového vektoru pXL2675 (2,513 kb), minimálního replikonu plazmidu ColEl vzešlého z plazmidu pBluescript (ORI), který má pro značení selekce transportní gen Tn5, který kóduje rezistenci ke kanamycinu. Plazmid pXL2784 obsahuje také homopurino-homopyrimidinovou sekvenci (GAA)₁₇ pocházející z plazmidu pXL2563, který se může vázat k oligomeru (CTT)_n, kde n = 1 až 17, aby se lokálně vytvořila struktura triplet-helix a umožnila purifikaci afinitou. Plazmid pXL2784 má lokus cer (382 bp) pocházející z plazmidu ColEl a klonován do plazmidu pXL565, lokus cer obsahuje regiospecifickou sekvenci rekombinas XerC/XerD a vede k výslednému plazmidovému multimeru. Transgen klonovaný na plazmidu pXL2784 je kazeta exprese (3,3 kb) genu luc, který kóduje luciferasu Photinus pyralis pod řízením promotoru P CMV lidského cytomegaloviru, tato kazeta pochází z plazmidu pXL2622.

Plazmid má velikost 6390 bp. Mapa plazmidu pXL2784 je uvedena na Obrázku 1 a jeho detailní konstrukce je dále popsána.

···· • ·

1.2 Minimální vektor pXL2675

Po ztrátě přesahujících konců Bsal působením Klenowova fragmentu, fragment Bsal-PvuII 1,15 kb plazmidu pBKS+ (Stratagen) byl klonován s fragmentem Smál 1,2 kb plazmidu pUC4KIXX (Pharmacia), aby se vytvořil plazmič pXL2647.

Oligonukleotid 5542:

5'-AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG

AGCGGCCGCG AGCTCC-3' (SEQ ID n°10) a oligonukleotid 5543:

5'-AGCTGGAGCT CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT ATCCTGCAGC TCGAGA-3'(SEQ ID n°ll) byly hybridovány mezi sebou a potom klonovány v místě HindlII pXL2647 tvořící plazmid pXL2675. Tento plazmid obsahuje multimísto HindlI, Xhol, Pstl, EcoRV, EcoRI, BamHI, Xbal, Notl, Sstl mezi počátkem replikace a genem kódujícím rezistenci ke kanamycinu.

1.3 Kazeta luciferasy v plazmidu pXL2622

Promotor CMV obsažený ve fragmentu MluI-HindlII 660 bp plazmidu pcDNA3 (pocházející z Invitrogenu) byl klonován mezi místy MluI-HindlII základního plazmidu pGL2 (Promega obsahuje gen luciferasy), aby se vytvořil plazmid pXL2622.

1.4 Plazmidy pXL2563 a pMTL22-TH obsahující sekvenci schopnou tvořit triplet-helix s oligonukleotidem

Oligonukleotid 4817:

5'-GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG-3' (S EQ ID η°12) • φ a oligonukleotid 4818:

5'-AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG-3'(SEQ ID n°13) byly hybridovány mezi sebou a klonovány v místech EcoRI a BamHI plazmidu pBluescriptlI KS, aby se vytvořil plazmid pXL2563. Fragment EcoRI-BamHI 62 bp je klonován v místech EcoRI-BamHI plazmidu pMTL22 (P.Minton 1988 Gene 68: 139), aby se vytvořil plazmid pMTL22-TH.

1.5 Plazmidy pXL565 a pXL2781 obsahující lokus cer

Fragment Hpall 382 bp plazmidu ColEl (P-L Biochemicals) byl klonován v místě AccI plazmidu M13 mp7 (Messing et coll. 1981 Nucleic Acids Res 9: 309), aby se vytvořil plazmid pXL565. Fragment BamHI 382 pb pXL565 byl klonován v místě BglII plazmidu pSL301 (Invitrogen), aby se vytvořil plazmid pXL2781.

1.6 Konstrukce plazmidu pXL2784

Fragment BamHI-XhoI plazmidu pXL2781 382 bp obsahující lokus cer je klonován v místech BamHI a Xhol plazmidu pXL2675, aby se vytvořil plazmid pXL2782.

Fragment BglII-BamHI plazmidu pMTL22-TH 62 bp obsahující sekvenci (GAA)₁₇ je klonován v místě BamHI plazmidu pXL2782, aby se vytvořil plazmid pXL2783.

Fragment Sall-Spel 3,3 kb plazmidu pXL2622 obsahující kazetu luciferasy je klonován v místech Xhol a Nhel plazmidu pXL2783, aby se vytvořil plazmid pXL2784. Očekává se, že může být vložena v místě kazety luciferasy každá jiná kazeta exprese genu luciferasy.

Kmen DHl (Maniatis et al., 1989) obsahující tento • ·

plazmid je kultivován ve fermentoru o obsahu 2 1, 7 1 a až

800 1. Mohou být použity také jiné kmeny.

2. Fermantace

Hostitel obsahující plazmidovou DNA pro kultivaci může být získán klasickými metodami fermentace (Jung et al., Ann. Inst. Pasteur/Micribiol. 1988, 139, pl29-146, Bauer et al., Biotechniol. Bioeng. 1976, 18, p81-94), technika fed-batch je upřednostňovaná. Po fermentaci v laboratorním měřítku tzn. pro objemy menší než 5 1, jsou získané buňky klasicky odstředěny (20 minut při 1000 rpm) nebo jsou odstřeďovány kontinuálně pro větší objemy (průmyslové objemy, které mohou dosahovat až několika set litrů). Takto získané buňky mohou být použity hned nebo po zmrazení na -80°C.

3. Chemická lýza

Buňky jsou popřípadě rozmražené a potom lyžované. Chemická lýza se skládá ze třech etap. První etapa spočívá ve vložení buněčné suspenze do pufru 25 mM Tris pH 6,8, 50 mM glukosy, 10 mM ETDA nebo ekvivalentu. Lýza buněk se tedy provádí ve směsi obsahující 0,2 M NaOH a 1 % SDS. pH roztoku se pohybuje okolo 12. Výběr ionického detergentu je důležitý, jelikož neionický detergent dává výtěžky extrakcí 10 krát slabší. Lýza je následována pseudoneutralizací prostředí v přítomnosti octanu draselného (konečné pH roztoku je mezi 5,5 a 6). Tato acidifikace prostředí vede k vytvoření sraženiny, která obsahuje proteiny, části chromozomální DNA a RNA. Toto srážení je způsobeno reakcí dodekylsulfátu sodného (SDS) s octanem draselným, které tvoří bílou sraženinu dodekylsulfátu sodného.

Sráženina musí být odstraněna. Proto se postupuje tak, ····

že odstřeďování se provádí v nádobách (15 minut při 8000 rpm), je-li odstřeďovaný objem nižší než 5 litrů, nebo kontinuálním způsobem, jsou-li objemy vyšší (>5 litrů). Jiná metoda pro eliminaci supernatantu spočívá ve zlepšení filtrace na filtru s velikostí pórů větší nebo rovnou 20 μτη (PALL, profil II použit podle doporučení dodavatele).

4. Diafiltrace

Supernatant získaný po chemické lýze je shromážděn k diafiltraci, aby se plazmidová DNA zakoncentrovala, a aby se vyloučily molekuly malé molekulové hmotnosti, zejména soli, které jsou přítomny v silné koncentraci. Tato diafiltrace se provádí na membráně s velikostí pórů mezi 50 až 300 kD podle velikosti plazmidů. Přednostně se používá membrána s velikostí pórů 100 kD. Hodnota 100 kD je hodnotou nominálně danou pro proteiny, které jsou globulární molekuly. Požaduje se, aby pro molekuly nukleových kyselin, které mají prostorovou strukturu různou, všechny molekuly, které mají molekulovou hmotnost nižší než 30 kd byly vyloučeny. Množství přítomné DNA v roztoku po diafiltraci a množství přítomné DNA v čistém lyzátu se měří pomocí HPLC. Výtěžek této etapy je vyšší nebo roven 80 %.

V průběhu diafiltrace jsou vyloučeny soli. Jsou nahrazeny 10 mM fosfátovým pufrem. Je tedy možné aplikovat produkt přímo na chromatografickou kolonu zejména na Ceramic Hydroxyapatite™.

Plazmidová DNA pocházející z afinitní chromatografie triple-helix je opět diafiltrovéna, aby došlo k zakoncentrování vzorku a k vyloučení nežádoucích solí. To umožňuje ekvilibrovat produkt v pufru vhodného složení. Diafiltrace na membráně s póry o velokosti 10 a 50 kD je proto účinná. Výtěžek je vyšší než 80 %.

0000 • · • ·

4 0 0

0

4 filtrován a připraven

Vzorek je potom sterilně analýzám před formulací.

5. Chomatografie na koloně Ceramic Hydroxyapatie™

Gel Ceramic Hydroxyapatie™ je nalit do kolony vhodné velikosti, která je uzpůsobena objemu vzorku k purifikaci a čistotě vzorku na počátku chromatografie. Pro určení velikosti kolony a objemu gelu se měří pomocí HPLC množství DNA v mg/ml přítomné v roztoku na počátku chromatografie. Stanoví se, že alespoň 0,1 mg DNA je fixováno ml hydroxyapatitu, tato hodnota se může měnit až k 1 mg v závislosti na množství RNA přítomné v roztoku na počátku. RNA se fixuje na gel více než by se mohla fixovat DNA. RNA je vyloučena různou elucí. Kolona je ekvilibrována fosfátovým pufrem slabé iontové síly (10 mM). Vzorek je vložen na gel při lineárním průtoku 50 cm/h. Gel je potom připraven k promytí fosfátovým pufrem zvýšené vodivosti (150 mM). Hlavní část DNA získané ze vzorku je vyloučena v tomto stádiu. Plazmidová DNA je eluována novým zvýšením vodivosti fosfátového pufru (250 mM) . Poslední kontaminanti jsou vyloučeny aplikací 0,5 N NaOH, který je neutralizován fosfátovým pufrem molární síly (500 mM) před případném opětném použití kolony. V případě farmaceutické produkce má tato náplň výhodu, že může podléhat chemické dekontaminaci, poněvadž je rezistentní k 0,5 M NaOH, což je klasicky čistící činitel při chromatografii, a je také rezistentní k silné koncentraci ethanolu.

Výsledek použití keramického hydroxyapatitu je výborný. Tato etapa postupu umožňuje vyloučit více než 80 % RNA, 99,9 % chromozomální DNA a snížit obsah endotoxinů faktorem 1000. Tato technologie nabízí použití každého enzymu hovězího původu nebo jiného původu (ne Rnasy ani proteasy K); mimoto jejich rezistence keramického hydroxyapatitu k chemickým • · · ·

I · · 1 ί · ·· • ff · · « činitelům umožňuje ho použít dnes více než 40 krát bez problémů reproducibility. Výtěžek chromatografie je vyšší nebo roven 80 %.

6. Afinitní chromatografie s tvorbou triple-helix

6.1 Příprava kolony

Materiál: Použitá kolona je kolona HiTrap aktivovaná 5 ml NHS (N-hydroxysukcinimid, Pharmacia), spojená s peristaltickou pumpou (začátek lml/min). Použitý specifický oligonukleotid má Skupinu NH₂ na 5' .

Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následuj ící:

-Vazebný pufr: 0,2 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl, pH 8,3

-Pufr A: 0,5 M ethanolamin, 0,5 M NaCl, pH 8,3

-Pufr B: 0,1 M octan draselný, 0,5 M NaCl, pH 4.

Metoda: Kolona je promyta 30 ml 1 mM HC1, potom je diluovaný oligonukleotid ve vazebném pufru (250 nmol v 5 ml) aplikován na kolonu a ponechán třicet minut v okolní teplotě. Kolona je 3 krát promyta 30 ml pufru A a potom 20 ml pufru B. Oligonukleotid je takto kovalentně vázán ke koloně vazbou CONH. Kolona je skladována při teplotě 4°C a může být použita alespoň čtyřikrát.

6.2 Purifikace plazmidu

Materiál:

Plazmid pXL2784 (popsán v kapitole 1) byl purifikován na koloně HiTrap spojené s oligonukleotidem popsaném v kapitole 7.1. Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou

4444

44 44

4 4 4 4 4

4 4 4 44

444 4 4444 4

4 4 4

44 44 následuj ící:

-Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M octan draselný, pH 4,5

-Pufr Ε: 1M Tris, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Metoda:

Kolona je promyta pufrem F, potom roztok, který obsahuje plazmid je aplikován na kolonu a ponechán alespoň dvě hodiny temperovat v okolní teplotě. Kolona je promyta pufrem F a potom se eluce provádí pufrem E.

7, Iontoměničová chromatografie

Předčištěný vzorek je připraven k chromatografii na slabé iontoměničové koloně. Silné anionty mají vlastnost fixovat velmi silně DNA, tak silně, že je velmi obtížné znovu získat produkt (výtěžek je tedy nižší než 60 %). To je důvod proč předkladatel používá slabou výměnu iontů, které nezachycují plazmidovou DNA, ale fixují zbytky RNA. Přednostně by se mohl používat slabý měnič aniontů typu DEAE Sepharose nebo DEAE hyper D nebo ekvivalenty. Gel je ekvilibrován v 10 mM fosfátovém pufru, vzorek pocházející z chromatografie na Ceramic Hydroxyapatie je přímo aplikován na gel. Fixovaná RNA je potom vyloučena při aplikaci koncentrovaného roztoku NaCl. Chemická dekontaminace může být provedena roztokem 0,5 M NaOH, což umožní pracovat za dobrých hygienických podmínek (vyloučení endotoxinů a nebezpečí mikrobiální kontaminace).

8. Stanovení plazmidové DNA v komplexních vzorcích HPLC

Předmětem této metody je možnost určit množství ···· plazmidové DNA v průběhu různých etap purifikace, aby se určil výtěžek. Může se také kvantitativně a kvalitativně posoudit účinnost různých operací.

Použité techniky jsou následující:

Chromatografická náplň je gel Poros R2 od Perseptive Biosystems. Jedná se o polystyrendivinylbenzenovou náplň s velikostí částic 10 μπι. Velikost fúzních pórů je 6000 až 8000 Angstrómů, velikost difúzních pórů je 500 až 1000. Objem gelu je 1,7 ml.

Jedná se o chromatografii párů iontů. Systém roztoků je voda, triethylamin acetát pH 7,1 / triethylamin acetát acetonitril 90 %.

Průtok je 3 ml/min. Byl definován gradient k rozlišování plazmidové DNA od RNA.

Referenční vzorek je plazmidová DNA purifikována na Qiagen podle doporučení výrobce. Na agarosovém gelu tento vzorek obsahuje jen ocDNA a cccDNA. V HPLC nedává než jeden samotný pík. Koncentrace byla určena měřením jeho DO při 260 nm a za základ byla vzata 1 jednotka DO = 50 pg/ml DNA.

Bylo tedy injektováno vzrůstající množství produktu, aby se vytvořila kalibrační stupnice.

Plocha píků odpovídajících retenčním časům referenční DNA je porovnán s kalibrační stupnicí. Může tak být stanoveno množství purifikované DNA.

9. Stanovení zbytkové chromozomální DNA

Zbytková genomická DNA je kvantifikována PCR za použití nástrojů v genu galK E. coli. Sekvence nástroje genu galK E. coli je (Debouck et al., Nucleic Acids Res., 1985, 13, ···· • ·

1841-1853):

5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3'(SEQ ID n°14) a 5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3'(SEQ ID n°15).

Reakční prostředí obsahuje v pufru PCR (Promega Francie, Charbonnieres) : 1,5 mM MgCl₂; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 μΜ nástroje, 20 U/ml Taq-polymerasy (promega). Reakce byla provedena podle sekvencí:

-5 minut při teplotě 95°C

-30 cyklů 10 sekund při teplotě 95°C 30 sekund při teplotě 60°C minuta při teplotě 78°C

-10 minut při teplotě 78°C.

Fragment amplifikované DNA délky 124 párů basí je separován elektroforeticky na 3 % agarosovém gelu v přítomnosti SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA), potom kvantifikován srovnáním se stupnicí genomické DNA Ultrapur E. coli, kmen B (Sigma, ref. D4889).

10. Transfekce savčích buněk in vitro

Tato metoda je použita pro určení biologické aktivity plazmidu purifikovaného metodou podle vynálezu. Použité buňky jsou NIH 3T3, rozmnožené v předvečer pokusu na kultivačních miskách se 24 jamkami s počtem 50 000 buněk na jamku. Plazmid je diluován 150 mM NaCl a smísen s lipofektantem. Používá se poměr pozitivních nábojů k negativním nábojům DNA rovný 3. Směs se zamíchá, nechaná deset minut temperovat při okolní teplotě, rozředí v kultivační půdě, je zbavena hovězího plodového séra, potom přidána k buňkám v množství 1 pg DNA na ···· kultivační jamku. Po dvou hodinách při teplotě 37°C se přidá 10 % obj./obj. hovězího plodového séra a buňky jsou inkubovány po dobu 48 hodin při teplotě 37°C v přítomnosti 5 % C0₂. Buňky jsou dvakrát promyty PBS a aktivita luciferasy je měřena podle popsaného protokolu (souprava Promega, Promega Corp. Madison, WI) na luminomertru Lumat LB9501 (EG a G Bertholt, Evry). Proteiny byly stanoveny technikou BCA (Pierce, Interchim, Asniéres).

11. Různé techniky

Získané plazmidy analyzované elektroforézou na agarosovém gelu a barveny ethidiumbromidem se detekují ve formě jednoho pruhu kruhové DNA nadšrobovicové. Žádná stopa DNA s vysokou molekulovou hmotností (chromozomální) ani RNA nebyla detekována v purifikovaném plazmidu.

Koncentrace proteinů ve vzorku je měřena Micro-BCA (Pierce) podle doporučení výrobce.

Koncentrace endotoxinů je stanovena LAL (Biosepra) podle doporučení výrobce.

Klasické metody molekulární biologie jako je digesce restrikčními enzymy, elektroforéza na gelu, transformace v E. coli, srážení nukleových kyselin atd. jsou popsány v literatuře (Maniatis et al., T., E.F.Fritsch, and J. Sambrook, 1989, Molecular cloning: laboratory manual, druhé vydání. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F. M,, R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman and K.Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York). Nukleotidové sekvence byly určeny metodou terminace řetězce uvedenou v popsaném protokolu (Ausubel et al., 1987).

·♦·· • · · · · · · · ·· • · · · ····> ···· ·

Restrikční enzymy byly dodány New-England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).

Pro ligaci byly fragmenty DNA inkubovány v pufru 50 mM Tris-HCl pH 7,4; 10 mM MgCl₂; 10 mM DTT, 2 mM ATP v přítomnosti DNA ligasy fágu T4 (Biolabs).

Oligonukleotidy byly syntetizovány za použití chemie fosforamidu chráněných v β kyanoethylovou skupinou (Sinha, N.

D., J. Biernat, J. McManus and H. Kdster, 1984. Polymer support oligonukleotide synthesis, XVIII: Use of b-cyanoethyl-N,N.dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the finál product. Nucl. Acids Res. 12, 4539-4557; Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am Biotechnol., Nov./Dec.) automatickým syntetizátorem DNA Biosearch 8600 za použití doporučení výrobce.

Ligaturovaná DNA nebo DNA určená k testování pro svou účinnost transformace jsou použity pro transformování příslušného kmene: E. coli DH5a [F/endAl, hsdR17, supE44, thi-1, gyrA96, relAl, D(lacZYA-argF)U169, deoR, F80dlac(lacZDM15)].

Minipreparace plazmidové DNA byla provedena podle protokolu Kleina et al., 1980.

Kultivační půda LB byla použita pro kultivaci kmene E. coli (Maniatis et al., 1982). Kmeny byly inkubovány při teplotě 37°C. Bakterie byly rozloženy na kultivačních miskách s půdou LB doplněnou vhodnými antibiotiky.

99 · · 9 • 9 99

999 9 9

9 9 ····

999

Příklady

Příklad 1: Purifikace plazmidové DNA na keramické hydroxyapatické koloně

1.1 Příprava čistého lyzátu

Materiál:

Roztoky, které byly použity v tomto příkladu jsou následující:

roztok 1: Tris 25 mM pH 6,8, 50 mM glukosy, 10 mM ETDA roztok 2: 0,2 M NaOH a 1% SDS roztok 3: 3M octan draselný, pH 5

Metoda:

200g buněk je vloženo do suspenze 2200 ml roztoku 1. Potom je přidán roztok 2 (také 2200 ml) . Potom je přidáno 1100 ml roztoku 3. Takto vytvořená sraženina je odstředěna při 9000 rpm po dobu 30 minut. Získá se 5200 ml supernatantu.

1.2 Diafiltrace

Materiál: Membrána Maximate (Filtron), velikost pórů 100 kD na povrchu 1860 cm²

Pufr: 100 mM fosforečnan sodný, pH 6,8

Metoda:

Po použití membrána se podrobí chemické dekontaminaci 0,5 M hydroxydem sodným během jedné hodiny. NaOH je potom vyloučen vodou ppi.

Supernatant takto získaný v etapě 1.1 je koncentrovaný asi 10 krát, potom diafiltrován proti čtyřnásobnému objemu

4444

44 44

4 4 4 4

4 4 4 4

444 4 4444 4 • 4 4 4

44 44 fosfátovému pufru 100 mM a pH 6,8. Výsledný objem je 810 ml. Vzorek tak obsahuje 224 mg plazmidové DNA určené pomocí HPLC.

1.3 Purifikace na Ceramic Hydroxyapatie™

Materiál:

Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následuj ící:

Pufr A = 10 mM fosfátový pufr pH 6,8

Pufr	B =	150	mM	fosfátový	pufr	pH	6, 8
Pufr	C =	250	mM	fosfátový	pufr	pH	6,8
Pufr	D =	500	mM	fosfátový	pufr	pH	6,8

0,5 M NaOH

Metoda:

Kolona (průměr 113 mm a délka 17 cm) obsahuje 1700 ml gelu.

Před použitím byl gel podroben chemické dekontaminaci 0,5 M hydroxydem sodným během jedné hodiny. NaOH je pak vyloučen aplikací pufru D. Kolona je ekvilibrována pufrem A.

Aplikuje se 610 ml pocházející z předem získaných 810 ml (tj. 171 mg) na gel. Na začátku je průtok 60 ml/min. Gel je pak promyt 6 1 pufru B. Produkt je eluován při aplikaci pufru C. Objem eluátu je 1520 ml a obsahuje 147 mg plazmidové DNA (určené HPLC).

Gel je potom regenerován promytím 0,5 M hydroxydem sodným a pak pufrem D. Gel je takto připraven pro nový cyklus.

Tyto operace jsou sledovány spektrometrií UV při 254 nm.

• · ® · · · · · · • · · · · ·»· · • · · · · ··· · ·· ··

1.4 Purifikace na DEAE Sepharose

Materiál:

Pufr, který byl použit v tomto příkladu je následující:

Pufr A 1M NaCl a 0,5 M NaOH

Metoda:

Kolona (průměr 50 mm a délka 6 cm) obsahuje 110 ml gelu.

Před použitím gel byl podroben chemické dekontaminaci 0,5 M hydroxydem sodným během jedné hodiny. NaOH je pak vyloučen aplikací 1 M NaCl. Kolona je ekvilibrována pufrem A.

1130 ml vzniklých z 1520 ml (tj. 110 ml) předem získaných je aplikováno na gel s počátečním průtokem 50 ml/min. Jelikož DNA není zadržena, výtok je sesbírán (1036 ml) a obsahuje 104 mg DNA. Získané produkty na gelu jsou potom eliminovány roztokem 1 M NaCl. Gel je tedy promyt 0,5 M NaOH a pak 1 M NaCl. Gel je takto připraven pro novou operaci.

Tyto operace jsou sledovány spektrometrií UV při 254 nm.

1.5 Diafiltrace

Materiál:

Membrána Ultrasette (Filtron), velikost pórů 30 kD na povrchu 860 cm²

Pufr: voda ppi

Metoda:

Před použitím membrána je podrobena chemické dekontaminaci 0,5 M NaOH po dobu jedné hodiny. NaOH je pak

4444

44

4 4 4 • · · ·

4 444

4 4

4* 44

44

4 4

44

444 4 4

4 4

4 4 eliminován vodou ppi. 720 ml produktu získaného v předchozí etapě je koncentrováno třikrát, potom dvakrát diafiltrován proti čtyřnásobnému objemu vody ppi. Konečný objem je 210 ml. Vzorek obsahuje 62 mg plazmidové DNA určené HPLC.

1.6 Charakteristika DNA

Metoda popsaná dále umožňuje získat plazmid dostatečně čistý. Byly stanoveny různé příměsy ve vzorku a byly určeny jako:

-RNA: nedetekovatelná na agarosovém gelu nebo HPLC

-chromozomální DNA určená PCR: 0,5%

-nadšroubovicová DNA určená HPLC: 80%

-endotoxiny (LAL) 50 EU/mg

-proteiny (microBCA) 1 pg/ml

-biolobická aktivita in vitro:

pXL2784 část 42DNA95 : 20*10⁶ RLU/gg proteinů (ve srovnání se stejným plazmidem purifikovaným v gradientu chloridu cesnatého = 13*10⁶ RLU/gg proteinů).

1.7 Varianta

Postup popsaný dále byl opakován za podmínek uvedených v etapě 1.1 a doplněn filtrací na membráně místo odstřeďování. Tato varianta postupu umožňuje získat plazmid farmaceutické čistoty, jehož charakteristika je následující:

-RNA: nedetekovatelná na agarosovém gelu nebo HPLC

-chromozomální DNA určená PCR: 0,5%

-nadšroubovicová DNA určená HPLC: 70% • · >··· 0*40

4 00 0000· 0000 0

00 0 000 0 4 0 * 0* «· · 0 ⁴⁴

-endotoxiny (LAL) 50 EU/mg

-proteiny (microBCA) 1 gg/ml

Příklad 2: Purifikace hydroxyapatitového eluátu afinitní triple-helix chromatografií

2.1 Příprava afinitní kolony

Použitá kolona je kolona HiTrap aktivovaná 5 ml NHS (N-hydroxysukcinimid, Pharmacia), spojená s peristaltickou pumpou. Použitý specifický oligonukleotid má skupinu NH₂ na 5'konci. Jeho sekvence je následující:

5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(SEQ ID n°l).

Použité pufry v tomto příkladu jsou následující:

-Vazebný pufr: 0,2 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl, pH 8,3

-Pufr A: 0,5 M ethanolamin, 0,5 M NaCl, pH 8,3

-Pufr B: 0,1 M octan draselný, 0,5 M NaCl, pH 4.

Kolona je promyta 30 ml 1 mM HC1, potom zředěnýný oligonukleotid ve vazebném pufru (250 nmol v 5 ml) je aplikován na kolonu a ponechán třicet minut v okolní teplotě. Kolona je 3 krát promyta 30 ml pufru A a potom 20 ml pufru B. Oligonukleotid je takto kovalentně vázán ke koloně vazbou CONH. Kolona je skladována při teplotě 4°C.

2.2 Purifikace plazmidu

Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následuj ící:

-Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5 • · • · · · · · · · · · • · · · ····· ···· · • · ·· · ··· ··· · ·· ·· ·· ··

-Pufr E: 1M Tris, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Kolona, předem upravená 2M NaCl pH 4,5, je ekvilibrována v pufru F, potom je 9 ml hydroxyapatitového eluátu získaného za podmínek popsaných v příkladu 1.3 aplikováno ve smyčce na kolonu během noci při okolní teplotě (začátek 0,5 ml/min). Kolona je promyta pufrem F a potom se eluce provádí pufrem E. DNA je detekována spekrometricky UV při 254 nm.

2.3 Chrakteristika purifikované DNA

Purifikovaná DNA analyzovaná pomocí HPLC (metoda je dále popsaná) je vyjádřená ve formě jednoho píku s retenčním časem 24,8 min. Nebyl dekován žádný obsah RNA. Po elektroforéze na 1% agarózovém gelu s detekcí ethidiumbromidem purifikovaná DNA nevyjadřuje žádný detekovatelný obsah RNA.

DNA byla také analyzována iontoměničovou chromatografií na koloně Gen-Pak Waters, který odděluje relaxovanou DNA od nadšroubovicové DNA. Purifikovaný vzorek obsahuje 97% nadšroubovicové DNA proti 80% nadšroubovicové DNA v kontrolním vzorku.

Genomická DNA E. coli byla kvantifikována PCR podle technik popsaných v paragrafu 3: DNA purifikovaná na afinitní koloně obsahuje okolo 0,01% genomické DNA.

Příklad 3

3.1 Purifikace plazmidu

Používá se afinitní kolona připravená tak, jak je popsáno v příkladu 2 s oligonukleotidovou sekvencí:

• 4

5'-CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3'(SEQ ID n°2).

Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následuj ící:

-Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M octan draselný, pH 4,5

-Pufr E: 1M Tris, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Kolona je ekvilibrována v pufru F, potom se přidá 0,8 mg purifikovaného plazmidů podle protokolu v příkladu 1.7, rozředěného v 10 ml pufru F. Vzorek je aplikován smyčkou na kolonu během noci při okolní teplotě (průtok 0,5 ml/min). Kolona je promyta pufrem F a potom se eluce provádí pufrem E. DNA je detekována spekrometricky UV při 254 nm.

3.2 Charakteristiky purifikované DNA

Získaná DNA byla analyzována iontoměničovou chromatografií na koloně Gen-Pak Fax Waters, která odděluje relaxovanou DNA od nadšroubovicové DNA. Purifikovaný vzorek obsahuje 100% nadšroubovicové DNA proti 72% nadšroubovicové DNA v kontrolním vzorku na afinitní koloně.

Genomická DNA E. coli byla kvantifikována PCR podle technik popsaných výše: DNA purifikovaná na afinitní koloně obsahuje okolo 0,01% genomické DNA proti 0,3 % ve vzorku na afinitní koloně.

Příklad 4: Změna stupnice afinitní chromatografie triple-helix po purifikaci hydroxyapatického eluátu (pXL2784)

4.1 Příprava afinitní kolony

Použitá kolona je kolona obsahující Sepharosu 4 Fast Flow aktivovaná NHS (N-hydroxysukcinimid, Pharmacia) spojena

s oligonukleotidem sekvence:

5'-CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3'((CTT)₇: SEQ ID n°l) podle metody popsané v příkladu 2.1.

Kolona (průměr 26 mm, délka 16 cm) obsahuje 80 ml gelu a je spojena s peristaltickou pumpou.

4.2 Purifikace plazmidu

Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následuj ící:

-Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5

-Pufr E: 1M Tris, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Kolona je ekvilibrována v pufru F, potom 135 ml tj. 8 mg hydroxyapatitu získaného za podmínek popsaných v příkladu 1.3, předem upraveného 2M NaCl pH 4,5 je aplikováno na kolonu (začátek 1,25 ml/min) za čtyřnásobné recilkulace. Kolona je promyta pufrem F a potom se eluce provádí pufrem E. DNA je detekována spekrometricky UV při 254 nm: bylo získáno 2,2 mg.

4.3 Charakteristiky purifikované DNA

Purifikovaná DNA analyzovaná pomocí HPLC (metoda je dále popsaná) je vyjádřená ve formě jednoho píku s retenčním česem 24,4 min. Nebyl dekován žádný obsah RNA. Po elektroforéze na 1 % agarózovém gelu s detekcí ethidiumbromidem purifikovaná DNA nevyjadřuje žádný detekovatelný obsah RNA.

DNA byla také analyzována iontoměničovou chromatografii na koloně Gen-Pak Waters, která odděluje relaxovanou DNA od nadšroubovicové DNA. Purifikovaný vzorek obsahuje 100 % nadšroubovicové DNA proti 94 % nadšroubovicové DNA v • · • · · · · · ·· • · * ·« · · ·· · · · • · · · · · • · ·· ·· · · kontrolním vzorku.

Genomická DNA E. coli byla kvantifikována PCR podle technik popsaných v paragrafu 3: DNA purifikovaná na afinitní koloně obsahuje okolo 0,02% genomické DNA proti 2 % v kontrolním vzorku.

Příklad 5: Purifikace vysokého stupně plazmidové DNA na keramické hydroxyapatitové koloně

5.1 Příprava čistého lyzátu

Čistý lyzát je připraven tak, jak je popsáno v příkladu

1.1 z bakteriální buněčné kultury E. coli transformované plazmidem pXL2774. Plazmid pXL2774 má redukovanou velikost (okolo 4,5 kb) a obsahuje zejména:

-kazetu exprese genu Luc (promotor CMV-luc-poly(A)+)

-selektivní markér sup Phe

-počátek replikace ori γ R6K

-fragment cer ColEl

Metoda:

456 g buněk se umístí do suspenze 5000 ml roztoku 1. Potom je přidán roztok 2 (5500 ml) . Je přidáno 2500 ml roztoku 3. Takto vytvořená sraženina je vyloučena odstředěním při 9000 rpm po dobu 30 minut nebo filtrací. Získá se 12,3 1 upernatantu.

5.2 Diafiltrace

Materiál:

Membrána Maximate (Filtron) s velikostí pórů 100 kD na ff · povrchu 1860 cm².

Pufr: 100 mM fosforečnan sodný pH 6,8

Metoda:

Vzorek je diafiltrován podle metody popsané v příkladu

1.2.

Konečný objem je 945 ml. Vzorek obsahuje 235 mg plazmidové DNA určené pomocí HPLC.

5.3 Purifikace na Ceramic Hydroxyapatite™

Materiál:

Pufry, následuj ící:

které byly použity v tomto příkladu jsou

Pufr A:	100
Pufr B:	150
Pufr C:	250
Pufr D:	500
0,5 M NaOH

mM fosfátový mM fosfátový mM fosfátový mM fosfátový

Metoda:

pufr pH 6,8 pufr pH 6,8 pufr pH 6,8 pufr pH 6,8

Kolona (průměr 100 mm a délka 23 cm) obsahuje 1700 ml gelu. Po použití je gel podroben dekontaminaci 0,5 M NaOH po dobu jedné hodiny. NaOH je po odstraněn aplikací pufru D. Kolona je ekvilibrována pufrem A.

Na gel bylo aplikováno 475 ml, které pocházejí z 945 ml (tj. 128 mg) předem získaných. Průtok je 65 ml/min. Gel je potom promyt 6 1 pufru B. Produkt je eluován aplikací pufru C. Objem eluátu je 1760 ml a obsahuje 100 mg plazmidové DNA (určené HPLC).

···· ·· ·· ·· ·· • · 4 · · · 4 • · · · · ·♦ • · · · · · * ···· · ·· · · * · · · <·· « ·· ·· ·· ··

Gel se potom regeneruje promytím 0,5 M NaOH, potom pufrem D. Gel je tak připraven pro nový cyklus.

5.4 Diafiltrace

Diafiltrace byla provedena podle protokolu podsaného v příkladu 1.5.

5.5 Charakteristiky DNA

Postup popsaný dále umožňuje získat plazmid dostatečně čistý. Byly stanoveny různé příměsy ve vzorku a byly určeny jako:

-RNA: nedetekovatelná na agarosovém gelu

-chromozomální DNA určená PCR: 0,6%

-nadšroubovicová DNA určená HPLC: 87%

-endotoxiny (LAL) 50 EU/mg

-proteiny (microBCA) 1 μς/ml • · ·· · · · · • · · · · · · · • · ···· · ♦ · 4 . · * · · ··· · ··· · · • · ·♦ · »·» ,·· · ·· ·· ·· ··

Seznam sekvencí (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 1:

GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

charakteristika sekvence:
(A)	délka: 21 párů basí
(B)	typ: nukleotid
(C)	počet vláken: jedno
(D)	konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 2:

CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT T 21 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 19 párů basí ···· • · ·· ·· ·· » · · · * ···♦ • · <♦······ • · · · ♦ ··· · ··· * · • · ·· · ··· ·· · · ·· ·· ·· ·· (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 3:

AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 19 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 4:

AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 19 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 19 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 5:

9999

99 99 99 • 9 9 9999 9999

9 9999 99 99 • · 9 9 9 999 · 999 · 9 • 9 99 9 999 ·«· ♦ »· ·♦ ·· ··

TTGGTGTGGT GGGTGGGTT (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 19 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 6:

CTTCCCGAAG GGAGAAAAGG (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 7:

GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 13 párů basí ···· ·· φφ ·· φ» ♦ · ♦ » « · ♦ · * • φ ········ • φ · · · ··· · ···« * ·· ·· · φ φ φ φφφ · ·· ·· ·♦ ♦· (Β) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 8:

GAAAAAGGAA GAG 13 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 9:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 17 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 9:

AAAAAAAGGGA TAAGGG 17 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 10:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 56 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 10:

4444 ·· 44 44

4444 4 4 4 4

4444 4 4 44 • 44 4 4444 4444 4

4 4 4 4 4 4 • 4 44 44 44 44

AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG AGCGGCCGCG AGCTCC 56 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 11:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 56 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 11:

AGCTGGAGCT CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT ATCCTGCAGC TCGAGA 56 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 12:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 58 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 12:

GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG 58 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 13:

• 4 • 44 4

4 4 4

4 4 4 4

4444

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 58 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 13:

AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT

CTTCTTCG (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 14:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 27 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 14:

CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 27 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 15:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 27 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno • · (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 15:

CCAAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT • 4 · · • 4

• 4 44

4 4 4

4« 4

4 4 4 4

·

4 4

Τ>1/ΐ7Μ-^

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Metoda purifikace dvouvláknové DNA farmaceuticky čisté vyznačená tím, že obsahuje alespoň etapu chromatografie na koloně keramického hydroxyapatitu.
2. 2. Metoda purifikace dvouvláknové DNA vyznačená t i m, že zahrnuje dvě etapy chromatografie, z nichž jedna je provedena na koloně hydroxyapatitu.
3. 3. Metoda podle nároku 2 vyznačená tím, že zahrnuje etapu chromatografie na koloně hydroxyapatitu a etapu chromatografie afinitní nebo iontoměničové.
4. 4. Metoda podle nároku 3 vyznačená tím, že zahrnuje etapu chromatografie na koloně hydroxyapatitu a etapu chromatografie afinitní specifickou hybridací mezi sekvencí DNA a imobilizovaným oligonukleotidem s vytvořením triple-helixu.
5. 5. Metoda podle nároku 3 vyznačená t í m, že zahrnuje etapu chromatografie na koloně hydroxyapatitu a etapu chromatografie iontoměničové.
6. 6. Metoda podle nároku 1 až 5 vyznačená tím, že zahrnuje mimo jiné etapu diafiltrace.
7. 7. Metoda purifikace dvouvláknové DNA vyznačená t i m, že zahrnuje následující etapy:

   φ · · · φ

   φφφφ • ff φ • ··

   -chemickou lýzu buněk

   -diafiltraci

   -chromatografii na koloně keramického hydroxyapatitu

   -chromatografii afinitní specifickou hybridací mezi sekvencí DNA a zmobilizovaným oligonukleotidem s vytvořením triple-helixu.
8. 8. Metoda podle jednoho z jakéhokoliv nároku 1 až 7 vyznačená tím, že dvouvláknová DNA obsahuje mimo jiné jednu nebo více sekvencí zájmu.
9. 9. Metoda podle jednoho z nároků 1 až 8 vyznačená t i m, že dvouvláknová DNA je plazmidové DNA.
10. 10. Příprava plazmidové rekombinantní DNA vyznačená obsahem chromozomální DNA vyšším nebo rovným 0,01 %.
11. 11. Příprava plazmidové rekombinantní DNA purifikované podle nároku 10 vyznačená obsahem endotoxinu vyšším nebo rovným 50 EU/mg.
12. 12. Příprava purifikované plazmidové rekombinantní DNA podle nároku 11 vyznačená obsahem endotoxinu vyšším nebo rovným 10 EU/mg.
13. 13. Farmaceutická kompozice obsahující DNA získanou postupem podle jednoho z nároků 1 až 9.