SK129198A3 - Purification of pharmaceutical-grade plasmid dna - Google Patents
Purification of pharmaceutical-grade plasmid dna Download PDFInfo
- Publication number
- SK129198A3 SK129198A3 SK1291-98A SK129198A SK129198A3 SK 129198 A3 SK129198 A3 SK 129198A3 SK 129198 A SK129198 A SK 129198A SK 129198 A3 SK129198 A3 SK 129198A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- sequence
- buffer
- column
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 113
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 159
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 90
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 36
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims abstract description 36
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 67
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 22
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 11
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 10
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 63
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 52
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 27
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 11
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000009390 chemical decontamination Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical group [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- VJUBYQUPDRGGMP-UHFFFAOYSA-N (morpholin-4-ylamino)phosphonous acid Chemical compound OP(O)NN1CCOCC1 VJUBYQUPDRGGMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 244000058084 Aegle marmelos Species 0.000 description 1
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 101100297345 Caenorhabditis elegans pgl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091036055 CccDNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000772600 Norion Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- -1 Superose Polymers 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- CIHUOJZDKZENCP-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;triethylazanium;acetate Chemical compound CC#N.CC(O)=O.CCN(CC)CC CIHUOJZDKZENCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 125000006367 bivalent amino carbonyl group Chemical group [H]N([*:1])C([*:2])=O 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N dXTP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000004200 deflagration Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004190 ion pair chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical group CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000008039 phosphoramides Chemical class 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M sodium chlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)=O YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 231100000378 teratogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010891 toxic waste Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 231100000925 very toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Purifikácia plazmidovej DNA farmaceutickej kvality
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka novej metódy na purifikáciu DNA. Metóda podlá vynálezu umožňuje rýchlo purifikovať farmaceutický použiteľnú dvojvláknovú DNA. Metóda purifikácie zahŕňa iba diafiltráciu a chromatografiu.
Doterajší stav techniky
Techniky génovej terapie a bunkovej terapie zaznamenávajú výnimočný vývoj. Tieto techniky tiež zahrňujú možnosť použitia dôležitého množstva farmaceutický veľmi čistej DNA, predovšetkým plazmidovej DNA. V nových terapiách je medikament často tvorený
I samotnou DNA, ktorá sa môže pripraviť v prijateľnom množstve, izolovať a vhodným spôsobom purifikovať na terapeutické použitie pre ľudí, predovšetkým na intravenózne použitie.
Problémy týkajúce sa množstva a purifikácie nie sú zahrnuté v klasických metódach izolácie DNA. Metódy použité v laboratóriu nie sú prenosné do farmaceutického priemyslu na purifikáciu plazmidovej DNA. Dve z týchto metód, ktoré sú najviac používané, sú . metódy ktoré poskytujú najlepšie výsledky. Vychádzajú z hrubého bakteriálneho lyzátu obohateného plazmidovou DNA pri súčasnom vylúčení kontaminantov. Na rozbitie bakteriálnej steny sa používa predovšetkým lyzozým z vaječného bielka, potom sa lyzát odstredí, aby sa odstránili zvyšky buniek. Supernatant sa potom opracuje s pankreatickou RNázou zvieracieho pôvodu, ktorá umožňuje odstrániť RNA, ktorá predstavuje v tejto etape okolo 75% prítomných nukleových kyselín.
Proteíny sa vyzrážajú zmesou fenol/chloroform/izoamylalkohol. Zo získaného supernatantu sa odstredením odstránia proteíny a RNA, avšak ešte stále obsahuje veľké množstvo chromozómovej DNA, ktorá sa musí odstrániť až v následnej etape. Táto etapa spočíva v ultracentrifugácii v gradiente chloridu cézneho a v prítomnosti etídiumbromidu. Tri druhy nukleových' kyselín: chromozómová DNA, plazmidová DNA a RNA majú väčšiu alebo menšiu schopnosť fixovať etídiumbromid. Rozdeľujú sa ultracentrifugáciou v gradiente chloridu cézneho na tri fázy.
Variant tohto protokolu spočíva v nasledujúcom pôsobení pankreatickej RNázy, redukciou v prítomnosti alkalického detergentu, nasledujúcou extrakciou zmesou fenol/chloroform. DNA sa potom zráža etanolom, rozpustí a znovu zráža s polyetylénglykolom.
Tieto dve metódy, ktoré umožňujú; získať roztok plazmidovej DNA, sa bežne používajú na priemyselnú výrobu farmaceutický čistého produktu. Avšak použitie enzýmov zvieracieho pôvodu spôsobuje problém. Lyzozým a pankreatická RNáza, vzhľadom na svoj pôvod, sú rizikom vnesenia vírusovej kontaminácie do konečného produktu. A navyše organické rozpúšťadlá sú veľmi toxické a musia sa odstrániť, ak má ísť o výrobok, ktorý sa použije ako liek. Tieto rozpúšťadlá sú príčinou značného zvýšenia ceny výrobku spojenej predovšetkým s jeho skladovaním, s jeho používaním pri maximálne bezpečných podmienkach a s ! . J odstránením tvoriacich sa toxických odpadov a z dôvodu ťažkostí úplného odstránenia týchto produktov v konečnom roztoku. Čo sa týka etídiumbromidu, je toxický, mutagénny a teratogénny a v produkte, ktorý je určený na liečenie, sa nemôže tolerovať ani stopové množstvo. Použitie rozpúšťadiel, toxických reaktantov, ako aj použitie enzýmov zvieracieho pôvodu, je nekompatibilné s priemyselnou metódou zodpovedajúcou dobrým postupom výroby.
Podstata vynálezu
Predložený vynález opisuje novú jednoduchú a účinnú metódu na purifikáciu DNA. Metóda opísaná v predloženom vynáleze umožňuje produkciu veľkého množstva veľmi čistej DNA. Metóda opísaná v predloženom.vynáleze výhodne umožňuje vylúčiť použitie toxických organických rozpúšťadiel a použitie enzýmov zvieracieho pôvodu. Umožňuje tiež obmedziť počet odstreďovania a obmedziť slabý výťažok predovšetkým z dôvodu etáp zrážania s PEG, octanom amónnym alebo CaCl2. Metóda podľa vynálezu umožňuje bez technických ťažkostí získať veľké množstvo DNA (100 mg, 1 g, g alebo viac). Metóda podľa vynálezu pracuje s metódami kompatibilnými s dobrým výrobnými postupmi a umožňuje získať DNA farmaceutickej kvality.
Prvý predmet vynálezu sa týka postupu na purifikáciu dvojvláknovej DNA, ktorý umožňuje získať veľmi rýchlo veľké , množstvo plazmidovej DNA s farmaceutickou čistotou a. zahrňuje chromatografiu na kolóne hydroxyapatitu v keramickej forme. Hydroxyapatit v kryštalickej forme bol známy už skôr, ale kvôli svojej krehkosti bolo jeho použitie ťažké a obmedzené. Keramická forma je viac odolná fyzikálne aj chemicky.
Uprednostňovaný spôsob postupu podľa vynálezu obsahuje dve chromatografické etapy, z toho aspoň jednu chromatografiu na hydroxyapatite. ' >
Druhá chromatografia je výhodne afinitná alebo iónomeničová chromatografia. Tieto dve chromatografie sa môžu uskutočniť v akomkoľvek poradí.
Podľa spôsobu uskutočnenia, predovšetkým uprednostňovaného, postup podľa vynálezu zahrňuje etapu chromatografie na kolóne hydroxyapatitu a etapu afinitnej chromatografie Triple-Helix. Afinitná chromatografia Triple-Helix je založená na použití nosiča, na ktorom je kovalentne naviazaný oligonukleotid schopný tvoriť hybridizáciou triple helix so špecifickou sekvenciou prítomnou na uvedenej DNA. Tieto dve chromatografie sa môžu uskutočniť v akomkoľvek poradí.
Podľa iného spôsobu uskutočnenia, postup podľa vynálezu zahrňuje etapu chromatografie na kolóne hydroxyapatitu a etapu ionomeničovej chromatografie.
Postup podľa vynálezu výhodne obsahuje, okrem iného, etapu diafiltrácie. Tá sa všeobecne uskutočňuje pred chromatografiami.
Hlavná etapa postupu podľa vynálezu chromatografii na kolóne hydroxyapatitu.
spočíva
Hydroxyapatit je komplex fosforečnanu vápenatého obsahujúceho desať atómov vápnika. Keramickú forma, ktorá je stabilnejšia ako kryštalická forma, poskytla firma Bio-Rad Laboratories a Asahi Optical Co., Ltd. Keramická zlúčenina má rovnaké vlastnosti ako kryštalická zlúčenina, ale je bez fyzikálnych obmedzení; tento materiál sa skôr používa na chromatografie pri purifikácii proteínov, oproti keramickej forme má výhody a umožňuje získať veľmi dobré výsledky v súvislosti s purifikáciou nukleových kyselín. Je to materiál makropórovitý, sférický, chemický a fyzikálne velmi stabilný a môže sa opakovane použiť ňa viac použití bez- straty účinnosti. Táto keramická forma môže znášať zvýšené tlaky, velmi vysoké pH, velmi rýchly prietok a organické rozpúšťadlá.
Chromatografia na kolóne keramického hydroxyapatitu je typ časticovej chromatografie, ktorá zo striktného hladiska nie je ani afinitnou ani ionomeničovou chromatografiou. Má vlastnosti týchto dvoch typov chromatografií a môže sa teda definovať ako pseudoafinitná alebo pseudoionomeničová chromatografia.
Nukleové kyseliny sa viažu na hydroxyapatit na základe interakcií medzi skupinami fosfátového skeletu a vápenatými zvyškami nosiča. Nukleové kyseliny sa môžu eluovať rôznymi spôsobmi s použitím rôznej iónovej sily fosfátových pufrov. Nukleové kyseliny sa môžu teda separovať od proteínov, DNA sa môže separovať od RNA a jednovláknová DNA sa separovať od dvoj vláknovej DNA. RNA sa viaže menej pevne a môže sa eluovať pufrom s relatívne slabou iónovou silou. Jednovláknová DNA sa slabšie fixuje ako dvojvláknová DNA, ktorá je pevnejšie viazaná na nosič a nepotrebuje silnejší pufor.
Biologický materiál vo fosfátovom pufri so slabšou iónovou silou sa nanesie na kolónu. Nukleové kyseliny DNA a RNA sa zachytia. Potom sa použije druhý pufor so zvýšenou iónovou silou na elúciu RNA, ktorá sa v tomto štádiu takmer úplne vylúči. Tretí pufor s vysokou iónovou silou sa použije na elúciu dvojvláknovej DNA, ktorá je žiadaná. Použitie hydroxyapatitu v metóde podlá vynálezu umožňuje získať dvoj vláknovú DNA, ktorá má vysoký stupeň čistoty.
Ako sa už naznačilo, spôsob uskutočnenia vynálezu obsahuje, okrem iného, etapu afinitnej chromatografie triple-helix.
Afinitná chromatografia triple-helix spočíva v prechode roztoku získaného na nosiči, na ktorom je kovalentne viazaný oligonukleotid schopný tvoriť hybridizáciu triple-helix so· špecifickou sekvenciou prítomnou na DNA, ktorá je určená na purifikáciu (WO96/18744).
Špecifická sekvencia môže byť sekvenciou prirodzene prítomnou na dvojvláknovej DNA alebo sekvenciou syntetickou, umelo vloženou do tejto kyseliny. Oligonukleotidy použité v predloženom vynáleze sú oligonukleotidy hybridizujúce priamo s dvojvláknovou DNA. Tieto oligonukleotidy môžu obsahovať nasledujúce bázy:
- tymidín (T) , ktorý je schopný tvoriť triplet s dubletom A.T dvoj vláknovej DA (Rajagopal a kol., Biochem 28 (1989) 7859),
- adenín (A), ktorý je schopný tvoriť triplet s dubletom A.T dvojvláknovej DNA, *
- protónovaný cytozín (C+), ktorý je schopný triplet s dubletom G. C dvoj vláknovej DNA (Rajagopal a kol., Biochem 28 (1989) 7859),
- uracil (U), ktorý je schopný tvoriť triplet s bázovými pármi A.U alebo A.T.
prítomná na
Použité oligonukleotidy obsahujú predovšetkým sekvencie homopyrimidínové, bohaté na cytozíny a špecifickú sekvenciu ktorá je homopurín-homopyrimidinovou
DNA, sekvenciou. Prítomnosť cytozínov umožňuje, že triple-helix je stabilný pri kyslom pH, keď sú cytozíny protonované a destabilizovaný v alkalickom pH, keď cytozíny sú neutrálne.
Na umožnenie tvorby triple-helix hybridizáciou je dôležité, aby oligonukleotid a špecifická sekvencia prítomná na dvoj vláknovej DNA boli komplementárne. Z tohto hladiska na získanie najlepších výťažkov najlepšej selektivity sa používa postup podlá vynálezu, v ktorom oligonukleotid a špecifická
I sekvencia sú úplne komplementárne. Môže isť konkrétne o oligonukleotid poly-CTT a špecifickú sekvenciu poly-GAA. Napríklad sa môže uviesť oligonukleotid so sekvenciou 5'GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG (CTT) 7) , (SEQ ID NO: 1), v ktorej bázy GAGG netvoria triple-helix, ale umožňujú oddialiť rameno oligonukleotidu na viazanie. Môže sa uviesť sekvencia (CTT)7 (SEQ ID NO: 2). Tieto dva oligonukleotidy sú schopné tvoriť triple-helix so špecifickou sekvenciou obsahujúcou komplementárne motívy (GAA). Môže ísť predovšetkým o oblasť obsahujúcu 7, 14 alebo 17 motívov GAA, ako je opísané v príkladoch.
Inou špecifickou sekvenciou záujmu je sekvencia:
5' -AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ ID. NO: 3)
L '
Táto sekvencia tvorí triple-helix s oligonukleotidom
5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ ID NO: 4) alebo
5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ ID NO: 5).
V tom prípade sa oligonukleotid fixuje v antiparalelnom smere polypurínového vlákna. Tieto triple-helixy sú stabilné iba v prítomnosti Mg24- (Vasquez a kol., Biochemistry, 1995, 34, 7243721, Beal a Dervan, Science 1991, 251, 1360-1363).
Ako sa už naznačilo, špecifická sekvencia môže byť sekvencia prirodzene : prítomná v dvojvláknovej 'DNA alebo syntetická sekvencia umelo vložená do tejto kyseliny. Predovšetkým je zaujímavé použitie oligonukleotidu schopného tvoriť triple-helix so sekvenciou prirodzene prítomnou na dvojvláknovej DNA, napríklad na počiatku replikácie plazmidu alebo v markerovom géne. Z tohto hladiska predkladatel uskutočnil analýzu plazmidovej sekvencie a ukázal, že určité oblasti tejto DNA, predovšetkým v počiatku replikácie, majú oblasti homopurín-homopyrimidínové. Syntéza oligonukleotidov schopných tvoriť triple-helix s týmito prirodzenými homopurínI homopyrimidínovými oblasťami umožňuje výhodne aplikovať postup podlá vynálezu na nemodifikované plazmidy, predovšetkým plazmidy komerčného typu pUC, pBR322, pSV, atď.. Ako homopurínhomopyrimidínové sekvencie prirodzene prítomné na dvojvláknovej DNA sa môžu uviesť sekvencie obsahujúce celok alebo časť sekvencie 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID NO: 6) nachádzajúce sa v oblasti replikácie ColEl E. coli. V tom prípade oligonukleotid tvoriaci triple-helix má sekvenciu: 5' GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ ID NO: 7) a fixuje sa alternatívne na dve vlákna dvojhelixu, ako je opísané (Bael a Dervan, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) ,, Jayasena a Johnston, Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Môže ísť tiež o sekvencie 5'GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 8) génu β-laktamázy plazmidu pBR322 (Duval-Valentin a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,, 1992,· 89, 504-508). Predovšetkým výhodné je použitie oligonukleotidu schopného tvoriť triple-helix so sekvenciou prítomnou na počiatku replikácie alebo v markerovom géne, pretože umožňuje purifikovať s rovnakým oligonukleotidom každú DNA obsahujúcu uvedený počiatok replikácie alebo uvedený značený gén. Nie je nutné teda modifikovať plazmid alebo dvojvláknovú DNA, aby sa zahrnula do umelej špecifickej sekvencie.
Aj keď budú uprednostnené sekvencie úplne komplementárne, môže sa tolerovať určité nespárovanie medzi sekvenciami oligonukleotidu a sekvenciou prítomnou na DNA, ktoré nie je veľkou stratou afinity. Môže sa; uviesť sekvencia 5'AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ ID NO: 9) prítomná v géne β-laktamázy E. coli. V tomto prípade tymidín, ktorý prerušuje polypurínovú sekvenciu, sa môže rozpoznať guanínom tretieho vlákna tvoriaceho triplet ATG, ktorý je stabilný, keď je sprevádzaný dvoma tripletmi TAT (Kiessling a kol., Biochemistry, 1992, 31, 28292834) .
Podľa spôsobu uskutočnenia, oligonukleotidy podľa vynálezu obsahujú sekvenciu (CCT)n, sekvenciu (CT)n alebo sekvenciu (CTT)n, v ktorých n zodpovedá hodnotám 1 až 15. Tiež sa môžu výhodne použiť sekvencie typu (CT)n alebo (CTT)n. Predkladáte! dokázal, že na výťažok purifikácie mal vplyv počet C v oligonukleotide. Ako je uvedené v príklade 7, výťažok purifikácie sa zvyšuje, keď oligonukleotid obsahuje menej cytozínov. Oligonukleotidy podľa vynálezu môžu mať tiež kombinácie motívov (CCT), (CT) alebo (CTT).
Použitý oligonukleotid môže byť prírodný (zlúčeniny na prirodzenom modi f i kovaný.
alebo chemicky obsahovať určité základe, nemodifikované)
Oligonukleotid môže výhodne chemické modifikácie umožňujúce zvýšiť jeho rezistenciu alebo jeho ochranu voči .nukleázam alebo zvýšiť svoju afinitu voči špecifickej sekvenčii. ' Podlá predloženého vynálezu sa tiež rozumie oligonukleotidom každé spojenie nukleotidov, ktoré majú modifikovaný skelet, aby sa získala väčšia rezistencia voči nukleázam. Ako možné modifikované oligonukleotidy sa môžu uviesť oligonukleotidy fosfotioátové, ktoré sú schopné tvoriť triplehelixy s DNA (Xodo a kol., Nucleic Acids Res. 1994, 22, 33223330), rovnako aj oligonukleotidy, ktoré majú skelet formacetálový alebo metylfosfonátový (Matteucci a kol., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768). Môžu sa tiež použiť oligonukleotidy syntetizované z α-anomérov nukleotidov,· ktoré tiež tvoria triple-helix s DNA (Le Doan a kol., Nucleic Acids
Res. 1987, 15, 7749-7760) .
fosforamidová väzba. Ako
Iná modifikácia skeletu je príklad sa môže uviesť internukleotidová väzba N3'-P5' fosforamidu opísaná v publikácii (Gryaznov a Chen, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3143-3144), ktorá poskytuje oligonukleotidy tvoriace s DNA velmi stabilný triplehelix. Ako ďalšie modifikácie skeletu sa môže uviesť použitie ribonukleotidov, 2'-O-metyribózy, fosfodiesteru, atď. (Sun a Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Fosfátový skelet sa môže nahradiť skeletom polyamidovým ako v PNA (Peptide Nucleic Acid), ktoré tiež môžu tvoriť triple-helixy (Nielsen a kol., Science, 1991, 254, 1497-1500), Kim a kol., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 6477-6481) alebo skeletom na základe guanidínu, ako v DNG (deoxyribonucleic guanidin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), ktoré sú polykatiónové analógy DNA, ktoré tiež tvoria triple-helix.
Tymidín tretieho vlákna sa môže tiež nahradiť 5brómuracilom, čím sa zvýši afinita oligonukleotidov voči DNA (Povsic a Derva, J. Am. Che. Soc., 1989, 111, 3059-3061). Tretie vlákno môže tiež obsahovať neprirodzené bázy, z ktorých sa môže uviesť 7-deaza-2'-deoxyxantozin (Meligan a kol.,. Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-deoxy-p-D-ribofuranozyl-5-aminolH-pyrazolo [4,3-cf] pyrimidín-7-on (Koh a Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oxodenin, 2-aminopurin, 2'-0metylpseudoizocytidin, alebo každá modifikácia odborníkom známa (pozri Sun a Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345356) .
Iný typ modifikácie oligonukleotidov je určený na zvýšenie interakcie alebo na zvýšenie afinity medzi nukleotidom a špecifickou sekvenciou. Modifikácia podlá vynálezu spočíva výhodne v metylácii cytozínov oligonukleotidu. Takto metylovaný oligonukleotid má schopnosť tvoriť stabilný triple-helix so špecifickou' sekvenciou v oblastiach pH blízkych neutrálnym hodnotám (>5). Tieto oligonukleotidy umožňujú teda pracovať pri zvýšenom pH v porovnaní s oligonukleotidmi vedľajších odborov, totiž pri pH, keď je nebezpečenstvo degradácie plazmidovej DNA druhoradé.
Dĺžka použitého oligonukleotidu v predloženom vynáleze je aspoň 3 bázy, výhodnejšie od 5 do 30 báz. Výhodne sa .používa 1 ' . · » r f oligonukleotid s dľžkou 10 báz. Dĺžka, sa môže prispôsobiť odborníkom, prípad od prípadu, funkcii selektivity a stability hľadanej interakcie.
Oligonukleotidy podľa vynálezu sa všetkými známymi technikami. Predovšetkým prostredníctvom syntetizátorov nukleových použiť akákoľvek iná metóda známa odborníkom môžu syntetizovať sa môžu pripraviť kyselín. Môže sa
Aby sa umožnila kovalentná väzba k náplni, oligonukleotid sa všeobecne funkcionalizuje. Môže sa modifikovať tiolovými skupinami, aminovými alebo karboxylovými v polohe 5' alebo 3' . Pridanie tiolovej skupiny, aminovej alebo karboxylovej umožňuje napríklad väzbu oligonukleotidu na nosič nesúci funkcie disulfidové, maleimidové, aminové, karboxylové, esterové, epoxidové, brómkyanové alebo aldehydové. Tieto väzby sa tvoria vystavením disulfidových, tioéterových, esterových, amidových alebo amínových väzieb medzi oligonukleotidom a náplňou. Môže sa tiež použiť akákoľvek iná metóda známa odborníkom, ktorá bifunkčne viaže reaktanty.
Na zvýšenie hybridizácie s viazaným oligonukleotidom môže byť výhodné, aby oligonukleotid obsahoval rameno a sekvencia báz medzerník. Použitie ramena umožňuje fixovať oligonukleotid vo vybranej vzdialenosti od náplne, ktorá umožňuje zlepšiť podmienky' interakcie' s DNA. Rameno' je výhodne tvorené ‘lineárnym uhlíkovým reťazcom, obsahujúcim 1 až 18, a prednostne 6 až 12 skupín (CH2) a jednu aminovú skupinu, ktorá umožňuje väzbu ku kolóne. Rameno je pripojené fosfátom oligonukleotidu alebo medzerníkom tvoreným bázami, ktoré neinteragujú s hybridizáciou. Medzerník môže obsahovať purínové bázy. Môže napríklad obsahovať sekvencie GAGG. Rameno je výhodne tvorené uhlíkovým lineárnym reťazcom, ktorý obsahuje 6 až 12 uhlíkových atómov.
Na uskutočnenie predloženého vynálezu sa použili rôzne typy nosiča. Predovšetkým to môžu byť chromatograficky funkčný voľne uložený nosič alebo dopredu naplnený v kolóne s plasticky funkčným povrchom alebo funkčnými magnetický alebo nemagnetický. Môže chromatografický nosič. Napríklad chromatografické nosiče, ktoré sa môžu použiť, sú agaróza, akrylamid, alebo Dextrán, rovnako aj ich deriváty (ako je Sephadex, Sepharose, Superose, polyméry ako poly(styrendivinylbenzén), alebo štepené latexovými guľôčkami, to byť predovšetkým ) , či neštepené silikagély. Chromatografické kolóny sa môžu sfunkčniť difúziou alebo perfúziou.
Na získanie lepších výťažkov purifikácie je predovšetkým výhodné použiť sekvenciu na plazmide, ktorá obsahuje viac hybridizačných pozícií s oligonukleotidom. Prítomnosť viacerých hybridizačných pozícií uprednostňuje interakcie medzi uvedenou sekvenciou a oligonukleotidom, následkom čoho sa zvyšuje výťažok purifikácie. Pre nukleotid obsahujúci n opakovaných modifikácií (CCT), (CT) alebo (CTT) sa prednostne použila DNA sekvencia obsahujúca aspoň n komplementárnych motívov a konkrétne, n+1 komplementárnych motívov. Sekvencia, ktorá nesie n+1 komplementárnych motívov poskytuje dve hybridizačné miesta k oligonukleotidu.' Sekvencia výhodne obsahuje až 11 hybridizačných miest, teda n + 10 komplementárnych motívov.
Podľa iného spôsobu uskutočnenia 'chromatografie na' kolóne keramického hydroxyapatitu, nasleduje za ňou alebo jej predchádza chromatografia na ionomeničovej kolóne. Prednostne sa používa slabá ionomeničová kolóna, silné ióny majú fixačné vlastnosti veľmi silné ku DNA a v tom prípade sa veľmi ťažko získava produkt (výťažok je menší ako 60%). To je dôvod, prečo predkladáte! používa slabú ionomeničovú kolónu, ktorá nezachytáva plazmidovú DNA, ale fixuje reziduálnu RNA.
Ako sa už naznačilo, postup podľa vynálezu obsahuje výhodne etapu diafiltrácie. Diafiltrácia je koncentračná etapa, v ktorej sa vylúči voda a malé molekuly (ako sú napr. soli, proteíny, nukleové kyseliny s malou veľkosťou), ktoré sú prítomné v čistom lyzáte. Soli sa nahradia fosfátovým pufrom na chromatografiu. Po diafiltrácii je roztok 5 až 50 krát koncentrovanejší ako pred diafiltráciou (koncentračný faktor závisí od objemu počiatočného roztoku).
Použitie diafiltrácie má viacero výhod. Umožňuje, okrem iného, vyhnúť sa použitiu organických rozpúšťadiel, ako je izopropanol, ktorého použitie je nevyhnutné pri antideflagračnej inštalácii. Táto technika je použiteľná predovšetkým na veľmi rozdielne objemy. Stačí zvýšiť povrch membrán so zvýšením
I určeného objemu.
Na diafiltráciu sa výhodne používa prístroj, ktorý má náplň tvorenú modifikovanou polyétersulfónovou membránou alebo modifikovanou acetyl regulovať počiatočný pórmi, ktoré sú v molekúl, ktoré môžu celulózovou membránou, ktoré umožňujú prietok. Tieto membrány sú definované nominálnej hodnote maximálnej veľkosti prejsť uvedenou membránou. Vzhľadom na skutočné veľkosti, membrána s pórmi 100 kD, umožňuje zachytiť molekuly s veľkosťou väčšou ako 30 kD.
Uprednostňovaný piostup podľa vynálezu obsahuje! nasledujúce etapy:
diafiltrácia i
chromatografia na!kolóne keramického hydroxyapatitu afinitná chromatografia špecifickou hybridizáciou medzi sekvenciou DNA a oligohukleotidom s tvorbou triplei-helix.
Postup podlá predloženého vynálezu sa môže použiť na i ' 1 I 1 purifikáciu každého typu dvojvláknovej DNA. Ide napríklad o
I ' kruhovú DNA, ako je plazmid, ktorý všeobecne nesie jeden alebo « | viac génov terapeutického významu. Tento plazmid môže tiež niesť • počiatok replikácie, márkerový gén, atd’. Tento postup umožňuje tiež purifikovať DNA, lineárnu alebo kruhovú, ktorá nesie sekvenciu záujmu so zmesou obsahujúcou DNA rôznych sekvencií.
í
DNA je produktom hostiteľského mikroorganizmu modifikovaného technikami rekombinantnej DNA. Z tohto hľadiska hostite! obsahujúci dvojvláknovú DNA, ktorá je predmetom záujmu, sa namnoží a amplifikuje. Používajú sa na to klasické fermentačné techniky, ktoré umožňujú získať veľkú hustotu buniek. Prednostne používanou technikou je technika nazývaná fed-batch, ktorá je podrobne opísaná v literatúre (Jung a kol., Ann. InstPasteur/Microbiol. 1988, 139, pl29-146, Bauer a kol., Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p81-94).
Po fermentácii nasleduje lýza buniek. Na lýzu buniek sa používa buď mechanický systém alebo chemický systém, za ktorými nasleduje koncentrovanie buniek podľa toho, či je potrebné pracovať so surovým bunkovým lyzátom alebo s čistým bunkovým lyzátom. Na mechanickú lýzu sa prednostne používa systém, ktorý nedenaturuje DNA (miešanie, tepelný šok, osmotický šok). Tieto metódy nie sú prispôsobené na extrakciu DNA z prokaryotických buniek. Mechanické pôsobenie použité na rozbitie prokaryotických buniek denaturuje DNA. Mechanická lýza sa prednostne používa pre eukaryotické bunky, pre prokaryotické bunky sa prednostne používa chemická lýza.
Prokaryotické bunky sa lyžujú známymi technikami všetkým odborníkom (detergenty, lyzozýmy, prípadne kombinované s tepelným šokom, ...). Prednostne sa používa zmes NaOH a SDS. Počas tohto pôsobenia sa pH pohybuje okolo 12. PH lyzátu takto získaného sa potom znova upraví na hodnotu 6, čo spôsobí zrážanie proteínov, časti chromozómovej DNA a RNA. Táto zrazenina sa odstráni odstredením.
Uprednostňovaný spôsob uskutočnenia vynálezu spočíva predovšetkým v opracovaní buniek, ktoré obsahujú dvojvláknovú DNA určenú na purifikáciu, chemickou lýzou, ktorá umožňuje získať čistý lyzát. Takto získaný koncentrát sa chromatografuje na kolóne keramického hydroxyapatitu.
Bunkový lyzát môže byť lyzát prokaryotických alebo eukaryotických buniek.
Čo sa týka prokaryotických buniek, môžu sa uviesť napríklad baktérie E. coli, B. subtilis, S. typhimurium alebo Streptomyces. Čo sa týka eukaryotických buniek, môžu sa uviesť zvieracie bunky, kvasinky, huby, atď., predovšetkým však kvasinky Kluyveromyces alebo Saccharomyces alebo bunky COS, CHO, C127, NIH3T3, atď..
Postup podľa vynálezu je výhodný predovšetkým, pretože i
umožňuje získať rýchlo a jednoducho plazmidovú DNA s vysokou čistotou. Ako je naznačené v príkladoch, postup umožňuje účinne separovať žiadanú plazmidovú DNA od zložiek kontaminantov ako sú fragmenty chromozómovej DNA, RNA, endotoxíny, proteíny, nukleázy, atď.. Postup podľa vynálezu umožňuje predovšetkým získať preparát dvojvláknovej DNA, konkrétne plazmidovej, prakticky bez chromozómovej DNA (<0,5%). Okrem toho obsahujú prípravky získanej DNA veľmi malé množstvá endotoxínov (<50 EU/mg),’čo je dostačujúce na farmaceutické použitie.
Predkladáte! prekvapujúco ukázal, že kombinácia týchto dvoch opísaných etáp, chromatografia na kolóne hydroxyapatitu, ktorá nasleduje alebo predchádza chromatografii Triple-Helix, umožňuje získať preparát plazmidovej DNA, ktorý obsahuje chromozómovú DNA v hodnotách 0,01%. Vynález sa tiež dotýka prípravy plazmidovej DNA, ktorá má obsah chromozómovej DNA menší alebo rovný 0,01%.
. Vynález sa tiež dotýka prípravy plazmidovej DNA, ktorá má obsah endotoxínov menší alebo rovný 50 EU/mg, konkrétne nižší ako 10 EU/mg. Obsah endotoxínov je teda nižší ako je povolený obsah, ktorý je 350 EU/injekciu pre človeka vážiaceho 70 kg (EU znamená Endotoxin Unit a je rovný 100 mg) .
Predložený vynález opisuje teda kompozície obsahujúce plazmidovú DNA farmaceutický použiteľnú predovšetkým v génovej alebo bunkovej terapii in vivo alebo ex vivo. Z tohto hladiska má vynález ako predmet vynálezu farmaceutickú kompozíciu, ktorá obsahuje dvojvláknovú DNA lineárnu alebo plazmidovú, pripravenú podlá opísaného postupu.
Kompozície môžu obsahovať nahú plazmidovú DNA alebo ' ' I ' spojenú s prenášačovým vektorom, ako sú napríklad lipozómy, nanočastice, katiónové lipidy, polyméry, proteíny alebo rekombinantné vírusy, atď..
Nasledujúce obrázky a príklady bližšie opisujú vynález, pričom neobmedzujú v akomkoľvek smere jeho rozsah.
Materiál a metódy
1. Konštrukcia plazmidu pXL2784
V príkladoch, ktoré nasledujú, sa použil špecifický plazmid pXL2784. Tento plazmid obsahuje kazetu obsahujúcu promótor z Cytomegalovírusu, gén kódujúci luciferázu a homopurínhomopyrimidínovú sekvenciu (GAA)i7. Konštrukcia tohto vynálezu je opísaná ďalej. Je evidentné, že postup opísaný podlá vynálezu, nie je obmedzený iba na opísaný plazmid.
1.1. Opis plazmidu pXL2784
Plazmid sa skonštruoval- z plazmidového vektora- pXL2675, (2,513 kb) , minimálneho replikónu plazmidu ColEl odvodeného z plazmidu pBluescript (ORI), ktorý má na selekciu transportný gén Tn5, ktorý kóduje rezistenciu voči kanamycínu. Plazmid pXL2784 obsahuje tiež homopurín-homopyrimidínovú sekvenciu (GAA)u pochádzajúcu z plazmidu pXL2563, ktorá sa môže viazať na oligomér (CTT)n, kde n = 1 až 17, aby sa lokálne vytvorila štruktúra triple-helix a umožnila sa afinitná purifikácia. Plazmid pXL2784 má lokus cer (382 bp) pochádzajúci z plazmidu ColEl a klonovaný v plazmide pXL565, lokus cer obsahuje oblastne špecifickú sekvenciu rekombináz XerC/XerD, čo vedie ku výslednému plazmidovému multiméru. Transgén klonovaný na plazmide pXL2784 je expresná kazeta (3,3 kb) génu luc, ktorá kóduje luciferázu z Photinus pyralis pod kontrolou promótora P CMV z ludského cytomegalovírusu a táto kazeta pochádza z plazmidu pXL2622.
Plazmid má veľkosť 6390 bp. Mapa plazmidu pXL2784 je ’ uvedená na Obrázku 1 a jeho detailná konštrukcia je opísaná ďalej .
1.2. Minimálny vektor pXL2675
Po odstránení prečnievajúcich Bsal koncov pôsobením Klenowovho fragmentu, sa fragment Bsal-PvuII plazmidu pBKS+ s veľkosťou 1,15 kb klonoval s 1,2 kb Smal fragmentom plazmidu pUCKIXX (Pharmacia), aby sa vytvoril plazmid pXL2647„
Oligonukleotid 5542:
5'-AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG AGCGGCCGCG AGCTCC-3' (SEQ ID NO: 10) a oligonukleotid 5543:
5'-AGCTGGAGCG CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT ATCCTGCAGC TCGAGA-3' (SEQ ID NO: 11) sa navzájom hybridizovali a potom klonovali do HindlII miesta pXL2647, čím sa vytvoril plazmid pXL2675. Tento plazmid » obsahuje multiklonovacie miesto HindlII, PstI, EcoRV, EcoRI, BamHI, Xbal, Nôti, SstI medzi počiatkom replikácie a génom kódujúcim rezistenciu voči kanamycínu.
1.3. Kazeta luciferázy v plazmide pXL2622
Promótor CMV obsiahnutý v 660 bp MluI-HindlII fragmente plazmidu pcDNA3 (Invitrogene) sa klonoval medzi miesta MlulHindlII základného plazmidu pGL2 (Promega, obsahuje gén luciferázy), aby sa vytvoril plazmid pXL2622.
í
1.4. Plazmidy, pXL2563 a pMLT22-TH. obsahujúce sekvenciu schopnú tvoriť triple-helix s oligonukleotidom ’ Oligonukleotid 4817:
5'-GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAGAA GAAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 12) a oligonukleotid 4818:
5'-ATTTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG-3' (SEQ ID NO: 13) sa hybridizovali navzájom ,a klonovali do -miest EcoRI a . BamHI plazmidu pBluescriptII- KS, aby sa vytvoril plazmid pXL2563. Fragment 62 bp EcoRI-BamHI sa klonoval do miest EcoRIBamHI plazmidu pMTL22 (P. Minton 1988 Gene 68: 139), aby sa vytvoril plazmid pMTL22-TH.
1.5. Plazmidy pXL565 pXL2781 obsahujúce lokus cer
Fragment Hpall veľký 382 bp z plazmidu ColEl (P-L Biochemicals) sa klonoval do miesta. , Accl plazmidu M13mp7 (Messing a kol., 1981, Nucleic Acids Res 9: 309), aby sa vytvoril plazmid pXL565. Fragment BamHI veľký 382 bp sa klonoval » do miesta BglII plazmidu pSL301 (Invitrogen), aby sa vytvoril plazmid pXL2781.
1.6. Konštrukcia plazmidu pXL2784
Fragment BamHI-XhoI plazmidu pXL2781 veľký 382 bp obsahujúci lokus cer sa klonoval v miestach BamHI a Xhol plazmidu pXL2657, aby sa vytvoril plazmid pXL2782.
Fragment BglII-BamHI plazmidu pMTL22-TH 62 bp obsahujúci sekvenciu (GAA)i7 sa klonoval v mieste BamHI plazmidu 1 pXL2782, aby sa vytvoril plazmid pXL2783.
Fragment Sall-Spel 3,3 kb plazmidu pXL2622 obsahujúci kazetu luciferázy sa klonoval v miestach Xhol a NheI plazmidu pXL2783, aby sa vytvoril plazmid pXL2784. Očakáva sa, že sa môže vložiť v mieste kazety luciferázy akákoľvek iná expresná kazeta génu luciferázy.
Kmeň DH1 (Maniatis a kol., 1989) obsahujúci tento plazmid, sa kultivoval vo fermentore s obsahom 21, 7 1 až 800 1. Môžu sa použiť tiež iné kmene.
2. Fermentácia
Hostite! obsahujúci plazmidovú DNA na kultiváciu sa môže získať klasickými metódami fermentácie (Jung a kol., Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 1988, 139, pl29-146, Bauer a kol, Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p81-94), pričom sa uprednostňuje technika fedbatch. Po fermentácii v laboratórnom meradle, to znamená pre objemy menšie ako 5 1,, sa získané bunky klasicky odstredia (2é > í ' ' min pri 1000 rpni) alebo sa odstredia kontinuálne pre väčšie objemy (priemyselné objemy, ktoré môžu dosahovať až niekoľko stoviek litrov). Takto získané bunky sa môžu použiť hneď alebo po zmrazení na -80 °C.
3. Chemická lýza
Bunky sa môžu zmraziť a potom lyžovať. Chemická lýza sa skladá z troch etáp. Prvá etapa spočíva vo vložení bunkovej suspenzie do pufru 25mM Tris pH 6,8, 50mM glukóza, lOmM EDTA alebo jeho ekvivalentu. Lýza buniek sa teda uskutočňuje v zmesi obsahujúcej 0,2M NaOH a 1% SDS. pH roztoku sa pohybuje okolo 12. Výber iónového detergentu je dôležitý, pretože neiónový detergent dáva 10 krát nižšie výťažky extrakcii. Lýza je nasledovaná pseudoneutralizáciou prostredia v prítomnosti octanu draselného (konečné pH roztoku je medzi 5,5 až 6). Následkom tejto acidifikácie prostredia sa vytvorí zrazenina, ktorá Obsahuje proteíny, časti chromozómovej DNA a RNA. Toto zrážanie je spôsobené reakciou dodecylsulfátu sodného (SDS) s octanom 'draselným, ktoré tvorí bielu zrazeninu dodecylsulfátu sodného.
Zrazenina sa musí odstrániť. Preto sa postupuje tak, že sa odstreďovanie uskutočňuje v nádobách (15 minút pri 8000 rpm), ak je odstreďovaný objem menší ako 5 litrov, alebo kontinuálnym spôsobom, ak sú objemy vyššie ( > 5 litrov ) . Iná metóda na elimináciu supernatantu spočíva v zlepšení filtrácie s veľkosťou pórov väčšou alebo rovnou 20 μια (PALL, profil II použiť podľa odporučenia dodávateľa) .
4. Diafiltrácia
Supernatant získaný chemickou lýzou sa zozbiera na diafiltráciu, aby sa plazmidová DNA zakoncentrovala a aby sa odstránili molekuly s malou molekulovou hmotnosťou, predovšetkým soli, ktoré sú prítomné vo vysokej koncentrácii. Táto diafiltrácia sa uskutočňuje na membráne s veľkosťou pórov medzi 50 až 300 kD podlá veľkosti plazmidov. Prednostne sa používa u membrána s veľkosťou pórov 100 kD. Hodnota 100 kD je nominálne danou hodnotou pre proteíny, ktoré sú globulárne. Je potrebné, aby pre molekuly nukleových kyselín, ktoré majú priestorovú štruktúru rôznu, sa odstránili všetky molekuly s molekulovou hmotnosťou menšou ako 30 kD. Množstvo prítomnej DNA v roztoku po diafiltrácii a množstvo prítomnej DNA v čistom lyzáte sa meria pomocou HPLC. Výťažok tejto etapy je vyšší alebo rovný 80%.
V priebehu diafiltrácie sú odstránené soli. Sú nahradené lOmM fosfátovým pufrom. Produkt sa teda môže aplikovať priamo na chromatografickú kolónu, konkrétne na Ceramic Hydroxyapatite™.
Plazm.idová DNA pochádzajúca z afinitnej chromatograf ie triple-helix sa opäť diafiltruje, aby sa zakoncentrovala vzorka a odstránili sa nežiaduce soli. Umožňuje to ekvilibrovať produkt v pufri s vhodným zložením. Preto je účinná diafiltrácia na membráne s pórmi s veľkosťou 10 až 50 kD. Výťažok je vyšší ako 80%.
Vzorka sa potom sterilné filtruje a pripraví na analýzy pred formuláciou.
5. Chromatografia na kolóne Ceramic Hydroxyapatite™
Gél Ceramic Hydroxyapatite™ sa naplnil do kolóny s vhodnou veľkosťou, ktorá je prispôsobená objemu vzorky na purifikáciu a čistote vzorky na začiatku chromatografie. Pomocou HPLC sa meria množstvo DNA v mg/ml prítomné v roztoku na začiatku chromatografie, aby sa určila veľkosť kolóny a objem gélu. Stanoví sa, že minimálne 0,1 mg DNA sa fixuje na ml hydroxyapatitu, pričom táto hodnota sa môže meniť až na 1 mg v závislosti na množstve RNA prítomnej v roztoku na začiatku. RNA sa fixuje na gél viac ako sa môže fixovať DNA. RNA sa odstráni rôznou elúciou. Kolóna sa ekvilibruje 'fosfátovým pufrom so slabou iónovou silou (lOmM). Vzorka sa nanesie na gél pri lineárnom prietoku 50 cm/h. Gél sa potom pripraví na premytie fosfátovým pufrom so zvýšenou vodivosťou (150mM). Hlavná časť DNA získaná zo vzorky sa v tomto štádiu vylúči. Plazmidová DNA sa eluuje ďalším zvýšením vodivosti fosfátového pufru (250mM). Posledné kontaminácie sa odstránia aplikáciou 0,5M NaOH, ktorý sa neutralizuje fosfátovým pufrom s molárnou silou (500mM) pred prípadným opätovným použitím kolóny. V prípade farmaceutickej produkcie má táto náplň výhodu, že sa môže podliehať chemicky dekontaminovať, pretože je rezistentná voči 0,5M NaOH, čo je klasický purifikačný činiteľ pri chromatografii, a je tiež rezistentná voči vysokej koncentrácii etanolu.
; Výsledok použitia keramického hydroxyapatitu je výborný. Táto etapa postupu umožňuje vylúčiť viac ako 80% RNA, 99,9% chromozómovej DNA a znížiť obsah endotoxínov s faktorom 1000.
Táto technológia poskytuje použitie každého enzýmu hovädzieho v
pôvodu alebo iného pôvodu (nie RNázu ani proteázu K); okrem toho „ ich rezistencia hydroxyapatitu voči chemickým činiteľom ho umožňuje použiť dnes viac ako 40 krát bez problémov reprodukovateľnosti. Výťažok chromatografie je vyšší alebo rovný
80%.
6. Afinitná chromatografia s tvorbou triple-helix
6.1. Príprava kolóny
Materiál: Použitá kolóna je kolóna HiTrap aktivovaná 5 ml NHS (N-hydroxysukcinimid, Pharmacia), spojená s peristaltickou pumpou (začiatok 1 ml/min). Použitý špecifický oligonukleotid má na 5' konci NH2 skupinu.
Pufre, ktoré sa použili v tomto príklade, sú nasledovné:
- Väzbový pufor: 0,2M NaHCO3, Ó,5M NaCl, pH 8,3
- Pufor A: 0,5M etanolamín, 0,5M NaCl, pH 8,3
- Pufor B: 0,lM octan draselný, 0,5M NaCl pH 4.
Metóda: Kolóna sa premyje s 30 ml lmM HC1, potom sa nariedený oligonukleotid vo väzbovom pufri (250 nmol v 5 ml) aplikoval na kolónu a ponechal 30 minút pri teplote okolia. Kolóna sa 3 krát premyje s 30 ml pufru A, a potom s 20 ml pufru
B. Oligonukleotid sa takto kovalentne viazal na kolónu väzbou CONH. Kolóna sa skladuje pri teplote 4 °C a môže sa použiť minimálne štyrikrát.
6.2. Purifikácia plazmidu j · ·
Materiál:
* Plazmid pXL2784 (opísaný v kapitole 1) sa purifikoval na kolóne HiTrap spojenej s oligonukleotidom opísaným v kapitole 7.1. Pufre, ktoré sa použili v tomto príklade, sú nasledovné:
- Pufor F: 2M NaCl, 0,2M octan draselný, pH 4,5
- Pufor E: IM Tris pH 9, 0,5mM EDTA
Metóda: . ‘
Kolóna sa premyla pufrom F, potom sa aplikoval roztok, ktorý obsahuje plazmid, na kolónu a ponechal sa minimálne dve hodiny temperovať pri teplote okolia. Kolóna sa premyla pufrom F a elúcia sa uskutočňovala s pufrom E.
7. Ionomeničová chromatografia
Prečistená vzorka sa pripravila na chromatografiu na slabej ionomeničovej kolóne. Silné anióny majú vlastnosť velmi silno fixovať DNA, a to až tak, že sa iba velmi ťažko znovu získava - produkt (výťažok je teda menší ako 60%) . To je dôvod, prečo predkladatel používa slabé ionexy, ktoré nezachytávajú plazmidovú DNA, ale fixujú zvyšky RNA. Prednostne sa mohol použiť slabý anex typu DEAE Sepharose alebo DEAE hyper D alebo ekvivalenty. Gél sa ekvilibroval v lOmM fosfátovom pufri, vzorka pochádzajúca z chromatografie na Ceramic Hydroxyapatite sa priamo aplikovala na gél. Fixovaná RNA sa potom odstráni aplikáciou koncentrovaného roztoku NaCl. Chemická dekontaminácia sa môže uskutočniť s 0,5M NaOH roztokom, čo umožní pracovať pri dobrých hygienických podmienkach (odstránenie endotoxínov a nebezpečenstvo mikrobiálnej kontaminácie) .
8. Stanovenie plazmidovej DNA v komplexných vzorkách HPLC
Predmetom tejto metódy je možnosť určiť množstvo * plazmidovej DNA v priebehu rôznych etáp purifikácie, aby sa určil výťažok. Môže sa tiež kvalitatívne a kvantitatívne posúdiť účinnosť rôznych operácií.
Použité techniky sú nasledovné:
Chromatografická náplň je gél Poros R2 od firmy Perseptive Biosystems. Ide o polystyrendivinylbenzénovú náplň s veľkosťou častíc 10 μπι. Veľkosť fúznych pórov je 6000 až 8000 Angstrómov, véľkosť difúznych pórov je 500 až 1000. Objem gémú je 1,7 ml.
Ide o chromatografiu iónových párov. Systém roztoku je voda, trietylamín acetát pH 7,1 / trietylamín acetát acetonitril 90%.
Prietok je 3 ml/min. Definoval sa gradient na rozlišovanie plazmidovej DNA od RNA.
„ Referenčná vzorka je plazmidová DNA purifikovaná na Qiagen podľa odporučenia výrobcu. Na agarózovom géli táto vzorka obsahuje iba ocDNA a cccDNA. V HPLC nedáva viac ako jeden samotný pík. Koncentrácia sa určila meraním jeho DO pri 260 nm a za sa zobrala 1 jednotka DO = 50 pg/ml DNA.
Injikovalo sa teda narastajúce množstvo produktu, aby sa vytvorila kalibračná stupnica.
Plocha píkov zodpovedajúcich retenčným časom referenčnej DNA sa porovnala s kalibračnou stupnicou. Takto sa môže stanoviť množstvo purifikovanej DNA.
9. Stanovenie zvyškovej chromozómovej DNA
Zvyšková genómová DNA sa kvantifikuje s PCR s použitím primerov pre gén galK E. coli. Sekvencia primerov pre gén galK E. coli je (Debouck a kol., Nucleic Acids Res., 1985, 13, 18411853) :
5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEQ ID NO: 14) a 5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (SEQ ID NO: 15)
Reakčné prostredie pre PCR (Promega, Francúzsko,
Charbonnieres) obsahuje v pufri: l,5mM MgC12; 0,2mM; dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 μΜ primery, 20U/ml Taq polymeráza (Promega). Reakcia sa uskutočnila podlá sekvencií:
- 5 minút pri teplote 90 °C
- 30 cyklov 10 sekúnd pri teplote 95 °C sekúnd pri teplote 60 eC 1 minúta pri teplote 78 °C
- 10 minút pri teplote 78 °C
Fragment amplifikovanej DNA s dĺžkou 124 bázových párov sa elektroforeticky separoval v 3% agarózovom géli v prítomnosti SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA), potom sa kvantifikoval porovnaním so stupnicou genómovej DNA Ultrapur E. coli, kmeň B (Sigma, ref. D4889).
10. Transfekcia cicavčích buniek in vitro
Táto metóda sa použila na určenie biologickej aktivity plazmidu purifikovaného metódou podlá vynálezu. Použité bunky sú NIH3T3, namnožené večer pred pokusom na kultivačných miskách s 24 jamkami s počtom 50000 buniek na jamku. Plazmid sa riedil s 150mM NaCl a zmiešal s lipofektantom. Pomer pozitívnych nábojov ku negatívnemu náboju DNA je rovný 3. Zmes sa zamieša, nechá sa desať minút temperovať pri teplote okolia, nariedi sa v kultivačnej pôde, odstráni sa hovädzie fetálne sérum, potom sa pridá k bunkám v množstve 1 gg DNA na kultivačnú jamku. PO dvoch . hodinách pri teplote 37 °C sa pridá 10 % obj./obj. hovädzieho fetálneho séra a bunky sa inkubujú 48 hodín pri teplote 37 °C v prítomnosti 5% CO2. Bunky sa dvakrát premyjú s PBS a aktivita luciferázy sa meria podľa opísaného protokolu (súprava Promega, Promega Corp., Madison, WI) na luminometri Lumat LB9501 (EG a G Berthold, Evry). Proteíny sa stanovili BCA technikou (Pierce,
Interchim, Asniéres).
11. Rôzne techniky
Získané plazmidy analyzované elektroforézou v agarózovom géli a farbené s etídiumbromidom sa detegujú vo forme jedného pruhu kruhovej superhelixovej DNA. Nedetegovala sa žiadna stopa DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou (chromozómová) ani RNA.
Koncentrácia proteínov vo vzorke sa merala .Micro-BCA ; (Pierce) podľa odporučenia výrobcu.
Koncentrácia endotoxínov sa stanovila s LAL (Biosepra) podľa odporučenia výrobcu.
Klasické metódy molekulovej biológie, ako je štiepenie reštrikčnými enzýmami, gélová elektroforéza, transformácia E. coli, zrážanie nukleových kyselín, atď., sú v literatúre opísané (Maniatis, T., E. F. Fritsch, a J. Sambrook, 1989, Molecular cloning: laboratory manual, druhé vydanie. Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman a K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Wiley and Sons, New York). Nukleotidové sekvencie sa určili metódou terminácie reťazca uvedenou v opísanom protokole (Ausubel a kol.,).
Reštrikčné enzýmy dodala firma New-England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).
Na ligáciu sa fragmenty DNA inkubovali v pufri 50mM TrisHC1 pH 7,4; lOmM MgCl2, lOmM DTT, 2mM ATP v prítomnosti T4 DNA ligázy (Biolabs).
Oligonukleotidy sa syntetizovali s použitím chémie fosforamidov chránených v kyanoetylovou skupinou polohe β (Sinha, N. D., J. Biernat,J. McManus a H. Kôster, 1984. Polymér support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of 3-cyanolethyl-N,Ndialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite od deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res. 12, 4539-4557; Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.) s použitím automatizovaného syntetizátora DNA Biosearch 8600 podlá odporučenia výrobcu.
1 ' , - · '
DNA po ligácii alebo DNA určená na testovanie účinnosti transformácie sa použili na transformovanie kmeňa E. coli DH5a [F/endAl, hsdR17, supE44, thi-1, gyrA96, relAl, A(lacZYAargF)U169, deoR, F80dlac (lacZAM15)].
Minipreparácia plazmidovej DNA sa uskutočnila podlá protokolu Klein a kol., 1980.
Kultivačná pôda LB sa použila na kultiváciu kmeňa E. coli (Maniatis a kol., 1982). Kmene sa inkubovali pri teplote 37 ’C. Baktérie sa rozotreli na kultivačných miskách s LB pôdou doplnenou s vhodnými antibiotikami.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Purifikácia plazmidovej DNA na keramickej hydroxyapatitovej kolóne
1.1. Príprava čistého lyzátu
Materiál:
Roztoky, ktoré sa použili v tomto príklade sú nasledovné:
roztok 1: 25mM Tris pH 6,8, 50mM glukóza, lOmM EĎTA roztok 2: 0,2M NaOH a 1% SDS roztok 3: 3M octan draselný pH 5
Metóda:
200 g buniek sa rozsuspendovalo v 2200 ml roztoku 1. Potom sa pridal roztok 2 (tiež 2200 ml) . Potom sa pridalo 1100 ml roztoku 3) Takto vytvorená zrazenina sa odstred’ovala 30 .minút pri 9000 rpm. Získalo sa 5200 ml supernatantu.
1.2. Diafiltrácia
Materiál: Membrána Maximate (Filtron), veľkosť pórov 100 kD ma povrchu 1860 cm2.
Pufor: lOOmM fosforečnan sodný, pH 6,8
Metóda:
Membrána sa po použití chemicky dekontaminovala s 0,5M NaOH počas 1 hodiny. NaOH sa potom odstránil vodou ppi.
Supernatant takto získaný v etape 1.1 sa koncentroval asi 10 krát, potom sa diafiltroval proti štvornásobnému objemu lOOmM fosfátového pufru a pH 6,8. Výsledný objem je 810 ml. Vzorka obsahuje 224 mg plazmidovej DNA určenej pomocou HPLC:
1.3. Purifikácia na Ceramic Hydroxyapatite™
Materiál:
Pufre, ktoré sa použili v tomto príklade, sú nasledovné:
Pufor A - lOmM fosfátový pufor pH 6,8 .
Pufor B = 150mM fosfátový pufor pH 6,8
Pufor C = 250mM fosfátový pufor pH 6,8
Pufor D = 500mM fosfátový pufor pH 6,8
0,5M NaOH
Metóda:
Kolóna (priemer 113 mm a dĺžka 17 cm) obsahuje· 1700 ml
I gélu. , ' ' '·.·'··
Pred použitím sa gél 1 hodinu chemicky dekontaminoval s O,5M hydroxidom sodným. NaOH sa potom odstránil aplikáciou pufru D. Kolóna sa ekvilibrovala s pufrom A.
Na gél sa aplikovalo 610 ml pochádzajúcich z dopredu získaných 810 ml (t.j. 171 mg). Na začiatku je prietok 60ml/min. Gél sa potom premyl so 6 1 pufru B. Produkt sa eluoval aplikáciou pufru C. Objem eluátu bol 1520 ml a obsahoval 147 mg plazmidovej DNA (určenej s HPLC).
Gél sa potom regeneroval premytím s 0,5M hydroxidom sodným a potom pufrom D. Gél sa takto pripravil na nový cyklus. 1
Tieto operácie sa sledovali UV spektrometriou pri 254 nm.
1.4 Purifikácia na DEAE Sepharose
Materiál:
Pufor, ktorý sa použil v tomto príklade je nasledujúci:
Pufor A IM NaCl a 0,5M NaOH
Metóda:
Kolóna (priemer 50 mm a dĺžka 6 cm) obsahuje 110 ml gélu.
Pred použitím bol gél podrobený chemickej dekontaminácii 0,5M hydroxidom sodným počas jednej hodiny. NaOH je potom vylúčený aplikáciou IM NaCl. Kolóna je ekvilibrovaná pufrom A.
1130 ml vzniknutých z 1520 ml (t.j. 110 ml) získaných skôr sa aplikovalo na gél s počiatočným prietokom 50 ml/min. Nakoľko DNA nie je zadržaná/ výtok sa zozbiera (1036 nil) a obsahuje 104 mg DNA. Získané produkty na géli sú potom eliminované roztokom IM NaCl. Gél je takto pripravený na novú operáciu.
Tieto operácie sa sledovali UV spektrometriou pri 254 nm.
1.5. Diafiltrácia
Materiál:
Membrána Ultrasette (Filtron), veľkosť pórov 30 kD na povrchu 860 cm2.
Pufor: voda ppi
Metóda:
Pred použitím sa membrána 1 hodinu chemicky dekontaminovala s 0., 5M NaOH. NaOH sa potom eliminoval s vodou ppi. 720 ml produktu získaného v predchádzajúcej etape sa trikrát zakoncentrovalo, potom sa dvakrát diafiltrovalo oproti štvornásobnému objemu vody ppi. Konečný objem je 210 ml. Vzorka obsahuje 62 mg plazmidovej DNA určenej HPLC.
1.6. Charakteristika DNA
Metóda opísaná ďalej umožňuje získať plazmid dostatočne čistý. Stanovili sa rôzne prímesi vo vzorke a určili sa ako:
- RNA: nedetegovatelná v agarózovom géli alebo s HPLC
- chromozómová DNA určená s PCR: 0,5%
- superhelixová DNA určená s HPLC: 80%
- endotoxíny (LAL) 50 EU/mg
- proteíny (microBCA) 1 gg/ml
- biologická aktivita in vitro:
pXL2784 'časť 42DNA95 : 20xl06 RLU/gg proteínov (v porovnaní • s rovnakým plazmidom purifikovaným v gradiente chloridu cézneho = 13xl06 RLU/μς proteínov).
1.7. Varianty
Postup ďalej opísaný sa opakoval pri podmienkach uvedených v etape 1.1 a namiesto odstreďovania sa doplnil filtráciou na membráne. Tento variant postupu umožňuje získať plazmid farmaceutickej čistoty, ktorého charakteristika je nasledovná:
- RNA: nedetegovateľná v agarózovom géli alebo s HPLC
- chromozómová DNA určená s PCR: 0,5%
- superhelixová DNA určená s HPLC: 70%
- endotoxíny (LAL) 50 EU/mg
- proteíny (microBCA) 1 pg/ml
Príklad 2: Purifikácia hydroxyapatitového eluátu afinitnou triple-helix chromatografiou
2.1. Príprava afinitnej kolóny
Použitá kolóna je kolóna HiTrap aktivovaná s 5 ml NHS (N-hydroxysukcimid, Pharmacia), spojená s peristaltickou pumpou. Použitý špecifický oligonukleotid má skupinu NH2 na 5' konci. Jeho sekvencia je nasledovná:
5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1).
Použité pufre v tomto príklade sú nasledovné:
- Väzbový pufor: 0,2M NHCO3, 0,5M NaCl, pH 8,3 )
- Pufor A: Ό/5Μ etanolamín, 0,5M NaCl, pH '8,3
- Pufor B: O,1M octan draselný, 0,5M NaCl, pH 4.
Kolóna sa premyla s 30 ml lmM HC1, potom sa aplikoval zriedený vo väzbovom pufri oligonukleotid (250 nmol v 5 ml) na kolónu a ponechal 3o minút pri teplote okolia. Kolóna sa premyla 3 krát s 30 ml pufru A a potom s 20 ml pufru B. Oligonukleotid sa takto kovalentne viazal ku kolóne väzbou CONH. Kolóna sa skladovala pri teplote 4 °C.
2.2. Purifikácia plazmidu
Pufre, ktoré sa použili v tomto príklade, sú nasledovné:
- Pufor F: 2M NaCl, 0,2M acetát, pH 4,5
- Pufor E: IM Tris pH 9, 0,5mM EDTA
Kolóna dopredu upravená s 2M NaCl pH 4,5, sa ekvilibrovala v pufri F, potom sa 9 ml hydroxyapatitového eluátu získaného pri podmienkach opísaných v príklade 1.3. aplikovalo v slučke na kolónu cez noc pri teplote okolia (začiatok 0,5ml/min). Kolóna sa premyla pufrom F a potom sa elúcia uskutočnila s pufrom E. DNA sa detegovala UV spektrometricky pri 254 nm.
2.3. Charakteristika purifikovanej DNA
Purifikovaná DNA analyzovaná pomocou HPLC (metóda je ďalej opísaná) je vyjadrená vo forme jedného piku s retenčným časom 24,8 min. Nedetegoval sa žiadny obsah RNA. Purifikovaná DNA nevykazuje žiadny detegovateľný obsah RNA po elektroforéze v 1% agarózovom géli s detekciou etídiumbromidom.
DNA sa tiež analyzovala ionomeničovou chromatografiou na kolóne Gen-Pak Waters, ktorý oddeluje relaxovanú DNA od superhelixovej DNA. Purifikovaná vzorka obsahuje 97% superhelixovej DNA oproti 80% superhelixovej DNA v’ kontrolnej vzorke.
Genómová DNA E. coli sa kvantifikovala s PCR podlá techník opísaných v paragrafe 3: DNA purifikovaná na afinitnej kolóne obsahuje okolo 0,01% genómovej DNA.
Príklad 3
3.1. Purifikácia plazmidu
Používa sa afinitná kolóna tak, ako je opísané v príklade 2 s oligonukleotidovou sekvenciou:
5'-CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' (SEQ ID NO: 2).
t ,
Pufre, ktoré sa použili v tomto príklade, sú nasledovné:
- Pufor F: 2M NaCl, 0,2M octan draselný pH 4,5 . - Pufor E: IM Tris pH 9, 0,5mM EDTA.
Kolóna sa ekvilibrovala v pufri F, potom sa pridalo 0,8 mg purifikovaného plazmidu podlá protokolu v príklade 1.7, nariedeného v 10 ml pufru F. Vzorka sa aplikovala slučkou na kolónu cez noc pri teplote okolia (prietok 0,5 ml/min). Kolóna sa premyla pufrom F a potom sa elúcia uskutočnila s pufrom E. DNA sa detegovala UV spektrometricky pri 254 nm.
3.2. Charakteristiky purifikovanej DNA
Získaná DNA sa analyzovala ionomeničovou chromatografiou na kolóne Gen-Pak Waters, ktorá oddeľuje relaxovanú DNA od superhelixovej DNA. Purifikovaná vzorka obsahuje 100% superhelixovej DNA oproti 72% superhelixovej DNA v kontrolnej vzorke na afinitnej kolóne.
Genómová DNA E. coli sa kvantifikovala s PCR podľa opísaných techník: DNA purifikovaná na afinitnej kolóne obsahuje okolo 0,01% genómovej DNA oproti 0,3% vo vzorke na afinitnej kolóne.
Príklad 4: Zmena stupnice afinitnej chromatografie triple-helix po purifikácii hydroxyapatitového eluátu (pXL2784)
4.1. Príprava afinitnej kolóny
Použitá kolóna je kolóna obsahujúca Sepharose 4 Fast Flow aktivovaná s NHS (N-hydroxysukcinimid, Pharmacia) spojená s oligonukleotidom so sekvenciou:
5'-CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3,'. ((CTT)7 SEQ ID NO: 1)
I í podlá metódy opísanej v príklade 2.1.
Kolóna (priemer 26 mm, dĺžka 16 cm) obsahuje 80 ml gélu a je spojená s peristaltickou pumpou.
4.2. Purifikácia plazmidu
Pufre, ktoré sa použili v tomto príklade, sú nasledovné:
- Pufor F: 2M NaCl, 0,2M octan draselný pH 4,5
- Pufor E: IM Tris pH 9, 0,5mM EDTA.
j :
Kolóna sa ekvilibrovala v pufri F, potom sa aplikovalo 135’ ml, t. j. 8 mg hydroxyapatitu získaného pri podmienkach v príklade 1.3 dopredu upraveného s 2M NaCl pH 4,5 na kolónu (začiatok 1,25 ml/min) so štvornásobnou recirkuláciou. Kolóna sa premyla pufrom F a elúcia sa potom uskutočnila s pufrom E. DNA sa detegovala UV spektrometricky pri 2545 nm: získalo sa 2,2 mg.
4.3 Charakteristiky purifikovanej DNA ’ 1 , ' I
Purifikovaná DNA analyzovaná pomocou HPLC (metóda je ďalej opísaná) je vyjadrená vo forme jedného piku s retenčným časom 24,4 min. Nedetegoval sa žiadny obsah RNA. Po elektroforéze v 1% agarózovom géli s detekciou etídiumbromidom, purifikovaná DNA nevykazuje žiadny detegovatelný obsah RNA.
DNA sa tiež analyzovala ionomeničovou chromatografiou na kolóne Gen-Pak Waters, ktorá oddeľuje relaxovanú DNA od superhelixovej DNA. Purifikovaná vzorka obsahuje 100% superhelixovej DNA oproti 94% superhelixovej DNA v kontrolnej vzorke.
Genómová DNA E. coli sa kvantifikovala s PCR podľa techník opísaných v paragrafe 3:' DNA purifikovaná na afinitnej kolóne i obsahuje okolo 0,02% genómovej DNA oproti 2% v kontrolnej vzorke.
Príklad 5: Purifikácia vysokého stupňa plazmidovej DNA na keramickej hydroxyapatitovej kolóne
5.1. Príprava čistého lyzátu
Čistý lyzát sa pripraví tak, ak sa opísalo v príklade 1.1 z bakteriálnej bunkovej kultúry E. coli transformovanej s plazmidom pXL2774. Plazmid pXL2744 má redukovanú veľkosť (okolo 4^5 kb) a obsahuj e'konkrétne:
- expresnú kazetu génu Luc (promótor CMV-luc-poly(A)+)
- marker selekcie sup Phe
- počiatok replikácie ori γ R6K
- fragment cer ColEl
Metóda:
. S '
456 g buniek sa rozsuspendovalo v 5000 roztoku 1. Potom sa pridal roztok 2 (5500mi). Pridalo sa 2500 ml roztoku 3. Takto vytvorená zrazenina sa odstránila 30 min. odstredením pri 9000 rpm alebo filtráciou. Získalo sa 12,3 1 supernatantu.
5.2. Diafiltrácia
Materiál
Membrána Maximate (Filtron) s veľkosťou pórov 100 kD na povrchu 18 60 cm2.
Pufor: lOOmM fosforečnan sodný pH 6,8
Metóda:
Vzorka sa diafiltrovala podľa metódy opísanej v príklade
1.2.
Konečný objem je 945 ml. Vzorka obsahuje 235 mg plazmidovej DNA určenej pomocou HPLC.
5.3. Purifikácia na Ceramic Hydroxyapatite™
Materiál:
Pufre, ktoré sa použili v tomto príklade, sú nasledovné:
Pufor A = lOmM fosfátový pufor pH 6,8
Pufor B = 150mM fosfátový pufor pH 6,8
Pufor C = 250mM fosfátový pufor pH 6,8
Pufor D = 500mM fosfátový pufor pH 6,8
0,5M NaOH
Metóda:
Kolóna (priemer 100 mm a dĺžka 23 cm) obsahuje 1700 ml gélu. Po použití sa gél 1 hodinu dekontaminuje s 0,5M NaOH. NaOH sa odstráni aplikáciou pufru D. Kolóna sa ekvilibruje s pufrom
A.
Na gél sa nanieslo 475 ml, ktoré pochádzajú z dopredu získaných 945 ml (t. j. 128 mg). Prietok je 6 ml/min. Gél sa potom premyje so 6 1 pufru B. Produkt sa eluuje aplikáciou pufri C. Objem eluátu je 1760 ml a obsahuje 100 mg plazmidovej DNA (určenej s HPLC).
I · · · '
Gél sa potom regeneruje premytím s 0,5M NaOH a následne s pufrom D. Gél je takto pripravený na nový cyklus.
5.4. Diafiltrácia
Diafiltrácia sa uskutočnila podlá protokolu opísaného v príklade 1.5.
5.5. Charakteristiky DNA
Postup opísaný ďalej umožňuje získať plazmid s dostatočnou čistotou. Stanovili sa rôzne prímesi vo vzorke ä určili sa ako:
- RNA: nedetegovatelná v agarózovom géli
- chromozómová DNA určená s PCR: 0,6%
- superhelixová DNA určená s HPLC: 87%
- endotoxíny (LAL) 50 EU/mg
- proteíny (microBCA) 1 gg/ml
Zoznam sekvencií (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 25 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 1:
GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 21 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 2:
CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT T 21 (Í) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 3:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 19 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 3:
AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvencie: , 1 I (A) dĺžka: 19 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 4:
AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 19 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 19 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 5:
TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 19 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 19 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 6:
CTTCCCGAAG GGAGAAAAGG 19 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 7:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 21 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 7:
GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 8:
(i) charakteristika sekvencie: 1 (A) dĺžka: 13 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 8:
GAAAAAGGAA GAG 13 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 9: (i) charakteristika sekvencie:
| (A) | dĺžka: 17 bázových párov | |
| (B) | typ: nukleotid | |
| (C) | počet vláken: jedno | |
| (D) | konfigurácia: lineárne | |
| (ii) | typ | molekuly: cDNA |
| (ix) | opis | : sekvencie SEQ ID NO: 9: |
AAAAAAAGGGA TAAGGG 17 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 10:
(i) icharakteristika sekvencie:
i p : (A) dĺžka: 56 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 10:
AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG AGCGGCCGCG AGCTCC 56 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 11: (í) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 56 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 11:
AGCTGGAGCT CGCGGCCGČT CTAGAGGATC CGAAŤTČGAT ATCCTGCAGC TCGAGA 56 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 12: (i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 65 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 12:
GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG .58 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 13:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 58 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 13:
AATTCČTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCŤ TCTTCTTCTT CTTCTTCG 58 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 14:
(i) charakteristika sekvencie:
| (A) | dĺžka: 27 bázových párov | |
| (B) | typ: nukleotid | |
| (C) | počet vláken: jedno | |
| (D) | konfigurácia: lineárne' ; | |
| (ii) | typ | molekuly: cDNA |
| (ix) | opis sekvencie SEQ ID NO: 14: |
CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 27 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 15: (i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 27 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárne (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 15:
CCAAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT 27
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Metóda purifikácie farmaceutický čistej dvojvláknovej DNA, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň etapu chromatografie na kolóne keramického hydroxyapatitu.
- 2. Metóda purifikácie dvojvláknovej DNA, vyznačuj úca sa t ý m, že zahrňuje 2 etapy chromatograf ie, z ktorých je jedna uskutočnená na kolóne hydroxyapatitu.
- 3. Metóda podlá nároku 2, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje etapu chromatografie na kolóne hydroxyapatitu a etapu afinitnej alebo ionomeničovej chromatografie.
- 4. Metóda podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje etapu chromatografie na kolóne hydroxyapatitu a etapu afinitnej chromatografie špecifickou hybridizáciou medzi sekvenciou DNA a imobilizovaným oligonukleotidom s vytvorením triple-helixu.
- 5. Metóda podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že zahrňuje etapu chromatografie na kolóne hydroxyapatitu a etapu ionomeničovej chromatografie.
- 6. Metóda, podľa nároku 1' až 5, vyznačujúca sa i 1 , · tým, že zahrňuje okrem iného etapu diafiltrácie.
- 7. Metóda purifikácie dvojvláknovej DNA, vyznačuj úca sa t ý m, že zahrňuje nasledovné, etapy:- chemickú lýzu buniek- diafiltráciu- chromatografiu na kolóne keramického hydroxyapatitu- afinitnú chromatografiu špecifickou hybridizáciou medzi sekvenciou DNA a imobilizovaným oligonukleotidom s vytvorením triple-helixu.
- 8. Metóda podlá jedného z ktoréhokoľvek nárokov 1 až 7, v y z načujúca.sa tým, i že dvoj vláknová DNA obsahuje okrem iného jednu alebo viac sekvencií záujmu.
- 9. Metóda podlá jedného z nárokov 1 až 8, vyznačujúca sa t ý m, že dvojvláknová DNA je plazmidová DNA.
- 10. Príprava plazmidovej rekombinantnej DNA vyznačená obsahom chromozómovej DNA vyšším alebo rovným 0,01%.
- 11. Príprava plazmidovej rekombinantnej DNA purifikovanej podlá nároku 10 vyznačená obsahom endotoxínu vyšším alebo rovným 50 EU/mg. 1
- 12. Príprava purifikovanej plazmidovej rekombinantnej DNA podľa nároku 11 vyznačená obsahom endotoxínu vyšším alebo rovným 10 EU/mg.
- 13. Farmaceutická kompozícia obsahujúca DNA získanú postupom podľa jedného z nárokov 1 až 9.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9603519A FR2746412B1 (fr) | 1996-03-21 | 1996-03-21 | Purification d'adn plasmidique de qualite pharmaceutique |
| PCT/FR1997/000472 WO1997035002A1 (fr) | 1996-03-21 | 1997-03-17 | Purification d'adn plasmidique de qualite pharmaceutique |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK129198A3 true SK129198A3 (en) | 1999-03-12 |
Family
ID=9490391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1291-98A SK129198A3 (en) | 1996-03-21 | 1997-03-17 | Purification of pharmaceutical-grade plasmid dna |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6730781B1 (sk) |
| EP (1) | EP0902835A1 (sk) |
| JP (1) | JP2000506736A (sk) |
| KR (1) | KR100502116B1 (sk) |
| AU (1) | AU730755B2 (sk) |
| BR (1) | BR9708227A (sk) |
| CA (1) | CA2249465A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ295587B6 (sk) |
| FR (1) | FR2746412B1 (sk) |
| HU (1) | HU225426B1 (sk) |
| IL (1) | IL126268A0 (sk) |
| NO (1) | NO984342L (sk) |
| SK (1) | SK129198A3 (sk) |
| WO (1) | WO1997035002A1 (sk) |
| ZA (1) | ZA972462B (sk) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7026468B2 (en) | 1996-07-19 | 2006-04-11 | Valentis, Inc. | Process and equipment for plasmid purification |
| US7807822B2 (en) | 1996-08-01 | 2010-10-05 | Robert Bridenbaugh | Methods for purifying nucleic acids |
| US6214586B1 (en) * | 1997-12-08 | 2001-04-10 | Genzyme Corporation | Method for purifying plasmid DNA and plasmid DNA substantially free of genomic DNA |
| MXPA02011463A (es) * | 2000-05-26 | 2004-09-06 | Centelion | Purificacion de una formacion de triple helice con un oligonucleotido inmovilizado. |
| FR2822476B1 (fr) * | 2001-03-23 | 2004-04-02 | Aventis Pharma Sa | Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice |
| KR101002499B1 (ko) * | 2001-03-23 | 2010-12-17 | 센텔리옹 에스아에스 | 2본쇄 ｄｎａ 표적 서열을 3중 나선 상호작용에 의해 정제 및 검출하는 방법 |
| AU2003267175A1 (en) | 2002-09-13 | 2004-04-30 | Valentis, Inc. | Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids |
| EP1628749B1 (en) | 2003-05-30 | 2019-07-31 | VGXI, Inc. | Devices and methods for biomaterial production |
| MXPA06003004A (es) * | 2003-09-17 | 2006-06-23 | Centelion | Metodo de preparacion de acido desoxirribonucleico plasmidico de grado farmaceutico. |
| CA2559368A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-10-27 | Centelion | Method for purifying plasmid dna |
| EP2246413A3 (en) * | 2004-04-19 | 2011-10-26 | Centelion | Method for purifying plasmid DNA having pharmaceutical quality |
| BRPI0515418A (pt) | 2004-08-16 | 2008-07-22 | Nature Technology Corp | método para a produção de dna de plasmìdio super-enrolado fechado covalentemente e composição de matéria |
| ES2529675T3 (es) | 2004-11-30 | 2015-02-24 | Merial Ltd. | Dispositivos de mezclado para la lisis química de células |
| US20120258502A1 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Vinod Pandiripally | Method of producing recombinant plasmid dna using substantially solid growth medium |
| US20120283503A1 (en) * | 2011-04-29 | 2012-11-08 | The Johns Hopkins University | Nanoparticle loaded stem cells and their use in mri guided hyperthermia |
| CN116790578B (zh) * | 2023-08-22 | 2023-12-12 | 赛奥斯博生物科技(北京)有限公司 | 一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3888079T2 (de) * | 1987-10-22 | 1994-07-14 | Asahi Optical Co Ltd | Poröses keramisches Material. |
| JPH01135792A (ja) * | 1987-11-20 | 1989-05-29 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 核酸の分離・精製方法 |
| CA2006008C (en) * | 1988-12-20 | 2000-02-15 | Donald J. Kessler | Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex dna molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use |
| AU6125294A (en) * | 1993-01-13 | 1994-08-15 | Genetics Institute Inc. | Process for producing m-csf 223 |
| US5503816A (en) * | 1993-09-27 | 1996-04-02 | Becton Dickinson And Company | Silicate compounds for DNA purification |
| CA2182388C (en) * | 1994-02-07 | 2007-08-07 | Metin Colpan | Process for producing endotoxin-free or endotoxin-poor nucleic acids and/or oligonucleotides for gene therapy |
| US5576196A (en) * | 1995-01-13 | 1996-11-19 | Vical Incorporated | Process for reducing RNA concentration in a mixture of biological material using diatomaceous earth |
| US6750333B1 (en) | 1996-02-06 | 2004-06-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Process for preparing purified nucleic acid and the use thereof |
-
1996
- 1996-03-21 FR FR9603519A patent/FR2746412B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-03-17 SK SK1291-98A patent/SK129198A3/sk unknown
- 1997-03-17 KR KR10-1998-0707410A patent/KR100502116B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-03-17 AU AU21661/97A patent/AU730755B2/en not_active Ceased
- 1997-03-17 EP EP97914411A patent/EP0902835A1/fr not_active Ceased
- 1997-03-17 BR BR9708227A patent/BR9708227A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-03-17 CA CA002249465A patent/CA2249465A1/fr not_active Abandoned
- 1997-03-17 WO PCT/FR1997/000472 patent/WO1997035002A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1997-03-17 IL IL12626897A patent/IL126268A0/xx unknown
- 1997-03-17 HU HU9902152A patent/HU225426B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-03-17 JP JP9533199A patent/JP2000506736A/ja active Pending
- 1997-03-17 CZ CZ19982984A patent/CZ295587B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-03-20 ZA ZA9702462A patent/ZA972462B/xx unknown
-
1998
- 1998-09-15 US US09/153,838 patent/US6730781B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-18 NO NO984342A patent/NO984342L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9708227A (pt) | 1999-07-27 |
| AU2166197A (en) | 1997-10-10 |
| EP0902835A1 (fr) | 1999-03-24 |
| NO984342D0 (no) | 1998-09-18 |
| CZ295587B6 (cs) | 2005-08-17 |
| JP2000506736A (ja) | 2000-06-06 |
| HUP9902152A3 (en) | 2001-04-28 |
| HU225426B1 (en) | 2006-11-28 |
| HUP9902152A2 (hu) | 1999-11-29 |
| CA2249465A1 (fr) | 1997-09-25 |
| KR20000064693A (ko) | 2000-11-06 |
| FR2746412B1 (fr) | 1998-06-12 |
| IL126268A0 (en) | 1999-05-09 |
| AU730755B2 (en) | 2001-03-15 |
| US6730781B1 (en) | 2004-05-04 |
| FR2746412A1 (fr) | 1997-09-26 |
| KR100502116B1 (ko) | 2005-12-20 |
| ZA972462B (en) | 1997-09-29 |
| NO984342L (no) | 1998-09-18 |
| CZ298498A3 (cs) | 1999-01-13 |
| WO1997035002A1 (fr) | 1997-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK129198A3 (en) | Purification of pharmaceutical-grade plasmid dna | |
| JP2009045070A (ja) | 固定化させたオリゴヌクレオチドと三重らせんを形成させることによるｄｎａ精製 | |
| US8399636B2 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide | |
| AU2007202804B8 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide | |
| MXPA98007323A (en) | Purification of plasmid dna of pharmaceutical quality | |
| AU2001263459A1 (en) | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide | |
| IL152860A (en) | Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide | |
| PL206844B1 (pl) | Sposoby oczyszczania dwuniciowego DNA |