JP2023509383A

JP2023509383A - レトロインベルソペプチド

Info

Publication number: JP2023509383A
Application number: JP2022538266A
Authority: JP
Inventors: フットゥネン，ヘンリ; バッタチャルジー，アルナブ; クレスカヤ，ナタリア
Original assignee: HERANTIS PHARMA Oyj
Current assignee: HERANTIS PHARMA Oyj
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2023-03-08
Also published as: CN114846020A; KR20220117319A; EP3838912A1; BR112022011906A2; US20230391842A1; WO2021123050A1; CA3165091A1; AU2020409569A1; EP4077348A1

Abstract

本発明は、非定型神経栄養因子の分野および変性、慢性または進行性疾患および障害ならびに病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患を処置する分野に関する。より具体的に本発明は、修飾ペプチド、特にレトロインベルソペプチドに関する。本発明は、該ペプチドを含む、医薬組成物にも関する。さらに、本発明は、医薬として使用するおよび変性、慢性または進行性疾患および障害ならびに病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患の処置における該ペプチドおよび医薬組成物ならびに該疾患および障害を処置する方法にも関する。

Description

発明の分野
本発明は、非定型神経栄養因子および小胞体(ＥＲ)に位置するタンパク質の分野および変性、慢性または進行性疾患および障害の処置の分野に関する。より具体的に本発明は、レトロインベルソペプチドを処置する分野に関する。本発明は、該ペプチドを含む、医薬組成物にも関する。さらに、本発明は、医薬として使用するおよび変性、慢性または進行性疾患および障害ならびに病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患の処置における該ペプチドおよび医薬組成物ならびに該疾患および障害を処置する方法にも関する。

発明の背景
神経栄養因子(ＮＴＦ)は、ニューロンの生存および分化を促進し、神経保護および神経回復性質を有する増殖因子のサブグループである(Hefti, 1994)。ＮＴＦは、発達中および成熟したニューロンの増殖、生存および分化を支持し、傷害および毒素から保護する小タンパク質である。脳ドパミン神経栄養(ＣＤＮＦ)は、その最も近い近縁中脳星状細胞由来神経栄養因子(ＭＡＮＦ)と共に、他の増殖因子と構造的および機構的いずれでも異なる非定型ＮＴＦの新規ファミリーを形成する(Lindholm and Saarma, 2010; Huttunen and Saarma, 2019)。ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは、中枢神経系だけでなく、非神経組織にも発現される、それぞれ１６１および１５８アミノ酸の約１８kDaの小分子量の成熟タンパク質の小モノマータンパク質である。ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは、主に小胞体(ＥＲ)管腔に局在化する。それらは、それらをＥＲに向けるＮ末端シグナルペプチドを含む。ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦ両者は、分泌される増殖因子では概して存在しないＣ末端ＫＤＥＬ(配列番号３１)様ＥＲ保持シグナルも含む。それらは、ＢｉＰ／ＧＲＰ７８などのＥＲタンパク質と相互作用し、小胞体ストレス応答(ＵＰＲ)シグナル伝達を調節し、ＥＲストレス誘導細胞死から保護する。ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦ両者は健常細胞においてＥＲ管腔に蓄積され、Ｃ末端ＥＲ保持シグナルの破壊が分泌をもたらす。検出可能なレベルのＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは正常ヒト血清で見られ、ＭＡＮＦはまた脳脊髄液(ＣＳＦ)でも見られる。これらの特徴に基づき、ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは、高度に特異的な神経栄養因子ではなく、一般的ストレス保護タンパク質であると考えられている(Huttunen and Saarma, 2019)。ＭＡＮＦは、カルディオマイオカインとしても記載されている(Glembotski, 2011)。

ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは、パーキンソン病のラット６－ＯＨＤＡモデルで、変性ドパミンニューロンの処置のために現在最も効率的なタンパク質である(Lindholm and Saarma, 2010)。両因子とも、毒素の前に適用したとき、６－ＯＨＤＡ誘導ドパミンニューロン喪失およびパーキンソン病様運動症状を、強く予防する(Lindholm et al., 2007; Voutilainen et al., 2009)。より重要なことに、いずれの因子の破壊後投与も、パーキンソン病の６－ＯＨＤＡ誘導症状が既に広範囲に及んだ段階で適用したとき、正常運動行動および線条体のドパミン作動性神経支配を効率的に回復させる(Lindholm et al., 2007; Voutilainen et al., 2011)。ＣＤＮＦは、パーキンソン病のマウスＭＰＴＰモデルにおいてもドパミンニューロンを保護および修復し(Airavaara et al., 2012)、重度６－ＯＨＤＡモデルにおいて、グリア細胞株由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)より有効である(Airavaara et al., 2012; Voutilainen et al 2011)。これらの因子が神経保護する機構は完全には明らかではないが、酸化的およびＥＲストレスを軽減し、アポトーシス細胞死を抑制することを目的とする経路を活性化することが示唆されている。糖尿病ならびにパーキンソン病、アルツハイマー病(ＡＤ)および筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)などの神経変性疾患を含む多くの病態生理学的状態は、ＥＲストレスと関連する。従って、ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦの効果は、種々の中枢神経系疾患で示されている(ＷＯ２００９１３３２４７；ＷＯ２００７０６８８０３；およびAiravaara et al, 2009)。免疫およびグリア細胞の応答調節を含む非細胞自律的機構は、ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦの細胞保護効果に寄与することが示されている(Sousa-Victor et al, 2018)。

具体的に、ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは、ＣＮＳ疾患および傷害の全てではないにしても、大部分の病態生理学に関与する神経炎症を抑制することが示されている(Nadella et al, 2014; Zhao et al, 2013)。

ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは、約６０％のアミノ酸配列相同性を共有するだけでなく、三次元構造が非常に類似している。ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦの何れも、柔軟性ループ領域により接続された２個の独立して折りたたまれたドメインからなる(Lindholm and Saarma, 2010)。二次構造は主にα－らせんであり、Ｎ末端ドメインに５個のα－らせんおよびＣ末端ドメインに３個のα－らせんがある。３個のジスルフィド架橋がＮ末端ドメインを安定化し、ＣＤＮＦのＣ末端ＣＲＡＣ(配列番号３２)配列、ＭＡＮＦのＣＫＧＣ(配列番号３３)が内部ジスルフィド架橋を形成する。このＣＸＸＣ(配列番号３４)ジスルフィド架橋はＣＤＮＦおよびＭＡＮＦ両者で見られ、これらタンパク質の細胞保護活性の中心的役割を有する。

ＣＤＮＦは、脳だけでなく、例えば骨格筋、肝臓、心臓、肺、膵臓、精巣、唾液腺および腸管神経系を含む多数の他の組織でも発現される(Lindholm et al, 2007)。ＭＡＮＦは、脳だけでなく、膵臓および心臓などの末梢組織でも発現される。

公報ＷＯ２０１３／３０３４８０５およびＷＯ２０１８／２０２９５７に開示されるものなどの天然ペプチドは、ほとんど医薬品として使用できない。

文献ＷＯ２０１３／３０３４８０５Ａ１は、配列ＣＫＧＣ(配列番号３３)またはＣＲＡＣ(配列番号３２)を含む４～４０アミノ酸長のＭＡＮＦおよびＣＤＮＦフラグメントを開示する。文献ＷＯ２０１８／２０２９５７Ａ１は、少なくとも５０アミノ酸長を有するＣＤＮＦフラグメントを開示する。Hellmann et al., 2011は、残基９６～１５８を含むＭＡＮＦの活性Ｃ末端フラグメントを開示する。Fletcher and Hughes 2006は、ループ作成のためにシステインが操作されたＣＲＡＣ(配列番号３２)含有脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)由来ペプチドを開示する。それ故、代謝安定性および分布性質が改善された、治療剤について必要性がまだある。

発明の概要
本発明の目的は、新規の修飾レトロインベルソペプチドの提供である。本発明の他の目的は、該新規ペプチドの使用の提供である。

本発明は、ペプチド、特にレトロインベルソペプチドの新規かつ革新的方法での利用により、これら前記性質を備えたツールを提供する。

本発明者らは、線形天然ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦペプチドは、特に非経腸投与でヒトまたは動物に投与したとき、その速い代謝および分布の悪さのために、薬物分子に適さないことを発見した。それ故、先行文献に開示されるような天然非修飾ペプチドは、ほとんど医薬品として使用できない。本発明者らは、ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦの細胞保護効果を再現するが、非侵襲性末梢投与に十分に適する、ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦ由来の新規安定化ペプチドを開発した。本発明者らは、本明細書のデータにより示されるとおり、ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦペプチドのレトロインベルソ異性化が、細胞保護活性を喪失することなく代謝安定性および分布性質を改善することを発見した。また、本修飾ペプチドは、先行文献に開示のものより短い。

ＣＤＮＦ／ＭＡＮＦの生物学的活性は、タンパク質のＣ末端ドメインに局在化する。本発明は、特にレトロインベルソ異性化の形態の、ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦのＣ末端ドメインに由来する８～３２アミノ酸ペプチドを開示する。ＣＸＸＣ(配列番号３４)モチーフ周囲の短非修飾オクタペプチドは、ここに開示するとおり、インビトロで完全長ＣＤＮＦ／ＭＡＮＦタンパク質および細胞膜を通過する能力を示した。

本発明者らは、ＣＸＸＣ(配列番号３４)モチーフまたは特定のタイプのＣＸＸＸＣ(配列番号２１)モチーフを有するＣＤＮＦ／ＭＡＮＦペプチドのレトロインベルソ異性化が顕著に改善された医薬性質、例えば代謝安定性、血液脳関門(ＢＢＢ)浸透およびインビボ薬物動態を有することを初めて示した。これらのレトロインベルソ異性化ペプチドを、変性、慢性および／または進行性疾患および障害または病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患のための医薬の開発に使用し得る。

本発明は、Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ(配列番号２１)
〔式中、
Ｘ_１はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、ＡおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；そして
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択される。〕
のレトロインベルソ形態のアミノ酸配列を含む、８～３２アミノ酸の長さを有するペプチドまたはその薬学的に許容される塩を提供する。

ある態様において、ペプチドはシュードペプチドである。ある例において、ペプチドは、次の性質の少なくとも１個(例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個)を有する：(ｉ)ペプチドは、ＴＨ陽性ニューロンをＭＰＰ^＋毒性から用量依存的に保護できる；(ii)ペプチドは、ＴＨ陽性ニューロンにおけるアルファ－シヌクレイン封入体の数を減少させる；(iii)ペプチドは、その親対応物と比較して改善された血漿での安定性を有する；(iv)ペプチドは、その親対応物と比較して改善された肝細胞での安定性を有する；または(ｖ)ペプチドは、その親対応物と比較して改善された血液脳関門を通過する能力を有する。

本発明は、医薬として使用するための該ペプチドをさらに提供する。

本発明は、神経変性疾患または障害などの変性疾患または障害、慢性疾患または障害または進行性疾患または障害または病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患の処置に使用するための、該ペプチドをさらに提供する。

本発明は、該ペプチドおよび次の薬学的に許容される担体、薬学的に許容される添加物、防腐剤、安定化剤および／または希釈剤の少なくとも１個を含む、医薬組成物をさらに提供する。

本発明は、医薬として使用するための医薬組成物をさらに提供する。

本発明は、神経変性疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害または病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患の処置に使用するための、医薬組成物をさらに提供する。

本発明は、処置を必要とする対象における神経変性疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害または病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患を処置する方法対象に前記ペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法をさらに提供する。

次に、本発明を好ましい実施態様の手段により、さらに詳細に記載する。

試験した化合物の一覧を示す。化合物番号、配列番号、Ｃｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド結合、配列の長さ、修飾の説明およびモノアイソトピック質量(Da)を示す、アミノ酸配列を示す。カラム５はＭＳスペクトルで見られる荷電質量ピークの詳細を示し、カラム６は化合物のモノアイソトピック質量を示す。

図２Ａ～２Ｂは、ＣＤＮＦの、ＭＰＰ＋(１－メチル－４－フェニルピリジニウム)で傷害させたドパミン作動性ＴＨ(チロシンヒドロキシラーゼ)陽性ニューロンに対する神経保護効果およびＴＨ陽性ニューロンにおけるアルファ－シヌクレイン凝集に対する効果を示す。データは、対照非傷害状態のパーセンテージとして平均±ＳＥＭで表す(ｎ＝４～６；ＭＰＰ＋陰性対照ｎ＝１２２～１２７複数試験にまたがり集めた)。^＊ｐ＜０.０５、^＊＊ｐ＜０.０１、^＊＊＊ｐ＜０.００１、^＊＊＊＊ｐ＜０.０００１ブラウン・フォーサイスおよびウェルチＡＮＯＶＡ検定と、ウェルチ相関一対比較を用いる事後独立ｔ検定で対ＭＰＰ＋陰性対照。

存在するｒｈＣＤＮＦの濃度を増加させてＭＰＰ＋傷害した後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。上部点線は、非傷害細胞から得たパラメータの対照レベル(１００％)を示す；下部点線は、化合物でさらに処置しないＭＰＰ＋傷害細胞から得たパラメータの陰性対照レベルを示す。

存在するｒｈＣＤＮＦの濃度を増加させてＭＰＰ＋傷害した後の中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。上部点線は、ＣＤＮＦでさらに処置しないＭＰＰ＋傷害細胞から得たパラメータの陰性対照レベルを示す；下部点線は非傷害細胞から得たパラメータ(１００％)の陰性対照レベルを表す。

図３Ａ～３Ｈは、ＭＰＰ＋(１－メチル－４－フェニルピリジニウム)で傷害させたドパミン作動性ＴＨ(チロシンヒドロキシラーゼ)陽性ニューロンに対する親およびレトロインベルソ化合物(それぞれ配列番号１～８を有する化合物１～８)の神経保護効果およびＴＨ陽性ニューロンにおけるアルファ－シヌクレイン凝集に対する効果を示す。データは、対照非傷害状態のパーセンテージとして平均±ＳＥＭで表す(ｎ＝４～６；ＭＰＰ＋陰性対照ｎ＝１２２～１２７複数試験にまたがり集めた)。^＊ｐ＜０.０５、^＊＊ｐ＜０.０１、^＊＊＊ｐ＜０.００１、^＊＊＊＊ｐ＜０.０００１ブラウン・フォーサイスおよびウェルチＡＮＯＶＡ検定と、ウェルチ相関一対比較を用いる事後独立ｔ検定で対ＭＰＰ＋陰性対照。＃ｐ＜０.０５、＃＃ｐ＜０.０１、＃＃＃ｐ＜０.００１、＃＃＃＃ｐ＜０.０００１ブラウン・フォーサイスおよびウェルチＡＮＯＶＡ検定とウェルチ相関一対比較を用いる事後独立ｔ検定で、同じ濃度の親および対応するレトロインベルソ化合物間。

化合物１(配列番号１)および化合物２(配列番号２)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。上部点線は、非傷害細胞から得たパラメータの対照レベル(１００％)を示す；下部点線は、化合物でさらに処置しないＭＰＰ＋傷害細胞から得たパラメータの陰性対照レベルを示す。

化合物１(配列番号１)および化合物２(配列番号２)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。上部点線は、化合物でさらに処理していないＭＰＰ＋傷害細胞から得たパラメータの陰性対照レベルを示す；下部点線は非傷害細胞から得たパラメータ(１００％)の陰性対照レベルを表す。

化合物３(配列番号３)および化合物４(配列番号４)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。

化合物３(配列番号３)および化合物４(配列番号４)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。

化合物５(配列番号５)および化合物６(配列番号６)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。

化合物５(配列番号５)および化合物６(配列番号６)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。

化合物７(配列番号７)および化合物８(配列番号８)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。

化合物７(配列番号７)および化合物８(配列番号８)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。

図４Ａ～４Ｌは、ＭＰＰ＋(１－メチル－４－フェニルピリジニウム)で傷害させたドパミン作動性ＴＨ(チロシンヒドロキシラーゼ)陽性ニューロンに対する親およびレトロインベルソ化合物(それぞれ配列番号９～２０を有する化合物９～２０)の神経保護効果およびＴＨ陽性ニューロンにおけるアルファ－シヌクレイン凝集に対する効果。データは、対照非傷害状態のパーセンテージとして平均±ＳＥＭで表す(ｎ＝４～６；ＭＰＰ＋陰性対照ｎ＝１２２～１２７複数試験にまたがり集めた)。^＊ｐ＜０.０５、^＊＊ｐ＜０.０１、^＊＊＊ｐ＜０.００１、^＊＊＊＊ｐ＜０.０００１ブラウン・フォーサイスおよびウェルチＡＮＯＶＡ検定と、ウェルチ相関一対比較を用いる事後独立ｔ検定で対ＭＰＰ＋陰性対照。＃ｐ＜０.０５、＃＃ｐ＜０.０１、＃＃＃ｐ＜０.００１、＃＃＃＃ｐ＜０.０００１ブラウン・フォーサイスおよびウェルチＡＮＯＶＡ検定とウェルチ相関一対比較を用いる事後独立ｔ検定で、同じ濃度の親および対応するレトロインベルソ化合物間。

化合物９(配列番号９)および化合物１０(配列番号１０)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。上部点線は、非傷害細胞から得たパラメータの対照レベル(１００％)を示す；下部点線は、化合物でさらに処置しないＭＰＰ＋傷害細胞から得たパラメータの陰性対照レベルを示す。

化合物９(配列番号９)および化合物１０(配列番号１０)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。上部点線は、化合物でさらに処理していないＭＰＰ＋傷害細胞から得たパラメータの陰性対照レベルを示す；下部点線は非傷害細胞から得たパラメータ(１００％)の陰性対照レベルを表す。

化合物１１(配列番号１１)および化合物１２(配列番号１２)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。

化合物１１(配列番号１１)および化合物１２(配列番号１２)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。

化合物１３(配列番号１３)および化合物１４(配列番号１４)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。

化合物１３(配列番号１３)および化合物１４(配列番号１４)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。

化合物１５(配列番号１５)および化合物１６(配列番号１６)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。

化合物１５(配列番号１５)および化合物１６(配列番号１６)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。

化合物１７(配列番号１７)および化合物１８(配列番号１８)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。

化合物１７(配列番号１７)および化合物１８(配列番号１８)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。

化合物１９(配列番号１９)および化合物２０(配列番号２０)存在下、ＭＰＰ＋傷害後の中脳細胞の一次培養におけるＴＨニューロン数、ＴＨニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ神経突起のシナプス数を示す。

化合物１９(配列番号１９)および化合物２０(配列番号２０)存在下、中脳細胞の一次培養のＴＨニューロンにおけるＭＰＰ＋傷害後のアルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)凝集を示す。

化合物１４と複合体化したＧＲＰ７８(ＧＲＰ７８－ＮＢＤ)のヌクレオチド結合ドメインのコンピューターによる分子モデルを示す。ＧＲＰ７８－ＮＢＤを、その模式的トレースと共に半透明表面モデルで示す。化合物１４(配列番号１４)におけるＣｙｓ－Ｃｙｓ結合は灰色棒で示す。

代表的な一連のペプチドのＧＲＰ７８－ＮＢＤの結合親和性(Ｋｄ、μMで)を表で示す。結合親和性を、マイクロスケール熱泳動ベースの無細胞アッセイにより得る。

化合物１４(配列番号１４)および２０(配列番号２０)の神経保護活性の小胞体ストレス応答(ＵＰＲ)経路シグナル伝達活性への依存を示す。ＧＳＫ２６０６４１４をＰＥＲＫシグナル伝達阻害に、そしてＫＩＲＡ６をＩＲＥ１アルファシグナル伝達阻害に使用した。^＊ｐ＜０.０５、^＊＊ｐ＜０.０１、^＊＊＊ｐ＜０.００１、^＊＊＊＊ｐ＜０.０００１一元配置ＡＮＯＶＡ検定と事後フィッシャーＬＳＤ検定でＭＰＰ＋陰性対照に対して一対比較。＃ｐ＜０.０５、＃＃ｐ＜０.０１、＃＃＃ｐ＜０.００１、＃＃＃＃ｐ＜０.０００１一元配置ＡＮＯＶＡ検定と事後フィッシャーＬＳＤ検定で化合物単独およびＵＰＲシグナル阻害剤との組み合わせの間の一対比較。

図６Ａ～６Ｂは、ラット血漿およびヒト血漿における親(配列番号１～８を有する化合物１～８)およびレトロインベルソ化合物(配列番号１～８、１３～１４および１９～２０を有する化合物１～８、１３～１４および１９～２０)のインビトロ代謝安定性を示す。

ラット血漿における化合物消失に基づき計算した半減期を示す。

ヒト血漿における化合物消失に基づき計算した半減期を示す。カラム上の角括弧および数字はレトロインベルソ化合物の半減期の変化を、対応する親化合物と比較して示す。ＮＤ、技術的問題によりアッセイで検出されず。７８９分の最高計算半減期は、実験カットオフ時間限界を示す。

図７Ａ～７Ｂは、ラット肝細胞およびヒト肝細胞における親(配列番号１～８を有する化合物１～８)およびレトロインベルソ化合物(それぞれ配列番号１～８、１３～１４および１９～２０を有する化合物１～８、１３～１４および１９～２０)のインビトロ代謝安定性を示す。

ラット肝細胞における化合物消失に基づき計算した半減期を示す。

ヒト肝細胞における化合物消失に基づき計算した半減期を示す。カラム上の角括弧および数字はレトロインベルソ化合物の半減期の変化を、対応する親化合物のパーセンテージとして示す。３９５分の最高計算半減期は、実験カットオフ時間限界を示す。

血液脳関門の３Ｄインビトロモデルを通る親およびレトロインベルソ化合物(それぞれ配列番号１～１４および１７～２０を有する化合物１～１４および１７～２０)の浸透を示す。人工血液脳関門を通過する化合物の量を、最初に適用した濃度のパーセンテージで表す。データは平均±ＳＥＭで示す(ｎ＝３～４)。^＊＊＊＊ｐ＜０.０００１、ｎ.ｓ. 非有意、ブラウン・フォーサイスおよびウェルチＡＮＯＶＡ検定とウェルチ相関一対比較を用いる事後独立ｔ検定で親および対応するレトロインベルソ化合物の間。

５mg／kg用量でラットに静脈内投与した後２分、５分、１５分、３０分、１時間、２時間および４時間後に測定したレトロインベルソ化合物６、１２、１４および２０(配列番号６、１２、１４および２０)、天然化合物１３(配列番号１３)および天然対照化合物の血漿濃度を示す。データは平均±ＳＥＭで示す(ｎ＝３)。

１０mg／kg静脈内ボーラス注射後の化合物２０(配列番号１８)の脳間質液(ＩＳＦ；線条体)分布動態を示す。ＩＳＦ濃度は微小透析フィルターリカバリー－％により正規化されている(インビトロ実験により決定)。化合物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してＩＳＦおよび血漿から検出した。

ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦのＣ末端ドメインのペアワイズアラインメントを示す。アラインメントを次のGenbank読み出し配列を使用して実施した：ヒトＣＤＮＦについて、受託番号NP_001025125.2およびヒトＭＡＮＦについて、受託番号NP_006001.5。ＣＸＸＣモチーフを灰色背景で示し、３個のα－らせんの位置を示す。

１０の異なる種(それぞれ配列番号４７～６６)からのＣＤＮＦおよびＭＡＮＦ(６１－６３ａａ)のＣ末端ドメインのＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アラインメントを示す。Genbank受託番号を配列アラインメントに示す。ＣＸＸＣモチーフを灰色背景で示し、３個のα－らせんの位置を示す。これら代表的配列(ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦ両者内)間で保存されているこれら塩基を太字で示す。配列アラインメントの下、代表的１０種で見られる各位置毎の天然バリアントを示す。示す配列および種の一覧を使用して、保存的および可変的位置を同定でき、大部分の非必須アミノ酸残基について限定的な変動しか可能ではないことが示される。

化合物１７～２０(それぞれ配列番号１７～２０)の構造式を示す。標準的略語としてのアミノ酸名を、配列順と共に式の下に示す(天然ペプチドでＮＨ_２→ＣＯＯＨおよびレトロインベルソペプチドでＣＯＯＨ→ＮＨ_２)。灰色矢印は、Ｌ－アミノ酸からなる線形ペプチドのアミドペプチド結合におけるアミン基およびカルボニル基とＤ－アミノ酸からなるレトロインベルソペプチドの異なる順番を説明するために、各化合物で単一ペプチド結合を刺す。

配列表
配列番号１ MRVAELKQILHSWGEECRACAEK
配列番号２ KEACARCEEGWSHLIQKLEAVRM
配列番号３ LRVKELKKILDDWGETCKGCAEK
配列番号４ KEACGKCTEGWDDLIKKLEKVRL
配列番号５ GEECRACAEKT
配列番号６ TKEACARCEEG
配列番号７ GETCKGCAEKS
配列番号８ SKEACGKCTEG
配列番号９ GEECRGACAEKT
配列番号１０ TKEACAGRCEEG
配列番号１１ GETCKGGCAEKS
配列番号１２ SKEACGGKCTEG
配列番号１３ EECRACAEK
配列番号１４ KEACARCEE
配列番号１５ ETCKGCAEK
配列番号１６ KEACGKCTE
配列番号１７ EECRACAE
配列番号１８ EACARCEE
配列番号１９ ETCKGCAE
配列番号２０ EACGKCTE
配列番号２１Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ
配列番号２２Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ
配列番号２３Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１
配列番号２４Ｘ_１２－Ｘ_１３－Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｉ－Ｌ－Ｘ_５Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１
配列番号２５ RVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA、天然ヒトＣＤＮＦペプチド
配列番号２６ RVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYA、天然ヒトＭＡＮＦペプチド
配列番号２７Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１
配列番号２８Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０
配列番号２９Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９
配列番号３０Ｘ_１３－Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ
配列番号３１ KDEL
配列番号３２ CRAC
配列番号３３ CKGC
配列番号３４ CXXC
配列番号３５ ETCKGCAE
配列番号３６ TCKGCA
配列番号３７ MWCASPVAVV AFCAGLLVSH PVLTQGQEAG GRPGADCEVC KEFLNRFYKS LIDRGVNFSL DTIEKELISF CLDTKGKENR LCYYLGATKD AATKILSEVT RPMSVHMPAM KICEKLKKLD SQICELKYEK TLDLASVDLR KMRVAELKQI LHSWGEECRA CAEKTDYVNL IQELAPKYAA THPKTEL 完全長ＣＤＮＦ(ＮＣＢＩ参照配列： NP_001025125.2)
配列番号３８ MRRMWATQGL AVALALSVLP GSRALRPGDC EVCISYLGRF YQDLKDRDVT FSPATIENEL IKFCREARGK ENRLCYYIGA TDDAATKIIN EVSKPLAHHI PVEKICEKLK KKDSQICELK YDKQIDLSTV DLKKLRVKEL KKILDDWGET CKGCAEKSDY IRKINELMPK YAPKAASART DL 完全長ＭＡＮＦ(ＮＣＢＩ参照配列： NP_006001.5)
配列番号３９ TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA(４９ａａＣＤＮＦ)
配列番号４０ RVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA(３７ａａＣＤＮＦ)
配列番号４１ TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKT(３５ａａＣＤＮＦ)
配列番号４２ LASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKT(３２ＣＤＮＦ)
配列番号４３ QIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYA(４９ａａＭＡＮＦ)
配列番号４４ RVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYA(３７ａａＭＡＮＦ)
配列番号４５ QIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKS(３５ａａＭＡＮＦ)
配列番号４６ LSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKS(３２ａａＭＡＮＦ)
配列番号４７ KYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA ATHPKTEL、ヒトＣＤＮＦ(NP_001025125.2)
配列番号４８ KYEKKLDLASVDLLKMRVAELKQILNSWGEECRACAEKSDYVNLIKELAPKYA AMHPKTEL、ウマＣＤＮＦ(XP_001498617.2)
配列番号４９ KYEKKLDLASVDLSKMRVAELKQILHGWGEECRACAEKTDYVNLIKELAPKYA ATHPQTEL、バイソンＣＤＮＦ(XP_010858254.1)
配列番号５０ KYEKKLDLASVDLSKMRVAELQILYSWGEECRACAEKTDYVNLIKELAPKYTE TPPQTEL、ブタＣＤＮＦ(XP_003130787.1)
配列番号５１ KYEKKLDLASVDLSKMRVAELKQILHSWGEECIACAEKTDYVNLITELAPKYAA AHPKTEL、イヌＣＤＮＦ(XP_848954.2)
配列番号５２ KYGKKLDLASVDLWKMRVAELKQILQRWGEECRACAEKSDYVNLIRELAPKY VEIYPQTEL、マウスＣＤＮＦ(NP_808315.1)
配列番号５３ NYEKKLDLASVDLWKMRDAELKQILHSWGEECRACAEKNDYVNLIKELAPKY VEIHPQIEL、ハムスターＣＤＮＦ(XP_027261009.1)
配列番号５４ KYERKLDLTSVDLSKMRVAELRKILDSWGEVCKACIEKTEFVNLIKELAPKYA PPNSRADL、アリゲーターＣＤＮＦ(XP_019343086.1)
配列番号５５ KYEKKLDLASVDLSKMRVAELKQILYSWGEECRACVEKTDYVNLIKELAPKYT ATYPKTEL、イルカＣＤＮＦ(XP_026977721.1)
配列番号５６ RYERLVLDWSTDALSKMRALELKRVLASWGEECRACLEKSEFIALIQEVAPKH SASEHRAHTEEF、ゼブラフィッシュＣＤＮＦ(NP_001116753.1)
配列番号５７ KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASARTDL、ヒトＭＡＮＦ(NP_006001.5)
配列番号５８ KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL、ウマＭＡＮＦ(NP_001184244.1)
配列番号５９ KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL、バイソンＭＡＮＦ(XP_010850093.1)
配列番号６０ KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL、ブタＭＡＮＦ(NP_001231584.1)
配列番号６１ KYDKQIDLRTVDLKKLRVRELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL、イヌＭＡＮＦ(XP_003639808.2)
配列番号６２ KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGEMCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASARTDL、マウスＭＡＮＦ(NP_083379.2)
配列番号６３ KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGEMCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASARTDL、ハムスターＭＡＮＦ(RLQ67668)
配列番号６４ KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL、アリゲーターＭＡＮＦ(XP_014455597.1)
配列番号６５ KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL、イルカＭＡＮＦ(XP_026976745.1)
配列番号６６ KYDKQVDLSSVDLKKLKVKDLKKILEEWGESCKGCVEKSDFIRKINELMPKYA PSAAKARTDL、ゼブラフィッシュＭＡＮＦ(NP_001070097.1)

発明の詳細な記載
用語「修飾ペプチド」は、修飾されているまたは合成ペプチドまたはポリペプチドをいう。ペプチド修飾または合成選択肢は、例えばレトロインベルソ異性化ペプチド、環状ペプチド、ペプチド模倣体、クリック化学、ステープルペプチド、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、同位体標識ペプチド、ビオチニル化およびタグ付きペプチド、蛍光色素標識ペプチド、ペプチド二量体、翻訳後修飾、内部消光／ＦＲＥＴペプチド、リンカー／スペーサー／ペグ化、ペプチド貯留、タンパク質コンジュゲート、免疫原性ペプチドおよび不自然アミノ酸の取り込みを含む。「天然でコードされないアミノ酸」は、２０の一般的アミノ酸の一つまたはピロリシンまたはセレノシステインではないアミノ酸をいう。用語「天然でコードされないアミノ酸」と同義で使用され得る他の用語は、「非天然アミノ酸」、「不自然アミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」ならびにその種々のハイフンで結ばれたおよびハイフンで結ばれていないバージョンである。用語「天然でコードされないアミノ酸」は、天然にコードされるアミノ酸(２０の一般的アミノ酸またはピロリシンおよびセレノシステインを含むが、これらに限定されない)の修飾(例えば翻訳後修飾)により生ずるが、それ自体、翻訳複合体により伸長中のポリペプチド鎖に天然に取り込まれないアミノ酸も含むが、これに限定されない。このような天然に存在しないアミノ酸の例は、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－スレオニンおよびＯ－ホスホチロシンを含むが、これらに限定されない。

用語「レトロインベルソ」は、アミノ酸の１以上がＤアミノ酸(インベルソ)でありかつペプチド配列が逆の順番(レトロ)である、ペプチド配列をいう。ある実施態様において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個のＤアミノ酸が存在し得る。ある実施態様において、レトロインベルソペプチドは、交互のキラリティーのアミノ酸を含む。ある実施態様において、レトロインベルソペプチドは、全Ｄアミノ酸を含む。ここで使用するキラリティーは、アミノ酸のＤおよびＬ異性体をいう。説明のために、配列ＣＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｃを有するレトロインベルソペプチドは、配列ＣＸ_３Ｘ_２Ｘ_１Ｃを有し、ここで、アミノ酸の少なくとも１以上がＤアミノ酸である。Ｄ－アミノ酸からなるペプチドは、Ｌ－アミノ酸からなるタンパク質およびペプチドの分解のために進化したプロテアーゼの基質にほとんどならないため、代謝に安定である。しかしながら、Ｄ－ペプチドは、例えばらせん構造の掌性が逆であり、すなわち、アミノ酸側鎖は鏡像として位置する。Ｄ－ペプチドの配列順の逆転は、側鎖配向がＬ－ペプチドアナログを模倣する、換言すればレトロインベルソ異性化の構造を提供する。短非らせんレトロインベルソペプチドは、標的結合でその天然Ｌ－タンパク質対応物を機能的に模倣できる。

レトロインベルソ異性化の原則は、例えば線形ペプチドが
ＮＨ_２－Ｇｌｙ－Ｌ－Ｇｌｕ－Ｌ－Ｇｌｕ－Ｌ－Ｃｙｓ－Ｌ－Ａｒｇ－Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｃｙｓ－Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｇｌｕ－Ｌ－Ｌｙｓ－Ｌ－Ｔｈｒ－ＣＯＯＨ(配列番号５)
であるとき、レトロインベルソ異性化が
ＮＨ_２－Ｄ－Ｔｈｒ－Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ｇｌｕ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ｃｙｓ－Ｄ－Ａｌａ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｃｙｓ－Ｄ－Ｇｌｕ－Ｄ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－ＣＯＯＨ(配列番号６)
であることである。

レトロインベルソ異性化の原則の例は、化合物１７～２０(それぞれ配列番号１７～２０)について図１２にも示される。

用語「シュードペプチド」は、天然ペプチドまたはタンパク質で生じないアミノ酸のアミド、特にポリペプチド鎖に導入されたものをいう。シュードペプチドまたはアミノ結合サロゲートは、主鎖修飾ペプチドをいうために使用できる、多様な用語の一つである。これらペプチドの合成アナログは多様な用途の可能性があるが、これらの領域で興味が持たれている大部分は、代謝安定かつおそらく経口活性である、生物学的効力が増強したペプチドホルモンアナログまたは酵素阻害剤を開発する可能性に焦点が集まっている。本用語は、当業者に知られるペプチド主鎖修飾(すなわち、アミド結合模倣体)を特に含む。このような修飾は、アミド窒素、α－炭素、アミドカルボニル、アミド結合の完全置換、伸長、欠失または主鎖架橋の修飾を含む。Ψ[ＣＨ_２Ｓ]、ψ[ＣＨ_２ＮＨ]、ψ[ＣＳＮＨ_２]、ψ[ＮＨＣＯ]、ψ[ＣＯＣＨ_２]およびψ[(Ｅ)または(Ｚ)ＣＨ＝ＣＨ]を含むいくつかのペプチド主鎖修飾が知られる。上記命名法において、ψはアミド結合がないことを示す。アミド基に変わる構造を、括弧内に具体的に示す。

ここで使用するとき、２個の物が互いに「コンジュゲート」されるとき、それらは、直接または間接共有結合的または非共有結合的相互作用により連結される。ある態様において、結合は共有結合的である。他の態様において、結合は非共有結合的である。非共有結合的相互作用は、水素結合、ファンデルワールス力相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電気相互作用などを含む。間接共有結合的相互作用は、所望によりリンカー基を介して、２個の物が共有結合で結合するときである。「コンジュゲート」は、ここでは、検出可能な化学または生化学部分またはＰＥＧまたは血漿半減期の延長のために使用される他の部分コンジュゲートまたは結合されることを意味する。ある例において、ここに開示する１以上のペプチドは、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。このようなコンジュゲート組成物は、単価でも多価でもよい。例えば、コンジュゲート組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートしたここに開示する１個のペプチドを含み得る。あるいは、コンジュゲート組成物は、担体にコンジュゲートしたここに開示する２個以上のペプチドを含み得る。

「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は、中枢神経系における循環血液と脳および細胞外液を分ける、高度に選択的な半透膜関門である。ＢＢＢは、毛細血管壁内皮細胞、毛細血管を鞘で覆う星状細胞終足および毛細血管基底膜に包埋される周皮細胞により形成される。本システムは、ある分子の受動拡散による通過ならびに神経機能に重要なグルコース、水およびアミノ酸などの分子の選択的輸送を可能とする。タンパク質などの大型分子は概してＢＢＢを通過できない。しかしながら、一部ペプチドは種々の機構を介してＢＢＢを通過でき、また脳血管内皮細胞表面に存在するトランスポータータンパク質の特異的認識モチーフを含む一部タンパク質もＢＢＢを超える輸送がされる。

ここで使用する「薬学的に許容される担体」は、ヒトに投与するのに適する医薬などの医薬の製剤に使用することが許容される、１以上の溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で周知である。補助的活性成分も組成物に包含させ得る。

ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは約６０％アミノ酸配列相同性を共有するだけでなく(図１０および１１)、三次元構造が非常に類似している。ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦの何れも、柔軟性ループ領域により接続された２個の独立して折りたたまれたドメインからなる。二次構造は主にα－らせんであり、Ｎ末端ドメインに５個のα－らせんおよびＣ末端ドメインに３個のα－らせんがある。３個のジスルフィド架橋がＮ末端ドメインを安定化し、ＣＤＮＦのＣ末端ＣＲＡＣ(配列番号３２)配列、ＭＡＮＦのＣＫＧＣ(配列番号３３)が内部ジスルフィド架橋を形成する。このＣＸＸＣ(配列番号３４)ジスルフィド架橋はＣＤＮＦおよびＭＡＮＦ両者で見られる。ＣＸＸＣモチーフはＭＡＮＦおよびＣＤＮＦの神経保護活性に有益である。しかしながら、ここに示すデータは、ＣＸＸＣ(配列番号３４)モチーフが小アミノ酸(例えばグリシンおよびセリン)の付加などのある修飾を収容できる、すなわち特定のタイプのＣＸＸＸＣモチーフも使用され得ることを示す。ある態様において、ＣＤＮＦはNP_001025125.2(配列番号３７)に由来する配列を有する。ある態様において、ＭＡＮＦはNP_006001.5(配列番号３８)に由来する配列を有する。

ＭＡＮＦおよびＣＤＮＦペプチドに由来する天然に存在するアレルバリアントに加えて、コードされるＭＡＮＦ／ＣＤＮＦペプチドのアミノ酸配列を改変させる変化を、ＭＡＮＦ／ＣＤＮＦ配列への変異により導入し得る。「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に至るヌクレオチド置換を、ＭＡＮＦ／ＣＤＮＦペプチドの配列に行い得る。１以上の「非必須」置換を含むＭＡＮＦ／ＣＤＮＦペプチドまたはその機能的フラグメントは、ここに開示する野生型ＭＡＮＦ／ＣＤＮＦペプチドと等価であるとして見られ得る。

各アミノ酸は天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でもよい。用語「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように、天然アミノ酸に類似する構造を有する点で、天然アミノ酸の同類物である有機化合物をいう。非天然アミノ酸は、２０の一般に天然に存在するアミノ酸または稀天然アミノ酸セレノシステインまたはピロリシンではない修飾アミノ酸および／またはアミノ酸アナログであり得る。非天然アミノ酸は天然アミノ酸のＤ－異性体でもよい。

適当なアミノ酸の例は、アラニン、アロイソロイシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シクロヘキシルアラニン、２,３－ジアミノプロピオン酸、４－フルオロフェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ホモプロリン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ナフチルアラニン、ノルロイシン、フェニルアラニン、フェニルグリシン、ピペコリン酸、プロリン、ピログルタミン酸、サルコシン、セリン、セレノシステイン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、誘導体またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

用語「薬学的に許容される」は、ここでは、合理的な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答または他の問題または合併症なくヒトおよび動物の組織と接触させる利用に適し、合理的利益／リスク比に釣り合う、化合物、物質、組成物および／または投与形態をいうために用いる。

「薬学的に許容される塩」は、非毒性で、生物学的に忍容性であるまたは他の点で対象への投与に生物学的に適する、ここに示す化合物の遊離酸または塩基の塩を意味することを意図する。一般に、S.M. Berge, et al., “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19参照。好ましい薬学的に許容される塩は、薬理学的に有効でありかつ過度の毒性、刺激またはアレルギー性応答なく、対象の組織と接触させるのに適するものである。ここに記載する化合物は、十分に酸性の基、十分に塩基性の基、両タイプの官能基または１を超える各タイプを有し、よって、多数の無機または有機塩基および無機および有機酸と反応して、薬学的に許容される塩を形成し得る。

アミンなどの塩基性基を含むここに記載する化合物について、薬学的に許容される塩は、当分野で利用可能なあらゆる適当な方法により、例えば、遊離塩基を塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、硝酸、ホウ酸、リン酸などの無機酸または酢酸、フェニル酢酸、プロピオン酸、ステアリン酸、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、イセチオン酸、コハク酸、吉草酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、オレイン酸、パルミチン酸、ラウリン酸、グルクロン酸またはガラクツロン酸などのピラノシジル酸、マンデル酸、クエン酸または酒石酸などのアルファ－ヒドロキシ酸、アスパラギン酸またはグルタミン酸などのアミノ酸、安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、ナフトエ酸またはケイ皮酸などの芳香族酸、ラウリルスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸などの有機酸またはエタンスルホン酸などのスルホン酸またはここに例として示すもののなどの酸の適合性のあらゆる混合物および本テクノロジーにおける通常の技術レベルに照らして、等価または許容される代替として認識されるあらゆる他の酸およびそれらの混合物で処理して、製造し得る。

カルボン酸基などの酸性基を含むここに記載する化合物について、塩基付加塩を、当分野で利用可能なあらゆる方法により、例えば、このような化合物を十分量の所望の塩基と、そのまままたは適当な不活性溶媒で処理して、製造できる。薬学的に許容される塩基付加塩の例は、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、亜鉛またはマグネシウム塩または他の金属塩；アルキル、ジアルキル、トリアルキルまたはテトラ－アルキルアンモニウム塩などの有機アミノ塩を含むが、これらに限定されない。

薬学的に許容される塩の他の例は、カンシル酸塩、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン－１,４－二酸塩、ヘキシン－１,６－二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、プロピルスルホン酸塩、ベシル酸塩、キシレンスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ－ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩およびマンデル酸塩を含むが、これらに限定されない。他の適当な薬学的に許容される塩の一覧は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985に見ることができる。

中性形態の化合物を、好ましくは慣用法で塩と塩基または酸を接触させ、親化合物を単離することにより再生する。親形態の化合物は、極性溶媒での溶解度などある物理的性質が種々の塩形態と異なるが、それ以外、塩は本願の目的で親形態の化合物と等価である。

本発明の実施態様において、ペプチドまたはフラグメントの長さは８～３２アミノ酸、の範囲であり、ここで、ペプチドまたはそのフラグメントはここに記載するとおり、ＣＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｃ(配列番号２１)を含む。ある実施態様において、好ましいペプチドまたはフラグメントは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２アミノ酸からなり得る。ある実施態様において、ペプチドまたはフラグメントの長さは、８～２３、１１～２３、１２～２３、８～１１または８～１２アミノ酸の範囲内である。ある実施態様において、ペプチドまたはフラグメントの長さは、８～３１、８～２９、８～２７、８～２５、８～２３、８～２１、８～１９、８～１７、８～１５、１１～２７、１１～２５、１１～２３、１１～２１、１１～１９、１１～１７、１１～１５、１２～２５、１２～２３、１２～２１、１２～１９、１２～１７、１２～１５、２３～２７、２４～２７または２５～２７アミノ酸の範囲内である。フラグメントは、アラニン[Ａｌａ(Ａ)]、アルギニン[Ａｒｇ(Ｒ)]、アスパラギン[Ａｓｎ(Ｎ)]、アスパラギン酸[Ａｓｐ(Ｄ)]、システイン[Ｃｙｓ(Ｃ)]、グルタミン[Ｇｌｎ(Ｑ)]、グルタミン酸[Ｇｌｕ(Ｅ))]、グリシン[Ｇｌｙ(Ｇ)]、ヒスチジン[Ｈｉｓ(Ｈ)]、イソロイシン[Ｉｌｅ(Ｉ)]、ロイシン[Ｌｅｕ(Ｌ)]、リシン(Ｌｙｓ(Ｋ)]、メチオニン[Ｍｅｔ(Ｍ)]、フェニルアラニンＰｈｅ(Ｆ)]、プロリン[Ｐｒｏ(Ｐ)]、セリン[Ｓｅｒ(Ｓ)]、スレオニン[Ｔｈｒ(Ｔ)]、トリプトファン[Ｔｒｐ(Ｗ)]、チロシン[Ｔｙｒ(Ｙ)]およびバリン[Ｖａｌ(Ｖ)]ならびに非天然または修飾アミノ酸などの天然に存在するアミノ酸の何れを含んでもよい。

シクロチドは、植物から単離される小さなジスルフィドに富むペプチドである。シクロチドは、概して２８～３７アミノ酸を含み、頭－尾環化ペプチド主鎖および３個のジスルフィド結合の連動式配置を有する。植物シクロチドのファミリーは潜在的ＣＸＸＣおよびＣＸＸＸＣモチーフを伴う環状ペプチドを含み得るが、哺乳動物細胞でＣＤＮＦおよびＭＡＮＦがするのに類似する細胞保護的性質を有する、すなわちＥＲストレス誘導細胞機能不全または細胞死、例えばアポトーシスから保護することは知られていない。

ある実施態様において、本願発明ペプチドは、植物シクロチドまたは植物シクロチドのファミリーと関連しない。

好ましくは、本明細書に開示するペプチドは、チオレドキシンおよび／またはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーのタンパク質由来ではない。

本発明は、Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ(配列番号２１)
〔式中、
Ｘ_１はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、ＡおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；そして
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択される。〕
のレトロインベルソ形態のアミノ酸配列を含む８～３２アミノ酸の長さのペプチドまたはその薬学的に許容される塩を提供する。

好ましい実施態様において、ペプチドは、Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ(配列番号２２)
〔式中、
Ｘ_１はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、ＡおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択され；そして
Ｘ_４はＥ、Ｔ、Ｖ、Ｄ、ＭおよびＧからなる群から選択される。〕
のレトロインベルソ形態のアミノ酸配列を含む。

異なる種におけるＣＤＮＦおよびＭＡＮＦ配列の天然バリエーションに基づき(ヒト、ウマ、バイソン、ブタ、イヌ、マウス、ハムスター、アリゲーター、イルカおよびゼブラフィッシュＣＤＮＦおよびＭＡＮＦが図１１で配列例として使用される)、ヒト配列と比較してＸ基に関してペプチド配列における限定的変化が生物学的活性を失うことなく収容され得る。

他の好ましい実施態様において、ペプチドは、Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１(配列番号２３)
〔式中、
Ｘ_１はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、ＡおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_４はＥ、Ｔ、Ｖ、Ｄ、ＭおよびＧからなる群から選択され；
Ｘ_５は存在しないかまたはＨ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｙ、ＮおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_６は存在しないかまたはＳ、Ｄ、Ｇ、ＮおよびＲからなる群から選択され；
Ｘ_７は存在しないかまたはＷであり；
Ｘ_８は存在しないかまたはＧであり；
Ｘ_９は存在しないかまたはＫであり；
Ｘ_１０は存在しないかまたはＴ、Ｓ、Ａ、ＩおよびＮからなる群から選択され；そして
Ｘ_１１は存在しないかまたはＤおよびＥから選択される。〕
のレトロインベルソ形態のアミノ酸配列を含む。

他の好ましい実施態様において、ペプチドは、Ｘ_１２－Ｘ_１３－Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１(配列番号２４)
〔式中、
Ｘ_１はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、ＡおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_４はＥ、Ｔ、Ｖ、Ｄ、ＭおよびＧからなる群から選択され；
Ｘ_５は存在しないかまたはＨ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｙ、ＮおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_６は存在しないかまたはＳ、Ｄ、Ｇ、ＮおよびＲからなる群から選択され；
Ｘ_７は存在しないかまたはＷであり；
Ｘ_８は存在しないかまたはＧであり；
Ｘ_９は存在しないかまたはＫであり；
Ｘ_１０は存在しないかまたはＴ、Ｓ、Ａ、ＩおよびＮからなる群から選択され；そして
Ｘ_１１は存在しないかまたはＤおよびＥから選択され；
Ｘ_１２は存在しないかまたはＬ、ＩおよびＶからなる群から選択され；
Ｘ_１３は存在しないかまたはＤであり；
Ｘ_１４は存在しないかまたはＬおよびＷから選択され；
Ｘ_１５は存在しないかまたはＡ、Ｓ、Ｔ、ＥおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ_１６は存在しないかまたはＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は存在しないかまたはＶおよびＤから選択され；
Ｘ_１８は存在しないかまたはＤおよびＡから選択され；
Ｘ_１９は存在しないかまたはＬであり；
Ｘ_２０は存在しないかまたはＲ、Ｋ、ＳおよびＷからなる群から選択され；
Ｘ_２１は存在しないかまたはＫであり；
Ｘ_２２は存在しないかまたはＭ、Ｌ、ＩおよびＶからなる群から選択され；
Ｘ_２３は存在しないかまたはＲであり；
Ｘ_２４はＡ、Ｋ、Ｔ、ＬおよびＶからなる群から選択され；
Ｘ_２５はＱ、ＫおよびＲからなる群から選択され；そして
Ｘ_２６は存在しないかまたはＩおよびＶから選択される。〕
のアミノ酸配列内である、レトロインベルソ形態のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、ペプチドは、配列番号２４内の８～２３アミノ酸長ペプチドを含み、ここで、ペプチドはＣＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｃ(配列番号２１)モチーフを含む。

他の好ましい実施態様において、ペプチドは、
Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１(配列番号３５)、
Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０(配列番号３６)、
Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９(配列番号３７)および
Ｘ_１３－Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ(配列番号３８)。〕
からなる群から選択されるアミノ酸配列内である、レトロインベルソ形態のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ペプチドは、配列番号３５～３８内の何れか内の８～２３アミノ酸長ペプチドを含み、ここで、ペプチドはＣＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｃ(配列番号２１)モチーフを含む。

ある例において、ペプチドは、アミノ酸配列の配列番号３９内またはアミノ酸配列の配列番号４３内である、アミノ酸配列を含む。

好ましくは、ペプチド、特に－ペプチドは、ＫＥＡＣＡＲＣＥＥＧＷＳＨＬＩＱＫＬＥＡＶＲＭ(配列番号２)、ＫＥＡＣＧＫＣＴＥＧＷＤＤＬＩＫＫＬＥＫＶＲＬ(配列番号４)、ＴＫＥＡＣＡＲＣＥＥＧ(配列番号６)、ＳＫＥＡＣＧＫＣＴＥＧ(配列番号８)、ＴＫＥＡＣＡＧＲＣＥＥＧ(配列番号１０)、ＳＫＥＡＣＧＧＫＣＴＥＧ(配列番号１２)、ＫＥＡＣＡＲＣＥＥ(配列番号１４)、ＫＥＡＣＧＫＣＴＥ(配列番号１６)、ＥＡＣＡＲＣＥＥ(配列番号１８)およびＥＡＣＧＫＣＴＥ(配列番号２０)からなる群から選択される配列からなり、ここで、ペプチドの全アミノ酸はＤ－アミノ酸である。

ある実施態様において、ペプチドは、小胞体(ＥＲ)ストレス誘導細胞機能不全または細胞死、例えばアポトーシスから保護する。

ある実施態様において、ペプチドのＮ末端はアセチル化される。ある実施態様において、ペプチドのＣ末端はアミド化され得る。ある実施態様において、ペプチドのＮ末端はアセチル化され、ペプチドのＣ末端はアミド化され得る。

ある実施態様において、ペプチドはシュードペプチドである。

ある実施態様において、ペプチドは環状である。

ある例において、ペプチドは１１～３２アミノ酸長である。ある例において、ペプチドは１２～３２アミノ酸長である。ある例において、ペプチドは１２～２３アミノ酸長である。ある例において、ペプチドは８～２３アミノ酸長である。ある例において、ペプチドは８～１３アミノ酸長である。ある例において、ペプチドは８～１２アミノ酸長である。

好ましい実施態様において、修飾ペプチドシステイン(Ｃ)は、還元形態またはジスルフィド架橋形態である。

ある実施態様において、ここに記載するペプチドはＧＲＰ７８に結合する。

ある態様において、ここに記載するペプチドは、その親対応物より少なくとも１.５倍安定である。ある実施態様において、ここに記載するペプチドは、その親対応物より少なくとも２倍、３倍または４倍安定である。ある態様において、ペプチドｄｅｓｃｒｉｂｅｄは、その親対応物より少なくとも１.５倍長い半減期を有する。ある実施態様において、ここに記載するペプチドは、その親対応物より少なくとも２倍、３倍または４倍長い半減期を有する。

ある態様において、ペプチドは、ペプチドのＮ末端からＣ末端へ接続させる結合を含み得る。

ある態様において、ペプチドのＮ末端はアセチル化され得る。ある態様において、ペプチドのＣ末端はアミド化され得る。ある態様において、ペプチドのＮ末端はアセチル化されてよく、ペプチドのＣ末端はアミド化されてよい。

他の好ましい実施態様において、ペプチドは、検出可能な部分、化学部分または生化学部分またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)にコンジュゲートされる。

ペプチドは、フルオロフォア(例えばフルオレセインまたはローダミン)などの検出可能な化学または生化学部分にコンジュゲートされ得る。例えばＳＰＥＣＴまたはＰＥＴ造影に使用するために、ペプチドの放射標識を使用し得る。ここで使用する「検出可能な化学または生化学部分」は、可視、蛍光、化学発光または他の検出可能な化学タグ；基質存在下検出可能である酵素、例えば、ＮＢＴとＢＣＩＰと組み合わせたアルカリホスファターゼまたは適当な基質と組み合わせたペルオキシダーゼ；検出可能なタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質から選択される検出可能な分子などの、ペプチドの検出を容易にする目的のアミノ酸配列または検出可能な化学または生化学部分を示す化学タグを意味する。好ましくは、タグはフラグメントの標的細胞への浸透を阻止または妨害せずまたは他に化合物の生物学的活性を変えない。

ペプチドまたはフラグメントの安定性および／または細胞透過性をさらに増加させるためのＣ末端ＣＤＮＦフラグメントまたはＣ末端ＭＡＮＦフラグメントのＮおよび／またはＣ末端修飾も好ましい。ＣＤＮＦフラグメントまたはＭＡＮＦフラグメントの末端のアセチル化－アミド化(すなわちＮ末端アセチル化およびＣ末端アミド化)は、当分野で知られる選択肢の一つである(例えばMarino et al. 2015, ACS Chem. Biol. 10: 1754-1764参照)。

ある例において、ここに記載するペプチドは、次の性質の少なくとも１個(例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個)を有する：(ｉ)ペプチドは、ＴＨ陽性ニューロンをＭＰＰ^＋毒性から用量依存的に保護できる；(ii)ペプチドは、ＴＨ陽性ニューロンにおけるアルファ－シヌクレイン封入体の数を減少させる；(iii)ペプチドは、その親対応物と比較して改善された血漿での安定性を有する；(iv)ペプチドは、その親対応物と比較して改善された肝細胞での安定性を有する；または(ｖ)ペプチドは、その親対応物と比較して改善された血液脳関門を通過する能力を有する。

ある実施態様は、医薬として使用するためのここに記載するペプチドを提供する。

ＣＤＮＦ／ＭＡＮＦペプチドがドパミンニューロンを死滅から強力に保護するため、ＷＯ２００９１３３２４７およびＥＰ１９６９００３などの先行技術は、該ペプチドがアルツハイマー病、パーキンソン病(ＰＤ)、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、前頭側頭葉変性、レヴィ小体型認知症、軽度認知機能障害、ハンチントン病(ＨＤ)、外傷性脳傷害、薬物嗜癖および卒中などの中枢神経系(ＣＮＳ)疾患の処置に使用できることを示している。

ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは小胞体ストレス応答(ＵＰＲ)経路のシグナル伝達を調節し、細胞をＥＲストレス関連細胞死から保護する。ＥＲストレスは、神経変性および代謝疾患などの種々の慢性疾患ならびに急性傷害に重要な病態生理学的役割を演ずることが知られている(Wang and Kaufman, 2016)。ＧＲＰ７８(別名ＢｉＰおよびＨＳＰＡ５)は主要ＥＲ管腔シャペロンであり、ＵＰＲの主要制御因子である(Bertolotti et al, 2000; Wang and Kaufman, 2016)。ＧＲＰ７８とＵＰＲ受容体ＩＲＥ１α、ＰＥＲＫおよびＡＴＦ６の動的会合および解離は、ＥＲストレス下のＵＰＲ受容体のシグナル伝達活性を制御する重要な段階である。ＭＡＮＦとＧＲＰ７８の相互作用は、その細胞活性を制御する(Yan et al, 2019)。

従って、本発明は、ＣＮＳ疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害または病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患を処置する方法であって、配列Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ(配列番号２１)、Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ(配列番号２２)、Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１(配列番号２３)またはＸ_１２－Ｘ_１３－Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１(配列番号２４))を含む８～３２アミノ酸ペプチドであって、該アミノ酸配列のレトロインベルソ形態であるペプチドの薬学的有効量を、患者に投与することを含む、方法に関する。

他の実施態様は、神経変性疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害の処置に使用するための、ペプチドを提供する。

該神経変性疾患または障害は、好ましくはパーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性、レヴィ小体型認知症、軽度認知機能障害、ハンチントン病、外傷性脳傷害、外傷性脊髄傷害、進行性核上性麻痺、ピック病、純粋自律神経不全症、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、脊髄小脳失調症、双極性障害および末梢ニューロパチーならびにその疾患および障害のスペクトルからなる群から選択される中枢神経系疾患である。

神経変性疾患は、広範な脳タンパク質症に帰する一部重複する、動的非線形進行性「次元」であり得る。中枢神経系内の複数タンパク質のいくつかの組み合わせの発現において可変性が生じ得る。故に、患者で、混合型神経病理の併存が観察され得る。神経変性疾患の遺伝的スペクトルは変わり得て、例えば、同じ遺伝子型を有する一卵性双子で異なる疾患が顕在化し得る。

他の実施態様は、ウォルコット・ラリソン症候群、ウォルフラム症候群、マリネスコ・シェーグレン症候群、マシャド・ジョセフ病および網膜色素変性症などの変性網膜疾患および一次性ネフローゼ症候群および常染色体優性多嚢胞性腎臓疾患などの遺伝性ネフローゼ症候群からなる群から選択される単遺伝子遺伝性疾患の処置に使用するための、ペプチドを提供する。該単遺伝子遺伝性疾患は、病原性因子としてＥＲストレスを有する疾患である。

ある実施態様は、本発明に従い使用するためのペプチドを提供し、ここで、該ペプチドは、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、眼内、鼓室内または局所投与などの末梢投与、経口、直腸、舌下または頬側投与、腹腔内、筋肉内、関節内、経皮、蝸牛内、局所眼または吸入投与を含む経腸、非経腸または局所経路または吸入投与または頭蓋内、髄腔内、硬膜外または病巣内投与により投与される。

ある実施態様において、ペプチドは皮下投与により投与される。

医薬組成物
ここに開示するペプチドの１以上を、医薬組成物として使用するためにまた医薬組成物に製剤化し得る。このような組成物は、何れかの経路、例えば、適切な当局により承認された何れかの経路により、対象に投与するために製剤化するまたはそれに適応させることができる

ある実施態様は、ここに記載するペプチドおよび次の薬学的に許容される担体、薬学的に許容される添加物、防腐剤、安定化剤および／または希釈剤の少なくとも１個を含む、医薬組成物を提供する。

ある実施態様において、本発明は、さらに配列Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ(配列番号２１)、Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ(配列番号２２)、Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１(配列番号２３)またはＸ_１２－Ｘ_１３－Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１(配列番号２４)を含む、８～３２アミノ酸の長さのペプチドであって、前記配列の何れかのアミノ酸配列のレトロインベルソ形態であるペプチドを含む、医薬組成物に関する。

ある例において、医薬組成物は、有効量の１以上のペプチドを含み得る。ここで使用する用語「有効量」および「処置に有効」は、その投与の状況内において、意図する効果または生理学的アウトカムをもたらすのに有効である、一定期間利用される(急性または慢性投与および定期的または連続的投与を含む)１以上のここに記載する化合物または医薬組成物の量または濃度をいう。

本発明のある実施態様において、ペプチドは医薬組成物に組み込まれ得る。このような本発明の組成物は、所望の純度のペプチドと、所望の生理学的に許容される担体(例えばナノ担体)、添加物、緩衝液または安定化剤(Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Allen, Loyd V., Jr, Ed., (2012))の混合により、凍結乾燥ケーキまたは水溶液で保存するために調製される。許容される担体、添加物または安定化剤は、用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；および／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性界面活性剤またはキトサン、メチル化ペクチン、アルキル糖類ベースの粘膜吸収増強剤およびＰＥＧのヒドロキシ脂肪－アシルエステルなどの鼻から脳への送達を増強する添加物を含む。

患者に投与するペプチドの実際の投与量(例えば、有効量)は、体重、状態の重症度、処置する疾患のタイプ、以前のまたは現在の治療介入、患者が特発的に示す応答(idiopathy)および投与経路などの身体的および生理学的因子により決定され得る。投与を行う実施者は、個々の対象について組成物中の活性成分の濃度および適切な用量を決定できる。

ペプチドを、例えば、慣用技術または界面重合(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－(メチルメタシラート)マイクロカプセル)により製造したマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョンに封入し得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Allen, Loyd V., Jr, Ed., (2012)に開示される。制御放出ゲル製剤も適用され得る。

ある実施態様において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０.１％の活性化合物を含み得る。他の実施態様において、活性化合物は、重量単位で約２％～約７５％または、例えば約２５％～約６０％およびこの間に入る何らかの範囲で含まれ得る。

他の非限定的例において、医薬組成物または製剤の１用量は、約１ng／kg／体重、約５ng／kg／体重、約１０ng／kg／体重、約５０ng／kg／体重、約１００ng／kg／体重、約２００ng／kg／体重、約３５０ng／kg／体重、約５００ng／kg／体重、１μg／kg／体重、約５μg／kg／体重、約１０μg／kg／体重、約５０μg／kg／体重、約１００μg／kg／体重、約２００μg／kg／体重、約３５０μg／kg／体重、約５００μg／kg／体重、約１mg／kg／体重、約５mg／kg／体重、約１０mg／kg／体重、約５０mg／kg／体重、約１００mg／kg／体重、約２００mg／kg／体重、約３５０mg／kg／体重、約５００mg／kg／体重のペプチド～約１０００mg／kg／体重またはそれ以上のペプチド(この間に入る何らかの範囲)を、投与あたり含み得る。ここに挙げる数値範囲に入る非限定的例において、約５mg／kg／体重～約１００mg／kg／体重、約５μg／kg／体重～約５００mg／kg／体重のペプチドなどの範囲を、上記数値に基づき投与し得る。

ここでの方法は、所望のまたは記載する効果を達成するために、有効量の化合物または複合組成物の投与を意図する。概して、本発明の医薬組成物は、１日約１～約６回、例えば１日１～２回、１～３回、１～４回、１～５回、２～３回、２～４回または２～５回または連続的点滴として投与される。医薬組成物を、１日あたり例えば１回、２回、３回、４回、５回または６回投与し得る。このような投与を慢性または急性治療として使用できる。単一剤形を産生するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置する宿主および特定の投与方法により変わる。典型製剤は、約５％～約９５％の活性化合物(ｗ／ｗ)を含む。あるいは、このような製剤は、約２０％～約８０％の活性化合物を含む。

投与は、種々の技術を使用して決定され得る。選択する投与量レベルは、例えば、用いる特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄もしくは代謝速度、処置期間、用いる特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態および／または病歴および医学分野で周知のこのような因子を含む、多様な因子に依存し得る。投与量値はまた軽減すべき状態の重症度によっても変わり得る。ある特定の対象について、具体的投与量レジメンは、個々の必要性および組成物を投与するまたは投与を監督する者の専門的判断により、経時的に調節され得る。

ある態様において、本発明化合物の適当な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である化合物の用量であり得る。このような有効用量は、一般に上記因子に依存する。ある患者で最も有効な処置をもたらすであろう特定の化合物の厳密な投与時間および量は、特定の化合物の活性、薬物動態およびバイオアベイラビリティ、患者の生理学的状態(年齢、性別、疾患タイプおよびステージ、一般的身体状態ある投与量への応答および投薬タイプを含む)、投与経路などに依存する。

医師または獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を処方できる。例えば、医師または獣医師は、医薬組成物における本発明の化合物を、所望の治療効果を達成するために必要であるより低いレベルの投与で開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増やす。

ここに記載する医薬組成物は、厳密な投与量の単回投与に適する単位剤形であり得る。単位剤形において、製剤を、適切な量の１以上の化合物を含む単位用量に分割する。単位投与量は、個別の量の製剤を含むパッケージの形態であり得る。非限定的例は、バイアルまたはアンプル中の液体である。水性懸濁液組成物は、単回用量の再密封できないコンテナに包装され得る。複数用量再封可能コンテナは、例えば、防腐剤と組み合わせて使用され得る。非経腸注射用製剤は、例えば、アンプルまたは多回用量コンテナに防腐剤と共に単位剤形で提供され得る。

用語「薬学的に許容される担体またはアジュバント」は、本発明の化合物と共に患者に投与でき、化合物の治療量の送達に十分な用量で投与したとき、その薬理学的活性を破壊せずかつ非毒性である、担体またはアジュバントをいう

本発明の医薬組成物で使用され得る薬学的に許容される担体、アジュバントおよび媒体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達系(ＳＥＤＤＳ)、例えばＤ－アルファ－トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート、Ｔｗｅｅｎｓなどの医薬剤形で使用される界面活性剤または他の類似ポリマー送達マトリクス、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸などの緩衝剤、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸塩、蝋、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含むが、これらに限定されない。

本発明の医薬組成物は、あらゆる慣用の非毒性薬学的に許容される担体、アジュバントまたは媒体を含み得る。ある場合、製剤のｐＨを、薬学的に許容される酸、塩基または緩衝液で調節して、製剤化した化合物またはその送達形態の安定性を増強し得る。ここで使用する用語非経腸は、非経腸、硬膜外、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または点滴技術を含む。

本発明の化合物の有効量を、単回または複数回投与、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回または投与方法の何れかにより許容される何らかの適当な回数で投与し得る。投与回数は、上記値の任意の２つにより定義された範囲内であり得る。選択した投与経路に関わらず、本発明の化合物および／または本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される投与形態に製剤化される。本発明の化合物を、他の医薬と同様、ヒトまたは動物用医薬に使用する何らかの慣用法において投与のために製剤化し得る。

ある態様において、本発明は、１以上の薬学的に許容される担体(添加物)および／または希釈剤と共に製剤化された、上記化合物の１以上の治療有効量を含む、医薬製剤を提供する。ある態様において、ここに記載する化合物の１以上を非経腸投与用に製剤化し、ここに開示する化合物の１以上を、水性または非水溶液、分散剤、懸濁液またはエマルジョンまたは使用直前に無菌注射用溶液または分散体で再構成され得る無菌粉末として製剤化し得る。このような製剤は、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にするための溶質または懸濁もしくは濃化剤を含み得る。これら組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含み得る。対象化合物に対する微生物の影響を、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含により確実に阻止し得る。組成物に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を入れることが望まれることもある。さらに、注射用医薬形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延させる薬剤を入れることによりもたらされ得る。所望により、製剤を、使用前に、例えば、等張食塩水溶液またはデキストロース溶液で希釈し得る。ある例において、化合物を水溶液として製剤化し、静脈内投与する。

医薬組成物は注射用溶液または粉末の形態であり得る。このような組成物は、適当な分散または湿潤剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ８０など)および懸濁化剤を使用して当分野で知られる技術により製剤化され得る。無菌注射用製剤は、非毒性の非経腸的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液、例えば、１,３－ブタンジオール溶液であり得る。特に用いられ得る許容される媒体および溶媒は、マンニトール、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌、固定油は、溶媒または懸濁媒体として慣用的に用いられる。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含むあらゆる非刺激固定油を用い得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、注射用製剤に有用であり、オリーブ油またはヒマシ油、特にそのポリオキシエチル化バージョンなどの天然の薬学的に許容される油と同様である。これら油溶液または懸濁液は、エマルジョンおよびまたは懸濁液などの薬学的に許容される投与形態の製剤で一般に使用される長鎖アルコール希釈剤または分散剤またはカルボキシメチルセルロースまたは類似分散剤も含み得る。ＴｗｅｅｎｓまたはＳｐａｎｓなどの他の一般的に使用される界面活性剤および／または薬学的に許容される固体、液体または他の投与形態の製造に一般に使用される他の類似乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤も、製剤の目的で使用され得る。

医薬組成物は、カプセル、錠剤、エマルジョンおよび水性懸濁液、分散剤および溶液を含むが、これらに限定されないあらゆる経口に許容される剤形で経口投与され得る。経口使用の錠剤の場合、一般的に使用される担体はラクトースおよびトウモロコシデンプンを含む担体である。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も概して添加される。カプセル形態の経口投与について、有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンを含む。水性懸濁液および／またはエマルジョンを経口投与するとき、活性成分を、乳化および／または懸濁化剤と組み合わせて油相に懸濁または溶解させ得る。所望により、ある甘味剤および／または風味剤および／または着色剤を加え得る。

本発明の医薬組成物は、直腸投与用坐薬の形態でも投与され得る。これら組成物は、本発明の化合物と、室温で固体であるが、直腸温度で液体であり、それ故に直腸で溶解して活性内容物を放出する適当な非刺激性添加物を混合することにより調製し得る。このような物質は、カカオバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されない。

これとは別にまたはこれに加えて、医薬組成物を、経鼻エアロゾルまたは吸入により投与し得る。このような組成物を、医薬製剤の分野で周知の技術により調製し、当分野で知られるベンジルアルコールまたは他の適当な防腐剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フッ化炭素および／または他の可溶化または分散剤を用いて、食塩水中の溶液として調製し得る。

ある例において、ここに開示する１以上のペプチドは、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。このようなコンジュゲート組成物は、単価でも多価でもよい。例えば、コンジュゲート組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートしたここに開示する１個のペプチドを含み得る。あるいは、コンジュゲート組成物は、担体にコンジュゲートしたここに開示する２個以上のペプチドを含み得る。

ここに提供されるのは、ここに記載するペプチドを使用する方法である。例えば、ここに提供する方法は、患者にここに記載するペプチドを投与することを含む。患者は、哺乳動物および非哺乳動物両者を含み得る。

薬学的に許容される担体は、選択した投与経路および標準的薬務に基づき、選択され得る。例えば、組成物を、経口投与用溶液剤、懸濁液剤、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤またはエリキシル剤または非経腸投与および腹腔内注射用無菌溶液無菌溶液または懸濁液または懸濁液剤ならびに経皮パッチ製剤に経皮パッチ製剤、乾燥粉末吸入器および軟膏剤などの、適当な医薬製剤に製剤化し得る(例えば、Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition 1985, 126参照)。ペプチドおよび／または免疫グロブリンは、医薬製剤の分野で標準的な実施に従い剤形に製剤化し得る。Alphonso Gennaro, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa参照。

非経腸投与について、医薬組成物は、適当な担体または希釈剤、例えば水、油(特に植物油)、エタノール、食塩水溶液、水性デキストロース(グルコース)および関連糖溶液、グリセロールまたはグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールを含み得る。非経腸投与用溶液は、好ましくはペプチドおよび／または活性剤の水溶性塩を含む。安定化剤、抗酸化剤および防腐剤も加え得る。適当な抗酸化剤は、亜硫酸、アスコルビン酸、クエン酸およびその塩およびナトリウムＥＤＴＡを含む。適当な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、メチル－またはプロピル－パラベンおよびクロロブタノールを含む。非経腸投与用添え遺物は、水性または非水溶液、分散体、懸濁液またはエマルジョンの形をとり得る。

経口投与について、医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤またはその他適当な経口剤形の製造のための１以上の固体不活性成分を含み得る。例えば、医薬組成物は、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤または滑沢剤などの少なくとも１個の添加物を含み得る。

本発明はまた神経細胞をさらに含み得る医薬組成物にも関する。神経細胞は、例えば、ニューロン、神経幹細胞または神経前駆体細胞であり得る。

本発明は、医薬として使用するための、ここに記載するペプチドおよび次の薬学的に許容される担体、添加物、防腐剤、安定化剤および／または希釈剤の少なくとも１個を含む医薬組成物に関する。

処置方法において、薬学的有効量のここに定義するペプチドが患者に投与される。換言すると、本発明のペプチドは、ＣＮＳ疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害、病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患の処置に使用するためである。

医薬組成物は、神経変性疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害の処置に使用するためである。

該神経変性疾患または障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性、レヴィ小体型認知症、軽度認知機能障害、ハンチントン病、外傷性脳傷害、外傷性脊髄傷害、進行性核上性麻痺、ピック病、純粋自律神経不全症、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、脊髄小脳失調症および末梢ニューロパチーからなる群から選択される中枢神経系疾患である。

ある実施態様において、医薬組成物は皮下投与により投与される。

ペプチドの投与経路は、既知の方法ならびに静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、眼内、鼓室内または局所投与による注射または注入、経腸、非経腸または経口、直腸、舌下または頬側投与を含む局所経路、頭蓋内、髄腔内または硬膜外、腹腔内、筋肉内、関節内、経皮、蝸牛内、局所眼、病巣内または吸入投与または下記のとおり持続放出系の一般的経路による。

持続性製剤の適当な例は、ペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、そのマトリクスは成型品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)およびLanger, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)に記載のヒドロゲルまたはポリビニルアルコール、ポリラクチド(米国特許３,７７３,９１９、ＥＰ５８,４８１)または分解不可能なエチレン－ビニルアセテート(Langer et al., supra)を含む。

本発明はまたＣＮＳ疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害、病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患を処置する方法にも関し、ここで、薬学的有効量のここに定義するペプチドが患者に投与される。好ましくは、該フラグメントは末梢性に投与される。経口投与も好ましい投与形態である。

本発明は、ＣＮＳ疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害または病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患の処置用医薬の製造のための、ここに定義するペプチドの使用にも関する。

本発明はまた処置を必要とする対象における神経変性疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害を処置する方法であって、対象にここに記載するペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

ある実施態様において、パーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性、レヴィ小体型認知症、軽度認知機能障害、ハンチントン病、外傷性脳傷害、外傷性脊髄傷害、進行性核上性麻痺、ピック病、純粋自律神経不全症、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、脊髄小脳失調症および末梢ニューロパチーからなる群から選択される中枢神経系疾患などの神経変性疾患または障害を処置する方法は、対象にここに記載するペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む。

本発明は、ウォルコット・ラリソン症候群、ウォルフラム症候群、マリネスコ・シェーグレン症候群、マシャド・ジョセフ病および網膜色素変性症などの変性網膜疾患および一次性ネフローゼ症候群および常染色体優性多嚢胞性腎臓疾患などの遺伝性ネフローゼ症候群からなる群から選択される単遺伝子遺伝性疾患を処置する方法であって、対象にここに記載するペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。該単遺伝子遺伝性疾患は、病原性因子としてＥＲストレスを有する。

処置を必要とする対象はヒトであり得る。

本発明のペプチドまたは該ペプチドを含む医薬組成物は、点滴により連続的にまたはボーラス注射により投与され得る。一般に、障害から可能であるならば、部位特異的送達のためにフラグメントを製剤化し、投与すべきである。投与は連続的または定期的であり得る。投与は、定量またはプログラムされた流量のインプラント可能ポンプまたは定期的注射により達成され得る。本発明により、レトロインベルソペプチドが神経細胞膜ならびにインビトロおよびインビボで血液－脳－関門(ＢＢＢ)を効率的に浸透できることが示されたため、末梢または全身投与が好ましい(それぞれ図８および９Ｂ)。他の好ましい投与経路は皮下、髄腔内、脳室内、鼻腔内または経皮投与である。

他の実施態様において、本発明は、ドパミン作動性ニューロンと、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の配列を、該アミノ酸配列のレトロインベルソ形態で含む、８～３２アミノ酸のペプチドを接触させる段階を含む、ドパミン作動性ニューロンの生存を促進する方法を提供する。好ましくは、方法は、下の実験の章に示すとおり、インビトロで実施する。該ドパミン作動性ニューロンは、好ましくはマウスまたはラット交感ニューロンなどの培養非ヒトニューロンまたは誘導多能性細胞(ｉＰＳＣ)由来ヒトニューロンである。

本明細書に提供する結果に基づき、本発明はまた、ＣＮＳ疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害または障害、病原性因子としてＥＲストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患の処置に使用するための、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の配列を、該アミノ酸配列のレトロインベルソ形態で含む、８～３２アミノ酸のペプチドにも関する。

ペプチドの製造方法
本発明の化合物を合成する方法は、当分野で知られる。次の例示的方法が使用され得る。種々の工程を、所望の化合物を得るために別の順序または順番で実施し得ることは認識される。ここに記載する化合物の合成に有用な合成化学変換および保護基方法論(保護および脱保護)は当分野で知られ、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthes；およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)およびそれらのその後の版に記載されているものなどを含む。

本発明のペプチドは、当業者に周知の化学合成方法により製造され得る。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77参照。

Ｏここに記載するペプチドを製造する一つの方法は、固相ペプチド合成(ＳＰＰＳ)の使用である。Ｃ末端アミノ酸を、リンカー分子を用いて酸不安定結合を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合させる。この樹脂は合成に使用する溶媒に不要性であり、比較的単純で速く、過剰の試薬および副産物を洗い流すことができる。Ｎ末端を、酸に安定であるが、塩基で除去可能なＦｍｏｃ基で保護する。あらゆる側鎖官能基を、塩基安定、酸不安定基で保護する。

本発明の背景を明らかにする、特に、実施についてさらなる詳細を提供するためにここで使用した刊行物および他の資料を、引用により本明細書に包含させる。

技術の進歩に連れて、本発明の基本的考えが種々の方法で実施され得ることは、当業者には明らかである。従って、本開示およびその実施態様は、下記実施例に限定されず、特許請求の範囲の範囲内で変化し得る。

実施例１
ＭＰＰ＋傷害パミン作動性ＴＨ陽性ニューロンに対する親およびレトロインベルソ化合物の神経保護効果
化合物１～２０(配列番号１～２０、親およびレトロインベルソ)の神経保護効果を、ラット胚中脳ニューロンの一次培養物を、神経毒１－メチル－４－フェニル－１,２,３,６－テトラヒドロピリジン(ＭＰＴＰ)の活性代謝物であるＭＰＰ＋で負荷したインビトロモデルで試験した。ＭＰＰ＋は、ミトコンドリア機能不全、ペルオキシナイトライトの産生、酸化的ストレス、ＥＲストレスおよびアポトーシスの誘導を含む多様な毒性機構でドパミン作動性(ＴＨ陽性)ニューロンを死滅させる。ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦのＣ末端ドメイン由来のペプチドがレトロインベルソペプチドに修飾されたため、神経保護活性を、完全長ＣＤＮＦタンパク質がＭＰＰ＋誘導傷害(図２Ａ)およびＴＨ＋ニューロンにおけるアルファ－シヌクレイン凝集体の蓄積減少(図２Ｂ)からＴＨ＋ドパミンニューロン、シナプスおよび神経突起ネットワークを神経保護的に保護することが示されている、モデルで試験した

材料および方法
ペプチドの合成および特徴づけの材料および方法。
標準固相ペプチド合成方法を、線形(Ｌ－ａａ)およびレトロインベルソ(Ｄ－ａａ)ペプチドの産生に使用した。

ペプチド－ＳＰＰＳ合成に使用した一般的プロトコール
固相ペプチド合成を、自動ペプチド合成装置で実施した(Biotage Initiator+ AlstraまたはActivotec Activo-P11)。ペプチド伸長のために標準Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ(Ｐｂｆ)、Ａｓｐ(ｔＢｕ)、Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)、Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ(ｔＢｕ)、Ｔｈｒ(ｔＢｕ)、Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)、ＶａｌおよびＣｙｓ(ＳｔＢｕ)。２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を使用してＦｍｏｃ基を除去し、マイクロ波照射下、４当量の対応するアミノ酸、３.９当量のＨＢＴＵ、４当量のＨＯＢｔおよび８当量のＤＩＰＥＡを使用してキャッピングした。粗製ペプチドを脱保護し、ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／ｉＰｒ_３ＳｉＨで２時間の処理により樹脂から開裂させ、続いて冷Ｅｔ_２Ｏで沈殿させた。

レトロインベルソペプチドの場合、Ｆｍｏｃ保護Ｌ－アミノ酸の代わりに標準Ｆｍｏｃ保護Ｄ－アミノ酸を使用した。必要なレトロインベルソペプチドが得られるように、Biofage Initiatorペプチドシンセサイザーでの開始前に逆配列に留意すべきである。

ペプチドの品質対照を、標準液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー方法を使用して得た。図１(カラム５)は、ペプチドのＭＳ分析で同定したピークを示す

中脳ニューロンの培養。
ラットドパミン作動性ニューロンを、Visanji et al., 2008により記載のとおり培養した。簡潔には、１５日齢ラット胚(Janvier, France)から得た中脳を切除し、ドパミン作動性ニューロンに富む脳の発達中の領域である中脳弯曲部の腹側部分を、細胞調製のために使用した。中脳細胞を、２０分間、３７℃でトリプシン処理することにより解離させた(最終濃度０.０５％トリプシンおよび０.０２％ＥＤＴＡの溶液)。ＤＮＡａｓｅＩグレードII(０.５mg／mL)および１０％のウシ胎児血清(ＦＣＳを含むダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)を加えて、反応を停止させた。次いで、１０mlピペットを３回通すことにより、細胞を機械的に解離させた。次いで、細胞をＬ１５中ＢＳＡ(３.５％)の層上で１８０×ｇで１０分間、＋４℃で遠心分離した。細胞ペレットをＢ２７(２％)、Ｌ－グルタミン(２mM)および２％のＰＳ溶液および１０ng／mlの脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)および１ng／mLのグリア由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)を添加したNeurobasal(Invitrogen)からなる規定の培養無血清培地に再懸濁した。生存可能細胞を、トリパンブルー排除試験を使用して、Neubauer血球計算器で計数した。細胞を、９６ウェルプレート(ポリ－Ｌ－リシンでプレコート)中４００００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃で５％ＣＯ_２／９５％空気雰囲気の加湿インキュベーターに維持した。培地の半分を、２日毎に新鮮培地に交換した。９６ウェルプレートで、６０ウェルのみ使用する。何らかの縁効果を回避するために、第一列および行は培養に使用せず、無菌水で満たした

試験化合物およびＭＰＰ＋暴露。
培養６日目、ＣＤＮＦまたは化合物１～２０(配列番号１～２０、親およびレトロインベルソ)、を培養培地に溶解し、次いで中脳ニューロンと４時間プレインキュベートし、その後ＭＰＰ＋を適用した。化合物のプレインキュベーション４時間後、ＭＰＰ＋を、対照培地で希釈した４μMの最終濃度で、なお化合物存在下、４８時間加えた。

免疫染色：ＴＨニューロン生存、ＴＨニューロンにおける神経突起ネットワークおよびα－ｓｙｎ凝集。
中毒させた４８時間後、細胞を、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液、ｐＨ７.３で２０分間、室温で固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、透過性処理し、非特異的部位を、０.１％のサポニンおよび１％ＦＣＳを含むＰＢＳ溶液で１５分間、室温で遮断した。次に、細胞を、(ａ)マウスで産生したモノクローナル抗体抗チロシンヒドロキシラーゼ(ＴＨ)の１：１００００希釈および(ｂ)ウサギで産生したポリクローナル抗体抗アルファ－シヌクレイン(ａＳｙｎ)抗体の１％ＦＣＳ、０.１％サポニン含有ＰＢＳ中１：４００希釈でと２時間、室温でインキュベートした。これら抗体を、１：８００希釈した二次抗体Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスＩｇＧおよび１％ＦＣＳ、０.１％サポニン含有ＰＢＳで１：４００希釈したAlexa 568ヤギ抗ウサギＩｇＧで、１時間、室温で確認した。

シナプス免疫染色：ＴＨニューロンおよびＰＳＤ－９５(ＴＨ／ＰＳＤ－９５ニューロン間の重複)。
中毒させた４８時間後、細胞培養上清を除去し、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液、ｐＨ７.３で２０分間、室温で細胞を固定させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、透過性処理し、非特異的部位を、０.１％のサポニンおよび１％ＦＣＳを含むＰＢＳ溶液で１５分間、室温で遮断した。次いで、細胞を、ａ)１％ＦＣＳ、０.１％サポニン含有ＰＢＳで１：１００００希釈したモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼ(ＴＨ)抗体と２時間、室温およびｂ)１％ＦＣＳ、０.１％サポニン含有ＰＢＳ溶液で１：２００希釈したポリクローナル抗シナプス後膜肥厚タンパク質－９５(ＰＳＤ－９５)抗体で２時間、室温とインキュベートした。この抗体はシナプスを特異的に染色する。これら抗体を、１：８００希釈のAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスＩｇＧおよび１％ＦＣＳ、０.１％サポニン含有ＰＢＳで１：４００希釈したAlexa Fluor 568ヤギ抗ウサギＩｇＧで、１時間、室温で確認した。

各条件について、全ウェル領域を表す画像を、ImageXpress(Molecular Devices)で１０倍(２０図、ＴＨおよびα－ｓｙｎについて)または４０倍(６０図、ＴＨおよびＰＳＤ－９５について)倍率を使用して自動的に取得した。次の読出しを、Custom Module Editor(Molecular Devices)を使用して、自動的に決定した：
－ＴＨニューロン総数の分析(ＴＨ陽性ニューロン)、
－ＴＨ陽性ニューロンの総神経突起ネットワーク(μm)
－ａＳｙｎ凝集(ＴＨおよびａＳｙｎ染色の重複)
－ＴＨ陽性ニューロン中の陽性シナプス数(ＴＨおよびＰＳＤ９５の重複、μm²)。

ＴＨ＋ニューロン総数、ＴＨ＋ニューロンの総神経突起ネットワークおよびＴＨ＋ニューロンのシナプス数を、図２Ａ(ＣＤＮＦ)、図３Ａ(化合物１および２)、図３Ｃ(化合物３および４)、図３Ｅ(化合物５および６)、図３Ｇ(化合物７および８)、図４Ａ(化合物９および１０)および図４Ｃ(化合物１１および１２)、図４Ｅ(化合物１３および１４)、図４Ｇ(化合物１５および１６)、図４Ｉ(化合物１７および１８)、図４Ｋ(化合物１９および２０)に示す。

ＭＰＰ＋傷害後中脳細胞の一次培養のＴＨ陽性ニューロンにおけるα－シヌクレイン凝集を、図２Ｂ(ＣＤＮＦ)、図３Ｂ(化合物１および２)、図３Ｄ(化合物３および４)、図３Ｆ(化合物５および６)、図３Ｈ(化合物７および８)、図４Ｂ(化合物９および１０)および図４Ｄ(化合物１１および１２)、図４Ｆ(化合物１３および１４)、図４Ｈ(化合物１５および１６)、図４Ｊ(化合物１７および１８)、図Ｌ(化合物１９および２０)に示す。

データは、多くのレトロインベルソペプチドがＭＰＰ＋毒性からＴＨ陽性ニューロンならびにその神経突起およびシナプスを保護することを示す。さらに、これらレトロインベルソ化合物は、ＴＨ陽性ニューロンにおいてＭＰＰ＋により蓄積が強く誘導されるａＳｙｎ封入体の数を有効に減らした。ほとんどの場合、レトロインベルソペプチド(化合物２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０)の効力は、その親化合物(それぞれ化合物１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９)および完全長ＣＤＮＦタンパク質(図２)と同等であった。

実施例２
ＥＲストレス応答経路との相互作用
ＣＤＮＦおよびＭＡＮＦは、ＥＲストレスに対する細胞応答を調節することにより、細胞をＲストレス誘導細胞機能不全または細胞死、例えばアポトーシスから保護する。Yan et al (2019)は、ＭＡＮＦのＣ末端がＧＲＰ７８のヌクレオチド結合ドメイン(ＮＢＤ)に結合し、その細胞活性を制御することを示した。データは、ＭＡＮＦ(およびＣＤＮＦ)は、ＭＡＮＦ(およびＣＤＮＦ)が、ＥＲ管腔で最も豊富なシャペロンタンパク質であるＧＲＰ７８と、基質様相互作用ではなく、制御性相互作用を有することを示唆する。化合物のＧＲＰ７８－ＮＢＤへの結合を、精製組み換えＧＲＰ７８－ＮＢＤおよび合成ペプチドを使用する無細胞結合アッセイで評価した。ＧＲＰ７８が小胞体ストレス応答(ＵＰＲ)経路の３個の受容体、ＩＲＥ１α、ＰＥＲＫおよびＡＴＦ６の重要なリガンドとして作用するため、化合物の神経保護効果のＵＰＲシグナル伝達に対する依存性も試験した。図５Ａは、ＧＲＰ７８－ＮＢＤのＭＡＮＦ結合ポケットにおける分子モデリングを示す。図５Ｂは、選択化合物の無細胞結合アッセイにおけるＧＲＰ７８－ＮＢＤとの結合親和性を示す。図５Ｃは、化合物１４および２０の神経保護効果がＰＥＲＫ(ＧＳＫ２６０６４１４)およびＩＲＥ１アルファ(ＫＩＲＡ６)の薬理学的阻害剤存在下で消失することを示す。

材料および方法
分子モデリング
ここに記載した種々の化合物(図５Ｂ)との複合体のＧＲＰ７８－ＮＢＤを、MAESTROインターフェースを介するSchrodinger suiteバージョン2018-4のＰＲＩＭＥモジュール(Schroedinger Llc, USA)を使用して、先に解析されたＧＲＰ７８－ＮＢＤ：ＭＡＮＦ複合体の構造をもとにモデル化した。作成されたモデルを、鋳型構造を使用して、手動で確認した(ＰＤＢ：６ＨＡＢ、Yan et al, 2019)。モデルを、そのラマチャンドラン図を調べることによっても検証した。

無細胞結合アッセイ。
Ｈｉｓ－タグ付きＧＲＰ７８－ＮＢＤを組み換えにより大腸菌細胞で過発現させ、精製し、ＮＨＳ－Ｒｅｄ色素(Nanotemper Technologies GmbH)を使用して標識した。ＨｉｓタグをＴＥＶプロテアーゼを使用してタンパク質から開裂した。タグがないＧＲＰ７８－ＮＢＤを標識するための種々のペプチド(連続希釈)の結合を、ＰＢＳ環境で高出力でMonolith N.A.デバイス(Nanotemper Technologies GmbH)を使用するMonolith N.T標準キャピラリーで測定した。図５Ｂは、ＭＳＴ結合実験から得たデータの表を示す。

中脳ニューロンの培養。
神経細胞培養、ＭＰＰ＋中毒、免疫染色および化合物の神経保護効果の分析を、実施例１におけるとおりに実施した。ＰＥＲＫ阻害剤ＧＳＫ２６０６４１４(２μM、Sigma)またはＩＲＥ１アルファ阻害剤ＫＩＲＡ６(２μM、Sigma)を、試験化合物添加１時間前に培養物に加えた。

このデータは、レトロインベルソ異性化化合物が重要なＥＲストレス調節標的分子ＧＲＰ７８に結合し、レトロインベルソ異性化化合物の神経保護効果がＵＰＲシグナル伝達活性に依存することを示す。

実施例３
ラット血漿における親およびレトロインベルソ化合物のインビトロ代謝安定性
レトロインベルソおよび天然対照ペプチドの代謝安定性を、ラット血漿を使用して初期試験濃度１μMで、１２０分間にわたり試験した。サンプルを、LC/QE-orbitrap-MSを使用して分析した。計算半減期は、ラット血漿における化合物消失に基づく。

材料および方法
親またはレトロインベルソ化合物１～８、１３～１４および１９～２０(配列番号１～８、１３～１４および１９～２０)を、１μM濃度で、ラット血漿(Sprague-Dawley、雄；４００μl)と種々の時点(０分、２０分、４０分、６０分または１２０分)、３７℃でインキュベートした。アセトニトリルによりインキュベーションを停止させた。集めたサンプルを２０分間、２２７２×ｇで遠心分離し、分析した。原液を５０％ＤＭＳＯを使用して調製し、化合物を０.５％の最終ＤＭＳＯ含量とするためインキュベーションのために１／１００で加えた。サンプルを、化合物の消失をモニターするために、高解像度マススペクトロメトリー(DDIモードのQE-Orbitrap-MS)を伴うＵＨＰＬＣ／ＰＤＡにより分析した。化合物１３～１４および１９～２０の分析のために、原液をＰＢＳで調製し、サンプルをＵＨＰＬＣ－ＴｏＦマススペクトロメトリーにより分析した。エナラプリル１μMを、消失速度対照として使用した。分析方法を、最適なクロマトグラフ性質(ピーク形状および保持)および質量分光学イオン化について親化合物を使用して最適化した。イオンクロマトグラムを、５mDa幅の計算モノアイソトピック精密質量を使用する総イオンクロマトグラムから抽出した。消失は、０分を１００％とするＬＣ／ＭＳピーク面積に基づいた。代謝の一次速度定数ｋ(分^－１)を、Excelソフトウェアを使用する、時間対対数(残存化合物％)プロットの傾斜から得た。試験化合物のインビトロ半減期(ｔ_１／２)を、ｔ_１／２＝ｌｎ２／ｋとして定義した。

図６Ａにおいて、各バーのペアは、非修飾ペプチド(親)および対応する修飾ペプチド(レトロインベルソ)からのデータを示す。一部試験したレトロインベルソペプチド(化合物８、１４および２０)は、その親化合物(それぞれ化合物７、１３および１９)と比較して、ラット血漿で安定性の有意な改善を示した。

実施例４
ヒト血漿における親およびレトロインベルソ化合物のインビトロ代謝安定性
代謝安定性を、ヒト血漿を使用して初期試験濃度１μMで、１２０分間にわたり試験した。サンプルを、LC/QE-orbitrap-MSを使用して分析した。計算半減期は、ヒト血漿における化合物の消失に基づく。

材料および方法
親またはレトロ逆化合物１～８(配列番号１～８)を、１μM濃度で、ヒト血漿(性別混合、４００μl)と種々の時点(０分、２０分、４０分、６０分または１２０分)、３７℃でインキュベートした。アセトニトリルによりインキュベーションを停止させた。集めたサンプルを２０分間、２２７２×ｇで遠心分離し、分析した。サンプルを、化合物の消失をモニターするために、高解像度マススペクトロメトリー(DDIモードのQE-Orbitrap-MS)を伴うＵＨＰＬＣ／ＰＤＡにより分析した。プロパンテリン臭化物１μMを、消失速度対照として使用した。分析方法を、最適なクロマトグラフ性質(ピーク形状および保持)および質量分光学イオン化について親化合物を使用して最適化した。イオンクロマトグラムを、５mDa幅の計算モノアイソトピック精密質量を使用する総イオンクロマトグラムから抽出した。消失は、０分を１００％とするＬＣ／ＭＳピーク面積に基づいた。代謝の一次速度定数ｋ(分^－１)を、Excelソフトウェアを使用する、時間対対数(残存化合物％)プロットの傾斜から得た。試験化合物のインビトロ半減期(ｔ_１／２)を、ｔ_１／２＝ｌｎ２／ｋとして定義した。

図６Ｂにおいて、各バーのペアは、非修飾ペプチド(親)および対応する修飾ペプチド(レトロインベルソ)からのデータを示す。

ヒト血漿におけるペプチド安定性は、報告されるヒト血漿における最半減期により示されるとおり、ラット血漿における安定性と比較して線形およびレトロインベルソペプチド両者で良好であった(試験特異的最大半減期は７９５分)。一つの試験したレトロインベルソ化合物(化合物８)は、その親化合物(化合物７)と比較して、ラットおよびヒト血漿において安定性の改善を示した。

実施例５
ラット肝細胞における親およびレトロ逆化合物のインビトロ代謝安定性
代謝安定性を、ラット(Sprague-Dawley、雄)肝細胞を０～６０分(ｎ＝２)、初期試験濃度１μMを使用して試験した。サンプルを、LC/QE-orbitrap-MSを使用して分析した。計算半減期は、化合物消失に基づく。

材料および方法
親またはレトロ逆化合物１～８、１３～１４および１９～２０(配列番号１～８、１３～１４および１９～２０)を、１μM濃度で、プールされた凍結保存ラット肝細胞(Sprague-Dawley、雄；化合物１～８について４００μl、１００万生存可能細胞／mlまたは化合物１３～１４および１９～２０について１００μl、１０万生存可能細胞／ml)と種々の時点(０分、１０分、２０分、４０分または６０分)、３７℃でインキュベートした。細胞密度および生存能をトリパンブルー排除方法により決定した。アセトニトリルによりインキュベーションを停止させた。集めたサンプルを２０分間、２２７２×ｇで遠心分離し、分析した。サンプルを、化合物の消失をモニターするため、高解像度マススペクトロメトリー(DDIモードのQE-Orbitrap-MS)(化合物１～８)またはＨＨＰＬＣ－ＴｏＦマススペクトロメトリー(化合物１３～１４および１９～２０について)を伴うＵＨＰＬＣ／ＰＤＡで分析した。ベラパミル１μMを、消失速度対照として使用した。分析方法を、最適なクロマトグラフ性質(ピーク形状および保持)および質量分光学イオン化について親化合物を使用して最適化した。イオンクロマトグラムを、５mDa幅の計算モノアイソトピック精密質量を使用する総イオンクロマトグラムから抽出した。消失は、０分を１００％とするＬＣ／ＭＳピーク面積に基づいた。代謝の一次速度定数ｋ(分^－１)を、Excelソフトウェアを使用する、時間対対数(残存化合物％)プロットの傾斜から得た。試験化合物のインビトロ半減期(ｔ_１／２)を、ｔ_１／２＝ｌｎ２／ｋとして定義した。

図７Ａにおいて、各バーのペアは、非修飾ペプチド(親)および対応する修飾ペプチド(レトロインベルソ)からのデータを示す。

全ての試験したレトロインベルソペプチド(化合物２、４、６、８、１４および２０)は、その親化合物(それぞれ化合物１、３、５、７、１３および１９)と比較して、ラット肝細胞で安定性の有意な改善を示した。

実施例６
ヒト肝細胞における親およびレトロインベルソ化合物のインビトロ代謝安定性
代謝安定性を、ラット(性別混合、雄)肝細胞で０～６０分(ｎ＝２)、初期試験濃度１μMを使用して試験した。サンプルを、LC/QE-orbitrap-MSを使用して分析した。計算半減期は、化合物消失に基づく。

材料および方法
親またはレトロ逆化合物１～８(配列番号１～８)を、１μM濃度で、プールされた凍結保存ヒト肝細胞(性別混合；４００μl、１００万生存可能細胞／ml)と種々の時点(０分、１０分、２０分、４０分または６０分)、３７℃でインキュベートした。細胞密度および生存能をトリパンブルー排除方法により決定した。アセトニトリルによりインキュベーションを停止させた。集めたサンプルを２０分間、２２７２×ｇで遠心分離し、分析した。サンプルを、化合物の消失をモニターするために、高解像度マススペクトロメトリー(DDIモードのQE-Orbitrap-MS)を伴うＵＨＰＬＣ／ＰＤＡにより分析した。ベラパミル１μMを、消失速度対照として使用した。分析方法を、最適なクロマトグラフ性質(ピーク形状および保持)および質量分光学イオン化について親化合物を使用して最適化した。イオンクロマトグラムを、５mDa幅の計算モノアイソトピック精密質量を使用する総イオンクロマトグラムから抽出した。消失は、０分を１００％とするＬＣ／ＭＳピーク面積に基づいた。代謝の一次速度定数ｋ(分^－１)を、Excelソフトウェアを使用する、時間対対数(残存化合物％)プロットの傾斜から得た。試験化合物のインビトロ半減期(ｔ_１／２)を、ｔ_１／２＝ｌｎ２／ｋとして定義した。

図７Ｂにおいて、各バーのペアは、非修飾ペプチド(親)および対応する修飾ペプチド(レトロインベルソ)からのデータを示す。

全ての試験したレトロインベルソペプチド(化合物２、４、６および８)は、その親化合物(それぞれ化合物１、３、５および７)と比較して、ヒト肝細胞で安定性の有意な改善を示した。

実施例７
血液脳関門の３Ｄインビトロモデルにおける親およびレトロインベルソ化合物の浸透性
末梢投与経路でＣＮＳ疾患を処置するためのＣＤＮＦおよびＭＡＮＦ由来ペプチドの開発が興味深いため、化合物が血液脳関門を通過する能力を、確立された血液脳関門のインビトロモデルで試験した。この目的で、レトロインベルソおよび親化合物１～１４および１７～２０(配列番号１～１４および１７～２０)を、５００nMで２時間、２区画インビトロ血液脳関門モデル(ｎ＝４)でインキュベートし、続いてサンプル取得およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析した。

図８において、各バーのペアは、非修飾ペプチド(親)および対応する修飾ペプチド(レトロインベルソ)からのデータを示す。親化合物と比較して、良好なＢＢＢ通過がレトロインベルソ化合物２、４、６および１２(配列番号２、４、６および１２)で観察された。

４個の試験したレトロインベルソ化合物(化合物２、４、６および１２)は、その親化合物(それぞれ化合物１、３、５および１１)と比較して、インビトロ血液脳関門を通過する能力の改善を示した。

材料および方法
星状細胞一次培養。
ラット星状細胞を、Ｅ１５胚から調製した。簡潔には、妊娠１５日目の妊娠雌ラット(Wistar, Janvier Labs)を(ＣＯ_２チャンバー)で深く麻酔し、頚椎脱臼により屠殺した。胎児を集め、２％ペニシリン(１０,０００Ｕ／mL)およびストレプトマイシン(１０mg／mL)溶液(ＰＳ)および１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)添加氷冷Ｌ１５ライボビッツ培地にすぐに入れた。完全脳を、最終濃度０.０５％トリプシンおよび０.０２％ＥＤＴＡのトリプシン－ＥＤＴＡ溶液で２０分間、３７℃で処理した。解離細胞を、ＤＭＥＭ１０％ウシ胎児血清で培養した。精製星状細胞を継代４(Ｐ４)で使用した。

ヒト内皮細胞の培養。ＨＢＭＥＣ(一次ヒト脳マイクロ血管内皮細胞、ACBRI 376)のバイアルを、特定の継代８(Ｐ８)で使用した。

皮質ニューロンの一次培養。ラット皮質ニューロンを、Callizot et al., 2013の記載に修飾を加えて、培養した。簡潔には、妊娠１５日目の妊娠雌ラット(Wistar, Janvier Labs)を(ＣＯ_２チャンバー)で深く麻酔し、頚椎脱臼により屠殺した。胎児を集め、２％ペニシリン(１０,０００Ｕ／mL)およびストレプトマイシン(１０mg／mL)溶液(ＰＳ)および１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)添加氷冷Ｌ１５ライボビッツ培地にすぐに入れた。皮質を、最終濃度０.０５％トリプシンおよび０.０２％ＥＤＴＡのトリプシン－ＥＤＴＡ溶液で２０分間、３７℃で処理した。解離を、ＤＮＡｓｅＩグレードII(最終濃度０.５mg／mL)および１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を含む４.５ｇ／Ｌのグルコース添加ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)を加えて停止させた。細胞を、１０mlピペットの先端を３回通すことにより、機械的に解離させた。次いで、細胞を５１５×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。ペレットを、Ｂ２７サプリメントの２％溶液、２mmol／ＬのＬ－グルタミン、２％のＰＳ溶液、１０ng／mLの脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)を含むNeurobasal培地からなる規定の培養培地に再懸濁した。生存可能細胞を、トリパンブルー排除試験を使用して、Neubauer血球計算器で計数した。皮質ニューロンを、２４ウェルプレートのウェルあたり２５５,０００密度で、インサートと共にポリ－Ｌ－リシンでプレコートしたウェルの底に播種し、空気(９５％)－ＣＯ_２(５％)インキュベーターで３７℃で培養した。培養培地を隔日で交換した。

内皮細胞、星状細胞および一次皮質ニューロンの共培養。先に公開されたとおりの手順を実施した(Callizot et al., 2017により改変されたXue et al., 2013)。すなわち、０日目、精製星状細胞(Ｐ４)を、３７℃の水浴で迅速に解凍した。細胞を、１０％のＦＣＳ含有ＤＭＥＭにすぐに入れた。細胞懸濁液を、５１５×ｇで５分間、４℃で遠心分離し、ペレットを１０％のＦＣＳ含有ＤＭＥＭＦ１２に懸濁した。細胞を、インサートあたり４５,０００細胞の密度でインサート膜(ＰＥＴ、１μm)の外面に播種し、空気(９５％)－ＣＯ_２(５％)インキュベーターで３７℃で培養した。星状細胞播種３６時間後、ＨＢＭＥＣ(Ｐ８)を３７℃の水浴で迅速に解凍し、１０％のＦＣＳ含有ＤＭＥＭにすぐに入れた。細胞懸濁液を５１５×ｇで５分間、４℃で遠心分離し、ペレットを、５％のＦＣＳ、１％のＰＳ溶液、１.４μMのヒドロコルチゾン、５μg／mLのアスコルビン酸、１％の脂質混合物、１０mMのＨＥＰＥＳ、１ng／mLのｂＦＧＦを含むEGM-2 bullet kitに懸濁した。細胞を、インサートあたり５０,０００細胞の密度でインサート膜(ＰＥＴ、１μm)の内側に播種し、３７℃で空気(９５％)－ＣＯ_２(５％)インキュベーターでインキュベートした。ＨＢＭＥＣ播種３６時間後(星状細胞播種７２時間後)、皮質ニューロンを、ウェルあたり１７０,０００の密度でポリ－Ｌ－リシンでプレコートしたウェルの底に播種し、空気(９５％)－ＣＯ_２(５％)インキュベーターで３７℃で培養した。

親またはレトロインベルソ化合物適用。
ＨＢＭＥＣ播種５日後、内皮細胞層の完全性の最初の試験後、試験化合物１～１４および１７～２０(配列番号１～１４および１７～２０)を管腔区画に加え、２時間、５００nM濃度でインキュベートした。

試験化合物の定量。
反管腔側上清における各化合物の検出および定量を、マススペクトロメトリー(ＭＳ)分析でさらに実施した。サンプル解凍後、各細胞培養サンプルの１００μL量を、質量分析によるペプチドの定量により分析した。

計算した通過パーセンテージは、適用の最後に反管腔側区画で測定された反管腔側区画における、適用された化合物のパーセンテージを表す。

実施例８
ラットへの末梢投与後のレトロインベルソ化合物のインビボ薬物動態プロファイル
ペプチドのクリアランスおよび除去は、代謝および腎臓排泄を含む複数のインビボ過程により介在され得る(Li et al, 2015; Lin et al, 2009)。インビトロ試験で、レトロインベルソペプチドの安定性の改善が示唆されたため、薬物動態性質を、化合物を末梢(静脈内)に単回用量レベルで投与し、次いで、血漿中の化合物の存在を、末梢投与後種々の時点で決定することにより試験した。

図９Ａは、静脈内投与後種々の時点でのレトロインベルソ化合物、１個の天然化合物および１個の天然２７アミノ酸対照化合物の血漿濃度を表す。全ての試験したレトロインベルソ化合物は、天然化合物と比較して、血漿保持時間の延長を示した。

表１は、ラットに静脈内投与後のレトロインベルソ化合物および天然２７アミノ酸対照化合物のインビボ薬物動態性質を示す。

図９Ｂは、雄Sprague-Dawleyラットにおける化合物２０の脳分布動態を示す。マイクロダイアリシスプローブを、ラットの腹側線条体にインプラントしたガイドカニューレをとおして挿入し、ＣＳＦにより潅流した。化合物１８を、単回１０mg／kg静脈内ボーラス注射として投与し、マイクロダイアリシスサンプルを２０分間隔で４時間集めた。化合物の脳間質液(ＩＳＦ)濃度を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより決定し、マイクロダイアリシス膜の回収％に対して正規化した(インビトロ実験により決定)。

全の試験したレトロインベルソ化合物は、２７Ｌ－アミノ酸からなる対照天然ペプチドと比較して、血漿半減期、分布容積および平均滞在時間の改善を示した。さらに、脳マイクロダイアリシス試験は、単回静脈内ボーラス注射後、化合物２０の脳実質への浸透を示した。

材料および方法
試験化合物を、雄Sprague-Dawleyラット(約６週齢、化合物あたりｎ＝３)に、５mg／kgで静脈内(ｉ.ｖ.)投与した。血液サンプを、化合物投与後２分、５分、１５分、３０分、１時間、２時間および４時間に抗凝血材(ヘパリン)を含む、ラベルしたポリプロピレンにインプラントした内在カテーテル(２５０μl血液)を介して頸静脈から集め、最大３０分間ウェットアイス上に維持した。血液サンプルを、血漿分離のために遠心分離した(４℃、２１１００Ｇ、５分間)。アセトニトリルまたはＭｅＣＮ中の１０％ＴＦＡ含有トルブタミド５００ng／mlを、内部標準溶液として使用した。標準サンプルを、ラット血漿にそれぞれ２～１００００ng／ml濃度の検体をマトリクスに添加し、その他サンプルと同じに処理して調製した。サンプル血漿５０μl量に、内部標準２００μlを加えた。サンプルを混合し(１５０rpm、１５分間)、遠心分離(３０００rpm、１５分間)した。分析方法を、クロマトグラフ(ピーク形状＆保持)シフトおよびマススペクトル性質(イオン化効率、ＭＳ／ＭＳ検出)の反応モニタリングに最適化させた。上清を、エレクトロスプレーイオン化を使用するＵＨＰＬＣ－ＴＯＦマススペクトロメトリーにより分析した。

試験化合物を、雄Sprague-Dawleyラット(ｎ＝３)に０.５mg／kgで静脈内(ｉ.ｖ.)投与した。投与化合物は、化合物６(配列番号６)、化合物１２(配列番号１２)、化合物１３(配列番号１３)、化合物１４(配列番号１４)、化合物２０(配列番号１８)および２７個のＬ－アミノ酸からなる親対照化合物であった。血漿サンプルを集め、続いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析した。薬物動態パラメータを、種々のデータ点で血漿濃度から計算した。

脳マイクロダイアリシス試験を、化合物２０(配列番号２０)で静脈内処置した覚醒動物の別の群で実施した。マイクロダイアリシス実験１週間前、Sprague-Dawleyラットに、次の連携で、ガイドカニューレを線条体にインプラントした：ＡＰ＋０.６mm；Ｌ－３.０mm；マイクロダイアリシスプローブのチップに最終Ｖ－６.８mmを提供する、Ｖ－２.８mm。実験当日、マイクロダイアリシスプローブ(Eicom A-I：０.２２mm Ｏ.Ｄ.、４mm膜長でカットオフ５０kDa)をガイドカニューレに挿入し、人工脳脊髄液(ａＣＳＦ)溶液で０.１μL／分の一定流速で潅流した。１２０～１５０分間の安定化期間後、化合物１８を、単回１０mg／kg静脈内ボーラス注射として投与し、サンプルを２０分間隔で４時間採った。化合物の脳間質液濃度をＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。インビボ試験に類似した条件下でａＣＳＦで潅流したときの管類、コネクターおよびマイクロダイアリシスプローブからの試験化合物の回収を決定するためのさらなるインビトロ試験を実施した。決定された回収パーセンテージ(２７.４％)を、マイクロダイアリシス試験で得たデータの補正に使用した。

ＥＰ５８,４８１；ＵＳ３,７７３,９１９；ＷＯ２００７０６８８０３；ＷＯ２００９１３３２４７；ＷＯ２０１３／３０３４８０５；ＷＯ２０１８／２０２９５７

Airavaara M, Shen H, Kuo CC, Peranen J, Saarma M, Hoffer B, and Wang Y. 2009. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor reduces ischemic brain injury and promotes behavioral recovery in rats. J. Comp. Neurol. 515(1):116-24. Airavaara M, Harvey BK, Voutilainen MH, Shen H, Chou J, Lindholm P, Lindahl M, Tuominen RK, Saarma M, Hoffer B, Wang Y. 2012. CDNF protects the nigrostriatal dopamine system and promotes recovery after MPTP treatment in mice. Cell Transplant. 21(6):1213-23. Bertolotti A, Zhang Y, Hendershot LM, Harding HP, Ron D. 2000 Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response. Nat Cell Biol. 2(6):326-32. Callizot N, Combes M, Steinschneider R, Poindron P. 2013. Operational dissection of beta-amyloid cytophathic effects on cultured neurons. J Neurosci Res. 91(5):706-16 Di L. 2014. Strategic approaches to optimizing peptide ADME properties. AAPS J. 17(1):134-43. Dornburg R. 1995. Reticuloendotheliosis viruses and derived vectors. Gene Therap. 2: 301-310. Fletcher JM and Hughes RA. 2006. Novel monocyclic and bicyclic loop mimetics of brain-derived neurotrophic factor. J. Pept. Sci. 12:515-524. Glembotski CC. 2011. Functions for the cardiomyokine, MANF, in cardioprotection, hypertrophy and heart failure. J. Mol. Cell. Cardiol. 51:512-517. Hefti F. Neurotrophic factor therapy for nervous system degenerative diseases. 1994. J Neurobiol., 25:1418-1435. Hellman M, Arumae U, Yu LY, Lindholm P, Peranen J, Saarma M, and Permi P. 2011. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) has a unique mechanism to rescue apoptotic neurons. J. Biol. Chem. 286:2675-2680. Huttunen, HJ and Saarma M. 2019. CDNF protein therapy in Parkinson’s disease. Cell Transplantation 1-18. Langer R, Brem H, Tapper D. 1981. Biocompatibility of polymeric delivery systems for macromolecules. J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 Langer R. 1982. Controlled release of macromolecules. Chem. Tech., 12:98-105 Lindholm P., Voutilainen M.H., Lauren J., Peranen J., Leppanen V.M., Andressoo J.O., Lindahl M., Janhunen S., Kalkkinen N., Timmusk T., Tuominen R.K., and Saarma M. 2007. Novel neurotrophic factor CDNF protects and rescues midbrain dopamine neurons in vivo. Nature. 448:73-77. Lindholm P, and Saarma M. 2010. Novel CDNF/MANF family of neurotrophic factors. Dev.Neurobiol. 70:360-371. Lin JH. 2009. Pharmacokinetics of biotech drugs: peptides, proteins and monoclonal antibodies. Curr Drug Metab. 10(7):661-91. Li Y, Wang Y, Wei Q, Zheng X, Tang L, Kong D, Gong M. 2015. Variant fatty acid-like molecules Conjugation, novel approaches for extending the stability of therapeutic peptides. Sci Rep. 5:18039. Nadella R, Voutilainen MH, Saarma M, Gonzalez-Barrios JA, Leon-Chavez BA, Jimenez JM, Jimenez SH, Escobedo L, Martinez-Fong DJ. 2014. Transient transfection of human CDNF gene reduces the 6-hydroxydopamine-induced neuroinflammation in the rat substantia nigra. Neuroinflammation. 16;11:209. Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Allen, Loyd V., Jr, Ed., (2012) Sousa-Victor P, Jasper H, and Neves J. 2018. Trophic Factors in Inflammation and Regeneration: The Role of MANF and CDNF. Front. Physiol. 9:1629. Tuschl T. 2002. Expanding small RNA interference. Nat. Biotechnol, 20: 446-448. Visanji NP, Orsi A, Johnston TH, Howson PA, Dixon K, Callizot N, Brotchie JM and Rees DD. 2008. PYM50028, a novel, orally active, nonpeptide neurotrophic factor inducer, prevents and reverses neuronal damage induced by MPP+ in mesencephalic neurons and by MPTP in a mouse model of Parkinson's disease. FASEB J., 22(7):2488-97. Voutilainen MH, Back S, Peranen J, Lindholm P, Raasmaja A, Mannisto PT, Saarma M, and Tuominen RK. 2011. Chronic infusion of CDNF prevents 6-OHDA-induced deficits in a rat model of Parkinson's disease. Exp. Neurol. 228:99-108. Voutilainen MH, Back S, Porsti E, Toppinen L, Lindgren L, Lindholm P, Peranen J, Saarma M, and Tuominen RK. 2009. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor is neurorestorative in rat model of Parkinson's disease. J. Neurosci. 29:9651-9659. Wang M, Kaufman RJ. 2016. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature 529(7586):326-35. Xue Q, Liu Y, Qi H, Ma Q, Xu L, Chen W, Chen G, Xu X. 2013. AA novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9(2):174-89. Yan Y, Rato C, Rohland L, Preissler S, Ron D. 2019. MANF antagonizes nucleotide exchange by the endoplasmic reticulum chaperone BiP. Nat Commun. 10(1):541. Zhao H, Liu Y, Cheng L, Liu B, Zhang W, Guo YJ, Nie L. 2013. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor inhibits oxygen-glucose deprivation-induced cell damage and inflammation by suppressing endoplasmic reticulum stress in rat primary astrocytes. J Mol Neurosci. 51(3):671-8.

Claims

Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ(配列番号２１)
〔式中、
Ｘ_１はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、ＡおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；そして
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択される。〕
のレトロインベルソ形態のアミノ酸配列を含む、８～３２アミノ酸の長さからなるペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ(配列番号１８)
〔式中、
Ｘ_１はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、ＡおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択され；そして
Ｘ_４はＥ、Ｔ、Ｖ、Ｄ、ＭおよびＧからなる群から選択される。〕
のレトロインベルソ形態のアミノ酸配列を含む、請求項１のペプチド。
Ｘ_５－Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１(配列番号２３)
〔式中、
Ｘ_１はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、ＡおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_４はＥ、Ｔ、Ｖ、Ｄ、ＭおよびＧからなる群から選択され；
Ｘ_５は存在しないかまたはＨ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｙ、ＮおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_６は存在しないかまたはＳ、Ｄ、Ｇ、ＮおよびＲからなる群から選択され；
Ｘ_７は存在しないかまたはＷであり；
Ｘ_８は存在しないかまたはＧであり；
Ｘ_９は存在しないかまたはＫであり；
Ｘ_１０は存在しないかまたはＴ、Ｓ、Ａ、ＩおよびＮからなる群から選択され；そして
Ｘ_１１は存在しないかまたはＤおよびＥから選択される。〕
のレトロインベルソ形態のアミノ配列を含む、請求項１または２のペプチド。
Ｘ_１２－Ｘ_１３－Ｘ_１４－Ｘ_１５－Ｘ_１６－Ｘ_１７－Ｘ_１８－Ｘ_１９－Ｘ_２０－Ｘ_２１－Ｘ_２２－Ｘ_２３－Ｖ－Ｘ_２４－Ｅ－Ｌ－Ｋ－Ｘ_２５－Ｘ_２６－Ｌ－Ｘ_５Ｘ_６－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｅ－Ｘ_４－Ｃ－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｃ－Ａ－Ｅ－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１(配列番号２４)
〔式中、
Ｘ_１はＲ、Ｋ、Ｉ、Ｇ、ＡおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_２は存在しないかまたはＧ、Ａ、Ｒ、Ｋ、ＩおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_３はＡ、ＧおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_４はＥ、Ｔ、Ｖ、Ｄ、ＭおよびＧからなる群から選択され；
Ｘ_５は存在しないかまたはＨ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｙ、ＮおよびＳからなる群から選択され；
Ｘ_６は存在しないかまたはＳ、Ｄ、Ｇ、ＮおよびＲからなる群から選択され；
Ｘ_７は存在しないかまたはＷであり；
Ｘ_８は存在しないかまたはＧであり；
Ｘ_９は存在しないかまたはＫであり；
Ｘ_１０は存在しないかまたはＴ、Ｓ、Ａ、ＩおよびＮからなる群から選択され；そして
Ｘ_１１は存在しないかまたはＤおよびＥから選択され；
Ｘ_１２は存在しないかまたはＬ、ＩおよびＶからなる群から選択され；
Ｘ_１３は存在しないかまたはＤであり；
Ｘ_１４は存在しないかまたはＬおよびＷから選択され；
Ｘ_１５は存在しないかまたはＡ、Ｓ、Ｔ、ＥおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ_１６は存在しないかまたはＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は存在しないかまたはＶおよびＤから選択され；
Ｘ_１８は存在しないかまたはＤおよびＡから選択され；
Ｘ_１９は存在しないかまたはＬであり；
Ｘ_２０は存在しないかまたはＲ、Ｋ、ＳおよびＷからなる群から選択され；
Ｘ_２１は存在しないかまたはＫであり；
Ｘ_２２は存在しないかまたはＭ、Ｌ、ＩおよびＶからなる群から選択され；
Ｘ_２３は存在しないかまたはＲであり；
Ｘ_２４はＡ、Ｋ、Ｔ、ＬおよびＶからなる群から選択され；
Ｘ_２５はＱ、ＫおよびＲからなる群から選択され；そして
Ｘ_２６は存在しないかまたはＩおよびＶから選択される。〕
のレトロインベルソ形態のアミノ酸配列を含む、請求項１～３の何れかのペプチド。
ＫＥＡＣＡＲＣＥＥＧＷＳＨＬＩＱＫＬＥＡＶＲＭ(配列番号２)、
ＫＥＡＣＧＫＣＴＥＧＷＤＤＬＩＫＫＬＥＫＶＲＬ(配列番号４)、
ＴＫＥＡＣＡＲＣＥＥＧ(配列番号６)、
ＳＫＥＡＣＧＫＣＴＥＧ(配列番号８)、
ＴＫＥＡＣＡＧＲＣＥＥＧ(配列番号１０)、
ＳＫＥＡＣＧＧＫＣＴＥＧ(配列番号１２)、
ＫＥＡＣＡＲＣＥＥ(配列番号１４)、
ＫＥＡＣＧＫＣＴＥ(配列番号１６)、
ＥＡＣＡＲＣＥＥ(配列番号１８)および
ＥＡＣＧＫＣＴＥ(配列番号２０)、
からなる群から選択される配列からなり、ここで、ペプチドの全アミノ酸はＤ－アミノ酸である、請求項１～４の何れかのペプチド。
ペプチドが小胞体(ＥＲ)ストレス誘導細胞機能不全または細胞死から保護する、請求項１～５の何れかのペプチド。
ペプチドがＧＲＰ７８に結合する、請求項１～６の何れかのペプチド。
システインが還元形態またはジスルフィド架橋形態である、請求項１～７の何れかのペプチド。
ペプチドのＮ末端がアセチル化される、請求項１～８の何れかのペプチド。
ペプチドのＣ末端がアミド化される、請求項１～９の何れかのペプチド。
ペプチドのＮ末端がアセチル化され、ペプチドのＣ末端がアミド化される、請求項１～１０の何れかのペプチド。
ペプチドがシュードペプチドである、請求項１～１１の何れかのペプチド。
ペプチドが環状ペプチドである、請求項１～１２の何れかのペプチド。
検出可能な化学部分、生化学部分またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)にコンジュゲートした、請求項１～１３の何れかのペプチド。
ペプチドが、次の性質
(ｉ)ＴＨ陽性ニューロンをＭＰＰ^＋毒性から用量依存的に保護できる；
(ii)ＴＨ陽性ニューロンにおけるアルファ－シヌクレイン封入体の数を減少させる；
(iii)その親対応物と比較して改善された血漿での安定性を有する；
(iv)その親対応物と比較して改善された肝細胞での安定性を有する；または
(ｖ)その親対応物と比較して改善された血液脳関門を通過する能力を有する
の少なくとも１個を有する、請求項１～１４の何れかのペプチド。
医薬として使用するための、請求項１～１５の何れかのペプチド。
神経変性疾患または障害などの変性疾患または障害、慢性疾患または障害または進行性疾患または障害の処置に使用するための、請求項１～１５の何れかのペプチド。
該神経変性疾患または障害がパーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性、レヴィ小体型認知症、軽度認知機能障害、ハンチントン病、外傷性脳傷害、外傷性脊髄傷害、進行性核上性麻痺、ピック病、純粋自律神経不全症、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、脊髄小脳失調症および末梢ニューロパチーならびにその疾患および障害のスペクトルからなる群から選択される中枢神経系疾患である、請求項１７の使用のためのペプチド。
ウォルコット・ラリソン症候群、ウォルフラム症候群、マリネスコ・シェーグレン症候群、マシャド・ジョセフ病および網膜色素変性症などの変性網膜疾患および一次性ネフローゼ症候群および常染色体優性多嚢胞性腎臓疾患などの遺伝性ネフローゼ症候群からなる群から選択される、病原性因子として小胞体(ＥＲ)ストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患の処置に使用するための、請求項１～１５の何れかのペプチド。
該ペプチドが静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、眼内、鼓室内または局所投与などの末梢投与、経腸、非経腸または経口、直腸、舌下または頬側投与を含む局所経路、腹腔内、筋肉内、関節内、経皮、蝸牛内、局所眼または吸入投与または頭蓋内、髄腔内、硬膜外または病巣内投与により投与される、請求項１６～１９の何れかの使用のためのペプチド。
該ペプチドが皮下投与により投与される、請求項２０の使用のためのペプチド。
請求項１～１５の何れかのペプチドおよび次の薬学的に許容される担体、薬学的に許容される添加物、防腐剤、安定化剤および／または希釈剤の少なくとも１個を含む、医薬組成物。
医薬として使用するための、請求項２２の医薬組成物。
神経変性疾患または障害などの変性、慢性または進行性疾患または障害の処置に使用するための、請求項２２の医薬組成物。
該神経変性疾患または障害がパーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性、レヴィ小体型認知症、軽度認知機能障害、ハンチントン病、外傷性脳傷害、外傷性脊髄傷害、進行性核上性麻痺、ピック病、純粋自律神経不全症、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、脊髄小脳失調症および末梢ニューロパチーならびにその疾患および障害のスペクトルからなる群から選択される中枢神経系疾患である、請求項２４の使用のための医薬組成物。
ウォルコット・ラリソン症候群、ウォルフラム症候群、マリネスコ・シェーグレン症候群、マシャド・ジョセフ病および網膜色素変性症などの変性網膜疾患および一次性ネフローゼ症候群および常染色体優性多嚢胞性腎臓疾患などの遺伝性ネフローゼ症候群からなる群から選択される病原性因子として小胞体(ＥＲ)ストレスを有する単遺伝子遺伝性疾患の処置に使用するための、請求項２２の医薬組成物。
該組成物が静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、眼内、鼓室内または局所投与などの末梢投与、経腸、非経腸または経口、直腸、舌下または頬側投与を含む局所経路、腹腔内、筋肉内、関節内、経皮、蝸牛内、局所眼または吸入投与または頭蓋内、髄腔内、硬膜外または病巣内投与により投与される、請求項２２～２６の何れかの使用のための医薬組成物。
該組成物が皮下投与により投与される、請求項２７の使用のための医薬組成物。