SK43297A3 - Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity - Google Patents

Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity Download PDF

Info

Publication number
SK43297A3
SK43297A3 SK432-97A SK43297A SK43297A3 SK 43297 A3 SK43297 A3 SK 43297A3 SK 43297 A SK43297 A SK 43297A SK 43297 A3 SK43297 A3 SK 43297A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
analog
amino acid
gly
afgf
ala
Prior art date
Application number
SK432-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Tsutomu Arakawa
Gary M Fox
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of SK43297A3 publication Critical patent/SK43297A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Analógy rastového faktora kyslého fibroblastu, ktoré’majú zvýšenú stabilitu a biologickú aktivitu
Oblasť techniky
Komplexný priebeh liečenia, ktoré nasleduje po poškodení tkaniva, napríklad po zranení alebo popálení je sprostredkovaný množstvom proteínových faktorov, ktoré sa niekedy priradzujú k rastovým faktorom mäkkého tkaniva. Tieto faktory sú vyžadované pre rast a diferenciáciu nových buniek pri obnovení porušeného tkaniva. Vnútri skupiny rastových buniek mäkkého tkaniva je zahrnutá bielkovinová rodina rastových faktorov mäkkého tkaniva (FGFs). FGFs sú mitogenické mitogenic a chemotaktické chemotactic pre rôzne bunky epiteliálneho, mezenchýmového a nervového pôvodu.
Okrem toho sú FGFs angiogénne angiogenic”, čo znamená, že majú schopnosť stimulovať tvorbu krvných ciev. Členovia rodiny FGFs zahrnujú kyslý FGF, zásaditý FGF, KGF, Int-2, HST, FGF-5 a FGF-6.
Doterajší stav techniky
Kyslý FGF (aFGF) a Zásaditý FGF (bFGF) sú považované za dva pôvodné originál členy rodiny FGF. Obidva aFGF a. bFGF sú zrejme odvodené od rovnakého genetického predchodcu, kde obidve molekuly majú približne 55% sekvenčnú identitu mimo rovnakú štruktúru intrón/exón. Kyslý aFGF a zásaditý bFGF sú tiež známe tým, že viažu rovnaký receptor, aj keď existencia špecifických aFGF a bFGF receptorov nebola vylúčená. Bolo objavených niekoľko foriem molekulovej hmotnosti aFGF a bFGF v rôznych tkanivách. Avšak Southern blotting experimenty potvrdzujú, že je len jeden gén pre každý aFGF a bFGF s odlišnosťami medzi týmito molekulami, ktoré sú pravdepodobne spôsobené posttranslačnou úpravou. Obidva, kyslý aj zásaditý FGF, sú mitogény pre široký výber bunkových typov mezodermálneho a neuroektodermálneho pôvodu a sú schopné vyvolať angiogenézu v obidvoch prostrediach, v in vitro a in vivo (pozri napr. Gospodarowicz a kol., 1979, Exp. feye Res., 28: 501-514) .
Rozsah biologických aktivít týchto dvoch tried je takmer identický, aj keď bFGF je asi desaťkrát viac silnejší ako aFGF vo väčšine systémoch bioskúšok.
KGF predstavuje silnú mitogenickú aktivitu pre rôzne bunky a viaže receptory k bunkovému povrchu na Balb/MK keratinocyty, ku ktorým sa môžu tiež viazať aFGF a bFGF (Bottaro a kol., 1990, J. Biol. Chem., 265: 12767-12770). Avšak KGF je odlišný od známych FGFs (napr. aFGF a bFGF), pretože nie je mitogenický pre fibroblasty alebo endoteliálne bunky (pozri Rubín a kol., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 802-806). KGF má tiež rôzne receptory na NIH/3Ť3 fibroblastoch z receptorov pre aFGF a bFGF, ktoré nereagujú s KGF (pozri Bottaro a kol., uvedené vyššie).
Spoločným charakteristickým znakom aFGF a bFGF je prirodzená tendencia týchto faktorov viazať sa tesne k heparínu. Afinita aFGF k heparínu sa zdá byť slabšia ako pre bFGF, kde aFGF má aniónový izoelektrický bod (Thomas a kol., 1984, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 82: 6409-9413). Ojedinelé väzbové vlastnosti heparínu k aFGF a bFGF obrovsky uľahčili čistenie týchto faktorov.
Zistenie, že FGFs má silnú afinitu pre imobi1izovaný heparín, tiež popohnalo výskum vzhľadom na regulátorovú úlohu molekúl podobných heparínu v prostredí in vivo biológie FGFs. Aj keď boli stanovené úplné spektrá funkcií pre heparín, je známe, že heparín môže regulovať funkciu FGF niekoľkými spôsobmi (Lobb, 1988, Eur. J. Clin. Invest., 18: 231-236). Napríklad molekuly podobné heparínu môžu hrať riadiacu úlohu vo funkcii FGF, ktorá zahrnuje aktiváciu alebo zosilnenie aFGFs (Uhllrich a kol., 1986, Biochem. Biophys. Res. Comm., 137: 1205-1213).
Neexistuje však priama súvislosť medzi afinitou FGF pre imobi1 izovaný heparín a schopnosťou FGF byť zosilnený pomocou rozpustného heparínu. Z tohoto dôvodu sa zdá byť zosilňujúca sila heparínu selektívna pre aFGF. Napríklad Uhllrich (á kol., 1986, uvedené vyššie), zistil, že stupeň zosilneného čistého aFGF je asi desaťkrát väčší ako pre čistý bFGF, ktorý zvyšuje silu pre aFGF na približne rovnakú úroveň ako má bFGF. Avšak v prítomnosti fetálneho hovädzieho séra bol zistený významne znížený zosilňujúci efekt heparínu (Uhllrich a kol., 1986, pozri vyššie uvedené).
Použitie FGF proteínov sa zdá byť efektívne v podpore liečenia tkanív vystavených poraneniu. Jedinečné angiogénne vlastnosti proteínov FGF robia tieto faktory veľmi vhodnými pre liečenie hlbokých rán. Prirodzené FGF proteíny boli uvedené ako užitočné v liečení infarktu myokardu (US patenty č. 4 269 100 a 4 378 347). Okrem toho bolo zistené, pokiaľ ide o ľudský bFGF, že zvyšuje schopnosť 'nervových buniek prežiť a predĺženie neuritov vo fetálnych neurónoch potkanieho hippocampu, čo potvrdzuje, že tento faktor môže byť užitočný v liečení degeneratívnych neurologických porúch, ako je napríklad Alzheimerova a Parkinsonova choroba (Wallicke a kol., 1986, Proc., Natl. Acad. Sci., USA, 83: 3012-3016).
Hlavný. kameň úrazu pre efektívne využitie aFGF v terapeutických aplikáciách sa zdá byť vo vzťahu k jeho významne zníženej biologickej aktivite v porovnaní s bFGF. Aj keď štúdie s heparínom predpokladajú, že zistený rozdiel v sile medzi aFGF a bFGF môže byť podstate zmenšený pomocou heparínu, ktorý zvyšuje aktivitu aFGF na úroveň porovnateľnú s bFGF, použitie heparínu vo farmaceutických prípravkoch však nie to je nutné poznamenať, že s glykozaminoglykán heterogénnou antikoagulant, ktorý urýchľuje priemernú rýchlosť, pri ktorej antitrombín III inaktivuje proteázy homeostázy (Jacques, 1980, Pharmacol Rev., 31: 99-166). Nie je známe, či môže byť použitie heparínu vo farmaceutických prípravkoch škodlivé pri liečení hlbokých rán, kde niektorý stupeň koagulácie môže byť požadovaný, aby bolo dosiahnuté správne liečenie.
Vzhľadom na sulfátovaný známy ako je vždy vhodné, heparín vysoko štruktúrou je
Okrem toho môžu vzniknúť praktické prípady' tam, kde je heparín začlenený do farmaceutického prípravku na liečenie hlbokých rán. Koncerny dodania liečiv zahrnujú kontrolovanie kompozície farmaceutického prípravku (s obsahom kombinácie aFGF a heparínu) na vstupe do tela pacienta. Avšak negatívny účinok fetálneho hovädzieho séra na zosilňujúci efekt heparínu na aFGF (zistené Uhllirichom a kol.), potvrdzuje, že ktorákoľvek výhoda získaná začlenením heparínu do farmaceutického prípravku ako aktivujúceho alebo zosilňujúceho faktora pre aFGF, by mohla byť úplne negovaná alebo stratená jediným kontaktom, ak bude reagovať vlastné sérum pacienta.
Podstata vynálezu
Predmetom toTioto predloženého vynálezu je poskytnutie analógu proteínu z rodiny FGF, ktorý má zvýšenú stabilitu v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcou formou proteínu. Ďalším predmetom tohoto predloženého vynálezu je poskytnutie analógu a FGF, ktorý vykazuje zvýšenú stabilitu a biologickú aktivitu pri neprítomnosti heparínu. A ešte ďalším predmetom tohoto predloženého vynálezu je poskytnutie aFGF analógu pre terapeutické použitie.
Predložený vynález poskytuje nové analógy proteínov FGF rodiny. Jedným z týchto analógov je aFGF, ktorý je stabilnejší a vykazuje väčšiu biologickú aktivitu pri neprítomnosti heparínu, než je u prirodzene sa vyskytujúceho aFGF. Ďalší takýto analóg je KGF analóg, ktorý má zvýšenú tepelnú stabilitu v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcim KGF. Zvýšená stabilita je dosiahnutá pomocou substitúcie aspoň jednej aminokyseliny, ktorá má vyššiu silu tvorby slučky loop-forming pre zvyšok aminokyseliny s nižšou silou tvorby slučky v alebo na slučke sekvencie aminokyselín Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr prirodzene sa vyskytujúceho proteínu. V prípade aFGF sa objavuje sekvencia slučky v priestore aminokyselín od asi 92 do 96. V prípade KGF sa oblasť slučky objavuje v priestore aminokyselín od asi 115 do 119. Preferovaný analóg podľa tejto prihlášky vynálezu obsahuje substitúciu aminokyseliny, ktorá má vyšší potenciál tvorby' slučky pre histidínový zvyšok v sekvencii slučky.
Podľa tohoto predloženého vynálezu sú poskytnuté nové analógy rodiny FGF. Tieto analógy vykazujú zlepšenú stabilitu v porovnaní s príslušnými prirodzene sa vyskytujúcimi proteínmi. V prípade analógu aFGF podľa predloženého vynálezu vykazuje tento analóg zvýšenú stabilitu a biologickú aktivitu pri neprítomnosti heparínu. V prípade analógu KGF podľa predloženého vynálezu vykazuje tento analóg zvýšenú tepelnú stabilitu. Analógy podľa tohoto predloženého vynálezu majú aspoň jeden iný aminokyselinový zvyšok odlišný od príslušného prirodzene sa vyskytujúceho proteínu v alebo na slučke sekvencie Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr nájdenej v prirodzene sa vyskytujúcej forme. Pre prípad aFGF sa slučka sekvencie vyskytuje v priestore aminokyselinových zvyškov od asi 92 do 96 (založené na číslovaní známej aminokyselinovej sekvencie pre hovädzí aFGF ako ukazuje obrázok 1). Pre prípad HGF sa slučka sekvencie vyskytuje v priestore aminokyselinových zvyškov od asi 115 do 119 ako ukazujú obrázky 9 a 10. Rôzne aminokyseliny(na) sú vybrané vzhľadom na ich vyšší potenciál tvorby slučky s cieľom stabilizácie tohoto priestoru v analógu. Aminokyseliny, ktoré majú relatívne vysoký potenciál tvorby slučky zahrnujú glycín, prolín, tyrozín, kyselinu asparágovú, asparagín a serín (Leszcynski a kol., 1986, Science, 234: 849-855, 1986, relatívne hodnoty potenciálu tvorby slučky zistené na základe frekvencie výskytu v štruktúrach slučiek prirodzene sa vyskytujúcich molekúl). Výhodne môže nahradzovať histidínový zvyšok v slučke tvorenej sekvenciou aj iná aminokyselina, ktorá má vyšší potenciál tvorby slučky. A ešte výhodnejšie môže byť histidínový zvyšok v slučke tvorenej sekvenciou nahradený glycínovým zvyškom.
K analógom predloženého vynálezu môžu byť zahrnuté tiež adície, substitúcie a/alebo delécie. Napríklad analóg môže tiež výhodne obsahovať aminokyselinovú substitúciu pre nekonzervované histidínové zvyšky (napr. cysteínový zvyšok pozícii 47 hovädzej aFGF molekuly a cysteínový zvyšok v pozícii 16 ľudskej aFGF molekuly). Okrem toho, analógy podľa predloženého vynálezu, ktoré sú exprimované v hosťujúcich bunkách E. coli, môžu obsahovať iniciačný rnetioninový aminokyselinový zvyšok (tj. v pozícii -1 ako je ukázané na obrázku 1). Ďalšou alternatívnou možnosťou je, že jeden alebo viac terminačných aminokyselinových zvyškov môže byť deletovaných zo sekvencie DNA, ako je známe odborníkom vyznajúci sa v stave techniky, zatiaľ čo si v podstate zachovávajú zvýšenú biologickú aktivitu, ktorá zodpovedá prirodzene sa vyskytujúcemu proteínu.
Sú tiež poskytnuté DNA sekvencie pre všetky analógy alebo časť analógov podľa tohoto predloženého vynálezu. Takéto sekvencie môžu výhodne zahrnovať včleneniu preferovaných kodónov pre expresiu pomocou selektovaných hostiteľských kmeňov E. coli (E. coli expressíon codons), zaistenie rozštiepených miest pomocou reštrikčných endonukleázových enzýmov a/alebo zaistenie iniciačných, terminačných alebo intermediátorových sekvencií DNA, ktoré umožňujú konštrukciu ľahko exprimovaných vektorov. Tieto nové DNA sekvencie zahrnujú sekvencie, ktoré sú užitočné pre zaistenie expresie analógov podľa tohoto predloženého vynálezu a to v obidvoch hosťujúcich bunkách eukaryotických a prokaryotických (ako sú napr. E. coli).
Viac špecifikované môžu DNA sekvencie podľa tohoto vynálezu zahrnovať DNA sekvencie vyznačené na obrázku 1, kde aspoň jeden kodón kódujúci aminokyselinový zvyšok v oblasti od asi 92 aminokyseliny do asi 96 aminokyseliny je nahradený pomocou kodónu, ktorý kóduje iný aminokyselinový zvyšok, ktorý má vyšší potenciál tvorby slučky (nižšie v tomto texte uvedené aFGF analógy sekvencie(í) alebo analógy sekvencie(í)), ako aj DNA sekvenciu, ktorá hybridizuje jeden z analógov sekvencií alebo ich fragmenty a DNA sekvenciu, ktorá by (až na degenerovaný genetický kód) mohla hybridizovať jeden z analógov sekvencií.
Podobne DNA sekvencia podľa tohoto vynálezu môže obsahovať DNA sekvenciu vyznačenú na obrázku 10, kde aspoň jeden kodón kódujúci aminokyselinový zvyšok v oblasti od asi aminokyseliny
115 do asi aminokyseliny 119 je nahradený pomocou kodónu, ktorý kóduje iný aminokyselinový zvyšok, ktorý má vyšší potenciál tvorby slučky (nižšie v tomto texte uvedené KGF analóg sekvencie(í) alebo analóg sekvencie(í)), ako aj DNA sekvenciu, ktorá hybridizuje jeden z analógov sekvencií alebo ich fragmenty a DNA sekvenciu, ktorá by (až na degenerovaný genetický kód) mohla hybridizovať jeden z analógov sekvencií.
Analógy podľa tohoto predloženého vynálezu môžu byť kódované, exprimované a čistené pomocou akejkoľvek metódy z početných rekombinantných technológií, ktoré sú známe odborníkom. Preferované produkčné metódy sa budú meniť v závislosti od mnohých faktorov a podmienok, ktoré zahrnujú cenu a dostupnosť materiálu a iných ekonomických podmienok. Optimálna produkčná procedúra získania situácie bude zrejmá tým odborníkom, ktorí experimentov. Analógy podľa tohoto byť exprimované na veľmi vysokej majú znalosť aspoň minima predloženého vynálezu môžu úrovni použitím hosťujúcich buniek E. coli, ktoré exprimujú konečný produkt a sú ďalej čistené, aby sa priblížili homogenite použitím procedúr známych zo stavu techniky. Typický čistiaci proces zahrnuje najprv rozpustenie orgánov, ktoré obsahujú analógy, nasleduje iónovovymieňačová chromatografia, potom rozkladanie proteínu a nakoniec hydrofóbna chromatografia.
Analógy podľa predloženého vynálezu predstavujú prekvapujúci stupeň zvýšenej stability. Na rozdiel od prirodzene sa vyskytujúceho aFGF, analógy aFGF podľa predloženého vynálezu demonštrujú zvýšenú stabilitu a biologickú aktivitu pri neprítomnosti heparínu. Zatiaľ čo je známe, že stabilnejšie analógy bFGF môžu byť získané pomocou substitúcie serínu alebo iných neutrálnych aminokyselín v mieste určitého cysteínového zvyšku (ako je napríklad popísané v zverejnenej PCT prihláške vynálezu č. 88/04189), substitúcia pre nekonzervovaný cysteínový zvyšok v pozícii 47 prirodzene sa vyskytujúceho samotného hovädzieho aFGF nie je významná pre zvýšenie biologickej aktivity a/alebo pre stabilitu analógu aFGF. To je ukázané nižšou aktivitou, ktorú znázorňuje hovädzí (Ala47) a FGF analóg (substituovaný cysteínom) v porovnaní s hovädzím (Äla47, Gly93) aFGF analógom (majúci požadovanú substitúciu aminokyselinových zvyškov v oblasti od 92 do 96 aFGF molekuly), ako je uvedené v príkladoch, ktoré nasledujú. U hovädzieho analógu (Ala47, Gly93) aFGF, aj keď má ešte nižšiu silu ako bFGF, bola špecificky zistená približne desaťkrát väčšia sila ako u hovädzieho (Ala47) analógu aFGF. Pri prídavku 45 /ug/ml heparínu bola zvýšená biologická aktivita u všetkých troch foriem FGF, ako u' hovädzieho (Ala47, Gly93) analógu, hovädzí (Ala47, Gly93) analóg a ľudský (Ser70, Gly93) analóg majú v podstate rovnakú potenciu.
Dôvod pre zvýšenie mitogenickej aktivity a stability hovädzieho (Ala47, Gly93) aFGF analógu vo vzťahu k hovädziemu (Ala47) aFGF analógu v neprítomnosti heparínu nebol okamžite jasný. Substitúcia glycínu za histidínový zvyšok v pozícii 93 ukázala tvorbu aFGF molekuly o niečo viac hydrofóbnou, ale neprejavila drastickú zmenu jej terciárnej štruktúry, ako je stanovené pomocou cirkulárneho dichroizmu a FTIR spektroskopie. Avšak tieto relatívne rozdiely v zistených aktivitách v prostredí in vitro testov pre hovädzí (Ala47, Gly93) aFGF analóg a pre hovädzí (Ala47) aFGF analóg (so substitúciou v pozícii len 47) naznačuje, že substituovaná aminokyselina glycín v pozícii 93 hovädzieho (Ala47, Gly93) aFGF analógu môže byť vnútri alebo blízko oblasti zodpovednej za väzbu receptora. Aj keď nebola stanovená väzbová oblasť receptora v aFGF, pozícia 93 v aFGF zodpovedá oblasti v bFGF, ktorá je zapísaná vnútri alebo blízko receptora, ktorý viaže doménu (Baird a kol., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 2324-2328).
Okrem toho hovädzí (Ala47, Gly93) aFGF analóg podľa predloženého vynálezu na rozdiel od hovädzieho (Ala47) analógu ukazuje zvýšenú stabilitu, ktorá udržiava. jeho pôvodnú mitogenickú aktivitu pri neprítomnosti heparínu počas 250 hodín, zatiaľ čo hovädzí (Ala47) analóg rýchlo stráca aktivitu. Hovädzí (Ala47, Gly93) aFGF analóg bol rekryštalizovaný a výsledné kryštály skúmané r | ntgenovou kryštalografiou. Rintgenové kryštalografické údaje získané zo skúmaných kryštálov podporujú histidínovú hydrof i Inú. analógové j predpoklad podľa údajov z hydrofóbnej chromatografie/ že zvyšok v pozícii 93 je vystavený rozpusteniu, tj. že glycín pre substitúciu v pozícii 93 tvorí molekulu menej Podrobný prieskum hovädzieho (Ala47, Gly93) aFGF sekvencie okolo zvyšku 93 ukázal nazhromaždenie približne 8 aminokyselín s vyšším potenciálom tvorby v oblasti od asi zvyšku kyseliny glutámovej v pozícii 90 do asi tyrozínového zvyšku v pozícii 97. Relatívne potenciály tvorby slučiek aminokyselín sú popísané, pričom bolo zistené, že glycín je aminokyselinový zvyšok, ktorý má najvyšší potenciál tvorby slučky a to z všetkých uvedených aminokyselín (Leszcynski a kol., uvedené vyššie). Teda glycín pre substitúciu histidínu je schopný slučku vzhľadom na oveľa vyšší stabilizovať predpokladanú potenciál tvorby histidínom.
slučky glycínového zvyšku porovnaní
Analógy KGF podľa predloženého vynálezu tiež ukazujú, že príslušná oblasť v KGF je rozpustnosti vstavená slučka, ktorá môže byť zahrnutá do receptorovej väzby. Pokiaľ ide o analóg (Gly116) KGF podľa predloženého vynálezu, bola špecificky zistená meniaca sa znížená mitogenetická aktivita v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcim KGF, ako je ukázané na príkladoch, ktoré nasledujú. Pokiaľ ide o analóg (Gly116) kGF, bolo tiež zistené, že má o 5-7 °C vyššiu termickú stabilitu v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcim kGF.
Ostatné analógy, okrem preferovaných (Gly93) aFGF a (Gyl116) KGF špecificky predstavených vyššie, sú predpovedané týmto predloženým vynálezom. Tieto ostatné analógy by mohli byť ľahko odborníkom pripravené pomocou nasledujúcich tu poskytnutých podkladov. Napríklad nie je menej ako 15 popísaných kyselín, ktoré majú vyšší potenciál tvorby slučky ako histidín (Leszcynski a kol., 1986, uvedené vyššie). Tieto aminokyseliny sú (v zostupnom poradí potenciálu tvorby slučky): glycín, prolín alebo tyrozín, kyselina asparágová alebo asparagín, serín, cysteín, kyselina glutámová, treonín, lyzín, cystín, glutamín, arginín, fenylalanín a tryptofán. Substitúcia ktoréhokoľvek z týchto aminokyselinových zvyškov histidínovým zvyškom v sekvencii slučky prirodzene sa vyskytujúceho proteínu, by mohla viesť k očakávanému analógu podľa predloženého vynálezu, ktorý má zvýšenú stabilitu. Bude samozrejme preferované nahradiť hystidínový zvyšok v sekvencii tvorenej slučky aminokyselinou, ktorá má najvyššiu možnú potenciu tvorby slučky bez vytvorenia akýchkoľvek negatívnych účinkov potenciálu, ako je napríklad tvorenie nežiaducich disulfidových väzieb počas inzercie pridaného cysteínu alebo cysteínového zvyšku. A preto ďalšími preferovanými aminokyselinovými substitúciami histidínového zvyšku v sekvenčnej slučke (tj. pri pridaní glycínu) sú predstavené prolínom, tyrozínom, kyselinou asparágovou, serínom, kyselinou glutámovou, treonínom, lyzínom, glutamínom, arginínom, fenylalanínom a tryptof ánom.
Tento predložený vynález tiež predpokladá substitúciu aminokyselín, ktoré majú vyšší potenciál tvorby slučky pre iné aminokyselinové zvyšky vnútri aminokyselinovej oblasti od 92 do 96 prirodzene sa vyskytujúceho aFGF (tj. aminokyselín 92 a 94-96) a aminokyselinovej oblasti od 115 do 119 prirodzene sa vyskytujúceho aFGF (tj. aminokyselín 92 a 115-117-119). Analógy aFGF podľa predloženého vynálezu zahrnujú napríklad aFGF analógy, ktoré majú treonínový zvyšok v pozícii 96 prirodzene sa vyskytujúceho aFGF nahradený glycínom, prolínom alebo tyrozínom, kyselinou asparágovou, serínom alebo kyselinou glutámovou v poradí preferencie, aj keď minimálne zvýšenie stability a/alebo biologickej aktivity by bolo očakávané za substitúcie glutámovej kyseliny pre treonín vzhľadom na podobnosť potenciálu tvorby slučky týchto dvoch aminokyselín.
Aminokyselinové zvyšky v pozíciách 92, 94, 95 a 97 (asparagín, tyrozín, resp. asparagín a tyrozín) prirodzene sa vyskytujúceho aFGF majú dostatočne vysoký potenciál tvorby slučky, takže sú predvídané minimálne úžitky vzniknuté zo substitúcie týchto jednotlivých zvyškov.
Zdá sa, že analógy podľa predloženého vynálezu zahrnujú analógy obojakého pôvodu, ľudský aj zvierací (napr. hovädzí), ako aj foriem proteínu, ktorý má takúto aminokyselinovú sekvenciu tvorenej slučky:
93 94 95 96 (aFGF)
-Asn-His-Tyr-Asn-Thr115 116 117 118 119 (KGF)
Napríklad obidve formy ľudského aj zvieracieho analógu aFGF sú známe a boli identifikované ako tie, ktoré majú totožné aminokyselinovú sekvencie (ukázané vyššie) v pozíciách od 92 do 96. Okrem toho je približne 92% sekvenčná totožnosť medzi ľudským a hovädzím aFGF a 97% podobnosť (tj. 5 % z celkovej 8% zmeny medzi dvoma formami aFGF je konzervovaných). Obidve formy, ľudská aj hovädzia, prirodzene sa vyskytujúceho aFGF vykazujú v podstate rovnakú mitogenickú aktivitu v prostredí in vitro.
Vzhľadom na ich zvýšenú stabilitu a biologickú aktivitu v neprítomnosti heparínu, sú nové analógy podľa predloženého vynálezu veľmi vhodné na to, aby boli použité vo farmaceutických zmesiach pre lekára a/alebo veterinára pri liečení mnohých typov hlbokých rán cicavčích druhov. Analógy KGF podľa predloženého vynálezu môžu byť tiež vhodné vzhľadom na ich zvýšenú termickú stabilitu na to, aby boli použité vo farmaceutických prípravkoch. Množstvo biologických analógov použitých v týchto liečeniach bude samozrejme závisieť od vážnosti liečených rán, cesty zvolenej aplikácie a špecifickej aktivity alebo čistoty analógu a bude stanovené ošetrujúcim lekárom alebo veterinárom. Termín terapeuticky účinné množstvo analógu sa týka množstva analógu určeného na to, aby bola vyvolaná terapeutická odpoveď v cicavcovi. Tieto terapeutické účinné množstvá sú ľahko zistiteľné odborníkom, ktorý sa vyzná v stave techniky.
Analógy podľa predloženého vynálezu môžu byť aplikované pomocou akejkoľvek cesty vhodnej na liečenie rán alebo na to, aby bol pripravený organizmus. Podmienky, ktoré môžu byť prospešné spracované spolu s terapeutickou aplikáciou(am.i) analógu podľa tohoto predloženého vynálezu zahrnujú, ale liečenie povrchových rán, liečenie regeneráciu nervov a tvorbu orgánov a/alebo nie sú tak obmedzené, kostí, angiogenézu, ich regeneráciu.
Farmaceutické zmesi podľa predloženého vynálezu pre obidve použitia, ako veterinárne, tak aj ľudské, obsahujú terapeuticky účinné množstvo analógu spoločne s jedným alebo viacerými farmaceutický vhodnými nosičmi, teda a výhodne, iné terapeutické prísady. ostatnými pri jemcu
Nosič(e) musí byť vhodný zložkami farmaceutickej Farmaceutické v zmysel znášanlivosti s zmesi a nesmie byť teda pre zmesi smú byť bez problémov a smú byť pripravené škodíivý.
prezentované v jednotke liekovej formy pomocou akejkoľvek metódy známej v stave techniky. Všetky tieto metódy zahrnujú krok zavedenia spojenia aktívnej zložky s nosičom, ktorý je'- tvorený jednou alebo viacerými vedľajšími zložkami. Všeobecne sú farmaceutické zmesi pripravené pomocou jednoznačne a dokonale zavedeného spojenia analógu s kvapalným nosičom alebo účelovo rozdeleného pevného nosiča alebo obidvoch.
Nasledujúce príklady sú poskytnuté ako pomoc na porozumenie predloženému vynálezu, ktorého skutočný rozsah je ukázaný v pripojených nárokoch. Je pochopiteľné, že môžu byť utvorené modifikácie v týchto procedúrach bez odchýlenia sa od zmyslu tohoto vynálezu.
Príklady realizácie vynálezu
Príklad 1: produkcia analógu (Ala47, Gly93) aFGF
Syntéza
Analóg (Ala47, Gly93) aFGF a analóg (Gly116) KGF boli pripravené použitím miestne riadenej mutagenézy. Avšak bude uznané, že tieto a iné analógy predloženého vynálezu môžu byť pripravené pomocou iných metód, ktoré zahrnujú chemické syntézy. V prípade analógu (Ala47, Gly93) aFGF bola použitá hovädzia sekvencia. Špecificky analóg (Ala47, Gly93) aFGF bol pripravený takto:
Hovädzí aFGF analóg podľa predloženého vynálezu bol pripravený a testovaný v nasledujúcich príkladoch. Tento analóg, hovädzí (Ala47, Gly93) aFGF bol konštruovaný tak, aby obsahoval požadované aminokyselinové substitúcie (glycín pre histidín v pozícii 93) v zvyšku sekvencie tvoriacej slučku od 92 do 93 molekuly aFGF a prídavnú aminokyselinovú substitúciu alanínu pre nekonzervovaný cysteínový zvyšok v pozícii 47, ako je ukázané na obrázku 1. Hovädzí (Ala47) aFGF analóg, ktorý má len aminokyselinovú substitúciu alanínu pre cysteín bol tiež pripravený pre použitie ako kontrola pre požadovaný hovädzí analóg (Ala47, Gly93) aFGF. Aj keď tieto príklady predstavujú hovädzí analóg aFGF predloženého vynálezu, rovnaké výsledky môžu byť dosiahnuté pre vysoko homológne ľudské analógy aFGF. Napríklad aminokyselinová sekvencia zodpovedajúca ľudskému analógu (Gyl93) aFGF podľa predloženého vynálezu je vyobrazená na obrázku 2 .
Syntetické gény, ktoré kódujú hovädzí analóg (Ala47, Gly93) aFGF, boli zhromaždené v dvoch sekciách z celkových 28 komponentov oligonukleotidov. Aminokyselinová sekvencia (Gimenez-Gallego a kol., 1985, Science, 230: 1385-1388) bola použitá ako základ pre tieto gény s kodónovými voľbami vybranými tak, aby optimalizovali expresiu v E. coli (Gimenez-Gallego a kol., 1985, uvedené vyššie). Sekcia I bola zhromaždená zo 16 oligonukleotidov, aby poskytla 287 nukleotidových fragmentov, ktoré by mohli byť inzertované do plazmidového vektora v Xba I a Xho I miestach reštrikčnej endonukleázy. Sekcia II bola zhromaždená z 12 nukleotidov, aby bolo získaných 170 nukleotidových fragmentov viazaných pomocou Xho I a Bam Hl kompatibilných koncov. Tieto dve sekcie boli inzertované do expresného plazmidu pCFM1156, ktorý bol predtým rozštiepený pomocou Xba I a Bam Hl v 3-komponentnej ligácii, čo poskytlo kompletný gén aFGF pod kontrolou lambda pL promótora.
Plazmid pCFM1156 je pripravený zo známeho plazmidu pCFM836.
Príprava plazmidu p(ľFM836 je popísaná v US patente 'č. 4 7 10 473; relevantné časti špecifikácie, predovšetkým príklady od 1 do 7, sú takto začlenené pomocou odkazu. Aby bol pripravený plazmid PCFM1156 z plazmidu pCFMS36. sú rozrezané dve endogénne Nde I reštrikčné miesta, odkryté konce sú vyplnené pomocou T4 polymerázy a vyplnené konce sú ligované zarovnanými koncami.
Výsledný plazmid je potom štiepený pomocou Cla I a Κρη I a excizovaný DNA fragment je nahradený oligonuklecitidom DNA s touto sekvenciou:
5' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3' ' - TAAACTAA.GATCTTQCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC - 5'
E. coli bunky transformované plazmidom boli pestované vo fermentačnej nádobe 16 litrov (ako je popísané vo Fox a kol., 19SS, J. Biol. Chem., 263: 18452-1S45S).
Kódujúci konvertovaný gén pre hovädzí analóg (Gly93, Ala47) aFGF bol na (Ala47) formu použitím miestne riadenej mutagenézy oligonukleotidov. Gén aFGF bol najprv transferovaný do fágového vektora M13mpl8 a bola pripravená jednoretazcová DNA slúžiaca ako matrica pre reakciu riadenej mutagenézy. Približne 0,5 /ug tejto DNA bolo mixovaných spolu s 5 pikomólmi každého mutagénneho priméru (5’-GAAGAAAACCATTACAACAC-3’) a M13 univerzálny primér bol použitý pre sekvenovanie DNA, zahriaty na 65 počas 3 minút a postupne pomaly ochladený. Schladený matricový primér bol mixovaný s ATP, so zmesou d.NTP, s veľkým fragmentom DNA polymerázy a s ligázou DNA, potom inkubovaný pri 15 °C počas 4 hodín. Alikvotné časti tejto reakčnej zmesi boli pridané ku kompetentným bunkám E. coli JM101 a umiestené v 0,7% agare. Výsledné plaky boli replikované do n itrocelulózových filtrov a filtre boli hybridizované s označeným mutagénnym primárom 32p. Pripravená DNA z fágu, ktorý hybridizoval, bola sekvenovaná, aby sa overila úspešná kompletácia požadovaného mutagénneho materiálu. Výsledný gén bol potom transferovaný spať do vektora PCFM1156 pre expresiu rekombinantného proteínu.
Čistenie analógu aFGF
Obidva hovädzie (Gly93. Ala47, a (Ala47) aFGF analógy boli vyčistené z nerozpustnej frakcie získanej z centrifugácie mechanicky lisovaných buniek E. coli,ktoré exprimujú rekobminantný proteín. Peletová frakcia bola rozpustená v 8 M močovine, 0,1 M glycínom, pH 2,5 a centri fugovaná, aby sa odstránili materiály. Supernatant bol zaliaty do S-Sepharose<R> (Pharmacia, Uppsala, Sweden) kolóny ekvi1ibrovanej 6 M močovinou, 10 mM glycínom, pH 3,0 a premytá 6 M močovinou, 20 mM citrátom sodný, pH 6,5. Proteíny, ktoré sa naviazali na kolónu, boli eluované lineárnym 'gradientom od 0 do 0,5 M chloridu sodného v 20 mM citráte sodnom, pH 6,5. Frakcie, ktoré obsahovali aFGF boli spojené, zriedené dvadsaťkrát s 20 mM citrátom sodným, 0,1 sulfátom amónnym a centri fugované, aby sa odstránili akékoľvek zrazeniny. Supernatant bol mixovaný s jedným dielom 20 mM citrátu sodného, 2 M sulfátu amónneho a zaliaty do kolóny feny1Sepharose<R) ekvi1ibrovanej s 20 mM citrátu sodného, 1 M sulfátu amónneho, pH 6,5. Naviazané proteínu boli eluované z kolóny pomocou zostupného lineárneho gradientu (od 1 M do 0 M) sulfátu amónneho. Frakcie, ktoré obsahovali analógy aFGF, boli spojené a dialyzované proti 20 mM citrát sodnému, pH 6,5. Tento produkt bol v podstate homogénny, ako demonštruje skutočnosť, že sa neobjavili žiadne iné väzby v SDS géle Coomasie blue, ako je uvedené na obrázku 4.
Príklad 2: gélová filtračná chromatografia aFGF analógu
Gélová použitím (Pharmacia, prietokovej M chloridu filtrácia bola uskutočnená pri kolóny Superosa(R>-12 na systéme Uppsala, Sweden). Kolóna bola izbovej teplote Pharmacia FPĽC filtrovaná pri rýchlosti 0,5 ml/min 20 mM sodného, pH 6,5.
citrátu sodného, 0,2
Gélová filtračná chromatografia ukázala, že čistené, hovädzie (Ala47) a (Ala47, Gly93) aFGF analógy eluované ako jednoduché piky sú identické elučnej pozícii, ktorú má robinukleáza A (Mr = 13 700). Toto naznačuje, že obidva proteíny sú monomérne a že majú rovnaký hydrodynamický rádius, aj keď je tu možnosť, že obidve formy proteínu interagujú s matricou kolóny a poskytujú oneskorenú elúciu z kolóny.
Príklad 3: hydrofóbne interakčná chromatografia
Hydrofóbne interakčná chromatografia bola uskutočnená pri izbovej teplote použitím kolóny fenyl-Superosa<R> na systéme Pharmacia FPLC. Vzorka v 2M sulfáte amónnom, 20mM citráte sodnom, pH 6,5, bol zaliaty do kolóny, ktorá bola ekvi1ibrovaná 2 M sulfátom amónnym.'Po premytí 2 M sulfátom amónnym bol zvyšný proteín eluovaný zostupným gradientom sulfátu amónneho v koncentrácii od 2 M do 0 M a nasledovalo konečné premytie pomocou 20 mM citrátu sodného, pH 6,5.
Pretože elučná pozícia proteínu v chromatografi i (HIC) veľmi silne hydrofóbnych oblastí v založenom stave, hydrofóbnej interakčnej závisí od orientácie poskytuje táto technika senzitívnu nukleotidovú sondu konformačnej homogenity podobných profily pre hovädzí Analóg (Ala47) aFGF proteínov. (Ala4 7) a
Obrázok (Ala4 7 , predstavuje elučné Gly93) aFGF analógy. ukazuje hlavný pik, ktorý je eluovaný pri použití 0,25 M sulfátu amónneho, zatiaľ čo analóg (Ala47, Gly93) aFGF ukazuje samostatný pik pri použití 0,13 M sulfátu amónneho, čo naznačuje, že obidva proteíny existujú primárne v odlišnej konforinác i i . Elúcia pri nižšej soľnej koncentrácii analógu (Ala47, Gly93) aFGF ukazuje, že je mierne hydrofóbnejší ako forma (Ala47). Toto pozorovanie je zhodné aj pri nahradení histi d í nového zvyšku v pozícii 93 glycínom, ak je konformácia proteínu taká, že je tento zvyšok vystavený vplyvu rozpúšťadla. Inou možnosťou je, že zmena v tomto zvyšku by mohla spôsobiť celkovú zmenu v konformácii molekuly, aby vznikla hydrofóbnejšia štruktúra.
Príklad 4: spektroskopia analógu aFGF
Cirkulárny dichroizmus
Cirkulárne dichroické spektrum bolo stanovené pri izbovej teplote na spektropolarimetri Jasco Model J-500C (Jasco, Tokyo, Japan) vybaveným počítačom Oki lf S00 Model 30 (Oki, Tokyo, Japan). Merania boli uskutočnené v šírke 1 nm vlnového pásma použitím kyviet 1 a 0,02 cm pre blízku a vzdialenú ultrafialovú oblasť. Zistené údaje boli vyjadrené pomocou prostriedku zvyškovej eliptičnosti, (Ú), počítané použitím prostriedku zvyškovej hmotnosti obidvoch foriem aFGF.
Spektrum cirkulárneho dichroizmu (CD) hovädzích analógov (Ala47, Gly93) a '(Ala47) aFGF bolo takmer zhodné v obidvoch vzdialených aj blízkych ultrafialových oblastiach, ako ukazujú obrázky 4A a 4B. CD spektrum analógov bolo tiež veľmi podobné spektru zapísanému pre ľudský bFGF (Arakawa a kol., 19S9, BBRC, 161: 335-341). Podobnosť spektra v blízkej ultrafialovej oblasti je súhlasná s podobnosťou terciárnych štruktúr pre analógy FGF.
Teplotná tranzícia
Teplotná tranzícia proteínov bola stanovená na spektrofotometri Response II (Gilford, Medfield, Massachusetts) vybaveným teplotným programovaním a teplotným kyvetovým držiakom. Vzorky boli zahriate pri teplotnom prírastku 0,1 °C/min alebo 0,5 °C/min a ich absorbancia bola monitorovaná pri vlnovej dĺžke 2S7 nm. Proteínové koncentrácie boli stanovené spektrofotometricky použitím extinkčného koeficientu 0,98 pre bFGF a 1,04 pre obidva hovädzie analógy aFGF pri vlnovej dĺžke 280 nm pre 0,1% proteín.
Teplotná denaturácia aFGF analógov bola testovaná v prítomnosti a v neprítomnosti heparínu pri dvoch, pH 6,5 a 7,0, 20 mM citrátom sodným. Vo všetkých prípadoch sa proteíny vyzrážali hneď ako bola zvýšená teplota. Pri neprítomnosti heparínu bola táto teplota asi o 10 °C vyššia pre hovädzí analóg (Ala47, Gly93) aFGF než pre hovädzí analóg (Ala47) aťGF. Prídavok buď 1,4-násobného alebo S-násobného (w/w) prebytku heparínu zvýšil denaturačnú teplotu pre obidve formy na 14-20 °C, čo záviselo od rýchlosti použitia zvýšenej teploty. Rozdiel medzi denaturačnou teplotou obidvoch foriem bol asi 10 °C. Nebol tu však zrejmý efekt 1,4-násobného alebo 8-násobného (w/w) prebytku heparínu na spektrum CD ktoréhokoľvek proteínu v rozsahu vlnovej dĺžky od 240 do 340 nm, aj keď v prípade 8-násobného prebytku heparínu spektrum aFGF v rozsahu vlnovej dĺžky od 240 do 260 bolo maskované absorbanciou samotného heparínu.
Fourier-transformačná infračervená spektroskopia (FTIR)
Fourier-transformačné infračervené spektrum bolo stanovené preto, aby bola testovaná ďalšia podobnosť v konformácii obidvoch analógov aFGF. Pre FTIR spektroskopiu boli proteíny dôkladne dialyzované proti vode. Každý proteín bol pripravený ako 2% roztok v 20 mM imidazolovom pufri pripravenom v D2O (Sigma Chemical Co. , 99,9% izotopová čistota). Roztoky boli umiestené v IR komôrkach s CaFs páskami a 100 /um medzerníkmi. Pre každé spektrum bolo zhromaždených 1 500 interferónov a kodifikovaných na systéme Nicolet S00 FTIR vybavenom KBr smerovým deličom (beam splitter) potiahnutým germániom a detektorom DTGS. Optické miesto (optical bench) bolo kontinuálne čistené pomocou suchého plynu dusíka. Druhé odvodené spektrum bolo odhadnuté (ako je popísané v Susi a kol., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm., 115:
391- 397). Deväťbodová hladiaca funkcia (9-point smoothing funktion) bola aplikovaná na vodnú spektrum parou odčítané.
Obrázok 5 ukazuje druhé odvodené spektrum (Ala47, Gly93) a (Ala47) hovädzích analógov aFGF v amidovej oblasti I’ (C=O plocha stretch v deuterovaných proteínoch). Rýchlosti v jednotlivých väzbách proteínov a polypeptidov v tejto oblasti sú závislé od obsahu druhej štruktúry (Surewicz a kol., 1988, Biochem. Biophys. Acta, 952: 115-130). Spektrá ukazujú silné väzby 1 630 cm-1 a
6S5 cm-1, ktoré indikujú významné množstvo betaštruktúr v týchto dvoch proteínoch. Silná väzby blízko 1 647 cm-1 je indikovaná prítomnosťou nepravidelných alebo porušených štruktúr. Slabé piky blízko 1 666 a 1 673 cm-1 vznikajú zo ^zmenených štruktúr. Malý pik je uvedený blízko 1 651 cm-1 v spektre obidvoch proteínov.· Amidové I’ komponenty blízko tejto rýchlosti sú typicky podobné alfahelixom. Avšak nedávno bolo ukázané, že tieto väzby môžu vzniknúť zo slučkových štruktúr (Wilder a kol., 1990, Abstracts of the Fourth Symposium of the Protein Society, San Diego). Ako je ukázané na obrázku 5, vysoko rozriešené FTIR spektrá, na rozdiel od CD spektier, jasne dokladajú prítomnosť betaštruktúr obrátených štruktúr (turn) a spektrá pre hovädzí analóg (Ala47) aFGF a pre hovädzí analóg (Ala47, Gly93) aFGF sú blízko zoradené, čo opäť potvrdzuje domnienku, že tieto dva proteíny majú podobnú konformáciu.
Druhé odvodené” spektrum neukazuje očividne žiadny rozdiel v konformácii medzi týmito dvoma aFGF analógmi. Avšak bolo evidentné, že sa denaturácia vymeniteľných protónov vyskytuje častejšie pre hovädzí (Ala47) aFGF analóg než pre hovädzí analóg (Ala47, Gly93) aFGF počas ekvilibrácie lyofi 1 izovaného proteínu s roztokom D2O. Pretože tieto dva proteíny majú podobnú konformáciu, pozorované rozdiely vo výmene pomeru H-D nemôžu byť vysvetlené z rozdielov v stupni vystavenia vymeniteľných protónov medzi týmito proteínmi. Je viac pravdepodobné, že analóg (Ala47) aFGF má flexibilnejšiu štruktúru, ktorá poskytuje amidovým protónom väčšiu prístupnosť k rozpúšťadlu.
Príklad 5: heparínová chromatografia analógu (Ala47, Gly93) aFGF
Heparínová Sepharose<R7 (Pharmacia) bola naplnená do 1x8 cm kolóny ekvilibrovanej 10 mM Tris-HCl, pH 7,2. Kolóna bola nastrieknutá, premytá 10 mM Tris-HCl, pH 7,2 a eluovaná lineárnym gradientom od 0 do 2,8 M chloridu sodného v rovnakom pufri pri prietokovej rýchlosti 0,5 ml/min použitím systému Pharmacia FPLC.
Kyslý a zásaditý aFGF sú význačné pre ich tendenciu viazať sa k heparínovým a heparínu podobným molekulám. Obidva hovädzie analógy a (Ala47, Gly93) a (Ala47) aFGF ukazujú jediný pik vzhľadom na elúciu pri 1,54 M chloride sodnom pH 7,2.
Tris-HCI
Príklad 6: biologická aktivita analógov aFGF
Bioskúšky v in vivo
Mitogenetická aktivita buniek NIH 3T3 analógov aFGF z predchádzajúcich príkladov bola stanovená ako je popísané nižšie. Okrem toho ľudský (Ser70, Ser88) bFGF analóg, ktorý bol popísaný v zverejnenej PCT prihláške vynálezu č. 88/041S9 bol tiež testovaný v bioaktívnych skúškach popri analógoch aFGF.
streptomycínu. týždeň. Prvý
Bunky NIH 3T3 analógov aFGF boli získané zo zbierky ATCC. Bunky boli pestoVané v DME doplnenom 10% hovädzím sérom, 10 jednotkami/ml penicilínu, 2 mM glutamínom a 10 jednotkami/ml , Bunky boli pasážované pri pomere 1:40 dvakrát za deň skúšky boli splývajúce kultúry rozptýlené trypsínom a umiestené do 24-jamkovej doštičky v koncentrácii 20 000 buniek/ml, 1 ml na jamku vyššie uvedeného média. Piaty deň bolo médium nahradené 1 ml/jamku DMEM bez séra, ale s obsahom penicilínu, streptomycín a glutamín vo vyššie uvedenej koncentrácii. Šiesty deň boli do média pridané testované vzorky v objeme, ktorý nebol väčší ako 100 /ul. O osemnásť hodín neskôr boli bunky pulzované počas jednej hodiny s 1 ml vyššie uvedeného média, ktoré obsahovalo 2- 10 /uCi tritiumovaný tymidín pri 37 °C. Po pulzácii boli bunky raz premyté s médiom a potom bolo pridaných 250 mM sacharózy, 10 mM fostátu sodného, 1 mM EDTA, pH 8 a doštičky boli inkubované pri 37 °C 10 minút, aby boli bunky uvoľnené. Bunky boli zozbierané na Skarton harvester (Skarton,
Inc., Šterling, Virginia). Filtre scintilačnej kvapaline a počítané boli sušené, umiestené v na scintilačnom počítači
Beckman (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, California).
Mitogenetická aktivita hovädzieho (Ala47, Gly93) a (Ala47) aFGF analógov buniek NIH 3T3 bola stanovená ako ukazuje obrázok 6. Pri neprítomnosti heparínu produkoval aFGF analóg od dávky závisiacu stimuláciu 3H tymidínovú absorpciu v rozsahu od 1 do 100 ng/ml s polovičnou stimuláciou 25 ng/ml. Pri rovnakých podmienkach bol analóg (Ala47. Gly93) aFGF schopný produkovať rovnakú mitogenetickú aktivitu pri oveľa menšej koncentrácii proteínu, polovičná dávka bola asi 1 mg/ml. Rekombinantný bFGF bol 4-5 krát silnejší než analóg (Ala47, Gly93) aFGF pri polovičnej dávke 220 pg/ml. Keď bolo pridaných 4,5 /ug/ml heparínu k obidvom analógom, bola ich aktivita v in vitro zvýšené so zvyšnou väčšou silou analógu (Ala47, Gly93) aFGF. Pri prítomnosti 45 /ug/ml heparínu boli aktivity také, že príslušná dávka všetkých troch molekúl bola takmer zhodná pri polovičnej dávke 90 pg/ml.
Stabilita analógov aFGF ako bolo stanovené pomocou ich retencie, resp. mitogenickej aktivity, bola preskúmaná inkubáciou 0,1 mg/ml roztoku každého FGF analógu v 20 mM citráte sodnom, pH 7, pri 37 °C, obidva pri prítomnosti a neprítomnosti 1 mg/ml heparínu. Pri neprítomnosti heparínu hovädzí analóg (Ala47) aFGF rýchlo stratil aktivitu s polčasom rozpadu 13 hodín, ako je ukázané na obrázku 7. Avšak pri prítomnosti heparínu hovädzí analóg (Ala47) aFGF nestratil biologickú aktivitu viac ako 250 hodín počas experimentu. V kontraste s tým, žiadny hovädzí analóg (Ala47, Gly93) aFGF, ani ľudský analóg nestratil aktivitu viac ako 250 hodín, prítomný, alebo nie.
(Ser7 0 , Sers 8 ) bFGF jedno či bol heparín
Príklad 7: kryštalografia analógu (Ala47, Gly93) aFGF
Kryštály hovädzieho analógu (Ala47, Gly93) boli pestované pomocou parnej difúzie proti 0,2 M NH4SO4, 2 M NaCl, 0,099 M citrátu sodnému a 0,02 M fosfátu sodnodraselnému, pH 5,6. Proteínová kvapôčka obsahovala rovnaké objemy zásobného roztoku a 10 mg/ml proteínového roztoku. Kryštály boli trigonálne (priestorová skupina P3i 21 , a = 78,6 A, c=115,9 A) a odchýlka 2,5 A rozlišovacej schopnosti.
pomocou Siemens (Madison,
Intenzívne údaje boli zhromaždené Wisconsin) multiwire area detector inštalovaného na 18 kw rotačnom anódovom generátore. Vhodné procesné programy Siemens boli použ i té na zníženie údajov. Multipólové izomorfné náhradné fázy (mir) boli počítané na 3 A rozlišovaciu schopnosť z dvoch derivátov s číselnou hodnotu 0,68. Po stabilizovaní · rozpúšťadlom boli identifikované oblasti zodpovedajúce dvom nezávislým molekulám aFGF v asymetrickom útvare. Všeobecná nekryštalografická symetria týmito molekulami bola stanovená z priestorovej translačnej funkcie a hustoty. Molekulový obal bol definovaný okolo vypočítaného priemeru molekuly aFGF modifikovaným B.C. Wang algoritmom. Fázy boli opakovane čistené pomocou molekulového zisteného priemeru a stabilizované rozpúšťadlom.
príbuzná medzi funkcie, reálne rotačnej štúdií vzájomných vzťahov
Začiatočné mapy odkryli predĺžené oblasti beta plošnej štruktúry, ktorá 1)013 skrátená v slučke, vzhľadom na malý molekulový obal, ako je ukázané na obrázku 8. Končená mapa pre modelovanie výstavby bola počítaná pomocou fáz mir, z ťažkých atómových parametrov opäť čistená proti spriemerneným fázam (ako popisuje Rould a kol., 1989, Science, 246: 1135-1142) a opakovane spriemernená s molekulovým obalom generovaným pomocou rozmiestenia 6 A sfér okolo atómových pozícií v začiatočnom modeli. Vypočítanie priemeru pri 3 A rozlišovacej schopnosti konvergovalo ku konečnému faktoru R 17,8 % medzi pozorovanými štrukturovými faktormi a štrukturovými faktormi vypočítanými z priemernej mapy a mapy stabilizovanej rozpúšťadlom. Grafický program T0M/FR0D0, ktorý bol vybavený Silicon Graphics 4D80 od C. Cambillaua, bol použitý, aby vstaval zvyšky sekvencie aFGF od 10 do 136 do priemernej elektrónovej mapy hustoty.
Kryštalografické výsledky podporili hypotézu, že 90-97 oblasť je zahrnutá v slučkovej štruktúre. Ak je v skutočnosti táto oblasť zahrnutá v receptore, ktorý viaže (ako navrhuje Baird a kol., 1988, uvedené vyššie) akúkoľvek aminokyselinovú substitúciu, ktorá stabilizuje slučku, môže vlastne stabilizovať a/alebo zvyšovať biologickú aktivitu molekuly. , Toto je pravdepodobne podľa všetkého mechanizmus pre zaznamenané zvýšenie aktivity dosiahnuté s hovädzím analógom (Ala47, Gly93) aFGF.
Príklad 8: produkcia analógu (Gly116) KGF
Syntézy
Aby bol pripravený analóg (Gly116), bola najprv získaná sekvencia kódujúca prirodzene sa vyskytujúcu KGF a potom zmenená na kodón pre aminokyselinu 116, aby sa dosiahla kódujúca sekvencia pre analóg.
Kódujúca sekvencia pre prirodzene sa vyskytujúci KGF bola získaná použitím RNA izolovanej z ľudských fibroblastových buniek (bunková línia AG1523) ako štartovný materiál, z ktorého sa pripravuje cDNA pre KGF použitím štandardných techník známych zo stavu techniky. KGF cDNA bola potom použitá ako matrica pre polymerázové reťazcové reakcie (PCR), aby bol ampli f i kovaný gén KGF. Vzhľadom na prítomnosť vnútorného miesta Ndel v géne KGF, bola PCR DNA pripravená ako dva fragmenty, ktoré boli potom spojené dokopy v charakteristickom mieste BsmI. Oligonukleotidy 23S-21 a 238-24 (ukázané dole) boli použité na to, aby bol pripravený produkt, ktorý bol potom rozrezaný s BsmI a s BamHI a potom bol izolovaný výťažok 311 párov báz fragmentu KGF. Tieto dva fragmenty DNA, ktoré sú ligované dokopy, tvoria gén pre prirodzene sa vyskytujúci KGF, ako je ukázané na obrázku 9.
Aby bola získaná kódujúca sekvencia pre požadovaný analóg (Gly116) KGF, bolo nevyhnutné substituovať glycínový kodón histidínovým kodónom His116 v géne KGF. To bolo dosiahnuté použitím PCR prekrývajúcich sa oligonukleotidov mutagenézou s oligonukleotidmi 315-17 a 315-18, kúdujúcimi sekvenciu DNA KGF, ktorá zodpovedá oblasti His116 s vhodnými zmenami párových báz, aby bol kódovaný analóg (Gly116) KGF. Matrica DNA KGF pre PCR bola rovnaká, ako je ukázané na obrázku 9, okrem toho, že bola sekvencia DNA medzi miestami KpnI a EcoRI nahradená chemicky syntetizovanou DNA, ako je ukázané na obrázku 10. Akékoľvek vyhovujúce oligonukleotidy zodpovedajúce oblastiam KGF DNA 5’- a 3’- miestam riadených mutačnou zmenou, ako napríklad oligonukleotidy 23Š-22 a poskytli vonkajšie priméry Fraement DNA EcoRI a BamHI.
23Š-24, by mohli byť'' použité. aby pre prekrývajúce sa mutagenézy PCR. ktorý obsahoval kódujúcu, sekvenciu
I pre analóg (Gly116) KGF, bol potom ligovaný do predtým popísaného expresného plazmidu pCFMI156 už s obsahom génu KG tak, aby nahradil zodpovedajúcu oblasť génu KGF oblasťou kódujúcej sekvencie, ktorá obsahovala nevyhnutné zmeny pre kódovanie analógu (Gly116) KGF, ako je ukázané na obrázku 10. Ligovaná DNA bola potom transformovaná do buniek FM5 (ATCC# 53911) a kolónie, ktoré obsahovali analógový plazmid pCFM1156 (Gly116) boli izolované. Analógový mutant KGF FM5/pCFM1156 KGF (Gly116) bol potom fermentovaný a bunková pasta bola zozbieraná použitím štandardných techník.
oligo 233-21 oligo 233-22 oligo 238-24 oligo.. 315-17 oligo 315-18 ' - ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA - 3' ' - ACÄCATATGTGCAATGACATGÄCTCCA · 3 '
5' - ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA - 3 ' 5 ' - GGAAÄÄCGGTTACAACÄCATATGCA - 3 ' ' - GTGTTGTAACCGTTTTCCAGAATTAG - 3 '
Čistenie analógu (Gly116) KGF
Bunky obsahujúce analóg (Gly116) KGF z fermentácie popísanej vyššie, boli najprv rozbité pomocou suspendovania 665 g bunkovej pasty E. coli v cca 4 litroch 20 mM fosfátu sodného, pH 6,S, 0,2 M NaCl a potom bola suspenzia prepasírovaná cez homogenizér Gaulin pri 9 000 psi. Suspenzia bola ďalej centri fugovaná na rotore Beckman JA-10 (Beckman Instruments, Fullerton, California) pri 10 000 rpm, počas 30 minút, pri 4 °C.
Iónovymieňačová chromatografia bola uskutočnená pomocou využitia supernatantu z centrifugovanej suspenzie jeho nanesením na kolónu S-Sepharose(R1 Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Sweden, 5 x 23 cm, 450 ml celkový objem, s ekvi1ibrovaním 20 mM fosfátom sodným, pH 7,5, 0,4 M NaCl pri prietoku 25 ml/min. Kolóna bola potom premytá dvoma litrami 20 mM fosfátu sodného, pH 7,5, 0,4 M NaCl a analóg (Gly116) KGF bol eluovaný s lineárnym gradientom od
0,4 do 0,6 M NaČl v 20 mM fosfáte sodnom, pH17,5. Celkový gradientový objem bol sedem litrov (asi šestnásťkrát použitý objem kolónou). Frakcie obsahujúce KGF boli zhromaždené a skoncentrované asi -dvadsaťnásobne cez membránu YM(R>-10 (Amicon) v 400 ml miešanej komôrke.
skoncentrovaného iónovými eňačovej
Rozdeľovacia chromatografia size exclusion chromatography (SEC) bola uskutočnená použitím polovičného objemu KGF (celkový objem je 80 ml) získaného z chromatografie na kolóne Sephadex<R> G-75 (Pharmacia, 4,4 x 85 cm, celkový objem 1 300 ml) ekvi1ibrovanej s 20 mM fosfátom sodným, pH 6,8, 0,5 M NaCI a vyvolaním tejto kolóny týmto pufrom. Proces bol potom opakovaný s druhou polovicou skoncentrovaného prípravku KGF.
Druhá iónovýmieňačová chromatografická procedúra bola potom uskutočnená pomocou prvých zhromaždených frakcií SEC, ktoré zodpovedali monomérnej forme analógu (Gly116) KGF a ďalej boli zhromaždené frakcie rozriedené piatimi objemami 20 mM fosfátu sodného, pH 6,8, 0,2 M NaCI a zriedené frakcie boli nanesené na kolónu S-Sepharose<R> Fast Flow (Pharmacia, 5 x 23 cm, 450 celkový objem) s ekvilibráciou s 20 mM fosfátom sodným, pH 6,8, 0,4 M NaCI. Táto kolóna bola potom premytá asi jeden a pol litrom 20 mM fosfátu sodného, pH 6,S, 0,4 M NaCI. Čistený analóg (Gly116) KGF bol eluovaný s lineárnym
NaCI v 20 mM fosfáte sodnom, pH 6,S.
bol desať litrov (asi dvadsaťkrát použitý objem kolónou) ktoré obsahovali analóg (Gly116) KGF, ako bolo zistené SDS-PAGE, boli zhromaždené a obsah KGF bol stanovený pomocou absorpcie UV.
gradientom od 0,4 do 0,6 M Celkový gradientový objem Vzorky, pomocou
Príklad 9: spektroskopia analógu KGF
Spektroskopia fourier-transform Infrared (FTIR)
Vzorky boli pripravené pre infračervenú spektroskopiu pomocou diafiltrovaných proteínových roztokov v 20 mM fosfáte sodnom, 0,5 M NaCl, pD = 6,8 pufra pripraveného v bž O; (Sigma, 99,9%+ izotopická čistota,. Hodnoty pD boli stanovené pomocou hodnoty 0.45 odčítanej zo sklenenej elektródy pH metra (podľa Covington a kol.,· 1968, Anál. Chem., 40: 700-706). Konečná proteínová koncentrácia bola 30 mg/ml. Proteínové roztoky boli umiestené v komôrkach IR spolu s CaFa páskami a 100 / uM teflónovými medzerníkmi.
Pre štruktúrne charakteristiky bolo kodifikovaných 256 obojstranných interferónov a transformovaných po aplikácii nezvratnej funkcie Happ-genzel použitím systému S00 FTIR. Výsledky boli odhadnuté na 2 cm-1. Odvodené spektrum a fourier self-deconvolution (samonarovnanie, boli uskutočnené podľa (Susi a Byler, 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm., 115: 391—397) použitím softvéru 'Nicolet. Bodová krivka bola uskutočnená použitím programu Peakfit™ (Jandel Scientific Co.). Infračervené spektrum KGF ukazuje na silnú podobnosť k týmto analógom bFGF a aFGF, ktoré indikujú podobné štruktúry pre tieto tri proteíny.
Štúdie teplotnej stability prirodzene sa vyskytujúceho KGF a analógu (Gly116) KGF boli uskutočnené pomocou umiestenia komôrok IR v elektricky vyhrievanom plášti kontrolovanom automatickým kontrolórom teploty (Specac Inc., Fairfield, Connecticut). Teplota bola zvýšená pri rýchlosti 0,5 °C/min. IR spektrum bolo vybrané pri 8 cm-1 rozlišovacej schopnosti.
Pri teplotách pod 50 °C sa spektrá javili s malými zmenami od spektier pri teplote okolia. Pri teplotách nad 50 °C spektrá naznačovali, že prirodzene sa vyskytujúci KGF vydrží pri tomto stupni termotropický prechod. Piky blízko 1616 a 16S5 cm-1 boli v spektre evidentné a pri 65 °C tieto piky dominovali s príslušnou stratou intenzity pri 1643 cm-1. Tento spektrálny prechod predstavuje kooperatívne vyrovnanie záhybu prirodzene sa vyskytujúceho KGF. Zaznamenané termálne prechody neboli vratné najpravdepodobnejšie vzhľadom na agregáciu vyrovnaných proteínov. Teplota topenia Tra pre prirodzene sa vyskytujúci KGF bola odhadnutá na 60 °C, zatiaľ čo Tm pre analóg (Gly,116) KGF bola odhadnutá na 65 °C. 0 5 ÓC väčšia teplota, ako pre prirodzene sa vyskytujúci KGF naznačuje, že analóg (Gly116) KGF má vyššiu relatívnu termálnu stabilitu než prirodzene sa vyskytujúci KGF.
Ultrafialová spektroskopia
Termálna denaturácia obidvoch analógov, (Gly116) KGF a prirodzene sa vyskytujúceho KGF, bola študovaná použitím spektrofotometra Response II UV
Massachusetts) s kontrolórom teploty (Gi1ford, Peltier a programom, mixované konečnej
KGF roztoky v 20 mM fosfáte sodnom, pH
Medf ield, termálnym 6,8, boli s S M guanidínom HCI alebo 20 mM fosfátom sodným do koncentrácie proteínu asi 0,5 mg/ml a do konečnej koncentrácie guanfdínu HCI od 0 do 2
M. Termálna prehľadná a vlnová dĺžka bola rýchlosť bola zobrazená pri 0,5 °C/min monitorovaná pri 260 nm. Prídavok malého množstva guanidínu HCI eliminoval zrážanie proteínov počas termálnej denaturácie, ale nezaistil, aby bola denaturácia vratná porovnávané počas reakcie súčasne.
tohoto dôvodu boli vzorky
Experimenty termálnej denaturácie neboli úspešné v prítomnosti od 0 do 1 na to, že pri zahriatí vznikol zákal. Avšak vyvinutý zákal pri nižšej teplote pre prirodzene sa vyskytujúci KGF než pre analóg (Gly116) KGF prezrádza, že predtým uvedený proteín denaturuje a následkom toho agreguje pri nižšej teplote. V 1,5 M guanidíne HCI je absorbancia pri 2S7 nm znížená, hned ako proteín denaturuje a potom zasa zvýšená vzhľadom na agregáciu. Teploty, pri ktorých sa absorbancie znižujú a zvyšujú, sa vyskytovali v tomto poradí 25 a Prídavok 2 M guanidínu HCI viedol prirodzene sa teplote 25 °C.
k úplnej denaturácii pre proteíny, prebehlo okolo teploty 37 °C pre KGF a blízko teploty 46 °C pre analóg použitím UV spektroskopie M guanidínu HCI vzhľadom °C pre analóg (Gly116) KGF. k čiastočnej denaturácii pre obidva analógy vyskytujúceho KGF a analóg (Gly116) KGF pri Zvýšenie teploty viedlo zakončenie denaturácie prirodzene sa vyskytujúci (Gly116 ) KGF.
Tieto výsledky indikujú, že analóg (Gly116) KGF je viac termálne stabilný pri príslušných stupňoch pri teplote topenia a že sú tieto výsledky v súhlase s infračervenou analýzou, ktorá naznačuje zvýšenie približne o 5 °C pri Tm analógu (Gly116) KGF vzhľadom na prirodzene sa vyskytujúci KGF.
Príklad 10: mitogenetická aktivita analógu (Gly116) KGF
Mitogenetická aktivita analógu (Gly116) KGF bola analyzovaná použitím mitogenetických skúšok (Rubin a kol., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 86: 802-S06). Analóg (Gly116) KGF demonštruje menšie začlenenie 3H-tymidínu, než bolo pozorované pri prirodzene sa vyskytujúcom KGF, čo indikuje nižšiu špecifickú aktivitu pre analóg (Gly116) KGF\
Popis obrázkov na priložených výkresoch
Obrázok 1 ukazuje nukleovú kyselinu a aminokyselinové sekvencie rekombinantného hovädzieho analógu (Ala47, Gly93) aFGF.
Obrázok 2 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu rekombinantného ľudského analógu (Gly93) aFGF.
Obrázok 3 demonštruje elučné profily pre hovädzie analógy (Ala47) a (Ala47, Gly93) aFGF použitím hydrofóbnej interakčnej chromatografi e
Obrázky 4A a 4B ukazujú cirkulárne dichroické spektrum pre hovädzie analógy (Ala47) a (Ala47, Gly93) aFGF.
Obrázok 5 ukazuje druhé odvodené spektrum FTIR hovädzích analógov (Ala47) a (Ala47, Gly93) aFGF v amidovej I’ oblasti (C=0 stretch v deuterovaných proteínoch).
Obrázok 6 je grafická ukážka diagramu logaritmu koncentrácie hovädzích analógov (Ala47) a (Ala47, Gly93) aFGF a ľudského analógu (Ser70, Serss) bFGF proti percentu maximálnej stimulácie.
Obrázok 7 je grafické znázornenie straty aktivity nastaveného času hovädzích analógov (Ala47) a (Ala47, Gly93) aFGF pri neprítomnosti heparínu v porovnaní s ľudským (Ser70, Ser88) bFGF.
Obrázok S ukazuje štruktúru hovädzieho analógu (Ala47, Gly93) aFGF podľa predloženého vynálezu, ako je stanovené pomocou rontgenovej kryštalografie.
Obrázok 9 ukazuje nukleovú kyselinu a aminokyselinové sekvencie prirodzene sa vyskytujúceho KGF.
Obrázok 10 ukazuje nukleovú kyselinu a aminokyselinové sekvencie rekombinantného analógu (Gly116) KGF.
Zoznam sekvencii (1) Všeobecná informácia:
(i) prihlasovateľ: Amgen Inc.
(ii) názov vynálezu: Analógy rastového faktora kyslého fibroblastu, ktoré majú zvýšenú stabilitu a biologickú aktivitu ( iii ) (iv) (v) (vi) počet sekvencii: 17 korešpondenčná adresa:
(A) adresa: Amgen Inc (B) ulica: 1840 DeHavillnad Drive (C) mesto: Thousand Oaks (D) štát: Kalifornia (E) krajina: USA (F) poštovný kód: 91320-1789 počítačovo čítacia forma:
(A) typ média: flopydisk (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) softvér: Patentln Release #1.0 Version #1.25 údaje o prihláške:
(A) číslo prihlášky:
(B) deň prihlásenia:
(C) triedenie:
(2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 1: (i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 463 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
I
I ι
TGTAGAAAAA ACCAAGGAGG TAATAAATAA tgttcaacct GCCGCTGGGT AACTACAAAA 60
AACCTAAGCT TCTGTACTGC TCTAACGGCG GTTACTTCCT GCGCATTCTC CCGGATGGCA 120
CTGTAGACGG TACCAAAGAT CGTTCCGACC AGCACATTCA GCTCCAGCTC GCTGCAGAAT 130
CTATCGGTGA AGTTTACATC AAATCCACCG AAACTGGTCA GTTCCTGGCT ATGGATACTG 240
ATGGTCTCCT CTACGGTTCT CAGACTCCGA ACGAAGAGTG CGTGTTCCTC GAGCGTCTGG 300
AAGAAAACGG TTACAACACC TACATCTCCA AAAAACACGC TGAAAAACAC TGGTTCGTTG . 360
GTCTGAAAAA AAACGGTCGT f TCTAAACTGG GTCCGCGCAC TCACTTCGGT CAGAAAGCTA 420
TCCTGTTCCT CCCTCTGCCG gtttcttccg ATTAATAGGA TCC 453
informácie pre sekvenciu SEQ ID NO
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 141 aminokyselín
(B) typ: aminokyselina
(C) reťazec: neznámy
(D) topológia: neznáma
(ii) typ molekuly: proteín (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 2:
Met Phe Asn Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Cys Ser Asn Gly Gly Tyr Phe Leu Arg íle Leu Pro Asp Gly Thr Val
20 25 30
Asp Gly Thr Lys Asp Arg Ser Asp Gin His íle Gin Leu Gin Leu Ala
35 .40 45
Ala Glu Ser íle Gly Glu Val Tyr íle Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin
55 60
Phe Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro
65 ·· 70 75 80
Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn
85 90 95
Thr Tyr íle Ser Lys Lys His Ala Glu Lys His Trp Phe Val Gly Leu
100 105 110
Lys Lys Asn Gly Arg Ser Lys Leu Gly Pro Arg Thr His Phe Gly Gin
115. . 120 125
Lys Ala íle Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp
130 135 140
(2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: (i) charakteristiky sekvencie: (A) dĺžka: 155 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: proteín (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 3: 3 :
Met Ala Glu Gly Glu íle Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe
1 5 10 15
Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Ala
20 25 3 0
Asn Gly Gly His Phe Leu Arg íle Leu Pro Asp Gly Thr Val· Asp Gly
35 40 4 5
Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His íle Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu
50 55 60
Ser Val i • Gly Glu Val Tyr íle Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu
65 70 75 30
Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu
3
90 95
Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Thr
100 105 110 íle Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys
115 120 125
Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala 130 135 140 íle Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp
145 150 155 (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 502 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 4:
TATGTGCAAT .GACATGACTC CAC-AGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA 60
x»· GCGACACACA AGÄAGTTATG ATTACATGGA AGC-AGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTC 120
TGTCGAACAC AGTGGTACCT GAGC-ATCGAT AAAAGAGGCA AAGTAAAAGG CACCCAAGAG 180
ATC-AAGAATA ATTACAATAT CATGGAAATC AGC-ACAGTGG CAGTTC-C-AAT TGTGC-CAATC 240
AAAGGGGTGG AAAGTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAC-G AAGGAAAACT CTATC-CAAAG 300
AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA 360
TATGCATCAG CTAAATGGAC ACACAACGGA GGGGAAATGT TTC-TTGCCTT AAATCAAAAG 420
GGGATTCCTG TAAGAGC-AAA AAAÄACGAAG AAAGAACAAA AAACAGCCCA CTTTCTTCCT 480
ATGGCAATAA CTTAATAGGA TC
502 (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 497 párov báz (B) typr nukleová kyselina (C, reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristické črty:
(A) meno/kľúč: (B) umiestenie: doplnkové (1..497) (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 5:
. CTATTAAGTT J*. ' · ATTGCCATAG GAAGAAAGTG GGCTGTTTTT TGTTCTTTCT TCGTTTTTTT 60
; TCCTCTTACA GGAATCCCCT TTTGATTTAA GGCAACAAAC ATTTCCCCTC CGTTGTGTGT 120
CCATTTAGCT GATGCATATG TGTTGTAATG GTTTTCCAGA ATTÄGTTCTT TGAAGTTACA 130
ATCTTCATTG CATTCTTTCT TTGCÄTAGAG TTTTCCTTCC TTGTTCATTG CAAGATAGAA 240
TTCACTTTCC A,CCCCTTTGA TTGCCACAAT TCCAACTGCC ACTC-TCCTGA TTTCCATGAT 300
ATTGTAATTA yŕcTTCATCT 1 CTTGGGTCCC TTTTACTTTG CCTCTTTľAT CGATCCTCAG 360
GTACCACTGT GTTCGACAGA AGAGTCTTCT CÄCTCTTATA TCCCCTCCTT CCATGTAATC 420
ATAACTTCTT GTGTGTCGCT CAC-GGCTGGA ACAGTTCACA TTTGTAGCCA TTTGCTCTGG 430
AGTCATGTCA TTGCACA 497 (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 164 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: proteín
(xi) popis sekvencie : SEQ ID NO: 6:
Met Čys « Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Cys
1 5 10 15
Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly
Asp íle Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg
35 40 45
íle Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn
50 55 6 0
Tyr Asn íle Met Glu íle Arg Thr Val Ala Val Gly íle Val Ala íle
65' 70 75 80
Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys
.85 90 95
Leu Tyr Ala Lys Lys. Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu
100 105. 110
íle Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His
115 120 125
Asn Gly Gly r Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly íle Pro Val
130 r 135 140
Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala H i s Dno Leu ?ro
14 5 150 155 1 £ f) J_ v
Met Ala íle Thr (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 7: (i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 503 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 7:
TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA 60
GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTT 120
CTGTCGAACA CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGÄ 180
GATGAAAAAC AACTACAATA T7A7GGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGG7A TCGTTGCÄAT 240
CAAAGGTGTT GAATCTGAAT 7C7ATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA 300
GAAAGAATGC AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAÄCTAATT CTGGAAAACG GTTACAACAC 36 0
A7ATGCATCA GCTAAA7GGA CACACAACGG AGGGGAAATG TTTGTTGCCT TAAA7CAAAA 420
GGGGATTCCT, t TATGGCAATÄ GTAAGAGGAA AAAAAACGAA GAAAGAACAA AAAACAGCCC ACTTTCTTCC 430
ACTTAATAGG A7C 503
(2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 8:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 497 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristické črty:
(A) meno/kľúč: (B) umiestenie: doplnkové (1..497) (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: S:
CTATTAAGTT ATTGCCATAG C-AAGAAAGTG C-GCTGTTTTT TGTTCTTTCT TCGTTTTTTT 6 0 TCCTCTTACA. GGAATCCCCT TTTC-ATTTA.Ä GGCTTCAAAC ATTTCCCCTG CGTTGTGTGT 120 CCATTľAGCT GATGCATATG TGTTGTAACC GTT7TCCAGA ATTAGTTCTT TGAAGTľACA ISO ATCTTCATTG CATTCTTTCT TTGCATAGAG TTTTCCTTCC TTCTTCATTG CAAGATAGAA 24 0 TTCAGATTCA ACACCTTTGA TTGCAACGAT ACCAACAC-CA ACAGTACGGA TTTCCATAAT 3CO ATTGTAGTTG TTTTTCATCT CTTGGGTGCC CTTGACTTTG CCGCGTTTGT CGATACGCAG 350 GTACCACTGT GTTCGACAGA AC-AGTCTTCT CACTCTTATA TCCCCTCCTT CCATGTAATC 420 ATAACTTCTT GTGTGTCGCT CAGGGCTGGA ACAG7TCACA TTTGTAGCCA TTTGCTC7GG 480 AGTCATGTCA TTGCACA 497 (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 9: (i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 164 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: proteín (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 9:
Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu ,Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Cys
1 5 10 15
Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp . Ty r Met Glu Gly Gly
20 25 . 30
Asp.íle Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg
35 . ' 40 45
íle Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn
50 55 50
Tyr Asn íle Met Glu íle Arg Thr Val Ala Val Gly íle Val Ala íle
δ 5 70 75 30
Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys
1«' ľ 35 90 95
Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu
100 105 110
íle Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Tro Thr His
115 120 125
Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly íle Pro Val
130 135 140
Arg Gly^-Lys Lys Trh Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala. His Phe Leu Pro
1 D 150 155 160
(2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 10: (i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 55 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 10:
CC-ATTTGÄTT CTAGAAGGA
TGGTTAACGC GTTGGAATTC GC-TAC
S (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 11: ' (i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 49 párov báz _ (B) typ:· nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 11:
ČGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTÄŤT CCTCCTTCTA CAATCAAAT (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 12:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 párov báz (B) typ :* nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 12:
.GAAGAAAACC ATTACAACAC 20 (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 13:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 26 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 13:
ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA 26 (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 14:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 27 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 14:
ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27 (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 15: (i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 31 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekTencie: SEQ ID NO: 15:
ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A 31 (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 16: (i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 25 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 16:
GGAAAACGGT:,ŤACAACÁCÁŤ ATGCA 25 (2) informácie pre sekvenciu SEQ ID NO: 17: (i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 26 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazec: neznámy (D) topológia: neznáma (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 17:
GTGTTGTAAC CGTTTTCCAG AA7TAG

Claims (16)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Analóg prirodzene sa vyskytujúceho proteínu z rodiny FGF, kde aspoň jedna aminokyselina v sekvencii tvoriacej slučku -Asn-His-Tyr-Asn-Thr- v uvedenom proteíne je nahradená pomocou zvyšku rôznych aminokyselín, ktoré majú vyšší potenciál tvorby slučky.
  2. 2. Analóg podľa nároku 1, kde uvedený prirodzene sa vyskytujúci proteín je KGF.
  3. 3. Analóg podľa nároku 2., kde uvedenou nahradenou aminokyselinou je aminokyselina 116.
  4. 4. Analóg podľa nároku 3, kde uvedená aminokyselina, ktorá má vyšší potenciál tvorby slučky, je vybraná zo skupiny obsahujúcej glycín, prolín, tyrozín, kyselinu asparágovú, asparagín, serín, kyselinu glutámovú, treonín, lyzín, glutamín, arginín, fenylalanín a tryptofán.
  5. 5. Analóg podľa nároku 4, kde uvedenou aminokyselinou, ktorá má vyšší potenciál tvorby slučky, je glycín.
  6. 6. Analóg podľa nároku 5, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 10.
  7. 7. Analóg podľa nároku 6, v ktorom aspoň jeden terminálny aminokyselinový zvyšok je deletovaný, aj keď si uvedený analóg v podstate zachováva zvýšenú biologickú aktivitu.
  8. 8. Analóg podľa nároku 7, v ktorom aspoň jeden cysteínový zvyšok uvedeného prirodzene sa vyskytujúceho proteínu je nahradený pomocou zvyšku neutrálnej aminokyseliny.
  9. 9. DNA sekvencia, ktorá kóduje analóg podľa nároku 1 pre prokaryotické alebo eukaryotické expresie. '
  10. 10. DNA sekvencie podľa nároku 10, kde uvedeným analógom je analóg podľa nároku- 6.
  11. 11. Farmaceutické kompozície obsahujúce terapeuticky účinné množstvo analógu podľa nároku 1 a jeden alebo viac farmaceutický vhodných prísad.
  12. 12. Farmaceutické kompozície podľa nároku 11, kde uvedený analóg je analóg podľa nároku 6.
  13. 13. Spôsob liečenia hlbokých rán, ktorý zahrnuje zavádzanie terapeuticky účinného množstva analógu podľa nároku 1 do týchto rán.
  14. 14. Spôsob podľa nároku 13, kde uvedeným analógom je analóg podľa nároku 6.
  15. 15. Analóg podľa nároku 5, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1.
  16. 16. Analóg podľa nároku 5, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 2.
SK432-97A 1994-10-13 1995-10-12 Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity SK43297A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32347394A 1994-10-13 1994-10-13
PCT/US1995/012907 WO1996022369A1 (en) 1994-10-13 1995-10-12 Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK43297A3 true SK43297A3 (en) 1998-01-14

Family

ID=23259345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK432-97A SK43297A3 (en) 1994-10-13 1995-10-12 Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0786000A1 (sk)
JP (1) JPH10507929A (sk)
CN (1) CN1169158A (sk)
AU (1) AU3828195A (sk)
CA (1) CA2201944C (sk)
CZ (1) CZ98097A3 (sk)
HU (1) HUT77746A (sk)
NO (1) NO971508L (sk)
SK (1) SK43297A3 (sk)
WO (1) WO1996022369A1 (sk)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0785949B1 (en) * 1994-10-13 2003-05-02 Amgen Inc. Method for purifying keratinocyte growth factors
US6693077B1 (en) 1995-02-14 2004-02-17 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US6077692A (en) 1995-02-14 2000-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US7232667B2 (en) 1995-02-14 2007-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides
US6743422B1 (en) 1996-10-15 2004-06-01 Amgen, Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
WO1998039436A2 (en) * 1997-03-03 1998-09-11 Eisai Co., Ltd. Fibroblast growth factor mutein compositions and methods of use therefor
US6869927B1 (en) 1997-12-22 2005-03-22 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
US6238888B1 (en) 1997-12-22 2001-05-29 Human Genone Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
US6274712B1 (en) 1997-12-23 2001-08-14 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamute 89, aspartate 101 or leucine 137
IL139380A0 (en) * 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
TWI634898B (zh) * 2013-10-07 2018-09-11 雅祥生技醫藥股份有限公司 經修飾之人類酸性纖維母細胞生長因子及其組合物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2098484A1 (en) * 1990-12-18 1992-06-19 Tsutomu Arakawa Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity

Also Published As

Publication number Publication date
HUT77746A (hu) 1998-07-28
CA2201944C (en) 2002-12-31
NO971508L (no) 1997-06-13
WO1996022369A1 (en) 1996-07-25
CN1169158A (zh) 1997-12-31
JPH10507929A (ja) 1998-08-04
AU3828195A (en) 1996-08-07
CZ98097A3 (en) 1997-12-17
EP0786000A1 (en) 1997-07-30
NO971508D0 (no) 1997-04-03
CA2201944A1 (en) 1996-07-25
MX9702475A (es) 1997-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6737404B2 (en) Methods of using analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamate 89, aspartate 101 or leucine 137
US10000540B2 (en) Fibroblast growth factor mutants having improved functional half-life and methods of their use
Fox et al. Production, biological activity, and structure of recombinant basic fibroblast growth factor and an analog with cysteine replaced by serine.
Zakrzewska et al. Highly stable mutants of human fibroblast growth factor-1 exhibit prolonged biological action
JP2006508049A (ja) 増殖因子βタンパク質を形質転換するための可溶化賦形剤としてのペプチド
US5223483A (en) Cysteine-modified acidic fibroblast growth factor
AU620925B2 (en) New derivatives of human/bovine basic fibroblast growth factor
SK43297A3 (en) Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity
Arakawa et al. Production and characterization of an analog of acidic fibroblast growth factor with enhanced stability and biological activity
EP1248844B1 (en) Analogs of human basic fibroblast growth factor
AU663067B2 (en) Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity
IE65360B1 (en) Mutant acidic fibroblast growth factor
WO1998039436A2 (en) Fibroblast growth factor mutein compositions and methods of use therefor
IE920054A1 (en) HUMAN bFGF DERIVATIVES, THEIR ANALOGS AND PROCESS FOR THEIR¹PRODUCTION
JP3127246B2 (ja) ポリペプチド，ｄｎａおよびその用途
CA2079291A1 (en) Activities of heparin binding neurite-outgrowth promoting factor
MXPA97002475A (en) Analogues of the fibroblast acid growth factor that have stability and biological acticity improves