CZ98097A3

CZ98097A3 - Acid fibroblast growth factor analogs exhibiting increased stability and biological activity

Info

Publication number: CZ98097A3
Application number: CZ97980A
Authority: CZ
Inventors: Tsutomu Arakawa; Gary Mchael Fox
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1997-12-17
Also published as: AU3828195A; SK43297A3; CA2201944C; HUT77746A; CA2201944A1; WO1996022369A1; NO971508D0; MX9702475A; NO971508L; JPH10507929A; CN1169158A; EP0786000A1

Description

/ G’^< í

o		o
o? _s•-H .<	^c 1	co		1 θ'.
CS;	I	><	o o	Ol
O cr. -o < Cti	1	co N	o	J X
nasiec	3u j e	po	poskoz

o<

tkáně, například po zranění nebo popálení je zprostředkován množstvím proteinových faktorů, které se někdy přiřazují k růstovým faktorům měkké tkáně. Tyto faktory jsou vyžadovány pro růst a diferenciaci nových buněk při obnovení porušené tkáně. Uvnitř skupiny růstových faktorů měkké tkáně je zahrnuta růstových faktorů měkké tkáně bílkovinná rodina (FGFs). FGFs ohernotaktické jsou mitogenické 'chemotactic pro mi togenic r užne >uňky ípitheliálního, mezenchymálního a nervového původu.

Kromě toho jsou FGFs angiogenní angiogenic, což znamená schopnost stimulování tvorby krevních cév. Členy rodiny FGFs zahrnují kyselý FGF, zásaditý FGF, KGF, Int-2, HST, FGF-5 a FGF-6.

Dosavadní stav techniky

Kyselý FGF (aFGF) a zásaditý FGF (bFGF) jsou považovány za dva původní originál členy rodiny FGF. Oba aFGF a bFGF jsou zřejmě odvozeny od stejného genetického předchůdce, kde obě molekuly mají přibližně 55% sekvenční identitu mimo stejnou strukturu intron/exon. Kyselý aFGF a zásaditý bFGF jsou také známé tím, že vážou stejný receptor, ačkoliv existence specifických a FGF a bFGF receptorů nebyla vyloučena. Bylo nalezeno několik forem molekulární váhy aFGF a bFGF v rozdílných tkáních. Avšak Southern blotting experimenty potvrzují, že je pouze jeden gen pro každý aFGF a bFGF ε odlišnostmi mezi těmito molekulami, které jsou pravděpodobně způsobeny posttranslační úpravou. Oba dva kyselý a zásaditý FGF jsou mitogeny pro široký výběr buněčných typů mesodermálního a neuroektodermálního původu a jsou schopné vyvolat angiogenesi v obou prostředích v in vitro a in vivo (viz např,,

Gospodarowicz a kol., 1979, Exp. Eye Res. , 28: 501 - 514).

Rozsah biologických aktivit těchto dvou tříd je téměř identický, ačkoliv bFGF je asi desetkrát více silnější než aFGF ve většině systémech biozkoušek.

KGF představuje silnou mitogenickou aktivitu pro různé buňky a váže receptory k buněčnému povrchu na Balb/MK keratinocyty, ke kterým se mohou také vázat aFGF a bFGF (Bottaro a kol., 1990, J. Biol. Chem., 265.: 1276712770). Avšak KGF je odlišný od známých FGFs (např. aFGF a bFGF), protože není rnitogenický pro fibroblasty nebo endotheliální buňky (viz Rubín a kol., 1989, Proč, Kati. Acad. Sci., USA, 85: 802-806). KGF má také rozdílné receptory na NIH/3T3 fibroblastech z receptorů pro aFGF a bFGF, které nereagují s KGF (viz Bottaro a kol., uvedeno výše).

Společným charakteristickým znakem aFGF a bFGF je přirozená tendence těchto faktorů vázat se těsně k heparinu. Afinita aFGF k heparinu se zdá být slabší než pro bFGF, kde aFGF má aniontový izoelektrický bod (Thomas a kol., 1984, Proč. Nat, Acad. Sci., USA, 82: 6409-6413). Ojedinělé vazebné vlastnosti heparinu k aFGF a bFGF obrovsky usnadnily čištění těchto faktorů.

Zjištění, že FGFs má silnou afinitu pro imobi1izovaný heparin, také popohnalo výzkum vzhledem k regulátorové roli heparinu-podobných molekul v prostředí in vivo biologie FGFs. Ačkoliv byly dosud stanoveny úplné spektra funkcí pro heparin, je známé že heparin může regulovat funkci FGF několika způsoby (Lobb, 1983, Eur. J. Clin. Invest., 13: 321 - 326). Například heparinu - podobné molekuly mohou hrát řídící úlohu ve funkci FGF, která zahrnuje aktivaci nebo zesílení aFGFs (Uhllrich a kol., 1936, Biochem.

Biophys. Res. Comm., 137: 1205-1213).

Neexistuje však přímá souvislost mezi afinitou FGF pro imobilizovaný heparin a schopností FGF být zesílený pomocí rozpustného heparinu. Z tohoto důvodu se zdá být zesilující síla heparinu selektivní pro aFGF. Například (Uhllrich a kol., 1986, uvedeno výše) nalezl, že stupen zesílení Čistého aFGF je asi desetkrát větší než pro čistý bFGF, který zvyšuje sílu pro aFGF na přibližně stejnou úroveň jakou má bFGF. Avšak v přítomnosti fetálního hovězího séra byl nalezen významně sníženy zesilující efekt heparinu (Uhllrich a kol.,1936, viz výše uvedeno).

Použití FGF proteinů se zdá být efektivní v podpoře léčení tkání vystavených poranění. Jedinečné angiogenní vlastnosti proteinů FGF činí tyto faktory zejména vhodnými pro léčení hlubokých ran. Přirozené FGF proteiny byly uváděny jako užitečné v léčení infarktu myokardu (US patenty č. 4 296 100 a 4 378 347). Kromě toho bylo nalezeno u lidského bFGF, že zvyšuje schopnost nervových buněk přežít a prodloužení neuritů ve fetálních neuronech krysího hippocampu, což potvrzuje že tento faktor může být užitečný v léčení degenerativních neurologických poruch jako například Alzheimerova a Parkinsonova nemoc (Wallicke a kol.,1986, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 83: 3012 - 3016) .

Hlavním kamenem úrazu pro efektivní využití aFGF v terapeutických aplikacích se zdá být ve vztahu k jeho významně snížené biologické aktivitě ve srovnání s bFGF. Ačkoliv studie s heparinem předpokládají, že zjištěný rozdíl v síle mezi aFGF a bFGF může být podstatně zmenšený pomocí heparinu, který zvyšuje aktivitu aFGF na úroveň srovnateiou s bFGF, použití heparinu ve farmaceutických přípravcích však není vždy vhodné. Vzhledem k tomu je nutné poznamenat, že heparin vysoce sulfatovaný gLykosaminoglykan heterogenní - struktury je známý jako antikoagulant, který urychluje průměrnou rychlost, při které antithrombin III inaktivuje proteasy horneostasy (Jacques, 1980, Pharmacol Rev,

31: 99-166). Není známé jestli může být použití heparinu ve farmaceutických přípravcích škodlivé pro léčení hlubokých ran, kde některý stupeň koagulace může být požadován, aby bylo dosáhnuto správného léčení.

Krorně toho mohou vzniknout praktické případy tam, kde je heparin začleněn do farmaceutického přípravku pro léčení hlubokých ran. Koncerny dodání léčiv zahrnují kontrolování kompozice farmaceutického přípravku (obsahující kombinaci aFGF a heparinu) na vstupu do těla pacienta. Avšak negativní účinek fetálního hovězího séra na zesilující efekt heparinu na aFGF (zjištěno Uhllrichem a kol.)potvrzuje, že kterákoliv výhoda získaná začleněním heparinu do farmaceutického přípravku jako aktivujícího nebo zesilujícího faktoru pro aFGF, by mohla být úplně negována nebo ztracena jediným kontaktem, pokud bude reagovat vlastní sérum pacienta.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto předloženého vynálezu je poskytnout analog proteinu z rodiny FGF, která má zvýšenou stabilitu ve srovnání s přirozeně se vyskytující formou proteinu. Dalším předmětem tohoto předloženého vynálezu je poskytnout analog aFGF, který vykazuje zvýšenou stabilitu a biologickou aktivitu za nepřítomnosti nepař inu. A ještě dalším předmětem tohoto předloženého vynálezu je poskytnout aFGF analog pro trapeutieké použ i t í.

Předložený vynález poskytuje nové analogy proteinů FGF rodiny. Jedním z těchto analogů je aFGF, který je stabilnější a vykazuje větší biologickou aktivitu za nepřítemnosti heparinu než je tomu u přirozeně se vyskytujícího aFGF. Další takový analog je KGF analog, který má zvýšenou tepelnou stabilitu ve srovnání s přirozeně se vyskytujícím KGF. Zvýšená stabilita je dosáhnuta pomocí substituce alespoň jedné aminokyseliny, která má vyšší sílu tvorby smyčky loop-řorming pro zbytek aminokyseliny s nižší sílou tvorby smyčky v nebo na smyčce sekvence aminokyselin Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr přirozeně se vyskytujícího' proteinu. V případě aFGF se objevuje sekvence smyčky v prostoru aminokyselin od asi 92 do 96. V případě KGF se oblast smyčky objevuje v prostoru aminokyselin od asi 115 do 119. Preferovaný analog podle této přihlášky vynálezu obsahuje substituci aminokyseliny, která má vyšší potenciál tvorby smyčky pro histidinový zbytek v sekvenci smyčky.

Podle tohoto předloženého vynálezu jsou poskytnuty nové analogy rodiny FGF. Tyto analogy vykazují zlepšenou stabilitu ve srovnání s odpovídajícími přirozeně se vyskytujícími proteiny. V případě analogu aFGF podle předloženého vynálezu vykazuje tento analog zvýšenou stabilitu a biologickou aktivitu za nepřítomnosti heparinu. V případě analogu KGF podle předloženého vynálezu vykazuje tento analog zvýšenou tepelnou stabilitu. Analogy podle tohoto předloženého vynálezu mají alespoň jeden jiný aminokyselinový zbytek odlišný od odpovídajícího přirozeně se vyskytujícího proteinu v nebo na smyčce sekvence Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr nalezené v přirozeně se vyskytující formě. Pro případ aFGF se smyčka sekvence vyskytuje v prostoru aminokyselinových zbytků od asi 92 do 96 (založeno na číslování známé aminokyselinové sekvence pro hovězí aFGF jak ukazuje obázek 1). Pro případ KGF se smyčka sekvence vyskytuje v prostoru aminokyselinových zbytků od asi 115 do 119 jak ukazují obrázky 9 a 10. Různé aminokyseliny (na) jsou vybrány vzhledem k jejich vyššímu potenciálu tvorby smyčky za účelem stabilizace tohoto prostoru v analogu. Amynokyseliny, které mají relativně vysoký potenciál tvorby smyčky zahrnují glycin, prolin, tyrosin, asparagovou kyselinu, asparagin a serin (Leszcynski a kol., 1986, Science, 234: 849-855, 1986, relativní hodnoty potenciálu tvorby smyčky zjištěné na základě frekvence výskytu v strukturách smyček přirozeně se vyskytujících molekul). Výhodně může nahrazovat histidinový zbytek ve smyčce tvořené sekvencí i. jiná aminokyselina, která má vyšší potenciál tvorby smyčky. A ještě výhodněji může být histidinový zbytek ve smyčce tvořené sekvencí nahrazen glycinovým zbytkem.

K analogům předloženého vynálezu můžou být zahrnuty též adice, substituce a/nebo delece. Například analog může také výhodně obsahovat aminokyselinovou substituci pro nekonzervované histidinové zbytky (např. cysteinový zbytek v pozici 47 hovězí a FGF molekuly a cysteinový zbytek v pozici 16 lidské aFGF molekuly). Kromě toho, analogy podle předloženého vynálezu, které jsou exprimovány v hostujících buňkách E. colli, mohou obsahovat iniciační methioninový aminokyselinový zbytek (tj., v pozici -1 jak je ukázáno na obrázku 1). Další alternativní možností je, že jeden nebo více terminačních aminokyselinových zbytků může být deletován ze sekvence DNA, jak je známo odborníkům znalým stavu techniky, zatímco si v podstatě zachovává zvýšenou biologickou aktivitu, která odpovídá přirozeně se vyskytujícímu proteinu.

Jsou také poskytnuty DNA sekvence pro všechny analogy nebo část analogů podle tohoto předloženého vynálezu.

Takové sekvence mohou výhodně nahrnovat včlenění preferovaných kodonů pro expresi pomocí selektovaných hostitelských kmenů E. coli (E. coli expression codons), zajištění rozštěpených míst pomocí restrikčních endonukleasových enzymů a/nebo zajištění iniciačních, terminačních nebo intermediatorových sekvencí DNA, které umožňují konstrukci snadno exprlitovaných vektorů. Tyto nové DNA sekvence zahrnují sekvence, které jsou užitečné pro zajištění exprese analogů podle tohoto předloženého vynálezu a to v obou hostujících buňkách eukaryotických a prokaryotických (jako jsou např . E. coli) .

Více specifikovaně rnohou DNA sekvence podle tohoto vynálezu zahrnovat DNA sekvence vyznačené na obrázku 1, kde alespoň jeden kodon kódující aminokyselinový zbytek v oblasti od asi 92 aminokyseliny do asi 96 aminokyseliny je nahrazen pomocí kodonu, který kóduje jiný aminokyselinový zbytek tvorby smyčky (níže v tomto sekvence (í) nebo analogy sekvenci, která hybridizuje nebo jejich fragmenty a DNA degenerovaný genetický kod) z analogu sekvencí.

který má vyšší potenciál textu uvedeno aFGF analogy sekvence (í)), jakož i DNA jeden z analogu sekvencí sekvenci, která (až na by mohla hybridizovat jeden

Podobně DNA sekvence podle tohoto vynálezu může obsahovat DNA sekvenci vyznačenou na obrázku 10, kde alespoň jeden kodon kódující aminokyselinový zbytek v oblasti od asi aminokyseliny 115 do asi aminokyseliny 119 je nahrazen pomocí kodonu, který kóduje jiný aminokyselinový zbytek, který má vyšší potenciál tvorby smyčky (níže v tomto textu uvedeno KGF analog sekvence (í) nebo analog sekvence (í)), jakož i DNA sekvenci, která hybridizuje jeden z analogu sekvencí nebo jejich fragmenty a DNA sekvence, která (až na degenerovaný genetický kod) by mohla hybridizovat jeden z analogu sekvencí.

Analogy podle tohoto předloženého vynálezu mohou být kódovány, exprirnovány a čištěny pomocí jakékoliv metody z početných rekombinantních technologií, které jsou známé odborníkům. Preferované produkční metody se budou měnit v závislosti na mnoha faktorech a podmínkách, které zahrnují cenu a dostupnost materiálů a jiných ekonomických podmínek. Optimální produkční procedury pro získání situace bude zřejmá těm odborníkům, kteří znají alespoň minimum experimentů. Analogy podle tohoto předloženého vynálezu mohou být exprirnovány ve zvláště vysoké úrovni použitím hostujících buňěk E. coli, které exprimují konečný produkt a jsou dále čištěny, aby se přiblížily homogenitě použitím procedur známých ze stavu techniky. Typický čistící proces zahrnuje za prvé rozpuštění orgánů, které obsahují analogy, následuje iontomšničová chromatografie, potom rozkládání proteinu a nakonec hydrofobní chromatografie.

Analogy podle předloženého vynálezu představují překvapující stupeň zvýšené stability. Na rozdíl od přirozeně se vyskytujícího aFGF, analogy aFGF podle předloženého vynálezu demonstrují zvýšenou stabilitu a biologickou aktivitu za nepřítomnosti heparinu. Zatímco je známé, že stabilnější analogy bFGF mohou být získány pomocí substituce šeřinu nebo jiných neutrálních aminokyselin v místě určitého cysteinového zbytku (jak je například popsáno ve zveřejněné PCT přihlášce vynálezu č. 88/04189), substituce pro nekonzervovaný cysteinový zbytek v pozici 47 přirozeně se vyskytujícího samotného hovězího aFGF není významná pro zvýšení biologické aktivity a/nebo pro stabilitu analogu aFGF.

To je ukázáno nižší aktivitou, kterou znázorňuje hovězí (Ala⁴⁷) aFGF analog (substituovaný cysteinem) ve srovnání s hovězím (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF analogem (mající požadovanou substituci aminokyselinových zbytků v oblasti od 92 do 96 aFGF molekuly), jak je uvedeno v příkladech které následují. Hovězí analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF, ačkoliv má ještě nižší sílu ve srovnání s bFGF, byl specificky nalezen s přibližně desetkrát větší sílou než u hovězího (Ala⁴⁷) analogu aFGF. Při přídavku gg/rnl heparinu byla zvýšena biologická aktivita u všech tří forem FGF, jako u hovězího (Ala⁴⁷,Gly) analogu, hovězí (Ala⁴⁷, Gly³³) analog a lidský (Ser⁷⁰, Gly⁹³) analog mají v podstatě stejnou potenci.

Důvod pro zvýšení mitogenické aktivity a stability hovězího (Ala⁴⁷, Gly⁹^) aFGF analogu týkající se hovězího (Ala47) aFGF analogu v nepřítomnsti heparinu nebyla okamžitě jasná. Substituce glycinu za histidinový zbytek v pozici 93 ukázala tvorbu aFGF molekuly o něco více hydrofobní, ale neprojevila drastickou změnu její terciární struktury, jak je stanoveno pomocí cirkulárního dichroismu a FTIR spektroskopie. Avšak tyto relativní rozdíly v nalezených aktivitách v prostředí in vitro testech pro hovězí (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF analogu a pro hovězí (Ala⁴⁷) aFGF analog (se substitucí v pozici pouze 47) naznačuje, že substituovaná arainokyselina-glycin v pozici 93 hovězího (Ala47, Gly93) aFGF analogu múze být uvnitř nebo blízko oblasti odpovědné za vazbu receptoru. Ačkoliv nebyla stanovena vazebná oblast receptoru v aFGF, pozice 93 v aFGF odpovídá oblasti v bFGF, která je zapsána uvnitř nebo blízko receptoru, který váže doménu (Baird a kol., 1988, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 2324-2328).

Kromě toho hovězí (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF analog podle předloženého vynálezu na rozdíl od hovězího (Ala⁴⁷) analogu ukazuje zvýšenou stabilitu, která udržuje jeho původní mitogenickou aktivitu za nepřítomnosti heparinu v průběhu 250 hodin., zatímco hovězí (Ala⁴⁷) analog rychle ztrácí aktivitu. Hovězí (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF analog byl krystalizován a výsledné krystaly zkoumány rentgenovou krystalografií. Rentgenové krystalografické údaje získané ze zkoumaných krystalů podporují předpoklad podle údajů z hydrofobní chromatografie, že zbytek v pozici 93 je vystavený rozpuštění, t.j., že glycin pro histidinovou substituci v pozici 93 tvoří molekulu méně hydrofilní. Podrobný průzkum hovězího (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF analogové sekvence okolo zbytku prokázal nashromáždění přibližně 8 aminokyselin s vy

3 ššírn potenciálem tvorby smyčky v oblasti od asi zbytku glutamové kyseliny v pozici 90 do asi tyrosinového zbytku v pozici 97 . Relativní potenciály tvorby srnvček aminokyselin jsou popsány, přičemž glycin byl shledán jako aminokyselinový zbytek, který rná nejvyšší potenciál tvorby smyčky a to ze všech uvedených aminokyselin (Leszcynski a kol., uvedeno výše). Tudíž glycin pro substituci histidinu je schopný stabilizovat předpokládanou smyčku vzhledem k mnohem vyššímu potenciálu tvorby smyčky glycinového zbytku ve srovnání s histidinem.

Analogy KGF podle předloženého vynálezu také prokazují, že odpovídající oblast v KGF je rozpustnost i-vystavená smyčka, která může být zahrnuta do receptorové vazby. U analogu (Gly¹¹⁶) KGF dle předloženého vynálezu byla specificky nalezena měnící se snížená mitogenetická aktivita ve srovnání s přirozeně se vyskytujícím KGF jak je ukázáno na příkladech které následují. U analogu (Gly¹¹⁶) KGF bylo také nalezeno, že rná o 5-7 °C vyšší termickou stabilitu ve srovnání s přirozeně se vyskytujícím KGF.

Ostatní analogy, kromě preferovaných (Gly⁹³) aFGF a (Gly¹¹⁶) KGF specificky představených zde, jsou předpovězeny tímto předloženým vynálezem. Tyto ostatní analogy by mohly být lehce odborníkem připraveny pomocí následujících zde poskytnutých podkladů. Například není méně než patnáct popsaných aminokyselin, která mají vyšší potenciál tvorby smyčky než histidin (Leszcynski a kol.,1986, uvedeno výše). Tyto aminokyseliny jsou (v sestupném pořadí potenciálu tvorby smyčky) glycin, prolin nebo tyrosin, asparagová kyselina nebo asparagin, serin, cystein, glutamová kyselina, threonin, lysin, cystin, glutamin, arginin, fenylalanin a tryptofan. Substituce kteréhokoliv z těchto aminokyselinových zbytku histidinovým zbytkem v sekvenci smyčky přirozené se vyskytujícího proteinu by mohla vést k očekávanému analogu dle předloženého vynálezu, který má zvýšenou stabilitu. Bude samozřejmě preferováno nahradit hystidinovy zbytek v sekvenci tvořené smyčky aminokyselinou, která má nejvyšší možnou potenci tvorby smyčky, bez vytvoření jakýchkoliv negativních účinků potenciálu jako je například tvoření nežádoucích disulfidových vazeb během inzerce přidaného cysteinu nebo cystinového zbytku. A proto dalšími preferovanými aminokyselinovými substitucemi histidinového zbytku v sekvenční smyčce (t.j. za přidání glycinu) jsou představeny zahrnutými prolinem, tyrosinerc, asparagovou kyselinou, asparaginem, serinem, glutamovou kyselinou, threoninem, iysinem, glutaminem, argininem, fenylalaninem a tryptofanem.

Tento předložený vynález také předpokládá substituci aminokyselin, které mají vyšší potenciál tvorby smyčky pro jiné aminokyselinové zbytky unitř aminokyselinové oblasti od 92 do 96 přirozeně se vyskytujícího aFGF (t.j. aminokyselin 92 a 94-96) a aminokyselinové oblasti od 115 do 119 přirozeně se vyskytujícího aFGF (t.j. aminokyselin 92 a 115-117-119). Analogy aFGF podle předloženého vynálezu zahrnují například aFGF analogy, které mají threoninový zbytek v pozici 96 přirozeně se vyskytujícího aFGF nahrazen glycinem, prolinem nebo tyrosinem, asparagovou kyselinou, serinem nebo glutamovou kyselinou v pořadí preference,ačkoliv minimální zvýšení stability a/nebo biologické aktivity by bylo očekáváno za substituce glutamové kyseliny pro fhreonin vzhledem k podobnosti potenciálu tvorby smyčky těchto dvou aminokyselin.

Aminokyselinové zbytky v pozicích 92, 94, 95 a 97 (asparagin, tyrosin, resp. asparagin a tyrosin) přirozeně se vyskytujícího aFGF mají dostatečně vysoký potenciál tvorby smyčky, takže jsou předvídány minimální užitky vzniklé ze substituce těchto jednotlivých zbytků.

Analogy podle předloženého vynálezu se zdají zahrnovat analogy obojího původu lidského i zvířecího (např. hovězího) jakož i forem proteinu, který má následující aminokyselinovou sekvenci tvořené smyčky:

93 94 95 96 (aFGF)

-Asn-His-Tyr-Asn-Thr115 116 117 118 119 (KGF)

Například obě dvě formy lidského i zvířecího analogu aFGF jsou známé a byly identifikovány jako ty, které mají totožné aminokyselinové sekvence (ukázáno nahoře) v pozicích od 92 do 96. Kromě toho je přibližně 92% sekvenční totožnost mezi lidským a hovězím aFGF a 97% podobnost (t.j. 5 % z celkové 8% změny mezi dvěma formami aFGF je konzervováno). Obě dvě formy lidská a hovězí přirozeně se vyskytujícího aFGF vykazují v podstatě stejnou mitogenickou aktivitu v prostředí in vitro.

Vzhledem k jejich zvýšené stabilitě a biologické aktivitě v nepřítomnosti heparinu, jsou nové analogy podle předloženého vynálezu zvláště vhodné pro použití ve farmaceutických směsích pro lékaře a/nebo veterináře při léčení mnoha typů hlubokých ran savčích druhů. Analogy KGF podle předloženého vynálezu mohou být také vhodné vzhledem k jejich zvýšené termické stabilitě pro použití ve farmaceutických přípravcích. Množství biologických analogů použitých v těchto léčeních bude samozřejmě záviset na vážnosti léčených ran, cestě zvolené aplikace a na specifické aktivitě nebo čistotě analogu a bude stanoveno ošetřujícím lékařem nebo veterinářem. Termín terapeuticky účinné množství analogu se týká množství analogu určeného k tomu, aby vyvolal terapeutickou odpověď v savci. Tato terapeutická účinná množství jsou snadno zjistitelná odborníkem znalým stavu techniky.

Analogy podle předloženého vynálezu mohou být aplikovány pomocí jakékoliv cesty vhodné k léčení ran nebo k přípravě organismu. Podmínky, které mohou být prospěšně zpracovány spolu s terapeutickou aplikací (emi) analogu podle tohoto předloženého vynálezu zahrnují, ale nejsou tím omezeny, léčení povrchových ran, léčení kostí, angiogenesi, regeneraci nervů a tvorbu orgánů a/nebo jejich regeneraci.

Farmaceutické směsi podle předloženého vynálezu pro obě použití jak veterinární tak lidské obsahují terapeuticky účinné množství analogu společně s jedním nebo více farmaceuticky vhodnými nosiči tudíž a výhodně jiné terapeutické přísady. Nosič (e) musí být vhodné ve smyslu snášenlivosti s ostatními složkami farmaceutické směsi a nesmí být tudíž pro příjemce škodlivé.

Farmaceutické směsi smí být bez obtíží presentovány v jednotce lékové formy a smí být připraveny pomocí jakékoliv metody známé ze stavu techniky. Všechny tyto metody zahrnují krok zavedení spojení aktivní složky s nosičem, který je tvořen jednou nebo více vedlejšími složkami. Obecně řečeno jsou farmaceutické směsi připraveny pomocí jednoznačně a dokonale zavedeného spojení analogu s kapalným nosičem nebo účelově rozděleného pevného nosiče a nebo obou.

Následující příklady jsou poskytnuty pro pomoc k porozumění předloženého vynálezu, jehož skutečný rozsah je ukázán v připojených nárocích. Je pochopitelné, že mohou být utvořeny modifikace v těchto procedurách bez odchýlení se od smyslu tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: produkce analogu (Ala^⁷, Gly^) aFGF

Syntéza

Analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF a analog (Gly¹¹⁶) KGF byly připraveny použitím místně-řízené mutageneze. Nicméně bude uznáno, že tyto a jiné analogy předloženého vynálezu mohou být připraveny pomocí jiných metod, které zahrnují chemické syntézy. V případě analogu (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF byla použita hovězí sekvence. Specificky analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF byl připraven následovně:

Hovězí aFGF analog podle předloženého vynálezu byl připraven a testován v následujících příkladech. Tento analog, hovězí (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF byl konstruován tak, aby obsahoval obě požadované aminokyselinové substituce (glycin pro histidin v pozici 93) ve zbytku sekvence tvořící smyčku od 92 do 96 molekuly aFGF a přídavnou aminokyselinovou substituci alaninu pro nakonzervovaný cysteinový zbytek v pozici 47, jak je ukázáno na obrázku 1. Hovězí (Ala⁴⁷) aFGF analog, který má pouze aminokyselinovou substituci alaninu pro cystein byl také připraven pro použití jako kontrola pro požadovaný hovězí analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF. Ačkoliv tyto příklady představují hovězí analog aFGF předloženého vynálezu, stejné výsledky mohou být dosáhnuté pro vysoce homologní lidské analogy aFGF. Například aminokyselinová sekvence odpovídající lidskému analogu (Gly⁹³) aFGF dle předloženého vynálezu je vyobrazena na obrázku 2.

Syntetické geny, které kódují hovězí analog (Ala⁴⁷,Gly⁹³) aFGF, byly shromážděny ve dvou sekcích z celkových 28 komponentů oligonukleotidů. Aminokyselinová sekvence (Gimenez-Gallego a kol.,1985, Science, 230: 1385-1388) byla použitá jako základ pro tyto geny s kodonovýmí volbami vybranými tak, aby optimazovaly expresi v E. coli (Gimenez-Gallego a kol., 1985, uvedeno výše). Sekce I byla shromážděna ze 16 oligonukleotidů, aby poskytla 237 nukleotidových fragmentů, které by rnohly být inzertovány do plasmidového vektoru v Xba I a XhO' I místech restrikční endonukleázy. Sekce II byla shromážděna z 12 nukleotidů, aby bylo získáno 170 nukleotidových fragmentů vázaných pomocí Xho I a Bára HI kompatibilních konců. Tyto dvě sekce byly inzertovány do expresního plasmidu pCFM1156, který byl předtím rozštěpen pomocí Xba I a Bam HI ve 3 - komponentní ligaci, což poskytlo kompletní gen aFGF pod kontrolou lambda pL promotoru.

Plasmid pCFM1156 je připraven ze známého plasmidu pCFM336. Příprava plasmidu pCFM836 je popsána v US patentu , číslo 4 710473; relevantní části specifikace, zejména příklady od 1 do 7 jsou takto začleněny pomocí odkazu. Aby byl připraven plasmid pCFM1156 z plasmidu pCFM336, jsou rozříznuta dvě endogenní Nde I restričkní místa, odkryté konce jsou vyplněny pomocí T4 polymerasy a vyplněné konce jsou ligovány zarovnanými konci.

Výsledný plasmid je potom štěpen pomocí Cla I a Κρη I a excizovaný DNA fragment je nahrazen oligonukleotidem DNA následující sekvence:

5' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3' ' - TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTA.TA.CCAATTGCGC71ACCTTAAGC - 5'

E. coli buňky transformované plasmidem byly pěstovány ve fermentační nádobě 16-ti litrů (jak je popsáno ve Fox a kol., 1988, J. Biol. Chem., 263: 18452-18458).

Kódující gen pro hovězí analog (Gly⁹³, Ala⁴⁷) aFGF byl konvertován na (Ala⁴⁷) formu použitím místně-řízené mutageneze oligonukleotidú. Gen aFGF byl nejprve transferován do fágového vektoru M13mpl8 a byla připravena jednořetězcová DNA sloužící jako matrice pro reakci řízené mutageneze. Přibližně 0,5 gg této DNA bylo mixováno spolu s 5 pikomoly každého mutagenního primeru (5'-GAAGAAAACCATTACAACAC-3') a M13 universální prirner byl použitý pro sekvenování DNA, zahřát na 65 °C po 3 minuty a postupně pomalu ochlazen. Zchlazený matricový priraer byl mixován s ATP, se směsí dNTP, s velkým fragmentem DNA polymerásy a s ligasou DNA, potom inkubován při 15 °C po dobu 4 hodin. Alikvotní části této reakční směsi byly přidány ke kompetentním buňkám E. coli JM101 a umístěné v 0,7% agaru. Výsledné piaky byly replikovány do nitrocelulozových filtrů a filtry byly hybridizovány s označeným mutagenním primerem Připravená DNA z fágu, který hybridizoval, byla sekvenována, aby se ověřila úspěšná kompletace požadovaného mutagenního materiálu. Výsledný gen byl potom transferován zpět do vektoru pCFM1156 pro expresi rekombinantního proteinu.

Čištění analogu aFGF

Oba dva hovězí (Gly⁹³,Ala⁴⁷) a (Ala⁴⁷) aFGF analogy byly vyčištěny z nerozpustné frakce získané z centrifugace mechanicky lysovaných buněk E. coli, které exprimují rekombinantní protein. Peletová frakce byla rozpuštěna v 8 M močovině, 0,1 M glycinem, pH 2,5 a centrifugována, aby se odstranily nerozpustné materiály. Supernatant byl zalitý do S-Sepharosy© (Pharmacia, Uppsala, Sweden) kolony ekvilibrované 6 M močovinou, 10 mM glycinem, pH 3,0 a promyta 6 M močovinou, 20mM citrátem sodným, pH 6,5. Proteiny, které se navázaly na kolonu byly eluovány lineárním gradientem od 0 do 0,5 M chloridu sodného v 20 mM citrátu sodném, pH 6,5. Frakce, které obsahovaly aFGF byly spojeny, zředěny dvacetkrát s 20 mM citrátem sodným, 0,1 sulfátem amonným a centrifugovány, aby se odstranily jakékoliv sraženiny. Supernatant byl mixován s jedním dílem 20mM citrátu sodného, 2 M sulfátu amonného a zalitý do kolony fenyl17

Sepharosy® ekvilibrované s 20 niM citrátu sodného, 1 M sulfátu amonného, pH 6,5. Navázané proteiny byly eluovány z kolony pomocí sestupného lineárního gradientu (od 1 M do 0 M) sulfátu amonného.Frakce, které obsahovaly analogy aFGF byly spojeny a dialyzovány proti rnM citrátu sodném, pH 6,5. Tento produkt byl v podstatě homogenní jak demonstruje skutečnost, že se neobjevily žádné jiné vazby v SDS gelu Coomassie blue, jak je ukázáno na obrázku 4 .

Příklad 2: gelová filtrační chromatografie aFGF analogu

Gelová filtrace byla provedena při pokojové teplotě použitím kolony Superosy®-12 na systému Pharmacia FPLC (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Kolona byla filtrována při průtokové rychlosti 0,5 ml/min 20 rnM citrátu sodného,

0,2 M chloridu sodného, pH 6,5.

Gelová filtrační chromatografie ukázala, že čištěné hovězí (Ala⁴⁷) a (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF analogy eluované jako jednoduché píky jsou identické eluční pozici, kterou má ribonukleáza A (M_r= 13 700). Toto naznačuje, že oba dva proteiny jsou monomerní, a že mají stejný hydrodynamický rádius, ačkoliv je zde možnost, že obě dvě formy proteinu interagují s matricí kolony a poskytují opožděnou eluci z kolony.

Příklad 3: hydrofobně interakční chromatografie

Hydrofobně interakční chromatografie byla provedena při pokojové teplotě použitím kolony feny 1 -Superosy® na systému Pharmacia FPLC. Vzorek v 2M sulfátu amonném,

20mM citrátu sodném, pH 6,5 byl zalitý do kolony, která byla ekvilibrována 2 M sulfátem amonným. Po promytí 2 M sulfátem amonným byl zbývající protein eluován sestupným gradientem sulfátu amonného v koncentraci od 2 M do 0 M a následovalo konečné promytí pomocí 20 ntM citrátu sodného, pH 6,5.

Protože eluční pozice proteinu v hydrofobní interakční chromatografii (HIC) veirni silně závisí na orientaci hydrofobních oblastí v založeném stavu, poskytuje tato technika senzitivní nukleotidovou sondu konformační homogenity podobných proteinu. Obrázek 3 představuje eluční profily pro hovězí (Ala⁴⁷) a (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF analogy. Analog (Ala⁴⁷) aFGF ukazuje hlavní pík, který je eluován při použití 0,25 M sulfátu amonného, zatímco analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF ukazuje samostatný pík při použití 0,13 M sulfátu amonného, což naznačuje, že oba dva proteiny existují primárně v odlišné konformaci. Sluce při nižší solné koncentraci analogu (Ala⁴⁷, Gly⁹³) ukazuje, že je mírně hydro fobnější než forma (Ala⁴⁷). Toto pozorování je shodné i při nahrazení histidinového zbytku v pozici 93 glycinem, jestliže je konformace proteinu taková, že je tento zbytek vystaven vlivu rozpouštědla. Jinou možností je, že změna v tomto zbytku by mohla způsobit celkovou změnu v konformaci molekuly, aby vznikla hydrofobnější struktura.

Příklad 4: spektroskopie analogu aFGP

Cirkulární dichroismus

Cirkulární dichroické spektrum bylo stanoveno při pokojové teplotě na spektropolarimetru Jasco Model J500C (Jasco, Tokyo, Japan) vybaveným počítačem Oki If 800 Model 30 (Oki, Tokyo, Japan). Měření byla uskutečněna v šířce 1 nm vlnového pásma za použití kyvet 1 a 0,02 cm pro blízkou a vzdálenou ultrafialovou oblast. Nalezené údaje byly vyjádřeny pomocí prostředku zbytkové eliptičnosti, (Θ), počítáno použitím prostředku zbytkové hmotnosti obu dvou forem aFGF.

Spektrum cirkulárního dichroismu (CD) hovězích analogu (Ala⁴⁷, Gly³³) a (Ala⁴⁷) aFGF bylo téměř shodné v obou dvou vzdálených i blízkých ultafialových oblastech ja ukazují obrázky 4A a 4B. CD spektrum analogů bylo také velmi podobné spektru zapsaném pro lidský bFGF (Arakawa a kol., 1989, BBRC, 161: 335-341). Podobnost spektra v blízké ultafialové oblasti je souhlasná s podobností terciárních struktur pro analogy FGF.

Teplotní tranzice

Teplotní tranzice proteinů byla stanovena na spektrofotometru Response II (Gilford, Medfield, Massachusetts) vybaveným teplotním programováním a teplotním kyvetovým držákem. Vzorky byly zahřátý při teplotním přírůstku 0,1 °C/rnin nebo 0,5 °C/min a jejich absorbance byla monitorována při vlnové délce 287 nm. Proteinové koncentrace byly stanoveny spektrofotometricky požitím extinkčního koeficientu 0,93 pro bFGF a 1,04 pro oba dva hovězí analogy aFGF při vlnové délce 280 nm pro 0,1% protein.

Teplotní denaturace aFGF analogů byla testována v přítomnosti a v nepřítomnosti heparinu při dvou pH 6,5 a 7,0, 20 mM citrátem sodným. Ve všech případech se proteiny vysrážely, jakmile byla zvýšena teplota. Za nepřítomnosti heparinu, byla tato teplota asi o 10 °C vyšší pro hovězí analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF než pro hovězí analog (Ala⁴⁷) aFGF. Přídavek bud 1,4 násobného nebo 8 násobného (w/w) přebytku heparinu zvýšil denaturační teplotu pro obě dvě formy na 14-20 °C, což záviselo na rychlosti použití zvýšené teploty. Rozdíl mezi denaturační teplotou obou dvou forem zbýval asi 10 °C. Nebyl zde však zřejmý efekt 1,4 násobného nebo 8 (w/w) násobného přebytku heparinu na spektrum CD kteréhokoliv proteinu v rozsahu vlnové délky od 240 do 340 nm, ačkoliv v případě 8 násobného přebytku heparinu, spektrum aFGF v rozsahu vlnové délky od 240 do 260 bylo maskováno absorbančí samotného heparinu.

Fourier- transformační infračervená spektroskopie (FTIR)

Fourier- transformační infračervené spektrum bylo stanoveno proto, aby byla testována další podobnost v konformaci obou dvou analogů aFGF. Pro FTIR spektroskopii byly proteiny důkladně dialyzovány proti vodě. Každý protein byl připraven jako 2% roztok v 20 mM imidazolovém pufru připraveném v D2O (Sigma Chemical Co., 99,9% isotopové čistotě) . Roztoky byly umístěny v IR komůrkách s CaF₂ pásky a 100 pm mezerníky. Pro každé spektrum bylo shromážděno 1500 interferogramů a kodifikovámo na systému Nicolet 800 FTIR vybaveným KBr směrovým děličem (beam splitter) potaženém germaniem a detektorem DTGS. Optické místo (optical bench) bylo kontinuálně čištěné pomocí suchého plynu dusíku. Druhé odvozené spektrum bylo odhadnuté (jak je popsáno v Susi a kol., 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm., 115: 391397). Devítibodová hladící funkce (9-point smoothing funktion) byla aplikována na vodní spektrum párou odečtené.

Obrázek 5 ukazuje druhé odvozené spektrum (Ala⁴⁷,

Gly⁹³) a (Ala⁴⁷) hovězích analogů aFGF v amidové oblasti I' (OO plocha stretch v deuterovaných proteinech). Rychlosti v jednotlivých vazbách proteinů a polypeptidů v této oblasti jsou závislé na obsahu druhé struktury (Surewicz a kol., 1988, Biochem. Biophys. Acta, 952: 115-130). Spektra ukazují silné vazby 1630 cm¹ a 1685 cm'¹, které indikují významné množství beta struktur v těchto dvou proteinech. Silná vazba blízko 1647 cm'¹ je indikována přítomností nepravidelných nebo porušených struktur. Slabé píky blízko 1666 a 167 3 cm'¹ vznikají ze změněných struktur. Malý pík je uveden blízko 1651 cm'¹ve spektru obou dvou proteinů. Amidové I' komponenty blízko této rychlosti jsou typicky podobné alfa helixům. Avšak nedávno bylo ukázáno, že tyto vazby mohou vzniknout ze smyčkových struktur (Wilder a kol., 1990, Abstracts of the Fourth Symposium of the Protein Society, San Diego). Jak je ukázáno na obrázku 5, vysoce rozřešené FTIR spektra, na rozdíl od CD spekter, jasně dokládají přítomnost beta struktur a obrácených struktur (turn) a spektra pro hovězí analog (Ala⁴⁷) aFGF a pro hovězí analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF jsou blízce seřazená, což opět podporuje domněnku, že tyto dva proteiny mají podobnou konformaci.

Druhé odvozené spektrum neukazuje očividně žádný rozdíl v konformaci mezi těmito dvěma aFGF analogy. Avšak bylo evidentní, že se deuterace vyměnitelných protonů vyskytuje častěji pro hovězí (Ala⁴⁷) aFGF analog než pro hovězí analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF během ekvilibrace lyofilizovaného proteinu s roztokem D2O. Protože tyto dva proteiny mají podobnou konformaci, pozorované rozdíly ve výměně poměru H-D nemohou být vysvětleny z rozdílů ve stupni vystavení vyměnitelných protonů mezi těmito proteiny. Je více pravděbodobné, že analog (Ala⁴⁷) aFGF má flexibilnější strukturu, která poskytuje amidovým protonům větší přístupnost k rozpouštědlu.

Příklad 5: heparinová chromatografie analogu (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF

Heparinová-Sepharosa® (Pharmacia) byla naplněna do 1 x cm kolony ekvi1ibrované 10 mM Tris-HCl, pH 7,2. Kolona byla nastřiknuta , promyta 10 mM Tris-HCl, pH 7,2 a eluována lineárním gradientem od 0 do 2,8 M chloridu sodného ve stejném puřru při průtokové rychlosti 0,5 ml/rain použitím systému Pharmacia FPLC.

Kyselý a zásaditý aFGF jsou význačné pro jejich chtivost vázání k heparinovým a heparinu podobným molekulám. Oba dva hovězí analogy (Ala⁴⁷, Gly⁵'³) a (Ala⁴⁷) aFGF ukazují jediný pík elucí při 1,54 M chloridu sodném v 10 mM Tris-HCl, pH 7,2.

Příklad 6: biologická aktivita analogů aFGF

Biozkoušky v in vivo

Mitogenetická aktivita buněk NIH 3T3 analogů aFGF z předcházejících příkladů byla stanovena ja je popsáno níže. Kromě toho lidský (Ser⁷⁰, Ser⁸⁸) bFGF analog, který byl popsán ve zveřejněné PCT přihlášce vynálezu č. 88/04189 byl také testován v bioaktivních zkouškách vedle analogů aFGF.

Buňky NIH 3T3 analogů aFGF byly získané ze sbírky ATCC.

Buňky byly pěstované v DME doplněném 10% hovězím sérem, 10 jednotky/ml penicilinu, 2 mM glutarainem a 10 jednotky/ml streptomycinu, Buňky byly pasážovány při poměru 1:40 dvakrát za týden. První den zkoušky byly splývající kultury rozptýleny trypsinem a umístěny do 24-jamkové destičky v koncentraci 20 000 buněk/ml, 1 ml na jamku zhora uvedeného media. Pátý den bylo medium nahrazeno 1 ml/jamku DMEM bez séra, ale které obsahovalo penicilín, streptomycin a glutamin ve zhora uvedené koncentraci. Šestý den byly do media přidány testované vzorky v objemu, který nebyl větší než 100 pl. 'Za osmnáct hodin později byly buňky pulsovány po dobu jedné hodiny s 1 ml zhora uvedeného media, které obsahovalo 210 pCi tritiumovaný thymidin při 37 °C. Po pulsací byly buňky jednou promyty s mediem a potom bylo přidáno 250 mM sacharosy, 10 rnM fosfátu sodného, 1 rnM EDTA, pH 8 a destičky byly inkubovány při 37 °C po dobu 10 minut, aby byly buňky uvolněny. Buňky byly sklizeny na Skarton harvester (Skarton, lne. , Sterling, Virginia? . Filtry byly sušeny, umístěny ve scintilační kapalině a počítány na scinti lačním počítači Beckman (Beckman Instruments, lne., Fullerton, California).

Mitogenetická aktivita hovězího (Ala⁴⁷,Gly⁹³) a (Ala⁴⁷) aFGF analogu buftek NIH 3T3 byla stanovena jak ukazuje obrázek 6. Za nepřítomnosti heparinu produkoval aFGF analog na dávce závisející stimulaci ³H thymidinovou absorbci v rozsahu od 1 do 100 ng/ml s poloviční stimulací 25 ng/ml. Za stejných zkušebných podmínek byl analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF schopen produkovat stejnou mitogenickou aktivitu při mnohem menší koncentraci proteinu, poloviční dávka byla asi 1 ng/ml.

Rekombinantní bFGF byl 4-5 krát silnější než analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF při poloviční dávce 220 pg/ml. Když bylo přidáno 4,5 pg/ml heparinu k oboum analogům, byla jejich aktivita v in vitro zvýšena se zbývající větší silou analogu (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF. Za přítomnosti 45 pg/ml heparinu byly aktivity takové, že odpovídající dávka všech tří molekul byla téměř shodná při poloviční dávce 90 pg/ml.

Stabilita analogů aFGF jak bylo stanoveno pomocí jejich retence resp. mitogenické aktivity byla prozkoumána inkubací 0,1 mg/ml roztoku každého FGF analogu v 20 mM citrátu sodném, pH 7 při 37 °C, oba dva za přítomnosti a nepřítomnosti 1 mg/ml heparinu. Za nepřítomnosti heparinu hovězí analog (Ala⁴⁷) aFGF rychle ztratil aktivitu s poločasem rozpadu 13 hodin, jak je ukázáno na obrázku 7. Avšak za přítomosti heparinu hovězí analog (Ala⁴⁷) aFGF neztratil biologickou aktivitu přes 250 hodin v průběhu experimentu. V kontrastu s tím žádný hovězí analog (Ala⁴⁷, Gly⁹³) aFGF ani lidský analog (Ser⁷⁰, Ser⁸⁸) bFGF nezratil aktivitu přes 2bG hodin, zda-ii byl heparin přítomen nebo ne.

Příklad 7: krystalografie analogu (Ala⁴⁷, Gly^’⁸) aFGF

Krystaly hovězího analogu (Ala⁴⁷, Gly⁸⁸) byly pěstovány pomocí parní difuse proti 0,2 M NH4SO4, 2 M NaCl, 0,099 M citrátu sodném a 0,02 M fosfátu sodno draselném, pH 5,6. Proteinová kapička obsahovala stejné objemy zásobního roztoku a 10 mg/ml proteinového roztoku. Krystaly byly trigonální (prostorová skupina PS^žl, a=73,6 A, c=115.9 A) a odchylkou 2,5 A rozlišovací schopnosti. Intenzivní údaje byly sebrány pomocí Siemens (Madison, Wsconsin) multiwire area detector instalovaný na 18 kw rotačním anodovém generátoru. Vhodné procesní programy Siemens byly použité pro snížení údajů. Multiplové isomorfní náhradní fáse (mir) byly počítány na 3 A rozlišovací schopnost ze dvou derivátů s číselnou hodnotou 0,68. Po stabilizování rozpouštědlem bylv identifikovány oblasti odpovídající dvěma nezávislým molekulám aFGF v asymetrickém útvaru. Obecní nekrystalografická symetrie příbuzná mezi těmito molekulami byla stanovena z rotační funkce, reálneprostorové translační funkce a studií vzájemných vztahu hustoty. Molekulární obal byl definován okolo vypočítaného průměru molekuly aFGF s modifikovaným B.C. Wang algoritmem. Fáze byly opakovaně čištěny pomocí molekolového zjištěného průměru a stabilizování rozpouštědlem.

Počáteční mapy odkryly prodloužené oblasti beta plošné struktury, která byla zkrácena ve smyčce, vzhledem k malému molekulárnímu obalu, jak je ukázáno na obrázku 8. Konečná mapa pro modelování výstavby byla počítána pomocí fází mir, z těžkých atomových parametru znovu čištěna proti z průměr ovánými fázírn (jak popisuje Rould a kol

1989, Science, 246: 1135-1142) a opakovaně zprúměrována s molekulárním obalem rozmístění 6 A sfér okolo atomovýc: modelu. Vypočítání průměru při 3 A generovaným • z p 01.1C1 v ρ rozlisován í pomocí c a z e o nim schopnosti konvergovalo ke konečnému faktoru R 17,8 % mezi pozorovanými strukturovými faktory a strukturovými faktory vypočítanými z průměrované mapy a mapy stabilizované rozpouštědlem. Grafický program TOM/FRODO, který byl opatřený Silicon Graphics 4D80 od C.

Cambillau, byl použitý, aby vestavěl zbytky sekvence aFGF od 10 do 136 do průměrné elektronové mapy hustoty.

Krystalografické výsledky podpořily hypotézu, že 90-97 oblast je zahrnuta ve smyčkové struktuře. Jestliže je ve skutečnosti tato oblast zahrnuta v receptem, který váže (jak navrhuje Baird a kol., 1988 uvedeno výše) jakoukoliv aminokyselinovou substituci, která stabilizuje smyčku, může vlastně stabilizovat a/nebo zvyšovat biologickou aktivitu molekuly. Toto je pravděpodobně podle všeho mechanismus pro zaznamenané zvýšení aktivity dosáhnuté s hovězím analogem (Ala^⁷, Gly⁹³) aFGF.

Příklad 8: produkce analogu (Gly^llO) KGF

Syntézy

Aby byl připraven analog (Gly¹¹⁶), byla nejprve získána sekvence kódující přirozeně se vyskytující KGF a potom změněna v kodonu pro aminokyselinu 116, aby se dosáhla kódující sekvence pro analog.

Kódující sekvence pro přirozeně se vyskytující KGF byla získána použitím RNA izolované z lidských fibroblastových buněk (buněčná linie AG1523) jako startovní materiál, z kterého se připravuje cDNA pro KGF použitím standardních technik známých ze stavu techniky. KGF cDNA byla potom použita jako matrice pro polymerásove řetězcové reakce (PCR), aby byl amplifikován gen KGF. Vzhledem k přítomnosti vnitřního místa Ndel v genu KGF, byla PCR DNA připravena jako dva fragmenty, které byly potom spojeny dohromady v charakteristickém místě Bsrcl. 01igonukleotidv 238-21 a 238-24 (ukázáno dole) byly použité k tomu, aby byl připraven produkt, který byl následně rozříznut s BsmI a s BamHI a potom byl izolován výtěžek 311 párů bází fragmentu KGF. Tyto dva fragmenty DNA, které jsou ligovány dohromady tvoří gen pro přirozeně se vyskytující KGF, jak je ukázáno na obrázku 9.

Aby byla získána kódující sekvence pro požadovaný analog (Gly¹¹⁶) KGF, bylo nezbytné substituovat glycinový kodon histidinovým kodonem His¹¹⁶ v genu KGF. Toto bylo dosáhnuto použitím PCR překrývajících se oligonukleotidových mutagenesí s oligonukleotidy 315-17 a 315-18, kódujícími sekvenci DNA KGF, která odpovídá oblasti His¹¹⁶ s vhodnými změnami párových bází, aby byl kodován analog (Gly¹¹⁶) KGF. Matrice DNA KGF pro PCR byla stejná, jak je ukázáno na obrázku 9, kromě toho že byla sekvence DNA mezi místy KpnI a EcoRI nahrazena chemicky syntetizovanou DNA, jak je ukázáno na obrázku 10. Jakékoliv vyhovující oligonukleotidy odpovídající oblastem KGF DNA 5'- a 3'místům řízených mutační změnou, jako například oligonukleotidy 238-22 a 238-24 by mohly být použité, aby poskytly vnější primery pro překrývající se rcutagenese PCR. Fragment DNA EcoRI a BamHI, který obsahoval kódující sekvenci pro analog (Gly¹¹⁶) KGF, byl potom ligován do předtím popsaného expresního plasmidu pCFM1156 obsahující již gen KGF tak, aby nahradil odpovídající oblast genu KGF oblastí kódující sekvence, která obsahovala nezbytné změny pro kódování analogu (Gly¹¹⁶) KGF, jak je ukázáno na obrázku 10. Ligovaná DNA byla potom transformována do buněk FM5 (ATCC# 53911) a kolonie, které obsahovaly analogový plasroid pCFM1156 (Gly¹¹⁶) byly izolovány. Analogový mutant KGF FM5/pCFM1156 KGF (-Gly¹¹⁶) byl potom fermentovár* a buněčná pasta byla sklizena použitím standardních technik.

o ligo	2 3 8 - 2 1
oligo	238-22	5'
ol igo	238-24	5'
oligo	315-17	5'
ol igo	315-18	5'

ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3'

ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA- 3'

ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA- 3

GGAAAACGGTTACAACACATATGCA- 3'

GTGTTGTAACCGTTTTCCAGAATTAG- 3'

Čištění analogu (Gly¹¹⁶) KGF

Buňky, obsahující analog (Gly¹¹⁶) KGF z fermentace popsané nahoře, byly nejprve rozbité pomocí suspendování 665 g buněčné pasty E. coli v cca 4 litrech 20 mM fosfátu sodném, pH 6,8, 0,2 M NaCl a potom byla suspenze propasírována zkrz homogenizer Gaulin při 9000 psi. Suspenze byla dále centr ifugována na rotoru Beckraan JA10 (Beckraan Instruments, Fullerton, California) při 10 000 rpra, po dobu 30 minut, při 4 °C.

Iontovýměnná chromatografie byla provedena pomocí využití supernatantu z centr ifugované suspenze jeho nanesením na kolonu S-Sepharose® Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Sweden, 5 x 23 cm, 450 ml celkový objem) ekvilibrované 20 mM fosfátem sodným, pH 7,5, 0,4 M NaCl při průtoku 25 ml/min. Kolona byla poté promyta dvěma litry 20 mM fosfátu sodného, pH 7,5, 0,4 M NaCl a analog (Gly¹¹⁶) KGF byl eluován s lineárním gradientem od 0,4 do 0,6 M NaCl v 20 mM fosfátu sodném, pH 7,5. Celkový gradientový objem byl sedm litrů (asi seštnáctkrát použitý objem kolonou) . Frakce, obsanující řCGF byly shromážděny a ^koncentrovány asi dvaadvaceti násobně přes membránu YM®-10 (Amicon) ve 400 ml míchané komůrce.

Rozdělovači chromatograťie size exclusion chromatography¹¹ (SEC) byla provedena za použití polovičního objemu zkoncentrovaného KGF (celkový objem je 80 ml) získaného z iontovýměnne chromatografie na koloně Sephadex® G-75 (Pharmacia, 4,4 x 85 cm, celkový objem 1 300 ml) ekvi1ibrovane s 20 mM fosfátem sodným, pH 6,8, 0,5 M NaCl a vyvoláním této kolony tímto pufrem.

Proces byl potom opakován s druhou polovinou zkoncentrovaného přípravku KGF.

Druhá iontovýměnná chromatografická procedura byla poté provedena pomocí prvních shromážděných frakcí SEC, které odpovídaly monomerní formě analogu (Gly¹¹⁶) KGF a dále byly shromážděné frakce rozředěny pěti objemy 20 mM fosfátu sodného, pH 6,8, 0,2 M NaCl a zředěné frakce byly naneseny na kolonu S-Sepharose® Fast Flow (Pharmacia, 5 x 23 cm, 450 celkový objem) ekvilibrovane s 20 mM fosfátem sodným, pH 6,8, 0,4 M NaCl. Tato kolona byla potom promyta s asi jeden a půl litrem 20 mM fosfátu sodného, pH 6,8, 0,4 M NaCl. Čištěný analog (Gly¹¹⁶) KGF byl eluován s lineárním gradientem od 0,4 do 0,6 M NaCl v 20 mM fosfátu sodném, pH 6,8. Celkový gradientový objem byl deset litrů (asi dvaadvacetkrát použitý objem kolonou). Vzorky, které obsahovaly analog (Gly¹¹⁶) KGF, jak bylo zjištěno pomocí SDS-PAGE, byly shromážděny a obsah KGF byl stanoven pomocí absorbce UV.

Příklad 9: spektroskopie analogu KGF

Spektroskopie fourier-transform Ifrared (FTIR)

Vzorky byly připraveny pro infračervenou spektroskopii pomocí diafi 1trováných proteinových roztoků v 20 rnM fosfátu sodném, 0,5 M NaCl, pD = 6,8 pufru připraveném v D₂O (Sigma, 99,9%+ isotopická čistota). Hodnoty pD byly stanoveny pomocí hodnoty 0,45 odečtené ze skleněné elektrody pH metru (podle Covington a kol., 1968, Anal. Chem., 40: 700-706). Konečná proteinová koncentrace byla 30 mg/ml. Proteinové roztoky byly umístěné v komůrkách IR spolu s CaF₂ pásky a 100 μ.Μ teflonovými mezerníky.

Pro strukturální charakteristiky bylo kodifikováno

256 oboustraných interferogramú a transformováno po aplikaci nezvratné funkce Happ-genzel použitím systému 800 FTIR. Výsledky byly odhadnuty na 2 cm'¹. Odvozené spekrum a fourier se 1f-deconvolution (samonarovnání) byly provedeny podle (Susi a Byler, 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm., 115: 391-397) použitím softwaru Nicolet. Bodová křivka byla provedena použitím programu Peakfit™ (Jandel Scietific Co.). Infračervené spektrum KGF ukazuje na silnou podobnost k těmto analogům bFGF a aFGF, které indikují podobné struktury pro tyto tři proteiny.

Studie teplotní stability přirozeně se vyskytujícího

KGF a analogu (Gly¹¹⁶) KGF byly provedeny pomocí umístění komůrek IR v elektricky vyhřívaném plášti kontrolovaném automatickým kontrolorem teploty (Specac lne. , Fairfield, Connecticut) . Teplota byla zvýšena při rychlosti 0,5 °C/minutu. IR spektrum bylo vybráno při 8 cm'¹ rozlišovací schopnosti.

Při teplotách pod 50 °C se spektra jevily s malými změnami od spekter při okolní teplotě. Při teplotách nad 50 °C spektra naznačovaly, že přirozeně se vyskytující KGF vydrží při tomto stupni termotropický přechod. Píky blízko 1616 a 1685 crn-1 byly ve spektru evidentní a při 65 °C tyto píky dominovaly s odpovídající ztrátou intensity při 1643 cm'¹. Tento spektrální přechod představuje kooperativní vyrovnání záhybu přirozeně se vyskytujícího KGF. Zaznamenané termální přechody nebyly vratné nejpravděpodobněji vzhledem k agregaci vyrovnaných proteinů. Teplota tání T_m pro přirozené se vyskytující KGF byla odhadnuta na 60 °C, zatímco Tra pro analog (Gly¹¹⁶) KGF byla odhadnuta na 65 °C, o 5 °C větší teplota, než u přirozeně se vyskytujícího KGF, naznačuje, že analog (Gly¹¹⁶) KGF má vyšší relativní termální stabilitu než přirozeně se vyskytující KGF.

Ultrafialová spektroskopie

Termální denaturace obou dvou analogů (Gly¹¹⁶) KGF a přirozeně se vyskytujícího KGF byla studována použitím spektrofotometru Response II UV (Gilford, Medfield, Massachusetts) s kontrolorem teploty Peltier a termálním programem. KGF roztoky v 20roM fosfátu sodném, pH 6,8 byly mixovány s 8 M guanidinem HCl nebo 20 m.M fosfátem sodným ke konečné koncentraci proteinu asi 0,5 rog/ml a ke konečné koncentraci guanidinu HCl od 0 do 2 M. Termální přehledná rychlost byla zobrazena při 0,5 ° c/minutu a vlnová délka byla monitorována při 260 nm. Přídavek malého množství guanidinu HCl eliminoval srážení proteinů během termální denaturace, ale neučinil denaturaci vratnou. Z tohoto důvodu byly vzorky srovnávány během reakce současně.

Experimenty termální denaturace použitím UV spektroskopie nebyly úspěšné v přítomnosti od 0 do 1 M guanidinu HCl vzhledem k tomu, že při zahřátí vzniknul zákal. Nicméně vyvinutý zákal při nižší teplotě pro přirozeně se vyskytující KGF než pro analog (Gly¹¹⁶) KGF prozrazuje, že dříve uvedený protein denaturuje a následkem toho agreguje při nižší teplotě. V 1,5 M guanidinu HCl je absorbance při 287 nm snížená, jakmile protein denaturuje a potom zase zvýšená vzhledem k agregaci. Teploty, při kterých se absorbance snižují a zvyšují, se vyskytovaly v tomto pořadí 25 a 44 °C pro analog (Gly¹¹⁶) KGF. Přídavek 2 M guanidinu HCl vedl k částečné denaturaei pro oba dva analogy přirozeně se vyskytující KG ilog (Gly

116 \ χ,’Γ' teplotě 21

Zvýšení teploty vedlo k úplné denaturaei pro proteiny, zakončení denaturace proběhlo poblíž teploty 37 °C pro přirozeně se vyskytující KGF a blízko teploty' 46 °C pro analog (Gly¹¹⁰) KGF.

Tyto výsledky indikují, že analog (Gly¹¹⁶) KGF je více termálně stabilní při příslušných stupních při teplotě tání, a že jsou tyto výsledky v souhlasu s infračervenou analýsou, která naznačuje zvýšení přibližně o 5 °C při Tm analogu (Gly¹¹⁶) KGF vzhledem k přirozeně se vyskytujícímu KGF.

Příklad 10: mitogenetická aktivita analogu (Gly¹¹⁶) KGF

Mitogenetická aktivita analogu (Gly¹¹⁶) KGF byla analysována použitím mitogenetických zkoušek (Rubín a kol., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Analog (Gly¹¹⁶) KGF demonstruje menší začlenění 3Hthymidinu než bylo pozorováno pro přirozeně se vyskytujícím KGF, což indikuje nižší specifickou aktivitu pro analog (Gly¹¹⁶) KGF.

Popis obrázků na přiložených výkresech

Obrázek 1 ukazuje nukleovou kyselinu a aminokyselinové sekvence rekombinantního hovězího analogu (Ala⁴⁷,Gly⁹³) aFGF .

Obrázek 2 ukazuje aminokyselinovou sekvenci rekombinantního lidského analogu (Gly⁹³) aFGF.

Obrázek 3 demonstruje eluční profily pro hovězí analogy (Ala47) a (Ala⁴⁷,Gly⁹³) aFGF použitím hydrofobní interakční chromatografie.

Obrázky 4A a 4B ukazují cirkulární dichroické spektrum pro hovězí analogy (Ala⁴') a (Ala**⁷ , Gly^{9 3}) aFGF.

Obrázek 5 ukazuje druhé odvozené spektrum FTIR hovězích analogů (Ala⁴⁷) a (Ala⁴⁷,Giy⁹³) aFGF v amidové I'oblasti (C=0 střech v deuterovaných proteinech).

Obrázek 6 je grafická ukázka diagramu logaritmu koncentrace hovězích analogů (Ala⁴⁷) a (Ala⁴⁷,Gly⁹³) aFGF a lidského analogu (Ser⁷⁰, Ser³³) bFGF proti procentu maximální stimulace.

Obrázek 7 je grafickým znázorněním ztráty aktivity nastaveného času hovězích analogů (Ala⁴⁷) a (Ala⁴⁷,Gly⁹³) aFGF za nepřítomnosti heparinu ve srovnání s lidským (Ser⁷⁰,Ser³³) bFGF.

Obrázek 8 ukazuje strukturu hovězího analogu (Ala⁴⁷,Gly⁹³) aFGF podle předloženého vynálezu, jak je stanoveno pomocí X-ray krystalografie.

Obrázek 9 ukazuje nukleovou kyselinu a aminokyselinové sekvence přirozeně se vyskytujícího KGF.

Obrázek 10 ukazuje nukleovou kyselinu a aminokyselinové sekvence rekombinantního analogu (Gly¹¹⁶) KGF.

ibrázek IQ ukazuje nukleovou kyselinu a aminokyselinové ekvence rekombinantriího analogu iGly^ii&) KGF.

3e znara s e k ve nc í

Π) Obecná informace:

(i) přihlašovatel: Amgen lne.

⁽’ii) název vynálezu: Analogy růstového faktoru kyselého fibrobiastu, které mají zvýšenou scabilitu a bilologickou aktivitu.

(iii) počet sekvencí: 17 (iv) korespondenční adresa:

(A) adresa: Amgen lne (B) ulice: 1840 DeHavilland Drive (C) město: Thousand Oaks (D) stát: California (E) země: USA (F) poštovní kod: 91320-1789 (v) počítačově čtecí forma:

(A) typ media: Floppy disk (B) počítač: IBM PC corapatible í'C) operační systém: PC -DOS/MS- DOS (D) software·. Patentln Release #1.0 Version #1.25 (vi) údaje o přihlášce:

(A) číslo přihlášky:

(B) den přihlášení:

(C) třídění:

3¼ (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(A) délka: 463 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

TGTAGAAAAA	ACCAAGGAGG	TAATAAATAA	TGTTCAACCT	GCCGCTGGGT	AACTACAAAA	60
AACCTAAGCT	TCTGTACTGC	TCTAACGGCG	GTTACTTCCT	GCGCATTCTC	CCGGATGGCA	120
CTGTAGACGG	TACCAAAGAT	CGTTCCGACC	AGCACATTCA	GCTCCAGCTC	GCTGCAGAAT	180
CTATCGGTGA	AGTTTACATC	AAATCCACCG	AAACTGGTCA	GTTCCTGGCT	ATGGATACTG	240
ATGGTCTCCT	CTACGGTTCT	CAGACTCCGA	ACGAAGAGTG	CGTGTTCCTC	GAGCGTCTGG	300
AAGAAAACGG	TTACAACACC	TACATCTCCA	AAAAACACGC	TGAAAAACAC	TGGTTCGTTG	360
GTCTGAAAAA	AAACGGTCGT	TCTAAACTGG	GTCCGCGCAC	TCACTTCGGT	CAGAAAGCTA	420
TCCTGTTCCT	CCCTCTGCCG	GTTTCTTCCG	ATTAATAGGA	TCC		463

(2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 141 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Met Phe Asn Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr

10 15

Cys Ser Asn Gly Gly Tyr Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val

25 30

Asp Gly Thr Lys Asp Arg Ser Asp Gin His Ile Gin Leu Gin Leu Ala

40 45

Ala Glu Ser Ile Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin .V .

50

55

60

Phe

Leu

Ala

Met

Asp

Thr

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gly

Ser

Gin

Thr

Pro

65

70

75

80

Asn

Glu

Cys

Leu

Phe

Leu

Glu

Arg

Leu

Glu

Asn

Gly

Tyr

Asn

85

90

95

Thr

Tyr

Ile

Ser

Lys

His

Ala

Glu

Lys

His

Trp

Phe

Val

Gly

Leu

100

105

110

Lys

Asn

Gly

Arg

Ser

Lys

Leu

Gly

Pro

Arg

Thr

His

Phe

Gly

Gin

115

120

125

Lys

Ala

Ile

Leu

Phe

Leu

Pro

Leu

Pro

Val

Ser

Asp

130

135

140

(2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 155 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein

(xi)

pop i S í

sekvence

: SEQ ID

NO:

3 :

Met

Ala

Glu

Gly

Glu

Ile

Thr

Phe

Thr

Ala

Leu

Thr

Glu

Lys

Phe

1

5

10

15

Asn

Leu

Pro

Gly

Asn

Tyr

Lys

Pro

Lys

Leu

Tyr

Ala

Ser

20

25

3 0

Asn

Gly

His

Phe

Leu

Arg

Ile

Leu

Pro

Asp

Gly

Thr

Val

Asp

Gly

35

40

4 5

Thr

Arg

Asp

Arg

Ser

Asp

Gin

His

Ile

Gin

Leu

Gin

Leu

Ser

Ala

Glu

50

55

50

Ser

Val •

Gly

Glu

Val

Tyr

Ile

Lys

Ser

Thr

Glu

Thr

Gly

Gin

Tyr

Leu

65

70

75

80

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg

100

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu

115

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly

130 135

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro

145 150

Leu Glu Glu Asn

105

Lys Asn Trp Phe

120

Pro Arg Thr His

Val Ser Ser Asp

155

Gly	Tyr	Asn	95 Thr	Thr
Val	Gly	110 Leu	Lys	Lys
Tyr	125 Gly	Gin	Lys	Ala

140 (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 502 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA 60

GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAC-AGTGA GAAGACTCTC 120

TGTCGAACAC AGTGGTACCT GAGGATCGAT AAAAGAGGCA AAGTAAAAGG GACCCAAGAG 180

ATGAAGAATA ATTACAATAT CATGGAAATC AGGACAGTGG CAGTTGGAAT TGTGGCAATC 240

AAAGGGGTGG AAAGTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG 300

AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA 360

TATGCATCAG CTAAATGGAC ACACAACGGA GGGGAAATGT TTGTTGCCTT AAATCAAAAG 420

GGGATTCCTG TAAGAGGAAA AAAAACGAAG AAAGAACAAA AAACAGCCCA CTTTCTTCCT 480

ATGGCAATAA CTTAATAGGA TC 502 (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5: (i) charakteristiky sekvence:

3?

(A) délka: 497 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristické rysy:

(A) jméno/klíč: (B) umístění: doplňkové (1..497) (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

CTATTAAGTT ATTGCCATAG GAAGAAAGTG GGCTGTTTTT TGTTCTTTCT TCGTTTTTTT 60

TCCTCTTACA GGAATCCCCT TTTGATTTAA GGCAACAAAC ATTTCCCCTC CGTTGTGTGT 120

CCATTTAGCT GATGCATATG TGTTGTAATG GTTTTCCAGA ATTAGTTCTT TGAAGTTACA 130

ATCTTCATTG CATTCTTTCT TTGCATAGAG TTTTCCTTCC TTGTTCATTG GAAGATAGAA 240

TTCACTTTCC ACCCCTTTGA TTGCCACAAT TCCAACTGCC ACTGTCCTGA TTTCCATGAT 300

ATTGTAATTA TTCTTCATCT CTTGGGTCCC TTTTACTTTG CCTCTTTTAT CGATCCTCAG 360

GTACCACTGT GTTCGACAGA AGAGTCTTCT GACTCTTATA TCCCCTCCTT CCATGTAATC 420

ATAACTTCTT GTGTGTCGCT CAGGGCTGGA ACAGTTCACA TTTGTAGCCA TTTGCTCTGG 430

AGTCATGTCA TTGCACA 497 (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6':

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 164 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Cys

10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

3Í (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 503 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

TATGTGCAAT	GACATGACTC	CAGAGCAAAT	GGCTACAAAT	GTGAACTGTT	CCAGCCCTGA	60
GCGACACACA	AGAAGTTATG	ATTACATGGA	AGGAGGGGAT	ATAAGAGTGA	GAAGACTCTT	120
CTGTCGAACA	CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	130
GATGAAAAAC	AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	240
CAAAGGTGTT	GAATCTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	300
GAAAGAATGC	AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACG	GTTACAACAC	360
ATATGCATCA	GCTAAATGGA	CACACAACGG	AGGGGAAATG	ψΓΊΓΠ^ΓΠΓΤΊ^Ί ’™*CT	TAAATCAAAA	420
GGGGATTCCT	GTAAGAGGAA	AAAAAACGAA	GAAAGAACAA	AAAACAGCCC	ACTTTCTTCC	430
TATGGCAATA	ACTTAATAC-G	ATC				50 3
(2) informace pr	o sekvenci	SEQ ID NO:	3 :

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 497 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý (£>) topologie: neznámá (id) typ molekuly: cDNA (ix) charakteristic^ké rysy:

(A) jméno/klíč:(B) umístění: doplňkové (1--437) (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

CTATTAAGTT	ATTGCCATAG	GAAGAAAGTG	GGCTGTTTTT	f \| ii ri ι fii¹ .!! r i p-irp	lp ( \| II \| II \| li \| I· Ml ¹ 1	0
TCCTCTTACA	GGAATCCCCT	TTTGATTTAA	GGCTTCAAAC	ATTTCCCCTG	CGTTGTGTGT	- O d*.
CCATTTAC-CT	GATGCATATG	TGTTGTAACC	G TTTT C C AG A	zyp'···'-g T^rr'c'pp	TGAAGTTACA	130
ATCTTCATTG	CATTCTTTCT	TTGCATAGAG		TTCTTCATTG	CAAGATAGAA	240
TTCAGATTCA	ACACCTTTGA	TTGCAACGAT	ACCAACAGCA	ACAgTACGGA	TTTCCATAAT	3 00
ATTGTAGTTG	TTTTTCATCT	CTTGGGTGCC	C x i<Jňt X i X<J	CCGCgTTTGT	CGATACSCAG	δ 0
GTACCACTGT	GTTCGACAGA	AGAGTCTTCT	CACTCTTATA	TCCCCTCCTT	CCATGTAATC	4 2 0
ATAACTTCTT	GTGTGTCGCT	CAGGGCTGGA	ACAGTTCACA	TTTGTAGCCA	rprprp^	.4 o n O ·-/
AGTGATGTCA	TTGCACA					407

to (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 9: (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 164 aminokyselin (B) .. typ: aminokyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein

	(xi)	popis :	sekvence	: SEQ ID	NO:	9 :
Met	Cys	Asn Asp	Met Thr	Pro Glu	Gin	Met Ala Thr Asn Val Asn Cys
1			5			10 15
Ser	Ser	Pro Glu	Arg His	Thr Arg	Ser	Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly
		20			25	30
Asp	Ile	Arg Val	Arg Arg	Leu Phe	Cys	Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg
		35		40		45
Ile	Asp	Lys Arg	Gly Lys	Val Lys	Gly	Thr Gin Glu Met Lys .Asn Asn
	50			55		60
Tyr	Asn	Ile Met	Glu Ile	Arg Thr	Val	Ala Val Gly Ile Val Ala Ile
6 5			7 0			7 5 3 0
Lys	Gly	Val Glu	Ser Glu	Phe Tyr	Leu	Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys
			35			90 95
Leu	Tyr	Ala Lys	Lys Glu	Cys Asn	Glu	Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu
		100			105	110
Ile	Leu	Glu Asn	Gly Tyr	Asn Thr	Tyr	Ala Ser Ala Lys Trp Thr His
		115		120		12 5
Asn	Gly	Gly Glu	Me t Phe	Val Ala	Leu	Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val
	130			135		140
Arg	Gly-	-Lys Lys	Trh Lys	Lys Glu	Gin	Lys Thr Ala His Phe Leu Pro
145			150			155 160

Met Ala Ile Thr <2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 10:

(1) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 55 párů bází í3) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý D) topologie: neznámá j íii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

. CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55 (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 11:

Sj^i (i) charakteristiky sekvence:

/ ·» \ ZQ ηίτι'ι ' C) řetězec: neznámý ÍD) tooologie: neznámá ( íi) typ molekuly: cDNA ixi) popis sekvence: SEQ ID NO: CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTAT’ (2) informace pro sekvenci SEQ (i) charakteristiky sekvence:

OA) délka: 2 0 párů bází

ÍB) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: ne známá (ii) typ molekuly: cDNA ixi) popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

:

CCTCCTTCTA CAATCAAAT D NO: 12:

GAAGAAAACC ATTACAACAC (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 13: i) charakteristiky⁷ sekvence:

;A) délka: 26 párů bází ÍB) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá íii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA 26 (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 14:

(1) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 14: ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27 (2) informace pro sekvenci SEQ ID NO: 15:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: neznámý (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A

2)	^Ί f ! É *^T3 -3. 3 A jZ O 3 ? '·\.\^τ Γ¹ 3 S Ξ χΊ^ ’	1 íO
i)	charakteristiky sekvence:
A)	délka: 25 párů bází
B)	typ: nukleová kyselina
C i	řetězec: ne z námý
D)	topologie: neznáma
n;	í typ mziexuly: cDNA
Xi I	) popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

gg AAAACGGT TACAACACAT ATG CA

(2)	informace pro sekvenci SEQ	ID NO: 17
(i)	charakteristiky sekvence:
i.A)	délka: 26 párů bází
(B i	typ: nukleová kyselina
(C)
retezec: neznámy
(D)	topologie: neznámá
(ii)	typ molekuly: cDNA
i xi'	popis sekvence: SEQ· ID NO:	: 17 :
GTGT	TGTAAC CGTTTTCCAG AATTAG	26

Claims

Analog přirozeně se vyskytujícího proteinu z rodiny FGr, kde alespoň jedna aminokyselina v sekvenci tvořící smyčku •Asn-H:

•Tyr-Asn . T¹!-. v ΣβοθΠθίϊϊ proteinu je nctOrezeiis.

<?8o pomocí zbytku různých aminokyselin, které mají vyšší potenciál tvorby smyčky.
2. Analog podle nároku 1, kde řečený přirozeně se vyskytující protein je KGF.
3. Analog podle nároku 2, kde řečenou nahrazenou aminokyselinou je aminokyselina 116.
4. Analog podle nároku 3, kde řečená aminokyselina, která má vyšší potenciál tvorby smyčky, je vybrána ze skupiny obsahující glycin, prolin, tyrosin, asparagovou kyselinu, asparagin, serin, glutamovou kyselinu, threonin, lysin, glutamin, arginin, fenylalanin a tryptofan.
5. Analog podle nároku 4, kde řečenou aminokyselinou, která má vyšší potenciál tvorby smyčky, je glycin.
6. Analog podle nároku 5, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 10.
7. Analog podle nároku 6, v kterém alespoň jeden terminální aminokyselinový zbytek je deletován, i když si řečený analog v podstatě zachovává zvýšenou biologickou aktivitu.

3. Analog podle nároku 7, v kterém alespoň jeden cysteinový zbytek řečeného přirozeně se vyskytujícího proteinu je nahrazen pomocí zbytku neutrální aminokyseliny.
9. DNA sekvence, která kóduje analog podle nároku 1 pro prokaryotické nebo eukaryotické exprese.

DNA sekvence podle nároku
10, kde řečeným analogem je analog podle nároku 6.
11. Farmaceutická kompozice obsahující terapeuticky účinné množství analogu poclie naroxu ± a jeden neno více farmaceuticky vhodných přísad.
12. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, kde řečeným analogem je analog podle nároku 6.

Způsob léčení hlubokých ran, který zrnuje za terapeuticky účinného množství analogu podle nároku 1 dtěchto ran.

Způsob podle nároku 13, kde řečeným analogem je analog podle nároku 6.

Analog podle nároku 5, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 1.

Analog podle nároku 5, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 2.