NO20130069L - Modulatoriske forbindelser av P-selektin glykoprotein-ligand 1 - Google Patents

Abstract

P-Selektin Glykoprotein 1 (PSGL-1) på overflaten av T-celler eller naturlige dreper- (NK) celler, kan anvendes til å bevirke T-celle- eller N-celle-utarming og/eller til å indusere T-celle eller NK-celleapoptose. Forbindelsene og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å regulere uønskede T-celle- eller NK-celle-immunresponser ved tilstander så som autoimmunsykdommer, transplantatavstøtning og allergiske sykdommer.

Description

MODULATORISKE FORBINDELSER AV P-SELEKTIN GLYKOPROTEINLIGAND 1.

Beslektet søknad.

Denne søknaden krever prioritet fra US "provisional"-søknad nr.

60/310,196, innlevert 3. august 2001, idet innholdet av den er innlemmet her ved referanse.

Oppfinnelsens område.

Oppfinnelsen vedrører preparater og fremgangsmåter for å regulere immunresponser.

Bakgrunn for oppfinnelsen.

Reguleringen av uønskede immunresponser er kritisk ved behandling av sykdommer, så som autoimmunsykdommer, transplantatavstøtning, allergiske sykdommer og noen krefttyper. Aktiviteten til overdrevent aggressive T-celler kan reguleres ved immunosuppresjon eller ved induksjon av immunologisk toleranse. Toleranse er definert som en tilstand hvor immunsystemet gjøres ikke-responsivt overfor et antigen, mens immunosuppresjon, som reduserer immunresponsen overfor antigener, vanligvis krever kontinuerlig anvendelse av medisin. Ved organtransplantasjon spiller T-celler en essensiell rolle i immunresponsen overfor allo-antigener. Nåværende immunosuppressive regimer innebærer vanligvis anvendelse av kortikosteroid, cyklosporin eller rapamycin, som blokkerer transkripsjonen av IL-2,

en nøkkel-vekstfaktor for T-celler, eller hemmer som IL-2-avhengig proliferasjon. Imidlertid har flere monoklonale antistoffer, som enten fungerer som T-celle-undertrykkende ("depleting") midler (for eksempel CD3, CD4, CD8), eller som inhibitorer av de cytokin-signaliserende eller de ko-stimulerende veiene til T-celler (for eksempel CD25, B7-1, B7-2, CD152, CTLA4) vist effektivitet når det gjelder å

redusere forekomsten av avstøtning, med begrensede bivirkninger eller toksisitet. Noen av disse midlene er blitt vist å ha noen grad av suksess ved behandling av autoimmunsykdommer og forlengelse av transplantat-overlevelse.

Apoptose er av veldig mange antatt å være av vital betydning for opprett-holdelse av den korrekte funksjonen til immunsystemet, og en hovedmekanisme for å fjerne uønskede celler (Kabelitz et at., Immunol. Today 14:338-340 (1993); Raff, Nature: 356:397-399 (1992)). Forskjellige signaler som stammer enten fra innsiden eller utsiden av en celle influerer på liv og død til cellen. Antistoffer mot T-celleoverflatemolekyler, så som Fas (eller CD95, MW = 43 kD), TNFR2 (MW = 75 kD), CD2 (MW =45 kD) og CTLA-4 (MW = 33 kD), for å indusere apoptose av T-celler (Osborne, Curr. Opin. Immunol. 8:245-248 (1996); Lin et al., J. Immunol. 158:598-603 (1997); Zhang et at., Nature: 377:348-350 (1995); Lai et at., Eur. J. Immunol. 25:3243-3248 (1995); Mollereau et al., J. Immunol. 156:3184-3190 (1996); Gribben et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 92:811-815 (1995)). Forsøk på å anvende Fas- og TNFR2-molekyler for å regulere uønskede T-celler er blitt vanskeliggjort av det faktum at disse to molekylene blir uttrykt ikke bare i immunceller, men også i flere andre viktige organsystemer, så som leveren. Dette ekspresjonsmønsteret begrenser potensielt den terapeutiske anvendelsen av disse to antistoffene (Ogasawara et at., Nature 364:806-809 (1993); Pfeffer et at., Cell: 73:457-467 (1993); Engelmann etat., J. Biological Chemistry 265:14497-14504 (1990)).

Oppsummering av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen er basert på oppdagelsen av at T-celler kan utarmes og/eller bevirkes til å gjennomgå apoptose ved hjelp av T-celle-overflateantigenet P-

Setectin Glycoprotein Ligand-1 (PSGL-1). T-celle-undertrykkelse kan være spesielt nyttig for behandling av tilstander forbundet med en overdrevet eller uønsket T-cellemediert immunrespons, eller overdrevet etter uønsket T-celleproliferasjon. For eksempel kan undertrykkelse av T-celler forårsake reduksjon eller eliminering av uønsket T-celleaktivitet eller -proliferasjon forbundet med autoimmunsykdommer, transplantatavstøtning, allergiske sykdommer og/eller T-celle-avledede krefttyper. Oppfinnelsen omfatter fremgangsmåter for anvendelse av modulatorer av PSGL-1 - funsjon, for å forhindre etter redusere T-cellemediert immunrespons, så vel som fremgangsmåter for screening med henblikk på PSGL-1 -funksjon.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å hindre eller redusere en T-cellemediert immunrespons hos et individ. Fremgangsmåten innbefatter følgende trinn: utvelgelse av et individ diagnostisert til å ha, eller risikere å få, en tilstand kjennetegnet ved en overdrevet eller uønsket T-cellemediert immunrespons; og administrering til individet av en forbindelse som binder seg tit PSGL-1 på overflaten av en T-celle, hvor bindingen av forbindelsen til PSGL-1 på overflaten av T-cellen bevirker en signaltransduksjonsvei som resulterer i at T-cellen dør, og derved forhindre eller redusere en T-cellemediert immunrespons hos individet.

Forbindelsen som anvendes ved en slik fremgangsmåte kan innbefatte et antistoff eller antigen-bindende fragment derav, som spesifikt binder seg til PSGL-1.1 ett eksempel er forbindelsen et monoklonalt antistoff som spesifikt binder seg til PSGL-1. I én utførelsesform innbefatter fremgangsmåten et ytterligere trinn med å administrere et middel som binder seg til det monoklonale antistoffet og bevirker tverrbinding av mange PSGL-1-antigener på overflaten til T-cellen.

I en utførelsesform innbefatter fremgangsmåten å bevirke tverrbinding av mange PSGL-1-antigener på overflaten til T-cellen, hvor tverrbindingen bevirker signaltransduksjonsveien som resulterer i at T-cellen dør.

I ett eksempel innbefatter fremgangsmåten et trinn med utvelgelse av et individ som er diagnostisert til å ha en autoimmunsykdom. I et annet eksempel innbefatter fremgangsmåten et trinn med utvelgelse av et individ som har mottatt, eller forventes å motta, et allogen- eller xenogen-transplantat. I et annet eksempel innbefatter fremgangsmåten et trinn med utvelgelse av et individ som er diagnostisert til å ha en allergisk sykdom, i et annet eksempel innbefatter fremgangsmåten et trinn med utvelgelse av et individ som er diagnostisert til å ha en T-celle-krefttype.

I én utførelsesform er T-cellen en aktivert T-celle. I ett eksempel er T-cellen en CD4+-T-celle. I et annet eksempel er T-cellen en CD8+-T-celle.

I én utførelsesform innbefatter fremgangsmåten et trinn med påvisning av antallet T-celler i en første biologisk prøve tatt fra individet for administrering av forbindelsen, og sammenligning av resultatene med antallet T-celler i en andre biologisk prøve tatt fra individet etter administrering av forbindelsen.

I en annen utførelsesform innbefatter fremgangsmåten et trinn med å påvise en biologisk aktivitet til T-celler i en første biologisk prøve tatt fra individet for administrering av forbindelsen, og å sammenligne resultatene med den biologiske aktiviteten til T-celler i en andre biologisk prøve tatt fra individet etter administrering av forbindelsen.

I en utførelsesform resulterer administreringen I undertrykkelse av minst 20% CD3+-celler i perifert blod i individet. I noen utførelsesformer resulterer administreringen i undertrykkelse av minst 30%, 40%, 50%, eller mer, av CD3+cellene i perifert blod i individet.

I en utførelsesform bevirker antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet derav, død av minst 20% av CD3+-cellene i perifert blod i individet, etter å ha vært utsatt for antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet derav. I noen utførelsesformer bevirker administreringen i død av minst 30%, 40%, 50%, eller mer, av CD3+-cellene i perifert blod i individet. Celledød kan måles på et hvilket som helst tidspunkt, for eksempel én, to, tre, fire, fem, seks, syv, eller flere, dager etter å ha vært utsatt for antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet derav.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bevirke at en T-celle eller en naturlig dreper- (NK) celle dør. Fremgangsmåten innbefatter trinnene å: tilveiebringe en T-celle eller NK-celle som uttrykker PSGL-1 på dens celleoverflate; og å bringe T-cellen eller NK-cellen i kontakt med en forbindelse som binder seg til PSGL-1 på overflaten av T-cellen eller NK-cellen, hvor bindingen av forbindelsen til PSGL-1 på overflaten av T-cellen eller NK-cellen bevirker en signaltransduksjonsvei som resulterer i at T-cellen eller NK-cellen dør.

Forbindelsen som anvendes ved en slik fremgangsmåte kan innbefatte et antistoff eller et antigen-bindende fragment derav, som spesifikt binder seg til PSGL-1. I ett eksempel er forbindelsen et monoklonalt antistoff som spesifikt binder seg til PSGL-1. I én utførelsesform innbefatter fremgangsmåten et trinn med å bringe det monoklonale antistoffet I kontakt med et middel som binder seg til det monoklonale antistoffet og bevirker tverrbindingen av mange PSGL-1 -antigener på overflaten av T-cellen eller NK-cellen.

I én utførelsesform innbefatter fremgangsmåten et trinn med å bevirke tverrbinding av mange PSGL-1-antigener på overflaten av T-cellen eller NK-cellen, hvor tverrbindingen bevirker signaltransduksjonsveien som resulterer i at T-cellen eller NK-cellen dør.

I en utførelsesform er T-cellen en aktivert T-celle. I ett eksempel er T-cellen en CD4+-T-celle. I et annet eksempel er T-cellen en CD8+-T-celle.

I én utførelsesform innbefatter fremgangsmåten et trinn med å vurdere levedyktigheten til T-cellen eller NK-cellen etter å ha vært brakt i kontakt med forbindelsen.

I en utførelsesform innbefatter fremgangsmåten et trinn med å vurdere biologisk aktivitet til T-cellen eller NK-cellen etter å ha vært brakt i kontakt med forbindelsen.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for screening med henblikk på en modulator av PSGL-1-funksjonen. Fremgangsåten innbefatter trinnene: å tilveiebringe en celle som uttrykker PSGL-1 på overflaten av cellen; å bringe cellen i kontakt med en test-substans; og å måle levedyktigheten til cellen etter å ha bragt cellen i kontakt med test-substansen, for derved å avgjøre om test-substansen er en modulator av PSGL-1 -funksjon.

I en utførelsesform innbefatter fremgangsmåten trinnet med å påvise død

av cellen bevirket av test-substansen, for derved å avgjøre om test-substansen er en modulator av PSGL-1 -funksjon.

I en utførelsesform er test-substansen et antistoff eller et antigen-bindende fragment derav, som spesifikt binder seg til PSGL-1. I ett eksempel er test-substansen et monoklonalt antistoff som spesifikt binder seg til PSGL-1.

I én utførelsesform innbefatter fremgangsmåten trinnet med å bringe det monoklonale antistoffet i kontakt med et middel som binder seg til det monoklonale antistoffet og bevirker tverrbinding av mange PSGL-1-antigener på overflaten av cellen.

I en utførelsesform innbefatter fremgangsmåten trinnet med å bevirke tverrbinding av mange PSGL-1-antigener på overflaten av cellen, hvor tverrbindingen bevirker signaltransduksjonsveien som resulterer i at cellen dør.

I en utførelsesform er T-cellen en aktivert T-celle. I ett eksempel er T-cellen en CD4+-T-celle. I et annet eksempel er T-cellen en CD8+-T-celle.

I en utførelsesform innbefatter fremgangsmåten trinnet med å produsere

store mengder av test-substansen og formulere test-substansen i en farmasøytisk akseptabel bærer.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et sett inneholdende: en forbindelse som binder seg til PSGL-1 på overflaten til en T-celle, hvor bindingen av forbindelsen til PSGL-1 på overflaten av T-cellen bevirker en signaltransduksjonsvei som resulterer i at T-cellen dør; og instruksjoner for anvendelse av oppfinnelsen for å behandle autoimmunitet, transplantatavstøtning, en allergisk tilstand, eller en T-celle-krefttype.

I andre utførelsesformer innbefatter settet instruksjoner for anvendelse for å behandle en hvilken som helst sykdom eller forstyrrelse beskrevet her.

En fordel ved oppfinnelsen er at den tillater undertrykkelse av T-celler og/eller bevirkning av apoptose I T-celler, uten å forårsake en tilknyttet, uønsket eller skadelig immunrespons. For eksempel resulterer administreringen av et anti-PSGL-1-antistoff til et individ ikke i en uønsket forhøyelse av nivået av inflammatoriske cytokiner, så som IL-2 eller TNF-É.

En annen fordel ved oppfinnelsen er at den tillater målsøking etter et celle-overflateprotein, PSGL-1, hvis ekspresjon stort sett er begrenset til leukocytter, og spesielt T-celler og NK-celler. Derfor bevirker forbindelsene beskrevet her ikke betydelige nivåer av apoptose av andre celletyper, så som leverceller. Målsøkingen etter T-celler og NK-celler (en viktig CD3"-celletype som er involvert i transplantatavstøtning) for selektiv undertrykkelse, uten betydelig å bevirke livstruende, systemiske cytokinresponser og ødeleggelse av andre organsystemer, er et ønsket kjennetegn ved et immunosuppressivt middel.

Med mindre annet er definert, har alle tekniske og vitenskapelige

betegnelser anvendt her, samme betydning som det som vanligvis forstås av fagpersoner på området som denne oppfinnelsen tilhører. Selv om fremgangsmåter og materialer som er lik eller ekvivalent med dem som er beskrevet her kan anvendes i praksis eller testing av oppfinnelsen, er egnede fremgangsmåter og materialer beskrevet nedenfor. Alle publikasjoner, patentsøknader, patenter og andre referanser nevnt her, innlemmet ved referanse i sin helhet. I tilfelle av en konflikt med hensyn til terminologi, vil foreliggende beskrivelse gjelde. I tillegg er de beskrevne materialer og fremgangsmåter kun illustrerende, og er ikke ment å være begrensende.

Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den følgende, detaljerte beskrivelse og kravene.

Kort beskrivelse av tegningene.

Fig. 1 viser resultatene av et tidsforløpsforsøk som undersøkte når aktiverte T-celler erverver følsomhet overfor TAB4-(et anti-PSGL-1 -monoklonalt antistoff) medierte apoptosesignaler. Fig. 2 viser resultatene av celleoverflate-biotinylering og immunoutfelling av antigenet gjenkjent av TAB4-antisstoffet. Fig. 3 viser ekspresjonen av PSGL-l-antigenet på milt-CD4+-T-celler, CD8+-T-celler, CD19+-B-celler, og NK-celler. Fig. 4 viser ekspresjonen av PSGL-1-antigenet på CD4<+->, CD8<+->og CD4<+>8<+->og CD4"8"- thymocytter. Fig. 5 viser nivåene av IL-2 produsert i blandet lymfocytt-kultur ved anvendelse av miltceller isolert fra TAB4- (eller hamster lg-) behandlede Balb/c-mus som responderere og H2-ikke-tilpassede ("mismatched") C3H-miltceller som stimulator. Fig. 6 viser western blot-analyser som viser at (A) proteiner immunoutfelt med TAB4-antistoffet kan gjenkjennes av et kommersielt tilgjengelig anti-PSGL-1 - antistoff og (B) forhåndsklaring av T-cellelysat med anti-PSGL-1-antistoff kan undertrykke proteinene gjenkjent av TAB4. Fig. 7 viser prosentandelen av overlevende transplantater i C57BL/6-mus som fikk et hudtransplantat fra Balb/c-mus og ble behandlet med et anti-PSGL-1 antistoff (lukket diamant) eller et kontroll-antistoff (åpen firkant). Fig. 8 viser tidsforløpet for prosentandelen av apoptotiske T-celler etter behandling av aktiverte mononukleære celler fra perifert blod fra menneske, med et anti-humant PSGL-1 -antistoff. Fig. 9 viser forekomsten av diabetes hos autoimmune, ikke-fete, diabetiske (NOD) mus av hankjønn, som ble behandlet med anti-PSGL-1-antistoff (lukket firkant) eller et kontroll-antistoff (åpen firkant).

Detaljert beskrivelse.

Oppfinnelsen er rettet mot fremgangsmåter for modulering av T-celleaktivitet ved å modulere funksjonen av PSGL-1-molekyler som finnes på overflaten av en T-celle. Binding av PSGL-1 med preparater beskrevet her, kan forårsake undertrykkelse av T-celler og/eller bevirke T-celler til å gjennomgå apoptose. Disse preparatene er derfor nyttige som terapeutiske midler for regulering av immunrelaterte tilstander, så som autoimmunsykdommer, transplantatavstøtning, allergiske sykdommer og/eller T-celle-avledede krefttyper. Preparatene er også nyttige til å forårsake undertrykkelse av T-celler fra enhver biologisk prøve hvor nærvær eller aktivitet av T-celler ikke er ønsket.

PSGL- 1 - protein.

PSGL-1 er et celleoverflate-adhesjonsmolekyl som uttrykkes på nøytrofiler, T- og B-lymfocytter, NK-celler, monocytter, dendrittceller og primitive humane CD34-hematopoietiske progenitorceller. Gjennom dens evne til å interagere med selektiner, medierer PSGL-1 rullingen av leukocytter på endotelet og ekstravasering av leukocytter til inflammerte vev. PSGL-1-mediert binding av T-celler til E- og P-selektin, eller migrering, blir differensielt regulert. For eksempel tenkes det at tilsynekomsten av CLA- (kutant lymfocyttantigen) epitop bevirkes på T-celler som gjennomgår naiv- til hukommelsesovergang. Bare aktivert hjelper 1- men ikke hjelper 2-T-celler, uttrykker funksjonell PSGL-1 og gjør den i stand til migrering til det inflammerte området av huden.

PSGL-1 er et sialomucin som rna vre spesifikt sialylert, fukosylert og sulfatert for å binde P-selektin. PSGL-1-molekylet eksisterer i isoformer som er kjennetegnet ved forskjellig grad av glykosylering og sulfateringsseter på deres N-termini. Hvilende T- og B-celler i perifert blod, lymfoide cellelinjer og in vitroaktiverte T-celler i perifert blod, uttrykker likt nivå av PGSL-1. Allikevel oppviser bare aktiverte T-celler en funksjonell form av PSGL-1, og binder seg begjærlig til P-selektin. Slik aktiveringsavhengig bindingsaktivitet synes å være et resultat av en differensiell post-translasjons-modifisering, som antydet av forhøyede nivåer av alfa(1,3)fukosyltransferase-aktiviteter i aktiverte T-celler. PSGL-1-isoformer viser også differensiell affinitet til L-selektin og E-selektin. For eksempel kan humane T-celler som oppviser den CLA-positive isoformen forankre seg og rulle på både E- og P-selektin, mens T-celler som uttrykker PSGL-1 uten CLA-epitopen bare binder seg til P-selektin. Videre er binding av PSGL-1 til P-selektin avhengig av nærværet av det terminale dekapeptidet som inneholder tre tyrosinrester for sulfatering og en treoninrest for glykosylering.

Et PSGL-1 -protein kan fremstilles ved rekombinante fremgangsmåter

og/eller ved isolering av et nativt PSGL-1 -protein fra biologisk materiale. Et rekombinant PSGL-1-protein kan produseres i prokaryotiske eller eukaryotiske celler, enten in vitro eller in vivo. Nukleinsyrer som koder for PSGL-1 kan anvendes for rekombinant produksjon av proteinet (Se for eksempel GenBankO Accession NM_003006 for et eksempel på en nukleinsyre som koder for et PSGL-1 -polypeptid). Antistoffer rettet mot PSGL-1 er også velkjente og kan anvendes for rensing av antigenet (Se for eksempel Herron et al. (2000), Science, juni 2; 288(5471): 1653-56; WO 00/25808) og/eller anvendt i fremgangsmåter beskrevet her. PSGL-1 er videre beskrevet i referanser som innbefatter, men ikke er begrenset til, Sako et al. (1993), Cell 75:1179; Vachino et al. (1995), J. Biol. Chem. 270:21966; og Veidman et al. (1995), J. Biol. Chem., 270:16470.

For rekombinant produksjon av PSGL-1 kan samtidig ekspresjon av både PSGL-1 og dens modifiserende alfa(1,3)fukosyltransferase, Fuc-TVII, være nødvendig forden funksjonelle ekspresjon av PSGL-1. I tillegg, eller alternativt, kan rekombinant produksjon av PSGL-1 følges av ko-transfeksjon med en nukleinsyre som koder for PACE for å fjerne propeptidet og/eller en nukleinsyre som koder for tyrosin-sulfotransferase.

Et anti-PSGL-1-antistoff kan anvendes for å isolere og rense et PSGL-1-antigen fra biologisk materiale. Enhver celletype som uttrykker et PSG L-1-protein,

for eksempel T-celler avledet fra et individ eller en T-cellelinje, kan anvendes som en kilde for proteinet. Så snart det er renset, kan proteinet anvendes i mange forskjellige fremgangsmåter, som beskrevet her. Foreksempel kan det rensede PSGL-1-proteinet anvendes i en in vitro-screening av modulatorer av PSGL-1-funksjon på T-celler, eller som et immunogen for å fremstille antistoffer rettet mot proteinet.

I tillegg kan et PSGL-1-antigen renses ved anvendelse av en selektin-Fcfusjon, for eksempel en P-selektin-Fc-fusjon.

Anti- PSGL- 1 - antistoffer.

PSGL-1-polypeptider (eller immunogene fragmenter eller analoger derav) kan anvendes til å frembringe antistoffer som er nyttige i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Som beskrevet ovenfor, kan PSGL-1-polypeptider, eller peptidfragmenter derav, produseres ved rekombinante teknikker, eller syntetiseres ved anvendelse av faststoff-fase- syntesemetoder. De rekombinante PSG L-1 -polypeptidene, eller et peptidfragment derav, kan anvendes som et immunogen for å produsere anti-PSGL-1-antistoffer. I tillegg kan et anti-PSGL-1-antistoff, så som de TAB4-monoklonale antistoffene, anvendes til a rense et PSGL-1-polypeptid, for eksempel et PSGL-1-polypeptid i sin naturlige form, som deretter kan anvendes som et immunogen for å produsere ytterligere anti-PSGL-1 -antistoffer.

Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan være et monoklonalt, polyklonalt eller konstruert antistoff som spesifikt binder seg til et PSGL-1-polypeptid. Et antistoff som "spesifikt binder seg" til et spesielt antigen, for eksempel et PSGL-1-polypeptid, vil ikke i vesentlig grad gjenkjenne eller binde seg til andre molekyler i en prøve. Således tilveiebringer oppfinnelsen også fremgangsmåter for identifisering av en testforbindelse (for eksempel et antistoff) som binder seg til et polypeptid ifølge oppfinnelsen, ved å bringe polypeptidet i kontakt med en testforbindelse og avgjøre hvorvidt polypeptidet binder seg til testforbindelsen (for eksempel ved direkte påvisning av bindingen, påvisning av et konkurrent-molekyl som bryter bindingen av testforbindelsen til polypeptidet, og/etter påvisning av binding ved anvendelse av et assay med henblikk på mating av apoptose-bevirkende aktivitet).

Generelt kan PSGL-1-polypeptider kobles til et bærerprotein, så som KLH, blandet med et hjelpestoff, og injiseres i et vertspattedyr. Antistoffer produsert i dette dyret kan deretter renses ved hjelp av peptid-antigen-affinitetskromatografi.

Spesielt kan forskjellige vertsdyr bli immunisert ved injisering med et PSGL1-polypeptid, eller et antigen-fragment derav. Vanlig benyttede vertsdyr innbefatter kaniner, mus, marsvin og rotter. Forskjellige hjelpestoffer som kan anvendes for å øke den immunologiske responsen avhenger av vertsartene, og innbefatter Freund's hjelpestoff (komplett og ikke-komplett), mineralgeler så som aluminium-hydroksyd, overflateaktive substanser, så som lysotecitin, pluronsyrepolyoler, po-lyanioner, peptider, oljeemulsjoner, nøkkelhull-"limpet"-hemocyanin, og dinitrofenol. Potensielt nyttige human-hjelpestoffer innbefatter BCG (bacille CalmetteGuerin) og Corynebacterium parvum. Polyklonale antistoffer er heterogene populasjoner av antistoffmolekyler som finnes i sera til de immuniserte dyrene.

Antistoffer innen oppfinnelsen innbefatter derfor polyklonale antistoffer og, i tillegg, monoklonale antistoffer, humaniserte eller kimere antistoffer, enkeltkjede antistoffer, Fab-fragmenter, F(ab')2-fragmenter, og molekyler produsert ved anvendelse av Fab-ekspresjonsbibliotek.

Monoklonale antistoffer, som er homogene populasjoner av antistoffer mot et spesielt antigen, kan fremstilles ved anvendelse av PSGL-1-potypeptider beskrevet ovenfor, og standard hybridom-teknologi (se for eksempel Kohler et at., Nature 256:495

[1975]; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 [1976]; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292

[1976]; Hammerting et al., Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.

[1981]).

Spesielt kan monoklonale antistoffer oppnås ved hjelp av en hvilken som helst teknikk som sørger for produksjonen av antistoffmolekyler ved hjelp av kontinuerlige cellelinjer i kultur, så som beskrevet i Kohler et at., Nature 256:495 (1975), og US-patent nr. 4.376.110; human-B-cellehybridom-teknikken (Kosbor et al., Immunology Today 4:72 [1983]; Cole et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 80:2026 [1983]), og EBV-hybridom-teknikken (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., s. 77-96 [1983]). Slike antistoffer kan være av en hvilken som helst immunoglobulinklasse, innbefattende IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, og en hvilken som helst underklasse derav. Hybridomene som produserer mAb ifølge foreliggende oppfinnelse, kan dyrkes in vitro eller in vivo. Evnen til å produsere høye titere av mAb'er in vivo, gjør dette til en spesielt nyttig produksjonsmåte.

Så snart de er produsert, blir polyklonale eller monoklonale antistoffer testet med hensyn til spesifikk PSGL-1-gjenkjennelse ved hjelp av Western blot- eller immunoutfellingsanalyse ved hjelp av standard metoder, for eksempel som beskrevet i Ausubel et al., ovenfor. Antistoffer som spesifikt gjenkjenner og binder seg til PSGL-1 er nyttige i oppfinnelsen. Anti-PSGL-1-antistoffer som binder seg til PSGL-1-antigenet på overflaten av en T-celle, for eksempel en CD3+-celle, og bevirker undertrykkelse og/eller apoptose av T-celler I et individ, er spesielt nyttige.

Antistoffene kan for eksempel anvendes som del av et terapeutisk regime (for eksempel for å redusere eller eliminere en uønsket immunrespons, så som en T-cellemediert immunrespons, forbundet med tilstander så som autoimmune sykdommer, transplantatavstøtning, allergiske sykdommer og T-celle-avledede krefttyper). Antistoffer kan også anvendes i en screenings-assay for å måle evnen som en kandidatforbindelse har til å binde seg til PSGL-1.

I tillegg kan teknikker utviklet for produksjon av "kimere antistoffer" (Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 81:6851 [1984]; Neuberger et al. Nature 312:604

[1984]; Takeda et al. Nature 314:452 [1984]) ved spleising av genene fraet muse-antistoffmolekyl med passende antigen-spesifisitet sammen med gener fra et humant antistoffmolekyl med passende biologisk aktivitet, anvendes. Et kimert antistoff er et molekyl hvor forskjellige deler er avledet fra forskjellige dyrearter, så som slike som har et variabelt område avledet fra et murint monoklonalt antistoff og et humant immunoglobulin-konstant område.

Alternativt kan teknikker beskrevet for produksjon av enkeltkjede-antistoffer (US-patenter nr. 4.946.778, 4.946.778 og 4.704.692) tilpasses til å produsere enkeltkjede-antistoffer mot et PSGL-1-polypeptid, eller et fragment derav. Enkeltkjede-antistoffer blir dannet ved å knytte de tunge og lette kjedefragmentene på Fv-området via en aminosyrebro, noe som resulterer i et enkeltkjede-polypeptid.

Antistoff-fragmenter som gjenkjenner og binder seg til spesifikke epitoper, kan frembringes ved kjente teknikker. For eksempel innbefatter slike fragmenter, men er ikke begrenset til, F(ab')2-fragmenter som kan produseres ved pepsinspaltning av antistoffmolekylet, og Fab-fragmenter som kan frembringes ved å redusere disulfidbroene til F(ab')2-fragmenter. Alternativt kan Fab-ekspresjons- biblioteker bli konstruert (Huse et al. Science 246:1275 [1989]), for å tillate rask og enkel identifikasjon av monoklonale Fab-fragmenter med den ønskede spesifisitet.

Antistoffer kan humaniseres ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. For eksempel kan monoklonale antistoffer med en ønsket bindings-spesifisitet bli kommersielt humanisert (Scotgene, Scotland; Oxford Molecular, Palo Alto, Calif.). Fulistendig humane antistoffer, så som dem uttrykt i transgene dyr, er også trekk ved oppfinnelsen (Green et al. Nature Genetics 7:13 [1994]; og US-patenter nr. 5.545.806 09 5.569.825).

Screening- assayer for forbindelser som modulerer PSGL- 1 - funksjon.

Oppfinnelsen omfatter også fremgangsmåter for identifisering av forbindelser som interagerer med PSGL-1 (eller et domene på PSGL-1) innbefattende, men ikke begrenset til, forbindelser som bevirker T-celle-undertrykkelse og/eller Tcelle-apoptose ved binding til PSGL-1. Forbindelser som modulerer interaksjonen av PSGL-1 med transmembran, ekstracellulære eller intracellulære proteiner som regulerer PSGL-1-aktiviteten og forbindelser som modulerer PSGL-1-aktivitet, er også innbefattet.

Forbindelsene som kan ble screenet i henhold til oppfinnelsen innbefatter,

men er ikke begrenset til, peptider, antistoffer og fragmenter derav, og andre organiske forbindelser som binder seg til PSGL-1 09 modulerer en biologisk funksjon mediert av PSGL-1, som beskrevet her.

Slike forbindelser kan innbefatte, men er ikke begrenset til, peptider, så som for eksempel løselige peptider, innbefattende, men ikke begrenset til, medlemmer av tilfeldige peptidbiblioteker; (Lam et al. Nature 354:82 [1991]; Houghten et al. Nature 354:84 [1991]), og kombinatorisk kjemi-avledet, molekylært bibliotek laget av D- og/eller L-konfigurasjons-aminosyrer, fosfopeptider (innbefattende, men ikke begrenset til, medlemmer av tilfeldige eller delvis degenererte, direkte fosfopeptid-biblioteker; Songyang et al, Cell 72:767 [1993]), antistoffer (innbefattende, men ikke begrenset til, polyklonale, monoklonale, humaniserte, anti-idiotypiske, kimere eller enkeltkjede-antistoffer, og Fab, F(ab')2 og Fab-ekspresjonsbibliotekfragmenter, og epitop-bindingsfragmenter derav), og små organiske eller uorganiske molekyler.

Andre forbindelser som kan screenes I henhold til oppfinnelsen, innbefatter, men er ikke begrenset til, små, organiske molekyler som påvirker en aktivitet til PSGL-1-proteinet, som beskrevet her.

Datamaskin-modellerings- og -søketeknologi tillater identifisering av forbindelser, eller en forbedring av allerede identifiserte forbindelser, som kan modulere PSGL-1 -ekspresjon eller -aktivitet. Etter å ha identifisert en slik forbindelse eller preparat, er de aktive setene eller områdene identifisert. Slike aktive seter kan typisk være et bindingssete for en naturlig modulator av aktivitet. Det aktive setet kan identifiseres ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, innbefattende for eksempel, fra aminosyresekvensen til peptider, fra nukleotidsekvensene til nukleinsyrer, eller fra studie av komplekser av den relevante forbindelsen eller preparatet med dens naturlige ligand. I sistnevnte tilfelle kan kjemiske eller røntgenstråle-krystallografiske metoder anvendes til å finne det aktive sete, ved å finne hvor på faktoren modulatoren (eller liganden) finnes.

Selv om det er beskrevet ovenfor, med henvisning til utforming og frembringelse av forbindelser som kan forandre binding, kan man også screene biblioteker med kjente forbindelser, innbefattende naturlige produkter eller syntetiske kjemikalier, og biologisk aktive materialer, innbefattende proteiner, med henblikk på forbindelser som binder seg til et PSGL-1-protein og forårsaker T-celle-under-trykkelse og/eller bevirker T-celle-apoptose.

In vitro-systemer kan utformes til å identifisere forbindelser som er i stand til interagere med PSGL-1 (eller et domene på PSGL-1). Forbindelser identifisert kan være nyttige til for eksempel å modulere T-celleaktivitet, som beskrevet her, og kan således være nyttig for behandling av tilstander så som autoimmunsykdommer, transplantatavstøtning, allergiske sykdommer og T-celle-avledede krefttyper.

Prinsippet til assayene som anvendes til å identifisere forbindelser som binder seg til PSGL-1, innebærer å fremstille en reaksjonsblanding av PSGL-1 (eller et domene derav) og testforbindelsen, under betingelser og i en tid som er tilstrekkelig til å tillate de to bestanddelene å interagere og binde seg, og således danne et kompleks som kan fjernes og/eller påvises i reaksjonsblandingen. PSGL-1 -artene som anvendes kan variere, avhengig av målet for screeningsassayet. I noen situasjoner er det foretrukket å anvende et peptid som tilsvarer et domene på PSGL-1 fusjonert til et heterologt protein eller polypeptid som gir fordeler i assay-systemet (for eksempel merking, isolering av det resulterende komplekset etc), kan anvendes.

Screening-assayene kan utføres på mange forskjellige måter. For eksempel innebærer en fremgangsmåte for å utføre et slikt assay, å forankre PSGL-1 -protein, polypeptid, peptid eller fusjonsprotein eller test-substansen på en fast-stoff-fase, og påvise PSG L-1 /testforbindelse-komplekser forankret på faststofffasen på slutten av reaksjonen. I en utførelsesform av en slik fremgangsmåte, kan PSGL-1-reaktanten forankres på en faststoff-overflate, og testforbindelsen, som ikke er forankret, kan merkes, enten direkte eller indirekte.

I praksis kan mikrotiterplater bekvemt anvendes som fasttstoff-fase. Den forankrede bestanddelen kan immobiliseres ved ikke-kovalente eller kovalente tilknytninger. Ikke-kovalent tilknytning kan utføres ved ganske enkelt å belegge faststoff-overflaten med en løsning av proteinet, og tørking. Alternativt kan et immobilisert antistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff, spesifikt for proteinet som skal immobiliseres, anvendes til å forankre proteinet til faststoff-overflaten. Overflatene kan fremstilles på forhånd og lagres.

For å utføre assayet, blir den ikke-immobiliserte bestanddelen tilsatt til den

belagte overflaten som inneholder den forankrede bestanddelen. Etter at reaksjonen er fullført, blir uomsatte bestanddeler fjernet (for eksempel ved vasking), under betingelser som er slik at eventuelle komplekser dannet vil forbli immobilisert på faststoff-overflaten. Påvisningen av komplekser forankret på faststoffoverflaten kan utføres på mange mater. Når den tidligere ikke-immobiliserte bestanddelen blir forhåndsmerket, indikerer påvisningen av merkelapp immobilisert på overflaten at komplekser ble dannet. Når den tidligere ikke-immobiliserte bestanddelen ikke er forhåndsmerket, kan en indirekte merkelapp anvendes til å påvise komplekser forankret på overflaten, for eksempel ved anvendelse av et merket antistoff spesifikt for den tidligere ikke-immobiliserte bestanddelen (antistoffet kan, i sin tur, blir direkte merket eller indirekte merket med et merket anti-lg-antistoff).

Alternativt kan en reaksjon utføres i en væskefase, reaksjonsproduktene skilt fra uomsatte bestanddeler, og komplekser påvist, for eksempel ved anvendelse av et immobilisert antistoff spesifikt for PSGL-1 -protein, polypeptid, peptid eller fusjonsprotein eller testforbindelsen, for å forankre eventuelle komplekser dannet i løsning, og et merket antistoff spesifikt for den andre bestanddelen i det mulige komplekset, for å påvise forankrede komplekser.

Alternativt kan celle-baserte assayer anvendes til å identifisere forbindelser som interagerer med PSGL-1. For dette formal kan cellelinjer som uttrykker PSGL-1, eller cellelinjer som er blitt genetisk konstruert til å uttrykke PSGL-1, anvendes. Cellebaserte assayer er spesielt nyttige for å vurdere de funksjonelle virkningene av en forbindelse identifisert med en screen beskrevet her. For eksempel kan en forbindelse, så snart en forbindelse er identifisert basert på sin evne til å binde seg til et PSGL-1-protein, deretter bli testet for sin evne til for eksempel a bevirke T-celle-apoptose in vitra eller in vivo, eller undertrykke T-celler in vitro eller in vivo.

Farmasø<y>tiske preparater.

Gitt at et formål for foreliggende oppfinnelse er å endre en immunrespons hos et individ, er et farmasøytisk preparat som inneholder for eksempel antistoffer, små molekyler eller andre forbindelser som spesifikt binder PSGL-1-polypeptider,

også et trekk ved oppfinnelsen. I et foretrukket eksempel virker forbindelsen som en agonisttil PSGL-1.

Farmasøytiske preparater for anvendelse i henhold til foreliggende

oppfinnelse kan formuleres på en konvensjonell måte, ved å anvende en eller flere fysiologisk akseptable bærere eller eksipienter. Således kan forbindelsene og deres fysiologisk akseptable salter og solvater bli formulert for administrering ved hjelp av mange forskjellige administreringsmåter.

Forbindelsene kan formuleres for parenteral administrering ved injisering, for eksempel ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon. Formuleringer for injisering kan presenteres i en enhetsdoseform, for eksempel i ampuller eller i flerdose-beholdere, med et konserveringsmiddel tilsatt. Preparatene kan ha form av suspensjoner, løsninger, eller emulsjoner i olje eller vandige vehikler, og kan inneholde formuleringsmidler, så som oppslemmings-, stabiliserings- og/eller dispergeringsmidler. Alternativt kan den aktive ingrediensen være i pulverform for konstitusjonering med en egnet vehikkel, for eksempel sterilt, pyrogenfritt vann, for anvendelse.

Fremgangsmåter for å regulere en T- cellemediert immunrespons og utarme T- cellepopulasloner.

Forbindelser, så som dem beskrevet i detalj i screenings-assayene beskrevet her kan være nyttige, for eksempel til å modulere en biologisk funksjon mediert av et PSGL-1 -polypeptid og/eller for behandling av forstyrrelser forbundet med en overdrevet eller uønsket immunrespons, for eksempel en T-cellemediert immunrespons. Disse forbindelsene innbefatter, men er ikke begrenset til, peptider, antistoffer og fragmenter derav, og andre organiske forbindelser som binder seg til PSGL-1 på overflaten av en T-celle, og bevirke en signaltransduksjonsvei som resulterer i at T-cellen dør. Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen innbefatter eventuelt tilsetning av et tverrbindingsmiddel som bevirker tverrbinding av PSGL-1 på overflaten til en celle. Forbindelsene beskrevet her kan anvendes i ethvert tilfelle hvor undertrykkelse eller eliminering av T-celleaktivitet er ønsket. Spesielt nyttige tilstander som kan behandles med forbindelsene ifølge oppfinnelsen innbefatter autoimmunsykdommer, transplantatavstøtning, allergiske sykdommer og T-celle-avledede krefttyper.

Eksempler på tilstander som kan behandles med anti-PSGL-1-forbindelsene beskrevet her innbefatter, men er ikke begrenset til, diabetes mellitus, artritt (innbefattende reumatoid artritt, juvenil reumatoid artritt, osteoartritt og psorisasis-artritt), multippel skierose, encefalomyelitt, myastenia gravis, systemisk lupus erytematosus, autoimmun-thyreoiditt, dermatitt (innbefattende atopisk dermatitt og eksematøs dermatitt), psoriasis, Sjogrens syndrom, Crohns sykdom, aftøs ulcer, iritt, konjunktivitt, keratokonjunktivitt, type I diabetes, innflammatoriske tarm-sykdommer, ulerøs kolitt, astma, allergisk astma, kutan lupus erytematosus, skleroderma, vaginitt, proktitt, medikamentelt utslett, reverserende lepra- ("leprosy reversal") reaksjoner, erytema nodosum leprosum, autoimmun uveitt, allergisk encefalomyelitt, akutt nekrotiserende hemorragisk encefalopati, idopatisk bilateral progressiv sensorinevralt hørselstap, aplastisk anemi, "pure red ceN"-anemi, idiopatisk trombocytopeni, polykondritt, Wegeners granulomatose, kronisk aktiv hepatitt, Stevens-Johnson-syndrom, idiopatisk sprue, lichen planus, Graves sykdom, sarkoidose, primær bililær cirrhose, uveitt posterior, interstitiell lungefibrase, transplantat-mot-vert-sykdom, transpiantasjon (innbefattende transplantasjon ved anvendelse av allogent eller xenogent vev), så som ben margstransplantasjon, levertransplantasjon, eller transplantasjon av et hvilket som helst organ eller vev, allergier, så som atopisk allergi, AIDS, og T-celleneoplasma, så som leukemier og/eller lymfomer.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å utarme T-celler fra en cellepopulasjon, enten in vitra eller in vivo. For eksempel kan en biologisk prøve tatt fra et individ få undertrykket T-celler in vitro, ved å bringe prøven i kontakt med en anti-PSGL-1-forbindelse beskrevet her, eventuelt sammen med et tverrbindingsmiddel. Denne fremgangsmåten kan være nyttig for eksempel ved å tillate beriking av ikke-T-celler i en cellepopulasjon, så vel som ved å redusere eller eliminere T-celleaktivitet fra en cellepopulasjon.

Det følgende er eksempler på praksis av oppfinnelsen. De skal ikke oppfattes som begrensende for rammen for oppfinnelsen på noen som helst måte.

Eksempler

Eksempel 1: Fremstilling av et monoklonalt anti- T- celle- apoptose- induser-ende protein- (" TAI F") antistoff.

Et TAIP-spesifikt, monoklonalt antistoff ble frembragt ved å anvende de veikjente cellefusjonsmetodene ifølge Kohler og Milstein ((1976), European Jour-nal of Immunology 6:511-519) til 6 fremstille et hybridom som utskiller ønskede antistaffer. Antistoff-praduserende celler fra en hamster injisert med Concanovalin A- (Con A) aktiverte Balbtc-T-celler fra milt ble fusjonert med en myeloma-celle-linje for å danne et antistoff-utskillende hybridom. De to populasjonscellene ble fusjonenert med polyetylenglykol, og de resulterende antistoff-parduserende cellene ble klonet og propagert ved hjelp av standard vevskulturmetoder. Ett hybridom frembragt i henhold til disse fremgangsmåtene utskilte et monoklonalt antistoff, betegnet TAB4, som var i stand til å bevirke T-celle-apoptose in vitro og undertrykke T-celler in vivo. Proteinet gjenkjent av TAB4 ble betegnet T-celle-apoptose-induserende protein (TAIP).

C57BL/6J (136) og BALB/c-mus ble kjøpt fra Jackson lab. (Bar Harbor, ME). Syriske hamstere ble kjøpt fra Animal Care Facility, National Taiwan University Medical College.

Konsentrert dyrknings-supernatant av TAB4-hybridomet ble sentrifugert ved 20.000 x g i 10 minutter og supernatanten ble fortynnet i et 1: 1 -forhold med bindingsbufferen (0,1 M natriumacetat, pH 5,0). En protein G-kolonne (tilnærmet 1 ml sjiktvolum) ble vasket tre ganger med 3-5 ml av bindingsbufferen. Den klarede dyrknings-supernatanten ble påsatt protein G-kolonnen og gjennomstrømningen ble oppsamlet og påsatt på kolonnen igjen. Kolonnen ble vasket med 6-10 ml av bindingsbufferen og det bundne antistoffet ble eluert fra kolonnen med 5 ml av elueringsbufferen (0,1 M glycin-HCI, pH 2,8). Hver fraksjon inneholdt 1 ml av det eluerte antistoffet og den eluerte fraksjonen ble justert til nøytral pH ved å blande hver 1 ml fraksjon med 50 mikroliter av 1 M Tris-HCI, pH 7,5. Fraksjoner inneholdende antistoffet ble slått sammen og dialysert mot 2 liter PBS, pH 7,4, tre ganger etter tre timer for hver dialyse. Protein-konsentrasjon i antistoffprøvene ble bestemt med fremgangsmåten beskrevet av Bradford, ved anvendelse av Bio-RAD Protein Assay (BIO-Rad, Hercules, CA).

Eksempel 2: Fremstillinp av en muse- miltcellesuspenslon op aktiverinp op beriking av T- celler.

Muse-milt ble nedsenket i en 8 ml Hanks balanserte saltløsning (HBSS), forsiktig finhakket med et sterilt dekkglass, overført til et 15 ml sentrifugerar (Costar), og sentrifugert ved 200 x g i 5 minutter. Supernatanten ble kastet og cellepelleten ble gjenoppslemmet i restbufferen ved forsiktig å banke på veggen. De forurensende, røde blodcellene (RBC) ble lysert ved tilsetning av 1 ml RBC-lysebuffer (0,6 M NH4CI, 0,17 M Iris-base, pH 7,65), fulgt av en 2 minutters inkubasjon ved romtemperatur og rask behandling med 9 ml HBSS. Cellene ble pelletert ved 200 x g i 5 minutter, vasket to ganger og gjenoppslemmet i RPMI-medium. Konsentrasjonen av, og levedyktigheten til, cellene i blandingen ble bestemt med et hemocytometer (Cambridge Scientific Inc.) og Trypan blå-eksklusjon.

Miltcellene ble justert til en endelig konsentrasjon på 3 x 10<6>/ml med RPMI-medium og Concanovalin A ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 2 mikro gram/ml for å aktivere T-cellene. Cellesuspensjonen ble overført til en 6-brønners dyrkningsplate (5 ml/brønn) eller en 10 cm dyrkningsskål (10 ml/skål) og inkubert ved 37°C, 5% C02, I 48 timer for hosting. De aktiverte miltcellene, innbefattende aktiverte T-celler, ble gjenoppslemmet i 5 ml HBSS og forsiktig lagt på toppen av en 5 ml 55% pute av Percoll-løsning i et sentrifugerør. Forsiktighet ble utvist for ikke å forstyrre de adskilte lagene. Cellene ble sentrifugert ved 1.900 x g i 13 minutter ved 25°C uten bremsen. De berikede T-cellene ble oppsamlet fra grense-flaten mellom de to lagene, vasket to ganger med HBSS, og var klar for forsøk.

Eksempel 3: Apoptose av aktiverte T- celler.

Aktiverte T-celler (Se eksempel 2) ble gjenoppslemmet til en endelig konsentrasjon på 5 x 10<5>celler/ml i RPMI-medium inneholdende 5 ng/ml av IL-2, og behandlet med kontroll-1 g, TAB4, eller anti-CD3, I henhold til betingelsene vist i tabell 1.

Etter en inkubasjonsperiode på 18-24 timer ble graden av apoptose i hver kultur bestemt ved anvendelse av 7-AAD-apoptose-assayet. De behandlede celllene ble overført til FACS-rør (Falcon), vasket to ganger med iskald FACS-løsning (1% kalvefosterserum, 0,05% natriumazid I PBS), pelletert ved 200 x g ved 4°C. Cellene ble gjenoppslemmet i iskald FACS-løsning til en endelig konsentrasjon på 1-2 x 10<7>celler/ml. For farging ble 0,1 ml av de gjenoppslemmede cellene blandet med 7-AAD til en endelig konsentrasjon på 2 ug/ml og deretter inkubert ved 4°C i mørket i 20 minutter. Til slutt ble de fargede cellene vasket to ganger med iskald FACS-løsning, gjenoppslemmet i 0,5 ml FACS-løsning og analysert med BD LSR-strømningscytometer (Beckton Dickison).

Fig. 1 viser resultatene av et representativt tidsforløp-forsøk som undersøk-te når aktiverte T-celler oppnår følsomhet overfor TAB4- (anti-TAlP) medierte apoptosesignaler. Muse-splenocytter ble aktivert med Con-A og opprettholdt i IL-2-holdig medium. Aktiverte T-celler ble høstet, gjenoppslemmet og utfordret med monoklonalt TAB4-antistoff eller kontroll-hamster-IgG i nærvær av anti-hamster-IgG-antistoff som tverrbindingsmiddel. Evnen som TAIP-tverrbindingsmiddel har til å bevirke et lavt nivå (6,5%) av apoptotisk celledød, var synlig på dag en. Imidlertid økte graden av TAB4-bevirket apoptose fra 17% på dag 2, toppet seg på 52% på dag 4, og sank til 44% på dag 6. Kontroll-hamster-IgG bevirket ikke spesifikk apoptotisk T-celledød, sommenlignet med kulturene som fikk tilført bare IL-2. Anti-CD3 (som positiv kontroll) induserte apoptose i 38% av T-cellene etter 48 timer med aktivering (data ikke vist).

Eksempel 4: Ekspresjon av TAIP- antigenet i forskjellige vev.

Celler ble vasket to ganger med iskald FACS-løsning (1 % kalvefosterserum, 0,05% natriumazid i PBS) og sentrifugert ved 200 x g ved 4°C i et FACS-rør (Falcon). Cellene ble gjenoppslemmet i iskald FACS-løsning til en endelig konsentrasjon på 1 x 10<7>celler/ml og en 0,1 ml alikvot av de gjenoppslemmede cellene i et FACS-rør (Falcon) ble anvendt for hvert assay. For overflatefarging ble monoklonalt TAB4-antistoff eller en kontroll-hamster-lg med en endelig konsentrasjon på 2 ug/ml tilsatt til cellene, og blandingene ble inkubert ved 4°C i 30 minutter i mørket. Cellene ble vasket en gang med iskald FACS og deretter farget med: (1) for miltceller: cychrome-konjugert anti-CD3-antistoff (2 ug/ml), FITC-konjugert antihamster-lg, og PE-konjugert-anti-CD8/CD4/CD19/CD1 1b/pan-NK/1-A/l-E/Mac-3- antistoff (2 ug/ml) i 100 ul iskald FACS-løsning; og (2) for thymus-celler, FITC-konjugert anti-hamster-lg, PE-konjugert anti-CD8, og cychrome-konjugerte antiCD4-antistoffer (2 ug/ml) i 100 ul iskald FACS-løsning. Reaksjonen ble utført ved 4°C I 30 minutter i mørket. Til slutt ble de fargede cellene vasket to ganger med iskald FACS-løsning, gjenoppslemmet i 1 ml FACS-høsning og analysert med BD LSR-strømningscytometer (Becton Dickison).

Figurene 3 og 4 viser ved FACS-analyse fordelingen av TAIP-antigen på de forskjellige sub-populasjonene av splenocytter og thymocytter. Som vist på figur 3, uttrykte CD19<*>B-celler lave, men påvisbare, mengder av TA1 P-proteiner på overflaten. Betydelig større mengder av TAIP-proteiner ble påvist på CD3<*->T-celler og en fraksjon av NK-celler. De fleste av CD4-, CD8- og CD48-thymusT-cellene uttrykte betydelige mengder av TAIP-proteiner. I motsetning til dette ble TAIP-proteinene uttrykt bare på en liten populasjon av CD48-thymus-T-celler (figur4).

Vev fra B6- og BALB/c-mus, innbefattende hjerne, thymus, hjerte, lunge, lever, mage, nyre, milt og hud, ble oppsamlet, fiksert i10% formaldehyd over natten ved romtemperatur, og innkapslet i paraffinblokker. Vevssnitt, i en tykkelse på 4 um, ble fremstilt av paraffinblokken med Leica RM2135 mikrotom, spredt i vann på 45°C, og lagt på et belagt objektglass. Objektglassene ble tørket ved 37°C og var klare for påfølgende forsøk.

Objektglass inneholdende vevsparaffinsnittene ble avvokset og tørket ved hjelp av en xylen-100% etanol-serie i henhold til standard protokoll og ble til slutt oppbevart i 100% etanol. Snittene ble fuktet igjen ved hjelp av en 100% etanol-90% etanol-85% etanol-70% etanol-PBS-serie-inkubasjon i henhold til standard protokoll, til en endelig PBS-løsning. De følgende reaksjonene ble alle utført i en fuktet boks. Ikke-spesifikk binding ble blokkert ved inkubering av vevssnittene i blokkeringsbuffer (1 % normalt geiteserum) i 1 time ved romtemperatur (eller 4°C over natten). Blokkeringsbufferen ble fjernet og TAB4 eller normalt hamster-lg (1 :200-fortynning) ble tilsatt til snittene og inkubering fortsatt i enda en time ved omtemperatur (eller 4°C over natten). Snittene ble vasket to ganger i PBS, i 5 minutter hver gang, for å fjerne det primære antistoffet, reagert med 1:250 fortynnet alkalisk fosfatase-konjugert geite-anti-hamster-lg, og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Snittene ble igjen vasket to ganger med PBS, 5 minutter hver gang, for å fjerne antistoff-enzymkonjugatet, og fargereaksjonen ble utviklet med BCIP/NBT-substratløsning ved romtemperatur i 30 minutter i mørket. Snittene ble vasket igjen med PBS for å fjerne overskudd av enzymsubstrat, dehydrert ved hjelp av PBS-etanol-xylen-serien, og montert for mikroskopi.

Resultatene indikerte at TAIP-protein-ekspresjonen ble påvist bare i vev som stammet fra benmarg, men ikke på resten av vevene som ble testet.

Eksempel 5: Celleoverflate- biotinylering og immunoutfelling avTAIP-antigenet. 5 x 107 RLcJl- eller NIH-3T3-celler ble overflate-biotinylert i 1 ml PBS inneholdende 0,5 mg/ml Sulfo-NHS-biotin (Pierce) i 30 minutter på is. Reaksjonen ble avsluttet ved å inkubere cellene med 0,5 ml Dulbecco's modifiserte Eagle's-medium (Life Technologies, Inc.) i 10 minutter på is. Celler ble vasket med 1 ml av Dulbecco's modifiserte Eagle's-medium en gang med 1ml fosfat-bufret salt-oppløsning to ganger.

Merkede celler ble lysert ved en densitet på 5,0 x 10<7>celler/ml i kald lysebuffer (1% Triton X- 100, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 160 mM NaCI, 1 mM CaCI2) inneholdende komplett protease-inhibitor-cocktail (Roche) i 15 minutter, og uløselig materiale ble pelletert ved 10.000 x g i 10 minutter; disse og alle påfølgende trinn ble utført ved 4°C. For immunoutfelling ble lysatet forhånds-inkubert i 30 minutter med 50 ul pakket protein G-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) for å fjerne ikke-spesifikt bindende proteiner. Perler ble pelletert, og alikvoter av supernatanten (rutinemessig tilsvarende 5,0 x 10<7>celler) ble inkubert med 20 ul protein G-Sepharose forhandspåsatt med 10 ug mAb TAB4 eller IgG fra normalt hamsterserum. Etter inkubering i 4 timer ved 4°C ble harpiksen vasket fire ganger med vaskebuffer (0,05% Triton X-100, 50 mM Tris-HCI, pH 8,5, 400 mM NaCI, 1 med mer CaCb, 1 mg/ml ovalbumin), to ganger med en lignende vaskebuffer, inneholdende 250 mM istedenfor 400 mM NaCI. Proteiner spesifikt bundet til TAB4 ble eluert med 50 ul 1xSDS-prøvebuffer. Eluerte proteiner ble skilt med 8% SIDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembran (Millipore). Filtre ble analysert med henblikk på biotinylerte proteiner med peroksydase-konjugert Avidin (PharMingen) og utviklet med Chemiluminscens-reagens (NEN™ Life Science Products).

Som vist på figur 2, ble et biotinylert overflateprotein med en molekylvekt på tilnærmet 120-kD identifisert ved hjelp av TAB4 i RLn1-celler (TAIP<+->celler), men ikke i 3T3-celler (TAIP"-celler). I motsetning til dette kunne protein G-sepharose belagt med normalt hamsterserum ikke finne igjen ("retrieve") dette 120-kDa-proteinet. Disse resultatene antyder at dette 120-kDa-proteinet er antigenet som blir gjenkjent av monoklonalt antistoff TAB4 på celleoverflaten til T-celler.

Eksempel 6: Warming av T- celler in vivo.

For å undersøke virkningen av TAB4 på populasjoner av T-celler og andre celler in vivo, fikk mus injisert 300 ug TAB4 eller kontroll-hamster-lg intraperitonealt og, på dag 4, ble splenocytter, thymocytter og mononukleære celler fra perifert blod høstet for den totale celletelling og for analyse av celleovenflatemarkører ved hjelp av FACS.

For FACS-assayer ble cellene fiksert med 2% påraformaldehyd ved 4°C i 20 minutter, vasket to ganger og gjenoppslemmet i iskald FACS-løsning til en endelig konsentrasjon på 1 x 10<7>celler/ml. En 100 ul alikvot av de gjenoppslemmede cellene i et FACS-rør (Falcon) ble anvendt for hvert assay. TAB4 eller kontrollhamster-lg i en endelig konsentrasjon på 2 ug/ml ble tilsatt til cellene, og blandingen ble inkubert ved 4°C i 30 minutter i mørket. Cellene ble vasket en gang med iskald FACS og reagert med: (1) for miltceller: cychrome-konjugert anti-CD3antistoff (2 ug/ml), FITC-konjugert anti-hamster-lg og PE-konjugert anti-CD8/CD4/CD19/CD11b/pan-NM-A/1-E/Mac-3-antistoff (2 ug/ml) i

100 ul iskald FACS-løsning; og (2) for thymus-celler: FITC-konjugert anti-hamster-lg, PE-konjugert anti-CD8, og cychnome-konjugerte anti-CD4-antistoffer (2 ug/ml) i100 ul iskald FACS-løsning. Reaksjonen ble utført ved 4°C i 30 minutter i mørket. Til slutt ble de fargede cellene vasket to ganger med iskald FACS-løsning, gjenoppslemmet i 1.000 ul FACS-løsning og analysert med BD LSR-strømningscytometer (Beckton Dickison).

Fire dager etter injisering sank prosentandelene av CD3-T-celler i leukocytter fra perifert blod (PBL)fra 36,7% I kontrollmus til 4,1% I TAB4-behandlede mus (tabell 2). TAB4-behandling forårsaket en lett reduksjon i det totale antall splenocytter. Imidlertid var det i TAB4-behandlede mus en 62% reduksjon i antall CD3<+->T-celler, en 50% reduksjon i antall NK-celler, og en lett økning i det totale antall CD19<+->B-celler. Det totale antall thymocyttergjenvunnet fra TAB4-behandlede mus var bare 48% av nivået sett i kontroll (52% redusert). Videre, unntatt for CD4+-T-celler, ble alle andre CD8+-, CD4+CD8+- og CD4-CD8- - T-celler redusert, idet CD4+CD8+-subpopulasjonen en den som er aller mest påvirket (64,7% reduksjon).

Eksemel 7: Anti- TAIP- antistoff bevirker ikke IL- 2- eller TNF- a- sekresion.

Balb/c-mus (H-2d) fikk injisert 300 mikrogram TAB4 eller kontroll-hamster-lg intraperitonealt. Splenocytter ble isolert 7 dager etter injeksjon, og anvendt som respondere i kultur med mitomycin C-behandlede C3H- (H-2k) splenocytter (som stimulatorer). Tre dager senere ble dyrkningssupernatantene høstet og IL-2-innholdet ble malt ved hjelp av et ELISA-sett (PharMingen). Som vist på figur 5 ble IL-2-produksjonen undertrykket i responderceller som stammet fra TAB4-behandlede mus, sammenlignet med den for kontrollmus. Plasmanivåene av IL-2 og TN F-a ble også analysert, og ingen betydelig forskjell ble bemerket for nivåene av IL-2 (eller TN F-a) i seraene fra kontroll- og de TAB4-behandlede musene. Siden produksjon av IL-2 er sentralt for aktiviteten til T-celler, viser resultatene at et TAIP-spesifikt antistoff, så som TAB4, kan anvendes in vivo for å manipulere T-celler og kontrollere uønskede T-cellemedierte immunresponser, så som dem forbundet med autoimmunsykdommer og transplantatavstøtning.

Eksempel 8: Anvendelse av et anti- TAIP- antistoff for å forhindre transplan-tatavstøtning.

Mus (fra Jackson Laboratory) på 8 til 12 ukers alder, ble anestetisert med Acepromazinmaleat (Fermenta Animal Health Co, Kansas City, MO). For hud-transplantering fikk ikke-thymektomiserte C57BL/6-mottagermus (H-2<b>)injisert 500 ug TAB4 eller isotyp-kontrollantistoffer intraperitonealt syv dager for hudtransplan-teringskirurgi. Syv dager senere ble en lateral flanke av hud fra fullstendig allogene ikke-tilpassede Balb/cj-mus (H-2<d>)transplantert på den laterale flanken til de antistoff-forhåndsbehandlede C57BL/6-musene. Syv dager etter transplantasjon fikk musene igjen injisert 500 ug TAB4 eller isotype-kontrollantistoff. Musene ble overvåket hverdag etter transplantasjonen. Transplantatene ble betraktet som avstøtt når 50% donorhud var nekrotisk. Prosenten av transplantatoverlevelse er vist på figur 7 (n=8). Dataene viste at TAB4-antistoffbehandlinger forlenget overlevelsen av de allogene hudtransplantatene.

Eksempel 9: Identifisering av TAIP som PSGL- 1.

P-selektin-glykoproteinligand-1 (PSGL-1), også benevnt CD162, er den viktigste P-selektinliganden uttrykt på leukocytter, innbefattende T-celler (Sako et al. (1993) Cell 75:1179; Vachino et al. (1995), J. Biol. Chem. 270:21966; Veldman et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:16470). Biokjemiske karakteristikker for TAIP, sa som dets molekylvekt og dets tendens til dimerisering, antyder muligheten for at TAB4 kan være analog med PSGL-1. For å undersøke slektskapet mellom disse to antigenene, ble følgende undersøkt: 1) hvorvidt antigenet utfelt av TAB4 kan gjenkjennes av et kommersielt tilgjengelig anti-PSGLI-antistoff; og 2) hvorvidt et anti-PSGL1-antistoff kan undertrykke TAB4 fra cellelysatet.

RLc?1-T-celler ble lysert ved en densitet på 1,0 x 10<8>celler/ml i lysebuffer

(1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 160 mM NaCI, 1 mM CaCI2)

inneholdende komplett protease-inhibitor-cocktail i 1 time, og uløselig materiale ble pelletert ved 10.000 x g i 10 minutter. Disse og alle påfølgende trinn ble utført ved 4°C. Lysatet, som tiisvarte 5,0 x 107 celler, ble inkubert med 20 ul protein G-Sepharose forhåndspåsatt med 10 ug anti-PSGL-1 mAb (klon 2PH1, PharMingen, San Diego, CA), anti-TAlP mAb, TAB4, eller IgG fra normalt hamsterserum. Etter inkubering i 4 timer ved 4°C ble perlene vasket fem ganger med vaskebuffer (0,05% Triton X100, 50 mM Tris-HCI, pH 8,5, 400 mM NaCI, 1 mM CaCI2, 1 mg/ml ovalbumin), og to ganger med en lignende vaskebuffer, inneholdende 250 mM istedenfor 400 mM NaCI. Bundne proteiner ble eluert med 40 ul 1xSDS-prøvebuffer. Eluerte proteiner ble skilt med 6% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. Membranene ble immunoblottet med anti-PSGL-1 mAb, og avslørt med peroksidasekonjugert anti-rotte-IgG (H+L) fra geit, fulgt av kjemiluminescens (Renaissance, NEN).

Overflate-biotinylert RL<3*1 -T-celler ble lysert ved en densitet på 1,0 x 10<8>celler/ml i lysebuffer. Celle-ekstrakten ble inkubert med 20 ug antistoff bundet til 40 ul protein G-Sepharose ved 4°C over natten. Undertrykkelser ble gjort med anti-PSGL-1 mAb (2PH1) eller kontroll-rotte-IgG, med TAB4 eller normalt hamsterserum som kontroll. Undertrykkede lysater ble videre utsatt for å utføre immunoutfelling med henholdsvis TAB4 eller anti-PSGL-1 mAb. Immunoutfellinger ble adskilt på 6% SDS-polyakrylamidgel og påvist ved hjelp av fluorografi. Som vist på figur 6, kan anti-PSGL-1-antistoff undertrykke TAIP-protein fra T-cellelysater. I tillegg kan proteiner immunoutfelt med anti-TAIP-antistoff (TAB4) bli gjenkjent av anti-PSGL-1 -antistoff med Western-analyse.

Eksempel 10: Induksjon av apoptose i humane T- celler med et anti- PSGL1 - antistoff.

For å bestemme den rollen som PSGL-1- spiller ved apoptose av humane T-celler, ble det utført tidsforløp-forsøk for å undersøke når aktiverte humane T-celler oppnår sensitivitet overfor PSG L-1 -medierte apoptosesignaler. Humane T-celler ble stimulert med fytohemagglutinin- (PHA) mitogen og videre ekspandert i IL-2-inneholdende medium. Aktiverte T-celler ble høstet og deretter utfordret med anti-PSGL-1 i nærvær av IL-2 og tverrbindings-antistoffer.

Humant perifert blod ble tatt fra friske voksne, heparinisert og beriket for mononuklere celler fra perifert blod (PBMC), basert på differensial-densitet ved anvendelse av Ficoll-Paque Plus (Pharmacia Biotech). PBMC ble aktivert med 1% PHA (Life Technologies, GibcoBRL) i 48 timer og deretter opprettholdt i rekombinant humant IL-2 (5 ng/ml) under assay-perioden. For å vurdere apoptose-induserende evne et anti-humant PSGL-1-antistoff, ble de aktiverte cellene behandlet med: (1) 1 ug/ml av anti-PSGL-1-antistoff-klonen KPL-1 (BD PharMingen), pluss tverrbindings-kanin-anti-muse-lg (0,5 ug/ml) (Jackson ImmunoResearch Laboratories); (2) isotype-kontroll-renset muse-lg pluss tverrbindings-kanin-anti-muse-lg; eller (3) tverrbindings-kanin-anti-muse-lg alene. Etter seks timer med behandling ble prosentandelen av tidlige apoptotiske celler bestemt ved hjelp av FACS, farging med anti-Annexin V (BD PharMingen) og P1 (Sigma).

Som vist på figur 8 ble signalisering trigget av PSGL-1 ved anvendelse av et anti-PSGL-1-antistoff pluss det tverrbindings-triggede, betydelige nivå av apoptose i PHA-aktivert humant PBMC (hovedsakelig T-celler). Prosentandelen av apoptotiske celler økte fra 8,5% på dag 3 til 24% på dag 8, i anti-PSGL1-behandlede kulturer. Verken isotop-tilpasset kontroll eller tverrbindings-antistoffene alene, hadde noen effekt på disse cellene.

Eksempel 11: Anvendelse av anti- PSGL- 1- agonist- antistoff for å behandle autoimmunsykdom.

Ikke-fete, diabetiske (NOD)mus, et vel anerkjent, autoimmun-diabetesdyr, ble avlet under standard betingelser. Spontan diabetes utviklet seg i NODmusene ved en alder på omtrent 20 uker. I forsøksgruppen fikk musene tre doser av anti-PSGL-1-antistoff (TAB4) intraperitonealt i en mengde av 300 ug pr. mus ved en alder på 14, 15 og 17 uker. To ytterligere injeksjoner med den samme dosen ble gitt ved en alder på 24 og 26 uker. Kontrollgruppen ble gitt hamster-lg i samme dose. Mus ble overvåket med henblikk på glukosuri med Medi-Test Glucose-strips (Macherey-Nagel, Tyskland) to ganger hver uke, etter en alder på 15 uker. Ikke-fastende uringlukosenivåer over 300 mg/dl i to påfølgende målinger, ble betraktet som diabetisk.

Som vist på figur 9, ga TAB4 (anti-PSGL-1) antistoffbehandling betydelig beskyttelse, sommenlignet med kontroll-antistoffbehandling. Således kan en anti-PSGL-1 -antistoffbehandling dempe aktiviteten til autoimmun-T-celler og forsinke innsettelsen av type 1-diabetes.

Andre utførelsesformer.

Det skal forstås at idet oppfinnelsen er blitt beskrevet i sammenheng med den detaljerte beskrivelsen derav, er den foregående beskrivelsen ment å illustrere, og ikke begrense, oppfinnelsens ramme. Andre aspekter, fordeler og modifikasjoner av oppfinnelsen ligger innenfor rammen for kravene, fremsatt nedenfor. Det som kreves er:

Claims (3)

1. Antistoff eller antigen-bindende fragment derav som spesifikt bindes til P-Selektin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1) på overflaten av en aktivert T-celle og induserer døden til aktivert T-celle for anvendelse ved behandling eller forebygging av en T-cellemediert allergisk sykdom.

2. Anvendelse av antistoff eller antigen-bindende fragment derav som spesifikt bindes til P-Selektin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1) på overflaten av en aktivert T-celle og induserer døden til aktivert T-celle for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av en T-cellemediert allergisk sykdom.

3. Antistoff ifølge krav 1 eller anvendelse ifølge krav 2, hvor antistoffet er et monoklonalt antistoff.