JPS61268177A - ヒト肝癌由来の変異細胞株ｈｕＧＫ−１４ - Google Patents
ヒト肝癌由来の変異細胞株ｈｕＧＫ−１４Info
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- JPS61268177A JPS61268177A JP60292427A JP29242785A JPS61268177A JP S61268177 A JPS61268177 A JP S61268177A JP 60292427 A JP60292427 A JP 60292427A JP 29242785 A JP29242785 A JP 29242785A JP S61268177 A JPS61268177 A JP S61268177A
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- medium
- serum
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
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- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、Ｂ型肝炎つィルス表面抗Ｍ （ＨＢｓＡｇ）
を著量産生しかつ無血清培養することのできるヒト肝癌
由来の変異株ｈｕＧＫ−１４に関する。
を著量産生しかつ無血清培養することのできるヒト肝癌
由来の変異株ｈｕＧＫ−１４に関する。
従来の技術
Ｂ型肝炎ウィルス（以下ＨＢＶという）の表面抗原はＢ
ｌｕｍｂａｒｇらにより、１９６４年オーストラリア原
住民の血清から発見された。
ｌｕｍｂａｒｇらにより、１９６４年オーストラリア原
住民の血清から発見された。
さらにこのＨＢＶの表面抗原は感染性のあるＨＢＶのＤ
ａｎｅ粒子の外被膜として発見されるに至り、ＨＢＶの
表面抗原）（ＢｓＡｇと定義された。
ａｎｅ粒子の外被膜として発見されるに至り、ＨＢＶの
表面抗原）（ＢｓＡｇと定義された。
表面抗原ＨＢｓＡｇの発見により、ＨＢＶの存在と病気
との関連について研究が進み、ＨＢＶはヒトのＢ型肝炎
を起すウィルスとして、知られる様になった。
との関連について研究が進み、ＨＢＶはヒトのＢ型肝炎
を起すウィルスとして、知られる様になった。
このＨＢＶは感染力が強く、母親から子供への感染が顕
著であるが、輸血を要する患者や医療従事者で血液に接
触する機会の多い外科系医師、看護婦、検査技師等にも
しばしば感染する。 ＨＢＶに感染すると、急性およ
び慢性肝炎になったり、慢性肝炎から肝硬変、肝癌へと
進行したりするので、大きな医学上の問題となっている
。
著であるが、輸血を要する患者や医療従事者で血液に接
触する機会の多い外科系医師、看護婦、検査技師等にも
しばしば感染する。 ＨＢＶに感染すると、急性およ
び慢性肝炎になったり、慢性肝炎から肝硬変、肝癌へと
進行したりするので、大きな医学上の問題となっている
。
ＨＢＶに対する研究は進み、ＨＢＶに於いてはＩＩ Ｂ
ｓ Ａ ｇのほかに内部抗原（ＨＢｃＡｇ）更にｅ抗
原（ＨＢｅＡｇ）があり、また感染者に於いては、これ
等に対するＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗体と言った抗体をもっ
ことも知られた。
ｓ Ａ ｇのほかに内部抗原（ＨＢｃＡｇ）更にｅ抗
原（ＨＢｅＡｇ）があり、また感染者に於いては、これ
等に対するＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗体と言った抗体をもっ
ことも知られた。
今日、ＨＢｓＡｇがＨＢＶの感染を予防し得ることが知
られている。
られている。
既に、キャリヤー（不顕性感染者）の血液を原料とした
ＨＢｅＡｇから成るワクチンの研究がなされ、実用化の
段階に達しようとしている。通常、キャリヤーの血液の
中には、粒子状のＨＢｓＡｇおよび４２ｎ履の直径を有
するＤａｎｅ粒子とＨＢｓＡｇに対する抗体も見い出さ
れる。
ＨＢｅＡｇから成るワクチンの研究がなされ、実用化の
段階に達しようとしている。通常、キャリヤーの血液の
中には、粒子状のＨＢｓＡｇおよび４２ｎ履の直径を有
するＤａｎｅ粒子とＨＢｓＡｇに対する抗体も見い出さ
れる。
ｌｌＢｓＡｇはＨＢＶの抗原であって免疫原性をもつ、
即ちＨＢｓ抗体の産生を誘発しうると言われている。
即ちＨＢｓ抗体の産生を誘発しうると言われている。
ＨＢｓＡｇは約１１６−２５ｎの範囲の直径を有する球
状あるいは管状粒子であり、いわゆるＩｔ’２２ｎｍ粒
子」の形態をなし、ＨＢＶの感染者の血液中にしばしば
見い出される。
状あるいは管状粒子であり、いわゆるＩｔ’２２ｎｍ粒
子」の形態をなし、ＨＢＶの感染者の血液中にしばしば
見い出される。
又ＨＢｓＡｇの２２ｎｍ粒子は非感染性のウィルス外被
のみから成っており、Ｄａｎｅ粒子とは明確に区別され
る。
のみから成っており、Ｄａｎｅ粒子とは明確に区別され
る。
従ってＨＢｓＡｇの２２ｎｍ粒子に対する抗体は、 Ｈ
ＢＶ感染に対して予防効果を有することになり、この非
感染性の小型粒子をワクチンとして有効使用することが
可能となる。
ＢＶ感染に対して予防効果を有することになり、この非
感染性の小型粒子をワクチンとして有効使用することが
可能となる。
発明が解決しようとする問題点
実際には、キャリヤーの血液からＨＢｓＡｇの小型粒子
のみを分けて回収し、それをホルマリンと熱で不活化し
てワクチンとして使用する。しかしながら、この場合、
総てキャリヤーの血液を原料とするため、原料の確保が
不安定で、その供給量に制約があることから、ヒト血液
を原料としないＨＢｓＡｇの製造法の研究が精力的にな
される様になった。即ち、第２世代のワクチンとして、
遺伝子工学の手法で、大腸菌や酵母にＨＢＶの遺伝子を
組み込んでＨＢｓＡｇを生産する試み（特開昭５８−１
０９４２７）や、第三世代のワクチンとして、抗原決定
基に関係するアミノ酸配列を基に化学的に合成したペプ
チドによるワクチンの開発が試みられている。
のみを分けて回収し、それをホルマリンと熱で不活化し
てワクチンとして使用する。しかしながら、この場合、
総てキャリヤーの血液を原料とするため、原料の確保が
不安定で、その供給量に制約があることから、ヒト血液
を原料としないＨＢｓＡｇの製造法の研究が精力的にな
される様になった。即ち、第２世代のワクチンとして、
遺伝子工学の手法で、大腸菌や酵母にＨＢＶの遺伝子を
組み込んでＨＢｓＡｇを生産する試み（特開昭５８−１
０９４２７）や、第三世代のワクチンとして、抗原決定
基に関係するアミノ酸配列を基に化学的に合成したペプ
チドによるワクチンの開発が試みられている。
又、細胞培養によりＨＢｓＡｇを生産させる方法につい
ても報告（特開昭５６−１５００２０）されている。し
かし、これ等の公知の）ｌＢｓＡｇ生産のための細胞培
養はすべて牛脂児血清の添加によって行なわれており、
その生産量は小量に過ぎない。
ても報告（特開昭５６−１５００２０）されている。し
かし、これ等の公知の）ｌＢｓＡｇ生産のための細胞培
養はすべて牛脂児血清の添加によって行なわれており、
その生産量は小量に過ぎない。
又、宿主として大腸菌や酵母を用いた場合、生産される
ＨＢｓＡｇは免疫原性が低いとの報告もある。
ＨＢｓＡｇは免疫原性が低いとの報告もある。
動物細胞の培養には、通常、培地中に動物の血清、特に
牛脂児血清の添加が必要とされている。
牛脂児血清の添加が必要とされている。
ところが、血清の添加によって有用物質の回収精製が困
難になり、その操作に於いて、多大のコストを必要とす
ることになる。更には、添加する血清そのものが高価で
あることから、有用物質の工業生産に大きな障害となっ
ている。
難になり、その操作に於いて、多大のコストを必要とす
ることになる。更には、添加する血清そのものが高価で
あることから、有用物質の工業生産に大きな障害となっ
ている。
これは、ＨＢｓＡｇの生産においても、同様であり、Ｈ
ＢｓＡｇが無血清培地で生産することが可能となれば、
培地の価格に於いて不利な点をなくし、回収精製も容易
であり、ＨＢｓＡｇの生産に於ける画期的方法となるも
のである。
ＢｓＡｇが無血清培地で生産することが可能となれば、
培地の価格に於いて不利な点をなくし、回収精製も容易
であり、ＨＢｓＡｇの生産に於ける画期的方法となるも
のである。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、Ｂ型肝炎に対する予防ワクチンとして有
効な抗原を大量に生産すべく研究を行ったところ、ヒト
肝癌細胞株の中から、ａｄｒ型ＨＢＶのＤＮＡの一部が
組込まれており、ＨＢｓＡｇを著量生産する変異細胞株
ｈｕＧＫ−１４をクローニングすることに成功した。ｈ
ｕＧＫ−１４は、先に小泡らによって樹立されたヒト肝
癌細胞株ｈｕＳＰ（特許出願昭５８−１４８７７４）を
ＨＢ ｓ Ａ ｇの産生量の高いコロニーのセレクトを
繰り返し、さらに数多くのクローニングの結果、ｈｕＳ
Ｐと比べて極めてＨＢｓＡｇ産生量が高く、かつｈｕＳ
Ｐが高い血清要求性細胞株であるのに対して無血清でも
培養できる性質を得たものである。
効な抗原を大量に生産すべく研究を行ったところ、ヒト
肝癌細胞株の中から、ａｄｒ型ＨＢＶのＤＮＡの一部が
組込まれており、ＨＢｓＡｇを著量生産する変異細胞株
ｈｕＧＫ−１４をクローニングすることに成功した。ｈ
ｕＧＫ−１４は、先に小泡らによって樹立されたヒト肝
癌細胞株ｈｕＳＰ（特許出願昭５８−１４８７７４）を
ＨＢ ｓ Ａ ｇの産生量の高いコロニーのセレクトを
繰り返し、さらに数多くのクローニングの結果、ｈｕＳ
Ｐと比べて極めてＨＢｓＡｇ産生量が高く、かつｈｕＳ
Ｐが高い血清要求性細胞株であるのに対して無血清でも
培養できる性質を得たものである。
本発明のｈｕＧＫ−１４は一１９６℃にほぼ永久的に凍
結保存が可能であって、財団法人癌研究会癌研究所に登
録保管されており、頒布可能な状態にある。
結保存が可能であって、財団法人癌研究会癌研究所に登
録保管されており、頒布可能な状態にある。
次にｈｕＧＫ−１４の細胞学的性質を示す。
（１）ヒト肝癌細胞由来変異株である。
（２）染色体モード数は５１である。
（３） ａｄｒ型Ｂ肝炎ウィルス表面抗原をコードする
遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが、染色体ハプロイド
当たり約８ケ所組み込まれている。
遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが、染色体ハプロイド
当たり約８ケ所組み込まれている。
（４） ａｄｒ型Ｂ型肝炎、ウィルス表面抗原を著量産
生する。
生する。
（５）細胞は不正円形で上皮性である。
（６）接着型の細胞である。
（７）生育温度は３６．５±１℃が適している。
（８）抗原の産生量は、細胞密度が飽和状態に達した後
急激に増加する。
急激に増加する。
（９）細胞の増殖はＤＭ−１６０基礎培地に１０％以上
の血清を添加したものが適当であるが、無地溝培地のウ
ィリアムスＥ基礎培地でも良好な分裂増殖を示す。
の血清を添加したものが適当であるが、無地溝培地のウ
ィリアムスＥ基礎培地でも良好な分裂増殖を示す。
（１０）抗原産生の培地としてはウィリアムスＥ基礎培
地が最も適しており、培地交換のみで長期にわたり産生
物回収が可能である。
地が最も適しており、培地交換のみで長期にわたり産生
物回収が可能である。
（１１）デキサメサゾン添加により、ａｄｒ型Ｂ型肝炎
ウィルス表面抗原の産生量を増加させることができる。
ウィルス表面抗原の産生量を増加させることができる。
ちなみにヒト肝癌由来細胞株ｈｕＳＰは、５３歳の日本
人の男性の肝癌組織より分離されたｈｕＨ−１細胞系（
日本癌学会総会第３７回１２０頁１９７８年参照）から
樹立された細胞株であり、その細胞学的な性質は次の通
りである。
人の男性の肝癌組織より分離されたｈｕＨ−１細胞系（
日本癌学会総会第３７回１２０頁１９７８年参照）から
樹立された細胞株であり、その細胞学的な性質は次の通
りである。
■）細胞由来：ヒト肝細胞癌組織。
２）細胞の形態：上皮性細胞。
３）染色体数：染色体モードは６９゜
４）細胞の増殖温度：３２〜４２℃。
５）凍結保存ニー７０℃限界なく継代培養可能。
６） 血性要求性：血性要求性が高い（牛胎児血清１０
％要求する）。
％要求する）。
？） ＨＢウィルスＤＮＡ ：染色体ハプロイド当た
り約９ケ所に組込まれている。
り約９ケ所に組込まれている。
８） ＨＢウィルスの遊離：認められない。
９） ＨＢｓＡｇの遊離：培養時に培養液中へ多量に
分泌する。
分泌する。
これら２つの細胞株（ｈｕＧＫ −１４とｈｕＳＰ）に
は明らかに変異がみられる。
は明らかに変異がみられる。
ｈｕＧＫ −１４細胞株の培養は、細胞増殖期と抗原生
産期に特徴的に分けられる。即ち細胞分裂増殖状態にあ
る時（細胞増殖期）のＨＢｓＡｇ産生量は少なく、細胞
密度が飽和状態に達した後（抗原生産期）ＨＢｓＡｇ産
生量は急激に増加する（図１参照）。
産期に特徴的に分けられる。即ち細胞分裂増殖状態にあ
る時（細胞増殖期）のＨＢｓＡｇ産生量は少なく、細胞
密度が飽和状態に達した後（抗原生産期）ＨＢｓＡｇ産
生量は急激に増加する（図１参照）。
（イ）細胞増殖用の培地として適性をみるために。
幾つかの代表的な培地での細胞増殖とそれに血清添加し
た場合の増殖を調べた。結果を図２に示す。
た場合の増殖を調べた。結果を図２に示す。
細胞の増殖には、１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）添加Ｄト
１６０培地（極東製薬（株））が適当であるが、無血清
のウィリアムスＥ基礎培地でも良好な増殖を示す。
１６０培地（極東製薬（株））が適当であるが、無血清
のウィリアムスＥ基礎培地でも良好な増殖を示す。
（ロ）抗原用の培地としての適性をみるために。
ＤＭ−１６０培地とウィリアムスＥ培地についてデキサ
メサゾンを添加した場合と添加しない場合のＨＢｓＡｇ
産生量をみた。結果を表１に示す。
メサゾンを添加した場合と添加しない場合のＨＢｓＡｇ
産生量をみた。結果を表１に示す。
表１
培地 ＨＢｓＡｇ産生量（ｎ
ｇ／ｍＱ）デキサメサゾン（−） ＤＭ−１６０９９
０ウイリアムスＥ １３４０ デキサメサゾン（＋） ＤＭ−１６０１３７０ウイリ
アムスＥ ２４００ 抗原生産期の培地としては血清を添加しないウィリアム
スＥ培地（ＧＩＢＣＯ社）が最適である。またデキサメ
サゾンは、ＨＢｓＡｇの産生促進物質として有効である
。デキサメサゾンの添加量は１０−’Ｍ〜１０−５Ｍの
範囲で良いが１０４Ｍ程度が好ましい。
ｇ／ｍＱ）デキサメサゾン（−） ＤＭ−１６０９９
０ウイリアムスＥ １３４０ デキサメサゾン（＋） ＤＭ−１６０１３７０ウイリ
アムスＥ ２４００ 抗原生産期の培地としては血清を添加しないウィリアム
スＥ培地（ＧＩＢＣＯ社）が最適である。またデキサメ
サゾンは、ＨＢｓＡｇの産生促進物質として有効である
。デキサメサゾンの添加量は１０−’Ｍ〜１０−５Ｍの
範囲で良いが１０４Ｍ程度が好ましい。
（イ）、（ロ）の結果から細胞増殖の各フェーズのＨＢ
ｓＡｇ産生量を測定するためにデキサメサゾン１０−’
Ｍを添加したウィリアムスＥ基礎培地で細胞の増殖と）
ＩＢｓＡｇ産生量の関係をみた。結果を図１に示す。Ｈ
ＢｓＡｇは細胞密度が飽和状態に達した後急激に増加し
ている。
ｓＡｇ産生量を測定するためにデキサメサゾン１０−’
Ｍを添加したウィリアムスＥ基礎培地で細胞の増殖と）
ＩＢｓＡｇ産生量の関係をみた。結果を図１に示す。Ｈ
ＢｓＡｇは細胞密度が飽和状態に達した後急激に増加し
ている。
培地中に分泌されたＩ（ＢｓＡｇの定量は、ＥＩＡ法（
「酵素免疫測定法」医学書院１９８２年第２版第１刷石
川英治ｇＰ４１−Ｐ４３）に使用する市販のＨＢｓＡｇ
測定キット（米国ダイナボット社）によって測定するこ
とができる。培地の回収は抗原生産期に入ってから、６
日間隔で５回以上可能であり、回収した培地のＨＢｓＡ
ｇは２４００ｎｇ／ｍＱ程度の含有量がある。
「酵素免疫測定法」医学書院１９８２年第２版第１刷石
川英治ｇＰ４１−Ｐ４３）に使用する市販のＨＢｓＡｇ
測定キット（米国ダイナボット社）によって測定するこ
とができる。培地の回収は抗原生産期に入ってから、６
日間隔で５回以上可能であり、回収した培地のＨＢｓＡ
ｇは２４００ｎｇ／ｍＱ程度の含有量がある。
培養後、口過して得られた培養口演を用いた１（ＢｓＡ
ｇの精製法としては、限外口過膜により１０乃至３０倍
濃縮後、硫安塩析ないしは超遠心分離を行ない、その後
、塩化セシウムによる平衡遠心法。
ｇの精製法としては、限外口過膜により１０乃至３０倍
濃縮後、硫安塩析ないしは超遠心分離を行ない、その後
、塩化セシウムによる平衡遠心法。
庶糖濃度勾配遠心法を組み合わせる方法等がある。
血清添加培地では、血清蛋白質が多い為、前記の膜濃縮
が困難であるとともに、その後の各超遠心工程を数回繰
返すと言う煩雑な精製工程を必要とするが、本発明の細
胞株ｈｕＧＫ−１４の無血清培養で得られたＨＢｓＡｇ
の標品は、血清添加培地のそれと比較して簡単に調整さ
れ、かつ満足のいく精製標品である。
が困難であるとともに、その後の各超遠心工程を数回繰
返すと言う煩雑な精製工程を必要とするが、本発明の細
胞株ｈｕＧＫ−１４の無血清培養で得られたＨＢｓＡｇ
の標品は、血清添加培地のそれと比較して簡単に調整さ
れ、かつ満足のいく精製標品である。
この様に、本発明の細胞株ｈｕＧＫ−１４を用いると。
極めて安価な培地で、極めて容易に精製できるＨＢｓＡ
ｇの大量生産が可能であり、得られたＨＢｓＡｇは、ワ
クチン原料として極めて有用であり、又ＨＢＶ感染診断
剤の原料としても有用である。
ｇの大量生産が可能であり、得られたＨＢｓＡｇは、ワ
クチン原料として極めて有用であり、又ＨＢＶ感染診断
剤の原料としても有用である。
実施例１ ｈｕＧＫ−１４の無血清培養細胞株ｈｕＧ
Ｋ−１４完全無血清培養で、硫酸カナマイシン６０μｇ
／ｒｎｎ、接着因子ファイプロネクチンを添加したウィ
リアムスＥ培地（Ｆｌｏｗ社）を使用し、５％炭酸ガス
を含む空気、３７℃で完全無血清培地にて培養した。容
器は２４穴プレート（１ｍＱ／ウェル）をもちい、接種
密度は２〜３ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／ａＪとした。
Ｋ−１４完全無血清培養で、硫酸カナマイシン６０μｇ
／ｒｎｎ、接着因子ファイプロネクチンを添加したウィ
リアムスＥ培地（Ｆｌｏｗ社）を使用し、５％炭酸ガス
を含む空気、３７℃で完全無血清培地にて培養した。容
器は２４穴プレート（１ｍＱ／ウェル）をもちい、接種
密度は２〜３ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／ａＪとした。
細胞密度の飽和状態時点で常法通りトリプシン処理し、
細胞を新たなプレートに接種し、完全無血清培地で培養
を継続する。以後２日間隔で培地交換をしながら１４日
〜１６日の単位で継代培養を繰り返す。
細胞を新たなプレートに接種し、完全無血清培地で培養
を継続する。以後２日間隔で培地交換をしながら１４日
〜１６日の単位で継代培養を繰り返す。
その結果を第３図に示す。無血清培地でも細胞密度は１
．２〜２．０Ｘ１０’ ｃｅｌｌｓ／ａ＃に達し、継代
培養も少なくとも５代は可能である。
．２〜２．０Ｘ１０’ ｃｅｌｌｓ／ａ＃に達し、継代
培養も少なくとも５代は可能である。
また継代数が増加しても、細胞増殖が認められた。
実施例２ ＨＢｓＡｇ生産
培地としては、デキサメサゾン（Ｓｉｇｍａ社）１０−
’Ｍ。
’Ｍ。
硫酸カナマイシン６０μｇＩＱ、接着因子ファイプロネ
クチンを添加したウィリアムスＥ基礎培地（Ｆｌｏ％１
社）を使用した。５％炭酸ガスを含む空気、３７℃、培
地交換を２〜３日毎の条件で培養した。
クチンを添加したウィリアムスＥ基礎培地（Ｆｌｏ％１
社）を使用した。５％炭酸ガスを含む空気、３７℃、培
地交換を２〜３日毎の条件で培養した。
容器２４穴プレート（１ｍＱ／ウェル）をもちい、接種
密度は、２．５申１０’ｃｅｌｌｓ／ａ＃とした。増殖
・回収は同一培地で行なった。１３日で細胞密度は飽和
状態になり、この時点で新たに培地を交換し以降３０日
間（６日間毎に培地回収を５回）のＨＢｓＡｇの生産回
収を行なった。結果を表２に示す。回収した培地中のＨ
Ｂ ｓ Ａ ｇはＥＩＡで測定した。
密度は、２．５申１０’ｃｅｌｌｓ／ａ＃とした。増殖
・回収は同一培地で行なった。１３日で細胞密度は飽和
状態になり、この時点で新たに培地を交換し以降３０日
間（６日間毎に培地回収を５回）のＨＢｓＡｇの生産回
収を行なった。結果を表２に示す。回収した培地中のＨ
Ｂ ｓ Ａ ｇはＥＩＡで測定した。
表２
回収回数 培養日数 培養液中の）ＨＢｓＡｇ
量（ｎｇ／ｍｌ２）１回目 ６日後
２，４００２ １２日後
２，７６０３ １８日後
２，５８０４ ２４日後
２，３９０５ ３０日後
２，４２０
量（ｎｇ／ｍｌ２）１回目 ６日後
２，４００２ １２日後
２，７６０３ １８日後
２，５８０４ ２４日後
２，３９０５ ３０日後
２，４２０
図１は、ｈｕＧＫ −１４培養時の細胞増殖期と抗原生
産期とを示す。図２は、ＤＭ−１６０培地とウィリアム
スＥ培地について各々血清を添加する場合としない場合
についてのｈｕＧＫ −１４の増殖曲線を示す。図３は
、無血清のウィリアムスＥ培地を用い、細胞株ｈｕＧＫ
−１４を５代継代培養した時の増殖曲線を示す。 図面の浄書（内容（こ変更なし） 図 １ 焙養ＩＩＭ （日数） 図面の浄書ｒ内容に変更なし） 図 ２ Ａ−−Ｆｅ２１０°ムＤＭ 鱒１蚤日数 （日） 図３ ｙ昔姿日委父（ｇン 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 特願昭６０−２９２４２７ ２、発明の名称 ヒト肝癌由来の変異細胞株ｈｕＧＫ−１４３、補正をす
る者 事件との関係 特許出願人 住 所 東京都豊島区上池袋１丁目３７番１号名称
財団法人癌研究会 代表者 安 西 浩 ４、代 理 人 住 所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目１９番１４
号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 明細書及び図面 ７．補正の内容 （１）明細書全文を別紙の通り補正する。（内容に変更
なし）（２）図１及び図２を別紙の通り補正する。（内
容に変更なし）
産期とを示す。図２は、ＤＭ−１６０培地とウィリアム
スＥ培地について各々血清を添加する場合としない場合
についてのｈｕＧＫ −１４の増殖曲線を示す。図３は
、無血清のウィリアムスＥ培地を用い、細胞株ｈｕＧＫ
−１４を５代継代培養した時の増殖曲線を示す。 図面の浄書（内容（こ変更なし） 図 １ 焙養ＩＩＭ （日数） 図面の浄書ｒ内容に変更なし） 図 ２ Ａ−−Ｆｅ２１０°ムＤＭ 鱒１蚤日数 （日） 図３ ｙ昔姿日委父（ｇン 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 特願昭６０−２９２４２７ ２、発明の名称 ヒト肝癌由来の変異細胞株ｈｕＧＫ−１４３、補正をす
る者 事件との関係 特許出願人 住 所 東京都豊島区上池袋１丁目３７番１号名称
財団法人癌研究会 代表者 安 西 浩 ４、代 理 人 住 所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目１９番１４
号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 明細書及び図面 ７．補正の内容 （１）明細書全文を別紙の通り補正する。（内容に変更
なし）（２）図１及び図２を別紙の通り補正する。（内
容に変更なし）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記の細胞学的性質を有する変異細胞株ｈｕＧＫ−（１
）ヒト肝癌細胞由来変異株である。 （２）染色体モード数は５１である。 （３）ａｄｒ型Ｂ肝炎ウィルス表面抗原をコードする遺
伝子を含むＤＮＡフラグメントが、染色体ハプロイド当
たり約８ケ所組み込まれている。 （４）ａｄｒ型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原を著量産生す
る。 （５）細胞は不正円形で上皮性である。 （６）接着型の細胞である。 （７）生育温度は３６．５±１℃が適している。 （８）抗原の産生量は、細胞密度が飽和状態に達した後
急激に増加する。 （９）細胞の増殖はＤＭ−１６０基礎培地に１０％の血
清を添加したものが適当であるが、無血清のウィリアム
スＥ基礎培地でも良好な分裂増殖を示す。 （１０）細胞密度が飽和状態に達した後の維持培地とし
てはウィリアムスＥ基礎培地が最も適しており、培地交
換のみで長期にわたり産生量回収が可能である。 （１１）デキサメサゾン添加により、ａｄｒ型Ｂ型肝炎
ウィルス表面抗原の産生量を増加させることができる。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27459384 | 1984-12-28 | ||
| JP59-274593 | 1984-12-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61268177A true JPS61268177A (ja) | 1986-11-27 |
| JPH0534949B2 JPH0534949B2 (ja) | 1993-05-25 |
Family
ID=17543899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60292427A Granted JPS61268177A (ja) | 1984-12-28 | 1985-12-27 | ヒト肝癌由来の変異細胞株ｈｕＧＫ−１４ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61268177A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02302669A (ja) * | 1989-05-17 | 1990-12-14 | Shinotesuto:Kk | Ｂ型肝炎ウイルス抗体検出システム |
-
1985
- 1985-12-27 JP JP60292427A patent/JPS61268177A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02302669A (ja) * | 1989-05-17 | 1990-12-14 | Shinotesuto:Kk | Ｂ型肝炎ウイルス抗体検出システム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0534949B2 (ja) | 1993-05-25 |
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