JPH02302669A - Ｂ型肝炎ウイルス抗体検出システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＢ型肝炎ウィルス表面抗原（以下ＨＢｓ抗原と
記す）に対する抗体（以下ＨＢｇ抗体と記す）を検出す
る方法及びそのための試薬に関する。詳しくは８８ｇ抗
原をコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている天然
の細胞株、及び／又は、遺伝子工学技術を用いてＨＢｓ
抗原をコードする遺伝子が人為的に細胞内に組み込まれ
た細胞株を培養することにより培養物中に産生されたＨ
Ｂｓ抗原を含んでなる、免疫学的反応によるＨＢｓ抗体
検出用試薬及びそれを用いる検出方法に関するものであ
る。

したがって本発明は、Ｂ型肝炎の診断、検査、ひいては
その治療にも広く利用できるものである。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕Ｂ型肝
炎を引き起こすＢ型肝炎ウィルスは感染性が橿めて強く
、そのキャリアーは全世界で厖大な数に上ると言われて
いる。感染しても自覚症状のない場合もあるが、劇症肝
炎で死に至ることもあり、更にキャリアーの一部は慢性
肝炎から肝硬変、肝癌へと進行することから社会的に大
きな問題となっている。このようなり型肝炎の感染を未
然に予防し、かつ患者の治療を全うすることが現代臨床
医学上の大きな課題の一つとなっているのである。Ｂ型
肝炎に感染すると血清中にか出現する。このＨａｓ抗体
を高感度に検出することは、Ｂ型肝炎に関するほぼ全て
のステージ、即ち初期感染の有無、ワクチン接種の可・
不可、ワクチン接種後の有効性の判定、或いはＢ型肝炎
患者の病状経過の診断などにおいて必須のこととなって
いる。

一般に、Ｈａｓ抗体の検出法としてはオフタロニー法、
交差免疫電気泳動法、エンザイムイムノアッセイ、受身
赤血球凝集反応法、ラジオイムノアッセイ等が知られて
いる。そしてこれらの検出法においては、特異性と検出
感度の点から、高度に精製された。　８８ｇ抗原の使用
が不可欠となっている。

従来は、ＨＢｓ抗原陽性のヒト血漿若しくはヒト血清か
ら硫安分画、エタノール分画、超遠心分画、密度勾配遠
心分画、アフィニティークロマトグラフィー等公知の精
製法により精製したＢ型肝炎ウィルスが８８ｇ抗原の原
料として用いられて来ている。

しかしながら、Ｂ型肝炎ウィルスを何ら処理することな
くこれをそのまま使用した場合、感染の危険性が非常に
高い、従って、感染を防ぐ目的で、ＨＢｓ抗原ワクチン
の製法の分野で行われている技術、即ち精製Ｂ型肝炎ウ
ィルスに対して加熱処理やホルマリン処理などの不活化
処理を行ったＨＢｓ抗原をｌｌＢｓ抗体検出用試薬に用
いているのが現状である。

この場合でも、不活化処理の際には生のＢ型肝炎ウィル
スを取り扱う必要があり、やはり危険性がつきまとう。

以上のようなヒト血液を原料としているＨＢｓ抗原は、
感染の危険性が高いだけでなく、血液成分中の非特異的
凝集を呈する混在因子の影響を受は易く、又ＨＢｓ抗原
、の精製に複雑な工程を必要とし、しかも大量供給が難
しくなど、多々の問題を有している。

近年、８８ｇ抗原をコードする遺伝子が組み込まれてい
る天然のヒト細胞株、或いは遺伝子工学技術を用いて該
遺伝子が人為的に組み込まれたヒト或いはマウス等の動
物細胞株を培養することによりＨＢｓ抗原を得て、これ
を診断剤に応用する報告が幾つか開示されている゛（特
開昭５９−７４９９１号、特開閉６１−２６８１７７号
、特開昭６１−１５８７９８号、特開昭６１−２３１９
９７号、特開昭６２−５５０８８号、特開昭６３−４５
２２７号、特開昭６３−２２０９８号など）。しかしな
がら、これらの報告は何れも製造されたＨＢｓ抗原が診
断剤として利用できる可能性を記載しているに留まって
おり、診断剤として実用化できるほど具体的に完成され
るまでには至っていないのである。

〔課題を解決するための手段〕

かかる現状に鑑みて、本発明者らは鋭意研究を行った結
果、遺伝子工学技術或いは細胞工学技術によって得られ
たＨＢｓ抗原が、全く予期せざることに、Ｂ型肝炎ウィ
ルスの感染による生体の免疫応答で成立したＨＢｓ抗体
と特異的に反応することを新たに見い出し、この有用な
新知見に基づき本発明を完成させるに至った。即ち、本
発明はＢ型肝炎ウィルスゲノムのプレーＳ１領域、プレ
ー３２領域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも一種以
上を保持している細胞から産生されたＨＢｓ抗原を含有
してなることを特徴とする、ＨＢｓ抗体検出システムに
関するものである。

本発明でいうＢ型肝炎ウィルスゲノムのプレーＳｌ領域
、プレーＳ２領域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を保持している細胞とは、まず、遺伝子工学技
術によりＢ型肝炎ウィルスゲノムのプレーＳｌ領域、プ
レー３２ｆｉＩ域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を人為的に組み込んだ細胞が挙げられる。この
ように人為的に創製した細胞株においては、該遺伝子が
挿入されたプラスミドが細胞核外にエピゾームとして存
在している場合と、該遺伝子が細胞のゲノムに組み込ま
れている場合とがあるが、本発明ではこれらの両方のタ
イプの細胞株が利用され得る。次に、Ｂ型肝炎ウィルス
に自然感染した結果、該ウィルスのプレー５ｌｆｆＪｌ
域、プレー３２　ｉｆｆ域、並びにＳ遺伝子のうちの少
なくとも一種以上の遺伝子がゲノムに組み込まれたヒト
細胞株、例えばヒト肝癌細胞を挙げられる。以上のよう
な条件を満たす細胞株で公知のものとして、遺伝子工学
技術により創製された細胞株ではクローン＾１２３（特
開昭６３−１３２８４５号）やＭＳ１２８　（第６１同
日本生化学会大会抄録、印、Ｎａ８、ｐ、６９９及び特
願昭６３−６５０７０号）が挙げられ、又Ｂ型肝炎ウィ
ルスに自然感染した結果該ウィルスの遺伝子がゲノムに
組み込まれたヒト細胞株では、ｈｕＳＰ　（特開昭６０
−４５５３５号）、ｈｕＧに−１４（特開昭６１−１５
８７９８号）等を挙げることが出来る。

これらの細胞株は何れも本発明に係るＨＢｓ抗原を取得
するのに使用され得るが、特にｈｕＧＫ−１４或いはＭ
Ｓ１２８の産生ずるＨＢｓ抗原を利用することが好まし
い。

そして酵母若しくはバクテリアなどの動物細胞以外の細
胞にＢ型肝炎ウィルスゲノムのプレーＳｌ　ｆｉＩ域、
プレー３２　ｅｆｆ域、並びにＳ遺伝子のうちの少なく
とも一種以上を組み込んだ細胞は本発明では使用されな
い。

本発明で用いられるＨＢｓ抗原は、上で述べた細胞株が
産生ずるプレＳｌ蛋白質、プレＳ２蛋白質、Ｓ抗原のう
ちの少なくとも一種以上を含むものである。しかして本
発明の８８ｇ抗原は、Ｂ型肝炎ウィルス粒子に非常に類
似したウィルス外被を有しておりＨＢｓ抗体と特異的に
結合するが非感染性のものであり・また一部がグリコジ
ル化されている場合もある。

上述の細胞株を培養することにより培養液、培養上清、
培養濾液、培養細胞体といった培養物中に得られたＨＢ
ｓ抗原は、任意の公知方法を用いて精製を行えばよい。

−例として、限外濾過膜により培養上清を適当に濃縮後
、硫安塩析或いは超遠心分離を行い、その後塩化セシウ
ムによる平衡遠心法、庶ＩＩ濃度勾配遠心法を組み合わ
せて精製する方法（特開昭６１−１５８７９８号）が挙
げられる。

以上のようにして得られたｌ１ｌｓ抗原は、当分野で通
常用いられている免疫学的反応に基づく抗体の検出方法
、例えばオフタロニー法、交差免疫電気泳動法、エンザ
イムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫
分析法、受身赤血球凝集反応法、並びに血球、ラテック
ス或いはその他の人工粒子を担体として用いた間接凝集
反応等によってＨａｓ抗体を検出するための試薬の主成
分として使用され・る。

本発明においては、後記するように、ヒト肝癌細胞由来
の細胞株、肝炎ウィルスＤＮＡの形質転換細胞株といっ
た既知の細胞株を使用できるが、特にこのような場合に
は危険なり型肝炎ウィルスを直接取扱う必要がないため
、感染することもなくきわめて安全である。

〔作　用〕

本発明のＨＢｓ抗体検出用試薬を、ＨＢｓ抗原陽性のヒ
ト血漿若しくはヒト血清を原料として製造されたＨＢｓ
抗原を主成分として含有する従来のＨＢｓ抗体検出用試
薬と比較すると、以下に記す有利な点を有している。

まずＨａｓ抗体検出用試薬の主成分であるＨＢｓ抗原の
製造に当たっては、 ｌ）従来、感染予防の目的で精製された）ＩＢｓ抗原に
対して行われてきたホルマリン処理或いは加熱処理など
の不活化処理が不要である。

そして、ＨＢｓ抗体の検出に関しては、２）従来のＨＢ
ｓ抗原陽性ヒト血漿由来のＨＢｓ抗原を主成分とする試
薬につきものの、血液成分に起因する非特異的反応が起
こらない。

３）従来のｌｌＢｓ抗原陽性ヒト血漿由来のＨＢｓ抗原
を主成分とするｌｌＢｓ抗体検出用試薬を用いては全く
検出出来ないか、或いは極く僅かの検出感度しか得るこ
との出来なかったＨａｓ抗体を、特異性よく、しかも高
感度に検出できる。

等の優れた特性を有しているのである。

次に本発明に係るＨＢｓ抗原の製造例を示す。

〔製造例〕

（１）培養細胞由来のＨＢｓ抗原の製造ヒト肝癌細胞由
来の細胞株ｈｕＧＫ−１４（微生物工業技術研究所に寄
託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１０６６５として寄託されている
）についてはその培養上清より、特許協力条約に基づい
て公開された国際特許出願国際公開番号−０８６１０３
９７５に記載の方法に従ってＨａｓ抗原を精製した。簡
単に述べると、（ａ）培養上清を限外濾過膜により１０
〜３０倍に？！４縮、（ｂ）得られた濃縮液を抗ＨＢｓ
抗原モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムに負荷、（Ｃ）カラムに吸着し
ている蛋白質を溶出、＠溶出液を塩化セシウムを用いた
平衡密度勾配超遠心にかける、（ｅ）抗原画分を取り出
して緩衝液で透析、（ｆ）メンブレンフィルターに通す
ことにより濾過滅菌、というステップを踏んで精製ＨＢ
ｓ抗原を得た。

Ｒ−Ｉ１１マウス由来の培養細胞Ｃｌ２７（ＡＴＣＣＣ
ＲＬ１６１６）にＢ型肝炎ウィルスのＤＮＡをトランス
フェクトして得られた形質転換細胞株ＭＳ１２８（微生
物工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−９７７３と
して寄託されている）についてもｈｕＧＫ−１４の場合
と同じ方法で培養上清より精製ＨＢｓ抗原を得た。

（２）血清由来のＨＢｓ抗原の製造 ＨＢｓ抗原陽性プール血清より常法により精製した。具
体的に用いた方法は以下の通りである。

ＨＢｓ抗原陽性血清２０１をｐＨ７，０において飽和硫
安５０〜５５％で沈澱分画後生理食塩水で溶解し、同溶
液で塩析した。塩析内液をセファロース６Ｂ（ファルマ
シア社製）カラム（φ５Ｘ１００ＣＩｌ）に負荷して分
画しつつゲル濾過した。２Ｂ０ｎｓ＋における吸光度の
最初のピークの画分を取り、これを粗ＨＢｓ抗原とした
。この粗ＨＢｓ抗原を抗ＨＢｓモノクローナル抗体（ジ
ノテスト社製）結合セファロース４Ｂ（ファルマシア社
製）カラム（φ５×３Ｃ層）に負荷し、ｐＨ７，６のＰ
ＢＳ　（本明細書の比較例及び実施例で用いられたＰＢ
ＳのｐＨ１以下全て７．６であった）で洗浄後、３Ｍの
にＳＣＮを含むＰＢＳによりカラムに吸着された物質を
溶出した。これをＰＢＳで透析後、透析内液を塩化セシ
ウムによる平衡遠心法を用いて、超遠心機（日立製作所
型５ＣＰ８５）１　）にて１３０，０ＯＯＸ　ｇ　、　
５０時間遠心し、ＨＢｓ抗原画分を得た。この両分をＰ
ＢＳで透析した後、透析内液を取って６０″Ｃで１０時
間の不活化処理を行って精製ＨＢｓ抗原を得た。

〔比較例〕

本発明に係るＨＢｓ抗原と従来のＨＢｓ抗原とのＨＢｓ
抗体に対する検出感度を受身赤血球凝集法によって比較
した。

（１）　ＨＢｓ抗原感作赤血球の調製 市販のヒツジ赤血球を生理食塩水で洗浄した後、ＰＢＳ
で５％（ｖ／ｖ）に浮遊させたちの４容に対し、２．５
％（Ｗ／Ｖ）のグルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液１容を
加え、室温で２時間反応させた。反応終了後ＰＢＳで遠
心洗浄し、グルタルアルデヒド固定化ヒツジ赤血球を得
た。該固定化ヒツジ赤血球の５％ＰＢＳ浮遊液１容に、
０．００５％（ｗ／ｖ）タンニン酸を含むＰ　Ｂ　Ｓ　
？９液１容を加え室温で３０分間反応させた後ＰＢＳで
遠心洗浄して、タンニン酸処理固定化ヒツジ赤血球を得
た。このタンニン酸処理固定化赤血球の５％ＰＢＳ浮遊
液１容に対し、製造例に従って調製されたｈｕＧＫ−１
４細胞由来のＨＢｓ抗原のＰＢＳ懸濁液（１ｍｇ／ｄ）
、若しくは血清由来のＨＢｓ抗原のＰＢＳ懸濁液（１■
／ｄ）１容を加え、室温で３時間反応させた。これらの
反応液をそれぞれＰＢＳで遠心洗浄し、赤血球濃度が０
．５％（ｗ／ｖ）となるように１％（ｖ／ｖ）正常ウサ
ギ血清を含むＰＢＳに浮遊させた。

以上のようにして得られたｈｕＧＫ−１４細胞由来のＨ
Ｂｓ抗原若しくは血清由来の８８ｇ抗原を結合させたタ
ンニン酸処理固定化ヒツジ赤血球（以下Ｈａｓ抗原感作
固定化ヒツジ赤血球という）を以下の試験に供した。

（２）検出方法 市販のラジオイムノアッセイ用試薬でＨＢｓ抗体陽性と
された血清２２検体について、上記（１）に従って調製
されたｈｕＧＫ−１４細胞由来ＨＢｓ抗原惑作固定化ヒ
ツジ赤血球若しくは血清由来ＨＢｇ抗原感作固定化ヒツ
ジ赤血球を用いて、受身赤血球凝集法によりＨＢｓ抗体
を下記の要領にて検出を試みた。

まず上記検体をＰＢＳで１０倍に希釈した後、これらの
各希釈検体２５μ！をＵ型９６六マイクロプレート（住
人ベークライト社製）の各ウェルに入れ、１％（ｖ／ｖ
）正常ウサギ血清を含むＰＢＳ　２５μ！を加えて検体
を希釈した（２０倍希釈）。この２０倍希釈液から２５
μ！を取って別のウェルに入れ、１％（ｖ／ｖ）正常ウ
サギ血清を含むＰＢＳ　２５μｌを加えて検体を希釈し
た（４０倍希釈）。このような希釈操作を繰り返すこと
により、希釈倍数、／）４２０〜２，５６０倍（２’　
〜２１１Ｘ１０）　ノ検体を得た０次に各ウェルに前記
（１）で得られたＩＢｓ抗原感作固定化ヒツジ赤血球（
ｈｕＧＫ−１４細胞由来ＨＢｓ抗原若しくは血清由来Ｈ
Ｂｓ抗原）のＰＢＳ浮遊液（０，５％（ｗ／ｖ）　）２
５μβづつを加え、プレート全体をマイクロミキサーで
１分間振擾し、室温にて２時間静置した後、赤血球凝集
の有無にょるＨＢｇ抗体の検出を行って、各ＨＢｓ抗原
感作固定化ヒツジ赤血球の検出感度を凝集価で評価した
。

凝集価は各検体において赤血球の凝集が認められた終末
点（ｅｎｄ　ｐａｉｎｔ）における希釈倍数値で表わし
た。

１１Ｂｓ抗原を感作していない固定化ヒツジ赤血球のＰ
ＢＳ浮遊溶液を用いた他は上記と同じ方法及び試薬によ
る実験を対照実験として行った。

凝集価の測定結果を第１図に示す、第１図においては横
軸にｈｕＧＫ−１４細胞由来ＨＢｓ抗原惑作赤血球の凝
集価を、縦軸に血清由来ＨＢｓ抗原感作赤血球の凝集価
を取り、各々の検体の両ＨＢｓ抗原感作赤血球による凝
集価を座標としてグラフ上に・又はＯでポイントした。

この図の座標のＮ、Ｄ、は全での検出濃度に亙って検出
されなかったこと（ｎｏ　ｔ　ｄｅ　ｔｅｃ　Ｌｅｄ）
を意味する。

この図に示されているように、ＨＢｓ抗原として血清由
来のｌｌＢｓ抗原を用いた場合に比べて、ｈｕＧＫ−１
４細胞由来のＨＢｓ抗原を用いた場合の方が、一部の例
外を除き、同一検体に対して２倍以上高い検出感度を有
することが判明した。これら２２検体の内、特に２検体
（第１図中の○で示した検体ＮＴＩＩ及び阻２）に関し
ては、血清由来のＨＢｓ抗原感作固定化赤血球を用いた
場合には、殆ど凝集しなかったのに対し、ｈｕＧＫ−１
４細胞由来のＨＢｓ抗原感作固定化赤血球を用いた場合
には高い凝集価を示した。

すなわち、検体Ｎａ２においては、従来法（血清由来Ｈ
Ｂｓ抗原を用いた試薬）によれば凝集が生じなかった（
Ｎ、Ｄ、）のに対して、本発明によれば６４０倍もの高
稀釈でも抗体が検出された。また検体Ｎａｌにおいて、
従来法によれば２０倍の希釈でやっと抗体が検出された
めに対して、本発明によれば３２０倍希釈でも抗体が検
出され、１６０倍もの高い検出感度を有することが実証
された。

一方対照実験においては、何れの検体の場合でも固定化
ヒツジ赤血球の凝集は認められなかった。

上記の血清由来のＨＢｇ抗原感作固定化赤血球を用いた
場合とｈｕＧＫ−１４細胞由来のＲａｇ抗原感作固定化
赤血球を用いた場合とで著しい検出感度の差が見られた
２検体（Ｎ１１．ｌ及びＮａ２）について、これがＨＢ
ａ抗体に対する特異的な反応によるものであることを確
認するために、ＨＢｓ抗原による吸収試験を以下の（３
）に記載の方法により行った。

（３）　ＨＢｓ抗原による吸収試験 上記（２）においてｈｕＧＫ−１４細胞由来のＨＢｓ抗
原感作固定化赤血球のみに高い凝集性を示した血清２検
体（第１図のＯで示した検体−１及び隘２）と、市販の
抗ＨＢｇモノクローナル抗体（英国ケンブリッジラボ社
製）を１μｇ／ａｌの割合で添加されたヒト正常血清（
ポジティブコントロールとして使用）を用意し、これら
の計３検体をＰＢＳで１０倍に希釈した。この１０倍希
釈された各検体２５μｌをＵ型９６六マイクロプレート
（住友ヘークライト社製）のウェルに入れ、１％（ｖ／
ｖ）正常ウサギ血清を含むＰＢ５２５μ２を用いて上記
（２）と同じ様にして各検体を倍々希釈した系列（２０
〜２５６０倍）を作った０次いでｈｕｌＪ−１４細胞由
来の精製ＨＢｓ抗原（２μｓ／ｍｅ）の１％（ｖ／ｖ）
正常ウサギ血清−ＰＢＳ懸濁液１０ｕ１．を前記の各ウ
ェルに添加し、プレート全体をマイクロミキサーで１分
間振盪した後、室温で２時間反応させた。

ｈｕＧＫ−１４細胞由来の精製８８ｇ抗原の代わりに１
％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清−ＰＢＳ　１０μｌを用い
た他は上と同じ条件の実験を対照実験として行った。

反応終了後、各ウェルに０．５％（ｗ／ｖ）　ｈｕＧＫ
−１４細胞由来のＨＢｓ抗原感作固定化ヒツジ赤血球の
浮遊液２５μｌづつを加え、プレートをマイクロミキサ
ーで１分間振盪して、室温にて２時間静置後の赤血球凝
集反応の有無から上記（２）と同様にして凝集価を決定
した。

この結果を表１に示す。

表１ １）抗ＨＢｇモノクローナル抗体 ２）−は全ての希釈倍率に亙って赤血球の凝集が起こら
なかったことを示す。

対照実験を基準とすると、３つの検体の何れにおいても
ｈｕＧに一１４細胞由来のＨＢｓ抗原を添加することに
より大幅に赤血球凝集が阻止されることが表１から示さ
れた。このことから上記（２）において２つの検体Ｎ１
１ｌ及びＮａ２について血清由来のＨＢｓ抗原感作固定
化赤血球を用いた場合とｈｕ（Ｊ−１４細胞由来のＨＢ
ｓ抗原感作固定化赤血球を用いた場合とで著しい検出感
度の差が見られたのは、ＨＢｓ抗体に対する特異的な反
応によるためであ企ことを確認された。

（４）結論 以上の比較例における実験結果から、本発明でＨａｓ抗
体検出用試薬として使用されるｈｕＧＫ−１４細胞由来
のＨａｓ抗原は当業者の予想を越えた検出感度を有し、
しかもその検出感度の高さはＨＢｓ抗体に対する特異的
な反応によるものであって、非特異的な反応によるもの
ではないことが示された。

以上の比較例において、Ｂ型肝炎ウィルスゲノムのプレ
ーｓＨＩ域、プレー３２領域、並びにＳ遺伝子のうちの
少なくとも一種以上を保持している細胞としてｈｕＧＫ
−１４を一例として用い、その培養上清から得られたＨ
ａｓ抗原について、血清由来のＨａｓ抗原との検出感度
の比較及び、ＨＢｓ抗体に対する反応特異性を述べた。

〔実施例〕

本発明に係るｈｕＧＫ−１４細胞或いはＭＳ１２８細胞
の培養上清より得られた精製ＨＢｓ抗原をＨＢｓ抗体検
出用試薬の主成分として用いて、ＨＢｓ抗体を免疫学的
反応により検出した例を以下に実施例として記載する。

実施例１ エンザイムイムノアッセイによるＨＢｇ抗体の検出（１
）　ＨＢｓ抗原結合マイクロプレートの調製ｈｕＧＫ−
１４細胞の培養上清より得られた精製ＨＢｓ抗原をＰＢ
Ｓで１μｇ／ｍｌに希釈し、これをエンザイムイムノア
ッセイ用９６六マイクロプレート（住人ベークライト社
製）の各ウェルに５０ｐｌずつ分注した。このプレート
を４℃で１０時間放置して０８ｇ抗原をウェルに吸着さ
せた後ＰＢＳで洗浄し、１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳ
溶液を２００ｕｊ！加えて４℃で５時間放置することに
よりウェルの抗原未吸着部分を覆い、ＨＢｓ抗原結合マ
イクロプレートを調製した。

以上のようにして得られたＨＢｇ抗原結合マイクロプレ
ートを以下の実験に供した。

（２）パーオキシダーゼで標識された抗ヒトＩｇＧ抗体
の調製 西洋ワサビパーオキシダーゼ（ベーリンガー社製、グレ
ードり５■を０．３Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８，１）１ｍに
溶解し、これに２．４−ジニトロフルオロベンゼン（Ｄ
ＮＦＢ）の１％溶液０．２−を加え、室温で１時間撹拌
した。得られたＤＮＦＢ結合パーオキシダーゼを０．０
１？ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）に対して透析した。透
析内液を取り、これに精製抗ヒトＩｇＧウサギ抗体（カ
ッペル社製）５■を含むｏ、ｏｔｎ炭酸緩衝液１ｊｄを
添加して、室温で２時間撹拌した。この反応液を予めＰ
ＢＳで平衡化しておいたセファロース６Ｂ（ファルマシ
ア社製）カラム（φ２．５Ｘ１００ｃｍ）に負荷して５
ｄづつ分画しつつゲル濾過した。得られた各両分につい
て２Ｂ０ｎｍにおける吸光度（蛋白質、濃度）及び４０
３ｎ−における吸光度（西洋ワサビパーオキシダーゼ）
を測定して、両吸光度の最初のピークに溶出されてきた
両分を取って、これをパーオキシダーゼで標識化された
抗ヒトＩｇＧ抗体とした。

（３）　Ｈａｇ抗体の検出 比較例の（２）のｌｌＢｓ抗体の検出で用いたＨａｓ抗
体陽性ヒト血清のうちのｈｕＧＫ−１４細胞由来のＨＢ
ｓ抗原感作固定化赤血球のみに高い凝集性を示した２検
体及びＨＢｓ抗体陰性ヒト血清ｌ検体の計３検体を［％
ＢＳＡ　（ｗ／ｖ）−ＰＢＳ溶液によりそれぞれ５０倍
希釈した。これらの５０倍希釈液を１倍として試験管内
で１％ＢＳＡ　（ｗ／ｖ）−ＰＢＳ溶液により倍々希釈
（１００〜１２．８００倍）した、これらの各希釈血清
５０μｌを上記ｌｌｌ５抗原結合マイクロプレートの各
ウェルに添加して、ウェットチェンバー内で３７℃３時
間反応させた０反応終了稜線マイクロプレートの各ウェ
ルを０．０５％ツイーン２〇−ＰＢＳ溶液で十分に洗浄
し、上記（２）で得られた西洋ワサビパーオキシダーゼ
標識化抗ヒ）ＩｇＧウサギ抗体の１％ＢＳＡ　（ｗ／ｖ
）−ＰＢＳ希釈液５０ｕｌを添加して、ウェットチェン
バー内で３７℃３時間反応させた。その後各ウェルを０
．０５％ツイーン２Ｏ−ＰＢＳ溶液を用いて十分に洗浄
し、ＯＰＤ溶液（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉ！ｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ＋　ｌＪｌ＋　ｐ、４３２）を１００μｉずつ
添加して、３７℃で３０分間反応させた。

次いで４Ｎ硫酸を１’ＯＯ，ｃｒｊ！づつ各ウェルに添
加して反応を停止させ、各ウェルの吸光度をマイクロプ
レートリーダー（コロナ電気社製）によって計測した。

対照実験として、０８ｇ抗原を結合していないマイクロ
プレートを用いて以上と同様の実験を行った。

結果を第２図に示す。

この図が示すように、本発明に係るＨａｇ抗体検出用試
薬を結合せしめたマイクロプレートによりＨＢｓ抗体を
特異的に検出することが出来た。

実施例２ マイクロプレートを用いた間接凝集法によるＨＢｓ抗体
の検出；　ｌｌＢｓ抗原としてｈｕＧＫ−１４細胞由来
の精製１８ｇ抗原を使用 （１）　ＨＢｇ抗原結合担体粒子の調製ＰＢＳに対して
２％（ｗ／ｖ）となるように浮遊させた高比重粒子（徳
山曹達社製）ｌ容に対し、ｈｕＧＫ−１４細胞より得ら
れた精製Ｈａｓ抗原（２０μｇ／ｄ）１容を加え、４℃
で１時間保持して、粒子にＨＢｓ抗原を結合させた。そ
して該粒子をＰＢＳで洗浄し、非特異的吸着を抑えるた
めにｌ　（ｗ／ν）ＢＳＡ　−ＰＢＳ中に更に４℃ｌＯ
時間該粒子を浸漬した。

その後この粒子を１％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清−ｐａ
ｓで１回遠心洗浄し、゛最終的に０．３％（ｗ／ν）と
なるように１％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清−ＰＢＳに浮
遊させたＨＢｓ抗原結合粒子を得た。

以上のようにして得られたＨＢｓ抗原結合粒子を以下の
実験に供した。

（２）　ＨＢｓ抗原結合測定マイクロプレートの調製Ｐ
ＢＳで１ｕｇ／−に希釈した精製１１Ｂｓ抗原をＵ型９
６六マイクロプレート（住人ベークライト社製）の各ウ
ェルに５０μ２ずつ分注し、４　’Ｃで一晩放置して該
ＨＢｓ抗原を該マイクロプレートに吸着させた。その後
各ウェルをＰＢＳで洗浄し、１％（＆４／ｖ）ＢＳＡ−
ＰＢＳ　２００μｊ！を加え、最後に４°Ｃで３時間放
置してウェルの抗原未吸着部分を覆うことによりＨＢｓ
抗原の結合したマイクロプレートを調製した。

（３）　ＨＢｓ抗体の検出 比較例の（２）のＨＢｓ抗体の検出で用いたヒト血清検
体のうちからｈｕＧに一１４細胞由来ＨＢｓ抗原感作固
定化赤血球のみに高い凝集性を示した２検体（Ｎａｌ及
びＮａ２）　、抗Ｈａｓモノクローナル抗体（英国ケン
ブリッジラボ社製）を１μｇ／ｄとなるように添加した
ヒト正常血清ＨＢｓ抗体（ポジティブコントロールとし
て使用）、及びＨＢｓ抗体陰性ヒト血清（ネガティブコ
ントロールとして使用）、の計４検体をＰＢＳでそれぞ
れ１０倍に希釈した。これらの希釈血清２５μ！を０．
２％（ｗ／ｖ）ツイーン２０及び２％（ｗ／ｖ）　ＢＳ
Ａを含むＰＢＳ　２５ｕｌを用いて、前記（２）で調製
したＨＢｓ抗原結合マイクロプレートの各ウェル中にて
倍々希釈（２０〜２．５６０倍）した０次に各ウェルに
前記（１）で調製されたＨＢｓ抗原結合粒子の浮遊液を
２５μβづつ加え、マイクロプレートをマイクロミキサ
ーで１分間振盪後、室温で１時間静置して凝集像を肉眼
で判定した。

一方これとは別に、）ＩＢｓ抗原を結合していない高比
重粒子の浮遊液を用い、他の方法と試薬は同一とした実
験を対照実験として行った。

凝集価は各検体において凝集像が認められた終末点にお
ける希釈倍数値で表わした。

結果を表２に示す。

表２ １）抗ＨＢｓモノクローナル抗体 ２）−は全ての希釈倍率に亙って粒子の凝集が起こらな
かったことを示す。

この表２が示すように、本発明に係るｈｕＧＫ１４細胞
由来のＨＢｇ抗体検出用試薬を結合せしめた粒子の凝集
反応により、ＨＢｇ抗体を特異的に検出することが出来
た。

実施例３ マイクロプレートを用いた間接凝集法によるＨＢｓ抗体
の検出：　ＨＢｓ抗原としてｌ’ｌｓ　１２８細胞由来
の精製ＨＢｓ抗原を使用 （１）　ＨＢｓ抗原結合担体粒子の調製ＨＢｓ抗原とし
てＭＳ１２８細胞の培養上清より得られた精製Ｈａｓ抗
原を用いた以外は実施例２（１）と同じ方法でＨａｓ抗
原結合担体粒子を調製した。

（２）　１（Ｂｓ抗原結合測定マイクロプレートの調製
８８ｇ抗原としてＭＳ１２８細胞の培養上清より得られ
た精製ＨＢｓ抗原を用いた以外は実施例２（２）と同じ
方法でＨａｓ抗原結合測定マイクロプレートを調製した
。

（３）　Ｈａｓ抗体の検出 市販のラジオイムノアッセイ用試薬でＨＢｓ抗体陽性と
された血清８０検体をｐｕｓで２０倍に希釈した。これ
らの希釈血清２５μｌを０．２％（ｉｎ／ｖ）ツイーン
２０及び２％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡを含むＰＢＳ　２５ｕ
ｉを用いて、前記（２）で調製したＨａｓ抗原結合マイ
クロプレートの各ウェル中にて倍々希釈（４０〜１０．
２４０倍）した０次に各ウェルに前記（１）で調製され
たＨＢｓ抗原結合粒子の浮遊液を２５μ！づつ加え、マ
イクロプレートをマイクロミキサーで１分間振盪後、室
温で１時間静置して凝集像を肉眼で判定した。各検体の
凝集価の決定は実施例２と同じである。

対照として、ｈｕＧＫ−１４細胞由来の精製ＨＢｓ抗原
を用いて上と全く同じ方法で調製したＨＢｓ抗原結合マ
イクロプレート及びＨＢｓ抗原結合粒子により、上記８
０検体に対して凝集価を求めた。

結果については、ＭＳ１２８細胞由来の精製ｌｌＢｓ抗
原を用いた試薬による凝集価と、対照のｈｕＧＫ−１４
細胞由来の精製１１Ｂｓ抗原を用いた試薬による凝集価
との相関を示す形で第３図に表示した。

この図から明らかなように、ＭＳ　１２８細胞由来の精
製ｔｌＢｓ抗原を用いた試薬による凝集価と、対照のｈ
ｕＧＫ−１４細胞由来の精製ＨＢｓ抗原を用いた試薬に
よる凝集価とはよく相関しており、ＭＳ　１２８細胞よ
り得られた精製ＨＢｓ抗原もまたＨＢｓ抗体検出用試薬
として有用である。

以上、Ｂ型肝炎ウィルスゲノムのプレーＳ　ｌ　ｍｌ域
、プレー３２領域、並びにＳ遺伝子のうちの少なくとも
一種以上を保持している細胞として、細胞株ｈｕＧＫ−
１４及びＭＳ１２８を用いた実施例を記載してきたが、
これ以外の細胞株を培養して得られた培養物から調製さ
れたＨＢｓ抗原を利用しても同様な効果を有するＨＢｓ
抗体検出用試薬を得ることが出来ることは当業者には明
白であろう。

〔発明の効果〕

本発明のＨａｓ抗体検出用試薬をエンザイムイムノアッ
セイ、ラジオイムノアッセイ、赤血球凝集法などの）Ｉ
Ｂｓ抗体検出法に利用することによって、ＨＢｓ抗原陽
性のヒト血漿若しくはヒト血清を原料として製造された
ＨＢｓ抗原を主成分として含有する従来のＢ型肝炎ウィ
ルス抗原に対するｌｌＢｓ抗体検出用試薬では検出出来
ないか、或いは掻く僅かの感度しか得ることの出来なか
ったＨＢｓ抗体を高感度に検出できるようになった。し
かも本発明のＢ型肝炎ウィルス抗原に対するＨＢｓ抗体
検出用試薬はその製造に当たってＢ型肝炎の感染の危険
が全（無いものである。

そのうえ本発明によれば、遺伝子工学ないし細胞工学の
技術によりＨａｓ抗体検出用試薬が大量に且つ低コスト
で工業生産することができる。しかも本発明においては
樹立された細胞株も使用することができるので、Ｂ型肝
炎感染の危険性はなく安全にＨＢｓ抗体検出用試薬を得
ることもできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は受身赤血球凝集法でＨＢｓ抗体を検出するに際
し、血清由来のＨＢｓ抗原を用いた従来のＨＢｓ抗体検
出用試薬を使用した場合とｈｕＧＫ−１４細胞由来のＨ
Ｂｓ抗原を用いた本発明に係るＨＢｇ抗体検出用試薬を
使用した場合との検出感度の違いを凝集価で比較したも
のである。 第２図は本発明のＨａｇ抗体検出用試薬を結合させたマ
イクロプレートを用いたエンザイムイムノアッセイによ
るＨａｇ抗体の検出を示すものである。 この図中でローロはＨＢｓ抗体陽性ヒト血清Ｎ１１ｌ、
Ｑ−Ｏはｆｉｎｇ抗体陽性ヒト血清ＮＯ，２、・−・は
ｆｌＢｓ抗体陰性ヒト血清を示す。 第３図は間接凝集反応法においてＭＳ１２８細胞由来の
ＨＢｓ抗原を用いたＨａｓ抗体検出用試薬を使用した場
合と、ｈｕＧＫ−１４細胞のＨａｓ抗原を用いたＨＢｓ
抗体検出用試薬を使用した場合との検出感度の相関を凝
集価で表わしたものである。。 第１図 １１．０．　　２０　　　４０　　　１！ＩＱ　　　　
１６０　　３２０　　６４Ｇ　　　＋２８０　　２５６
０ｈｕＧＫ−１４ｍ胞由来ＨＢｉ抗原を用い？−試！血
清希釈倍数 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムのプレーＳ１領域、プレー
   Ｓ２領域、並びにＳ遺伝子のうち、少なくとも一種以上
   を保持している細胞から産生されたＢ型肝炎ウィルス表
   面抗原を含有することを特徴とするＢ型肝炎ウィルス表
   面抗原に対する抗体検出用試薬。 ２、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムのプレーＳ１領域、プレー
   Ｓ２領域、並びにＳ遺伝子のうち、少なくとも一種以上
   を保持している細胞が、ゲノムにＢ型肝炎ウィルス遺伝
   子が組み込まれている天然の細胞株、及び／又は、Ｂ型
   肝炎ウィルス表面抗原をコードする遺伝子が人為的に細
   胞内に組み込まれた細胞株であることを特徴とする、請
   求項１記載のＢ型肝炎ウィルス表面抗原に対する抗体検
   出用試薬。 ３、該天然の細胞株がヒト肝癌細胞であることを特徴と
   する、請求項２記載のＢ型肝炎ウィルス表面抗原に対す
   る抗体検出用試薬。 ４、該ヒト肝癌細胞が細胞株ｈｕＧＫ−１４であること
   を特徴とする、請求項３記載のＢ型肝炎ウィルス表面抗
   原に対する抗体検出用試薬。 ５、該人為的細胞株が細胞株ＭＳ１２８であることを特
   徴とする、請求項２記載のＢ型肝炎ウィルス表面抗原に
   対する抗体検出用試薬。 ６、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原に対する抗体を検出する
   方法において、抗原として、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの
   プレーＳ１領域、プレーＳ２領域、並びにＳ遺伝子のう
   ち、少なくとも一種以上を保持している細胞から産生さ
   れるＢ型肝炎ウィルス表面抗原を用いることを特徴とす
   る、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原に対する抗体の検出方法
   。 ７、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムのプレーＳ１領域、プレー
   Ｓ２領域、並びにＳ遺伝子のうち、少なくとも一種以上
   を保持している細胞が、ゲノムにＢ型肝炎ウィルス遺伝
   子が組み込まれている天然の細胞株、及び／又は、Ｂ型
   肝炎ウィルス表面抗原をコードする遺伝子が人為的に細
   胞内に組み込まれた細胞株であることを特徴とする、請
   求項６記載の検出方法。 ８、該天然の細胞株がヒト肝癌細胞であることを特徴と
   する、請求項７記載の検出方法。９、該天然ヒト肝癌細
   胞が細胞株ｈｕＧＫ−１４であることを特徴とする、請
   求項８記載の検出方法。 １０、該人為的細胞株が細胞株ＭＳ１２８であることを
   特徴とする、請求項７記載の検出方法。 １１、Ｂ型肝炎ウィルス抗体の検出が免疫学的反応に基
   づくものであることを特徴とする、請求項６記載のＢ型
   肝炎ウィルス表面抗原に対する抗体の検出方法。