JPH08308575A - 組換アデノウイルス - Google Patents

組換アデノウイルス

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JPH08308575A JP7235069A JP23506995A JPH08308575A JP H08308575 A JPH08308575 A JP H08308575A JP 7235069 A JP7235069 A JP 7235069A JP 23506995 A JP23506995 A JP 23506995A JP H08308575 A JPH08308575 A JP H08308575A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｂ型肝炎ウイルスまたはロタウイルスに対す
る抗体または細胞性免疫を産生する経口ワクチンとして
有用な組換アデノウイルスを提供すること。 【解決手段】 Ｂ型肝炎表面抗原またはロタウイルス外
殻タンパク質をコードする遺伝子を欠失初期領域１また
は欠失初期領域３に含有するタイプ４、５または７の組
換アデノウイルス。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、温血動物において
感染性生物、特にＢ型肝炎ウイルスまたはロタウイルス
に対する抗体または細胞性免疫を産生する経口ワクチン
として有用な組換アデノウイルスに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】生物
医学的な研究の主な目的は、免疫法により、ウイルス性
疾病に対する防御法を提供することである。一方法とし
ては、死菌ワクチンを用いることである。しかし、十分
な抗原量を保持するためには、死菌ワクチンでは大量の
材料を必要とする。その上、死菌ワクチンは、しばしば
製造中に望ましくない生成物により汚染される。
【０００３】それ自体がワクチンである適当に操作され
たアデノウイルス（シャノック、アール・エムら、ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエイシ
ョン（Ｃhanock, Ｒ.Ｍ. et al., ＪＡＭＡ）、195、15
1（1966）参照）を用いる異種生ワクチンは、優れた免
疫原であると考えられる。現在、市販のアデノウイルス
は、腸溶皮錠の形態の生感染性アデノウイルスからな
る。接種すべき患者に投与されると、該ウイルスは、上
部呼吸器系（疾病を引き起こす感染が起こると考えられ
る部位）を通って運ばれ、腸内で放出される。腸内で該
ウイルスは腸壁で増殖し、腸内では、アデノウイルス性
疾病は起こらないが、アデノウイルス抗体の形成を惹起
するので、アデノウイルス性疾病に対する免疫が得られ
る。
【０００４】米国では、約２０００００人が、毎年、Ｂ
型肝炎ウイルスに感染している。さらに、Ｂ型肝炎感染
と肝臓ガンの間には、強い相関関係がある。現在市販の
Ｂ型肝炎に対するワクチンは、数種の不連続な段階を含
む長い工程により、健全な保菌者の血漿から生産される
注射可能な製品である。
【０００５】主な２つのＢ型肝炎ウイルス抗原として、
表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびコア抗原（ＨＢｃＡｇ）
がある。ＨＢｓＡｇの抗原構造は多少複雑である。各グ
ループに共通な群特異性決定基ａがある。さらに、２組
の互いに排他的な型特異性決定基、ｄまたはｙ、および
ｗまたはｒがある。ＨＢｃＡｇは単一抗原型である。Ｈ
ＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇに対する抗体の産生により、
Ｂ型肝炎感染に対する免疫が得られることが知られてい
る。
【０００６】微生物によりＨＢｓＡｇを合成するのに、
組換ＤＮＡ技術が用いられてきた。ＨＢｓＡｇは、エシ
エリヒア・コリ（Ｅscherichia coli）において、融合
蛋白質の形態で合成されている（エドマン、ジェイ・シ
ーら、ネイチャー（Ｅdman,Ｊ.Ｃ. et al., Ｎatur
e）、291、503（1981）参照）。酵母において、ＡＤＨ
プロモーター（バレンツエラら、ネイチャー（Ｖalenzu
ela et al., Ｎature）、298、347（1982）参照）、ま
たは、酸性ホスファターゼ・プロモーター（ミヤノハラ
ら、プロシーディグス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ（Ｍiyanohara et al., Ｐroc.
Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ）、80、１（1983）参照）
を用いても合成されている。また、ワクチン性ウイルス
は、肝炎ウイルスに対する生ウイルスワクチンを産生す
るベクターとして用いられる（スミスら、ネイチャー
（Ｓmith et al., Ｎature）、302、490（1983）参
照）。
【０００７】ロタウイルス（Ｒotaviruses）は、乳児に
おける急性胃腸炎の主な原因である。これらのウイルス
は、カプシドに包まれた１１個の二本鎖ＲＮＡのゲノム
を有する。カプシドは、内殻および外殻を有する。外殻
蛋白質の１種であるＶＰ７は、血清型特異性中和抗体と
反応する糖蛋白質である（カリカ、エイ・アールら、バ
イララジィ（Ｋalica, Ａ.Ｒ. et al., Ｖirology）、1
12、385（1981）参照）。この蛋白質は、ヒト１型（Ｗ
ａ）ロタウイルスの遺伝子９によりコードされる。１型
ヒトロタウイルスの遺伝子９は、近年イー・コリ（Ｅ.
coli）においてクローンされ、その配列が決定されてい
る（リチャードソン、エムら、ジャーナル・オブ・バイ
ロロジィ（Ｒichardson、 Ｍ. et al., Ｊ. Ｖirol.）、
51、860（1984）参照）。この蛋白質のいかなる他の系
における発現も報告されていない。
【０００８】アデノウイルスは、２０〜３０のポリペプ
チドをコードする線状二本鎖ＤＮＡ分子（分子量２０×
１０6〜２５×１０6）を含有する。これらの多くは、形
態学上複雑で、複雑な組立プロセスを有するウイルス粒
子内にある。あらかじめＳＶ４０Ｔ抗体を、アデノウイ
ルス組換体を用いて発現しておく（ソルニック、ディ
ー、セル（Ｓolnik, Ｄ., Ｃell）、24、135（1981）、
スンメル、シィら、セル（Ｔhummel, Ｃ. et al., Ｃel
l）、23、825（1981）、グルツマン、ワイら、ユーカリ
オティック・バイラル・ベクターズ、コールド・スプリ
ング・ハーバー（Ｇluzman, Ｙ. et al., in Ｅukaryot
ic Ｖiral Ｖectors, Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、p.187
（1982）参照）。また、マウスジヒドロ葉酸還元酵素
も、アデノウイルス組換体を用いて発現されている（バ
ークナー、ケイおよびシャープ、ピイ・エイ、ニューク
レイック・アシッズ・リサーチ（Ｂerkner, Ｋ. and Ｓ
harp,Ｐ.Ａ., Ｎucleic Ａcids Ｒeserch）、12、1925
（1984）参照）。
【０００９】本発明は、温血動物において感染性生物、
特にＢ型肝炎ウイルスまたはロタウイルスに対する抗体
または細胞性免疫を産生する経口ワクチンとして有用な
組換アデノウイルスを提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
上記目的を達成するために、本発明の組換アデノウイル
スは、Ｂ型肝炎表面抗原またはロタウイルス外殻タンパ
ク質をコードする遺伝子を欠失初期領域１または欠失初
期領域３に含有するタイプ４、５または７の組換アデノ
ウイルスであることを特徴とする。
【００１１】経口ワクチンとして用いる際、上記のよう
に操作された生感染性アデノウイルスは、腸溶皮錠の形
態で投与される。腸内で放出されると、該ウイルスは腸
壁で増殖し、アデノウイルスおよび他の疾病の原因とな
る生物の両方に対する抗体の形成を惹起するか、また
は、細胞性免疫を惹起する。「生ウイルス」なる語は、
「死菌」ウイルスに対して、それ自体、または別の遺伝
物質と結合して、同一の後世代を産生できるウイルスを
意味する。「感染性」なる語は、ウイルス性ゲノムを細
胞中に送達できることを意味する。
【００１２】本発明の組換アデノウイルスを用いた治療
法は、温血動物においてＢ型肝炎ウイルスまたはロタウ
イルスに対する抗体または細胞性免疫を産生する方法を
包含する。この方法は、各々、Ｂ型肝炎抗原またはロタ
ウイルス抗原をコードする遺伝子を含む生組換アデノウ
イルスを温血動物に経口投与することからなる。
【００１３】本発明の組換アデノウイルスを用いた経口
ワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスまたはロタウイルスに対
する抗体または細胞性免疫を産生するために、各々、Ｂ
型肝炎抗原またはロタウイルス抗原をコードする遺伝子
を含有する生組換アデノウイルスからなり、腸溶皮剤の
形態に処方される。
【００１４】以下、本発明の組換アデノウイルスについ
て詳しく説明する。
【００１５】（１）アデノウイルス・ベクター ３種のアデノウイルス・ベクター（グルツマン、ワイ
ら、ユーカリオティック・バイラル・ベクターズ、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ（Ｇluzm
an, Ｙ. et al., in Ｅukaryotic Ｖiral Ｖectors, Ｃ
old Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories）、p.182（1982）
参照）は、容易に構成できる。挿入可能な外来性ＤＮＡ
の長さを最大にするために、ウイルスゲノムの２つの伸
長部分を除去してもよい。即ち、アデノウイルス５型ウ
イルスゲノムの初期領域１または初期領域３（Ｅ１およ
びＥ３）または両方ともを除去してもよい。ΔＥ１は、
プラスミドおよび修飾アデノウイルスＤＮＡ間の in vi
vo の組換えにより生じる（本明細書に記載のプラスミ
ドはすべてイー・コリから増殖させる）。プラスミド
は、地図単位０および１７間のアデノウイルスのＤＮＡ
配列を、ｐＢＲ３２２に挿入し、次いで制限エンドヌク
レアーゼを用い消化および結紮し、地図単位１.４およ
び９.１間の配列を除去し、ＸｂａＩ制限サイトをこの
結合地点に配置することにより形成する。このプラスミ
ドは当該分野でｐＡＣと称されている。４.０位に１つ
のＸｂａＩ制限サイトを有する修飾アデノウイルスＤＮ
Ａを次のように形成している。ＸｂａＩは、野性型Ａｄ
５ＤＮＡを４つのサイト：４、２９、７９および８５単
位で開裂させる。２９、７９および８５サイトが欠失し
ている修飾ＤＮＡは、ＸｂａＩでＡｄ５ＤＮＡを切断
し、ＤＮＡをトランスフェクトし、２９および／または
７９位でＸｂａＩサイトが欠失した修飾アデノウイルス
を単離することにより単離される。この工程を再び行
い、４位にＸｂａＩサイトのみを含有する修飾アデノウ
イルスが単離される。かかる修飾アデノウイルスは、オ
リゴヌクレオチドによる突然変異誘発法（スミス、エム
およびギリアム、エス、ジェネティック・エンジニアリ
ング（Ｓmith, Ｍ. and Ｇilliam, Ｓ. inＧenetic Ｅn
gineering（1981）、セトロウ、ジェイ・ケイおよびホ
レンダー、エイ編（Ｓetlow, Ｊ.Ｋ. and Ｈollaender,
Ａ., Ｅds.)、第３巻、pp.1-32、Ｐlenum, Ｎew Ｙork
参照）を用いても、容易に組み立てることができる。こ
の技術において、ＸｂａＩ制限サイトは、各ＸｂａＩ制
限エンドヌクレアーゼにより決められるアミノ酸をコー
ドする領域においてサイレント変化を生じさせるための
化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いて分解さ
れる。ΔＥ３はＥ３部配列を除去することにより組み立
てられる。２種の修飾アデノウイルス（タイプ５）は、
前記した方法により形成される。一方はＸｂａＩサイト
を含有せず、他方は、２９、７９および８５位にＸｂａ
Ｉサイトのみを含有する。ＸｂａＩサイトを含有しない
突然変異体のＤＮＡの左半分を７９および８５位にＸｂ
ａＩサイトを含有する突然変異体のＤＮＡの右半分と結
合し、７９および８５位にのみＸｂａＩサイトを含有す
る修飾アデノウイルスを形成する。このＤＮＡをＸｂａ
Ｉで開裂させ、次いで再結紮することにより、７９およ
び８５位間にＥ３領域が欠失し、この地点に１つのＸｂ
ａＩクローニングサイトを有するΔＥ３ウイルスＤＮＡ
を形成する。ΔＥ１、ΔＥ３は、同様の方法で両方の領
域における欠失により組み立てられる。
【００１６】アデノウイルスのタイプ５のΔＥ１、ΔＥ
３およびΔＥ１ΔＥ３ベクターの組立と同様の方法で、
タイプ４および７のアデノウイルスのベクターを形成す
る。例えば、タイプ７のアデノウイルスにおいては、Ｅ
３領域は、８０.５位のＸｂａＩサイトおよび８５位の
ＥｃｏＲＩサイト間で欠失している。
【００１７】（２）６Ｘ系プラスミド（ＨＢｓＡｇおよ
びロタウイルスＶＰ７について） Ｂ型肝炎表面抗原またはロタウイルスＶＰ７をコードす
るＤＮＡの上流にアデノウイルス２後期プロモーター、
続いてＳＶ４０スプライシングシグナルを位置させるこ
とのできるプラスミドを組み立てることができる。これ
らの各々をアデノウイルスΔＥ１、ΔＥ３、またはΔＥ
１ΔＥ３ベクターに挿入するためにＸｂａＩサイトでフ
ランキングする。
【００１８】ａ. ｐ６ＸＨ プラスミド６ＸＨは、ＡＤ２主後期プロモーターの−４
００ｂｐにＸｂａＩリンカー、および第１アデノウイル
ス後期リーダーの末端の８ｂｐ前、＋３３ｂｐにＥｃｏ
ＲＩサイトを有する。これに続いて、ＨＢｓＡｇのＡＴ
Ｇの２６ｂｐ前にＥｃｏＲＩリンカーを有し、続いて６
７８ｂｐから８０９ｂｐの別のＥｃｏＲＩリンカーまで
のＨＢｓＡｇ配列を有する。これに続いて、ＳＶ４０地
図上の２７５３〜２５１６ｂｐに伸長するＳＶ４０配列
を有する。これらの配列は、全てＸｂａＩリンカーによ
り、ｐＢＲ３２２の大きいＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラ
グメントに挿入する。
【００１９】ｂ. ｐ６ＸＲ ロタウイルスＶＰ７遺伝子を−４００ｂｐにＸｂａＩサ
イト、および＋３３１にＥｃｏＲＩリンカーを有するＡ
ｄ２主後期プロモーターにヌクレオチド６および１０３
６でＥｃｏＲＩリンカーで連結させ、ＶＰ７遺伝子の後
方２７５３〜２５１６ｂｐのＳＶ４０配列を２７５３
（ＳＶ４０地図での位置）のＥｃｏＲＩリンカーおよび
２５１６ｂｐのＸｂａＩサイトと連結することにより形
成する。このカセットをｐＢＲ３２２の大きいＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントに挿入する。
【００２０】ｃ. プラスミド配列のウイルスＤＮＡベク
ターへの転移および組換アデノウイルスの産生 プロモーター・外来遺伝子−ターミネーターのカセット
のアデノウイルスベクターへの転移は、次のようにする
か、または in vivo での組換え（詳細は後記の実施例
参照）によるかのいずれかにより行う。精製したアデノ
ウイルスベクターＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで開
裂させ、次いで自己結紮を防ぐため、仔牛腸ホスファタ
ーゼで処理する。ｐ６ＸＨまたはｐ６ＸＲをＸｂａＩで
開裂させることにより、プラスミド由来の配列を得る。
これらを次いでアデノウイルスベクターＤＮＡに結紮す
る。２９３セル（グラームら、ジエネティック・バイラ
ラジィ（Ｇrahm, et al., Ｇen. Ｖirol.）、86、10（1
978））、ヘラセル、またはＷｉ３８セルを次いで結紮
混合物でトランスフェクトし、寒天で覆う。プラークを
７〜１０日後に取り出し、ウイルス保存株を調製する。
【００２１】（３）発現分析 Ｂ型肝炎表面抗原およびロタウイルスＶＰ７の発現を評
価するのに３種の分析法が用いられる：
【００２２】ａ. 間接免疫蛍光法 ＨＢｓＡｇまたはＶＰ７ ＤＮＡ配列を含有する組換体
ΔＥ１およびΔＥ３ウイルス保存株の発現を検出するの
に、マウスモノクローナル抗体またはウサギ抗血清を用
いる。ヤギ抗マウスまたは抗ウサギＦＩＴＣで対比染色
する。
【００２３】ｂ. 免疫沈降 組換アデノウイルスで感染させたセルにおけるＨＢｓＡ
ｇまたはロタウイルスＶＰ７の免疫沈降は、ＨＢｓＡｇ
またはロタウイルスＶＰ７に対するマウスモノクローナ
ル抗体またはウサギ抗血清、およびプロテインＡセファ
ロースＣＬ４Ｂを用いて行う。
【００２４】ｃ. ＲＩＡ ＨＢｓＡｇの発現は、商業的に利用し得るラジオイムノ
アッセイ（Ａusria、アボット・ラボラトリーズ（Ａusr
ia, Ａbott Ｌabs.））によっても試験される。
【００２５】（４）組換アデノウイルスの免疫原的性質 腸溶皮カプセルに入れた生凍結乾燥アデノウイルスを、
ハムスターまたはチンパンジーに投与し（１０4〜１０5
５０％感染投与量／錠）、抗体のレベルおよび対抗から
の防御を試験することにより、免疫原性に関して評価す
る。
【００２６】現在市販のアデノウイルスワクチンは、腸
溶皮錠中に、調製した不活性成分と混合したタイプ４ま
たはタイプ７の生凍結乾燥アデノウイルスを含有する。
錠剤（約１０4ＴＣＩＤ50のウイルス）の投与は発病の
ない選択的胃腸管感染を起こす。ワクチンは安全であ
る。即ち、惹起された感染は、特に腸に限られ、ワクチ
ンウイルスは、接種を受けた動物から感染し得る接触者
に伝達されない。特異的中和抗体は、免疫化の２１日
後、接種を受けた動物の９５％以上において見られる。
本明細書に記載の本発明の新規ワクチンは、Ｂ型肝炎表
面抗原およびロタウイルスＶＰ７を発現する組換アデノ
ウイルスからなり、Ｂ型肝炎抗原またはロタウイルスＶ
Ｐ７に対する抗体が、アデノウイルスに対する抗体と同
様に産生される以外は、従来のアデノウイルスワクチン
と同様に処方され作用する。本発明の他の具体例におい
ては、約１０4ＴＣＩＤ50の組換ウイルスまたはこれよ
りかなり少量でも投与することにより、所望の免疫原性
応答が得られる。最適の投与量は、用いる組換アデノウ
イルスによって異なるが、この最適投与量の決定は公知
の通りである。
【００２７】（５）真正ＨＢｓＡｇを発現する組換体の
詳細な例 アデノウイルス組換体の１種の組立ての詳細な例とし
て、ＨＢｓＡｇ翻訳開始コドンの２６ｂｐ上流で翻訳終
止コドンから１３１ｂｐ下流のａｄｗサブタイプのＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を、Ａｄ２主要後期プロモーターの上流の
配列（＋３３〜４００ｂｐ；ソルニック、ディー、セル
（Ｓolnick, Ｄ., Ｃell）、24、135-143（1981）参
照）およびＳＶ４０の下流の配列（２７５３〜２５１６
ｂｐ；ツーズ、ジェイ編、モレキュラ・バイオロジィ・
オブ・チューマー・バイラス、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Ｔooze, Ｊ.（Ｅd.）Ｍolecu
lar Ｂiology of Ｔumor Ｖiruses, Ｃold Ｓpring Ｈa
rbor Ｌaboratory）pp.801-829（1980）参照）によりフ
ランキングする。このプラスミドをｐ６ＸＨと称する
（前記の通り）。これらの配列を、アデノウイルスゲノ
ムの左端のＥｃｏＲＩリンカーからＡｄ５ １７.０のＨ
ｉｎｄIIIサイトに伸びるＡｄ５ ＤＮＡの挿入部を有す
る特異的ＸｂａＩサイトプラスミドｐＡＣに挿入する
（グルツマン、ワイ、ライクル、エイチ、およびソルニ
ック、ディー、（ワイ・グルツマン編）ユーカリオティ
ック・バイラル・ベクターズ、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリーズ（Ｇluzman, Ｙ., Ｒeichl.
Ｈ., and Ｓolnick, Ｄ., （Ｙ. Ｇluzman, Ｅd.）Ｅuk
aryotic Ｖiral Ｖectors, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌa
boratories）、pp.187-192（1982）参照）。任意の順番
でＡd２主要後期プロモーター・ＨＢｓＡｇ遺伝子−Ｓ
Ｖ４０プロセシングシグナルを含有するカセットを有す
る新規プラスミド（ｐＡＣＨ−２およびｐＡＣＨ−９）
をＨｉｎｄIIIで開裂させる。各々のＨｉｎｄIII開裂精
製物を、地図上９.１〜１００に伸びるアデノウイルス
突然変異体ΔＥ１の大ＸｂａＩフラグメントと連結させ
る（グルツマン、ワイ、ライフル、エイチ、およびソル
ニック、ディー、（ワイ・グルツマン編）ユーカリオテ
ィック・バイラル・ベクターズ、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリーズ（Ｇluzman, Ｙ. Ｒeichl,
Ｈ., and Ｓolnicks, Ｄ., （Ｙ. Ｇluzman, ed.）Ｅu
karyotic Ｖiral Ｖectors, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌ
aboratories）、pp.187-192（1982）参照）。このＤＮ
Ａ混合物を、２９３セル（グラハム、エフ・エル、スマ
イリー、ジェイ、ラッセル、ダブリュー・シイー、およ
びネアン、アール、ジャーナル・オブ・ジエネティック
・バイララジィ（Ｇraham, Ｆ.Ｌ., Ｓmiley, Ｊ., Ｒu
ssell, Ｗ.Ｇ. and Ｎairn, Ｒ., Ｊ. Ｇen. Ｖiro
l.）、36、59-72（1977）参照）上でトランスフェクト
し（グラハム、エフ・エルおよびフェン・デル・エブ・
エイ・ジェイ、バイララジィ（Ｇraham, Ｆ.,Ｌ. and v
en der Ｅd, Ａ., Ｊ., Ｖirology）、52、456-467（19
73）参照）、セルをプラーク検出のため、寒天で覆う。
約１０〜１４日後、５４のプラークが得られ、各々から
ウイルス株が生じた。これらのウイルスを32Ｐでラベル
したＨＢｓＡｇ ＤＮＡプローブとハイブリッド形成す
ることにより、ＨＢｓＡｇ ＤＮＡの存在に関してスク
リーンする。陽性のプラーク（５４中４９）を２９３セ
ルの単層上に感染させ、放射線免疫検定法（ＡＵＳＲＩ
Ａ、アボット・ラボラトリーズ社、またはＮＭＬ−ＨＢ
ｓＡｇ ＲＩＡ、ニュークレア−メディカル・ラボラト
リーズ（ＡＵＳＲＩＡ, Ａbott Ｌaboratories, Ｉnc.
or ＮＭＬ-ＨＢsＡgＲＩＡ, Ｎuclear−Ｍedical Ｌabo
ratories）およびＨＢｓＡｇに対するモノクローナル抗
体（抗サブタイプ、ベーリンガー・マンハイム・バイオ
ケミカルズ（Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemical
s））を用いた35ＳでラベルしたＨＢｓＡｇの免疫沈降
の両方法により、セル溶菌液において真正ＨＢｓＡｇの
発現を検出する。
【００２８】（６）前記例において、第１スプライスサ
イトが含まれないように、翻訳開始サイトの３３ヌクレ
オチド下流に伸びるＡｄ２主要後期プロモーターを用い
る。このプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロ
モーターの３部分リーダーの最初の部分しか含有しな
い。しかし、特に３、４、５または７タイプの他のアデ
ノウイルス由来の主要後期プロモーターを用いることが
でき、このプロモーターの完全な３部分リーダーを用い
ることができる。以下の実施例で、Ａｄ２主要後期プロ
モーター、および２００ｂｐ Ａｄ２ ３部分リーダーの
左側の１６８ｂｐ、続いてＨＢｓＡｇ遺伝子およびＳＶ
４０ウイルス由来のプロセシングおよびポリアデニル化
シグナルからなるカセットを有する２種のバクテリアプ
ラスミド、ｐＨＭ１およびｐＨＭ２の組立てを記載す
る。これらのプラスミドもカセットをフランキングする
アデノウイルス配列を含有するので、このカセットをア
デノウイルスゲノムに挿入するのに同種の組換えを用い
ることができる。カセットの左側には、Ａｄ５ゲノムの
左側の３５３ｂｐが位置し、右側には、アデノウイルス
５の８〜１５.５が存在する。プラスミドｐＨＭ１はＨ
ＢｓＡｇ遺伝子の前に１９ｂｐのＳＶ４０ウイルス配列
（ＳＶ４０ヌクレオチド５１７３〜５１７４）を含有す
る。プラスミドｐＨＭ２は、この配列を含有しない以外
はｐＨＭ１と同じである。
【００２９】ｐＨＭ１およびｐＨＭ２由来のカセットを
前記と同じ組換技術により、アデノウイルス５ゲノムの
Ｅ１領域におく。各プラスミドを直線状にし、地図上
９.１〜１００に伸びるアデノウイルス突然変異体ΔＥ
１の大ＸｂａＩフラグメントと連結する（グルツマン、
ワイ、ライクル、エイチおよびソルニック、ディー、
（ワイ・グルツマン編）、ユーカリオティック・バイラ
ル・ベクターズ、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリーズ（Ｇluzman, Ｙ., Ｒeichl, Ｈ. andＳoln
icks Ｄ. （Ｙ. Ｇluzman, ed.）Ｅukaryotic Ｖiral
Ｖectors, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories）、p
p.187-192（1982）参照）。プラークを調べ、各々から
ウイルス株が生じていた。
【００３０】これらのウイルス株（ＨＭ１およびＨＭ
２）をヒト胎児腎臓（２９３）セルライン上に感染させ
た場合（グラハム、エフ・エル、スマイリー・ジェイ、
ラッセル、ダブリュー・シィおよびネアン、アール、ジ
ャーナル・オブ・バイララジィ（Ｇraham, Ｆ.Ｌ., Ｓm
iley, Ｊ., Ｒussell, Ｗ.Ｇ. and Ｎairn, Ｒ., Ｊ.Ｇ
en. Ｖirol.）、36、59-72（1977）参照）、４０時間の
感染後、感染したセル５×１０6個につき約１μｇのＨ
ＢｓＡｇ（放射線免疫検定法およびＮＭＬ−ＨＢｓＡｇ
キット陽性コントロールに対するｃｐｍの比較に基づ
く）が、ＨＭ２感染したセルの培養上清中に観察され
た。ＨＭ１ウイルスより、この量の約６０％が産生され
た。本発明者らは、これらのウイルスにより産生された
ＨＢｓＡｇポリペプチドがグリコシル化された形態（Ｐ
２）およびグリコシル化されていない形態（Ｐ１）であ
ることを見い出した（マリオン、ピイ・エル、サラザ
ー、エフ・エイチ、アレキサンダー・ジェイ・ジェイお
よびロビンソン、ダブリュー、ジャーナル・オブ・バイ
ララジィ（Ｍarion, Ｐ.Ｌ., Ｓalazar, Ｆ.Ｈ., Ａlex
ander, Ｊ.Ｊ. and Ｒobinson, Ｗ., Ｊ. Ｖirol.)、3
2、796-802（1972）；ピーターソン、ディー・エル、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｐet
erson, Ｄ.Ｌ., Ｊ. Ｂiol. Ｃhem.）、256、6975-6983
（1981）参照）。感染後４０時間で、ＨＢｓＡｇの大部
分（７８％）が、ヒト血清において観察される２２ｎｍ
の粒子（ゲリン、ジェイ・エル、パーセル、アール・エ
イチ、ホガン、エム・ディー、ホランド、ピイ・ブイお
よびシャノック、アール・エム、ジャーナル・オブ・バ
イララジィ（Ｇerin, Ｊ.Ｌ., Ｐurcell, Ｒ.Ｈ., Ｈol
land,Ｐ.Ｖ., and Ｃhanock, Ｒ.Ｍ., Ｊ. Ｖirol.）、
4、763-768（1969）；ゲリン、ジェイ・エル、ホラン
ド、ピイ・ブイ、およびパーセル・アール・エイチ、ジ
ャーナル・オブ・バイララジィ（Ｇerin, Ｊ.Ｌ., Ｈol
land, Ｐ.Ｖ., and Ｐurcell, Ｒ.Ｈ., Ｊ. Ｖiro
l.）、7、569-576（1971）参照）と同じまたはほとんど
同じ粒子（密度＝１.２０ｇ／ｍｌ）でセルから培地中
へ分泌された。ＨＭ２により、ＨＭ１よりも約４０％多
いＨＢｓＡｇが産生された。しかし、ＨＭ２を前記ハイ
ブリッドアデノウイルス、ΔＥ１Ｈと比較した場合、Ｈ
Ｍ２ウイルスによりＨＢｓＡｇポリペプチドにおいて７
０倍の増加が見られた。
【００３１】アデノウイルス主要後期プロモーターの代
わりに、他のいかなる適当な真核プロモーター、例え
ば、ヒト金属チオネインプロモーターまたはヒト・ジヒ
ドロ葉酸還元酵素等を用いることができる。さらに、本
実施例においては、外来遺伝子発現用のベクターとして
アデノウイルスタイプ５ＤＮＡを用いたが、他のアデノ
ウイルスタイプもベクターとして使用でき、特に有用な
ものは、タイプ３、４および７であって、ワクチンとし
て用いられる。
【００３２】また、ＳＶ４０ ＤＮＡ由来のプロセシン
グおよびポリアデニル化シグナルの使用を記載したが、
いかなる適当なプロセシングおよびポリアデニル化シグ
ナルを用いることができる。これらはアデノウイルスＤ
ＮＡ、特にタイプ３、４および７由来のものである。
【００３３】本発明のワクチンを製造するにあたり、ア
デノウイルスの欠失した初期領域３に外来遺伝子を挿入
する場合、組換ウイルスは感染性であり、接種では、組
換ウイルスを腸に運ぶことだけが必要である。一方、初
期領域１は、アデノウイルス感染に対して必須である。
従って、外来遺伝子を欠失初期領域１に挿入する場合、
ヘルパーウイルスを同時に投与しなければならない。こ
のヘルパーウイルスは、未修飾感染性アデノウイルスで
あるのが好都合である。また、ヘルパーウイルスは組換
ウイルスにより補足し得る欠失を有する、それ自体は欠
失ウイルスであってもよい。この場合、ウイルス増殖お
よび外来抗原産生は、両方のウイルスで感染したセルに
おいてのみ起こる。この欠失ヘルパーウイルスは、組換
ウイルスと同じでも、異なるサブタイプでもよい。異な
るサブタイプである場合（例えば、組換ウイルスがＡｄ
４サブタイプであって、欠失ウイルスがＡｄ７サブタイ
プである場合）、組換による野性型ウイルスの形成は最
小限にしなければならない。ワクチン製造用のウイルス
の増殖は、ヒト・二倍体線維芽細胞におけるウイルスの
共培養または互いに欠失を補足しあうことが知られてい
るセルラインにおいて別々にウイルスを培養することに
より達成され得る。
【００３４】Ｅ１およびＥ３領域のほかに、プロモータ
ー、３部分リーダー、外来遺伝子、およびプロセシング
およびポリアデニル化シグナルを含有するカセットを挿
入し得るウイルス・ゲノムの他のいくつかの領域があ
る。これらの領域としては、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ間の領
域、ゲノムの左および右側の領域、およびＥ４領域、お
よびＬ５およびＥ４領域間の領域が挙げられる。いくつ
かの例を以下に記載する：
【００３５】Ａｄ５は地図上１.４にＥ１ａプロモータ
ーおよび４.７にＥ１ｂプロモーターを有する。Ｅ１ａ
のポリアデニル化サイトは、地図上４.６、ヌクレオチ
ド１６３１であり、ヌクレオチド１６７１には、Ｅ１ｂ
プロモーターのＴＡＴＡボックスがある。ヌクレオチド
１５７２には特異的ＨｐａＩサイト（ＧＴＴＡＡＣ）が
ある。このサイトはアデノウイルスタイプ２主要後期プ
ロモーターおよびＢ型肝炎ウイルス表面抗原の配置およ
びＥ１ａポリアデニル化サイトの使用に用い得る。Ｅ１
ａのポリアデニル化は、Ｅ１ａの後方のＳＶ４０ウイル
スＤＮＡ由来またはウイルスのＬ４領域由来のポリアデ
ニル化シグナルの配置により起こる。前記組立における
ゲノムにおける別のＤＮＡは、Ｅ３領域において必須で
ないＤＮＡの除去により補償される。
【００３６】他の挿入点は、ゲノムの極端に左側および
右側にある。左端では、挿入点は、Ｅ４プロモーターの
逆転末端反復配列およびＴＡＴＡボックス間である。Ａ
ｄ２において、９９.３地図単位にＭｂｏIIサイトがあ
る。これはウイルスＤＮＡの右端から１９１ｂｐであ
る。Ａｄ５において、ゲノムの左端から２４０ｂｐにＴ
ｈａＩ（ＦｎＵ４ＤII）サイトがある。この領域はＩＴ
ＲおよびＥ４ＴＡＴＡボックスの上流間にある。また、
必要に応じて、余分のＤＮＡを調節するために、Ｅ３欠
失突然変異体に挿入を行う。
【００３７】各々の場合、これらの領域を、現在市販の
アデノワクチンに用い得るアデノウイルスタイプ４およ
びタイプ７種におけるアデノウイルス主要後期プロモー
ター、アデノウイルス３部分リーダー、外来性遺伝子、
およびプロセシングおよびポリアデニル化シグナルのカ
セットの挿入点として用い得る。
【００３８】本明細書では、特にタイプ４、５、または
７のアデノウイルスについて記載したが、本発明におい
ては、いかなるタイプの生感染性アデノウイルスを用い
てもよい。タイプ４または７のアデノウイルスは、商業
的アデノウイルスワクチンで現在用いうるタイプなので
好ましい。同様に、Ｂ型肝炎およびロタウイルスに対す
る抗体を産生するワクチンに関する文献があるが、本発
明により、温血動物が抗体または細胞免疫を産生し、約
３０００までの塩基対からなる遺伝子によりコードされ
る抗原を含有するあらゆる病原に対する経口ワクチンが
提供される。このように、例えば、本発明の範囲内に
は、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器系ウ
イルス性疾病、Ａ型肝炎、後天的免疫欠失症候群（ＡＩ
ＤＳ）、コレラ、イー・コリ、百日咳、ジフテリア、破
傷風、赤痢、淋病、肺炎マイコプラズマ等の疾病に対す
る免疫が含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/15 Ａ６１Ｋ 39/15 (72)発明者 ポール・ポーウエン・ハング アメリカ合衆国ペンシルベニア州19010、 ブライン・モール、ランブルウッド・ドラ イブ506番

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 病原性生物により生じる抗原をコードす
    る遺伝子を含有するタイプ４、５または７の組換アデノ
    ウイルスであって、該遺伝子がＢ型肝炎表面抗原または
    ロタウイルス外殻タンパク質をコードし、かつ、該遺伝
    子が欠失初期領域１または欠失初期領域３に位置するこ
    とを特徴とする組換アデノウイルス。
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