JPH02501187A

JPH02501187A - 新規なワクチンとしての、プレ‐ｓ‐及びｓ‐ペプチドから選択された、異なるエピトープを含んで成る、組換ｄｎａ法により調製されたｈｂｖ表面抗原粒子

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Publication number: JPH02501187A
Application number: JP63505846A
Authority: JP
Inventors: トーマ，ハンス　アー．
Original assignee: メデバ　ホールディングス　ベスローテン　ベノートスハップ
Priority date: 1987-06-22
Filing date: 1988-06-22
Publication date: 1990-04-26
Anticipated expiration: 2013-05-28
Also published as: US6022543A; DE10299017I1; IL86833A0; EP0300213A1; HK1002900A1; ES2167304T3; US6100065A; DE3856496T2; CA1341074C; JPH02501186A; EP0299242A3; US6117653A; DE10299017I2; IL86832A; DE3856496D1; US6072049A; WO1988010300A1; US6589530B1; KR890701742A; ATE207535T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】肪」本発明は、組換ＤＮＡ法により製造されるポリペプチドから構成される肝炎８表面抗原（ｒ）ＩＢｓ抗原」又はｒ　）（ＢＳＡＧＪ　）粒子、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、及び主肌二ｌ量工征土韮士どとλλ医ワクチン製造技術の発展は、細菌、酵母及び哺乳類細胞中でＨＢｓ抗原に対応する、ポリペプチドを合成することを可能にした。しかしながら、ポリペプチドのグリコジル化及び分泌並びに該ポリペプチドから形成される粒子の組成に関する幾つかの欠点のため、細菌及び酵母での真核生物遺伝子の転写は抗原としてのこれらのポリペプチドの有効性に不都合な影響を与える。

例えば、肝炎Ｂウィルスの場合、インビボ生産されるポリペプチド抗原は高度にグリコジル化されている（Ｇｅｒｌｉｃｈ。

１９８４　：　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　：　５２（２）、　３９６）　、原核生物においてグリコジル化は本質的な過程ではなく、遺伝子操作された細菌により生産されるポリペプチドはグリコジル化されていないか、又はグリコジル化が不完全である。いずれの場合にも、ＨＢｓＡｇに対応するポリペプチドは、細菌中で発現される場合、ＨＢｓＡｇに見られるような効果的なワクチンのために十分な抗体を生じさせない。真核宿主としての酵母はより完全なグリコジル化を行うことができるが、酵母中で発現されたＨｂｓＡｇに対応するポリペプチドは細菌での発現の場合と同じ欠陥を有する（Ｍｕｒｒａｙ等、１９７９　：　Ｎａｔｕｒｅ、　２８２５７５　；　Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ等、１９８２　：Ｎａｔｕｒｅ、　２９８＋　３４７　；　Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ等、１９８３　：　ＰＮＡＳ、　８０．１）。更なる例として、細菌中では、ＨＢｓＡｇの真核性構造遺伝子はほとんどの場合効果的に転写されない。さらに、真核性ＨＢｓＡｇ遺伝子産物の構造及び機能はジスルフィド結合の連結の追加の翻訳後過程に依存し、これは細胞宿主においては達成され得ない。

さらに、発現されたポリペプチドはほとんどの場合細菌宿主細胞から分泌されない。発現されたポリペプチドの収得のためにはこれらが溶解されなければならない。精製の過程で、細菌壁成分がポリペプチドに汚染し、そして患者において深刻なアレルギー反応を惹起するか又は過敏性ショックを導（かもしれない。

最後に、真核性プロモーターは通常細菌中では機能せず、そして細菌性プロモーターにより置き換えられなければならず、この細菌性プロモーターは発現されたポリペプチドの修飾をもたらすかもしれない（Ｏｆｆｅｎｓｐｅｒｇｅｒ等、１９８５　：　ＰＮＡＳ、　８２゜７５４０　；　Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ等、１９８０　：　ＩＣＮ−ＵＣＬＡ　Ｓｙｎ＋ｐ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、。

１８５７　）。

、の乏　＼′、゛、肝炎Ｂウィルス（ｒ　ＨＢＶＪ　）の天然形、及びＨＢＶ蛋白質は３種類の区別される形態で存在する。

・　感染性材料であると思われるＨＢＶ−ピリオン〔ゾーン（Ｄａｎｅ）粒子〕・フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔ）・蛋白質エンベロープのみから成る２０又は２２ｎｍ粒子（以後、ｒ２０ｎｍ粒子」と称する）有効なワクチンのための最も興味ある形態は２０ｎｍ粒子である。なぜなら、１）コード配列が完全に知られており、２）全く非感染性であり、そして３）ヒト生物体において幾らかの有用な免疫原性を発揮するからである。

ＨＢＶ粒子の３種類の既知の成分は蛋白質組成のそれらの相対量において異る。

２２６個のアミノ酸を有する主要蛋白質、２８１個のアミノ酸を有する中間蛋白質、及びそれぞれサブタイプａｙｗ及びａｄｗに依存して３８９個又は４００個のアミノ酸を有する大形蛋白質と称される３種類のモノマーが存在する。大形蛋白質はプレーＳペプチド、プレーＳペプチド及びＳ−領域の完全配列によりコードされ、他方中間蛋白質はプレー５ｚｐｌ域及びＳ−領域のみに由来し、そして最後に主要蛋白質はＳ　６３域のみからである（Ｔｉｏｌｌａｉｓ等、１９８５　：Ｎａｔｕｒｅ＋　３１’Ｌ　４８９　；　Ｄｕｂｏｉｓ等、１９８０　：　ＰＮＡＳ、　７７、４５４９　；ＭｃＡｌｚｅｒ等、１９８４　：　Ｎａｔｕｒｅ、　３０７．１７８）　。

ＨＢＶの感染性ピリオン（ゾーン粒子）は、２０ｎｍ粒子に比べて４０〜８０倍多くの高分子量七ツマ−すなわち、プレーＳ。

ペプチド及びプレー３２ペプチドを含有する。これらのプレーＳポリペプチド類が幾つかの生物学的及び臨床的事項と関連性を有することが今や知られている。

プレーＳポリペプチド上のポリアルブミン受容体は、ＨＢＶに感受性のヒト及びチンパンジーからの重合したアルブミンに結合し得る（Ｔｈｕｎｇ等、１９８３　：　Ｌｉｖｅｒ＋　３＋　２９０；　Ｍａｃｈｉｄａ等、１９８４　：　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ。

８６、９１０）。この狭い宿主域及びヒト肝細胞上のポリヒト血清アルブミンに対する既知のりセプターはＨＢＶのへパトトロビズム（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）を説明する：ゾーン（Ｄａｎｅ）粒子は循環から肝細胞により取り上げられたポリヒト血清アルブミンを介して肝細胞に接触することができる。この証拠に基いて、プレーＳペプチドはＨＢＶに対する効率的なワクチンとして有用なはずである。なぜなら、その抗体は肝細胞に入るために必要なゾーン粒子上の存意な部位をブロックすることが期待され得るからである（Ｔｉｏｌｌａｉｓ等、１９８５　：　Ｎａｔｕｒｅ、　３１７゜４８９　；　Ｍｉｌｌｉｃｈ等、１９８５　；　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２８．１１９５）。

文献のデーターちまた、エンベロープ粒子上におけるよりも高い比率でプレＳ、エピトープが存在する感染性デ、−ン粒子に対するよりよい保護を示唆するであろう。

限定された免疫原性保護を生じさせる天然源（例えば提供血）から得られるワクチンはプレーＳ蛋白質を（はとんど）含有せず、これは２つの異る理由による。

第一に、精製工程が非感染性２０ｎｍ粒子に向けられる。これらは、ゾーン粒子中の１５〜２０％に比べてせいぜい１％のプレー３１ペプチドを。

含有する（Ｇｅｒｌｉｃｈ、　１９８４　：　Ｊ、Ｖｉｒ、、　５２（２）、　３９６　：　Ｔｉｏｌｌａｉｓ等、１９８５　：　Ｎａｔｕｒｅ、　３１７．４８９　；　Ｇｅｒｌｉｃｈ、　１９８２　：　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

１．２３．４３６）　、第二に、２０ｎｍ粒子は抗−ＨＢＥ陽性キャリヤー（Ｈｅｖａｃ　Ｂ、　Ｈｅｐａｖａｃ　Ｂ）の血清から単離され、又は精製工程中にプロテアーゼにより消化される。このプロテアーゼ消化は、Ｓモノマーのみを残してプレーＳ−ポリペプチドを切断することが示されている。その結果、これらのワクチンはプレーＳポリペプチドを含有しないか、又はほとんど含有しない。

従って、粒子の組成のために高い免疫原性を有し、細胞中でグリコジル化を受けそして粒子産生細胞から連続的に分泌されるＨＢｓ抗原粒子の形のワクチンの要求が存在する。

１皿文献及び豊丘ＥＰ−Ａ−７２３１８は、酵母レプリコン、酵母プロモーター及びＳペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成るベクターにより形質転換された酵母細胞中でのＨＢｓＡｇの発現を記載している。

Ｌａｕｂ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ、４８．　Ｎα１．２７１−２８０頁、１９８３は、１６３コドンの前駆体配列を含む）ＩＢｓＡｇが導入されているシ、ミアンウイルス４０から出発するベクターの作製を開示している。

Ｌａｕｂ等の報告によれば、該ベクターにより形質転換されたｃｖ−ｉ細胞は、さらに追加の１６３コドンの前駆体配列を含有する上記ベクターに比べて、Ｓ蛋白質のためのコード配列のみをベクターが含有する場合、一層良好な発現をもたらす。

さらに、武田薬品工業の日本特許出願Ｎａ　Ｊ５−８１９４−８９７−Ａは、全体プレーＳペプチド及びＳペプチドの発現を記載している。

ａｄｗサブタイプの発現にも言及されている。

Ｆｅ１ｔｉｌｓｏｎ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ＋　Ｖｏｌ、１３０．７５−９０頁、１９８３は、２４０００、２８０００．３２０００．４３０００及び５ｏｏｏｏダルトンの種を含むプレーＳコード配列内のポリペプチドの部分的発現を記載している。

さらに、ＤＨ−ＯＳ　３４３９４００は、肝炎Ｂウィルスの免疫原性ポリペプチド配列の発現を記載している。

上記の配列はプレー３１ポリペプチドの部分配列を代表し、１０８コドン又は１１９コドンを含み、そしてＨＢｓＡｇの第一出発コドンから始まりそして終止コドンの前の２８１コドンで終わる。

ＥＰ−Ａ−１５４９０２は、肝炎ＢウィルスのエンベロープのプレーＳ鎖コード領域内の少なくとも６個の連続するアミノ酸のアミノ酸鎖を有するペプチドを含有する肝炎Ｂワクチンを開示している。このワクチンは、肝炎Ｂウィルスの天然エンベロープ蛋白質に対応するアミノ酸配列を含有しない。

さらに、）［ｅｎｔ等はＰｅｐｔ、Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ、２２．１６７７０頁、１９８４に、プレー５ｚｊＪｉ域のＮ−末端の２６アミノ酸を含有する化、学合成されたペプチドが抗原として機能することができ、そして従って合成ワクチンとして適当であることを記載している。

主■■且煎前記参照文献はいずれも、２０ｎｍ粒子を構成するモノマーの組成を変え、そしてそれによってゾーン粒子の天然組成に接近することにより、粒子の抗原性が改良され得る可能性を考慮していない。

上に検討したように、ウィルスエンベロープ蛋白質のペプチドモノマーの免疫原性は、集合した蛋白質粒子に比べて非常に貧弱である。本発明の目的は、感染性ゾーン（Ｄａｎｅ）粒子の表面構造の天然組成に匹敵するプレーＳポリペプチドエビトープの量を含有する蛋白質粒子を開発することである。

更なる目的は、すでに市販されているか開発中の他のすべての生成物に比べて良好な免疫応答、長期間の保護、及び低い非−レスボンダー速度（ｎｏｗ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ　ｒａｔｅ）の出現における重要な保護エピトープを含有する追加のプレーＳペプチドを用いることである。

他の目的は、哺乳類細胞中でＨＢｓＡｇを発現せしめることである。これは、哺乳類細胞での目的ペプチドの発現が・３つの翻訳／（転写）生成物のための異る制御機構・プロモーター−プロモーター阻害・出発コドンの強さの相違・発現されるのがペプチドのすべてではないこと、をもたらし得るという既知の困難を克服することを必要とする。

１浬「口ｌ斐この明細書で使用する場合、ｒ　ＨＢＶ　Ｓペプチド」なる語はＨＢＶゲノムの完全なＳ領域によりコードされるペプチドを意味する。この明細書で使用する場合、ｒＨＢＶプレーＳｚペプチド」なる語は、ＨＢＶゲノムの完全なプレー３２領域及びＳ　６Ｎ域によりコードされるペプチドを意味する。この明細書において使用する場合、ｒＨＢＶプレー３１ペプチド」なる語は、ＨＢＶゲノムの完全なプレーＳペプチド、プレー３２領域及びＳ領域によりコードされるポリペプチドを意味する。

この明細書において使用する場合「エピトープ」なる語は、呼称されるゲノム頭載によりコードされる少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列を意味する（例えば、ｒ　ＨＢＶプレー３２エピトープ」はＨＢＶゲノムのプレＳ　Ｇｉ域によりコードされる少なくとも６個のアミノ酸の配列を意味する）。この明細書において使用する場合、「抗原性」は免疫応答を惹起する（例えば、ワクチン又は抗原として作用する）能力、抗体の生産を生じさせる（例えば、抗原として作用する）能力、及ｑ又は免疫応答もしくは抗体の産生を増強するように細胞表面受容体と相互作用する（例えば、Ｔ−細胞表面受容体と反応して免疫応答を増強する）能力を意味する。

ｒＨＢＶＪなる語は、文献（Ｐ、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ。

２８０、８１５頁（１９７９）　；　Ｇｅｒｌｉｃｈ、　ＥＰ−Ａ−８５１１１３６１；　Ｎｅｕｒａｔｈ。

ＥＰ−Ａ−８５１０２２５０）に記載されているあらゆるサブタイプのウィルス、特にａｄｗ、　ａｙｗ＋　ａｄｒ及びａｙｒを意味する。本発明のエピトープがそれに由来することができるペプチド配列の例は第ｖｎｉ−ｘｘ図に示されている。

本発明に従えば、第−ＤＮＡ配列及び第二ＤＮＡ配列を含んで成る組換ＤＮＡ分子が開示される。該第−ＤＮＡ配列はアミノ酸配列の発現をコードしており、該アミノ酸配列の一部分はＨＢＶプレーＳｌエピトープ及びＴ（ＢＶプレーＳ２エピトープから成る群から選択されたエピトープの抗原性を示す。該第二ＤＮＡ配列は、分泌後に直径１０ｎｎ＋以上の粒子を形成するペプチドの発現をコードする。これらの粒子は良好なワクチンを効果的に構成する最小の粒子であると信じられる。好ましくは（分泌後に直径１０ｎｍ以上の粒子を形成するペプチドはＨＢＶ　Ｓペプチド、ＨＢＶコアー抗原、ポリオ表面抗原、肝炎Ａ表面抗原、肝炎Ａコアー抗原、ＨＩＶ表面抗原及びＨＩＶコアー抗原のいずれかである。第二ＤＮＡ配列によりコードされるペプチドとして、ＲＢＶ　Ｓペプチドの実質的な部分又は全部が特に好ましい。第−ＤＮＡ配列及び第二ＤＮＡ配列をコードする組換ＤＮＡ分子において、これらは同じリーディングフレーム内にあり、単一ペプチドのそれぞれの別個の領域をコードし、そして発現制御配列に作用可能に連結されるべきである。最後に、これらの組換ＤＮＡ分子は完全なＨＢＶプレーＳＩペプチド又はＨＢＶブレー３２ペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列を含有しない。

本発明の特定の組換ＤＮＡ分子も開示され、ここで、第−ＤＮＡ配列は、（１）ＨＢＶ７”Ｌ／−３，領域及びプレＳ２−領域であって、プレーＳ２開始コドンＡＴＧが除去されたもの、（２）ＨＢＶプレーＳ、領域及びプレー８２領域であり、ここでプレーＳ、　ＡＴＧに対するフランキング配列が天然配列から変化しているもの、（３）ＨＢＶプレーＳ、領域及びＨＢ■ブレー５ｚＳＪ域であって、ここでプレー３２ＡＴＧに対するフランキング領域が天然配列から変化しているもの、（４）ＨＢＶブレー５１領域及びプレー３２領域であって、ここでプレー３９１域の５′−末端が除去されているもの、（５）ＨＢＶプレーＳ、領域及びプレー８２領域であって、ここでプレー３２領域の５′−末端が除去されているもの、（６）ＨＢＶプレー３１領域であって、ブレー８２領域の３′−末端が除去されているもの、（７）ＨＢＶブレーＳｔ’ｐ１４域であって、ここでプレー３２領域の３′−末端が除去されているもの、又は（８）ＨＢＶプレーＳ、領域及びプレー３２領域であって、これからプレーＳｚ　ＡＴＧが除去されているものに対応するヌクレオチド配列を含んで成り；そして第二ＤＮＡ配列はＨＢＶ　Ｓ領域であってＳ　ＡＴＧが除去されているもの、及び／又は（ａ）第１表に記載するオリゴヌクレオチドに対応する配列を含んで成る。

本発明の組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトされた宿主細胞も開示される。

この明細書において使用する場合、「トランスフェクトされた」又は「トランスフェクション」とはトランスフェクション、トランスホーメーション又は他の手段による宿主細胞への外来ＤＮＡの付加を意味する。宿主細胞は、組換ＤＮＡ分子を転写及び翻訳すること力５できる任意の単細胞生物を包含し、哺乳類細胞、細菌及び酵母を制限なく包含する０本発明の宿主細胞はまた、ＨＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列の実質的な部分又はすべてに対応するアミノ酸配列の発現をコードするＤＮＡ配列を含んで成る第二組換ＤＮＡ分子により同時トランスフェクトされ得る。

第一の個別の領域及び第二の個別の領域を含んで成るペプチドも開示される。該第−領域はＨＢＶプレーＳＩエビ）　−プ又はＨＢＶプレーＳｚエピトープのいずれかのエピトープの抗原性を示す。該第二領域は、分泌の後に直径１０ｎｍ以上の粒子を形成するペプチドの実質的部分に対応する。好ましくは、分泌の後に直径１０ｎ＋ａ以上の粒子を形成するペプチドはＨＢＶ、Ｓペプチド、ＨＢＶコアー抗原、ポリオ表面抗原、肝炎Ａ表面抗原、肝炎Ａコアー抗原、ＨＩＶ表面抗原及びＨＩ■コアー抗原のいずれかである。ＨＢＶ　Ｓペプチドの実質的部分及び全部が好ましい。好ましくは、第一領域は第二領域よりペプチドのＮ−末端近くに位置する。

複数の第一ペプチドモノマーを含んで成る免疫原性粒子も開示される。該第−ペプチドモノマーのそれぞれは、第一の個別の領域及び第二の個別の領域を含んで成り、これらは前記のペプチドの第−及び第二の個別の領域と同一であることができる。さらに複数の第二ペプチドモノマーを含んで成り、そして前記第一ペプチドモノマー及び該第二ペプチドモノマーがこれらのモノマー間の相互作用力により結合している免疫原性粒子も開示される。該第二ペプチドモノマーのそれぞれはＨＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列の実質的な部分又は全部に対応するアミノ酸配列を含んで成る。

実質的に１％より多くの、好ましくは５％より多くのプレーＳ２エピトープを含有する免疫原性粒子も開示される。この明細書において使用する場合、示されるエピトープを有するペプチドモノマーが粒子中の全蛋白質の１％を構成する場合に、粒子が示されるエピトープを「１％含有する」と言う。

１０％より、好ましくは１５％より実質的に多くのプレーＳ２エピトープを含有する免疫原性粒子もまた開示される。

適当なキャリヤーと共に投与された後に免疫応答を惹起するのに十分な濃度で上記の免疫原性粒子を含んで成る、抗体の生産のために有用な製剤又は医薬製剤も開示される。適当なキャリヤーは当業界においてよく知られており、そして簡単な緩衝液を包含する。

適当なキャリヤーと共に投与した後に免疫応答を惹起するのに十分な濃度で前記の免疫原性粒子を含んで成る、抗体の生産のために有用な他の調製物も開示される。適当なキャリヤーは当業界において知られており、そして簡単な緩衝液を包含する。

トランスフェクトされた宿主細胞の製造方法が開示され、この方法はＤＮＡの取り込みのために許容性にされた宿主細胞を用意し、前記の組換ＤＮＡ分子の１つを含んで成るＤＮＡの第一調製物に前記宿主細胞を暴露し、適当な条件下でＤＮＡの前記第一調製物からのＤＮＡの取り込みを前記宿主細胞に許容し、そして外来ＤＮＡを取り込んだ宿主細胞を選択することを含んで成る。この方法はさらに、ＩＩＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡ分子を含んで成るＤＮＡの第二調製物に前記宿主細胞を暴露し、そして適当な条件下でＤＮＡの第二調製物からのＤＮＡを該宿主細胞に取り込ませることを、さらに含むことができる。

ＤＮＡの第二調製物への暴露及びその取り込みは第−ＤＮＡ調製への暴露及びその取り込みの前又は後に行うことができる。あるいは、第−ＤＮＡ調製物はさらに）ＩＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡ分子を含むことができる。

ペプチドの製造方法も開示され、この方法は前記組換ＤＮＡ分子を用意し、該組換ＤＮＡ分子により宿主細胞をトランスフェクトし、該宿主細胞による蛋白質の発現及び分泌を許容する条件下で該宿主細胞を培養し、そして該組換ＤＮＡ分子中のＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドを集める、ことを含んで成る。この方法により製造されたペプチドは組換ＤＮＡ分子のコード領域によりコードされる全アミノ酸配列より少ない部分を含有することができる。これは、組換ＤＮＡ分子のコード領域の一部分のみの転写及び／又は翻訳から、あるいは翻訳後にペプチド中になされる欠失により生ずるであろう。

免疫原性粒子の製造方法が開示され、この方法は、前記組換ＤＮＡ分子を用意し、宿主細胞による蛋白質の発現及び分泌を許容する条件下で該宿主細胞を培養し、そして適当な条件下で該宿主細胞内での外来ＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドモノマーの凝集を許容することを含んで成る。）ＩＢＶ　Ｓペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡ分子により前記宿主細胞をトランスフェクト（同時トランスフェクト）することをさらに含んで成る免疫原性粒子の製造方法も開示される。このトランスフェクションは、前記組換ＤＮＡ分子のトランスフェクションの前、後又はそれと同時に行うことができる。

同時トランスフェクトされたＤＮＡ分子によりコードされるペプチドの存在は、宿主から分泌された痕跡量よりも多くの粒子を得るために必要である。

抗体の生産のために有用な製剤又は医薬製剤が開示され、この方法は、前記の組換ＤＮＡ分子を用意し、宿主細胞を、該宿主細胞による蛋白質の発現及び分泌を許容する条件下で培養し、適当な条件下で、宿主細胞中のＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドの凝集により免疫原性粒子を形成せしめ、そして該免疫原性粒子を適当なキャリヤーと一緒にして、個体への製剤の投与の後に抗体の生産を惹起するのに十分な濃度で該免疫原性粒子を存在せしめることを含んで成る。これらの方法において使用される宿主細胞もまた前記のようにして同時トランスフェクトすることができる。

凹皿■皿華星■里第■図〜第Ｘ図は、本発明の遺伝子の構成を示す。

第ＸＩ図及び第Ｘ■図は、例１０の免疫原性粒子の塩化セシウム沈澱により得られた結果を示す。

第Ｘ■図は、第ＸＩ表に示す従来技術の構成物を示す。

第ＸＴＶ図は、本発明の他の態様に従う構成物に由来する粒子の特徴付けを示す。

第ＸＶ図は、第Ｘ−２図のオリゴ配列を示す。

第ＸＶＩ図〜第ＸＸ図は、本発明のエピトープがそれに由来することができるペプチド配列の例を示す。

すしい能・の發本発明の好ましいＤＮＡ構成物はｄｈｆｒ　（ジヒドロフオレート・レダクターゼ）　、ＭＴ−ｎｅｏ　（メタロチオネインに連結されたネオマイシン耐性配列）、及びＭＴ−ｅｃｏｇｐｔ（メタロチオネイン　プロモーターに連結された耐性配列）から成る群から選択された選択マーカーの存在により特徴付けられる。

この構成物に増幅遺伝子としてｄｈｆｒ遺伝子を付加することにより発現速度をさらに上昇せしめることができる。

本発明の幾つかの構成物において使用されるＨＢＶヌクレオチド配列は、制限断片及び合成オリゴヌクレオチドの単離及び連結を含む任意の手段により形成し又は単離することができる０本明細書に具体的に記載された構成物は、完全なプレーＳ１−プＬ／−３ｔ−３領域を含むＢｇｌ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　Ｉｆ　ＨＢＶ断片（’Ｂｇｌ　Ｔｌ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片」）に由来する第１Ｘ図に示すＨＢＶゲノムのＳ領域からの５　’　Ｘｂａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　３　’断片（以下、ｒＸｂａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片と言う）に合成オリゴヌクレオチドを連結することにより形成された。ＨＢＶゲノムのプレーＳ。

−プレーＳ、−Ｓ領域を第１Ｘ図に示す。これらの構成物の作製に使用されるオリゴヌクレオチドを第１表に示す。

第−上一人ベ　−　のｔ−〇第１ゴヌ　レオ　゛−°ユ°しＬ之ス１７　ＢｇｌＩＩ−ＡＴＧ−Ｓ２−ＥｃｏＲＩ　Ｓ２（交換される　ＧＡＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＴＧＧフランキング　配列ＡＴＧ）第１表（続き）ベタ　−　のための第１ゴヌクレオチドー゛ユプレ・クス第１表中のオリゴヌクレオチドをＸｂａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片に結合して所望の性質を有する構成物を製造した。幾つかの構成物においてはアダプターオリゴヌクレオチド（第■ 表）を用し）てオリゴヌクレオチド及び他の構成成分上に適切にマ・ンチする付着末端を形成した。

２　Ａｐａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ｎ　−Ｈｌｎｄ　ｍ　ＣＴＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＣＣＧＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＣＧ八４　Ｍｓｔ　ＩＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ　ＴＣＡＧＧへＣＣＣＴＧＡＧＣＴ７　ＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍ　−ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＢｇｌ　ＩＩ　ＧＴＴＣＧＡＡＴＣＴＡＧ９　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　−ＢａｍＨＩ　ＴＣＧＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＣ１５ＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　ＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧ２７　ＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　■−ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＢａｍＨＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍ　ＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＧＡ３１　Ｂａｆｆ１ＨＩ−Ｈｉｎｄ　ｍ　ＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡ４１　Ａｐａ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ　ＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴ４７　Ｘｂａ　Ｉ　−ｐｏｌｙａｌａｎｉｎｅ−ＣＴＡＧＡＣ（２０ＨＧＣＣ）ＧＡＣＸｈｏ　Ｉ　ＴＧ（２０ＨＣＧＧ）ＣＴＧＡＧＣＴ５３　ＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｘｂａ　Ｉ　ＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣ−Ｘｈｏ　Ｉ　ＧＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＧＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＧＣＴ第１表の所望のオリゴヌクレオチドをＸｈａ　Ｉ　Ｂｇｌ　ＩＩ断片、他の制限断片、オリゴヌクレオチド及び他の構成物成分と連結するために他のアダプター配列を使用することができる。

このような他のアダプター配列の必要な配列は、制限部位の表〔例えば、漁旦ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｒｎｏｌｏ　、　Ｖｏｌ、１５２．　”Ｇｕｉｄｅ　ｔ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、　Ｂｅｒｇｅｒ及びＸｉｍｍｅ１ｍ集（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７）　、これを引用によりこの明細書に組み入れる〕、及び連結されるべき種々のヌクレオチドを考慮して、当業者に容易に明らかであろう、アダプター配列はまた、本発明の構成物に追加の制限部位を導入するためにも使用することができる。なお、アダプター配列は、ＨＢＶ配列にわたって適切なリーディングフレームが維持されるように選択され又は設計されなければならない。

宿主細胞をトランスフェクトするために使用される好ましい遺伝子構成物は本発明に従って組換ＤＮＡ技法により調製された。増強された発現を伴う構成物の好ましい具体例は第１図〜第■図に示され、そして次の様に模式的に示される。

ｐＵ２−構造遺伝子ｐＵ２−構造遺伝子−ｄｈｆｒｐＵ２−構造遺伝子−ｄｈｆｒ−ＭＴ−ｎｅ。

ｐｔ１２−構造遺伝子−ｄｈｆｒ−ＭＴ−ｅｇｐｔｐ肘−構造遺伝子−ｄｈｆｒｐＭＴ−構造遺伝子−ｄｈｆｒ−ＭＴ−ｎｅ。

ｐＭＴ−構造遺伝子−ｄｈｆｒ−１１Ｔ−ｅｇｐｔｐＨ２に一構造遺伝子−ｄｈｆｒｐＨ２に一構造遺伝子−ＭＴ−ｎｅ。

ｐＨ２に一構造遺伝子−ＭＴ−ｅｇｐｔｐ）１２に一構造遺伝子−ｄｈｆｒ−肘 −ｎｅ。

ｐＨ２に一構造遺伝子−ｄｈｆｒ−ＭＴ−ｅｇｐｔ第１図〜第■図中に示される構成物のそれぞれは、ＨＢＶ配列に加えて、ＭＴプロモーターを伴うネオマイシン選択マーカー、ｄｈｆｒ選択／増幅遺伝子、及びＨＢＶ配列のためのプロモーターを含有する。ＨＢＶ配列のためのプロモーターは好ましくはＵ２プロモーター、ＭＴプロモーター又は）（２にプロモーターである。種々のプロモーター、選択マーカー及び増幅遺伝子を含む断片の単離を後記する。第■図〜第■図中の構成物中のＨＢＶ配列は各図中の長方形の棒により模式的に示されており、これはＸｂａ　Ｉ　Ｂｇｌ　Ｉｆ断片と連結された第１表及び第■表からのオリゴヌクレオチド及び／又はアダプター配列を示している。棒中の影を付した部分は一般に、特定の構成物には見出されない完全なプレーＳ、−プレー５２ＳｆｉＩ域を模式的に示す。ＨＢＶ配列の各タイプを構成するために使用され得る第１表からのオリゴヌクレオチドがこれらの図中に示される。

第Ｘ図は、ＭＴプロモーターの制御のもとてプレー３２領域からの配列を含むペプチドの発明のための２つの追加の構成物を示す。

ＵＳプロモーターの制御のもとにＨＢＶゲノムがらの全Ｂｇｌ　Ｕ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片を含む構成物も作られた。これらの構成物は、ウェスタンプロット分析により示されるようにＳ領域の欠失を含むペプチドを生産した。

上記のプロモーターは、それらの使用が発現を増強するためにｄｈｆｒ遺伝子及びメトトレキセートを用いるモジュレーション法、と組み合わされる場合、特に好ましい。これは、選択マーカーに加えてｄｓｆｒミニ遺伝子（ｍｉｎｉ　ｇｅｎｅ）もプラスミド配列中に導入される場合に達成される。ｄｈｆｒ遺伝子が、発現されるべき構造遺伝子と一緒に同じプラスミド上に位置することが必須である。次に、州の濃度範囲でメトトレキセートを添加することにより構造遺伝子の発現速度の増強が得られる。こうして発現速度の多数倍の増強が達成される。

適当な細胞は例えばＶＥＲＯ細胞（モンキー腎セルライン）、３Ｔ３−細胞（ネズミ繊維芽細胞系）　、Ｃ１２７−細胞（ネズミ繊維芽細胞系）、Ｌ−細胞、及びＣＨＯ−細胞（チャイニーズ・ハムスター細胞、これはデヒドロフオレート　リダクターゼ陽性又は陰性である）である。

終止シグナルとして、真核細胞からの終止シグナルを用いるのが好ましい。後扛の例にわたって使用される場合、ｒＨＢＶ蛋白質蛋白質膜にＨＢｓＡｇ配列に対応する本発明に従って生産される任意の蛋白質を意味する。

翌１ｊ− ｎ３」ｌ１汰１、　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　）により分画された沈澱ＨＢＶ蛋白質住産培養物の上滑を集め、そして２，４００−の部分に分割した。各部分に１４４ｇのＰＥＧ　６０００（Ｓｅｒｖａ）を加え、そして室温にて２０分間撹拌することにより撹拌し、そして４℃にてさらに６時間撹拌した。　５００ａｆのボトル中Ｇ３３０−ター中で９．０００ｒｐ＋＊　（１５，０ＯＯＸ　ｇ　）にて３０分間１０°Ｃで遠心することにより沈澱を分離した。上清を集め、そして１４４ｇのＰＥＧ　６０００を添加し、そして上記の様にして溶解した。この溶液を４℃にて３時間撹拌した。この溶液からの沈澱を上記の様にして収得したが、遠心は６０分間続けた。

２、　ゲルクロマトグラフィーＰＥＧ後に得られた材料を２０ｍｆＰＢＳに再溶解し、そしてＡ　−５ｍ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　）上でのゲルクロマトグラフィーにかけた。カラムの寸法は２５　Ｘ　１０００ｓｎで、ヘッドポリウム４８０　＋ｎＺであった。典型的な分画操作においては、１Ｏ−１５ｒｎｌ中ＰＥＧ沈澱したＨＢＶ蛋白質１，０００ｇを負荷し、そしてＰＢＳにより６滴／分（ｌｅａｆ／時）の速度で３−ずつの百分を集めた。

ＨＢＶ蛋白質は最初のピークと共に溶出した。集められた両分はＣ５Ｃｊ！グラジエントにかけられた。

３、ＣｓＣｌ１グラジエントにおける沈降Ａ−５ｍ上でのカラムクロマトグラフィーの最初のピークを包含し、そして予備精製されたＨＢｖ蛋白質を集めて約１００−とした。この溶液を１．３０　ｇ　／　ｃｃの密度にＣ５Ｃｊ！により調整し、そして次にＳＷ　２７／２８０−ター（ベックマン）に装着されたニトロセルロースチューブに移した。１．３５　ｇ　／　ｃｃのＣ５Ｃｊ！溶液４ｍｌの上層及び１．２５ｇの４−及びこれに続＜　１．２０ｇ　／　ｃｃの４−の下層によりグラジェントを設定した。このグラジェントを２８，０００　ｒｐｍにて５０時間１０°Ｃにて運転した。

次に、グラジェントを分画し、そして１．２０　ｇ　／　ｃｃ密度層に浮く精製されたＨＢＶ蛋白質を集めた。水に対してバッグ中での３ライクルの透析により溶液を脱塩した。

ＨＢＶ　白　の１、　ラジオイムノアッセイによるＡＵＳＲＲＩＡ　ｌｌ−１２５ｒサンドインチ」ラジオイムノアッセイ（アボットから市販されている）において、肝炎８表面抗原に対するモルモット抗体（Ａｎｔｉ−ＨＢｓ）を血清もしくは血漿又は精製された蛋白質及び適当な対照と共にインキュベートした。

存在するすべてのＨＢｓＡｇを固相抗体に結合せしめた。未結合物質の吸引除去及びビーズの洗浄の後、ヒ）　１２５Ｔ−Ａｎｔｆ−ＨＢｓをビーズ上の抗体− 抗原複合体と反応せしめた。次に、ビーズを洗浄して未結合１２５Ｉ−Ａｎｔｉ −ＨＢｓを除去した。

）−八ｎｔｉ−ＨＢｓ　ＨＢｓＡｇ）−Ａｎｔｉ−ＨＢｓ　、ＨＢｓＡｇ　１２５Ｉ−Ａｎｔｉ−ＨＢｓ）−Ａｎｔｉ−）ＩＢｓ　、ＨＢｓＡｇ　、　１２５−Ａｎｔｉ−ＨＢｓビーズ上に残る放射能をγ−シンチレーションカウンターで計数した。

２、ＥＬＩＳＡによるＥｎｚｙｇｎｏｓｔ　ＨＢｓＡｇ　ミクロ「サンドインチ」アッセイ（Ｂｅｈｒｉｎｇから市販されている）において、ウェルを抗−ＨＢｓによりコートした。

血清もしくは血漿又は精製された蛋白質及び適当な対照をウェルに加え、そしてインキュベートした。洗浄後、ＨＢｓＡｇに対するパーオキシダーゼラベル化抗体を残留する抗原決定基と反応せしめた。未結合の酵素リンク抗体を洗浄により除去し、そして固相上の酵素活性を決定する。過酸化水素と発色剤との酵素触媒反応を希硫酸の添加により停止せしめた。色の強さはサンプルのＨＢｓＡｇ：ａ度に比例し、そして未知サンプルの色の強さを陰性及び陽性対照領域の色の強さと光度計比較することにより決定された。

■−主メ　ロチオネインプロモーターを１−するＣ００（７）璽袈１、ＭＩプロモーターの単離プラスミドｐＢＰＶ−３４２−１２（ＡＴＣＣから商業的に入手可能）をエンドヌクレアーゼＢｇｌｌＩ及びＢａ１ＩＩ）ｌ　Ｉにより消化した。３つのＤＮＡ分子が生じた。目的の断片はメタロチオネインプロモーター及び４．５ｋｂから成るｐＢＲ３２２配列を含有し、そして他の断片（２，０ｋｂ及び７．６ｋｂ）から容易に検出できる。

反応は合計容量２００Ｉの反応緩衝液中、各制限酵素１００ユニツトを含む０．５ｘｒ／μｆＤＮＡの最終濃度において行った。

３７°Ｃにて３時間のインキュベーションの後、０．８％アガロースゲルでのアガロースゲル電気泳動により反応の完了をチヱックした。４Ｉの０．５　Ｍ　ＥＤＴＡの添加により反応を停止した。

４．５ｋｂ断片を、分取用１．２％アガロースゲル電気泳動により他の断片から分離した。ＤＮＡをアガロースゲルからＤＨ−８１ワットマン濾紙に溶出し、ここからＤＮＡを高塩緩衝液中に取り出した。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、及び２回のエタノール沈澱により精製した。

２．２．３　ｋｂ　ＭＢＶ　Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　■断片の連結ＨＢＶプレーＳＩ＋プレーＳ２及びＳコード領域を含有する２、　３　ｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　Ｉｆ断片を、ＨＢＶ含有ＤＮＡから単離した。この２．３ｋｂ断片を、メタロチオネインプロモーターを含有する４、５ｋｂ断片（１，に記載したようにして得たもの）と連結した。

２１１１の２．３ｋｂ断片を３μ！の４．５ｋｂ断片と混合し、そして２ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ及び２ｍＭＡＴＰを含有する合計容量１０ｍの連結緩衝液中で１４°Ｃにて一夜連結した。

ＤＮＡの取り込みのため、連結混合物を１５０ｍのコンピテント細菌細胞懸濁液に加えた。ＤＮＡの取り込みの後、細菌細胞を５０汀／−アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に、プレート当り５０〜３００Ｉの細胞懸濁液の容量で拡げた。

この寒天プレートを３７°Ｃにて一夜インキユベートした。単一の単離された細菌コロニーを、目的の断片を含有するプラスミドの存在についてスクリーニングした。

３、　目的プラスミドを含有する細菌コロニーのスクリーニング単一コロニーをつまようじで拾い上げ、そしてＬＢ−アンピシリン培地を収容するチューブ（５ｔｄ）に移した。このチューブを速く振とうしなから３７°Ｃにて一夜インキユベートした。各増殖した細菌懸濁液のミニ−プラスミド調製を行った。異る生ずるＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥＣＯＲＩによる消化によってプローブした。２つの分子、すなわち２．２ｋｂ断片及び４．６ｋｂ断片が予想された。消化物をアガロースゲル電気泳動により分析した。細菌細胞からプラスミドを単離した。

４、ＨＢＶ−遺伝子配列の一部分の変換上記３．から得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼＢｇｌｌＩ及びＸｂａ　Ｉにより消化した。２つの分子、すなわち１個の５５０ｂｐ断片及び１個の６．２５０ｋｂ断片が予想され、これをアガロースゲル電気泳動により単離した。

この６．２５０ｋｂ断片を第１表のオリゴヌクレオチドＮα５５と連結した。ＤＮＡの取り込みのため、連結混合物を１５０Ｊｌｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に加えた。単一の単離された細菌コロニーを目的プラスミドの存在についてスクリーニングした。新しいプラスミドをエンドヌクレアーゼＩＩＥｃｏＲ１及びＢｇｌ　Ｉｆによる消化によってプローブした。２つの分子、すなわち１個の１．９　ｋｂ及び１個の４．４５０ｋｂが予想された。

５、　ネオマイシン選択マーカーの単離上記４．から得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって線状化した。合計容量５０Ｊ１１及び最終濃度１ｘ／ＩｌｔプラスミドＤＮＡで反応を行った。５０ユニツトのＥｃｏＲ■をを添加し、そして３７°Ｃにて３時間のインキュベーションの後アガロースゲル電気泳動により消化物をプローブした。ＩＩのＱ、　５　Ｍ　ＥＤＴ’Ａの添加により反応を停止せしめ、そして最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び３〜４容量のエタノールにより一８０°Ｃにて３０分間ＤＮＡを沈澱せしめた。沈澱したＤＮＡを５０Ｊ１１の蒸留水中に溶解した。

２ｔｔ！の線状化されたプラスミドを、メタロチオネインプロモーター及びネオマイシン選択遺伝子〔エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによる消化によってプラスミドｐＭＴ−ｎｅｏ−Ｅ（ＡＴＣＣから入手可能）から４ｋｂ断片として単離したもの〕を含有するＤＮＡ断片３Ｊｌｌと混合し、そして連結した。単一細菌コロニーを目的プラスミドの存在についてスクリーニングした。

５、ｄｈｆｒ増幅遺伝子ｄｈｆｒの付加プラスミドｐｄｈｆｒ３．２　（ＡＴＣＣから入手可能）を制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄＩ［［により消化した。２つの分子、１個のすなわちｄｈｆｒ遺伝子配列を含有する３、０００ｂｐ及び１個の３．４００ｂｐが生じた。３．０ＯＯｂｐ断片を単離し、そして上記５．から得られるプラスミドであってＨｉｎｄｌｌによりあらかじめ開環したものに連結した。生ずるプラスミドを第１−２に示す。

■−土１、　Ｕ２プロモーター配列を含有する断片の単離プラスミドｐＵｃ−８−４２（Ｅｘｏｇｅｎｅから入手可能）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＡｐａ　Ｉにより消化した。２つのＤＮＡ分子が生じた。目的の断片は３４０ｂｐを含んで成るＵ２−プロモーターを含有し、そして他の断片（３１６０ｂｐ）から容易に検出できる。全容！　２００ｍの反応緩衝液中、１００ユニツトの各制限酵素を含む０．５ｇ／ｍＤＮＡの最終濃度において消化を行った。３７°Ｃにて３時間のインキュベーションの後、０．７％アガロースゲル中アガロースゲル電気泳動により消化の完了をチエンドした。４ｕ！の０．５　Ｍ　ＥＤＴＡを添加することにより反応を停止した。３４０ｂｐの断片をプラスミドＤＮＡから、分取用１．２％アガロースゲル電気泳動により分離した。

ＤＮＡをアガロースゲルからＤＨ−８１ワットマン濾紙に溶出し、ここからＤＮＡを高塩緩衝液中に取り出した。フェノール／クロロホルム抽出及び２回のエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。

２、　ポリリンカープラスミドへのプロモーター配列含有断片の挿入ポリリンカー配列（制限部位：　ＢｃｏＲＩ　＋Ｓａｃ　Ｉ　＋Ｓｍａ　ｌ　、Ａｖａ　Ｉ　＋ＢａｍＨＩ　、Ｂｇｌ　ＩＩ　＋Ｓａｌ　Ｉ　＋Ｐｓｔ　Ｉ　、ＨｉｎｄＩ［［を含有する）を含有するプラスミドｐｓＰ１６５を制限酵素ＥｃｏＲＩにより線状化した。全容量５０ｊ１１及び１ｇ／、ＪプラスミドＤＮＡの最終濃度中で反応を行った。５０ユニツトのＥｃｏＲＩを添加し、３７°Ｃにて３時間のインキュベーションの後アガロースゲル電気泳動により消化をプローブした。ＩＪの０．５　Ｍ　ＥＤＴＡを添加することにより反応を停止し、そして最終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び３〜４容量のエタノールにより一８０℃ にて３０分間ＤＮＡを沈澱せしめた。沈澱したＤＮＡを５０Ｊ１１の蒸留水に溶解した。

２ＩのプラスミドＤＮＡを、Ｕ２プロモーター配列を含有するＤＮＡ断片１０ＪＪ１と混合し、そして２ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ及び２ｍＭＡＴＰを含有する合計容ｉ！２５Ｊｌｌの連結緩衝液中で１４°Ｃに゛て一夜連結した。この後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出及びこれに続く２回のエタノール沈澱により精製し、そして１０ｍの蒸留水に溶解した。ＥｃｏＲＩ及びＡｐａ　Ｉの生ずる付着末端を平滑化しそして連結しなければならなかった。平滑末端はムングビーン（Ｍｕｎｇビーン）ヌクレアーゼを用いる除去反応により次の様にして転換された。

２５ｊ１１（７）ＤＮＡ　（：ａ度１ｘ／ｍ）反応緩衝液に、２０ユニツトの酵素及び最終濃度１％のグリセロールを３５Ｊ１１の反応容積となるように添加した。３０℃にて３０分間のインキュベーションの後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出及びこれに続く２回のエタノール沈澱によって精製した。ＤＮＡを５Ｉの蒸留水に再溶解した。生ずる平滑末端を、上に使用したのより１０倍多いＴ４リガーゼ及び２ｍＭＡＴＰを含有する反応容量１５Ｉ中で、１４°Ｃにて一夜連結した。

ＤＮＡ取り込みのため、連結混合物を１５０４のコンピテント細菌細胞懸濁液に添加した。ＤＮＡの取り込みの後、細菌細胞を、５０ｎ／ｌｔｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に、プレート当り５０〜３００１１！細胞懸濁液の容量で拡げた。

単一の単離された細菌コロニーを、目的のＵ２−プロモーター断片を含有するプラスミドの存在についてスクリーニングした。

３、　目的のプラスミドを含有する細胞クローンのスクリーニング単一コロニーをつまようじにより拾い上げ、そしてＬＢ−アンピシリンを収容するチューブ（５−）に移した。このチューブを速く、振とうしながら３７℃にてインキュベートした。

各増殖した細菌懸濁液のミニ−プラスミド調製を行った。異る得られたプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌ及びＨｉｎｄｎ［の両者によって消化してプローブした。２つの分子、すなわちＵ２プロモーター配列を含有する４ｏｏｂｐ断片及び２、７００ｂｐのプラスミドが見出された。消化物をアガロースゲル電気泳動により分析した。生じたプラスミドを細菌細胞から単離した。

４、　ネオマイシン選択マーカーの挿入プラスミドｐＢＰＶ−３４２−１２（ＡＴＣＣから商業的に入手できる）をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨＩにより消化した。２つの分子、すなわち４．０００ｂｐのネオマイシン選択遺伝子と共にＭＴプロモーターを含有するもの及びｉｏ、　ｏｏｏｂ、のプラスミドを単離した。

前記３．から得られたプラスミドをＥｃｏＲＩにより線状化し、そしてネオマイシン選択遺伝子と共にＭＴ−プロモーターを含有する４、０００ｂｐ断片と連結した。生ずる付着末端をやはり平滑化し、そして前記のようにして連結した。

細菌形質転換、コロニー選択及びミニプラスミド調製の後、生ずるプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ［［を用いる消化によって分析した。２つのＤＮＡ分子、すなわち４００ｂｐ断片及び６，７００ｂｐ断片を単離した。

５．　Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩｎ断片連結上記４．からのプラスミドをＢｇｌ　ｎにより線状化した。２．３ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　Ｉｆ断片を該線状化されたプラスミドと連結した。生ず、るプラスミドを見出すため細菌コロニーを分析した。

プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そして生ずる２つの断片、すなわち’ ｒｏｏｂｐ断片（プロモーター及びＨＢＶ−配列の部分を含有する）及び８．７００ｂｐ断片（ＩＩＢＶ配列の残りの部分、ＭＴ−ｎｅｏ及びプラスミド）を得た。

６、ＨＢＶ配列内の変更上記５．からのプラスミドをエンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ及びＭｓｔｌＩにより消化した。２つの分子、すなわちプレーＳ配列の部分を含有する３００ｂｐ及び前記のようにして溶出された他方（９，０ＯＯｂｐ）が生じた。この９．１００ｂｐ断片を、変更されたプレーＳ、遺伝子配列をコードする他方のＢｇｌ　ＩＩ　／Ｍｓｔ　ｎ　２１６ｂｐ断片（配列：ＣＡ　Ａ　ＧＧ　ＡＣＡ　ＣＣＴＧＧ　ＣＣＡ　Ｇ　ＡＣＧＣＣＡ　Ａ　ＣＡ　Ａ　Ｇ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＧＣＴＧＧ　Ａ　ＧＣＡ　ＴＴＣf　ＧＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡ　Ｃに連結した。

目的プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、そして２つの生ずる断片、すなわち６１６ｂｐ断片及び８．７００ｂｐ断片を単離した。

改ＬｉＨ２にプロモー　−の　− Ｈ２にプロモーターをｐｓｐ６５Ｈ２（Ｅｘｏｇｅｎｅから入手可能）からＥｃｏＲＩ　／Ｂｇｌ　ｎ断片（２ｋｂ）として得た。

ｅｕｎ　マー′カーのメタロチオネインプロモーター及びｅｇｐｔ−選択遺伝子を含有する断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩによるプラスミドｐＭＳＧ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）の消化により、３゜６ｋｂ断片として単離した。

他のすべてのプラスミド構成は、同様にして、必要な成分を含有する断片を結合せしめ、そして目的のオリゴヌクレオチド及びアダプター配列（必要な場合）を用いることによりＨの　による　類　のトランスフェクション本発明の構成物によりコードされたＨＢＶペプチドの実質的量の分泌を達成するためには、哺乳類細胞が本発明の構成物及び全Ｓ蛋白質を発現する構成物の両者によりトランスフェクトされなければならない、トランスフェクションは２つの段階（すなわち、各構成物のための別々のトランスフェクション）、又は第一段階（すなわち、１つのトランスフェクションが両構成物の調製物を使用）で行われた。同時トランスフェクションは、２つの構成物上の異る選択マーカーにより、又はイムノアッセイによる両構成物の発現生成物の分泌の検出により確認された。

あるいは、本発明のＨＢＶペプチド配列をコードする配列、及び全Ｓ蛋白質をコードする個別の配列を単一の構成物中に結合せしめることができよう。

■−に瓜負立汰本発明を実施するのに、有用な一般的方法は、（１）　Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　＋　Ｖｏｌ、１５２．　’Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｃｑｕｅｓ　ＨＢｅｒｇｅｒ　及びＫｉｍ＋＊ｅｉ［（アカデミツクプレス）、及び（２）　Ｍａｒ＋１ａｔｉｓ等“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ” （Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２）に見ることができ、このいずれも引用によりこの明細書に組み入れる。

使用される特定の技法を後に記載する。

１、　エンドヌクレアーゼによる消化及び断片の単離使用した制限エンドヌクレアーゼはＢｇｌ　ｎ　、　ＢａｍＨＩ　、　Ｈ３ｎｄＩ［Ｉ、ＥｃｏＲＩ　、　ＸｂａＩ　、　ＭｓｔＩｒ　、　ＸｈｏＩ　、　ＰｆｌＭＩであり、これらはこれらそれぞれの制限緩衝液と共にＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから市販されてして断片を単離した。反応は典型的には１〜５ｎのり、ＮＡを含有した。

・蒸留水をエッペンドルフチューブ中のＤＮＡに最終体積８Ｉまで加えた。

・１４の適当なＩＯＸ消化緩衝液を加えた。

・ＩＩ（５〜ＩＯＵ含有）の制限酵素を受え、そして注意深く混合した。

・反応チューブを３７°Ｃにて１時間インキュベートした。

・０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を最終濃度１０ｍＭに添加することにより消化を停止した。

・ＤＮＡがゲル上で直接分析される場合、１ｊｔ１のゲル負荷色素ｍ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ）を添加し、混合し、そしてサンプルを０．５％アガロースゲルのスロットに負荷した。

アガロースゲルは通常、０．８％アガロース、ＩＸ泳動緩衝液（ＴＢＢ＋　Ｍａｎｉａｔｉｓ）を含有する。断片（約１００〜１０００ｂｐ）がアガロースゲルから単離される場合、アガロースは】。２〜１．４％に増加された。

２、　コンピテント（受容性）細菌細胞濃厚な一夜培養物からの１ｍＺの細菌細胞懸濁液を１００ｒＩｉの新鮮な増殖培地（Ｌ−ブロス）に添加した。細胞を３７°Ｃにて０Ｄｂｏ。＝０．７の密度に増殖せしめた。この密度は５００−のエルシンマイヤーフラスコ中で激しく振とうして２時間以内に達成された。培養物を氷上で１０分間冷却することにより増殖を停止せしめた。この培養物から３− を取り、３０００ｒｐｍにて５分間、指数期の細菌細胞を収得した。細胞を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）中５０ｗＭ　ＣａＣｊ！　ｚ　１．５　ｔｎｌに再懸濁し、そして氷上でさらに１５分間インキュベートした。３０００ｒｐｏ＋で５分間の遠心分離により細胞を再度収得し、そして１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）中５０ｍＭ　ＣａＣｊ２　ｔ　２００ｔｄ中に再？Ａ濁し、そして直接使用した。

３、　コンピテント細菌細胞の形質転換形質転換されるべきＤＮＡを７０ｍの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴに懸濁し、そしてＤＮＡの取り込みのために２００１１１の細菌細胞懸濁液に加えた。混合物を氷上で３０分間インキユベートし、そして１−のＬ−ブロスを添加した。混合物を４２℃にて２分間、そして３７°Ｃにて４０分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を、５０Ｊ！ｇ／−アンピシリンを含有する寒天プレート上にプレート当り５０〜３００Ｉの細胞悲濁液で拡げた。寒天プレートを３７℃にて一夜インキュベートした。このインキュベーション期間の後、単一の単離された細菌コロニーが形成された。

４、　プラスミドＤＮＡの単離１１、のプラスミド担持細胞をＬ−培地中で０．５ｏｎ、。。に増殖せしめ、そして２００ｘ／−のクロラムフェニコールと共に２０時時間幅せしめた。次に、培養物を４　、００Ｏｒｐｍにて２０分間Ｊ＾−１０ローター中で４°Ｃにて遠心した。ペレットを１８−の冷２５％シュークロース、５０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）に再懸濁し、２５０−のエルレンマイヤーフラスコに入れ、そして氷上に保持した。２５抛Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）中５■／−リゾチーム６− を加え、そしてこの混合物を１０〜１５分間放置した。６ｍｌの２５０ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）を添加し、ゆっ（り混合し、そして氷上で１５分間インキュベートした。３０−の洗浄〔０゜０１％トリトンＸ−１００；　６０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　；　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）　）を添加し、そして混合物を３０分間氷上でインキュベートした。

インキュベーションの後、この混合物を２５．　ＯＯＯｒｐｍにて５Ｗ２８０− ター中で９０分間４°Ｃにて遠心した。

プロナーゼを上清に２５０ｘ／−に添加し、そして３７°Ｃにて３０分間インキュベートした。この溶液を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８、０）　、　１ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化したフェノール１／２容量により１回フェノール抽出した。水層を取った。酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭに添加し、次に３容量の冷１００％エタノールを添加し、そして十分に混合した。この混合物を一２０°Ｃにて一夜貯蔵した。

この混合物を解凍し、そして遠心分離した。ペレットを６−の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１ＩＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０＞に再懸濁した。９．４ｇのＣｓＣ１及び０．６５−の６■／−臭化エチジウムを添加し、そして無菌二重蒸留水により体積を１０−にした。１０ｍＺのアリコートをベックマン溶封グラジェントチューブに入れ、そしてＴｉ　７０．１ベツクマンローター中で５０．００Ｏｒｐｍにて４８時間遠心した。

プラスミドのバンドをＵＶにより可視化し、そしてシリンジ及び１８ゲージ針を用いてチューブの側部に突き刺すことにより取り出した。同容量のイソブタノールで３回連続して抽出することによりプラスミド画分から臭化エチジウムを除去した。次に、百分を（１）２ｆの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）　、５＋ａＭ　ＮａＣ１に対して１回４℃にて２時間以上にわたって透析し：そして（２）上記のようにして平衡化された１／３ｆのフェノールにより１回フェノール抽出した。次に、酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭに加え、次に２容量の１００％エタノールを添加した。−２０″Ｃにて一夜、又は−７０℃にて３０分間、沈澱を形成せしめた。

５、　ミニプラスミド調製１−の−夜細菌培養物をエッペンドルフチューブに入れ、そして２０分間遠心した。上滑を除去した。１００ｍの５０ａ＋Ｍグルコース、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）をペレットに添加し、ポルテックスで混合し、そして室温にて５分間インキュベートした。２００Ｊ１！の０．２　Ｎ　ＮａＯＨ，１％ＳＤＳを添加し、そしてポルテックスで混合し、そして氷上で５分間インキュベートした。　１５０ｍの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）を添加し、ポルテックスで混合し、そして氷上で５分間インキュベートした。１３＋　００Ｏｒｐｍにて５分間の遠心の後、上清を新たなエッペンドルフチュープにデカントした。３容量の１００％エタノールを補充し、よく混合し、そして−８０°Ｃにて３０分間インキュベートし、次に１３．００Ｏｒｐｍにて１０分間遠心した。エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、凍結乾燥し、そして２０ｊ！１の蒸留水に溶解した。

５ＩのこのプラスミドＤＮＡ溶液を制限分析のために直接使用した。

６、　ニックトランスレーションニックトランスレーションをＲｉｇｂｙ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ。

１１３、２３７−２５１頁、１９７７　（引用によりこれをこの明細書に組み入れる）に従って行った。ＤＮＡの５ｔｐ−ラベル化のための反応混合物は０．５ｎのＨＢＶ断片を、全容量３０ｍの５０ｍＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，８）　、５　ｍＭ　ＭｇＣｊ！　２．１０ｍＭメルカプトエタノール、０、１　ｍＭ　ｄＡＴＰ、　０．１＋ｎＭ　ｄＧＴＰ、　０．　ｌｌ１１Ｍ　ｄＴＴＰ、５０μＣｉ　 ”Ｐ−ｄｃＴＰ、１０ユニツトのＤＮＡポリメラーゼＩ、３１１１の２Ｘ１０− ’稀釈の１■／ｍＩＤＮアーゼＩを含有しており、そして１５°Ｃにて９０分間インキュベートして３Ｘ１０’〜１２　Ｘ　１０’の全ｃｐｇｌ、すなわちｌＸｌ０’〜５　Ｘ　１０’ＣＩ）０１／　ｐｇ　Ｄ　Ｎ　Ａを得る。

７、　サザンプロット分析本発明のベクターの宿主細胞ゲノム中での構成を特徴付けるため、本発明の粒子を生産するセルラインから染色体ＤＮＡを単離し、そして適切な制限酵素により消化し、そして５ｏｕｔｈｅｒｎ（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ１６１．、　Ｖｏｌ、９８．５０３−５１７頁、１９７５）　（引用によりこの明細書に組み入れる）の方法により″′Ｐ−ラベル化ＤＮＡプローブを用いて分析した。制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩによる染色体ＤＮＡ　（２０ｇ）の消化の後、生ずる断片を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離した。次に、ＤＮＡを３６６ｎ＋ｏＵＶ光への１０分間の暴露により、及び０．５　Ｍ　ＮａＯＨ及びＩＭＮａＣｌの溶液中４５分間のインキュベーションにより変性した。ゲルを０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ、　１．５　Ｍ　ＮａＣｌ２　（ｐＨ７，５）中での６０分間のインキュベーションにより中和した。３ＭＮａＣｊ！。

０．３Ｍクエン酸ナトリウム（２０Ｘ　５ＳＣ）中に２０分間浸漬することにより、乾燥ペーパータオルのステーブルによりニトロセルロースフィルターの頂部を覆うことによりゲルを通してＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移行せしめた。ニトロセルロースフィルターを２時間真空オープル中で８０℃にて保持した。ｐＨＢＶ　（２，３ｋｂ）　（７）Ｂｇｌ　ＩＩ断片からの放射性ＤＮＡプローブをニックトランスレーションにより調製した。

ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションのため、ニトロセルロースフィルターを、１０−の前ハイブリダイゼーション混合物〔５０％ホルムアミド、５Ｘ　ＳＳＣ，５０＋ｏＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、５Ｘデンハート溶液、２５０ｘ／−変性サケ精子ＤＮＡ）を収容するプラスチックバッグ中にシールした。

フィルターをこの混合物中で４５゛Ｃにて４時間インキュベートし、この後この前ハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション混合物（５０％ホルムアミド、５Ｘ　ＳＳＣ，２０ｍ１’１リン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、ＩＸＸフンート溶液、１００パ／！変性サケ精子ＤＮＡ、５Ｘ１０５ｃｍｐ／＋＋Ｊ ”Ｐ−プローブ）で置換した。フィルターを、ハイブリダイゼーション混合物中で４５°Ｃにて１８時間インキュベートした後、５分間ずつ０、　ＩＸ　ＳＳＣ、０，１％ＳＤＳ中で３回５０°Ｃにて洗浄した。フィルターを６０°Ｃにて１０分間乾燥し、そして２株の増強スクリーン間の２枚のＸ−線フィルム（ＸＡＲ −５，ＫＯＤＡＫ）に暴露し、そして−８０°Ｃにて保持した。第１のＸ−線フイルムは３日間の暴露の後に現像し、第２のフィルムは７日間の暴露の後に現像した。

８、トランスフェクションのための哺乳類細胞及びＤＮＡ沈澱物の調製１日日に、受容体細胞（ＡＴＣＣから入手可能なＣ１２７又はＣＨＯ−細胞）を正常増殖培地（ＤＭＥＭ　＋　１０％ウシ胎児血清、グルコース及びグルタミン）中でペトリ皿（１〜２Ｘ１０ｈ細胞／皿、φ１０ｃｍ）に接種した。次の日、培地を除去しくＤＮＡ沈澱物を細胞に添加する４時間前）、そして細胞をＩＸ　ＰＢＳで２回洗浄した。次に、Ｆｅ２を含有しない８ＩｎｌのＤＭＥＭを加えた。４時間後、ＤＮＡ沈澱物を細胞に添加した。さらに４時間後、培地を除去し、３ｍＺのグリセロール−Ｍｉｘ（５０ｍｌの２Ｘ　ＴＢＳ緩衝液、３０−グリセロール、１２０ｍ１蒸留水）を添加した。３７°Ｃにて３分間のインキュベーションの後、グリセロール−Ｍｉｘをすぐに除去し、そして細胞を１χＰＢＳにより洗浄した。

細胞を、１０％ＦＣ３を含有する８＋ｎ７のＤＭＥ？Ｉと共に一夜培養した。

４８時間後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０，０２５％トリプシン＋　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で処理することにより細胞を皿から除去した。

次に、トリプシン−ＥＤＴＡを除去するため、細胞をＩＸ　ＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中に懸濁し、そして２４コスタ−・ウェルプレートに分配した（１枚の皿からの細胞を４枚の２４ウエルプレートに）。細胞が十分に増殖した時、選択培地を添加した〔濃度０．５〜１■／Ｉｎ／のネオマイシン、又はキサンチン：　２５０！！ｇ／ｍｊ、ヒボキサンチン：１５硝／−（又はアデニン：２５ｉ／ｍり、チミジン：１ｏｘ／’、アミノプテリン２パ／−、ミコフェノール酸：２５１！ｇ／ｍ１、（例えばｅｃｏ−ｇｐｔのため）〕。培地を毎週交換した。最初の増殖中の細胞コロニーが２週間後に見られた。

１０ｊ！ｇのプラスミドＤＮＡ及び２０Ｊ！ｇのキャリヤーＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡ、ウシ胸腺ＤＮＡ）に、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０５）を最終容量４４０ｊ！！に添加し、゛そして６０パの２　Ｍ　ＣａＣｌ　ｚと混合した。次に、同じ量の２Ｘ　ＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　２８０ｍＭ　ＮａＣ１、１，５ｍＭ　Ｎａ、ＨＰＯ，、ｐＨ７，０５）を添加し、そしてよく混合した。沈澱溶液を３７°Ｃにて３０分間インキュベートし、そしてトランスフェクトされるべき細胞に直接添加した。

選択された細胞を、セクション８において記載したように正常増殖培地中でさらに培養するために処理する。

■一度Ｆ、精製された粒子のアジュバントの調製無菌塩に懸濁された抗原粒子の所望の濃度に、１　：　１０．０００容量のチメロ・ソール（Ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）、１　／　１０容量のフィルター除菌０．２　Ｍ　ＡＩＫ（Ｓ（１４）ｚ　１２ＨｚＯを加えた。ｐ’Ｈを無菌Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨにより５．０に調整し、そして懸濁液を室温にて３時間撹拌した。明ばん沈澱した抗原を２０００ｒｐＩ１１にて１０分間の遠心により回収し、１　：　１００００チメロソールを含有する無菌中性塩溶液に再懸濁し、そして無菌条件下で小分けした。

■−上皇第■−Ｘ表は、下記のごとく、本発明の免疫原性粒子のＥＬＩＳＡ分析の結果の幾つかを示す。

第■表は、抗−ブレー３２モノクローナル抗体ＭＡ１８／７を使用しての、本発明のＨＢＶ配列構成物から生産された精製されたＨＢｓ抗原粒子のＥＬＩＳＡデーターを示し、このものはプレーＳ２の全部の除去及びプレー５ｔＡＴＧの上流の除去を伴うプレーＳｌ領域、並びにＳ　ＡＴＧとｇｇ　Ｓ　ＡＴＧの下流ＸＢａ　１部位までとの除去を伴う３８Ｍ域を含む（例えば、第１−１図の構成物）。画分９〜１５（第ＸＩ図）をＣｓＣｌ１沈降後にプールした。

第■表は、抗−プレー３２モノクローナル抗体Ｍ　Ｑ１９／１０を使用しての、本発明のＨＢＶ配列構成物により生産された精製されたＨＢＳ抗原粒子のＥＬＩＳＡデーターを示し、このものはプレーＳ２の全部の除去及びプレーＳｔ　ＡＴＧの上流の除去を伴うプレーＳｌ領域、並びにＳ　ＡＴＧとＭ　Ｓ　ＡＴＧの下流ＸＢａ　１部位までとの除去を伴う３６Ｎ域を含む（例えば、第１−１図の構成物）。両分１−１５（第ＸＩ図）をＣｓＣｆｆ１沈降後にプールした。

第Ｖ表は、抗−プレー３＋モノクローナル抗体Ｍ　Ａ　１８／　７を使用しての、本発明のＨＢＶ配列構成物から生産された精製されたＨＢｓ抗原粒子のＥＬＩＳＡデーターを示し、このものはプレー５ｚＳｌ域を含まずＳ　ＡＴＧの上流及びＳ　ＡＴＧの下流ＸＢａ　１部位までの除去を伴うプレー５ｚＳｌ域、並びにＳ　ＡＴＧの除去を伴うＳ領域を含む（例えば、第ｎ−１図の構成物）。

画分９−１５（第Ｘ■図）をＣ５（Ｊ沈降後にプールした。

第■表は、抗−ブレ−３２モノクローナル抗体Ｍ　Ｑ１９／１０を用いての、本発明のＨＢＶ配列構成物から生産された精製された抗原粒子のＥＬＩＳＡデーターを示し、このものはプレーＳｌ領域を含まずＳ　ＡＴＧの上流及びＳ　ＡＴＧの下流ＸＢａ　Ｉ部位までの除去を伴うプレーＳ−６Ｊｆ域、並びにＳ　ＡＴＧの除去を伴うＳ領域を含む（例えば、第ｎ−１図の構成物）。画分９−１５（第Ｘ■図）をＣｓＣβ沈降の後にプールした。

画分Ｎα９−１５（プールしたもの）Ｅ４９□＝　０．８３９ぶ−」Ｌ−衷画分Ｎα９−１５（プールしたもの）　Ｅａｑｔ＝　０．０００画分画分９−１５（プールしたもの）　Ｅ４＊ｚ＝　０．０００画分Ｎα９−１５（プールしたもの）　Ｅ４９２＝　１．０２８第■表は、抗−プレ−３２モノクローナル抗体Ｍ　Ａ　１８／　７を使用しての、本発明のＨＢＶ配列構成物から生産された精製されたＨＢｓ抗原粒子のＥＬ［ＳＡデーターを示し、このものはプレー３２の全部の除去及びプレーＳｔ　ＡＴＧの上流の除去を伴うプレＳ’＋Ｓｉ域、並びにＳ　ＡＴＧの除去を伴うＳ　ＳＩ域を含む（例えば、第Ｖｌ−２図の構成物）。画分９−１５（第ＸＩ図）をＣ５ＣＪ！沈降の後にプールした。

第■表は、抗−プレ−５２モノクローナル抗体Ｍ　Ｑ１９／１０を用いての、本発明のＨＢＶ配列構成物から生産された精製された抗原粒子のＥＬＩＳＡデーターを示し、このものはプレー５２ＡＴＧの上流の除去を伴うプレーＳ＋ＳＮ域を含み、Ｓ　ＡＴＧの除去を伴う（例えば、第Ｖｌ−４図の構成物）０画分９−１５（第ＸＩ図）をＣ５Ｃｊ！沈降の後にプールした。

第■表は、抗−プレ−３２モノクローナル抗体Ｍ　Ａ　１８／　７を用いての、本発明のＦ（ＢＹ配列構成物から生産された精製されたＨＢｓ抗原粒子のＥＬＩＳＡデーターを示し、このものはプレー３２領域を含まずＳ　ＡＴＧの上流の除去を伴うプレー３２領域、並びにＳ　ＡＴＧの除去を伴うＳ領域を含む（例えば、第■−２図の構成物）０画分９−１５（第ｘｎ図）をＣ５Ｃｊ！沈降の後にプールした。

第Ｘ表は、抗−プレ−３２モノクローナル抗体Ｍ　Ｑ１９／１０を用いての、本発明のＨＢＶ配列構成物から生産された精製されたＨＢｓ抗原粒子のＥＬＩＳＡデーターを示し、このものはＳ　ＡＴＧの上流の除去を伴うプレー３２領域を含み、Ｓ　ＡＴＧの除去を伴う（例えば、第■−４図の構成物）。画分９−１５（第Ｘ■図）をＣｓＣ／を沈澱の後にプールした。

モノクローナル抗体ＭＡ１Ｂ／７画分随９−１５（プールしたもの）Ｅ４９□＝　１．２７３第一」Ｌ−表面分Ｎα９−１５（プールしたもの）　Ｅａｑｚ＝　０．０００画分Ｎα９−１５（プールしたもの）　Ｅ＊ｑｚ＝　０．０００ＣｓＣβ−グラジェント　ＥＬＩＳＡ測定モノクトナル抗体ＭＱ１９／１０第ＸＩ表は、刺激物質（例えば、ＰＭＡ）による刺激の後ラウス肉腫ウィルスのＬ　Ｔ　Ｒ領域の制御の下での完全なプレーＳ。

−プレーＳｚ　５ｐＴｉ域を含む構成物並びにＳによる追加の同時トランスフェクション（第Ｘ■図）により生産された精製されたＨＢｓ抗原粒子のＥＬＩＳＡデーターを示す。

画分Ｎα９−１５（プールしたもの）　Ｅ４９！”’　０．１２５第ＸＩＶ図は、Ｃ＋Ｚ７に同時トランスフェクトされた第■表（第１−１図）及び第７表（第１１−１図）の遺伝子構成物に由来する粒子の、Ｃ５Ｃｊ？グランジエントでの精製後の特徴付けを示す、集められた両分はより小さい体積を有していた。

第Ｘ■表は、Ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅにおいて行われた、Ｓ配列を有する第１−１図の粒子の血清型（セロタイプ）をａｄｗ／ａｙｗ　：陽性以上の記載から、本発明の本質及び範囲を逸脱することなく、上記の組成物及び方法において種々の変更を行うことができることが当業者には自明であろう。従って、本発明を、その本質又は本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化することができる。従って、この具体例はすべての点において例示的なものであって制限的なものではなく、本発明の範囲は前記の記載によってではなく添付された請求の範囲によって特定されるべきであり、そして請求の範囲の均等の意味及び範囲に入るすべての変更はそれ故にその中に含まれると考えられる。

浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、ｌ−３ＦＩＧ、Ｉ−ＩＦＩＧ、Ｉ−２ＦＩＧ、Ｉ［ｌ−３ＦＩＧ、ＶＩ−１ＦＩＧ、ＶＩ−２ＦＩＧ、ＶＩＩ−１ＦＩＧ￥ＩＩ−３日Ｇ、Ｘ−１ＦＩＧ、ＸＩ画分番号ＦＩＧ、ＸＩＩ画分番号Ｆｉｇ、　ＸＩＩＩ ωト　０リ　コロ　Ｃｔｊ　Ｌ−ヒ：←　ψく　Ｑヒ　−く　＝ＵＣＬＩ−（Ｌ：）　ｕＳＬりＬＪ　）−（ひく　Ｑ←　コ（０（しΦ　−ＬＪ　０ＪＩ−Ｌ−ω ＜＜＜ψ　」ＬＪ　ＣＬＬＪａｌ　ｃＪ　＞　（Φ＜１−ト＝ヒ　−Ｌ）　−１−０ＪＬＪ乙トＬりロ　−＜ｃ／）← １’ＯＬＪ　−（＞ＬＪ　コΦ −ＬＪ　ｌ”３ヒ　−ロ　■トくロ　〉Φ　Ｌ）ロ　−ＱＯ（φΦ　口りり　ＯＬり１−（Ｊ　＞（−（Ｌ−ｔＪｅＬ　ＬＪ　−＜Ｌ）ＬＪ　ＣＬ　ＬｌΩ→　口ＬＪ　Ｉｔｌｌ−Ｌ−Ｌ１８５　３≦　雇８　ε冒＋ＩＪ１−　Ｑ　ＬＪ　フＩ＋）ｅｌｊ　シ１−＝１−　１（Ｑｌ）−−（Ｊ：ＬＪ乙ヒ　くΦ　−＋　１．：ｌ（Ｊ　ｌ−（０ｗ　ＱｔＪ　フロ　Ｃ：Ｑ＝１−　ψ（ＯＪ　）−−（１１−（Ｌ５　ｊ　＋　Ｌ５　ＬＪＯＪＬＪ　ψ（ｊ　−１−０１０ニ＋　さく　ロヒ　Ｌ−ロ乙Ｈ」く　〉Φ　くＱＯＬＪ　Ｑ（Ｊ　Ｏｌ−０＋　ｌ’ｔｌｃＪＬ−Ｕ　ψく　Ｉ−ｕ　Ｌ−Ｑ　＋Ｕ（Ｌ　Ｑ（ＣＯＣＬ　ＬＪ　ｅＬ　（Ｊ　（ＣＱ■Ｑ　■Ｑ　シく　−ロ　−← Ｌ−Ｌり　ｆｆ−−Φ　■ト　ΦＱくＱ　乙１−　Ｌりロ　Ｅく　リヒ０→　−＜−＜　シｔＪ　（ＩＪＬＪシＬＪ　（’Ｏ＋−１’ｏ　Ｉ−−ロ　−←ＣＬ　ＬＪ　＞　ｌｊ　：＞Φ　Φ ロ　−く手続補正書く方式）平成２年　２月　７日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、事件の表示ＰＣＴ／ＥＰ８８１００５５１、発明の名称新規なワクチンとしての、ブレーＳ−及びＳ−ペプチドから選択された、異なるエピトープを事件との関係　特許出願人名称　マコーミック　アンド　ジョーンズエンジニアリング　リミティド４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象（１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「発明者の名称」「特許出願人の代表者」の欄（２）委任状（３）明細書（第１頁）の翻訳文（４）図面の翻訳文７、補正の内容＋１１　＋２１　別紙の通り（３）明細書く第１頁）の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）図面翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録ｆｉｌ　訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１通（２）委任状及びその翻訳文　各１通（３）浄書した明細書の翻訳文　１通（４）浄書した図面の翻訳文　１通国際調査報告１Ｍ１６ｎｔｓｌｌｏＭｌ＾””””’＝　ＰＣＴ／ＥＰ　８８１００５５１＋１１ｅＩ′ＩＩｍ＋＋ｅ＋ｙｌＡｅ＋＋１１ｃｍ１ｉ＊ｓ＋ｉｏ、ＰＣＴ／ＥＰ８Ｂ１０Ｏ５５１国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．第一ＤＮＡ配列及び第二ＤＮＡ配列を含んで成る組換ＤＮＡ分子であって、該第一ＤＮＡ配列はアミノ酸配列の発現をコードしており、該アミノ酸配列の一部分はＨＢＶプレーＳ１エピトープ及びＨＢＶプレーＳ２エピトープから成る群から選択されたエピトープの抗原性を示すものであり、該第ニＤＮＡ配列は、分泌の後直径１０ｎｍ以上の粒子を形成するペプチドの発現をコードしており、前記第一ＤＮＡ配列及び第二ＤＮＡ配列は（１）同じリーディングフレーム内にあり、（２）単一ペプチドのそれぞれ別個の領域をコードしており・そして（３）前記組換ＤＮＡ分子中で発現制御配列に任用可能に連結されており、該ＤＮＡ分子はＨＢＶプレーＳ１ペプチド又はＨＢＶプレーＳ２ペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列を含有しない、前記組換ＤＮＡ分子。
２．前記第二ＤＮＡ配列が、ＨＢＶＳペプチド、ＨＢＶコアー抗原、ポリオ表面抗原、肝炎Ａ表面抗原、肝炎Ａコアー抗原、ＨＩＶ表面抗原及びＨＩＶコアー抗原から成る群から選ばれたペプチドのアミノ酸配列の実質的な部分又は全部に対応するアミノ酸配列の発現をコードしている、請求項１に記載の組換ＤＮＡ分子。
３．前記第二ＤＮＡ配列が、ＨＢＶＳペプチドの実質的な部分又は全部に対応するアミノ酸配列の発現をコードしている、請求項２に記載の組換ＤＮＡ分子。
４．前記第二ＤＮＡ配列が、ＨＢＶＳペプチドの全部に対応するアミノ酸配列の発現をコードしている、請求項３に記載の組換ＤＮＡ配列。
５．前記第一ＤＮＡ配列が、ＨＢＶプレーＳ１領域及びＨＢＶプレーＳ２領域のヌクレオチド配列に対応しそしてプレーＳ１開始コドンＡＴＧが除去されているヌクレオチド配列を含んで成る、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
６．前記第一ＤＮＡ配列が、ＨＢＶプレーＳ１領域及びＨＢＶプレーＳ２領域のヌクレオチド配列に対応しそしてプレーＳ１ＡＴＧに対するブランキング配列が天然配列から変えられているヌクレオチド配列を含んで成る、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
７．前記第一ＤＮＡ配列が、ＨＢＶプレーＳ１領域及びＨＢＶプレーＳ２領域のヌクレオチド配列に対応しそしてプレーＳ２ＡＴＧに対するブランキング配列が天然配列から変えられているヌクレオチドを含んで成る、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
８．前記第一ＤＮＡ配列が、ＨＢＶプレーＳ１領域及びＨＢＶプレーＳ２領域のヌクレオチドに対応しそして咳プレーＳ１領域５′一末端が除去されているヌクレオチド配列を含んで成る、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
９．前記第一ＤＮＡ配列が、ＨＢＶプレーＳ１領域及びＨＢＶプレーＳ２領域のヌクレオチド配列に対応しそして該プレーＳ２領域の５′一末端が除去されているヌクレオチド配列を含んで成る、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
１０．前記第一ＤＮＡ配列が、ＨＢＶプレーＳ１領域のヌクレオチド配列に対応しそして該プレーＳ１領域の３′一末端が除去されているヌクレオチドを含んで成る、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
１１．前記第一ＤＮＡ配列が、ＨＢＶプレーＳ２領域のヌクレオチド配列に対応しそして該プレーＳ２領域の３′一末端が除去されているヌクレオチド配列を含んで成る、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
１２．前記第一ＤＮＡ配列が、ＨＢＶプレーＳ１領域及びＨＢＶプレーＳ２領域のヌクレオチド配列であってプレーＳ２開始コドンＡＴＧが除去されたものに対応するヌクレオチド配列を含んで成り、そして前記第二ＤＮＡ配列がＨＢｓ領域のヌクレオチド配列であって、Ｓ開始コドンＡＴＧが除去されたものに対応するヌクレオチド配列を含んで成る、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
１３．前記組換ＤＮＡ分子が、第１表に記載するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に対応する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含有する、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
１４．前記組換ＤＮＡ分子が、第Ｉ−１，Ｉ−２，Ｉ−３，ＩＩ−１，ＩＩ−２，ＩＩ−３，ＩＩＩ−１，ＩＩＩ−２，ＩＩＩ−３，ＩＶ−１＜ＩＶ−２，ＩＶ −３，Ｖ−１，Ｖ−２，Ｖ−３，ＶＩ−１，ＶＩ−２，ＶＩ−３，ＶＩＩ−１，ＶＩＩ−２，ＶＩＩ−３，ＶＩＩＩ−１，ＶＩＩＩ−２又はＶＩＩＩ−３図により記載される、請求項３に記載の組換ＤＮＡ分子。
１５．請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３又は１４に記載の組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトされた宿主細胞。
１６．第一組換ＤＮＡ分子及び第二組換ＤＮＡ分子によりコトランスフェクトされた宿主細胞であって、該第一組換ＤＮＡ分子が請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３又は１４に記載の組換ＤＮＡ分子であり、そして該第二組換ＤＮＡ分子がＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の実質的部分に対応するアミノ酸配列の発現をコードするＤＮＡ配列を含んで成る、該宿主細胞。
１７．前記第二組換ＤＮＡ分子がＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の全部に対応するアミノ酸配列の発現をコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項１６に記載の宿主細胞。
１８．第一の個別の領域及び第二の個別の領域を含んで成るぺ．チドであって、該第一領域がＨＢＶプレーＳｌエピトープ及びＨＢＶプレーＳ２エビトープから成る群から選択されたエピトープの抗原性を示し、そして該第二領域が、直径１０ｎｍ以上の粒子を分泌後に形成するペプチドの実質的部分に対応する、該ペプチド。
１９．直径１０ｎｍ以上の粒子を分泌後に形成する前記ペプチドがＨＢＶＳペプチド、ＨＢＶコアー抗原、ポリオ表面抗原、肝炎Ａ表面抗原、肝炎Ａコアー抗原、ＨＩＶ表面抗原及びＨＩＶコアー抗原から成る群から選択されたものである、請求項１８に記載のペプチド。
２０．第一の個別の領域及び第二の個別の領域を含んで成り、該第一領域がＨＢＶプレーＳｌエピトープ及びＨＢＶプレーＳ２エピトープから成る群から選択されたエピトープの抗原性を示し、そして該第二領域が、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の実質的領域に対応する、該ペプチド。
２１．前記第二領域がＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の全部に対応する、請求項２０に記載のペプチド。
２２．前記第一領域が前記第二領域よりもＮ−末端の近くに位置する、請求項２０に記載のペプチド。
２３．複数の第一ペプチドモノマーを含んで成る免疫原性粒子であって、該ペプチドモノマーのそれぞれが第一の個別の領域及び第２の個別の領域を含んで成り、該第一領域がＨＢＶプレーＳｌエピトープ及びＨＢＶプレーＳ２エピトープから成る群から選択されたエピトープの抗原性を示し、そして該第二領域が、直径１０ｎｍ以上の粒子を分泌後に形成するペプチドの実質的な部分に対応する、該免疫原性粒子。
２４．直径１０ｎｍ以上の粒子を分泌後に形成する前記ペプチドが、ＨＢＶＳペプチド、ＨＢＶコアー抗原、ポリオ表面抗原、肝炎Ａ表面抗原、肝炎Ａコアー抗原、ＨＩＶ表面抗原及びＨＩＶコアー抗原から成る群から選択されたものである、請求項２３に記載の免疫原性粒子。
２５．複類の第一ペプチドモノマーを含んで成る免疫原性粒子であって、該ペプチドモノマーのそれぞれが第一の個別の領域及び第二の個別の領域を含んで成り、該第一領域がＨＢＶプレーＳ１エピトープ及びＨＢＶプレーＳ２エピトープから成る群から選択されたエピトープの抗原性を示し、そして該第二領域が、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の実質的な部分又は全部に対応する、該免疫原性粒子。
２６．前記第二領域がＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の全部に対応する、請求項２５に記載の免疫原性粒子。
２７．前記第一領域が前記第二領域よりもＮ−末端の近くに位置する、請求項２５に記載の免疫原性粒子。
２８．複類の第二ペプチドモノマーを更に含んで成り、前記第一ペプチドモノマーと該第二ペプチドモノマーが一緒に結合されており、該第二ペプチドモノマーのそれぞれがＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の実質的な部分に対応する、請求の範囲第２５項に記載の免疫原性粒子。
２９．前記第二ペプチドモノマーがＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列の全部に対応するアミノ酸配列を含んで成る、請求項２８に記載の免疫原性粒子。
３０．前記第一ペプチドモノマーのそれぞれが、請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３又は１４に記載の組換ＤＮＡ分子の第一ＤＮＡ配列及び第二ＤＮＡ配列によりコードされたペプチドである、請求項２５に記載の免疫原性粒子。
３１．実質的に１％より多くのプレーＳ１エピトープを含有する免疫原性粒子。
３２．実質的に５％より多くのプレーＳｌエピトープを含有する請求項３１に記載の免疫原性粒子。
３３．実質的に１０％より多くのプレーＳ２エピトープを含有する免疫原性粒子。
３４．１５％より多くのプレーＳ２エピトープを含有する、請求項３３に記載の免疫原性粒子。
３５．投与後に免疫応答を惹起するのに十分な濃度での、請求項２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３又は３４に記載の免疫原性粒子、及び適当なキャリヤーを含んで成る医薬製剤。
３６．個体に投与した後に抗体の産生を惹起するのに十分な濃度での、請求項２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３又は３４に記載の免疫原性粒子、及び適当なキャリヤーを含んで成る、抗体の産生のために有用な製剤。
３７．個体に投与した後に抗体の産生を惹起するのに十分な濃度での、請求項１８，１９，２０，２１，又は２２に記載のペプチド、及び適当なキャリヤーを含んで成る、抗体の産生のために有用な製剤。
３８．トランスフェクトされた宿主細胞の製造方法であって、ＤＮＡの取り込みのために受容性にされた宿主細胞を用意し、請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３又は１４に記載の組換ＤＮＡ分子を含んで成るＤＮＡの第一調製物に前記細胞を暴露し、適当な条件下でＤＮＡの前記第一調製物からのＤＮＡを前記宿主細胞に取り込ませ、そして外来ＤＮＡを取り込んだ宿主細胞を選択する、ことを含んで成る方法。
３９．前記宿主細胞を前記第一ＤＮＡ調製物に暴露するのに先立って、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子を含んで成るＤＮＡの第二調製物に該宿主細胞を暴露し、そして適当な条件下でＤＮＡの該第二調製物からのＤＮＡを該宿主細胞に取り込ませることを、さらに含んで成る請求項３８に記載のトランスフェクトされた宿主細胞の製造方法。
４０．前記宿主細胞を前記ＤＮＡ調製物に暴露した後、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子を含んで成るＤＮＡの第二調製物に該宿主細胞を暴露し、そして適当な条件下でＤＮＡの該第二調製物からのＤＮＡを該宿主細胞に取り込ませることを、さらに含んで成る請求項３８に記載のトランスフェクトされた宿主細胞の製造方法。
４１．前記第一ＤＮＡ調製物がＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子をさらに含んで成る、請求項３８に記載のトランスフェクトされた宿主細胞の製造方法。
４２．ペプチドの製造方法であって、請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３又は１４に記載の組換ＤＮＡ分子を用意し、該組換ＤＮＡ分子により宿主細胞をトランスフェクトし、該宿主細胞を、該宿主細胞による蛋白質の発現及び分泌を許容する条件下で培養し、そして前記組換ＤＮＡ分子中のＤ、ＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドを集める、ことを含んで成る方法。
４３．前記組換ＤＮＡ分子中のＤＮＡ配列の発現の結果として生産された前記ペプチドが該組換ＤＮＡ分子の全コード領域より小さい部分に対応するアミノ酸配列を含有する、請求項４２に記載のペプチドの製造方法。
４４．免疫原性粒子の製造方法であって、請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３又は１４に記載の組換ＤＮＡ分子を用意し、該組換ＤＮＡ分子により宿主細胞をトランスフェクトし、該宿主細胞を、該宿主細胞による蛋白質の発現及び分泌を可能にする条件下で培養し、そして該宿主細胞中の外来ＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドモノマーを適当な条件下で凝集せしめる、ことを含んで成る方法。
４５．前記宿主細胞を前記組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトするのに先立って、ＨＢＶＳぺプドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子により該宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４４に記載の免疫原性粒子の製造方法。
４６．前記宿主細胞を前記組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトした後に、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子により該宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４４に記載の免疫原性粒子の製造方法。
４７．前記宿主細胞を、前記組換ＤＮＡ分子、及びＨＢＵＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子により同時にトランスフェクトする、請求項４４に記載の免疫原性粒子の製造方法。
４８．医薬製剤の製造方法であって、請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３又は１４に記載の組換ＤＮＡ分子を用意し、該組換ＤＮＡ分子により宿主細胞をトランスフェクトし、該宿主細胞を、該宿主細胞による蛋白質の発現及び分泌を許容する条件下で培養し、適当な条件下で、該宿主中のＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドを凝集せしめることにより免疫原性粒子を形成せしめ、そして該免疫原性粒子を適当なキャリヤーと一緒にして、個体に該製剤が投与された後に抗体の生産を惹起するのに十分な濃度で該免疫原性粒子が存在するようにする、ことを含んで成る方法。
４９．前記宿主を前記組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトするのに先立ち、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子により該宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４８に記載の医薬製剤の製造方法。
５０．前記宿主細胞を前記組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトした後に、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ、分子により該宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項４８に記載の医薬製剤の製造方法。
５１．前記宿主細胞を、前記組換ＤＮＡ分子、及びＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子により同時にトランスフェクトする、請求項４８に記載の医薬製剤の製造方法。
５２．抗体の生産のために有用な製剤の製造方法であって、請求項１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３又は１４に記載の組換ＤＮＡ分子を用意し、咳組換ＤＮＡ分子により宿主細胞をトランスフェクトし、該宿主細胞を、該宿主細胞による蛋白質の発現及び分泌を許容する条件下で培養し、適当な条件下で、該宿主中のＤＮＡ配列の発現の結果として生産されたペプチドを凝集せしめることにより免疫原性粒子を形成せしめ、そして該免疫原性粒子を適当なキャリヤーと一緒にして、個体に該製剤が投与された後に抗体の生産を惹起するのに十分な濃度で該免疫原性粒子が存在するようにする、ことを含んで成る方法。
５３．前記宿主を前記組換ＤＮＡ分子によりトランスフェクトするのに先立ち、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子により該宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項５２に記載の医薬製剤の製造方法。
５４．前記宿主細胞を前記組換、ＤＮＡ分子によりトランスフェクトした後に、ＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子により該宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項５２に記載の医薬製剤の製造方法。
５５．前記宿主細胞を、前記組換ＤＮＡ分子、及びＨＢＶＳペプチドのアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡ分子により同時にトランスフェクトする、請求項５２に記載の医薬製剤の製造方法。