JPH07503615A - 肝炎療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 肝炎療ＩＦ’Ｊ 技術分野 本発明は一般に肝炎ならびに肝炎随伴ガン腫を治療する方法に関する。

発明の背景 肝炎は、肝臓に対し支配的な影響を及ぼす全身的疾病である。この疾病は、食欲 不振、悪心、おう吐、疲労感、倦怠感、関節痛、筋肉痛及び頭痛とそれに続く黄 だんの発症によって特徴づけられる。

この疾病は又、アミノトランスフェラーゼＡＳＴ及びＡＬＴの血清レベルの増大 によっても特徴づけられる。血中のこれらの酵素の数量化が、肝障害の程度を示 す。

肝炎に結びつけられてきたウィルス作用因子には５つの一般的カテゴリが存在す る。すなわち、Ａ型肝炎ウィルス（）ＩＡＶ）　；　Ｂ型肝炎ウィルス（ｌ（Ｂ Ｙ）　；　２つのタイプの非Ａ非Ｂ型（ＮＡＮＢ）作用因子、つまり血液伝染性 のもの（Ｃ型肝炎）と腸伝達性のもの（Ｃ型肝炎）；及びＨＢＶ随伴デルタ因子 （Ｂ型肝炎）である。

又肝炎には急性肝炎と慢性肝炎という２つの一般的臨床カテゴリがある。急性肝 炎の症状は、無症候性及び非顕性のものから胎児感染にまで至る。この疾病は、 潜在的で持続性のものでもありうるし、又は、肝硬変を伴う慢性肝臓病及び場合 によっては肝細胞性ガン腫に至るまで急激に進行する可能性もある。米国の成人 の白色人種における急性Ｂ型肝炎感染は、約５％〜ｌＯ％の症例において慢性Ｂ 型肝炎へと進行する。残りの症例では約６５％が無症候性である。極東では感染 は通常周生期のものであり、５０％〜９０％が慢性状態にまで進行する。進行速 度の違いは、宿主の遺伝子的相違というよりもむしろ感染時の年令に関連する可 能性が高い。米国では、人口の約０．２％が慢性的に感染しており、医師、薬物 常用者及び腎透析患者といったハイリスクグループにおいて比較的割合が高い。

台湾、ホンコン、及びシンカポールといった国では、人口の肝炎感染レベルは１ ０％にまで至り得る。

米国では、慢性肝炎を患う患者の約２０％が肝不全で死亡し、さらに５％がＢ型 肝炎随伴ガン腫を発現させる。極東では、人口の大きな割合がＨＢＶ感染を受け 、長い慢性感染（２０〜４０年）の後、そのうちの約２５％が肝細胞性ガン腫を 発現させる。

Ａ型及びＢ型の両方の肝炎についての血清学的試験の開発後に、研究者達は肝炎 様の症状を示しかつ感染症と一貫性あるインキュベーション期間及び伝達様式を 伴うもののＡ型又はＢ型肝炎感染の血清学的証拠のないその他の患者を識別した 。はぼ１５年後、原因となる作用因子はＲＮＡウィルスとして同定された。この ウィルス（ｒＣ型肝炎ウィルス」と呼ばれる）はＨＢＶ、レトロウィルス又はそ の他の肝炎ウィルスと全く相同性をもたない。

Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は、世界中の輸血後及び散発性弁Ａ非Ｂ（ＮＡＮＯ ）肝炎の主要な原因であると思われており、肝細胞性ガン腫を含む慢性肝臓病の 発現において主要な役割を果たしている（Ｋｕ。

ｅｌ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：　３６２−３６４．　１９８９　；　 Ｃｈｏｏ　ｅｔ　ａｌ、、ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　 ４６　（２）　；　４２３−４４１．１９９０）　、毎年輸血を受ける約３００ 万人の人々のうち約１５万人が急性Ｃ型肝炎を発現させることになる（Ｄａｖｉ ｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３２１　（２２）　；　 １５０１−１５０６．１９８９）。

さらに急性Ｃ型肝炎を発現させるこれらの患者のうち約半数が慢性Ｃ型肝炎を発 現させる。

最近まで、急性又は慢性Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎の感染の治療にとって有効である と実証された療法は全く無く、肝炎感染患者は一般に病気を進行するがままにさ せざるを得ない。ａｃｙｃｌｏｖｉｒといった抗ウイルス薬剤ならびにコルチュ ステロイドを用いて免疫系を強化しようとする試みの大部分は効果無しと立証さ れた（ＡＩ　Ｌｅｒ、「ウィルス性肝炎と肝臓病Ｊ　、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ　（ ｅｄ、）、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ。

ｐＩ）、５３７−４２．１９８８）。いくつかの抗ウィルス活性がアデノシンア ラビノシドについて観察された（Ｊａｃｙｎａ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｂｒ１ｔｉｓ ｈ　Ｍｅｄ、Ｂｕｌｌ、４６　：３６８−３８２．１９９０）が、この薬剤には 毒性副作用が付随するため、このような治療は受容不可能となっている。

Ｂ型及びＣ型慢性肝炎感染に対しいく分かの恩恵を提供した１つの治療は、組換 え型アルファインターフェロンの使用である（Ｄａｖｉｓｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３２１　（２２）　：　１５０１−１５０６．１９ ８９　；　Ｐｅｒｒｉｌｌ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３２３／　２９５〜３０１． 　１９９０）。しかしながら、Ｂ型肝炎感染を患う患者に関して、感染者のうち わずか約３５％だけがこのような治療に対して応答し、周生期感染者においては 約１０％のみが治療に応答した。Ｃ型肝炎感染については、このような治療を利 用した見かけの短期的成功にもかかわらず、治療終結から６力月後に、治療に応 答していた患者の半数が病気を回帰させた。さらに、アルファインターフェロン 療法に伴うもう１つの問題点は、この組成物が、敏感な患者については用量の減 少を必要とさせる毒性副作用を頻繁に有しているということにある。

従って細胞障害性を減少させながら肝炎又は腫瘍誘発及びその進行に対する自然 の宿主防御を増大させるのに役立つか、或いは、インターフェロン非応答性患者 の治療を可能にする療法がきわめて有利である。本発明はこのような治療薬を提 供し、さらにその他の関連する利点を提供する。

発明の概要 簡単に言うと、本発明は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染ならびに肝細胞ガン腫（Ｈ ＣＣ）を治療する方法に向けられている。本発明のｌ態様の範囲内では、免疫応 答が生成されるようにＢ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導 くベクター構成体を温血動物に投与する段階を含む、温血動物体内のＢ型肝炎感 染を治療するための方法が提供されている。本発明のその他の態様においては、 免疫調節補因子をＢ型肝炎抗原の免疫原性部分と共に投与するか又は発現させる こともできる。さまざまな実施態様において、ベクター構成体は、ｔ（ＢｅＡｇ 、　ＨＢｃＡｇ、　ＨＢｓＡｇｓＯＲＦ５．０ＲＦ６．　ＨＢＶｐｌｏＢ型肝炎 抗原の抗原の任意の組合せの発現を導く。ｌ実施態様においては、１（ＢｓＡｇ ｓはＳ、　ｐｒｅ−３１及びｐｒｅ−３２から成るグループの中から選択される 。

本発明の関連する態様においては、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部 分を免疫調節補因子の同時発現を導くベクター構成体が提供されている。同様に 提供されるのは、薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で組換え型 ウィルスを含む薬学組成物である。

本発明のもう１つの実施態様においては、免疫応答が生成されるように抗原Ｘの 免疫原性部分の発現を導くベクター構成体を温血動物に投与する段階を含む、温 血動物体内のＢ型肝炎ガン腫細胞を破壊するための方法が提供されている。本発 明のその他の態様においては、抗原Ｘの免疫原性部分と共に免疫調節補因子を投 与するか又は発現させることもできる。

本発明のさらにもう１つの態様においては、抗原Ｘの免疫原性部分の発現を導く か又はこの抗原を免疫調節補因子と共に同時発現させるベクター構成体が提供さ れている。同様に提供されているのは、薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組 合わせた形でこれらの組換え型ウィルスを含む薬学組成物である。

本発明のさらにもう１つの実施態様においては、免疫応答が生成されるようにＣ 型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導くベクター構成体を温血 動物に対して投与する段階を含む、温血動物体内のＣ型肝炎感染を治療する方法 が提供されている。その他の態様においては、Ｃ型肝炎抗原の免疫原性部分と共 に免疫調節補因子を投与するか又は同時発現させることも可能である。さまざま な実施態様においては、このベクター構成体は、コア抗原Ｃ１抗原Ｅｌ、抗原Ｅ ２／ＮＳＩ、抗原ＮＳ２、抗原ＮＳ３、抗原ＮＳ４、抗原ＮＳ５、Ｓ抗原又はそ れらの組合せを発現することができる。

本発明の関連する実施態様においては、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原 性部分の発現を導くか或いは又免疫調節補因子と組合わせた形でこの抗原を同時 発現させるベクター構成体が提供される。もう１つの実施態様においては、Ｂ型 肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分とＣ型肝炎抗原の少なくとも１つの免 疫原性部分の同時発現を導くベクター構成体が提供される。同様に提供されるの は、薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で組換え型ウィルスを含 む薬学組成物である。

本発明のもう１つの態様においては、免疫応答が生成されるようにポリタンパク 質抗原の免疫原性部分の発現を導くベクター構成物を温血動物に投与する段階を 含む、温血動物体内のＣ型肝炎ガン腫細胞を破壊するための方法が提供されてい る。本発明のその他の態様においては、Ｃ型肝炎抗原の免疫原性部分と共に免疫 調節補因子を投与するか又は発現させることもできる。

本発明の関連する態様においては、ポリタンパク質抗原の免疫原性部分の発現を 導くか又はこの抗原を免疫調節補因子と同時発現させるベクター構成体が提供さ れている。同様に提供されているのは、薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組 合わせた形でこれらの組換え型ウィルスを含む薬学組成物である。

本発明のさらにもう１つの態様においては、免疫応答が生成されるようにＢ型肝 炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分とＣ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫 原性部分の発現を導くベクター構成体を温血動物に投与する段階を含む、温血動 物体内の慢性肝炎感染を治療するための方法が提供されている。

本発明のベクター構成体は、例えば組換え型レトロウィルス、又はポリオウィル ス、鼻炎ライスル属、ポックスウィルス（例えばカナリア痘ウィルス又はワクシ ニアウィルス）、インフルエンザウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス（ 例えばアデノ随伴ウィルスＢ１９又ハＭＶＮ）、ヘルヘスウィルス、ＳＶ４０． 　ＨＩＶ、麻疹及び５ｉｎｄｂｉｓウイルスやコロナウィルスといったアルファ ウィルスから成るグループの中から選ばれた組換え型ウィルスを含む、さまざま な経路で送り出すことができる。さらにこのベクター構成体又は関連する免疫原 性部分をコードする核酸を直接、例えばリポフエクション、直接ＤＮＡ注射、微 小放物体ボンバード、リポソーム、ＣａＰＯ＋又はＤＮＡリガンドといったトラ ンスフェクション方法によって、患者に投与することも可能である。本発明は同 様に、免疫原性タンパク質自体、ベクター構成体、レトロウィルスベクター又は レトロウィルスベクターと免疫調節補因子を投与するのに適した組成物（例えば さまざまなアジュバント）及び方法をも提供している。

本発明のこれらの態様及びその他の態様は以下の詳細な説明及び添付図面を参照 することにより明らかになるだろう。

図面の簡単な説明 図１は、ＡＴＣＣ４５０２０からのＢ型肝炎ｅ配列の回収を概略的に示す図であ る。

図２は、ＨＢＶ　（ａｄｗ）プリコア／コアのヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ 。

Ｎｏ、　５６）及び補正した配列の図式表示である。

図３は、ｐＡＭ６　（ＡＴＣＣ４５０２０）がらのＨＢｅ−ｃ配列内の欠失の補 正の概要図である。

図４は、ＳＫ”ＨＢｅ−ｃからの補正したヌクレオチド配列を示すＤＮＡ配列決 定用ゲルである。

図５は、ＥＬＩＳＡにより決定された通りの、レトロウィルスで形質導入すれタ マウス細胞系統ＢＣＩＯＭＥ、Ｂ　１／６．　Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）、ＥＬ４及びレ トロウィルスで形質導入されたＥＢＶ−形質転換されたヒトＢ細胞系統ＪＹ−Ｌ ＣＬからのＨＢＶｅタンパク質の発現を示す図である。

図６は、レトロウィルスで形質導入されたＢＣＩＯＭＨにより分泌されたｐ１７ ｋＤＨＢＶｅタンパク質及びレトロウィルスで形質導入されたＢＣＩＯＭＩ！及 びＢｌ／６細胞からの細胞リゼイト内のｐ２２及びｐ２３ｋＤのブリコア中間タ ンパク質の発現を示すウェスタンプロットである。

図７は、抗原を発現する同系細胞と共に注入されるが又はＨＢＶｅ抗原をコード するレトロウィルスベクターと共に直接注入によって注射されるＢａ１ｂ／ｃ及 びＣ５７Ｂ１／６マウス体内の）ＩＢＶｅ抗原に対する抗体応答の誘発を示すグ ラフである。

図８は、ＨＢＶコアと８７／８８１タンパク質の両方を発現するベクター構成体 にＴ−１（ＢＹコア／Ｂ７／ＢＢＩの図式表示である。

発明の詳細な説明 本発明について記述する前に、以下で用いるいくつかの用語をまず定義づけする ことが本発明を理解する上で一助となるものと思ゎれる。以下で引用する全ての 参考文献は本書にその全文が参考として内含される。

本発明の中で利用されている「免疫原性部分」という語は、適切な条件の下で、 免疫応答（すなわち細胞媒介又は体液性のもの）をひき起こすことのできるそれ ぞれの抗原の一部分のことを意味する。

１部分」は、可変的サイズのものであってよいが、好ましくは９個のアミノ酸と いう長さをもち、抗原全体を含んでいてもよい。免疫原性（例えば細胞媒介性免 疫応答）を決定するのに利用できる代表的検定については、以下と例Ｉ２におい てさらに詳細に記述される。

細胞媒介性免疫応答は、主要組織適合性複合体（ｒＭＨＣＪ　）分類Ｉ提示、Ｍ ＩＩＣ分類■提示又はその両方を通して媒介されつる。

「ベクター構成体」というのは、問題の単数又は複数の配列又は遺伝子の発現を 導くことのできる集合体のことである。ベクター構成体はプロモータ要素を含ま なくてはならず、好ましくはポリアデニル化を導くシグナルを含む。さらにベク ター構成体は、転写された時点で、問題の配列又は遺伝子に作動的に結合され翻 訳開始配列として作用する配列を含んでいなくてはならない。好ましくは、ベク ター構成体は同様にＮｅｔ、　５ＶｘＮｅｏ、　ＴＫ、ハイグロマイシン、フレ オマイシン、ヒスチジノール又はＤＨＰＲといった選択可能な標識ならびに単数 又は複数の制限部位及び翻訳終結配列も含んでいる。さらに、ベクター構成体が レトロウィルス内に入れられる場合、このベクター構成体は、（また存在してい ないならば）使用されるレトロウィルスに該当するパッケージングシグナル及び 長末端反復（ＬＴＲＳ）を含まなくてはならない。

「免疫調節補因子」というのは、免疫応答に関与する細胞のうちの単数又は複数 のものにより製造されたとき、又は外来的に細胞に付加されたとき、免疫応答を この補因子の無い状態で起こると考えられるものと質又は潜在能の面で異なるも のとなるようにする因子のことである。応答の質又は潜在能は、例えば細胞増殖 を測定するインビトロ検定（例えば３Ｈチミジン摂取）及びインビトロ細胞障害 検定（例えばＧ　Ｉ　Ｃｒ放出を測定するもの）を含む、当業者にとっては既知 のさまざまな検定によって測定することができる（Ｗａｒｎｅｒｅｔ　ａｌ、、 　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　７　 ；　６４５−６５５．１９９１年を参照のこと）。免疫調節補因子は、インビボ 及び半ビボの両方で活性をもちうる。このような補因子の代表的な例としては、 インターロイキン２，４及び（なかんづく）６、アルファインターフェロン、ベ ータインターフェロン、ガンマインターフェロン、ＧＭ−Ｃ５Ｆ。

Ｇ−Ｃ５Ｆ及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ　ｓ　）といったサイトカインが含まれる 。

その他の免疫調節補因子としては、例えばＣＤ３．　ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ− ２゜ＬＦＡ−１，ＬＦＡ−３、Ｍ）ＩＣ分類Ｉ分子、ＭＨＣ分類■分子、Ｂ７／ ＢＢＩ、β。

−ミクログロブリン、チャペローン又はその類似体が含まれる。

上述のとおり、本発明は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染ならびに肝細胞ガン腫を治 療するための方法及び組成物に向けられている。簡単に言うと、外来性病原体を 認識しこれに対し防御する能力は免疫系の機能の中心を成すものである。この系 は免疫認識を通して「自己」を「非自己」　（外来性）と区別することができ、 このことは、宿主組織に対してではなくむしろ侵入する実体に向けて防御メカニ ズムが確実に導かれるようにするために必須のものである。以下でさらに詳しく 説明する方法は、潜在能ある分類■制限型保護・治療用ＣＴＬ応答ならびに体液 性応答を誘発する有効な手段を提供する。

上述の通り、本発明の１つの態様においては、免疫応答が生成されるように、Ｂ 型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導く温血動物に対してベク ター構成体を投与する段階を含む、温血動物体内のＢ型肝炎感染を治療するため の方法が提供されている。

簡単に言うと、Ｂ型肝炎ゲノムは、長さ約３．２キロベースの環状ＤＮＡから成 り、充分に特徴づけされたものである（Ｔｉｏｌｌａｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ　２１３　：　４０６−４１１．１９８１　；　Ｔｉｏｌｌａｊ ｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１７　：４８９−４９５．１９８５　； 及びＧａｎｅｍ及びＶａｒｍｕｓ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５６ 　：６５１〜６９３．１９８７）。Ｂ型肝炎ウィルスはなかんづく３つのＨＢｒ ５Ｊ抗原（ＨＢｓＡｇｓ）、ＨＢｃ抗原（ＨＢｃＡｇ）、ＨＢｅ抗原（ＨＢｅＡ ｇ）及びＨＢｘ抗原０（ＢｘＡｇ）を含むいくつかの異なる抗原を提示する（Ｂ ｌｕｍ　ｅｔ　ａｔ、。

ｒＢ型肝炎ウィルスの分子生物学Ｊ　ＴＩＧ　５（５）　：　１５４−１５８． １９８９）。簡単に言うと、ＨＢｅＡｇはＰ２２ブリコア中間体のタンパク質分 解分割の結果として得られ、細胞から分泌される。ＨＢｅＡｇは１７ｋＤのタン パク質として血清中に見い出される。ＨＢｃＡｇは１８３個のアミノ酸のタンパ ク質であり、）ｌＢｘＡｇは亜型に応じて１４５〜１５４個のアミノ酸のタンパ ク質である。

ＨＢｓＡｇｓ　（ｒ大型」、「中型」及び「小型」と呼ばれる）は、Ｂ型肝炎ゲ ノムの３つの領域すなわちＳ、　ｐｒｅ−３２及びｐｒｅ−３ｌによりコードさ れる。アミノ酸３８９個〜４００個まで変化する長さをもつ大型タンパク質は、 ｐｒｅ−５１，ｐｒｅ−５ｌ及びＳ領域によってコードされ、グリコジル化され た形及び非グリコジル化形状で発見される。中型タンパク質は長さがアミノ酸２ ８１個であり、ｐｒｅ−３２及びＳ領域によってコードされる。小型タンパク質 は長さがアミノ酸２２６個であり、Ｓ領域によってコードされる。これは２つの 形状つまりグルコシル化形状（ＧＰ２７’）及び非グリコジル化形状（Ｐ２４’ ）で存在する。これらの領域の各々が別々に発現される場合、ｐｒｅ−３ｌ領域 は約１１９個のアミノ酸のタンパク質をコードし、ｐｒｅ−８２領域は約５５個 のアミノ酸のタンパク質をコードし、Ｓ領域は約２２６個のアミノ酸のタンパク 質をコードすることになる。

当業者にとっては明白となるように、本書に記述されているベクター構成体の１ つにより投与された時点で免疫応答を提示するように、上述のＳ抗原のさまざま な免疫原性部分を組合わせることが可能である。さらに、１（ＢＹのＳ読取り枠 について異なる幾何的領域内に見い出される大きな免疫学的可変性を理由として 、特定の幾何的領域内での投与のためには特定の抗原組合せが好まれる可能性が ある。簡単に言うと、全てのヒトＢ型肝炎ウィルスのＳ個の試料の中に見い出さ れる実体は決定基「α」と定義づけされる。しかしながら互いに排他的な亜型決 定基も又２次元２重免疫拡散法によって同定された（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、 　Ｐｒｏｇｒ、　Ａｌｌｅｒｇｙ、　５：　１．１９５８）。これらの決定基は 、「ｄ」又は「ｙ」及びｒＷＪ又はｒｒＪと呼称された（ＬｅＢｏｕｖｉｅｒ、 　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　１２３：　６７１．１９７１　；　Ｂａｎｃｒｏｆｔ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１０９　：　８４２．１９７２　；　Ｃｏｕｒｏｕｃｅ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｂｉｂ１．Ｈａｅｍａｔｏｌ、　４２　＋１−１５８．１９７６ ）。免疫学的可変性は、Ｂ型肝炎ウィルスのＳ読取り枠の２つの部域内の単一の ヌクレオチド置換によるものである：すなわち（１）Ｂ型肝炎ウィルスのＳ読取 り枠内のアルギニンに対するリジン−１２２の交換はｄからｙへの亜型シフトを ひき起こし；　（２）アルギニン−１６０からリジンへの交換は、亜型ｒからＷ へのシフトをひき起こす。黒人アフリカでは、亜型ａｙｗが支配的であり、一方 米国及び北欧では、亜型ａｄｗ２がさらに豊富である（Ｂ型肝炎ウィルスの分子 生物学、ＭｃＬａｃｈｌａｎ　（ｅｄ、）、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　１９９１） 。当業者にとっては明白になるように、幾何的な投与領域内で優勢な特定なり型 肝炎ウィルス亜型に適切な投与のためのベクターを構成することが一般に好まれ る。特定の領域の亜型は、２次元２重免疫拡散法によって、或いは又好ましくは この領域内で患者から分離されたＨＢＶウィルスのＳ読取り枠を配列決定するこ とによって決定されうる。

ＨＢｖニヨッテ同様に提示されるのは、ｐｏｌ（ｒＨＢＶｐｏｌＪ　）、　０Ｒ Ｆ５及び０ＲＦ６抗原である。簡単に言うと、ＨＢＶのポリメラーゼ読取り枠は 、感染を受けた肝臓内のコア様粒子及びウィルス粒子の中に見い出される逆転写 酵素活性をコードする。ホリメラーゼタンパク質は少なくとも２つのドメインか ら成る：すなわち、アミノ末端ドメインは、逆転写をブライミングするタンパク 質をコードし、カルボキシル末端ドメインは逆転写酵素及びＲＮＡ５ｅｔ（活性 をコードする。ＩＩＢＶｐｏｌの免疫原性部分は、本書に説明する方法（例えば 以下及び例１２Ａｉｉ及び１３に説明されているもの）を利用して決定すること ができ、以下に記述するベクター構成体を利用して発現され、温血動物体内で免 疫応答を生成するべく投与されうる。同様にして、０ＲＦ５及び０ＲＦ６といっ たその他のＨＢＶ抗原（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ 　９　：　３２２−３２７゜１９８９）は、本書に記すとおりのベクター構成体 を利用して発現されうる。０ＲＦ５及び０ＲＦ６を利用したベクター構成体の代 表例が、以下の例２Ｊ、２Ｋ及び５Ｈ，５１の中に記述されている。

Ｂ型肝炎ウィルスをコードする分子クローニングを受けたゲノムは、例えばＡｌ ｎｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（米国標 準培養コレクション）（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ） を含むさまざまな供給源から得ることができる。例えば、ＡＴＣＣＮｏ、４５０ ２０は、ｐＢＲ３２２（Ｍｏｒｉａｒｔｙｃｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８　：　２６０６−２６１０．１９８１）の Ｂａｍｔ（１部位内に、Ｂ型肝炎の合計ゲノミックＤＮＡ　（精製ゾーン粒子か ら抽出されたもの）を含んでいる（Ｂｌｕｍ　ｅｔ　ａｌ、、　ＴＩＧ　５　（ ５）　＋　１５４−１５８゜１９８９の図３参照）。（例２Ａに記述され図２に 示されているように、補正可能な誤差はＡＴＣＣＮｏ、４５０２０の配列内に発 生するということに留意されたい）。

上述のとおり、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分は、ベクター構成 体の中に内含されている。ベクター構成体内に内含される免疫原性部分は、変化 する長さをもつものであってよいが、その長さが少なくとも９個のアミノ酸であ ることが一般に好ましく、抗原全体を含んでいてもよい。特定の配列の免疫原性 は往々にして予想しがたいが、潜在的なＴヘルパ一部位及びＣＴＬ部位について のコーディング領域を走査するためにＴＳＩＴＥＳ（Ｍｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ、　 Ｍａｒｙｌａｎｄ）といったコンピュータアルゴリズムを用いてＴ細胞エピトー プを予想することが可能である。この分析に基づきペプチドが合成され、例１３ に記されているもののようなインビトロ細胞障害検定において標的として用いら れる。しかしながら、例えば新たに導入されたベクターに対する抗体の存在を検 出するＥＬＩＳＡならびにガンマ−インターフェロン検定、ＩＬ−２産生検定及 び増殖検定といったＴヘルパー細胞についてテストする検定を含む。その他の検 定も利用することができる。特に好ましい検定は、以下の例１２Ｂでより詳細に 記述されている。

免疫原性部分はその他の方法によっても選択可能である。例えば、ＨＬＣＡ２． １遺伝子導入マウスは、ウィルス抗原のヒトＴ細胞認識のためのモデルとして有 用であることが立証された。簡単に言うと、インフルエンザ及びＢ型肝炎ウィル ス系において、マウスのＴ細胞レセプタレパートリ（能力範囲）は、ヒトＴ細胞 によって認識されたものと同じ抗原決定基を認識する。両方の系において、ＨＬ ＡＡ２．１遺伝子導入マウス内で生成されたＣＴＬ応答は、ＨＬＡＡ２．１ハブ ロタイブのヒトＣＴＬにより認識されたものとほぼ同じエピドームに向けて導か れる。（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７３　 ：　１００７〜１０１５．１９９１　；Ｖｉｔｉｅｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂ型 肝炎ウィルスの分子生物学シンポジウムの摘要、１９９２）。

ベクター構成体の中への内含のために特に好まれる免疫原性部分には、以下の例 の中でさらに詳細に記述されているようなＨＢｅＡｇ。

ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇｓが含まれる。

Ｂ型肝炎ウィルスの付加的な免疫原性部分は、例えばＢＳｔＵｌ、　５ｓｐ１゜ ＰｐｕＭｌ及びＭｓｐｌといった部位を含むさまざまな場所でコーディング配列 を切形にすることによって得ることができる（ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　ｅｔａｌ 、、　Ｎａｔｕｒｅ　２８０　；　８１５−１９．１９７９　；　Ｖａｌｅｎｚ ｕｅｌａ　ｅｔ　ａｌ、、動物ウィルス遺伝学二ＩＣＮ／ＵＣＬＡ　５ｙｌｌＩ ｐ、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１９８０．　Ｂ、Ｎ、Ｆｉｅｌｄｓ及び Ｒ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ　（ｅｄｓ、　）、　ｐ５７〜７０．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　；　Ａｃａｄｅｍｉｃ）　ｏ適当な免疫原性部分ならびに方法を見極めるため のさらなる方法も、以下でＣ型肝炎という条件下で記述されている。

上述のとおり、ベクター構成体の中に１つ以上の免疫原性部分を内含させること もできる。例えば、ベクター構成体は、以下で論述するとおり、ＨＢｃＡｇ、　 ＨＢｅＡｇ、　ＨＢｓＡｇｓ、　ＨＢｘＡｇならびにＨＣＶ抗原の免疫原性部分 の全て又は一部分を（個別にか又は１つの構成体として）発現することができる 。さらにベクター構成体は同様に、アルファインターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｒｕｇｓ　４２　（５）　：　７４９−７６５．１９９１　 ；米国特許第４．８９２．７４３号；米国特許第４．９６６、８４３号：　ＷＯ ３５１０２８６２。

Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２８４　；　３１６−３２０． １９８０　；　Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　７８　：　３８７−３９４．１９８１　；　Ｔ ｗｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６　：　２０４６−２０５０．　１９８５　；　Ｆａｋｔ ｏｒ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（発ガン遺伝子）　５　：８６７−８ ７２．１９９０）、ベータインター７　工ｏ　ン（Ｓｅｉｆｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、ｖｉｒｏｌ、　６５　：　６６４−６７１．１９９１）、ガンマインターフェ ロン（Ｒａｄｆｏｒｄ　ｅ（ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅ ｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　（米国肝臓学学会）　２００Ｂ２０１５． １９９１　；　’７タナベｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　８６　；　９４９６−９ ４６０゜１９８９　；　Ｇａｎ５ｂａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（ガン研究＞　５０　；　７８２０−７８２５、１９９０ 　；　Ｍａｉｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｔ ｈｅｒ、　３０　：　３４−４２゜１９８９　；米国特許第４．７６２．７９１ 号；米国特許第４．７２７．１３８号）　、Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４．９９９ ．２９１号及び４．８１０．６４３号’）　、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（ＷＯ８５１０４ １８８）、ＴＮＦｓ　（Ｊａｙａｒａｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｙ　１４４　：　９４２−９５１゜１９９０）　、インターロイキン −２（Ｕ　−２）（Ｋａｒｕｐｉａｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４４　：　２９０−２９８．１９９０　；　Ｗｅｂｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｌ！ｘｐ、Ｍｅｄ、　１６６　F １７１６−１７３３．　１９８７　；　Ｇａｎ５ｂａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｊ、ｆ！ｘｐ、Ｍｅｄ、１７２　：　１２１７−１２２４、１９９０；米国特許 第４．７３８．９２７号）　、ＩＬ　−４（Ｔｅｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　５７　：　５０３−５１２．　１９８９　；　Ｇｏｌｕｍｂｅｋ　ｅ ｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２５４　二　７１３−７１６、１９９１；米国特 許第５．０１７．６９１号）、ルーＱ　（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｅｔａｔ、、Ｊ 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９　；　４１１６−４１２１．　１９８７　；　ＷＯ ９０１０６３７０）、ＩｃＡＭ−１（Ａｌｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３３８　：　５１２−５１４．１９８９）、ＩＣＡＭ−２，ＬＦＡ−１゜ ＬＦＡ−３、Ｍ）Ｉｃ分分類骨分子Ｍ）ＩＣ分類■分子、β、−ミクログロブリ ン、チャブロン、ＣＤ３　Ｂ？／ＢＢＩ　、ＭＨＣ結合型輸送タンパク質又はそ の類似体、といった免疫調節補因子をも同時発現することができる。

ベクター構成体内にどの免疫調節補因子を含み入れるかの選択は、補因子の既知 の治療効果に基づいてもよいし、或いは実験により決定されてもよい。例えば、 慢性Ｂ型肝炎感染においては、アルファインターフェロンは、患者の免疫不全を 補償しがくして病気がらの回復を補助する上で効めがあることがわがっている。

代替的には、適当な免疫調節補因子を実験により決定することもできる。簡単に 言うと、まず、肝臓病を患う患者から血液試料を採取する。末梢血リンパ球（Ｐ ＢＬｓ）をインビトロで自己由来の又はＨＬＡ照合された細胞（例えばＥＢＶ形 質転換細胞）を用いて再度刺激し、肝炎抗原の免疫原性部分及び免疫調節補因子 の発現を導くベクター構成体を用いて形質導入する。ＨＬＡ照合された形質導入 細胞を標的として用いて、ＣＴＬ検定において、刺激されたＰＢＬをエフェクタ として使用する。

抗原を単独でコードするベクターで形質導入された標的細胞及び）ＩＬＡ照合さ れた刺激物質を用いて行なわれた同じ検定において見られたものに比べてＣＴＬ 応答が増大していることは、有用な免疫調節補因子であることを示している。

上述の免疫調節補因子をコードする分子はさまざまな供給源がら得ることができ る。例えば、これらの配列を含むプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｕｉｌｌｅ、　 Ｍａｒｙｌａｎｄ）といった保管所又はＢｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ、　ＯｘｆｏｒｄＥｎｇｌａｎｄ）とい った市販供給源から得ることができる。代表的な例としては、ＢＢＧ１２　（１ ２７個のアミノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を含む）　 、ＢＢＧ６　（ガンマインターフェロンをコードする配列を含む）　、ＡＴＣＣ Ｎｏ、３９６５６　（ＴＮＦをコードする配列を含む）、ＡＴＣＣＮｏ、２０６ ６３　（アルファインターフェロンをコードする配列を含む）　、ＡＴＣＣＮｏ 、３１９０２．３１９０２及び３９５１７　（ベータインターフェロンをコード する配列を含む）　、ＡＴＣＣＮｏ、３９４０５．３９４５２．３９５１６．３ ９６２６及び３９６７３　（インターロイキン−２をコードする配列を含む）、 ＡＴＣＣＮｏ、５７５９２　（インターロイキン−４をコードする配列を含む） 及びＡＴＣＣ６７１５３（インターロイキン−６をコードする配列を含む）が含 まれる。

類似の要領で、免疫調節補因子をコードする配列を、これらの補因子をコードす る配列を発現するか又は含む細胞から容易に得ることができる。簡単に言うと、 ｌ実施態様においては、ひきつづきＰＣＨによって増幅される望ましい配列のい ずれかの側でプライマーが調製される（米国特許第４．６８３．２０２号、４． ６８３．１９５号及び４．８００．１５９号）（同様にＰＣＲ技術：その原理と ＤＮＡ増幅に対する応用、Ｅｖｌｉｃｈ（ｅｄ、）、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒ ｅｓｓ、　１９８９も同様に参照のこと）。特に、２本鎖ＤＮＡは、熱安定性Ｔ ａｑポリメラーゼの存在下で、配列特異的ＤＮＡプライマ、ＡＴＰ、　ＣＴＰ、 　ＧＴＰ及びＴＴＰを加熱することによって変性される。２本鎖ＤＮＡは、合成 が完了した時点で産生される。このサイクルは多数回くり返され、望ましいＤＮ Ａの階乗増幅という結果が得られる。

免疫調節補因子をコードする配列も同様に、例えばＡｐｐｌ　ｉｅｄＢｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、ＤＮＡ合成機（例：　ＡＢＩ　ＤＮＡ合成機３９２型（Ｆ ｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ））上で合成することができる。

このような配列は同様に相補的末端を通して結合され、その後次いでＰＣＲ増幅 が行なわれて（Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＩｌｅ ｄｉｃａｌ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）長い２本鎖のＤＮＡ分子を形成する（Ｆｏｇｕｅ ｔ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３　：　６７４−６７５．１９９２）。

免疫原性部分（単数又は複数）（そして望ましい場合には免疫調節補因子）がひ とたび選択されたならば、これらのタンパク質をコードする遺伝子が、その発現 を導くベクター構成体内へ入れられる。

一般に、かかるベクターはこれらの遺伝子のみをコードし、選択可能な標識は全 くコードしない。特定の抗原及び免疫調節補因子をコードしその発現へと導くベ クターは、当業者であれば容易に構築することができる。特に、ベクター構成体 の構築ならびに直接注入によるレトロウィルス構成体の投与については「組換え 型レトロウィルス」という題の出願（１９９０年９月２１日提出のＵ、　Ｓ、　 Ｓ、　Ｎ、　０７１５８６．６０３）の中でさらに詳細に記述されている。これ らのベクター構成体は、複製受容能の無いものであるレトロウィルスベクター粒 子の産生のための産生細胞系統を生成するべく適切なパッケージング細胞系統（ Ｕ、Ｓ、　Ｓ、Ｎ、０７／８００．９２１参照）の中に導入することによって形 質導入受容能あるレトロウィルスベクター粒子を生成するのに使用することがで きる。

何らかの複製受容能ある感染性レトロウィルスの存在を検出するために、さまざ まな検定を利用することができる。好ましい１つの検定は、例８に記述されてい る拡張型Ｓ”Ｌ−検定である。

特に好ましい実施態様においては、ＳＶ４０（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｃｅ１１３８　＋　４８３．１９８４参照）、サイトメガロウィルス（ｒｃ ＭＶ　Ｊ　）（Ｂｏｓｈａｒｔｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４１　：　５２１− ５３０．１９９１参照）又は内部リポソーム結合部位（ｒｌＲＢｓＪ　）といっ たプロモータを内含するようにベクター構成体を構築することができる。簡単に 言うと、ＩＲＢＳに関しては、免疫グロブリン重鎮結合タンパク質の最初の５つ の未翻訳領域が、２シストロンメツセージの内部的係合を支持するものであると 立証された（Ｊａｃｅｊａｋ及びＳａｒｎｏｗ、　Ｎａｔｕｒｅ　３５３　：　 ９０−９４．１９９１参照）。この配列は小さく　（３００ｂ１１）　、この配 列で始まるシストロンをもつ多シストロンメツセージから多数の遺伝子を発現す るため、容易にレトロウィルスベクター内に取り込まれ得る。ＩＲＢＳを利用す る代表的ベクター構成体については、以下の例６Ｃ及び６Ｄでさらに詳しく記述 する。

さらに、ベクター構成体は、例えばポリオウィルス（Ｅｖａｎｓ　ｅｔａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ　３３９　；　３８５−３８８．１９８９　；及び５ａｂｉｎ、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉ盾■ １　、１１５−１１８．１９７３）　：鼻炎ウィルス（Ａｒｎｏｌｄ、　Ｊ、　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌ４０１−４０５、１９９０）　；ポックスウ ィルス例えばカナリア痘ウィルス又はワクシニアウィルス（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｈｏ ｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　８６　：　３１７−３２１．１９８９　；Ｆ ｌｅｘｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、５６９　 ：　８６−１０３．　１９８９　；　Ｆｌｅｘｎｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｖａｃｃ ｉｎｅ　８：　１７−２１．１９９０　；米国特許第４．６０３．１１２号及び ４、７６９．３３０号；　ＷＯ３９１０１９７３）　；　ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉ ｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７７　：１０８−１１４．　１９７ ９）；インフルエンザウィルス（ＬｕｙｔＪｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１５ ９　；　１１０７−１１１３．１９８９　；　ＭｃＭｉｃｈｅａｌ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３０９　：　１３−１７、１９８３；及びＹ ａｐ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　２７３　：　２３８−２３９．１９７８） 　；アデノウィルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６　： 　６１６−６２７．１９８８　；　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｌ　ａｌ、、　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２５２　；　４３１−４３４．１９９１）　；アデノ随伴ウィルスな どのバルボウイルス（Ｓａｍｕｌｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒ、　６３ 　：　３８２２−３８２８．１９８９　：Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｖｉｒｏｌ、　１６６　：　１５４−１６５．１９８８）　；　ヘルペス（Ｋ ｉｔ。

Ａｄｖ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　Ｂｉｏｌ、　２１５　＋　２１９−２３６．１ ９８９）　；　ＳＶ４０　；　ＨＩＶ（ＰｏｚｎａｎｓｋＹB ＪＪｉｒｏｌ、　６５＋５３２−５３６．１９９１）；麻疹（ＥＰ　Ｏ，４４０ ，２１９）　；　５ｉｎｄｂｉｓウイルス（Ｘｉｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２３４　：　１１８８−１１９１．１９８９）　；及びコロナウィ ルスを含むその他のウィルス担体を用いても開発され利用され得る。

ベクター構成体をひとたび調製したならば、Ｂ型肝炎感染を処理するべく混血動 物に対してこれを投与することができる。（レトロウィルス構成体の直接注入な どによる）レトロウィルスベクターを介してベクター構成体を投与する方法は、 １組換え型レトロウィルス」という題の出願（Ｕ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ　０７１５ ８６．６０３）の中でさらに詳細に記述されている。このような方法としては、 リボフエクシコン（Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　：　７４１３−７４１９．１９８９）、直接Ｄ ＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３５２　：　８１５ −８１８．１９９１）　；微小放物体ボンバード（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｃｔ　Ｉ ＬＬ、、　ＰＮＡＳ　８８　：　２７２Ｂ−２７３０，１９９１）　；リポソー ム（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　８４　：　７８５１〜７８５５．１ ９８７）　；　ＣａＰＯ，（Ｄｕｂｅｎｓｋｙｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　８１ 　：　７５２９−７５３３．１９８４）　；又はＤＮＡリガンド（Ｗｕ　ｅｔａ ｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４　＋　１６９８５−１６９８７．１ ９８９）などのさまざまな物理的方法を利用する方法によるトランスフェクショ ンが含まれる。

さらに、ベクター構成体、又は関連する免疫原性部分をコードする核酸を患者に 対して直接、すなわち、例えばリボフエクション、直接ＤＮＡ注射、微小放物体 ボンバード、リポソーム、ＣａＰＯ４又はＤＮＡリガンドなどのトランスフェク ション方法によって投与することができる。免疫原性タンパク質自体、ベクター 構成体、ウィルスベクター又はウィルスベクターと免疫原性補因子を投与するの に適した組成物及び方法については、以下で詳述する。

本発明のもう１つの態様においては、免疫応答が生成されるように、Ｃ型肝炎抗 原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導くベクター構成体を温血動物に投 与する段階を含むＣ型肝炎感染を治療するための方法が提供されている。簡単に 言うと、前述のとおり、Ｃ型肝炎（非Ａ非Ｂ　（ＮＡＮＢ）肝炎）は、輸血後に 発現する肝炎症例０９０％以上を占める一般的な病気である（Ｃｈｏｏ　ｅｔ　 ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ２４４　：　３５９−３６２．１９８９）。ＮＡＮＢ 肝炎についての大部分の情報は、チンパンジーの伝染研究から誘導されたもので あり、これらの研究は、ＮＡＮＢ肝炎がわずか１０”−１０’ＣＩＤ／ｍｌ　（ ｌ　ｍｌあたりのチンパンジー感染用量）という力価で大部分のヒト感染におい て存在するということを示していた。さらに、この病気は、実験的に感染を受け たチンパンジーの肝細胞内で顕著な膜性細管の出現をひき起こすことがわかった 。この「細管形成」作用因子を以下Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）と呼ぶ。

ＨＣＶのゲノミックＲＮＡは、最近、９３７９のヌクレオチドの配列を有するこ とが確認された（Ｃｈｏｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８８　：　２４５１−２４５５．１９９１　；　Ｃｈｏｏ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｂｒ１ｔ、Ｍｅｄ、Ｂｕｌｌ、　４６　（２）　；４２３−４４ １．１９９０　；　Ｏｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒ、　 ７２　：　２６９７−２７０４゜１９９１　：　Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号Ｍ６ ７４６３．　Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ。

Ｃａｌｉｆｏｒ口ｉａも参照のこと）。この配列は、フラビウイルス属のタンパ ク質に対する有意な相同性を有する３０１１個のアミノ酸のポリタンパク質前駆 物質をコードする。ポリタンパク質は、Ｃ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｅ 　１．Ｅ　２／ＮＳＩ及び非構造タンパク質ＮＳ２゜ＮＳ３．ＮＳ４及びＮＳ５ を含むいくつかの異なるタンパク質を内含するものと信じられている（Ｈｏｕｇ ｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　）ｌｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１４　：　３８１−３８ ８゜１９９１）。

上述のとおり、本発明の１実施態様においては、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つ の免疫原性部分がベクター構成体内に取り込まれている。さまざまなＣ型肝炎ウ ィルスの中でも最も保存された領域であることからＣ及びＮ５３−Ｎ５４領域の 中に、Ｃ型肝炎の好ましい免疫原性部分を見い出すことができる（Ｉ（ｏｕｇｈ ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＨｅｐａｔｏｌｏｇＹ１４　：　３８１−３８８．１ ９９１）。特に好ましい免疫原性部分はさまざまな方法によって決定することが できる。例えばＢ型肝炎ウィルスについて前述したとおり、アミノ酸配列に基づ いてポリタンパク質の免疫原性部分の同定を予測することができる。簡単に言う と、頻繁に免疫原性の両親媒性α−へリックスを有するＴ細胞エピトープを予測 するのに、当業者には既知のものであるさまざまなコンピュータプログラムを利 用することができる。Ｔ細胞エピトープは、潜在的なＴ−ヘルパ一部位及びＣＴ Ｉ、部位のためのコーディング領域を走査するべくＴＳｉｔｅｓ　（Ｍｅｄ　Ｉ ｍｍｕｎｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）といったコンピュータアルゴリズムを利用し て予測することができる。この解析はまず第１に、（１）タンパク質の構造的特 性（主としてα−へリックスの周期性及び両親媒性）、及び（２）　ＭＨＣ分類 ■及び分類Ｈの分子により認識される配列内に見い出されるモチーフ、に基づい ている。しかしながら、一般に、検定において免疫原性を決定することが好まれ る。

代表的検定としては、例１２Ｂの新たに導入されたベクターに対する抗体の存在 を検出するＥＬＩＳＡ、ならびに例１２ｃに記されているようなガンマ−インタ ーフェロン検定、ＩＬ−２産生検定及び増殖検定といったＴヘルパー細胞につい てテストする検定などが含まれる。特に好ましい検定は、以下の例１２Ａ　ｉに おいてさらに詳細に説明されている。

本発明の免疫原性タンパク質は同様に、より免疫原性を高めるべく当該技術分野 において既知のさまざまな方法によって操作することができる。かかる方法の代 表例としては、Ｔヘルパーエピトープに対応するアミノ酸配列を付加すること； 疎水性残基を加えて細胞摂取を促進すること；粒子構造を形成すること；又はこ れらのあらゆる組合せが含まれる（一般に１（ａｒｔ、前掲書中、１Ｊｉｌｉｃ ｈ　ｅＬ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　１６１０〜１６ １４．１９８８　；　Ｗｉｌｌｉｓ、　Ｎａｔｕｒｅ３４０　：　３２３−３２ ４．１９８９　：　Ｇｒｉｔ目ｔｈｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６ ５　：　４５０−４５８゜１９９１を参照）。

好ましい免疫原性部分は、以下の要領でも選択することができる。

簡単に言うと、患者の血清中にどの抗原フラグメントが存在するかを決定するた め、個々のＨＣＶポリタンパク質領域（例えば１（ＣＶココアＥｌ、Ｅ２／ＳＮ Ｉ及びＮ５２−Ｎ５５領域）に対する抗体を用いて、ＨＣＶを有する患者からの 血液試料を分析する。一時的緩解を与えるためアルファインターフェロンで治療 を受けた患者においては、幾分か抗原決定因子が消滅し、抗原に対する内因性抗 体により取ってかわられることになる。このような抗原は、本発明の情況下で免 疫原性部分として有用である（［（ａｙａｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｅｐａｔｏ ｌｏｇｙ　１３　：　１０２２−１０２８゜１９９１　；　Ｄａｕｉｓ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３２１　：　１５０１−１５０６．１９ ８９）。

Ｃ型肝炎の少なくとも１つの免疫原性部分（そして望ましくは上述のようなＨＢ Ｖの免疫原性部分及び／又は免疫調節補因子）がひとたび選択されたならば、そ の発現を導くベクター構成体の中に入れることができる。Ｂ型肝炎治療法につい て上述したように、例えば組換え型レトロウィルスを含めて、ベクター構成体を 運ぶのにさまざまな組換え型ウィルスベクターを利用することができる（Ｕ、　 Ｓ、　Ｓ、　Ｎ。

０７１５８６、６０３参照）。さらに上述のとおり、例えばポリオウィルス、鼻 炎ウィルス、ポックスウィルス、カナリア痘ウィルス、ワクシニアウィルス、イ ンフルエンザウィルス、アデノウィルス、パルポウイルス、アデノ随伴ウィルス 、ヘルペスウィルス、ＳＶ４０．旧■、麻疹、５ｉｎｄｂｉｓウイルス及びコロ ナウィルスを含むその他のウィルス担体を用いて開発し利用することができる。

さらにベクター構成体又は関連する免疫原性部分をコードする核酸は、例えばリ ポフエクシジン、直接ＤＮＡ注入、微小放物体ボンバード、リポソーム、ＣａＰ Ｏ４又はＤＮＡリガンドといったトランスフェクション方法により直接患者に投 与することもできる。免疫原性タンパク質自体、ベクター構成体、ウィルスベク ター又はウィルスベクターと免疫調節補因子を投与するのに適した化合物及び方 法については、以下でより詳細に記述されている。

本発明のその他の態様においては、肝ガン細胞を破壊するための方法が提供され ている。簡単に言うと、肝細胞ガン腫は、世界的に見て最も一般的なガンである 。これは、毎年約１００万人の死亡原因となっており、その大部分は中国及びサ ハラ砂漠以南のアフリカである。肝細胞ガン腫におけるＢ型肝炎感染の病因論学 的役割には強力な証拠が存在する。ＨＢＶのキャリヤは、非キャリヤに比べ肝細 胞ガン腫に対し９０倍以上高いリスクをもつ。多くの場合において、Ｂ型肝炎ウ ィルスＤＮＡは腫瘍の細胞ゲノム内に統合されている。同様にして、Ｃ型肝炎ウ ィルスも又最近になって、循環するＨＣｖ抗体を肝細胞ガン腫を有する幾人かの 患者の体内で発見できるという観察事実に基づいて、肝細胞ガン腫と結びつけら れるということが確認されている。現在のところ、化学療法、放射線療法及び免 疫療法がさほど有望でないことから、肝細胞ガン腫には外科的切除が唯一の治療 法を提供しているにすぎない（Ｃｏｌｏｍｂｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ 　１００６〜１００８、　１９８９年ｉｏ月２８日；　Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ａｎｎ、ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄ。

１０８　：　３９０−４０１．１９８８　；　ＷａＬａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　４８　：　３４Ｇ−３４３、１９９１；　Ｂｉ ｓｃｅｇｌｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｌ１ｅｒ、Ｊ、Ｇａ５ｔｒｏ、　８６　： 　３３５〜３３８゜１９９１）。

本発明のもう１つの態様においては、免疫応答が生成されるように、抗原Ｘの免 疫原性部分の発現を導くベクター構成体を温血動物に投与する段階を含むＢ型肝 炎ガン腫細胞を破壊するための方法が提供されている。ＨＢｘＡｇをコードする 配列は、本書に提供されている開示を仮定すれば、当業者によって容易に得るこ とのできるものである。簡単に言うと、本発明の一実施態様においては、６１２ ｂｐのＮｅｏ　ｌ−３ａｌ　ＩがＡＴＣＣ４５０２０から回収され、その他のＢ 型肝炎抗原について前述した通り、ベクター構成体の中に挿入される。

しかしながらＸ抗原は、その他の潜在的発ガン遺伝子（例えばＥＩＡ）に類似し た形で機能しうる既知のトランス作用因子である。従って、ベクター構成体内に 挿入する前に遺伝子産物が腫瘍形成性をもたないようにまずＸ抗原を変更するこ とが一般に好ましい。例えば切形、点突然変異、早発性停止コドンの付加又はリ ン酸化部位変更によるものを含むさまざまな方法を用いてＸ抗原を非腫瘍形成性 のものにすることができる。１つの実施態様においては、Ｘ抗原をコードする問 題の配列又は遺伝子は切形にされる。切形化はさまざまなフラグメントを生成し うるが、一般にはコードする遺伝子配列の５０％以上を保持することが好ましい 。その上、どんな切形化によっても遺伝子産物の免疫原性配列のいくつかが無傷 の状態に残されることが必要である。代替的には、本発明のもう１つの実施態様 においては、変更されたＸ抗原をコードする遺伝子内に、多数の翻訳終止コドン を導入することができる。終止コドンの挿入は、タンパク質の発現を早期に終止 し、かくしてタンパク質の形質転換部分の発現を防ぐ。

Ｘ遺伝子又はその修正されたバージョンはさまざまな方法でその腫瘍形成性につ いてテストすることができる。代表的な検定としては、ヌードマウスにおける腫 瘍形成（例１４Ａ参照）、軟寒天中のコロニー形成（例１４Ｂ参照）及び遺伝子 導入マウスといった遺伝子導入動物の調製が含まれる。

ヌードマウス又はラットにおける腫瘍形成は、腫瘍形成性を決定するための特に 重要な敏感な方法である。ヌードマウスには、機能的細胞免疫系が欠如しており （すなわちＣＴＬを有していない）、従って、細胞の腫瘍形成潜在力とテストす べき有用なインビボモデルを提供してくれる。正常な非腫瘍形成細胞は、ヌード マウス内に感染させられた場合、無制御の成長特性を示さない。しかしながら、 形質転換された細胞はヌードマウス内で急速に増殖し腫瘍を生成する。簡単に言 うと、１つの実施態様において、ベクター構成体は同系のマウス細胞に投与され 、細胞はヌードマウス内に注入される。

マウスは、腫瘍成長を確認するべく注射後４〜６週間目視される。

腫瘍が存在するか否かを確認するため、マウスを安楽死させて剖検することもで きる（Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｉｎ５ｔ、　４８　二１５３１−１５３３．１９７２；　Ｆｕｒｅｓｚ　ｅｔ　 ａｌ、、　ｒ生物学的薬剤の生産のために考慮されている細胞系統の腫瘍形成性 試験Ｊ　、Ａｂｎｏｒｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　（異常細胞）　、Ｎｅｗ　Ｐｒｏｄ ｕｃｔｓ　ａｎｄ　Ｒ１５ｋ（新製品とそのリスク）　、Ｈｏｐｐｓａｎｄ　Ｐ ｅｔｒｉｃｃｉａｎｉ　（ｅｄｓ、）、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ａｓ ５ｏｃｉａｔｉｏｎ、　１９８５　；Ｌｅｖｅｎｂｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｓｔｄ、　１３：　１３５−１４１．１９８５）。

腫瘍形成性は同様に、軟寒天中のコロニー形成を視覚化することによっても評価 されうる（Ｍａｃ　Ｐｈｅｓｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍｏｎｔａｇｎｌｅｒ、　Ｖｉｒ ａｌ。

２３：　２９１〜２９４．１９６４）。簡単に言うと、正常な非腫瘍形成性細胞 の１つの特性は、足場依存性成長である。より特定的に言うと、正常な非腫瘍形 成性細胞は、半固体寒天支持媒地の中に平板固定された時点で増殖を停止するの に対し、腫瘍形成性細胞は軟寒天内で増殖し続はコロニーを形成する。

遺伝子導入マウスといった遺伝子導入動物を、抗原Ｘの免疫原性部分の腫瘍形成 性を評価するのに利用することも可能である（Ｓｔｅｗａｒｔｅｔ　ａｌ、、　 Ｃｅ１ｌ　３８：　６２７〜６３７．１９８４　；　Ｑｕａｉｆｅ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｃｅ１ｌ　４８：１０２３−１０３４．１９８７　；　Ｋｏｉｋｅ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８６゜５６１５− ５６１９．１９８９）。遺伝子導入動物においては、対象となる遺伝子は動物の 全ての組織内で発現されうる（一般に、ＷＯ９０１０８８３２を参照のこと）。

トランスジーンのこの調節不良の発現は、新しく導入された遺伝子の腫瘍形成潜 存能についての１つのモデルとして役立ちつる。

上述のように、抗原Ｘの免疫原性部分がひとたび選択されたならば（これは好ま しくは非腫瘍形成性のものである）、上述のようにこれをベクター構成体内に挿 入し、組換え型ウィルスにより運ぶことができる。上述のように、本発明のベク ター構成体は、例えば、ポリオウィルス、鼻炎ウィルス、ポックスウィルス、カ ナリア痘ウィルス、ワクシニアウィルス、インフルエンザウィルス、アデノウィ ルス、パルポウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス、ＳＶ４０．　 ＨＩＶ、麻疹、コロナ及び５ｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選 択された組換え型ウィルス又は組換え型レトロウィルスによるものを含むさまざ まな方法で運ぶことができる。さらに、ベクター構成体又は関連する免疫原性部 分をコードする核酸は、患者に対し直接、すなわち、リポフェクション、直接Ｄ ＮＡ注入、微小放物体ボンバード、リポソーム、ＣａＰＯａ又はＤＮＡリガンド などのトランスフェクション方法によって投与することができる。免疫原性タン パク質自体、ベクター構成体、ウィルスベクター又はウィルスベクターと免疫調 節補因子を投与するのに適した組成物及び方法については、以下でさらに詳しく 論述する。

本発明のもう１つの態様においては、Ｃ型肝炎抗原の免疫原性部分の発現を導く ベクター構成体を温血動物に投与する段階を含む、Ｃ型肝炎ガン腫細胞を破壊す るための方法が提供されている。Ｃ型肝炎抗原の好ましい免疫原性部分（単複） は、コア抗原及びＮ５Ｉ−ＮＳ５領域を含むポリタンパク質内に見い出すことが できる（Ｃｈｏｏ　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　８８　：　２４５１−２４５５．１９９１）、特に好ましい免疫原性部 分はさまざまな方法によって決定できる。例えば、上述のように、アミノ酸配列 に基づいて好ましい免疫原性部分を予想することが可能である。簡単に言うと、 頻繁に免疫原性の両親媒性α−へリックスを有するＴ細胞エピトープを予測する のに、当業者には既知のものであるさまざまなコンピュータプログラムを利用す ることができる。免疫原性部分を予測するのに同様に利用することのできるもう １つの方法は、レトロウィルスベクターを利用してマウス体内でＣＴＬ誘発特性 を有するのがどの部分であるかを決定することにある（Ｗａｒｎｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、、　ＡＩＤＳ、　Ｒｅｓ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ７　 ：　６４５−６５５．１９９１）。Ｗａｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌの中で記されてい るように、マウス内のＣＴＬ誘発をヒト体内の細胞免疫原性を予測するのに利用 することができる。好ましい免疫原性部分は同様に、相応する遺伝子のベクター 形質導入の後にフラグメントを発現する標的細胞（例えばＥＢＶ形質導入を受け たリンパ球）を自己由来の患者のリンパ球によって溶解させることのできるのは ポリタンパク質抗原又はペプチドのどのフラグメントであるかを決定することに よっても演鐸できる（例１３）。

上述のとおり、免疫原性部分がひとたび選択されたならば、一般に、それが非腫 瘍形成性であることを確認することが好ましい。これは、切形化、点突然変異、 早発性停止コドン又はリン酸化部位変更を含むさまざまな方法によって達成でき る。ポリタンパク質又はその修正されたバージョンは又、上述の方法を利用して 又は例１４内に記述されている方法によって、腫瘍形成性についてテストするこ ともできる。

免疫原性部分（単複）（ならびに望まれる場合には免疫調節補因子）はこのとき ベクター構成体の中に挿入され上述のとおり組換え型ウィルスにより運ばれ得る 。付加的には、当業者にとっては明白であるはずであるように、急性及び慢性の ＨＣＶ感染の治療のための上述のようなベクターを利用して、肝細胞ガン腫に関 連するＩＩｃＶ感染を治療することも可能である。免疫原性タンパク質自体、ベ クター構成体、ウィルスベクター又はウィルスベクターと免疫調節補因子を投与 するのに適した組成物及び方法については以下でさらに詳しく論述する。

本発明のもう１つの態様においては、上述の免疫原性部分（ならびに望ましい場 合には免疫調節補因子）のいくつかの同時発現を導くベクター構成体を調製する ことができる。例えば、１つの実施態様においては、Ｂ型肝炎抗原の免疫原性部 分ならびにＣ型肝炎ポリタンパク質の免疫原性部分の両方の同時発現を導くベク ター構成体を調製することができる。かかる構成体は、Ｂ型又はＣ型のいずれか の急性及び慢性肝炎感染を予防するか又は治療するため、以上及び以下で記述さ れている通りに投与することができる。同様にその他の実施態様では、Ｂ型肝炎 Ｘ抗原の免疫原性部分ならびにＣ型肝炎ポリタンパク質の免疫原性部分の両方の 同時発現を導くベクター構成体を調製することができる。かかる構成体は、Ｂ型 肝炎又はＣ型肝炎のいずれかと結びつけられる肝細胞ガン腫を治療するために同 様にして投与することができる。さらに、Ｂ型及びＣ型肝炎に慢性的に感染して いる患者は肝細胞ガン腫を発現させるリスクがさらに高いことから、この疾病の 予防的治療としてかかるベクターを利用することもできる。

上述のとおり、本発明のベクター構成体又は上述の免疫原性部分をコードする核 酸を人間などの温血動物に対して直接投与するには、さまざまな方法を利用する ことができる（Ｃｕｒｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＨｕｍａｎＧｅｎｅ　ａｎｄ　 Ｔｈｅｒａｐｙ　３　：　１４７〜１５４．１９９２）。

さらに、上述の免疫原性部分（単複）をその細胞表面上で発現する細菌の投与に よって、免疫応答（ＣＴＬを含む）を生成することもできる。代表的例としては 、ＢＣＧ（Ｓｔｏｎｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　３５１　；　４５６−４５８．１９ ９１）及びサルモネラ（Ｎｅｗｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ４　：　７０−７２．１９８９）がある。

細胞媒介応答及び体液性応答は、上述の免疫原性部分（単複）の非経口的投与に よっても肝炎に対して誘発されうる。簡単に言うと、関連するエピトープを運ぶ 免疫原性部分は、化学合成（Ｂｅｒｇｏｔ　ｅｔａｔ、、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成機ユーザー会報第１６号、１９８６年、Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　Ｃａ１ｉｆｏｒ ｎｉａ）及び、昆虫由来のバキュロウィルス系（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ、　Ｃｕｒｒ ｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（免疫学における今日の話 題）１３１　：　５１−６８．１９８６）、哺乳動物由来系（例えばＣＨＯ細胞 ）（Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６３　：　３４８９− ３４９８、１９８９）　、酵母由来系（ＭｃＡｌｅｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａ ｔｕｒｅ　３０７　：　１７８−１８０）及び原核系（Ｂｕｒｒｅｌ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７９　：　４３−４７．１９７９）といった組換え型 系におけるＤＮＡの発現を含む、数多くの既知の方法において産生できる（Ｅｌ ｌｉｓ　ａｎｄ　Ｇｅｒｅｔｙ、　Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、　３１　：　５４ −５８．１９９０）。

このときタンパク質又はペプチドは、従来の手段により精製でき、分類■及び分 類■の応答を含む細胞媒介応答を誘発するべく数多くの方法により送り出すこと ができる。これらの方法の中には、ＩＳＣＯＭＳ（Ｍｏｒｅｉｎ、Ｉｗ＋ｍｕｎ ｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（免疫学通信）　２５　：　２８１−２８４．１ ９９０　。

タカハシｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４４　：　８７３−８７５ｍ、　１ ９９０）　、リポソーム（Ｇｅｒｇｏｒｉａｄｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖａｃｃ ｉｎｅ　（ワクチン’）　５　：　１４５−１５１．　１９８７）、脂質接合（ Ｄｅｒｅｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４２　：　５６１−５６４．１ ９８９）、自己由来細胞上のペプチドコーティング（Ｍｏｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｃｅ１ｌ　５４　：　７７７−７８５゜１９８８）　、ミョウバン、完全又 は不完全フロインドアジュバント（Ｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８　：　９４４８−９４５２．１９９１ ）又は有効な非経口投与を可能にするその他のさまざまな有用なアジュバント（ 例：　Ａ１１ｉｓｏｎ　ａｎｄ　Ｂｙａｒｓ、　Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ワクチン） 　８７　：　５６−５９゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、１９８７）（Ｌｉｔｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、エイズワクチン開発に おける進歩、１９９２年８月３０日の第５回合国エイズワクチン開発グループ年 次集会）といったさまざまなタイプのアジユバ・　ントの使用が含まれている。

代替的には、上述の免疫原性部分に相応するタンパク質又はペプチドは、胃腸内 放出のため、腸カプセル（Ｃｈａｎｎｏｃｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ａｍｅｒ。

Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、　１９５　：　４４５−４５２．１９６６）又はポリ（Ｄ Ｌ−ラクチド−コーグリコール酸塩）球（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ　ｅｔ　ａ１国際エ イズワクチン開発会議議事録中、ＤＡＩＤＳ、　ＮＩＡＩＤ、米国保健社会福祉 省、１９９１）といった適切な担体の中に、免疫応答を惹起すべく経口投与する ためにカプセル封入することができる。

上述のように、本発明の免疫原性タンパク質は、より免疫原性を強くするため当 該技術分野において既知のさまざまな方法により操作することもできる。このよ うな方法の代表的例としては、Ｔヘルパーエピトープに対応するアミノ酸配列を 付加すること；疎水性残基を付加することによって細胞摂取を促進すること；粒 状構造を形成すること；又はこれらの何らかの組合せが含まれる（一般に、Ｈａ ｒｔ、前掲の書中、Ｍｉｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：１６１０〜１６１４．１９８８　；　Ｗｉｌ ｌｉｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　３４０　；　３２３−３２４．１９８９　；　Ｇｒｉ ｆｆｉｔｈｓｅＬ　ａｔ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６５：　４５０−４５６．１ ９９１）。

本発明の好ましい実施態様においては、薬学的受入れられる担体又は希釈剤と組 合わせた形で、ポリオウィルス、鼻炎ウィルス、ポックスウィルス、カナリア痘 ウィルス、ワクシニアウィルス、インフルエンザウィルス、アデノウィルス、パ ルボウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス、ＳＶ４０．　ＨＩＶ、 麻疹、コロナ及び５ｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択された 組換え型レトロウィルス又は組換え型ウィルスといった上述の組換え型ウィルス の１つを含む薬学組成物が提供されている。この組成物は、溶液としてか或いは 又投与前に溶液中に懸濁される固体形態（例えば凍結乾燥されたもの）として調 製されつる。さらにこの組成物は、注射、経口又は直腸投与のために適した担体 又は希釈剤と共に調製することもできる。一般に組換え型ウィルスは、調剤の前 に０．２５％〜２５％好ましくは約５％〜２０％の濃度で利用される。その後続 いて、組成物調製後に組換え型ウィルスはｌ用量あたり材料的ｌμｇを構成し、 この量の約１０倍の量の材料（１０μｇ）を同時精製された汚染物質として伴っ ている。好ましくは、組成物は、以下で記述するように０．１−１．０ｍｌの水 溶液の形で調製される。

薬学的に受容可能な担体又は希釈剤は、利用される用量及び濃度では受容体にと って無毒である。注射可能な溶液のための担体又は希釈剤の代表例としては、水 、好ましくは生理学的ｐＨで緩衝されている等侵食塩水（例えばリン酸緩衝溶液 又はトリス緩衝液）、マンニトール、デキストロース、グリセロール及びエタノ ールならびにヒト血清アルブミンといったようなタンパク質又はポリペプチドが 含まれる。特に好ましい組成物には１０ａ＋ｇ／ｍｌのマンニトール、１＋ｎｇ ／＋ｎｌのＨ３Ａ、　２０＋ｎＭのトリス、ｐＨ７，２及び１５０ａ＋ＭのＮａ Ｃ１の中にベクター又は組換え型ウィルスが含まれている。この場合、組換え型 ベクターは約ｌμｇの材料を表わすことから、高分子量材料の１％未満で合計材 料（水を含む）のｌ　７１０００００未満でありうる。この組成物は少なくとも ６力月間−７０℃で安定している。組成物は静脈内（ｉ、ｖ、）又は皮下（Ｓ、 　Ｃ，）で注射できるが、一般には筋向注射（ｉ、＋ｎ）することが好ましい。

通常用いられる個々の用量はｌＯＴ〜１０”ｃ、　ｆ、　ｕ、　（ＨＴ１０８０ 細胞上で滴定されたネオマイシン耐性のコロニー形成単位）である。

これらは、当初３回又は４回の用量について１〜４週間の間隔で投与される。そ の後の追加抗原注射は、６〜１２力月後１回又は２回の用量として、又その後は 年１回与えることができる。

セルロース、ラクトース、マンニトール、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コーグリコー ル酸塩）球及び／又はでんぷんなどの炭水化物といった担体又は希釈剤と共に経 口製剤を利用することもできる。組成物は、例えば錠剤、ゲルカプセル、火剤、 溶液又は懸濁液の形をとることもできるし、付加的には持続放出用に調剤するこ ともできる。

直腸投与のためには、座薬の調製はポリアルカレングルコース又はトリグリセリ ドといった従来の担体を用いて達成できる。

上述のように、ベクター構成体は、肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分に 加えて免疫調節補因子の発現を導くことができる。

しかしながらベクター構成体が、サイトカインである免疫調節補因子を発現しな い場合、このサイトカインを上述の組成物中に含み入れてもよいし、或いは上述 の組成物と別に（同時に又はひき続き）投与することもできる。簡単に言うと、 このような実施態様においては、免疫調節補因子は、好ましくはＴｈｅ　Ｐｈｙ ｓｉｃｉａｎ’ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ内に規定されているような標 準的プロトコル及び用量に従って投与される。例えば、アルファインターフェロ ンは２−４力月間１日１〜５００万単位の用量で、ルー２は体重１ｋｇにつき１ ００００〜１０００００単位で１日１〜３回２−１２週間投与することができる 。ガンマインターフェロンは、２−１２週間２〜３回１５００００〜１５０００ ００　Ｕ／ｍの用量で投与することができる。

以下の例は、説明を目的として提供されるものであり制限的な意味をもつもので はない。

実施例 例　１ ）ＩＢＶｔ／ｃ。□配列の分離 Ｂ型肝炎の全ブリコア／コアコーディング領域を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩフ ラグメントをプラスミドｐＡＭ６（ＡＴＣＣ’Ｎｏ、　４５０２０）から得、Ｋ ＳＩＩ”″のＢａｍ８１部位内へ連結させる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　 Ｊｏｌｌａ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　ｏ　このプラスミドをＫＳ■＋ＨＢｐｃ／ｃ（図１） と呼ぶ。

ＫＳｎ”ＨＢｐｃ／ｃ内のブリコア／コアの５ｔｕ１部位にＸｈｏ　Ｉリンカ− を付加し、結果として得られた８７７塩基対のＸｈｏＩ−ＨｉｎｃＩＩブリコア ／コアフラグメントをＳに■４のＸｈｏｌ／ＨｉｎｃＩＩ部位内にクローニング する。このプラスミドをＳＫ”　ＨＢｅ（図１）と呼ぶ。

例　２ ＰＣＲを用いた配列の調製 して、ブリコア／コアコーディング領域が正しいか否かを決定する。

この配列は、コドン８４及び８５における２つの連続した枠内（ｉｎ−ｆｒａｍ ｅ）ＴＡＧ停止コドンという結果をもたらすコドン７９におけるフレームシフト をひき起こす単一の塩基対の欠失を有することがわかった（図２）。この欠失は 、プラスミドＳＫ”　）ｌＢｅ内のブリコア／コアコーディング領域のＰＣＲオ ーバーラツプ伸展によって補正される（Ｈｏ　ｅｔａｌ、、　Ｇｅｎｅ　７７　 ：　５１−５９．１９８９）。欠失を補正するのに行なわれる３回のＰＣＲ反応 のために４つのオリゴヌクレオチドプライマが用いられる。

第１の反応は２つのプライマを利用する。センスプライマ配列は、ａｄｗ株のヌ クレオチド配列５〜２７に対応し、５′末端に２つのＸｈｏ　Ｉ制限部位を含ん でいる。ヌクレオチド配列の番号付けはＧｅｎｂａｎｋ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ ｉｃｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ ）から得られている。

（配列ＩＤ番号ｌ） ５　’　−３’　：　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　 ＣＣＡ　ＴＧＣＡＡＣＴＴＴ　ＴＴ第２のプライマ配列は、Ｂ型肝炎ウィルスの ａｄｗ株のアンチセンスヌクレオチド配列２１５８〜２１３０に対応し、コドン ７９．８４及び８５を含む。

（配列ＩＤ番号２） ５−３　’　：　ＣＴＡ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＣＣＴＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　Ｇ ＡＴ　ＣＴＴ　ＣＣ第２の反応も又２つのプライマを利用する。センスプライマ はａｄｗ株のヌクレオチド配列２１３０〜２１５Ｂに対応し、コドン７９．８４ 及び８５を含む。

（配列ＩＤ番号３） ５　’　−３’　：　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＧ　ＧＧＡ　Ｔ ＣＴ　ＡＧＴ　ＡＧ第２のプライマは、コドン８４及び８５から下流側のＳＫ” プラスミドポリリンカーからのアンチセンスヌクレオチド配列に対応する。

（配列１０番号４） ５　’　−３’　：　ＧＧＧ　ＣＧＡ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＣＧ Ａ　ＴＡＣＣＣ第３の反応は同様に２つのプライマを利用する。センスプライマ はａｄｗ株のヌクレオチド配列５〜２７に対応し５′末端に２つのＸｈｏ　１制 限部位を含む。

（配列ＩＤ番号ｌ） ５　’　−３’　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＣＣ Ａ　ＴＧＣＡＡＣＴＴＴ　ＴＴＴ２Ｏプライマ配列はコドン８４及び８５から下 流側のＳＫ＋プラスミドポリリンカーからのアンチセンスヌクレオチド配列に対 応する。

（配列ＩＤ番号４） ５−３　’　ＧＧＧ　ＣＧＡ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＣＧＡ　ＴＡ ＣＣＣ第１のＰＣＲ反応は、アンチセンスストランド内の欠失を補正し、第２の 反応はセンスストランド内の欠失を補正する。ＰＣＲ反応ｌ及び２は、コドン７ ９内で起こるＣＣからＣＣＡへの突然変異及びコドン８１内のＴＣＡからＴＣＴ までの塩基対置換を補正する（図２参照）。プライマｌは、ＨＢＶｅコーディン グ領域のＡＴＧコドンより１０ｂｐ上流に２つの連続するＸｈｏ　１部位を含み 、プライマ４は、ＨＢＶブリコア／コアコーディング領域の停止コドンより１３ ５ｂｐ下流側に１つのＣｌａＩ部位を含んでいる。第１及び第２のＰＣＲ反応の 産物は、第３のＰＣＲ反応内で伸展させられて、正しい配列をもつ１つの完全な １（ＢＹダブリコアコアコーディング領域を生成する（図３）。

ＰＣＲ反応は、以下のサイクル条件を用いて行なわれる：すなわち、まず最初に 試料を２分間９４℃まで加熱する。融解段階と呼ばれるこの段階は２本鎖ＤＮＡ を、合成のため一本鎖へと分離する。次に試料を３０秒間５６℃で加熱する。ア ニーリング段階と呼ばれるこの段階によりプライマは第１段階で生成された１本 鎖ＤＮＡまでアニールすることができる。次に試料を３０秒間７２℃で加熱する 。この段階は伸展段階と呼ばれ、第１段階で生成された１本鎖ＤＮＡの相補的ス トランドを合成する。第２の融解段階が、３０秒間９４℃で行なわれ、その後に ３０秒間５６℃でアニーリング段階が続き、その後３０秒間７２℃で伸展段階が 続く。その後この手順を３５サイクルくり返し、結果として望ましいＤＮＡ産物 の増幅が得られる。

ＰＣＲ反応産物はゲル電気泳動によって精製され、ＮＡ４５ペーパー（Ｓｃｈｌ ｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１．　Ｋｅｅｎｅ、　Ｎｅｗ　Ｈａｗ＋ｐ ｓｈｊｒｅ）上に移送される。望ましい７８７ｂｐ０）ＤＮＡフラグメントは、 ４００μｌの高塩分緩衝液（１，５ＭのＮａＣ］、２０ｍＭのトリス、１）Ｈ８ ，０、及び０．１＋ｎＭのＥＤＴＡ）内で６５℃で３０分間インキュベートする ことによりＮＡ４５ペーパーから溶出される。溶出後、５００μｌのフェノール ：クロロホルム；イソアミルアルコール（２５：２４：１）を溶液に付加する。

混合物を渦巻運動に付し次に５分間１４０００ｒｐｍで遠心分離させる。望まし いＤＮＡフラグメントを含む水相を新鮮な１．５ｍｌ入りマイクロフユージュ管 に移し、１、０ｍｌの１００％ＥｔＯＨを付加する。この溶液を５分間ドライア イス上でインキュベートし、次に１１００００ｒｐで２０分間遠心分離する。上 清をデカントし、ベレットを５００μｌの７０％ＥｔＯＨで洗う。真空下１１０ ０００ｒｐの遠心分離によりベレットを乾燥させ、次に１０μｌの脱イオン水の 中で再懸濁させる。ｌ、５％のアガロースゲル電気泳動により１マイクロリツト ルのＰＣＲ産物を分析する。７８７塩基対のＸｈｏ　１、−Ｃ１ａｌブリコア／ コアＰＣＲ増幅済みフラグメントをＳＫ＋プラスミドのＸｈｏ　ｌ−Ｃ１ａ　Ｉ 部位内へクローニングさせる。このプラスミドをＳに”　）ＩＢｅ−ｅと呼ぶ。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　（Ｄｔ１５　ａｌｐｈａ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈＣａｂｓ、　Ｇａ１ｔｈｅｒｓ　ｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）をＳＫ” 　ＨＢｅ−ｃプラスミドで形質転換させ、プラスミドＤＮＡを生成するべく増殖 させる。次にプラスミドを、基本的にＢｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｎｕ ｃ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　７　：　１５１３．１９７９　；分子クローニング： 実験室マニュアル、Ｓａ＋ｎｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　（ｅｄｓ、）。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、１９８９も参照のこと） 　。ＳＫ”　ＨＢｅ−ｃプラスミドを分析して、ブリコア／コア遺伝子の配列（ 図４）を確認する。

Ｂ、ＩＩＢＶコア配列の分離 プラスミドＳＫ“ＨＢｅ内の単一塩基対欠失は、例２Ａに記したとおりＰＣＲオ ーバーラツプ伸展により補正される。突然変異を補正するべく行なわれるＰＣＲ 反応のために４つのオリゴヌクレオチドプライマが用いられる。

第１の反応は２つのプライマを利用する。センスプライマはＳＫ”　ＨＢｅプラ スミドのＴ−７ブロモータのためのヌクレオチド配列に対応する。

（配列ＩＤ番号５） ５’　−３’　：ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ第２のプライマは、 ａｄｗ株のアンチセンス配列２１５８〜２１３０に対応し、コドン７９．８４及 び８５を含む。

（配列ＩＤ番号２） ５　’　−３’　：　ＣＴＡ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＣＣＴＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ 　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＣＣ第２の反応は２つのプライマを利用する。アンチセンス プライマは、ＳＫ’　ＨＢｅプラスミドの中に存在するＴ−３プロモータのため のヌクレオチド配列に対応する。

（配列ＩＤ番号６） ５’　−３’　：ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ第２のプライマは、ａｄ ｗ株のセンスヌクレオチド配列２１３０〜２１５８に対応し、コドン７９．８４ 及び８５を含む。

（配夕１ＨＤ番号３） ５　’　−３’　：　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＧ　ＧＧＡ　Ｔ ＣＴ　ＡＧＴ　ＡＧ第３の反応は２つのプライマを利用する。アンチセンスプラ イマは、ＳＫ＋ＨＢｅプラスミド内に存在するＴ−３プロモータのためのヌクレ オチド配列に対応する。

（配列ＩＤ番号６） ５　’　−３’　：　ＡＴＴ　ＡＡＣＣＣＴ　ＣＡＣＴＡＡ　ＡＧ第２のプライ マは、ＳＫ’　ＨＢｅプラスミド内に存在するＴ−７プロモータのセンス配列に 対応する。

（配列ＩＤ番号７） ５’　−３’　：ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ第３の反応からのＰ ＣＲ産物は、ＨＢＶブリコア／コアコーディング領域のための正しい配列を生み 出す。

ＨＢＶコアコーディング領域を分離するため、コアコーディング領域のＡＴＧ開 始コドンの上流にＸｈｏ　Ｉ制限部位を導入するようにプライマを設計し、これ はＨＢＶプリコアコーディング領域の２９のアミノ酸リーダー配列を除去する。

第４の反応においては、ＨＢＶコアコーディング領域は、第３の反応からのＰＣ Ｒ産物及び以下のプライマを用いて生成される。

第４の反応は２つのプライマを利用する。センスプライマは、ａｄｗ株のヌクレ オチド配列１８８５〜１９０５に対応し、５′末端に２つのＸｈｏ　１部位を含 む。

（配列ＩＤ番号８） ５　’　−３’　：　ＣＣＴ　ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＧＴ Ｇ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　Ｇ第２のプライマはＳＫ”　ＨＢｅプラ スミド内に存在するＴ−３プロモータのためのアンチセンスヌクレオチド配列に 対応する。第４のＰＣＲ反応からの約ｅｏｏｂｐのＰＣＲ産物は、５′末端にＨ ＢＶコアコーディング領域及び新規のＸｈｏ　Ｉ制限部位そしてＳＫ”　）ＩＢ ｅプラスミドのマルチクローニング部位内に存在していた３′末端にＣ１ａ　Ｉ 制限部位を含んでいる。

（配列ＩＤ番号９） ５　’　−３’　：　ＡＴＴ　ＡＣＣＣＣＴ　ＣＡＣＴＡＡ　ＡＧ第４のＰＣＲ 反応に続いて、溶液は新鮮な１．５＋ｎｌのマイクロフユージュ管の中に移され る。この溶液に３Ｍの酢酸ナトリウムを５０マイクロリツトル、次に５００μｌ のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を付加する。混合物を渦巻 運動に付し、次に５分間１４０００ｒｐｍで遠心分離する。水相を新鮮なマイク ロフユージュ管に移し、１００％のＥＬＯＨを１．０＋ｎｌ付加する。この溶液 を４．５時間−２０℃でインキュベートし、次に２０分間１１００００ｒｐで遠 心分離する。上清をデカントし、ペレットを７０％のＨｌＯＨ５００μｌで洗う 。真空下で１０００゜ｒｐｍの遠心分離によりペレットを乾燥させ、次に１０μ ｌの脱イオン水の中で再懸濁させる。１．５％のアガロースゲルの中での電気泳 動によりＰＣＲ産物ｌＯマイクロリットルを分析する。

Ｃ，ＨＣＢコア配列の分離 慢性の非Ａ非Ｂ肝炎を患う患者から２００μｌの血清試料を得、Ｃｈｒｉｓｔｕ ａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　（肝臓学）　１４　：　５１ −５５．１９９１の手順によりウィルスＲＮＡを調製する。４．２Ｍのイソチオ シアン酸グアニジニウム（Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　ＳＬ 、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、０．５％のラウリルザルコース酸ナトリ ウム及び２５ｍＭのトリスＨＣＩ、　ＰＨ８，０から成る５５０μｍの抽出緩衝 液と２００μｌの血清を混合し、フェノール：クロロホルム（１：　ｌ）で１回 、クロロホルムで１回抽出する。水相を等量のイソプロピルアルコールで沈降さ せ、５分間１４０００ｒｐｍで遠心分離する。ウィルスＲＮＡを含む結果として 得られたペレットを７０％のエタノールで洗浄し２００μｌのＲＮａｓｅを含ま ない脱イオン水の中に再懸濁させる。４マイクロリツトルのＲＮａｓｉｎ（４０ ０００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ、、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓ ｃｏｎｓｉｎ）を混合物に付加する。

この混合物はＨＣＶ　ＲＮＡを含み、次に続（逆転写酵素反応のための鋳型であ る。ｃＤＮＡ　ＣＹＣＬＥキット（Ｉｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ 、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、全長の第１１１ｃＤＮＡを、分離された ウィルスｍＲＮＡから生成する。ｌｏμｌのＩＯＸ　ＰＣＲ緩衝液（バイアルＣ １６）、２μｍの２５ａ＋ＭのｄＮＴＰｓ（バイアルＣ１１）、５％の０ＭＳＯ ５４ＵのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ、　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ 、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）及び２回Ｍずつの２つのプライマを含む合計量１０ ０μｌの反応混合物中でＰＣＨにより、上述の逆転写反応を７マイクロリツトル （１００ｎｇの全長篇１　ｊｌＪｌｃＤＮＡ）を増幅させる。

センスプライマは、ヌクレオチド配列３１６〜３３５に対応し、Ｃ型肝炎ウィル スコア読取り枠の５′領域のためのヌクレオチド配列であり、　ＡＴＧ開始コド ンを含む。

（配列１０番号１０） ５　’　−３’　：　ＧＴＡ　ＧＡＣＣＧＴ　ＧＣＡ　ＴＣＡ　ＴＧＡ　ＧＣ第 ２のプライマは、Ｃ型肝炎ウィルス外皮読取り枠の中に存在するアンチセンスヌ クレオチド配列１１７２〜１１５３に対応する。

（配列ＩＤ番号１２） ５　’　−３’　：　ＡＴＡ　ＧＣＧ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＧＣ 反応混合物をＰＣＲ遺伝子ＡＭＰシステム９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−ｆ！Ｉｍｅ ｒ、　Ｃｅｔｕｓ。

Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）の中に入れる。ＰＣＲプロ グラムは、まず１分間９５℃に次に２分間６０℃に、そして最後に２分間７２℃ に反応容器の温度を調整する。このサイクルは４０回くり返される。４０回目の サイクルの後、最後のサイクルは反応容器を１分間９５℃に、次に２分間６７℃ にそして最後に７分間７２℃に調整する。

第１のＰＣＲ反応では、ＡＴＧ開始コドンから上流側の５′領域からＨＣＶｅ読 取り枠までのＨＣｖコア読取り枠が増幅される。ヌクレオチド番号付は配列は、 ＨＣＶ−Ｊ株に従ったものである（Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７　：　９５２４−９５２８．１９ ９０）。

第１のＰＣＲ反応からの産物は第２のＰＣＲ反応で増幅される。第２のＰＣＲ増 幅は、ヌクレオチド配列３２９〜３６７に対応するセンスプライマを用いて行な われる（そして、Ｃ型肝炎ウィルスコア読取り枠の５′末端のためのヌクレオチ ド配列である）。センスプライマの５′末端は２つの連続するＸｈｏ　Ｉ制限部 位を含んでいる。プライマは同様に、翻訳開始のための適切な規則に合致するべ くイニシエータＡＴＧ開始コドンの部域内に導入された一定数のヌクレオチド変 更をも含んでいる（Ｋｏｚａｋ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１９６：９４７−９５ ０．１９８７）。

（配列ＩＤ番号１２） ５　’　−３’　：　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＴＧＡ　 ＧＣＡ　ＣＡＡ　ＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　 ＡＡＣＧアンチセンスプライマは、ＨＣＶコア遺伝子と枠を成して２つの連続し た停止コドンを含むべく設計されている。プライマの５′末端は２つの連続する 旧ｎｄｌＩＩ制限部位を含む。このプライマは、ヌクレオチド配列９０２〜８６ ０に対応し、Ｃ型肝炎ウィルスのコアと外皮読取り枠の間の接合部である。

（配列Ｉｆ）番号１３） ５−３　’　：　ＧＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＴＣＡ　ＡＧ ＣＧＧＡ　ＡＧＣＴＧＧ　ＧＡＴＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　Ｃ ＡＡ　ＡＧＣＴＡＡ　ＧＡＧＡｌＯ２ＣＲ反応からの産物は同様に第３のＰＣＲ 反応においても増幅される。センスプライマの５′末端は２つの連続する旧ｎｄ ｌｌｌ制限部位を含む。このプライマは同様に、翻訳開始のためのＫｏｚａｋ規 則に合致するようヌクレオチド変更を含んでおり、ＨＣＶ−Ｊ配列のヌクレオチ ド配列３２９〜３６７に対応する（そしてＣ型肝炎ウィルスコア読取り枠の５′ 末端のためのヌクレオチド配列である）。

（配列ＩＤ番号１４） ５　’　−３’　：　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＴＧ Ａ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　ＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＣ Ａ　ＡＡＣＧアンチセンスプライマは、ＨＣＶコア遺伝子と枠を成して２つの停 止コドンを、又プライマの５′末端に２つの連続するＸｈｏ　Ｉ制限部位を含む ように設計されている。このプライマは、アンチセンスヌクレオチド配列９０２ 〜８６０に対応し、Ｃ型肝炎ウィルスのコアと外皮読取り枠の間の接合部である 。

（配列ＩＤ番号１５） ５　’　−３’　：　ＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＡ　ＴＣＡ　ＡＧ Ａ　ＧＧＡ　ＡＧＣＴＧＧ　ＣＡＴＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　 ＣＡＡ　ＡＧＣＴＡＡ　ＧＡＧＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、次に第２の反応 からの５７０ｂｌ）のＰＣＲ増幅した産物をｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）内に連結させ、凍 結した受容能あるＥ、　ｃｏｌｉ細胞へと形質転換させる。ＤＮＡ配列決定によ る確認の後、この構成体をｐＣＲＩＩ　Ｘｈ−Ｈ）ＩｃＶコアと呼称する。

上述のとおり、第３の反応からの５７０ｂｐのＰＣＢ増幅された産物をｐＣＲｎ ベクター内に連結させる。［ｌＮ＾配列決定による確認の後、この構成体をｐＣ ＲＩＩ　Ｈ−Ｘｈｌ（ＣＶココア呼称する。

Ｄ、ＨＣＶＮＳ３／ＮＳ４配列の分離 Ｃ型肝炎ウィルスＮＳ３／ＮＳ４配列を、例ＩＣ内に記述されているように非Ａ 非Ｂ肝炎を有する患者からの２００μＩの血清から分離する。ウィルスＲＮＡを 、ｃＤＮＡ　ＣＹＣＬＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ 。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）により逆転写し、ＰＣＲにより増幅する。第１のＰＣＲ 反応においては、ＨＣＶＮ５３／Ｎ５４読取り枠が増幅される。

第１のＰＣＲ増幅は２つのプライマを用いて行なわれる。センスプライマはＣ型 肝炎ウィルスＮＳ２読取り枠のヌクレオチド配列３０８８〜３１０６に対応する 。

（配列ＩＤ番号） ５　’　−３’　：　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＴＡＧ　ＴＧＣＣ第２ のプライマは、Ｃ型肝炎ウィルスＮ５５読取り枠のアンチセンスヌクレオチド配 列６５３０〜６５１１に対応する。

（配列ＩＤ番号１７） ５　’　−３’　：　ＣＧＴ　ＧＧＴ　ＧＴＡ　ＴＧＣＧＴＴ　ＧＡＴ　ＧＧＣ 第１ＰＣＲ反応からの産物は第２のＰＣＲ反応において増幅される。

センスプライマの５′末端には、２つの連続するＸｈｏ　Ｉ制限部位が含まれる 。このプライマは同様に、翻訳開始のためのＫｏｚａｋ規則に合致するべくヌク レオチド変更をも含み、ＨＣＶ−Ｊ配列のＮＳ３読取り枠の５′領域のヌクレオ チド配列３３４８〜３３８５に対応する。

（配列ＩＤ番号１８） ５　’　−３’　：　ＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ 　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＴＡＣＴＴＣＴＡＧ　ＧＡＣＣＧＧ　ＣＣＧ　ＡＴ Ａ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　Ｇこのプライマは、ＨＣＶ−Ｊ配列のＮＳ４読取り枠の３ ′領域のＨＣＶ　−Ｊのヌクレオチド配列６３６８〜６３２８に対応する。この プライマは、ＨＣＶコア遺伝子と枠をなす２つの連続する停止コドン及びその５ ′末端にある２つの連続する旧ｎｄｌｌＩ部位を含む。

（配列１０番号１９） ５　’　−３’　：　ＧＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＴＣＡ　 ＧＣＧ　ＴＴＧ　ＧＣＡ　ＴＧＡ　ＣＡＧＧＡＡ　ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＴＣＣＣＧ Ｇ　ＴＡＡ　ＣＣＧ　ＣＧＧ　Ｃ第２のＰＣＲ反応からの３０２０ｂｐのＰＣＲ 産物をｐＣＲＩＩプラスミド内に連結し、ＤＮＡ配列決定ニヨッテ確認し、ｐＣ ＲＩＩ　、　Ｘｈ−Ｈ）ＩＣＶＮ５３／ＮＳ４と呼称する。

Ｅ、免疫調節補因子ＩＬ−２の増幅 Ｔ７５フラスコ内で１５８ｍ１の合計体積となるまでｌＸｌ０’細胞／ｍｌでジ ャーカット細胞を再懸濁させる。合計体積の１％（合計１．５８ｍ１）までフィ トヘマグルチニン（ＰＨＡ）を付加し、３７℃、５％ＣＯｔで一晩インキユベー トする。翌日、細胞を３本の５０ｍ１入り遠心分離管の中に採収する。３つのペ レットを５０＋ｎｌのＰＢＳ内で組合わせ、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離さ せ、上清をデカントする。この手順を反復する。

Ｍｉｃｒｏ−Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ分離キット、バージョン１．２　 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、Ｐｏ１ｙ　Ａ”　ｍ ＲＮＡを分離する。分離された無傷のｍＲＮＡを鋳型として用いて、以下のプラ イマでｃＤＮＡＣＹＣＬＥキットにより全長第１鎖ｃＤＮＡを生成する。

このオリゴヌクレオチドは、停止コドンより２５塩基対だけ下流にあるＩｌ、− ２ｎ＋ＲＮＡのアンチセンスヌクレオチド配列に相応する。

（配列ＩＤ番号２０） ５　’　−３’　：　ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＡＧＡ　ＡＧＧ　ＣＣＴ　ＧＡＴ　ＡＴ Ｇ逆転写反応からの産物を、２つの別々の反応において増幅する。

第１のＰＣＲ増幅はＡＴＧ開始コドンの下流３ｂｐに相応するセンスプライマを 用いて行なわれる。このプライマはその５′末端に旧ｎｄＩ［［部位を内含し、 ＡＴＧ開始コドンを含むＩＬ−２読取り枠の５′領域を内含する。

（配列ＩＤ番号２１） ５　’　−３’　：　ＧＣＡ　ＡＧＣＴＴＡ　ＣＡＡ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＧＧＡ 　ＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴ　ＣＴアンチセンスプライマは、ＩＬ−２読取り枠 の３′領域に対し相補的であり、ＴＧＡ停止コドンの下流３ｂｐのところで開始 する。このプライマは、その５′末端にＸｈｏ　Ｉ部位を内含している。

（配列ＩＤ番号２２） ５　’　３　’　：　ＧＡＣＴＣＧ　ＡＧＴ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＴＣＡＧＴ　 ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＣＴ第１のＰＣＲ反応からの４６７ｂｐのＰ ＣＲ産物をｐＣＲＩＩプラスミド内に連結し、　ＤＮＡ配列により確認し、ｐＣ Ｒｎ　Ｈ−Ｘｈ　ＩＬ−２と呼称する。

逆転写反応からの産物を第２のＰＣＲ反応において増幅させる。ＡＴＧ開始コド ンの下流３ｂｐに対応するセンスプライマを用０て、第２のＰＣＲ増幅を実施す る。このプライマはその５′末端にＸｈｏ　１部位を内含し、ＡＴＧ開始コドン を含む１１、−２読取り枠の５′領域を内含する。

（配列ＩＤ番号２３） ５　’　−３’　：　ＧＣＣＴＣＧ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＧＧＡ 　ＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴ　ＣＴアンチセンスプライマは、ＩＬ−２読取り枠 の３′領域に対して相補的であり、ＴＧＡ停止コドンの下流３ｂｐのところで開 始する。このプライマは、その５′末端にＡｐａ　Ｉ部位を含む。

（配列ＩＤ番号２４） ５　’　−３’　：　ＧＡＧ　ＧＧＣＣＣＴ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＴＣＡＧＴ　 ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＣＴＴ２ＯＰＣＲ反応からの４６７ｂｐのＰ ＣＲ産物をｐＣＲＩＩプラスミド内に連結し、ＤＮＡ配列決定により確認し、凍 結した受容能あるＥ、　ｃｏｌｉ細胞へと形質転換する。このベクター構成体を ｐＣＲＩＩ　Ｘｈ−ＡＩＬ−２と呼称する。

Ｆ、ＰＣＲを利用した免疫調節補因子Ｂ７／ＢＢＩの増幅５本の７７５フラスコ 内で合計体積１５８ｍ１となるまでラージ細胞をｌＸｌ０’の細胞／ｍｌで懸濁 させ、３７℃、５％Ｃ０２で一晩インキユベートする。翌日、３本の５０ｍ！入 り遠心分離管の中に細胞を採収する。

細胞ベレットを５０ｍ１のＰＢＳ内で組合わせ、２０００ｒｐｍで１０分間遠心 分離し、上清をデカントする。この手順をくり返す。例２Ｅで記述したとおりポ リＡ”　ｎ＋ＲＮＡを分離する。分離された無傷のｍＲＮＡを鋳型として用いて 、ｃＤＮＡ　ＣＹＣＬＥキットを利用して全長第１鎖ｃＤＮＡを生成しひきつづ き基本的に例２Ｅに記されているとおりに２回の個別のＰＣＲ増幅反応を行なう 。ヌクレオチド番号づけシステムは、Ｆｒｅｅｍａｎ　ｅｔａｌ、（Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ　１４３　：　２７１４−２７２２．　１９８９）から得られる。

第１のＰＣＲ増幅は２つのプライマを用いて行なわれる。センスプライマは、Ｂ 　７　／ＢＢ　１のヌクレオチド配列３１５〜３５３に対応する。

このプライマは、ＡＴＧ開始コドンを含むＢ　７　／ＢＢ　１読取り枠の５′領 域を内含し、５′末端に２つの旧ｎｄｎ［制限部位を有する。

（配列ＩＤ番号２５） ５　’　−３’　：　ＣＧ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＧＣＣＡＴＧ　 ＧＧＣＣＡＣＡＣＡ　ＣＧＧ　ＡＧＧＣＡＧ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＴＣＡ　ＣＣＡ 　ＴＣＣ第２のプライマは、Ｂ７／ＢＢＩのアンチセンスヌクレオチド配列１１ ８７〜１１４９に対応する。このプライマは、ＴＡＡ停止コドンで終了するＢ７ ／ＢＢＩ読取り枠の３′領域に対し相補的であり、５′末端に２つのＸｈｏ　Ｉ 制限部位を含んでいる。

（配列ＩＤ番号２６） ５　’　−３’　：　ＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＧ　ＴＴＡ　ＴＡＣ ＡＧＧ　ＧＣＧ　ＴＡＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＣＴＣ ＴｉＯ２ＣＲ反応からの８６８ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩの中に連結させ、 ＤＮＡ配列決定により確認し、凍結した受容能あるＥ、　ｃｏｌｉ細胞へと形質 転換する。このベクター構造体をＰＣＲＩＩ　Ｈ−Ｘｈ−８７／ＢＢＩと呼称し 、ＤＮＡ配列によって確認する。

第２のＩ’ＣＲ増幅は２つのプライマーを用いて行なわれる。センスプライマは 、Ｂ７／ＢＢＩのヌクレオチド配列３１５〜３５３に対応する。

このプライマは、ＡＴＧ開始コドンを含むＢ７／ＢＢＩ読取り枠の５′領域を内 含し、その５′末端に２つのＸｈｏ　１部位を有する。

（配列ＩＤ番号２７） ５’　−３’　：Ｃｃ’ｒｃ　ＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＧＣＣ八ＴＧ　ＧＧＣＣ ＡＣＡＣＡ　ＣＧＧ　ＡＧＧＣＡＧ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＣ 第２のプライマは、Ｂ７／ＢＢＩのアンチセンスヌクレオチド配列１１８７〜１ １４９に対応する。このプライマは、ＴＡＡ停止コドンで終結するＢ７／ＢＢＩ 読取り枠の３′領域に相補的であり、５′末端に２つのＡｐａ　Ｉ制限部位を含 む。

（配列１０番号２８） ５　’　−３’　：　ＣＧＧＧ　ＣＣＣＧＧＧ　ＣＣＣＣＴＧ　ＴＴＡ　ＴＡＣ ＡＧＧ　ＧＣＧ　ＴＡＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＣＴＣ 第２のＰＣＲ反応からの８６８ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲｎプラスミド内に連結 し、ＤＮＡ配列決定により確認し、凍結した受容能ある［！、　ｃｏｌｉ細胞へ と形質転換する。このベクター構成体をｐＣＲＩＩ　Ｘｈ−Ａ−Ｂ７／ＢＢＩと 呼称し、ＤＮＡ配列により確認する。

Ｇ、ＰＣＲを利用した免疫調節補因子ＧＭ−Ｃ５Ｆの合成ＧＭ−Ｃ３Ｆの合成を 、Ｆｏｇｕｅｊ及びＬｕｂｂｅｒｔのプロトコル（ＢｉｏＬｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３　：　６７４−６７５．１９９２）に従って実施する。長さ５３〜１０６ヌ クレオチドの重複するオリゴヌクレオチドを合成する。第１のオリゴヌクレオチ ドは、５′末端で２つの旧ｎｄｎ１分割部位を含むヌクレオチド配列番号２９〜 ８６のヒトＧＭ−Ｃ５Ｆのセンス配列である。

（配列ＩＤ番号２９） ５　’　−３’　：　ＧＣＡ　ＡＧＣＴＴＡ　ＡＧＣＴＴＧ　ＡＧＧ　ＡＴＧ　 ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＴＴＧ　ＧＧＣＡＣＴ 　ＧＴＧ　ＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴ　ＧＣＡＣ２Ｏ４リゴヌクレオチド は、５′末端に２つのＸｈｏ　１部位を含むヌクレオチド番号２９〜８６のヒト ＧＭ−Ｃ３Ｆのセンス配列である。

（配列Ｉ１１番号４７） ５　’　−３’　：　ＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＧＴ Ｇ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＣＣＴＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＧＧ　ＣＡＣ ＴＧＴ　ＧＧＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＣＴＣＴＧＣＡ第３のオリゴヌクレオ チドは、ヌクレオチド配列番号１４５〜７０のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのアンチセンス 配列である。

（配列！Ｄ番号３０） ５　’　−３’　：　ＴＣＣＴＧＧ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＴＴＣＡＣＡ　ＴＧＣＴ ＣＣＣＡＧ　ＧＧＣＴＧＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＣＴＧ　ＧＧＣＧＡＧ　Ｃ ＧＧ　ＧＣＧ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ４番目のオリ ゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号１３１〜１９１のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのセン ス配列である。

（配列ＩＤ番号３１） ５　’　−３’　：　ＧＡＡ　ＴＧＣＣＡＴ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＧＧＣＣＣＧ　 ＧＣＧ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＧＡＡＣＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＣＡＣＴＧ ＣＴＧＣＴＧＡ　ＧＡＴ　Ｇ５番目のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド２８ ２〜１７６のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのアンチセンス配列である。

（配列ＩＤ番号３２） ５　’　−３’　：　ＣＴＴ　ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＧＴ 　ＣＴＧ　ＴＡＧ　ＧＣＡ　ＧＧＴＣＧＧ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＴＣＡＡ Ａ　ＣＡＴ　ＴＴＣＴＧＡ　ＧＡＴ　ＧＡＣＴＴＣＴＡＣＴＧＴ　ＴＴＣＡＴＴ 　ＣＡＴ　ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴ６番目のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオ チド２５６〜３４６のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのセンス配列である。

（配列ＩＤ番号３３） ５　’　−３’　：　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＧＧ Ｇ　ＣＣＴ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＣＡＧＣＣＴ　ＣＡＣＣＡＡ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　 ＧＧＧ　ＣＣＣＣＴＴ　ＧＡＣＣＡＴ　ＧＡＴ　ＧＧＣＣＡＧ　ＣＣＡ　ＣＴＡ ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＣＴＧ ７番目のオリゴヌクレオチド配列は、ヌクレオチド番号３３１〜３８９のヒトＧ Ｍ−Ｃ３Ｆのアンチセンス配列である。

（配列ＩＤ番号３４） ５　’　−３’　：　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＴＧＣＡＣＡ 　ＧＧＡ　ＡＧＴ　ＴＴＣＣＧＧＧＧＴ　ＴＧＧ　ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　Ｃ ＴＧ　ＣＴＴ　ＧＴＡ　Ｇ８番目のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号３ ７２〜４３１のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのセンス配列である。

（配列ＩＤ番号３５） ５　’　−３’　：　ＣＡＡ　ＣＣＣＡＧＡ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ 　ＡＡＡ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＡＡＧＡＧＡ　ＡＣＣＴＧＡ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　Ｔ ＴＣＴＧＣＴＴＧ　ＴＣ９番目のオリゴヌクレオチド配列は、５′末端に２つの Ｘｈｏ　Ｉ制限部位を含むヌクレオチド番号５２０〜４１６のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ のアンチセンス配列である。

（配列１０番号３６） ５　’　−３’　：　ＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＧＴＣＴＣＡ　ＣＴＣ ＣＴＧ　ＧＡＣＴＧＧ　ＣＴＣＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＴＣＡＡＡ　ＧＧＧ　ＧＡＴ 　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＧＴＣＣ１０番目のオリゴヌクレオチド配列 は、それが５′末端にＸｈｏ　Ｉ制限部位ではなく２つのＸｂａ　Ｉ制限部位を 含んでいる点を除いて、オリゴヌクレオチド番号９と同一である。

（配列ＩＤ番号３７） ５　’　−３’　：　ＧＣＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＴＣＡ　Ｃ ＴＣＣＴＧ　ＧＡＣＴＧＧ　ＣＴＣＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＴＣＡＡＡ　ＧＧＧ　Ｇ ＡＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＧＴＣＣオリゴヌクレオチド配列１０番 号２９．３６．３７及び４７を除いて全てのオリゴヌクレオチドはリン酸化され ている。連結は、各々のオリゴヌクレオチド８ｐＩｎｏ＋ずつと７．５μＩのＩ ＯＸ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｃ１ｅｖｅ ｌａｎｄ、　０ｈｉｏ）を混合して、無菌精製脱イオン水で最終体積７５μｌに なるようにすることによって行なわれる。反応を、５分間７０℃で、次に５分間 ４８℃で加熱する。２マイクロリツトルのｄＮＴＰ混合物（各ｄＮＴＰ　２．５ ＋ｎＭ）及びＩＯＵの５ｅｑｕｅｎａｓｅを付加し、３７℃で３０分間インキュ ベートする。５ｅｑｕｅｎａｓｅを失活させるため、連結反応を１０分間７０℃ で加熱する（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇＶ　（分子生物学における現行プロトコル）　、ＦｌＭ、Ａｓｕｂ ｅｔ　ｅｔａｌ、、　８．２．８−８．２．１３．１９８８）。

プライマとしての２つのオリゴヌクレオチド配列番号２９及び３６及びＹｅｎ　 ｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ 、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたＰＣＲ反応において、１マイクロリ ツトルの連結混合物を使用する。ＰＣＲ産物をｐＣＲ■ベクター内に連結させ、 凍結した受容能あるＥ、　ｃｏｌｉ細胞へと形質転換させる。この構成体をｐＣ ＲＩｆ　Ｈ−ＸｈＧＭ−Ｃ３Ｆと呼称し、ＤＮＡ配列決定により確認する。

プライマとしての２つのオリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号４７及び３７を伴って Ｖｅｎｔポリメラーゼを用いた第２のＰＣＲ反応においては、連結混合物１マイ クロリツトルを用いた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲｎベクター内に連結し、凍結した 受容能あるＥ、　ｃｏｌｉ細胞へと形質転換させる。コノ構成体をｐｃｉ（ＩＩ 　Ｘｈ−ＸｂＧＭ−Ｃ３Ｆと呼称し、ＤＮＡ配列ニ、ｋ　ＩＩ）　確Ｐｒｅ−５ ２読取り枠（Ｓを含む）を、２つのプライマ及びｐＡＭ６プラスミド（ＡＴＣＣ Ｎｏ、４５０２０）を用いてＰＣＲ増幅させる。センスプライマは、Ｂ型肝炎ウ ィルスのａｄｗ株のヌクレオチド３１７８〜３１に対応する。センスプライマの ５′末端は２つの連続するＸｈｏ　Ｉ制限部位を含んでいる。プライマは、Ｐｒ ｅ−３２読取り枠の５′領域であり、ＡＴＧ開始コドンを含む。

（配列ＩＤ番号４９） ５　’　−３’　：　ＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡ ＧＧ　ＣＣＡ　ＴＧＣＡＧＴＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＴＧＣ ＡＣＣＡＡＧ　ＣＴＣＴＧＣＡＧＧ第２のプライマは、アンチセンスヌクレオチ ド９０７〜８５９に対応し、５′末端に２つのＣ１ａ　Ｉ部位を含む。このプラ イマはＰｒｅ−３ｚ読取り枠の３′領域に対し相補的である。

（配列ＩＤ番号４９） ５　’　−３’　：　ＧＣＡＴＣＧＡＴ　ＡＴＣＧＡＴ　ＧＴＴ　ＣＣＣＣＡＡ 　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＡＴＧＴＡＧ　ＣＣＣＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＴ　Ａ ＧＧ　ＧＡＡ　ＴＡＡ　ＣＣＣＣ９５７ｂｐのＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩプラス ミド内に連結させ、ＤＮＡ配列決定によって確認し、ｐＣＲＨＨＢ−Ｐｒｅ−３ ２と呼称する。

１、　８ＢＶポリメラーゼ読取り枠の分離ＰＣＲ増幅は、２つのプライマ及びｐ ＡＭ６ブラスミド（ＡＴＣＣ４０２０２）を用いて実施される。センスプライマ は、Ｂ型肝炎ウィルスのａｄｗ株のヌクレオチド２３０９〜２３７０に対応する 。センスプライマの５′末端は２つの連続するＸｈｏ　Ｉ制限部位を含んでいる 。このプライマは同様に、翻訳のためのＫｏｚａｋ規則に合致するべくヌクレオ チド変更も含んでいる。

（配列ＩＤ番号５０） ５　’　−３’　：　ＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＣＣＣ ＣＴＡ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＣＡＡＣＡＣＴＴＣＣＧＧ　ＡＡＡ　ＣＴＡ　ＣＴＧ 　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＧＡＣＧＡＣＧＧＧ　ＡＣＣＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＧ第２のプ ライマは、アンチセンスヌクレオチド配列１６４５〜１５９４に対応し、２つの Ｃ１ａ　Ｉ部位を５′末端に含んでいる。このプライマは、ポリメラーゼ読取り 枠の３′領域に対し相補的であり、ＴＧＡ停止コドンを含む。

（配列ＩＤ番号５１） ５　’　−３’　：　ＧＣＡＴＣＧＡＴ　ＡＴＣＧＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＡ Ｔ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＧＧＣＧＴＴＣＡＣＧＧＴ　ＧＧＴ　ＣＧＣＣＡＴ　ＧＣ Ａ　ＡＣＧ　ＴＧＣＡＧＡ　ＧＧＴ　Ｇ２５６４ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲｎプ ラスミド内に連結させ、ＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＲＵ　ＨＢ−ｐｏｌ と呼称する。

Ｊ　、ＨＢＶＯＲＦ５読取り枠の分離 ２つのプライマ及びｐＡＭ６プラスミド（ＡＴＣＣ４５０２０）を用ｔ、”でＰ ＣＲ増幅を行なう。センスプライマは、Ｂ型肝炎ウィルスのａｄｗ株のヌクレオ チド１４３２〜１４８２に対応する。センスプライマの５′末端は２つの連続す るＸｈｏ　Ｉ制限部位を含む。プライマは同様に、翻訳のためのＫｏｚａｋ規則 に合致するべくヌクレオチド変更をも含んでいる。

（配列ＩＤ番号５２） ５　’　−３’　：　ＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＴＣＣ ＣＧＴ　ＣＧＧ　ＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣＣＧ　ＣＧＧ　ＡＣＧ　ＡＣＣＣＣＴ　 ＣＴＣＧＧＧ　ＧＣＣＧＣＴ　ＴＧＧ　ＧＡＣ第２のプライマは、アンチセンス ヌクレオチド配列１６９７〜１６４８に対応し、５′末端に２つのＣ１ａ　Ｉ部 位を含んでいる。このプライマは、０ＲＦ５読取り枠の３′領域に対し相補的で あり、ＴＡＡ停止コドンを含んでいる。

（配列ＩＤ番号５３） ５　’　−３’　：　ＧＣＡＴＣＧＡＴ　ＡＴＣＧＡＴ　ＧＧＴ　ＣＧＧ　ＴＣ Ｇ　ＴＴＧ　ＡＣＡ　ＴＴＧ　ＣＴＧＧＧＡ　ＧＴＣＣＡＡ　ＧＡＧ　ＴＣＣＴ ＣＴ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＡＧＡ　ＣＣ２９３ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲＩ［プラ スミド内に連結させ、ＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＲＩＩ　ＨＢ−ＯＲＦ ５と呼称する。

Ｋ、ＨＢＶＯＲＦ６読取り枠の分離 ２つのプライマ及びｐＡＭ６ブラスミド（ＡＴＣＣ４５０２０）を用ｕ”テＰＣ Ｒ増幅を行なう。センスプライマは、Ｂ型肝炎ウィルスのａｄｗ株のヌクレオチ ド１８４４〜１７８８に対応する。センスプライマの５′末端は、２つの連続し たＸｈｏ　Ｉ制限部位を含む。このプライマは同様に、翻訳のためのＫｏｚａｋ 規則に合致するようヌクレオチド変更をも含んでいる。

（配列ＩＤ番号５４） ５　’　−３’　：　ＧＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ 　ＡＧＧ　ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＴＧＡＡＡＡ　ＡＧＴ　ＴＧＣＡＴＧ　ＧＴＧ　Ｃ ＴＧ　ＧＴＧ　ＣＧＣＡＧＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＧＣＣ第２のプライマ は、アンチセンスヌクレオチド配列１１８８〜１２４０に対応し、２つのＣ１ａ 　１部位を５′末端に含む。このプライマは、０ＲＦ６読取り枠の３′領域に対 し相補的であり、ＴＡＡを含んでいる。

（配列ＩＤ番号５５） ５　’　−３’　：　ＧＣＡＴＣＧＡＴ　ＡＴＣＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＧＣＡ 　ＡＣＣＣＣＣＡＣＴ　ＧＧＣＴＧＧ　ＧＧＣＴＴＡ　ＧＣＣＡＴＡ　ＧＧＣＣ ＡＴ　ＣＡＧ　ＣＧＣＡＴＧ　ＣＧ６８７ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲＴＩプラス ミド内に連結させ、ＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＲＩＩ　ＪＩＢ−ＯＲＦ ６と呼称する。

Ｂ型肝炎ウィルスＸ読取り枠を含む６１２ｂｐのＮｅｏ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉフラ グメントを、ｐＡＭ６ブラスミド（ａｄｗ）（ＡＴＣＣ４５０２０）から得、フ レノウフラグメントにより平滑にし、ＳＫ’の旧ｎｃＩＩ部位（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ。

Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）内に連結させる。このプラスミド をＳＫ−ＸＡｇと呼ぶ。

ＳＫ−ＸＡｇベクター構成体を用いてＥ、　ｃｏｌｉ　（ＤＨ５アルファ、８ｅ ｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　１．ａｂｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　 Ｍａｒｙｌａｎｄ）を形質転換し、増殖させてプラスミドＤＮＡを生成する。こ のプラスミドを次に、基本的にＢｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔ　ａｌにより記述されて いるとおりに（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　７　：１５１３、１９７９　；　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕｅｌ、　Ｓｏｍｂｒｏｏｋｃｔ　ａｌ、（ｅｄｓ、）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９）分離し精製する。

Ｂ、　ＨＢＶＸ抗原の切形化 切形ＸＡｇを生成するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた枠内欠失 によりＴＡＧ停止コドンを挿入する（例２Ｃ）。次に切形Ｘ遺伝子をＳＫ″′の 旧ｎｃＩ［部位内に挿入する。このプラスミドをＳＫ−ＤＸＡｇと呼称する。Ｆ ａｋｔｏｒ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５　：　８６７−８７２．１ ９９０）により記述されている検定を用いて突然変異体を確認する。

Ｎ２ベクターからのｇａｇ配列を含むモロニーマウス白血病ウィルス（ＭｏＭＬ Ｖ）の５′の長末端反復（ＬＴＲ）（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、■ｉｒ、６１　：　１６４７−１６５０．１９８７　；　Ｅｇｌｉｔａｓ　ｅ ｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　：　１３９５−１３９８゜１９８５） をプラスミドＳＫ”　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ ｉｆｏｒｎｉａ）内に連結させる。結果として得られた構成体をＮ２Ｒ５と呼称 する。ＡＴＧ開始コドンをｇａｇ発現を防ぐＡＴＴに変えるための部位特異的イ ンビトロ突然変異誘発により、Ｎ２Ｒ５構成体を突然変異させる。この突然変異 誘発を受けたフラグメントは、長さが２００塩基対（ｂｐ）であり、Ｐｓ口制限 部位によりフランキングされている。ＰｓＩ−Ｐｓｉ突然変異を受けたフラグメ ントは、ＳＫ＋プラスミドから精製され、プラスミドＩ）ＵＣ３１内のＮ２Ｍｏ ＭＬＶ５’　１．ＴＲのＰｓｔＩ部位内に挿入されて突然変異を受けない２００ ｂｐフラグメントを置換する。プラスミドｐｕｃ３１はｐＵｃ１９　（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）から誘導され、 この中で、ポリリンカーのＥｃｏＲＩとＳａｃ　１部位の間に付加的な制限部位 Ｘｈｏｌ、ＢｇｌＩＩ、　Ｂｓ５）ＩＩＩ及びＮｅｏ　Ｉが挿入される。この構 成体をｐＵｃ３１／Ｎ２Ｒ５ｇＭと呼称する。

Ｎ２からの１．０キロベース（ｋｂ）のＭｏＭＬＶ３’　ＬＴＲＥｅｏＲＩ　− ＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミドＳＫ”″へとクローニングし、結果として Ｎ２Ｒ３−と呼ばれる構成体が得られる。この構成体から１．０ｋｂ　Ｃ１ａＩ −）ＩｉｎｄｌＩ［フラグメントを精製する。ネオマイシンホスホトランスフェ ラーゼ遺伝子の発現を駆動するＳＶ４０早期プロモータを含むｐＡＦＶＸＭレト ロウィルスベクターからのＣ１ａｌ　−Ｃ１ａＩ優性選択可能標識遺伝子フラグ メント（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３８　＋　４８３．１ ９８４　：　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　８５　：　３１５０−３１５４．１９ ８８）をＳＫ＋プラスミド内へクローニングさせる。ＳＫ”プラスミドから１． ３ｋｂのＣ１ａ　Ｉ　−ＢｓｊＢ　Ｉ遺伝子フラグメントが精製される。

発現ベクターは、問題の遺伝子を含むＸｈｏ　１−　Ｃ１ａ　１フラグメント及 び１．　ＯｋｂのＭｏＭＬｖ３’　ＬＴＲＣ１ａ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［ｒフラグメ ントがｐＵｃ３１／Ｎ２Ｒ５ｇＭプラスミドのＸｈｏ　ｌ−Ｈ１ｎｄｎ１部位の 中に挿入される３部分連結によって構築される。ｐＡＦＶＸＭレトロウィルスベ クターからの１．３ｋｂのＣ１ａ　Ｉ　−ＢｓｔＢ　Ｉ　ｎｅｏ遺伝子フラグメ ントを次に、センス配位でこのプラスミドのＣ１ａ　１部位の中に挿入する。

Ｂ、レトロウィルスバックボーンにＴ−１の調製ＫＴ−ルトロウイルスバックボ ーンベクターは、優性選択可能標識遺伝子ｎｅｏが発現ベクター内に挿入されな い点を除いて、基本的に例４ＡにおいてにＴ−３について記述されたものと同様 に構築される。

性−ｊ レトロウィルスベクターの構築 Ａ、Ｂ型肝炎つィルスｅ−ｃレトロウィルスベクターの構築次に、ＫＴ−３レト ロウイルスベクターバツクボーンのＸｈｏ　Ｉ及びＣｌａ　１部位の中に、例２ ＡのＳＫ″″）ＩＢｅ−ｃからの７８７ｂｐのＸｈｏ　Ｉ　−Ｃｌａ　Ｉフラグ メントを連結させる。この構成体をＫＴ−ＨＢｅ−ｃと呼称する。

Ｂ、Ｂ型肝炎ウィルスコアレトロウィルスベクターの構築長さが約６００ｂｐの 例２ＢからのＰＣＲ産物をＸｈｏ　Ｉ及びＣ１ａｌ制限エンドヌクレアーゼで消 化させ、　１．５％のアガロースゲルを通して電気泳動させ、Ｇｅｎｅｃｌｅａ ｎＩｌ（Ｂｉｏｌｏｌ、　Ｖｉｓｔａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）によりゲル切 片からＤＮＡを精製する。このＸｈｏｌ　−Ｃ１ａｌ　ＨＢＶコアＰＣＲ産物を ＫＴ−３レトロウイルスベクターバツクボーンのＸｈｏ　Ｉ及びＣ１ａ　１部位 内に挿入する。構成体をＫＴ−ＨＢｃと呼称する。

ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ”　Ｕ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏ ｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）のそれぞれの部位内にＫＴ−１（Ｂｅからの ＨＢＶコアフラグメント（Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉ　）を挿入する。この構成 体を、ＫＳ’　ＩＩＨＢｃと呼称し、ＤＮＡ配列決定により確認する。

Ｃ８Ｃ型肝炎ウィルスコアレトロウィルスベクターの構築ｐｓＰ７２ノソれぞれ の部位内１：　ｐｃＲＩＩＸｈ−ＨＨＣＶ　コアから＜７）Ｘｈｏｌ−旧ｎｄｌ Ｉ［フラグメントを挿入する。この構成体をｐＳＰ７２Ｘｈ−ＨＨＣｃと呼称す る。次１：　ｐｓＰ７２Ｘｈ−ＨＨＣｃカら（７）　Ｘｈｏｌ　−Ｃ１ａｌ　７ ラグメントを切除し、ＫＴ−３バツクボーン内に挿入する。この構成体をＫＴ− ＨＣｃと呼称する。

Ｄ、Ｃ型肝炎つィルスＮＳ　３　／ＮＳ　４レトロウイルスベクターの構築ｐＣ Ｒｎ　Ｘｈ−ＨＨＣＶＮＳ３／ＮＳ４から０）　Ｘｈｏ　Ｉ　−ＨｌｎｄＩＩ［ ７ラグメントを９３Ｐ７２４７）それぞれの部位に挿入する。コノ構成体をｐｓ Ｐ７２Ｘｈ−）１１１ｃＶＮｓ３／ＮＳ４と呼称する。ｐＳＰ７２Ｘｈ−聞ＣＶ ＮＳ３／　ＮＳ４からのＸｈｏ　−１−Ｃ１ａ　Ｉフラグメントを次に切除し、 ＫＴ−３バツクボーン内に挿入する。この構成体をＫＴ−ＨＣＶＮＳ３／ＮＳ４ と呼称する。

Ｅ、Ｂ型肝炎ウィルスＸレトロウィルスベクターの構築例３ＡからのＳＫ−ＸＡ ｇ読取り枠を、それがＳＫ″″マルチクローニング部位内に存在するＸｈｏ　Ｉ 及びＣ１ａ　Ｉ部位との関係において頭から尾部への配位となるように制限酵素 分析によって配位についてチェックする。次に正しい配位をもっＳＫ−ＸＡｇか らのＸ読取り枠をＸｈｏ　Ｉ及びＣ１ａ　Ｉにより切除し、ＫＴ３バックボーン のそれぞれの部位の中に挿入する。この構成体をＫＴ−）ＩＢ−Ｘと呼称する。

Ｆ、Ｂ型肝炎つィルスＰｒｅ−３２レトロウイルスベクターの構成体ＰＣＲＵ　 Ｐｒｅ−３２からのＸｈｏ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉフラグメントを切除し、ＫＴ３バ ックボーンのそれぞれの部位に挿入する。この構成体をＫＴ−１（Ｂ−Ｐｒｅ− ５２と呼ぶ。

Ｇ、Ｂ型肝炎ウィルスポリメラーゼレトロウィルスベクターの構築ｐＣＲ旧ＩＢ −ｐｏｌからのＸｈｏ　Ｉ　−Ｃｌａ　Ｉフラグメントを切除しＫＴ３／＜ツク ボーンのそれぞれの部位内に挿入する。この構成体をＫＴ−ＨＢ−ｐａｌと呼称 する。

１］、Ｂ型肝炎ウィルス０ＲＦ５レトロウィルスベクターの構築ｐＣＲｎ　１（ Ｂ−ＯＲＦ−５から（７）　Ｘｈｏｌ　−Ｃ１ａＩ　７５グメントを切除し、Ｋ Ｔ３バックボーンのそれぞれの部位の中に挿入する。この構成体をＫＴ−ＨＢ− ＯＲＦ５と呼称する。

１、Ｂ型肝炎ウィルス０ＲＦ６レトロウイルスベクターの構築ｐＣＲＩＩ　ＪＩ Ｂ−ＯＲＦ−６からのＸｈｏ　Ｉ　−Ｃｌａ　Ｉフラグメントを切除し、にＴ３ バックボーンのそれぞれの部位の中に挿入する。この構成体をＫＴ−ＪＩＢ−Ｏ ＲＦ６と呼称する。

汽−五 多価レトロウィルスベクターの構築 Ａ、Ｂ型肝炎ｅ／ＧＭ−Ｃ５Ｆレトロウイルスベクターの構築ｉ、ＩＲＢＳを伴 う多価レトロウィルスベクターｐＧＥＭ５Ｚ”旧Ｐ５’　（Ｐｅｔｅｒ　Ｓａｒ ｎｏｗ、コロラド大学保健科学センター、Ｄｅｎｖｅｒ、ヒト免疫グロブリン重 鎮結合タンノ（り質）をＳａｃ　Ｉ及びｓｐｈ　Ｉで消化させる、２５０ｂｐの ＨＩＰフラグメントを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離し、ｐＳＰ ７２のそれぞれの部位の中へサブクローニングする。このベクター構成体をｐｓ Ｐ７２ＢＩＰと呼ぶ。

旧ｎｄｌ［Ｉ　−Ｘｈｏ　ｒ　ＧＭ−Ｃ３Ｆ７ラグメントをｐｃＲｎ　Ｈ−Ｘｈ ＧＭ−ＣｓＦから切除し、ｐｓＰ７２ＢＩＰの旧ｎｄＩ［ｌ　−Ｘｈｏ１部位内 にサブクローニングする。この構成体をｐＳＰ７２Ｂ　ＩＰ−ＧＩＪ−Ｃ３Ｆと 呼称する。

構成体ｐｓＰ７２Ｂ　ＩＰＧＭ−Ｃ３ＦをＸｈｏ　１部位で分割させ、フレノウ フラグメントにより平滑化し、ひきつづきＣ１ａ　Ｉでの分割を行なう。ＫＴ− １バツクボーンをＣ１ａ　Ｉにより分割させ、フレノウフラグメントで゛　平滑 化し、ひきつづきＸｈｏ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼで分割を行なう。３部分連 結において、ＳＫ”　ＨＢｅ−ｃからのＸｈｏ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉフラグメント （例２Ａ）及びＣｌａ　Ｉ平滑化を受けたＸｈｏ　Ｉ　ＢＩＰ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ７ ラグメントをＫＴ−ルトロウイルスバックボーンのＸｈｏ　Ｉ平滑化を受けたＣ １ａ　Ｉ部位の中に連結させる。この構成体をＫＴ−ＨＢｅ−ｃ／　Ｂ　ＩＰ− ＧＭ−Ｃ３Ｆと呼称する。

ｉｉ、ＣＭＶプロモータを伴う多価レトロウィルスベクターｐＡＦ／　ＣＭＶ／ 　Ｅｎｖ’　（米国特許出願Ｎｏ、　０７／　３９５．９３２）から４．７ｋｂ のＣＭＶＥｎｖＲＰｓｔ−Ｒ１フラグメントを分離し、ｐＵｃ１８のＰｓＬＩ及 びＥｃｏＲ１部位の中に挿入する。この構成体をＩ）ＵＣ１８ＣＭＶＥｎｖ”と 呼称する。

ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｉｌＫｓ”　／Ｃ八へを生成するためｐＡＦ／　ＣＭＶ ／　Ｅｎｖ’からｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｉ［ＫＳ″’　（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）のＢａｍＦＩ　１部位内へ ５ａｕ３Ａフラグメントとして旧Ｖ−１１［１，ＣＡＲをサブクローニングする 。ＳＫ”　ｇａｇ／　ｐｏｌｓＤデルタ（米国特許出願Ｎｏ、０７／　３９５． ９３２）からＸｈｏ　Ｉ　Ｘｂａ　Ｉ　ＨＩＶ−１ｍ　ｍ　ｇａｇ／　ｐｏｌフ ラグメントを切除する。

ＣＭＶプロモータを含むプラスミドバックボーンを、Ｘｈｏ　Ｉ及びＣ１ａｌを 用いてｐＵｃ１８ｃＭＶ／　Ｅｎｖ’から切除する。３部分連結において、Ｘｈ ｏ　Ｉ　Ｘｂａ　Ｉ　ＨＩＭ　ＩＩＩ　ｅ　ｇａｇ−ｐｏ＋フラグメント及びＸ ｂａＩ　−Ｃ１ａＩＣＡＲフラグメントをｐｌＪｃ１８ｃＭＶ／　ＥｎｖＲバッ クボーンのＸｈｏ　Ｉ　−Ｃ１ａ　１部位内に挿入してｐＵｃ１８ｃＭＶｇａｇ ／ｐｏｌ　／ＣＡＲを生成する。

ｐＵｃ１８ｃＭＶ−ｇａｇ／ｐｏｔ　／ＣＡＲからのＣＭＶＩＥプロモータを含 む旧ｎｄｎｌ〜Ｘｈｏ　ＩフラグメントをｐＣＤＮＡ　ＩＩのそれぞれの部位の 中にサブクロ−ニングする。この構成体をｐＣＤＮＡ　ＩＩ　ＣＭＶと呼称する 。

Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ　ＧＭ−Ｃ３ＦＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ　Ｘｈ−Ｘｂ Ｇ）Ｊ−Ｃ３ＦからサブクローニングしｐＣＤＮＡ　ＩＩ−ＣＭＶ内のそれぞれ の部位内に挿入する。この構成体をｐＣＤＮＡ　ＩＩ　ＣＭＶ−ＧＭ−Ｃ３Ｆと 呼称する。

ｐＣＤＮＡ　ＩＩ　ＣＭＶＧＭ−Ｃ３Ｆ構成体をＸｂａ　Ｉ部位テ分割すセ、フ レノウフラグメントにより平滑化させ、ひきつづき旧ｎｄｎｌでの分割を行なう 。

ＫＴ−１バツクボーンをＣ１ａ　Ｔにより分割させ、フレノウフラグメントで平 滑化し、その後、Ｘｈｏ　Ｉでの分割を行なう。３部分連結においては、ＳＫ” 　ＨＢｅ−ｃからのＸｈｏ　ｌ−Ｈｌｎｄｌｌ［フラグメント（例２Ａ）及び旧 ｎｄｌＩ［で平滑化されたＸｂａ　Ｉ　ＣＭＶ−ＧＭ−Ｃ３Ｆフラグメントを、 ＫＴ−■レトロウィルスバックボーンのＸｈｏ　Ｉで平滑化されたＣｌａＩ部位 に連結させる。このベクター構成体をＫＴ−ＨＢｅ−ｃ／　ＣＭＶ−ＧＭ−Ｃ３ Ｆと呼称する。

Ｂ、Ｃ型肝炎コア／ＩＬ−２レトロウイルスベクターの構築ｉ、１ＲＢｓを伴う 多価レトロウィルスベクターｐＣＲＩＩ　Ｈ−Ｘｈ　ＩＬ−２から旧ｎｄｎｌ　 −Ｘｈｏｌ　ＩＬ−２配列を切除し、ｐｓＰ７２ＢＩＰの旧ｎｄＩ［［−Ｘｈｏ Ｉ部位へとサブクローニングする。この構成体をｐＳＰ７２Ｂ　ＩＰ　ＩＬ−２ と呼称する。Ｘｈｏ　Ｉ　−ＨｌｎｄＩ［［Ｃ型肝炎ウィルスコア配列（例２　 Ｃ）　ヲｐｃＲＩＩＸｈ−ＨＨＣＶＣコアカラ切除Ｌ、ｐＳＰ７２（７）　ソｔ Ｌ　ソｉｔの部位へとサブクローニングする。この構成体をｐＳＰ７２Ｘｈ−Ｈ ＨＣＶコアと呼称する。

構成体ｐｓＰ７２ＢＩＰ−ＩＬ２をＸｈｏ　１部位で分割し、フレノウフラグメ ントにより平滑化し、その後ＥＣＯＲＩでの分割を行なう。ＸｈｏＩ　−Ｅｃｏ ＲＩ　ｔｌｃＶコアフラグメントをｐＳＰ７２Ｘｈ−聞Ｃｖコアから分離させる 。

ＫＴ−１バツクボーンをＣ１ａｌにより分割し、フレノウフラグメントで平滑化 し、その後Ｘｈｏ　Ｉでの分割を行なう。３部分連結では、Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｅｃ ｏＲＩ　ＨＣＶＣ３ＦフラグメントＥｃｏＲＩ−平滑化されたＸｈｏ　Ｉ　ＢＩ Ｐ−ＩＬ−２フラグメントをＫＴ−ルトロウィルスバックポーンのＸｈｏ　Ｉ− 平滑化されたＣｌａＩ部位内に連結させる。このベクター構成体をＫＴ−ＨＣＶ コア／ＢＩＰ−ＩＬ２と呼称する。

ｉｉ、ＣＭＶプロモータを伴う多価レトロウィルスベクターｐＣＲｎ　Ｘｈ−Ａ 　ＩＬ−２からＸｈｏｌ　−Ａｐａｌ　ＩＬ−２７ラグメントを切除し、ｐＣＤ ＮＡ　ＩＩ−ＣＭＶプロモータのそれぞれの部位へとサブクローニングする。コ ノ構成体をｐｃＤＮＡＩＩ　ＣＭＶ−ＩＬ−２と呼称する。

ＫＴ−１バツクボーンをＣ１ａ　Ｉにより分割させフレノウフラグメントで平滑 化し、その後Ｘｈｏ　Ｉでの分割を行なう。構成体ｐＣＤＮＡ　ＩＩ　ＣＭＶ− ＩＬ−２をＡｐａ　１部位で分割し、フレノウフラグメントで平滑化し、その復 旧ｎｄｎ［制限エンドヌクレアーゼでの分割を行なう。３部分連結においてハ、 ｐＣＲＩＩ　Ｘｈ−ＨＨＣＶ　コアがら０）　ＸｈｏＩ　−ＨｌｎｄＩ［［ＨＣ Ｖ　Ｄ７７ラグメント及び旧ｎｄＩＩＩ−平滑化されたＡｐａ　Ｉ　ＣＭＶＩＬ −２７ラグメントをＫＴ−ルトロウィルスバックポーンのＸｈｏ　Ｉ平滑化され たＣｌａｌ部位内に連結させる。このベクター構成体をＫＴ−ＨＣＶコア／ＣＭ ＶＩＬ−２と呼称する。

Ｃ，Ｂ肝炎コア／Ｂ７／ＢＢＩレトロウィルスベクターの構築ｉ、ＩＲＢＳを伴 う多価レトロウィルスベクターｐＣＲＩＩ　Ｈ−ＸｈＢ７／　ＢＢＩから旧ｎｄ Ｉ［Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ　Ｂ７／　ＢＢＩ配列を切除し、ｐｓＰ７２ＢＩＰの旧ｎ ｄＩＩ［−ＸｈｏＩ部位へとサブクローニングする。この構成体をｐｓＰ７２１ （−ＸｈＢＩＰ−８７／ＢＢＩと呼称する。

構成体１）ＳＰ７２Ｈ−ＸｈＢＩＰ−８７／ＢＢＩをＸｈｏ　１部位で分割させ 、フレノウフラグメントにより平滑化し、その後Ｃ１ａＩでの分割を行なう。

例５　Ｂ（７）ＫＳＩＩ”　ＨＢＶ　コアカラＸｈｏ　−Ｉ　−ＣＩａｌＨＢＶ 　＝＋７７ラクメントを分離する。ＫＴ−１バツクボーンをＣ１ａ　Ｉにより分 割させ、フレノウフラグメントで平滑化させ、その後Ｘｈｏ　Ｉでの分割を行な う。

３部分連結においては、Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉ　ＨＢＶコアフラグメント及 びＣ１ａｌで平滑化されたＸｈｏ　Ｉ　ＢＩＰ−８７／　ＢＢＩフラグメントを 、ＫＴ−ルトロウイルスバックポーンのＸｈｏ　Ｉで平滑化されたＣｌａＩ部位 内に連結させる。このベクター構成体をＫＴ−ＨＢＶコア／ＢＩＰ−ＢＴ／ＢＢ Ｉ（例８）と呼称する。

Ｎ、ＣＭＶプロモータを伴う多価レトロウィルスベクターＸｈｏ　Ｉ　−Ａｐａ 　Ｉ　Ｂ７／ＢＢＩ配列をｐＣＲＩＩ　Ｘｈ−ＡＢ７／　ＢＢＩから切除し、ｐ ＣＤＡ　Ｉｆ−ＣＭＶプロモータのそれぞれの部位へとサブクローニングする。

コノ構成体をｐＣＤＮＡ　Ｉｆ　ＣＭＶ−８７／ＢＢＩと呼称する。

ＫＴ−１バツクボーンをＣ１ａ　Ｉにより分割させ、フレノウフラグメントで平 滑化させ、その後Ｘｈｏ　Ｉでの分割を行なう。構成体ｐＣＤＮＡ　ｎＣＭＶ− Ｂ７／ＢＢＩをＡｐａ　Ｉ部位で分割させ、フレノウフラグメントにより平滑化 させ、その復旧ｎｄＩ［Ｉ制限エンドヌクレアーゼでの分割を行なう。３部分連 結では、ＫＳＩＩ＋１（ＢＹ　：＋アからのＸｈｏ　Ｉ　−ＨｌｎｄｌＩ［ＨＢ Ｖコアフラグメント及び旧ｎｄｌＩｌで平滑化されたＡｐａ　Ｉ　ＣＭＶＢ７　 ／　ＢＢＩフラグメントをＫＴ−ルートロウィルスバックボーンのＸｈｏ　Ｉで 平滑化されたＣ１ａ　Ｉ部位内に連結する。このベクター構成体をＫＴ−ＨＢＶ コア／ＣＭＶＢ７　／ＢＢＩと呼称する。

Ｄ、Ｂ型肝炎ｅ　／　Ｃ型肝炎コアレトロウィルスベクターの構築ｉ、ＩＲＢｓ を伴う多価レトロウィルスベクター例２ＣのｐＣＲＩＩ　）Ｉ−ＸｈＨＣＶコア から旧ｎｄｌＩ［−Ｘｈｏ　Ｉ　ＨＣＶＣ３ＦＰＣＲ産物ブクローニングし、ｐ ｓＰ７２−ＢＩＰ内のそれぞれの部位の中に挿入する。この構成体をｐｓＰ７２ ＢＩＰ−ＨＣｖコアと呼称する。

構成体ｐＳＰ７２Ｂ　ＩＰ−ＨＣＶコアをＸｈｏ　Ｉ部位で分割し、フレノウフ ラグメントで平滑化し、その後Ｃ１ａ　Ｉでの分割を行なう。ＫＴ−１バツクボ ーンをＣｌａ　Ｉにより分割させ、フレノウフラグメントで平滑化し、その後Ｘ ｈｏ　Ｉでの分割を行なう。３部分連結ではＳＫ”　ＨＢｅ−ｃ（例２Ａ）から のＸｈｏ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉ　ＨＢｖｅフラグメント及びＣ１ａ　Ｉで平滑化さ れたＸｈｏ　Ｉ　ＢＩＰＨＣＶコアフラグメントは、ＫＴ−ルトロウイルスバッ クポーンのＸｈｏ　Ｉで平滑化されたＣ１ａ　Ｉ部位内に連結される。このベク ター構成体をＫＴ−ＨＢＶｅ／ＢＩＰＨＣＶコアと呼称する。

ｉｉ、ＣＭＶプロモータを伴う多価レトロウィルスベクターｐＳＰ７２Ｘｈ−Ｈ ＨＣＶ＋　７　（例６Ｂｉ）から（Ｄ　ＸｈｏＩ　−ＸｂａＩ　ＨＣＶ　）７７ ラグメントをｐＣＤＮＡ　ＩＩ　ＣＭＶプラスミドのそれぞれの部位の中に挿入 する。この構成体をｐＣＤＮＡ　ｎ　ＣＭＶＨＣＶコアと呼称する。

構成体ｐＣＤＮＡ　Ｕ　ＣＭＶＨＣＶ　コアを、Ｘｂａ　１部位で分割し、フレ ノウフラグメントにより平滑化し、その復旧ｎｄＩ［［での分割を行なう。ＫＴ −１バツクボーンをＣ１ａ　Ｉにより分割させ、フレノウフラグメントで平滑化 させ、その後Ｘｈｏ　Ｉによる分割を行なう。３部分連結では、ＳＫ”　ＨＢｅ −ｃからのＸｈｏ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［［ｔｌＢＶｅ配列（例２Ａ）、−）まり旧 ｎｄｎ［−平滑化されたＸｂａ　Ｉ　ＣＭＶＨＣＶコアフラグメントは、ＫＴ− ルートロウィルスバックボーンのＸｈｏ　Ｉ−平滑化されたＣｌａＩ部位の中に 連結される。このベクター構成体をＫＴ−１（ＢＶｅ／　ＣＭＶＩＩＣＶコアと 呼称する。

例７ パッケージング細胞系統ＨＸ及びＤＡの過渡的トランスフェクション及び形質導 入 Ａ、プラスミドＤＮＡトランスフェクションダルベツコの修正イーグル培地（Ｏ ＩＪＥＭ）及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて、１日目に１０ｃｍの 組織培養皿上に５×５５の細胞の割合でＤＸ細胞（Ｗ０９２１０５２６６）を播 種する。２日目に、トランスフェクションの４時間前に５．０ｍｌの新鮮培地で 培地を交換する。合計体積４００μｍとなるまで４０．０μｌの２．５Ｍ　Ｃａ ＣＩｚ、ＩＯμｇのプラスミドＤＮＡ及び脱イオン水を混合することによって、 標準リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈を行なう。４００μｍの沈降緩衝液（５０＋ ｎＭ　ＨＥＰＥＳ　−ＮａＯＨ１ｐｌ（７，ｌ　：　０．２５ＭのＮａＣｌ及び １．５ｍＭのＮａｔＨＰ（ｉｔ−Ｎａｌ（＊Ｐ（Ｌ）になるまで、常時撹拌しな がら４００マイクロリツトルのＤＮＡ　−ＣａＣｌ　を溶液を滴下により付加す る。この混合物を１０分間室温でインキュベートする。結果として得られた細か い沈降物を細胞の培養皿に付加する。３７℃で一晩ＤＮＡ沈降物と共に細胞をイ ンキュベートする。３日目に、培地を吸収し、新鮮培地を付加する。ウィルスを 含む上清を４日目に除去し、０．４５μのフィルタに通し、ＤＡパッケージング 細胞系統のマウス線維芽細胞を感染させるのに使用するが又は−８０℃で保管す る。

Ｂ、パッケージング細胞系統の形質導入１０ｍ１　ＤＭＥＭ及びｌＯ％ＦＢＳ、 ４μｇ／＋ｎｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。

Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の中で１日目に１０ｃｍの組織培養皿あたり５Ｘ１０’の細 胞の割合でＤＡ　（Ｗ０９２１０５２６６）細胞を播種する。２日目に、収集し たばかりのウィルスを含むＤＸ培地を３．０加ｌ、　１．０加ｌ及び０．２＋ｎ ｌ、細胞に付加する。３７℃で一晩、細胞をウィルスと共にインキュベートする 。

３日目に、培地を除去し、８００μｇ／ｍｌの０４１８を伴う１加ｌのＤＭＥＭ 。

ｌＯ％ＦＢＳを平板に付加する。ベクターでのトランスフェクションを受けｎｅ ｏ選択可能標識を含む細胞だけが生き残ることになる。０４１８耐性プールを、 −週間の期間にわたり生成する。このプールを、記述どおり（例１１）発現につ いてテストする。平板から細胞を除去し細胞懸濁を計数し、ＩＯ細胞／ｍｌに至 るまで細胞懸濁液を希釈し、９６ウエルの平板の各ウェル（ｌ細胞／ウェル）に Ｏ，１ｍｌ付加することにより、細胞プールを希釈クローニングする。１４日間 ３７℃、１０％Ｃ０２で細胞をインキュベートする。２４のクローンを選択し、 ２４ウエル平板、６ウ工ル平板次に１ｏｃｎ＋平板まで拡張させ、その時点で発 現についてクローンを検定し、上清を収集して、ウィルス力価について検定する 。

ＨＴ１０８０細胞、ヒト線維芽細胞系統ＡＴＣＣＣＣＬ１２１の感染により、個 々のクローンの力価を決定する。１日目に、３．０＋ｎｌのＤＭＥＭ、　１０％ ＦＢＳ及び４μｇ／＋ｎｌのポリブレンの中で６ウエルのマイクロタイター平板 の各ウェル上に５Ｘ１０’のＨＴ１０８０細胞を平板固定する。各クローンから の上溝を１０倍に階段希釈し、１．０＋ｏｌのアリコート内でＨＴ１０８０の細 胞を感染させるのに用いる。３７℃、１０％ＣＯｔでベクターと共に細胞をイン キュベートし、２日目に新鮮なりＭＥＭ、　１０％ＹＥＳ培地で培地を交換する 。３日目に、培地を８００μｇ／ｍｌの０４１８を含む新しいＤＭＥＭ、　１０ ％ＦＢＳ培地で交換することによって、形質導入された細胞の選択を行なう。１ ４日間３７℃、１０％ｃｏ、で細胞をインキュベートし、その時点でＧ４１８耐 性コロニーを各希釈倍数にて評点してコロニー形成単位／ｍ１（ｃｆｕ／ｍｌ） として各クローンのウィルス力価を決定する。

これらの手順を用いて、１（ＢＹココアびＨＢＶｅ産生細胞系統の力価が以下の とおりであることを示すことができる：ＤＡｃｏｒｅ−１　８　Ｘ　１０″ｃｆ ｕ／＋＋＋１ＤＡｃｏｒｅ−１０１ｘｌＯ’ｃｆｕ／ｍ１ＤＡＨＢｅ４−７　３ 　ｘ　ｌＯ’ｃｆｕ／ｍ１ＤＸ上清からのＤＡ細胞の形質導入について記述され ているのと同じ要領でＤＡベクター産生細胞系統から生成されたベクターを用い て、パッケージング細胞系統ＨＸＳＷ０９２１０５２６６を形質導入する。

ｎｅｏ選択可能標識が欠如している多価ベクターでのＤＡ　（ＷＯ９２１０５２ ６６）細胞の形質導入のためには、上述のような感染手順が用いられる。しかし ながら、３日目に細胞に０４１８を付加するのではなく、上述のとおり希釈度を 制限することにより細胞をクローニングする。

以上で説明したように発現のため５ｏのクローンを拡張させ、例９に記されてい るとおりに力価が検定する。

例　８ 複製受容能あるレトロウィルスの検出 拡張したＳ”Ｌ−検定は、問題の細胞系統の上清内に複製受容能ある伝染性ウィ ルスが存在するか否かを決定する。この検定は、伝染性レトロウィルスが指示細 胞系統ＭｉＣＩ　１（ＡＴＣＣＣＣＬ６４．　ｌ）上にフォーカスを生成すると いう経験的観察に基づくものである。ＭｉＣｌ　１細胞系統は、マウス肉腫ウィ ルス（ＩＪｓｖ）での形質導入によりＭｖｌＬｕミンク細胞系統（ＡＴＣＣＣＣ Ｌ６４）から導入される。これは、ＭＳＶゲノムの存在を示す肉腫を形成する（ Ｓｌ）ものの複製受容能あるウィルスの不在を示す白血病をひき起こさない（Ｌ −）マウス肉腫プロウィルスを含む、非産生的で形質転換を受けていない復帰変 異体クローンである。複製受容能あるレトロウィルスでのＭｉＣＩ　＋細胞の感 染は、ＭＳＶゲノムを「活性化」して、フォーカス形成という結果をもたらす「 形質転換」を誘発させる。

複製受容能あるレトロウィルスの存在についてテストするべく細胞系統から上清 をとり出し０．４５μのフィルタを通して全ての細胞を除去する。１日目に、２ 加ｌのＤＭＥＭ、　１０％ＦＢＳ及びｌｚｇ／ｎ＋１のポリブレンの中で６ウエ ルの平板のウェル１つあたりｌＸｌ０’細胞（テストすべき試料１つあたりｌウ ェル）の割合でＭｖｌＬｕ細胞を播種する。別々の６ウエル平板上に正及び負の 対照について同じ要領でＭｖｌＬｕ細胞を平板固定する。細胞を一晩３７°Ｃ， １０％ＣＯ２でインキュベートさせる。２日目に１．０加ｌのテスト用上清をＭ ｖｌＬｕ細胞に付加する。１．０加ｌの培地と共に負の対照平板をインキュベー トする。正の対照は、正の対照ウェル内の細胞に付加されるＭＡウィルス（Ｍｉ ｌｌｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　５： 　４３１−４３７．１９８５）の３つの希釈液（各々　］、Ｏｍｌの培地中２０ ０フオ一カス形成単位（ｆｆｕ）　、２０ｆｆｕ及び２　ｆｒｕ）から成る。細 胞を一晩インキユベートする。３日目に、培地を吸引し、３．Ｏｎ＋１の新鮮Ｄ ＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを細胞に付加する。

細胞を集密性に至るまで成長させ、６日目と１００日目１：１０に分裂させ、複 製受容能あるレトロウィルスがあればそれを増幅させる。

１３３日目、ＭｖｌＬｕ細胞上の培地を吸引し、２．０加ｌのＤＭＥＭ及び１０ ％のＦＢＳを細胞に付加する。さらに、２．０加ｌのＤＭＥＭ、　１０％のＦＢ Ｓ及び８μｇ／ｍ＋のポリブレン内でｌウェルあたりｌＸｌ０’の細胞の割合で ＭｉＣＩ　＋細胞を播種する。１４４日目Ｍｖ　ｌ　Ｌｕ細胞からの上清をＭｉ ＣＩ　＋細胞の対応するウェルに移し、３７℃、１０％ＣＯ２で一晩インキユベ ートする。１５５日目、培地を吸引し、３．０加ｌの新鮮なりＭＢＭ及び１０％ のＦＢＳを細胞に付加する。２１１日目、細胞の単層上の（単層にはびこり付着 した状態にとどまる群がった免疫性の細胞として現われる）フォーカス形成につ いて１０倍の倍率で顕微鏡を通して細胞を検査する。

ＭｉＣｌ　＋細胞上にフォーカスが現われた場合、その供試体は複製受容能ある レトロウィルスに汚染されているものと決定される。

これらの手順を用いて、ＨＢＶコア産生細胞系統ＤＡｃｏｒｅ−１，ＤＡｃｏｒ ｅ−１０及びＨＢＶｅ産生細胞系統ＤＡ）ＩＢｅ４−７が複製受容能あるレトロ ウィルスにより汚染されていないことを示すことができる。

例　９ 多価ベクターの滴定 多価ベクターはネオマイシン遺伝子といった選択可能標識を含んでいないことか ら、ベクターを滴定するもう１つの方法が記述される。より特定的には、１０− ’ｍｌの最終希釈度になるまで１．ｏｍｌのベクター上清を５倍希釈させる。次 に各希釈液を１ミリリツトルずつ用いて、基本的に例７Ｂに記されているように ５Ｘ１０’のＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ１２１）を形質導入する 。ただし、０４１８を付加する代りに、Ｗｉｌｌｉｓ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 　２５９　：　７８４２−７８４９．１９８４）により記述されているように７ 日後に容器からＤＮＡを抽出する。Ｇｅｎ５ｅｔ　（フランス。

パリ）から得た以下のＰＣＲプライマを用いてＰＣＲによりＨＢＶｅ／　ｃｏｒ ｅを増幅させる。

ＨＢＶｅ／ｃｏｒｅのためのＰＣＲ増幅は、ａｄｗクローンのヌクレオチド配列 １８６５〜１８８９に対応するセンスプライマを用いて行なわれる。

（配列ＩＤ番号３８） ５　’　−３’　：　ＴＴＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＡＧＣＴＧＴ　ＧＣＣＴ ＴＧ　Ｇこのプライマはａｄｗクローンのアンチセンスヌクレオチド配列２４３ ０〜２４０９に対応する。

（配列ＩＤ番号３９） ５　’　−３’　：　ＴＣＴ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＣＧＧ　ＣＧＡ　ＴＴＧ　ＡＧ Ａ望ましいＰＣＲ産物の存在を確認するのに用いられるプローブ配列で、Ｂ型肝 炎ウィルスのａｄｗ株のヌクレオチド配列１９２６〜１９０７に対応する。

（配列ＩＤ番号４０） ５　’　−３’　：　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＧＧＣＡＡＣ 型肝炎コアのだめのＰＣＲ増幅は、ＨＣＶ−Ｊのヌクレオチド配列３２８〜３４ ２に対応するセンスプライマを用いて行なわれる。

（配夕１ＨＤ番号４１） ５　’　−３’　：　ＣＡＴ　ＧＡＧ　ＣＡＣＡＡＡ　ＴＣにのプライマは、Ｈ ＣＶ−Ｊクローンのアンチセンスヌクレオチド配列８９２〜９０７に対応する。

（配列ＩＤ番号４２） ５’　−３’　：ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＧＴＣＡＡＡ　ＣＡＡ　Ｇ望ましい５６４ｂ ｐのＰＣＲ産物の存在を確認するのに用いられるプローブ配列であり、ＨＣＶ− Ｊクローンのヌクレオチド配列６７４〜６９３に対応する。

（配列ＩＤ番号４３） ５　’　−３’　：　ＧＴＣＧＣＧ　ＴＡＡ　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＴＡＡ　ＧＧＣ 型肝炎ＮＳ　３　／ＮＳ　４のためのＰＣＲ増幅は、ＨＣＶ−Ｊクローンのヌク レオチド配列４８７６〜４８９６に対応するセンスプライマを用いて行なわれる 。

（配列ＩＤ番号４４） ５　’　−３’　：　ＴＣＣＴＧＴ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＡＣＧ このプライマは、ＨＣＶ−Ｊクローンのアンチセンスヌクレオチド配列６３２１ 〜６３０２に対応する。

（配列ＩＤ番号４５） ５　’　−３’　：　ＧＡＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＡＣＣＧＴ　Ｇｅ望ま れる１４２６ｂｐのＰＣＲ産物の存在を確認するために用いられるプローブ配列 であり、ＨＣＶ−Ｊクローンのヌクレオチド配列５６１８〜５６３７に対応する 。

（配列ＩＤ番号４６） ５　’　−３’　：　ＣＡＣＡＴＧ　ＴＧＧ　ＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧＰＣＲ産 物は、適当な２２Ｐ−標識づけされたプローブを用いてサザンプロット分析によ り分析される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、分子クローニング、実験室マ ニュアル、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８９）　ｏ低い方の希 釈度の全てにおいてシグナルが予想され、これは希釈度が高くなるにつれて漸進 的に減少する。シグナルが目に見える最後の希釈度は、ベクターの伝染性Ｕ／ｍ ｌを生み出す。

４５００ｍｇ／　Ｌのグルコース、５８４ｍｇ／　Ｌのし一グルタミン（Ｉｒｖ ｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　５ａｎｔａ　Ａｎａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ ）及びｌＯ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ、　Ｃａ１ａｂａｓａｓ、 　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を含むＤＭＩ！Ｍの中で、マウス線維芽細胞系統ＢＣ １０ＭＩｌ！　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＴｌＢ８５）　Ｂ　１６およびＬ−Ｍ（ＴＫ ）（ＡＴＣＣＮｏ。

ＣＣＬｌ、　３）を成長させる。

ＦＢＳ及び４μｇ／ｍｌポリブレンの中で１０ｃｍ皿内に各々ｌＸｌ０’の細胞 の割合で平板固定する。各々を、約１０’ｃｆｕ／ｍｌのベクター力価をもつ１ ．０＋ｎｌのレトロウィルスベクター１．０＋ｎｌで形質導入する。ＤＭＥＭ、 ｌＯ％ＦＢＳ及び８０（ｌｃｚ　ｇ／ｍｌ　Ｇ４１８の中で、例７Ｂに記述され ているとおりに、クローンを選択する。

ＥＬ４　（ＡＴＣＣＮｏ、ＴｌＢ５８）細胞及びＥＬ４／Ａ２／Ｋｂ細胞（Ｓｈ ｅｒｍａｎ。

Ｌ、５ｃｒｉｐｐｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉ ｆｏｒｎｉａ）は、ＤＡ産生細胞との同時培養により形質導入される。特定的に 言うと、１日目にＲＰＭ１１６４０　（ｌｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、 　５ａｎｔａ　Ａｎａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　、１０％ＦＢＳ及び４．ｃ ｚｇ／＋ｎｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ、　ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｊｓｓｏｕｒ ｉ）内でｌＸｌ０’の照射を受けた（１００００ｒａｄｓ）　ＤＡ　（約ｌＯ″ 〜１０６のベクター力価）産生細胞に対して１．０ＸＩＯ’のＥＬ４細胞又はＩ 　Ｘ　１０’　ＥＬ４　／Ａ　２　／Ｋｂを付加する。２日目に、同時培養に対 して、１．０Ｘ１０’の照射された（１００００ｒａｄ）　ＤＡ産生細胞を付加 する。５日目に、８００μｇ／ｍｌの６４１８を用いて、形質導入されたＥＬ４ 又はＥＬ４　／Ａ　４　／ＫＢ細胞の選択を開始させる。例７Ｂに記述されてい るように、プールを希釈クローニングする。

Ｇ４１８内で多価ベクターにより形質導入されたＢＣＩＯＭＥ、Ｂ１６．　Ｌ− Ｍ（ＴＫ−）、ＥＬ−４細胞はＧ４１８内で選択されない；これらを例７Ｂにあ るように希釈を制限することによりクローニングさせ、例１１Ａに記すとおり発 現について検定する。

Ｂ、ベクター構成体を用いたヒト細胞の形質導入８９５−８．　ＥＢＶ形質転換 されたマルモセット白血球（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１２）の３週間経過培養の上清 からとられた新鮮なエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）でそのＢ細胞を感染 させる（形質転換する）ことにより、各々の患者についてリンパ芽球細胞系統（ ＬＣＬ）を樹立する。ＥＢＶ形質転換から３週間後、ＨＢＬｃｏｒｅ又はｅ抗原 を発現するレトロウィルスベクターで形質導入する。ＬＣＬの形質導入は、４． ０ｍｌの培地及び４．０ｍｇ／ｍｌのポリブレンを含む６ｃ＋ｎの平板の中で１ ．　ＯＸ　１０’の照射済み（１００００ｒａｄｓ）　ＦＩＸ産生細胞と１．０ ＸｌＯ’のＬＣＬ細胞を同時培養することによって達成される。培地は、ＲＰＭ １１６４０．２０％の熱活性化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、　Ｌｏｇａｎ、 　Ｕｔａｈ）、５．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び５．　Ｏｎ＋Ｍの可欠ア ミノ酸から成る。３７℃で５％ＣＯ□で一晩同時培養した後、ＬＣＬ懸濁細胞を とり出し、ｌＸｌ０＠の細胞を、１．０×１０６の照射済み（１００００ｒａｄ ｓ）　ＨＸ産生細胞を含む新鮮な平板内でさらに６〜１８時間再時間待培養させ る。８００＋ｎｇ／ｍｌのＧ４１８を付加す柩ことにより形質導入されたＬＣＬ 細胞を選択し、クローニングして高発現クローンを得る。ジャーカットＡ２／に ’細胞（Ｌ、　Ｓｈｅｒｍａｎ。

５ｃｒｉｐｐｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏ ｒｎｉａ）を基本的にＬＣＬ細胞の形質導入について記述した通りに形質導入す る。多価ベクターにより形質導入されたＬＣＬは６４１８内で選択されない：こ れらは、例７Ｂの場合と同様に希釈を制限することによりクローニングさせ、例 １１Ａの場合と同様に発現について検定する。

例１１ 形質導入された遺伝子の発現 Ａ、ＥＬＩＳＡ ＫＴ−）ＩＢｅ又はＫＴ−ＨＢｃにより形質導入された細胞からの細胞リゼイト は、ＰＢＳで１．０ＸＩＯ’個の培養細胞を洗い、ＰＢＳ上合計６００μｍの合 計体積になるまで細胞を再懸濁し、Ｂｒａｎｓｏｎ音波処理機、３５０型（Ｆｉ ｓｈｅｒ、　Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）内で３０の 設定値で５秒間ずつ２回音波処理するか又は３回凍結融解することにより作製さ れる。

５分間１１００００ｒｐでの遠心分離によりリゼイトを清澄化する。

細胞リゼイト内のコア抗原及びブリコア抗原及び培養上清中の分泌されたｅ抗原 を、ＡｂｂｏＬｔ　ＨＢｅ、　ｒＤＮＡ　ＥＩＡキット（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｃｈｉｃａｇ ｏ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）を用いて検定する。細胞リゼイト内のプリコア抗原及 び培養上清中の分泌されたｅ抗原についてのもう１）の敏感なＥＩＡ検定を、　 Ｉｎｃｓｔａｒ　ＥＴＩＥＢキット（ｌｎｃｓｔａｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 、　Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ、　ＭＮ）を用いて実施する。Ｂｉｏｇｅｎ（スイス 、ジュネーブ）から得た組換え型Ｂ型肝炎コア及びｅ抗原の希釈液から、標準曲 線を生成する。

これらの手順を用いて、どの例の第１段階に記したように調製された形質導入さ れた細胞系統の中で約１０ｎｇ／ＩＩｌのｅ抗原が発現される（図５参照）。

Ｂ、ウェスタンプロット分析による形質導入された遺伝子の発現ＳＯＳポリアク リルアミドゲル電気泳動を用いてその分子量（ＭＷ）に従ってタンパク質を分離 する。その後タンパク質をゲルからＩＰＶＨｌｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ）　ヘと移す。ゲルから膜までタンパク質を移送するためには、Ｈｏｅｆｅｒ　 ）ＩＳＩＴＴ［！トランスファ装置（Ｈｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉ ｎ５ｔｒｕ＋ｎｅｎｔｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いる。次に、発現され たタンパク質と特異的に反応する患者の血清からのポリクローナル抗体を用いて 、膜をプローブする。オートラジオグラフィによる形質導入されたタンパク質の 視覚化を可能にするＩｔｓ　ｌ−標識づけされたタンパク質Ａを用いて、結合し た抗体を検出する。

Ｃ１免疫沈降法／ウエスタンプロツト法形質導入された細胞により発現されたブ レコア／コア及びｅ抗原の特徴づけは、免疫沈降法とそれに続くウェスタンプロ ット分析によって行なわれる。特定的には、０．５〜１．０ｍｌのＰＯ３中の細 胞リゼイト又は培養上清を、Ｇ−セファロース（Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ、　ＬＫ Ｂ、　Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に結合されたポリクローナルウサギ抗Ｂ 型肝炎コア抗原（ＤＡＫＯＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ 、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）と混合し、４℃で一晩インキユベートする。２０ｍ Ｍのトリス−）ＩＣＩ　、　ｐｌ（８，０，１００ｍＭのＮａＣＬ、１０關のＥ ［ｌＴＡ中で試料を２度洗浄し、０．５％の２−ベータ・メルカプトエタノール を伴う試料装填緩衝液の中で煮沸する。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ　（Ｍ ｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｉｎｅ）に移送し、 ＤＡＫＯポリクローナルウサギ抗Ｃ型抗炎型肝炎抗原に続（１１８１−タンパク 質入を用いてプローブする。

これらの手順を用いて、形質導入されたマウス細胞により培養上清内に１７ｋｄ のＨＢｅタンパク質が分泌され、ｐ２２．　ｐ２３中間Ｂ型肝炎ｅ産物が形質導 入済みのマウス細胞のリゼイト内に主として存在するということを示すことがで きる（図６）。

１、通交系マウス 生後６週間乃至８週間の雌のＢａ１ｂ／ｃ、　Ｃ５７Ｂ１／６及びＣ３Ｈｖウス （Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｔｓ 、　Ｉｎｄｉａｎａ）に、それぞれｌＸｌ０’個の照射済（室温で１ｏｏｏｏｒ ａｄｓ）のベクター形質導入されたＢＣＩＯＭＢ、Ｂ１６及びＬ−Ｍ（ＴＫ−） 細胞を２回腹腔内（ｉ、　ｐ、　）に注射する。７日後に動物を安楽死させ、牌 細胞（３Ｘ　１０’　／　ｍｌ）をＴ−２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｃｏ ｒｎｉｎｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）内でそのそれぞれの照射・形質導入済み細胞 （６ＸＩＯ’　／ｍｌ）と共にインビトロで培養する。

培地は、ＲＰＭ１１６４０．５％の熱失活ウシ胎児血清、１ｍＭのピルビン酸ナ トリウム、５０μｇ／ｍ＋のゲンタマイシン及び１０−’ＭのＢ２−メルカプト エタノール（Ｓｉｇｎ＋ａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から成る 。４〜７日後にエフェクタ細胞を採収し、標準クロム放出検定内で９６ウエルの マイクロタイター平板（Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ）内でさまざまなエフェクタ：標的細胞比率を用いてテストする。標的は、形 質導入された及び形質導入されていないＢＣＩＱＭＥ、Ｂ１６及びＬ−Ｍ（ＴＫ っであり、ここで形質導入を受けていない細胞系統は負の対照として用いられる 。特定的には、Ｎａ２”Ｃｒ（Ｌ−標識づけされた（Ａｍｅｒｓｈａｍ。

ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　１１１ｉｎｏｉｓ）（ｌｏｏｕｃｉ　 、　３７℃で１時間）標識細胞（ＩＸＩＯ’細胞／ウェル）を２００μｍの最終 体積にて、さまざまなエフェクタ対標識細胞比率で、エフェクタ細胞と混合させ る。インキュベーションの後、　１００μＩの培地を取り出し、Ｂｅｃｋｍａｎ ガンマ分光計（Ｂｅｃｋｍａｎ、　Ｄａｌｌａｓ、　Ｔｅｘａｓ）内で分析する 。標的プラス培地からのＣＰＭとして自然放出（ＳＲ）を決定し、標的プラスＩ ＭのＨＣＩからのＣＰＭとして最大放出（ＭＲ）を決定する。〔（エフェクタ細 緬十標的ＣＰＭ）−（ＳＲ）／（ＭＲ）−（ＳＲ））　Ｘ１ｏＯとして標的細胞 溶解百分率を計算する。標的の自然放出値は標準的にＭＲの１０％〜２０％であ る。

ｉｉ、ＨＬＡＡ２．１遺伝子導入マウスｌＸｌ０’個の照射済み（室温で１００ ００ｒａｄｓ）のベクター形質導入されたＥＬ４Ａ２／Ｋｂ細胞を、生後６〜８ 週間のＨＬＡＡ２．１遺伝子導入マウス（Ｖ、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、　Ｃｈａｒ ｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を２回腹腔内に（ｉ、　ｌ）、 　）注射する。７日後に動物を安楽死させ、牌細胞（３Ｘ１０’／ｍｌ）を、フ ラスコ（Ｔ−２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ） 内で照射済（１００００ｒａｄｓ）で形質導入を受けたジャーカットＡ２／Ｋｂ 細胞（６Ｘ　１０’　／ｍｌ）を用いてインビトロで培養する。クロム放出検定 の残りの部分は例１２Ａに記されているとおりに実施され、ここで標的は形質導 入を受けた及び受けていないＥＬ４Ａ２／　Ｋ　”及びジャーカットＡ２／に’ 細胞である。形質導入を受けていない細胞系統は負の対照として利用される。

ｉ、ヒトＣＴＬ検定 ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓ ｏｕｒｉ）勾配遠心分離により分離する。特定的には、細胞を５分間室温で３０ ０Ｏｒｐｍで遠心分離する。ＩＯ日間１０；ｌのエフェクター−標的比率にてそ の自己由来の形質導入されたＬＣＬ　（例１０Ｂ）を用いてＰＢＭＣをインビト ロで再刺激する。培地は、５％の熱失活されたウシ胎児血清、１ｍＭのピルビン 酸ナトリウム及び５０μｎ／ｍｌのゲンタマイシンの予めスクリーニングしたロ ットを伴うＲＰＭ１１６４０から成る。結果として得られた刺激されたＣＴＬエ フェクタを、標準クロム放出検定において標的として形質導入された自己由来の ＬＣＬ又はＨＬＡ照合された細胞を用いて、ＣＴＬ活性についてテストする。大 部分の患者はＥＢＶに対する免疫を宵することから、負の対照として用いられる 形質導入を受けていないＥＢＶ形質転換されたＢ細胞（ＬＣＬ）は同様に、形質 導入されたＬＣ［。

と共にＥＢＶ特異的ＣＴＬにより標的として認識されることになる。ＥＢＶ特異 的ＣＴＬが標識づけされた標的細胞を殺すことによる高いパックグラウンド細胞 障害性を減少させるためには、５０：１の比率で標識づけされた標的細胞に標識 づけされていない未形質転換ＬＣＬを付加することが必要である。

８９体液性免疫応答の検出 ＨＢＶｃｏｒｅ及びｅ抗原に特異的な体液性免疫応答をＥＬＩＳＡにより検出す る。ＥＬＩＳＡプロトコルは、９６ウエルの平板をコーティングするため、　１ ００μｇ／ウェルの組換え型ＨＢＶコア及び組換え型ＨＢＶｅ抗原（Ｂｉｏｇｅ ｎ、スイス、ジュネーブ）を利用する。その後、ＨＢＶコア又はＨＢＶｅ抗原を 発現する細胞又は直接的ベクターで免疫化されたマウスからの血清を、抗原コー ティングされたウェル内で階段希釈させ、室温で１〜２時間インキュベートする 。インキュベーションの後、同等の力価をもつウサギ抗マウスＩｇＧ１．　Ｉｇ Ｇ２ａ、　ＩｇＧ２ｂ及び１ｇＧ３の混合物をウェルに付加する。各ウェルに対 して、ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ｒＨＲＰ　Ｊ　）で接合されたヤ ギ抗ウサギ抗血清を各ウェルに付加し、室温で１〜２時間試料をインキュベート する。

インキュベーションの後、適切な基質を付加することにより、反応性を視覚化す る。ＨＢＶコア又はＨＢＶｅ抗原に対し特異的な抗体を含むウェルにおいて顕色 することになる。

これらの手順を用いて、ＨＢＶｃｏｒｅ及びｅ抗原に対する抗体を誘発できると いうことを示すことができる（図７Ａ及び７Ｂ）。

Ｃ，Ｔ細胞増殖 ＨＢＶコア又はｅ抗原を発現する直接的ベクター調製物の２回又は３回の注射の 結果得られる抗原誘発されたＴヘルパー活性をインビボで測定する。特定的には 、免疫化されたマウスからの牌細胞を、負の対照として）ＩＢＶｃｏｒｅ又はｅ 抗原を発現しない細胞を用いるか又はＨＢＶｃｏｒｅ又はｅ抗原を発現する細胞 を用いて、予め定められた比率でインビトロで再度刺激する。５％のＦＢＳ、１ ．ｏｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１０−’の２−ベータメルカプトエタノー ルを含むＲＰＭＩ１６４０培地内で３７℃、５％ＣＯ８で５日装置いた後、特異 的にＨＢＶｃｏｒｅ又はｅ抗原による刺激を受けたＴヘルパー細胞により分泌さ れるＩＬ−２活性について上清をテストする。ＩＬ−２活性は、成長のためルー ２に依存しているＣＴＬクローン、ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣＴｌ８２１４）を用 いて測定される。ＣＴＬＬ−２クローンはＩＬ−２が存在しない場合増殖しない 。ＣＴＬＬ−２細胞を、９６ウエルの平板内で上清試料の階段希釈に付加し、３ ７℃、５％ＣＯ□で３日間インキュベートする。その後、ＣＴＬＬ−２に０．５ μＣ１の３Ｈ−チミジンを付加する。ＣＴＬＬ−２細胞が増殖する場合にのみ１ Ｈ−チミジンを取り込ませる。−晩のインキュベーションの後、ＰＨＤ細胞採収 装置（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、。

Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて細胞を採収し、 Ｂｅｃｋｍａｎベータカウンタ内で計数する。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　（Ｍａｎ ｎｈｅｒｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。

１ｎｄｉａｎａ）から得た標準組換え型ルー２から生成された標準曲線から、試 料中のＩＬ−２の量を決定する。

例１３ ＨＢＶプリコア／コアの免疫原性ドメインの同定Ｔ−５ｉｔｅｓ（Ｍｅｄ　Ｉｍ ｍｕｎｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）といったコンピュータアルゴリズムを利用して Ｔ−細胞エピトープを予測することができる。この解析から、ペプチドを合成し 、ＣＴＬエピトープを同定するのにこれを使用する。形質導入された自己由来（ 例１０Ｂ）のＬＣＩ、でインビトロで刺激された急性Ｂ型肝炎感染を有する患者 からのエフェクター細胞を、ペプチドでコーティングされた自己由来のＬＣＬ上 でテストする。最終濃度１−１００μｇ／ｍｌに至るまでエフェクター細胞と共 に未形質導入のＮａｔ”Ｃｒ０ｔ標識づけされたＬＣＬに対してペプチドが付加 されるという点を除いて、例１２Ａ　ｉｉに記されている通りにクロム放出検定 を実施する。反応を４〜６時間インキュベートし、標準クロム放出検定を例１２ Ａ　ｉに記されているとおりに実施する。

例Ｉ４ 腫瘍形成性と形質転換 Ａ、腫瘍形成性検定 ヌードマウスにおける腫瘍形成は、腫瘍形成性を決定する上で特に重要かつ感度 の高い方法である。ヌードマウスは成熟Ｔ細胞を有しておらず、従って機能的細 胞免疫系に欠け、細胞の腫瘍形成潜在能をテストすべき有用なインビボモデルを 提供する。正常な非腫瘍形成性細胞は、ヌードマウスに注射された場合無制御成 長特性を示さない。しかしながら、腫瘍形成性の形質転換済み細胞は、ヌードマ ウス体内で急速に増殖し腫瘍を生成することになる。簡単に言うと、ベクター構 成体は注射によってヌードマウスに投与される。腫瘍の成長を見極めるため注射 から４〜１６週間の期間中マウスを目視する。マウスを安楽死させ、腫瘍が存在 するか否かを見極めるため剖検することもできる（Ｇｉｏｒａｎｅｌｌａ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ。

４８　：　１５３１−１５３３．１９７２　；　Ｆｕｒｅｓｚ　ｅｔ　ａｌ、、 　ｒ生物学的薬剤の生産のため考慮される細胞系統の腫瘍形成性試験Ｊ　Ａｂｎ ｏｒｍａｌ　Ｃｅ１１ｇ　（異常細胞）　、Ｎｅｗ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ 　Ｒ１５ｋ、　Ｈｏｐｐｓ　ａｎｄ　Ｐｅｔｒｉｃｃｉａｎｉ　（ｅｄｓ）。

Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ、　１９８５　：　Ｌ ｅｖｅｎｂｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｓｔｄ、　１３：　１３５−１４１．１９８５）。このテストはＱｕａｌｉｔｙ 　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、。

（Ｃａｍｄｅｍ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）により実施される。

Ｂ、形質転換検定 腫瘍形成性は形質転換特性と密に相関関係をもつことが実証されてきた。形質転 換を見極めるために利用できる１つの検定は、軟寒天内に平板固定された細胞の コロニー形成である（Ｍａｃ　Ｐｈｅｒｓｏｎ　ｅｔａｌ、　、　Ｖｉｒ、　２ ３　：　２９１〜２９４．１９６４）。簡単に言うと、正常な未形質転換細胞の １つの特性は、足場依存型成長である。正常な未形質転換細胞は半固体寒天支持 培地内にあるとき増殖を停止するが一方形質転換された細胞は軟寒天内で増殖し 続けてコロニーを形成する。

ヒトの線維肉腫から誘導され１００％のヌードマウスにおいて腫瘍をひき起こす ものとして知られている新生細胞系統であるＨＴ１０８０（ＡＴＣＣＣＣＬ１２ １）は、検定の正の対照として用いられる。ヌードマウスにおいて腫瘍形成性を もたない二倍体胚性ヒト肺細胞系であるＷｌ−３８（ＡＴＣＣＣＣＬ７５）は、 検定の負の対照として用いられる。

Ｗｌ−３８細胞系統を、例７Ｂに記されているようにベクター構成体で形質導入 する。形質導入された細胞系統）ＩＴ１０８０及びＷｌ　−３８の各々の重複試 料を寒天内で培養する。簡単に言うと、ＤＭＥＭ　１７％ＦＢＳ中の５．ＯｗＩ 　Ｏ，８％のＢａｃｔｏａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈ ｉｇａｎ）の下部層を６０龍の組織培養平板上にセットする。５Ｘ１０’細胞／ ｍｌの濃度で細胞が懸濁させられている同じ培地内の２．０ｍｌの０，３％ｎａ ｃｔｏａｇａｒをこれにオーバーレイさせる。バックグラウンド凝塊を減少させ るため、寒天溶液内で懸濁させる前に各細胞系統を７０４ｍのナイロンメツシュ を通してろ過する。１４日間、Ｃ０１５％の加湿された雰囲気中で３７℃で平板 をインキュベートする。平板固定から２４時間以内に、平板固定の時点で存在し た細胞凝塊について各細胞系統の代表的平板を検査する。１３日目に１．０ｍｌ のＩＮＴウィルス染色剤（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で平板を染色し、１４日目に、１ｍ＋＋＋の 接眼鏡網線を用いて直径１５０μｍのコロニーについてこれらを走査する。

あらゆる向きで１５０μｍに広がるコロニーのみが評点される。というのもこの サイズのコロニーが顕微鏡下で全ての平面内に容易に観察でき、形質転換されて いない細胞がこのサイズのコロニーを形成することは稀であるからである。検点 の終りで、各細胞系統についての平板（コロニー形成）効率をｂ／ａＸ１００と して計算する。

なおここでｂは全ての平板上のコロニーの和に等しく、ｅは細胞平板の合計数に 等しい。形質転換されていない細胞系統は、０．００１％以下の平板効率を有す るものである。従って、形質転換された細胞系統は０．００１％以上の平板効率 を有することになる（Ｒｉｓｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｖｉｒｏｌ、　５９：　４７ ７−４８９．１９７４）。

匹−長 投与プロトコル Ａ、マウス ＨＢＶｃｏｒｅ又はｅ抗原をコードするベクターの直接投与を用いた体液性及び 細胞媒介性の免疫応答の誘発を評価するため、マウス系を使用する。生後６週間 〜８週間の雌のＢａ１ｂ／ｃ、　Ｃ５７Ｂ１６又はＣ３Ｈマウスに、０．１ｍｌ の再構成され（無菌脱イオン精製水で）凍結乾燥されたＨＢＶｃｏｒｅ又はＨＢ Ｖｅ発現レトロウィルスベクターを筋向（ｉ、ｍ、）注射する。−週間おいて２ 回の注射を行なう。２回目の注射後、動物を安楽死させる。基本的に例１２Ａ　 ｉに記されているとおり、クロム放出ＣＴＬ検定が好まれる。

Ｂ、チンパンジーの投与プロトコル Ｂ型肝炎ウィルスに慢性的に感染しているチンパンジーにおけるベクターの投与 プロトコルを決定するため例１５Ａからのマウス系内で生成されたデータを使用 する。マウス内のＨＢＶ特異的ＣＴＬの誘発に基づき、連続的に上昇する２つの 用量グループで２８日の間隔をおいてコア又はｅ抗体をコードするベクターの３ 回の用量をチンパンジー試験の被験動物に施す。対照の被験動物は、ＨＢＶ−Ｉ Ｔ（Ｖ）製剤培地から成るブラシーボを受ける。用量は、各注射日に筋肉に０． ５ｍｌの注射５回で与えられる１０’又は１０’）ＩＢＶ−ＩＴ（Ｖ）ｃｆｕで ある。血液試料を４８目、１２日目、２４日目、３６日目、５２日目、７０日目 及び８４日目、及び６力月目、１２力月目、１８力月目、２４力月目、３０力月 目及び３６力月目に採取して、血清ＡＬＴレベル、Ｂ型肝炎ｅ抗原の存在、Ｂ型 肝炎ｅ抗原に対して向けられた抗体の存在を測定し、治療の安全性及び許容可能 性を評価する。Ｂ型肝炎ｅ抗原は、例１１Ａに記されているようなＡｂｂｏｔｔ 　ＨＢｅ　ｒＤＮＡ　ＥＩＡキットにより検出されるｏ　ＨＢｅ抗原に対する抗 体はＡｂｂｏＬｔ　ＨＢｅ　ｒＤＮＡ　ＥＩＡキットにより検出でき、Ｂ型肝炎 ｃｏｒｅ又はｅ抗原に対するＣＴＬの誘発は、例１２Ａｉｉにある通りに決定で きる。チンパンジー研究からの安定性及び効力の結果に基づいて、ヒト試験にお ける被験者に対するベクターの投与について、用量及び接種スケジュールが決定 されることになる。ここで、上述のとおり、被験者は、血清ＡＬＴレベル、Ｂ型 肝炎ｅ抗原の存在及びＢ型肝炎ｅ抗原に対して向けられた抗体の存在について監 視される。

Ｂ型肝炎コア又はｅ抗原に対するヒトＣＴＬの誘発は、例１２Ａに記したとおり に決定される。

以上の記述から、ここでは本発明の特定の実施態様について例示を目的として記 してきたものの本発明の精神及び範囲から逸脱することなくさまざまな修正を行 なうことができるということがわかるだろう。従って本発明は、添付のクレーム による以下制限を受けるものではない。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：　Ｊｏｌｌｙ、　ＤｏｕｇＬａｓ　Ｊ。

Ｃｈａｎｇ、　５ｔｅｐｈｅｎ　Ｍ、Ｗ。

Ｌｅｅ、　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｔ、Ｌ。

Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、　Ｋａｙ Ｏ’Ｄｅａ、　Ｊｏａｎｎ （ｉｉ）発明の名称：肝炎療法 （ｉｉｉ）配列数＝５６ （ｉｖ　）郵使用住所： （Ａ）宛　名：　５ｅｅｄ　ａｎｄ　Ｂｅｒｒｙ（Ｂ）通り名：　６３００　Ｃ ｏｌｕｍｂｉａ　Ｃｅｎｔｅｒ、　７０１　Ｆｉｆｔｈ　Ａｖｅｎｕｅ（Ｃ）車 名：　５ｅａｔｔｌｅ （Ｄ）州　名：　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（Ｅ）国　名：　Ｕ、　Ｓ。

（Ｆ）郵便番号：　９８１０４ （Ｖ）コンピュータ読み取り可能書式：（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディス ク（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）操作シスチムニＰＣ −ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａ ｓｅ　＃１．Ｏ、バージョン＃１．２５（ｘｌ）配列の明細：配列ＩＤ番号４： ＧＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧ　ＡＴＡＣＣＧ　２６（２）配列Ｉ Ｄ番号５についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：１９の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号５：ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ Ｇ　１９（２）配列ＩＤ番号６についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝１７の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー二直線 ’　（ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列！Ｄ番号６：ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ　 １７（２）配列ＩＤ番号７についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝１９の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号７：ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ Ｇ　１９（２）配列ＩＤ番号８についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝３４の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号８：ＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧ ＧＴ　ＧＧＣＴＴＴＧＧ萌ＣＡＴＧ　３４（２）配列ＩＤ番号９についての情報 ：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：１７の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号９：ＡＴＴＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ　 １７（２）配列ＩＤ番号ｌＯについての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝２０の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｎ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号ｌ０＝ＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧ　ＣＡＴＣＡＴ ＧＡＧＣ２０（２）配列１０番号Ｕについての情報；（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：２０の塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列１０番号ｌＩ：ＡＴＡＧＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＣ ＡＧＣ２０（２）配列ＩＤ番号１２についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝５５の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 ＣＣ’）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号１２：ＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧ　ＡＧＣＣＡＣ ＣＡＴＧ　ＡＧＣＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡ　ＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣ ５０ＡＡＡＣＧ　５５ （２）配列１０番号１３についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ−６２の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｌ）配列の明細：配列ＩＤ番号１３：ＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡ　ＧＣＴＴＣＴ ＡＴＣＡ　ＡＧＣＧＧＡＡＧＣＴ　ＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡ　ＡＡＣＡＡＧＡＣＡ Ｇ　５０ＣＡＡＡＧＣＴＡＡＧ　ＡＧ　６２ （２）配列ＩＤ番号１４についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：５５の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号１４：ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣ ＡＴＧ　ＡＧＣＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＡ　ＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣ５ ０ＡＡＡＣＧ　５５ （２）配列ＩＤ番号１５についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝６２の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （市）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列１０番号１５：ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴ　ＣＧＡＧＣＴ ＡＴＣＡ　ＡＧＡＧＧＡＡＧＣＴ　ＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡ　ＡＡＣＡＡＧＡＣＡ Ｇ　５０ＣＡＡＡＧＣＴＡＡＧ　ＡＧ　６２ （２）配列ＩＤ番号１６についての情報：（ｉ）配列特性； （Ａ）長　さ＝１９の塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号１８：（ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （市）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号１６：ＧＴＧＣＡＴＧＣＡＴ　ＧＴＴＡＧＴ ＧＣＧ　１９（２）配列ＩＤ番号１７についての情報：（ｉ）配列特性； （Ａ）長　さ＝２０の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造；一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号１７：ＣＧＴＧＧＴＧＴＡＴ　ＧＣＧＴＴＧ ＡＴＧＧ　２０（２）配列ＩＤ番号１８についての情報：（ｉ）配列特性二 （Ａ）長　さ：５９の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （２）配列ＩＤ番号２１についての情報：ＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣ ＣＡＴ　ＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧ　ＡＴＡＣＴＴＣＴＡＧ　ＧＡＣＣＧＧＣＣＧＡ 　５０ＴＡＧＴＴＴＴＧＧ　５９ （２）配列］Ｄ番号１９についての情報：（ｉ）配列特性： （ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：３５の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号２３：ＧＣＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＣ ＡＧＧ　ＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴ（２）配列１０番号２４についての情 報＝（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝３５の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー；直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉ）仮　説：無し くｖ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号２４：ＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴ　ＡＴＣＡＡＧ ＴＣＡＧ　ＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧ　ＡＴＧＣＴ（２）配列ＩＤ番号２５について の情報＝（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝５３の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー、直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号２５：ＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡ　ＧＣＴＴＧＣ ＣＡＴＧ　ＧＧＣＣＡＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＡＧＧＧ　ＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡ 　５・ＴＣＣ５ （２）配列！Ｄ番号２６についての情報：（ｉ）配列特性： ３５　（Ａ）長　さ＝５２の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号２６：ＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴ ＴＡＴ　ＡＣＡＧＧＧＣＧＴＡ　ＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴ　ＴＣＴＣＡＡＴＣＴＣ ５ＴＣ５ （２）配列ＩＤ番号２７についての情報：３５　（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝５２の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列１０番号２７：ＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡ ＴＧＧ　ＧＣＣＡＣＡＣＡＣＧ　ＧＡＧＧＣＡＧＧＧＡ　ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴ 　’Ｃ （２）配列１０番号２８についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：５２の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （迅）仮　説二無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号２８：ＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧ　ＣＣＣＣＴＧ ＴＴＡＴ　ＡＣＡＧＧＧＣＧＴＡ　ＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴ　ＴＣＴＣＡＡＴＣＴ Ｃ５０ＴＣ５２ （２）配列ＩＤ番号２９についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝７２の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号２９：ＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡ　ＧＣＴＴＧＡ ＧＧＡＴ　ＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧ　ＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＧＣＡＣ ５０ＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＧ　ＣＡ　７２（２）配列ＩＤ番 号３０についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さニア５の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （伍）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号３０：ＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧ　ＣＡＴＴＣＡ ＣＡＴＧ　ＣＴＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧ　ＧＧＣＴＧＧＧＣＧＡ 　５０ＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴ　ＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＧ　７５（２）配 列ＩＤ番号３１についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ二６１の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号３１：ＧＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧ ＣＣＣＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴ　ＧＡＡＣＣＴＧＡＧＴ　ＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧ　 ５０ＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴ　Ｇ　６１ （２）配列１０番号３２についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝９６の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー木端 （Ｄ）トポロジ一二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列１０番号３２：ＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣ ＧＧＧ　ＴＣＴＧＴＡＧＧＣＡ　ＧＧＴＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡ　 ５０ＡＣＡＴＴＴＣＴＧＡ　ＧＡＴＧＡＣＴＴＣＴ　ＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴ　Ｔ ＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴ　９６（２）配列！Ｄ番号３３についての情報 ：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：９０の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイブニｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号３３：ＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧ　ＴＡＣＡＡＧ ＣＡＧＧ　ＧＣＣＴＧＣＧＧＧＧ　ＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＧ 　５０ＧＣＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡ　ＡＧ ＣＡＧＣＡＣＴＧ　９０（２）配列ＩＤ番号３４についての情報：（ｉ）配列特 性： （Ａ）長　さ：５８の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列１０番号３４：ＧＧＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＴＴＧ ＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＴＴＣＣＧＧＧＧＴＴＧＧＡ　ＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴ　５ ０ＧＣＴＴＧＴＡＧ　５８ （２）配列ＩＤ番号３５についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：５９の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号３５：ＣＡＡＣＣＣＡＧＡＴ　ＴＡＴＣＡＣ ＣＴＴＴ　ＧＡＡＡＧＴＴＴＣＡ　ＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴ　ＧＡＡＧＧＡＣＴＴ Ｔ　５０ＣＴＧＣＴＴＧＴＣ５９ （２）配列【Ｄ番号３６についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ二６９の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号３６：ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴ　ＣＧＡＧＧＴ ＣＴＣＡ　ＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴ　ＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＧＧ 　５０ＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＴＣＣ６９（２）配列ＩＤ番号３７に ついての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：６９の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー；直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号３７：ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＴＣ ＴＣＡ　ＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴ　ＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＧＧ　 ５０ＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＴＣＣ６９（２）配列１０番号３８につ いての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝２５の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くｖ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号３８：ＴＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧ ＴＧＣＣＴＴＧＧ　２５（２）配列ＩＤ番号３９についての情報：（ｉ）配列特 性： （Ａ）長　さ：２１の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号３９：ＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴ ＧＡＧ　Ａ　２１（２）配列ＩＤ番号４０についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：２０の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号４０：ＧＧＡＡＡＧＡＡＧＴ　ＣＡＧＡＡＧ ＧＣＡＡ　２０（２）配列ＩＤ番号４１についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：１５の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号４１：ＣＡＴＧＡＧＣＡＣＡ　ＡＡＴＣＣ１ ５（２）配列ＩＤ番号４２についての情報；（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：１６の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （Ｉ）仮　説：無し くｖ）フラグメントのタイプ二Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号４２：ＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡ　ＡＡＣＡＡＧ 　１６（２）配列ＩＤ番号４３についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：２０の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線 （■）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号４３：ＧＴＣＧＣＧＴＡＡＴ　ＴＴＧＧＧＴ 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（Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （伍）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号４９：ＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴ　ＣＧＡＴＧＴ ＴＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡＡ　ＴＴＡＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＴ　 ５０ＡＧＧＧＡＡＴＡＡＣＣＣＣ６３ （２）配列１０番号５０についての情報二（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さニア９の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号５０：ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴ　ＣＧＡＧＡＣ ＣＡＴＧ　ＣＣＣＣＴＡＴＣＴＴ　ＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴ　ＣＣＧＧＡＡＡＣＴ Ａ　５０ＣＴＧＴＴＧＴＴＡＧ　ＡＣＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＣＡＧＧ　７ ９（２）配列１０番号５１についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ二〇６の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー水路 （Ｄ）トポロジー：直線 （Ｕ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号５１＝ＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴ　ＣＧＡＴＧＧ ＧＣＡＧ　ＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧ　ＧＣＧＴＴＣＡＣＧＧ　ＴＧＧＴＣＧＣＣＡ Ｔ　５０ＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡ　ＧＡＧＧＴＧ　６６（２）配列１０番号５２に ついての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さニア１の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造；一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号５２：ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴ　ＣＧＡＧＡＣ ＣＡＴＧ　ＴＣＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣ５ ０ＣＣＴＣＴＣＧＧＧＧ　ＣＣＧＣＴＴＧＧＧＡ　Ｃ７１（２）配列ＩＤ番号５ ３についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ二６４の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー水路 （Ｄ）トポロジー；直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号５３：ＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴ　ＣＧＡＴＧＧ ＴＣＧＧ　ＴＣＧＴＴＧＡＣＡＴ　ＴＧＣＴＧＧＧＡＧＴ　ＣＣＡＡＧＡＧＴＣ Ｃ５０ＴＣＴＴＡＴＧＴＡＡ　ＧＡＣＣ６４ （２）配列ＩＤ番号５４についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さニア４の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー水路 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列１０番号５４：ＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴ　ＣＧＡＧＡＣ ＣＡＴＧ　ＡＴＴＡＧＧＣＡＧＡ　ＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧ　ＴＴＧＣＡＴＧＧＴ Ｇ　５０ＣＴＧＧＴＧＣＧＣＡ　ＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡ　ＴＧＣＣ７４（２）配 列ＩＤ番号５５についての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ：６７の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー水路 （Ｄ）トポロジー：直線 （■）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くｖ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細；配列ＩＤ番号５５：ＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴ　ＣＧＡＴＧＣ ＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡ　ＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧ　ＣＴＴＡＧＣＣＡＴＡ 　５０ＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＧ　６７（２）配列ＩＤ番号５６につ いての情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長　さ＝６５５の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖構造ニー水路 （Ｄ）トポロジー二直線 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮　説：無し くＶ）フラグメントのタイプ：Ｎ末端 （ｘｉ）配列の明細：配列ＩＤ番号５６：ＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＡＡＣ ＴＴＴ　ＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧ　ＣＣＴＡＡＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＡＴ　 ５０ＧＴＣＣＣＡＣＴＧＴ　ＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧ ＧＧＴＧＧＣＴ　ＴＴＧＧＧＧＣＡＴＧ　１００ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡ ＴＡＡＡＧＡ　ＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴ　ＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴ　ＴＡＣＴＣＴＣ ＧＴＴ　１５０ＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴ　ＧＡＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＣＣＧＴＣ ＡＧ　ＡＧＡＴＣＴＣＣＴＡ　ＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴ　２００ＣＡＧＣＴＣＴＧ ＴＡ　ＴＣＧＧＧＡＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧ　ＣＴ ＣＡＣＣＴＣＡＣ２５０ＣＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣ ＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＴ　ＴＧＡＴＧＡＣＴＣＴ　３００ＡＧＣＴＡＣ 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ＧＡ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　Ｇ入へ　ＴＣＴＦｉｇｕｒｅ 　２ ＦＩＧ。５ Ｈ８ｅＡｇについてのＥＬＩＳＡ 標準：　ｒＨＢｅＡｇ（Ｄａｖｅ　Ｍｉｌｉｃｈ／バイオゲン）ＦＩＧ。６ １４．３− ＦＩＧ、７Ａ インビボ＠−Ｈｏｅ　ＢＡＬＢ／ｃ インビボｔＡ−ＨＢｅ　Ｃ５７Ｂｌ／６国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／２９ 　ＡＤＹ　９２８４−４Ｃ４８１００８３１４−４Ｃ Ｃ１２Ｎ　７１００　９２８１−４Ｂ ／／Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４８（Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：９２） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　リ−，ウィリアム　ツンーリャンアメリカ合衆国、カリフォル ニア　９２００９゜カールスパッド、カル　ポサダ　７９６１Ｉ （７２）発明者　タウンセント、カイ アメリカ合衆国、カリフォルニア　９２０２４゜エンシニタス、バーチビュー　 ドライブ（７２）発明者　オデア、ジョアン アメリカ合衆国、カリフォルニア　９２０３７゜ラジョラ、クリフリッジ　アベ ニュ８８４２

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. １．免疫応答が生成されるように、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部 分の発現を導くベクター構成体を、温血動物に対し投与することを含む、温血動 物体内のＢ型肝炎感染を治療する方法。
2. ２．（ａ）免疫応答が生成されるようにＢ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原 性部分の発現を導くベクター構成体を、温血動物に対し投与する段階、及び （ｂ）免疫調節補因子を温血動物に投与する段階；を含む、温血動物体内の肝炎 を治療する方法。
3. ３．Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分と免疫調節補因子を同時発現 するベクター構成体を混血動物に投与する段階を含む温血動物体内のＢ型肝炎感 染を治療する方法。
4. ４．前記ベクター構成体がＨＢｅＡｇを発現する、請求の範囲第１項乃至第３項 に記載の方法。
5. ５．前記ベクター構成体がＨＢｃＡｇを発現する、請求の範囲第１項乃至第３項 に記載の方法。
6. ６．前記ベクター構成体がＨＢｓＡｇを発現する、請求の範囲第１項乃至第３項 に記載の方法。
7. ７．前記ＨＢｓＡｇがＳ，ｐｒｅ−Ｓ１及びｐｒｅ−Ｓ２から成るグループの中 から選択されている、請求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．前記ベクター構成体がＨＢＶＰＯ１抗原を発現する、請求の範囲第１項乃至 第３項に記載の方法。
9. ９．前記ベクター構成体がＯＲＦ５を発現する、請求の範囲第１項乃至第３項に 記載の方法。
10. １０．前記ベクター構成体がＯＲＦ６を発現する、請求の範囲第１項乃至第３項 に記載の方法。
11. １１．前記ベクター構成体がＨＢｅＡｇ及びＨＢｃＡｇの両方の発現を導く、請 求の範囲第１項乃至第３項に記載の方法。
12. １２．前記ベクター構成体が組換え型レトロウイルスにより運ばれている、請求 の範囲第１項乃至第３項に記載の方法。
13. １３．前記ベクター構成体が、ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイル ス、カナリヤ痘ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデ ノウイルス、パルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４ ０，ＨＩＶ、麻疹及びＳｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択さ れた組換え型ウイルスにより運ばれている、請求の範囲第１項乃至第３項に記載 の方法。
14. １４．Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分及び免疫調節補因子の同時 発現を導くベクター構成体。
15. １５．請求の範囲第１４項に記載のベクター構成体を運ぶ組換え型レトロウイル ス。
16. １６．ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ボックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス 、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パルボウイ ルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０．ＨＩＶ、麻疹及びＳ ｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択される、請求の範囲第１４ 項に記載のベクター構成体を運ぶ組換え型ウイルス。
17. １７．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で請求の範囲第１５項 に記載の組換え型レトロウイルスを含む薬学組成物。
18. １８．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で請求の範囲第１６項 に記載の組換え型レトロウイルスを含む薬学組成物。
19. １９．免疫応答が生成されるように、抗原Ｘの免疫原性部分の発現を導くベクタ ー構成体を温血動物に投与する段階を含む、Ｂ型肝炎ガン腫細胞を破壊する方法 。
20. ２０．（ａ）免疫応答が生成されるように、抗原Ｘの免疫原性部分の発現を導く ベクター構成体を温血動物に投与する段階；及び（ｂ）免疫調節補因子を温血動 物に投与する段階、を含む、温血動物体内のＢ型肝炎ガン腫細胞を破壊する方法 。
21. ２１．抗原Ｘの免疫原性部分と免疫調節補因子の同時発現を導くベクター構成体 を温血動物に投与する段階を含む、Ｂ型肝炎ガン腫細胞を破壊する方法。
22. ２２．前記ベクター構成体が組換え型レトロウイルスによって運ばれる、請求の 範囲第１９項乃至２１項に記載の方法。
23. ２３．前記ベクター構成体が、ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイル ス、カナリヤ痘ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデ ノウイルス、パルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４ ０，ＨＩＶ、麻疹及びＳｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択さ れた組換え型ウイルスによって支持されている、請求の範囲第１９項乃至第２１ 項に記載の方法。
24. ２４．抗原Ｘの免疫原性部分の発現を導くベクター構成体。
25. ２５．抗原Ｘの免疫原性部分及び免疫調節補因子の両方の発現を導くベクター構 成体。
26. ２６．請求の範囲第２４項又は２５項に記載のベクター構成体を運ぶ組換え型レ トロウイルス。
27. ２７．ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス 、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、バルボウイ ルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０，ＨＩＶ、麻疹及びＳ ｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択された、請求の範囲第２４ 項又は第２５項に記載のベクター構成体を運ぶ組換え型ウイルス。
28. ２８．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で請求の範囲第２６項 に記載の組換え型レトロウイルスを含む、薬学組成物。
29. ２９．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で請求の範囲第２７項 に記載の組換え型ウイルスを含む、薬学組成物。
30. ３０．免疫応答が生成されるように、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性 部分の発現を導くベクター構成体を温血動物に対し投与する段階を含む、混血動 物体内のＣ型肝炎感染を治療する方法。
31. ３１．（ａ）免疫応答が生成されるように、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免 疫原性部分の発現を導くベクター構成体を、温血動物に投与する段階；及び （ｂ）免疫調節補因子を温血動物に投与する段階、を含む、Ｃ型肝炎感染を治療 する方法。
32. ３２．Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分と免疫調節補因子の同時発 現を導くベクター構成体を温血動物に投与する段階を含む温血動物体内のＣ型肝 炎感染を治療する方法。
33. ３３．前記ベクター構成体がコア抗原Ｃを発現する、請求の範囲第３０項乃至第 ３３項に記載の方法。
34. ３４．前記ベクター構成体が抗原Ｅ２／ＮＳ１を発現する、請求の範囲第３０項 乃至第３３項に記載の方法。
35. ３５．前記ベクター構成体が抗原ＮＳ２を発現する、請求の範囲第３０項乃至第 ３３項に記載の方法。
36. ３６．前記ベクター構成体が抗原ＮＳ３を発現する、請求の範囲第３０項乃至第 ３３項に記載の方法。
37. ３７．前記ベクター構成体が抗原ＮＳ４を発現する、請求の範囲第３０項乃至第 ３３項に記載の方法。
38. ３８．前記ベクター構成体が抗原ＮＳ５を発現する、請求の範囲第３０項乃至第 ３３項に記載の方法。
39. ３９．前記ベクター構成体が組換え型レトロウイルスにより運ばれる、請求の範 囲第３０項乃至第３３項に記載の方法。
40. ４０．前足ベクター構成体が、ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイル ス、カナリヤ痘ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデ ノウイルス、パルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４ ０，ＨＩＶ、麻疹及びＳｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択さ れた組換え型ウイルスにより運ばれている、請求の範囲第３０項乃至第３３項に 記載の方法。
41. ４１．Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導くベクター構成 体。
42. ４２．Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分と免疫調節補因子の同時発 現を導くベクター構成体。
43. ４３．Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分とＣ型肝炎抗原の少なくと も１つの免疫原性部分の同時発現を導くベクター構成体。
44. ４４．請求の範囲第４１項、４２項又は４３項に記載のベクター構成体を運ぶ組 換え型レトロウイルス。
45. ４５．ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス 、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パルボウイ ルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０，ＨＩＶ、麻疹及びＳ ｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択された、請求の範囲第４１ 項、４２項又は４３項に記載ベクター構成体を運ぶ組換え型ウイルス。
46. ４６．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で請求の範囲第４４項 に記載の組換え型レトロウイルスを含む薬学化合物。
47. ４７．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で請求の範囲第４５項 に記載の組換え型レトロウイルスを含む薬学化合物。
48. ４８．免疫応答が生成されるように、ポリタンパク質抗原の免疫原性部分の発現 を導くベクター構成体を温血動物に投与する段階を含む、温血動物体内のＣ型肝 炎ガン腫細胞を破壊する方法。
49. ４９．（ａ）免疫応答が生成されるように、ポリタンパク質抗原の免疫原性部分 の発現を導くベクター構成体を温血動物に投与する段階；及び （ｂ）温血動物に免疫調節補因子を投与する段階、を含む、温血動物体内のＣ型 肝炎ガン腫細胞を破壊する方法。
50. ５０．ポリタンパク質抗原の免疫原性部分と免疫調節補因子を同時発現するベク ター構成体を投与する段階を含む、Ｃ型肝炎ガン腫細胞を破壊する方法。
51. ５１．前記ベクター構成体が組換え型レトロウイルスにより運ばれている、請求 の範囲第４８項乃至第５０項に記載の方法。
52. ５２．ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス 、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス及 びＳｉｎｄｂｉＳウイルスから成るグループの中から選択される組換え型ウイル スにより前記ベクター構成体が運ばれる、請求の範囲第４８項乃至第５０項に記 載の方法。
53. ５３．ポリタンパク質抗原の免疫原性部分の発現を導くぺクター構成体。
54. ５４．ポリタンパク質抗原の免疫原性部分及び免疫調節補因子の両方の発現を導 くベクター構成体。
55. ５５．請求の範囲第５２項又は５３項に記載のベクター構成体を運ぶ組換え型レ トロウイルス。
56. ５６．ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス 、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パルボウイ ルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０，ＨＩＶ、麻疹及びＳ ｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選ばれた、請求の範囲第５３項 又は第５４項に記載のベクター構成体を運ぶ組換え型ウイルス。
57. ５７．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で請求の範囲第５５項 に記載の組換え型レトロウイルスを含む薬学化合物。
58. ５８．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で請求の範囲第５６項 に記載の組換え型ウイルスを含む薬学化合物。