JP2003055265A - 肝炎療剤 - Google Patents

肝炎療剤

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JP2003055265A JP2002229247A JP2002229247A JP2003055265A JP 2003055265 A JP2003055265 A JP 2003055265A JP 2002229247 A JP2002229247 A JP 2002229247A JP 2002229247 A JP2002229247 A JP 2002229247A JP 2003055265 A JP2003055265 A JP 2003055265A
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Stephen M W Chang
エム．ダブリュ．チャン スティーブン
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ツン−リャン リー ウィリアム
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タウンセンド カイ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫応答が生成されるように、Ｂ型肝炎抗原
の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導くベクター
構成体を投与する段階を含むＢ型肝炎感染を治療する方
法を提供する。同様に提供されているのは、Ｃ型肝炎な
らびに肝細胞ガン腫を治療するための方法である。 【課題】Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分
の発現を導くベクター構成体を含有する組成物であっ
て、免疫応答が生成されるように、該組成物を温血動物
に対して投与することを含む、温血動物体内のＢ型肝炎
感染を治療する方法に使用するための組成物を提供す
る。 【解決手段】Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性
部分の発現を導くベクター構成体を含有する組成物であ
って、免疫応答が生成されるように、該組成物を温血動
物に対して投与することを含む、温血動物体内のＢ型肝
炎感染を治療する方法に使用するための組成物。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は一般に肝炎ならびに
肝炎随伴ガン腫を治療する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】肝炎は、肝臓に対し支配的な影響を及ぼ
す全身的疾病である。この疾病は、食欲不振、悪心、お
う吐、疲労感、倦怠感、関節痛、筋肉痛及び頭痛とそれ
に続く黄だんの発症によって特徴づけられる。この疾病
は又、アミノトランスフェラーゼＡＳＴ及びＡＬＴの血
清レベルの増大によっても特徴づけられる。血中のこれ
らの酵素の数量化が、肝障害の程度を示す。 【０００３】肝炎に結びつけられてきたウイルス作用因
子には５つの一般的カテゴリが存在する。すなわち、Ａ
型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）;Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ
Ｖ）;２つのタイプの非Ａ非Ｂ型（ＮＡＮＢ）作用因
子、つまり血液伝染性のもの（Ｃ型肝炎）と腸伝達性の
もの（Ｅ型肝炎）；及びＨＢＶ随伴デルタ因子（D型肝
炎）である。 【０００４】又肝炎には急性肝炎と慢性肝炎という２つ
の一般的臨床カテゴリがある。急性肝炎の症状は、無症
候性及び非顕性のものから胎児感染にまで至る。この疾
病は、潜在的で持続性のものでもありうるし、又は、肝
硬変を伴う慢性肝臓病及び場合によっては肝細胞性ガン
腫に至るまで急激に進行する可能性もある。米国の成人
の白色人種における急性Ｂ型肝炎感染は、約５％〜１０
％の症例において慢性Ｂ型肝炎へと進行する。残りの症
例では約６５％が無症候性である。極東では感染は通常
周生期のものであり、５０％〜９０％が慢性状態にまで
進行する。進行速度の違いは、宿主の遺伝子的相違とい
うよりもむしろ感染時の年令に関連する可能性が高い。
米国では、人口の約０．２％が慢性的に感染しており、
医師、薬物常用者及び腎透析患者といったハイリスクグ
ループにおいて比較的割合が高い。台湾、ホンコン、及
びシンガポールといった国では、人口の肝炎感染レベル
は10%にまで至り得る。 【０００５】米国では、慢性肝炎を患う患者の約２０％
が肝不全で死亡し、さらに５％がＢ型肝炎随伴ガン腫を
発現させる。極東では、人口の大きな割合がＨＢＶ感染
を受け、長い慢性感染（２０〜４０年）の後、そのうち
の約２５％が肝細胞性ガン腫を発現させる。 【０００６】Ａ型及びＢ型の両方の肝炎についての血清
学的試験の開発後に、研究者達は肝炎様の症状を示しか
つ感染症と一貫性あるインキュベーション期間及び伝達
様式を伴うもののＡ型又はＢ型肝炎感染の血清学的証拠
のないその他の患者を識別した。ほぼ１５年後、原因と
なる作用因子はＲＮＡウイルスとして同定された。この
ウイルス（「Ｃ型肝炎ウイルス」と呼ばれる）はＨＢ
Ｖ、レトロウイルス又はその他の肝炎ウイルスと全く相
同性をもたない。 【０００７】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中の
輸血後及び散発性非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎の主要な原
因であると思われており、肝細胞性ガン腫を含む慢性肝
臓病の発現において主要な役割を果たしている(Ｋｕｏ
ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４:３６２−３
６４，１９８９；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ４６
（２）；４２３−４４１，１９９０）。毎年輸血を受け
る約３００万人の人々のうち約１５万人が急性Ｃ型肝炎
を発現させることになる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａ１．，
Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１（２２）；１５０
１−１５０６，１９８９）。さらに急性Ｃ型肝炎を発現
させるこれらの患者のうち約半数が慢性Ｃ型肝炎を発現
させる。 【０００８】最近まで、急性又は慢性B型肝炎又はC型肝
炎の感染の治療にとって有効であると実証された療法は
全く無く、肝炎感染患者は一般に病気を進行するがまま
にさせざるを得ない。アシクロビルといった抗ウイルス
薬剤ならびにコルチュステロイドを用いて免疫系を強化
しようとする試みの大部分は効果無しと立証された（Ａ
ｌｔｅｒ、「ウイルス性肝炎と肝臓病」、Ｚｕｃｋｅｒ
ｍａｎ（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ，ｐｐ．５３７−４２，１９８８）。いくつか
の抗ウイルス活性がアデノシンアラビノシドについて観
察された（Ｊａｃｙｎａ ｅｔ ａ１．， Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：３６８−３８２， １
９９０）が、この薬剤には毒性副作用が付随するため、
このような治療は受容不可能となっている。 【０００９】Ｂ型及びＣ型慢性肝炎感染に対しいく分か
の恩恵を提供した1つの治療は、組換え型アルファイン
ターフェロンの使用である（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａ
１．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３２１（２
２）：１５０１〜１５０６， １９８９； Ｐｅｒｒｉ
ｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．３２３／２９５〜３０１， １９９０）。しかしな
がら、B型肝炎感染を患う患者に関して、感染者のうち
わずか約３５％だけがこのような治療に対して応答し、
周生期感染者においては約１０％のみが治療に応答し
た。Ｃ型肝炎感染については、このような治療を利用し
た見かけの短期的成功にもかかわらず、治療終結から６
カ月後に、治療に応答していた患者の半数が病気を回帰
させた。さらに、アルファインターフェロン療法に伴う
もう１つの問題点は、この組成物が、敏感な患者につい
ては用量の減少を必要とさせる毒性副作用を頻繁に有し
ているということにある。 【００１０】従って細胞障害性を減少させながら肝炎又
は腫瘍誘発及びその進行に対する自然の宿主防御を増大
させるのに役立つか、或いは、インターフェロン非応答
性患者の治療を可能にする療法がきわめて有利である。
本発明はこのような治療薬を提供し、さらにその他の関
連する利点を提供する。 【００１１】 【発明が解決しようとする課題】簡単に言うと、本発明
は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染ならびに肝細胞ガン腫
（ＨＣＣ）を治療する方法に向けられている。本発明の
１態様の範囲内では、免疫応答が生成されるようにＢ型
肝炎抗原の少なくとも1つの免疫原性部分の発現を導く
ベクター構成体を温血動物に投与する段階を含む、温血
動物体内のＢ型肝炎感染を治療するための方法が提供さ
れている。本発明のその他の態様においては、免疫調節
補因子をＢ型肝炎抗原の免疫原性部分と共に投与するか
又は発現させることもできる。さまざまな実施態様にお
いて、ベクター構成体は、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｇ，Ｈ
ＢｓＡｇｓＯＲＦ５，ＯＲＦ６，ＨＢＶｐｌｏ抗原又は
これらの抗原の任意の組合せの発現を導く。１実施態様
においては、ＨＢｓＡｇｓはＳ、ｐｒｅ−Ｓ１及びｐｒ
ｅ−Ｓ２から成るグループの中から選択される。 【００１２】本発明の関連する態様においては、Ｂ型肝
炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分を免疫調節補因
子の同時発現を導くベクター構成体が提供されている。
同様に提供されるのは、薬学的に受容可能な担体又は希
釈剤と組合わせた形で組換え型ウイルスを含む薬学組成
物である。 【００１３】本発明のもう１つの実施態様においては、
免疫応答が生成されるように抗原Ｘの免疫原性部分の発
現を導くベクター構成体を温血動物に投与する段階を含
む、温血動物体内のＢ型肝炎ガン腫細胞を破壊するため
の方法が提供されている。本発明のその他の態様におい
ては、抗原Ｘの免疫原性部分と共に免疫調節補因子を投
与するか又は発現させることもできる。 【００１４】本発明のさらにもう1つの態様において
は、抗原Ｘの免疫原性部分の発現を導くか又はこの抗原
を免疫調節補因子と共に同時発現させるベクター構成体
が提供されている。同様に提供されているのは、薬学的
に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形でこれらの
組換え型ウイルスを含む薬学組成物である。 【００１５】本発明のさらにもう1つの実施態様におい
ては、免疫応答が生成されるようにＣ型肝炎抗原の少な
くとも1つの免疫原性部分の発現を導くベクター構成体
を温血動物に対して投与する段階を含む、温血動物体内
のＣ型肝炎感染を治療する方法が提供されている。その
他の態様においては、Ｃ型肝炎抗原の免疫原性部分と共
に免疫調節補因子を投与するか又は同時発現させること
も可能である。さまざまな実施態様においては、このベ
クター構成体は、コア抗原Ｃ、抗原Ｅ１、抗原Ｅ２／Ｎ
Ｓ１、抗原ＮＳ２、抗原ＮＳ３、抗原ＮＳ４、抗原ＮＳ
５、Ｓ抗原又はそれらの組合せを発現することができ
る。 【００１６】本発明の関連する実施態様においては、Ｃ
型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導
くか或いは又免疫調節補因子と組合わせた形でこの抗原
を同時発現させるベクター構成体が提供される。もう１
つの実施態様においては、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも1
つの免疫原性部分とＣ型肝炎抗原の少なくとも１つの免
疫原性部分の同時発現を導くベクター構成体が提供され
る。同様に提供されるのは、薬学的に受容可能な担体又
は希釈剤と組合わせた形で組換え型ウイルスを含む薬学
組成物である。 【００１７】本発明のもう1つの態様においては、免疫
応答が生成されるようにポリタンパク質抗原の免疫原性
部分の発現を導くベクター構成物を温血動物に投与する
段階を含む、温血動物体内のＣ型肝炎ガン腫細胞を破壊
するための方法が提供されている。本発明のその他の態
様においては、Ｃ型肝炎抗原の免疫原性部分と共に免疫
調節補因子を投与するか又は発現させることもできる。 【００１８】本発明の関連する態様においては、ポリタ
ンパク質抗原の免疫原性部分の発現を導くか又はこの抗
原を免疫調節補因子と同時発現させるベクター構成体が
提供されている。同様に提供されているのは、薬学的に
受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形でこれらの組
換え型ウイルスを含む薬学組成物である。 【００１９】本発明のさらにもう１つの態様において
は、免疫応答が生成されるようにB型肝炎抗原の少なく
とも１つの免疫原性部分とＣ型肝炎抗原の少なくとも１
つの免疫原性部分の発現を導くベクター構成体を温血動
物に投与する段階を含む、温血動物体内の慢性肝炎感染
を治療するための方法が提供されている。 【００２０】本発明のベクター構成体は、例えば組換え
型レトロウイルス、又はポリオウイルス、鼻炎ウイルス
属、ポックスウイルス(例えばカナリア痘ウイルス又は
ワクシニアウイルス)、インフルエンザウイルス、アデ
ノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイル
スＢ１９又はＭＶＮ)、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、
ＨＩＶ、麻疹及びＳｉｎｄｂｉｓウイルスやコロナウイ
ルスといったアルファウイルスから成るグループの中か
ら選ばれた組換え型ウイルスを含む、さまざまな経路で
送り出すことができる。さらにこのベクター構成体又は
関連する免疫原性部分をコードする核酸を直接、例えば
リポフェクション、直接ＤＮＡ注射、微小放物体ボンバ
ード、リポソーム、ＣａＰＯ4又はＤＮＡリガンドとい
ったトランスフェクション方法によって、患者に投与す
ることも可能である。本発明は同様に、免疫原性タンパ
ク質自体、ベクター構成体、レトロウイルスベクター又
はレトロウイルスベクターと免疫調節補因子を投与する
のに適した組成物(例えばさまざまなアジュバント)及び
方法をも提供している。 【００２１】本発明のこれらの態様及びその他の態様は
以下の詳細な説明及び添付図面を参照することにより明
らかになるだろう。 【００２２】 【課題を解決するための手段】１．免疫応答が生成され
るように、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部
分の発現を導くベクター構成体を、温血動物に対し投与
することを含む、温血動物体内のＢ型肝炎感染を治療す
る方法。 【００２３】２．（ａ）免疫応答が生成されるようにＢ
型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導
くベクター構成体を、温血動物に対し投与する段階、及
び（ｂ）免疫調節補因子を温血動物に投与する段階；を
含む、温血動物体内の肝炎を治療する方法。 【００２４】３．Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫
原性部分と免疫調節補因子を同時発現するベクター構成
体を温血動物に投与する段階を含む温血動物体内のＢ型
肝炎感染を治療する方法。 【００２５】４．前記ベクター構成体がＨＢｅＡｇを発
現する、請求の範囲第１項乃至第３項に記載の方法。 【００２６】５．前記ベクター構成体がＨＢｃＡｇを発
現する、請求の範囲第１項乃至第３項に記載の方法。 【００２７】６．前記ベクター構成体がＨＢｓＡｇを発
現する、請求の範囲第１項乃至第３項に記載の方法。 【００２８】７．前記ＨＢｓＡｇがＳ，ｐｒｅ−Ｓ１及
びｐｒｅ−Ｓ２から成るグループの中から選択されてい
る、請求の範囲第６項に記載の方法。 【００２９】８．前記ベクター構成体がＨＢＶｐｏ１抗
原を発現する、請求の範囲第１項乃至第３項に記載の方
法。 【００３０】９．前記ベクター構成体がＯＲＦ５を発現
する、請求の範囲第１項乃至第８項に記載の方法。 【００３１】１０．前記ベクター構成体がＯＲＦ６を発
現する、請求の範囲第１項乃至第３項に記載の方法。 【００３２】１１．前記ベクター構成体がＨＢｅＡ宮及
びＨＢｃＡｇの両方の発現を導く、請求の範囲第１項乃
至第３項に記載の方法。 【００３３】１２．前記ベクター構成体が組換え型レト
ロウイルスにより運ばれている、請求の範囲第１項乃至
第３項に記載の方法。 【００３４】１３．前記ベクター構成体が、ポリオウイ
ルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイルス、カナリヤ痘ウ
イルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイル
ス、アデノウイルス、パルボウイルス、アデノ随伴ウイ
ルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ＨＩＶ、麻疹及び
Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択
された組換え型ウイルスにより運ぱれている、請求の範
囲第１項乃至第３項に記載の方法。 【００３５】１４．Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免
疫原性部分及び免疫調節補因子の同時発現を導くベクタ
ー構成体。 【００３６】１５．請求の範囲第１４項に記載のベクタ
ー構成体を運ぶ組換え型レトロウイルス。 【００３７】１６．ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポ
ックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス、ワクシニアウイ
ルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パル
ボウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、
ＳＶ４０，ＨＩＶ、麻疹及びＳｉｎｄｂｉｓウイルスか
ら成るグループの中から選択される、講求の範囲第１４
項に記載のベクター構成体を運ぷ組換え型ウイルス。 【００３８】１７．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤
と組合わせた形で請求の範囲第１５項に記載の組換え型
レトロウイルスを含む薬学組成物。 【００３９】１８．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤
と組合わせた形で請求の範囲第１６項に記載の組換え型
レトロウイルスを含む薬学組成物。 【００４０】１９．免疫応答が生成されるように、抗原
Ｘの免疫原性部分の発現を導くベクター構成体を温血動
物に投与する段階を含む、Ｂ型肝炎ガン腫細胞を破壊す
る方法。 【００４１】２０．（ａ）免疫応答が生成されるよう
に、抗原Ｘの免疫原性部分の発現を導くベクター構成体
を温血動物に投与する段階；及び（ｂ）免疫調節捕因子
を温血動物に投与する段階、を含む、温血動物体内のＢ
型肝炎ガン腫細胞を破壊する方法。 【００４２】２１．抗原Ｘの免疫原性部分と免疫調節捕
因子の同時発現を導くベクター構成体を温血動物に投与
する段階を含む、Ｂ型肝炎ガン腫細胞を破壊する方法。 【００４３】２２．前記ベクター構成体が組換え型レト
ロウイルスによって運ばれる、請求の範囲第１９項乃至
２１項に記載の方法。 【００４４】２３．前記ベクター構成体が、ポリオウイ
ルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイルス、カナリヤ痘ウ
イルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイル
ス、アデノウイルス、パルボウイルス、アデノ随伴ウイ
ルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ＨＩＶ、麻疹及ぴ
Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択
された組換え型ウイルスによって支持されている、請求
の範囲第１９項乃至第２１項に記載の方法。 【００４５】２４．抗原Ｘの免疫原性部分の発現を導く
ベクター構成体。 【００４６】２５．抗原Ｘの免疫原性部分及び免疫調節
補因子の両方の発現を導くベクター構成体。 【００４７】２６．請求の範囲第２４項又は２５項に記
載のベクター構成体を運ぶ組換え型レトロウイルス。 【００４８】２７．ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポ
ックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス、ワクシニアウイ
ルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パル
ボウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、
ＳＶ４０、ＨＩＶ、麻疹及びＳｉｎｄｂｉｓウイルスか
ら成るグループの中から選択された、請求の範囲第２４
項又は第２５項に記載のベクター構成体を遅ぶ組換え型
ウイルス。 【００４９】２８．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤
と組合わせた形で請求の範囲第２６項に記載の組換え型
レトロウイルスを含む、薬学組成物。 【００５０】２９．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤
と組合わせた形で請求の範囲第２７項に記載の組換え型
ウイルスを含む、薬学組成物。 【００５１】３０．免疫応答が生成されるように、Ｃ型
肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発現を導く
ベクター構成体を温血動物に対し投与する段階を含む、
温血動物体内のＣ型肝炎感染を治療する方法。 【００５２】３１．（ａ）免疫応答が生成されるよう
に、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分の発
現を導くペクター構成体を、温血動物に投与する段階；
及ぴ（ｂ）免疫調節捕因子を温血動物に投与する段階、
を含む、Ｃ型肝炎感染を治療する方法。 【００５３】３２．Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免
疫原性部分と免疫調節補因子の同時発現を導くベクター
構成体を温血動物に投与する段階を含む温血動物体内の
Ｃ型肝炎感染を治療する方法。 【００５４】３３．前記ベクター構成体がコア抗原Ｃを
発現する、請求の範囲第３０項乃至第３３項に記載の方
法。 【００５５】３４．前記ベクター構成体が抗原Ｅ２／Ｎ
Ｓ１を発現する、請求の範囲第３０項乃至第３３項に記
載の方法。 【００５６】３５．前記ベクター構成体が抗原ＮＳ２を
発現する、請求の範囲第３０項乃至第３３項に記載の方
法。 【００５７】３６．前記ベクター構成体が抗原ＮＳ３を
発現する・請求の範囲第３０項乃至第３３項に記載の方
法。 【００５８】３７．前記ベクター構成体が抗原ＮＳ４を
発現する、請求の範囲第３０項乃至第３３項に記載の方
法。 【００５９】３８．前記ベクター構成体が抗原ＮＳ５を
発現する、請求の範囲第３０項乃至第３８項に記載の方
法。 【００６０】３９．前記ベクター構成体が組換え型レト
ロウイルスにより運ばれる、請求の範囲第３０項乃至第
３３項に記載の方法。 【００６１】４０．前記ベクター構成体が、ポリオウイ
ルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイルス、カナリヤ痘ウ
イルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイル
ス、アデノウイルス、パルボウイルス、アデノ随伴ウイ
ルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ＨＩＶ、麻疹及び
Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中から選択
された組換え型ウイルスにより運ばれている、請求の範
囲第３０項乃至第３３項に記載の方法。 【００６２】４１．Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免
疫原性部分の発現を導くベクター構成体。 【００６３】４２．Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免
疫原性部分と免疫調節捕因子の同時発現を導くベクター
構成体。 【００６４】４３．Ｂ型肝炎抗原の少なくともｉつの免
疫原性部分とＣ型肝炎抗原の少なくとも１っの免疫原性
部分の同時発現を導くベクター構成体。 【００６５】４４．講求の範囲第４１項、４２項又は４
３項に記載のベクター構成体を運ぶ組換え型レトロウイ
ルス。 【００６６】４５．ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポ
ックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス、ワクシニアウイ
ルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パル
ボウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、
ＳＶ４０，Ｈル、麻疹及びＳｍ曲ｉｓウイルスから成る
グループの中から選択された、請求の範囲第４１項、４
２項又は４３項に記載のベクター構成体を運ぶ組換え型
ウイルス。 【００６７】４６．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤
と組合わせた形で請求の範囲第４４項に記載の組換え型
レトロウイルスを含む薬学化合物。 【００６８】４７．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤
と組合わせた形で講求の範囲第４５項に記載の組換え型
レトロウイルスを含む薬学化合物。 【００６９】４８．免疫応答が生成されるように、ポリ
タンパク質抗原の免疫原性部分の発現を導くベクター構
成体を温血動物に投与する段階を含む、温血動物体内の
Ｃ型肝炎ガン腫細胞を破壊する方法。 【００７０】４９．（ａ）免疫応答が生成されるよう
に、ポリタンパク質抗原の免疫原性部分の発現を導くベ
クター構成体を温血動物に投与する段階；及ぴ（ｂ）温
血動物に免疫調節補因子を投与する段階、を含む、温血
動物体内のＣ型肝炎ガン腫細胞を破壊する方法。 【００７１】５０．ポリタンパク質抗原の免疫原性部分
と免疫調節補因子を同時発現するベクター構成体を投与
する段階を含む、Ｃ型肝炎ガン腫細胞を破壊する方法。 【００７２】５１．前記ベクター構成体が組換え型レト
ロウイルスにより運ばれている、請求の範囲第４８項乃
至第５０項に記載の方法。 【００７３】５２．ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポ
ックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス、ワクシニアウイ
ルス、アデノウイルス、パルポウイルス、ヘルペスウイ
ルス及びＳｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグループの中
から選択される組換え型ウイルスにより前記ベクター構
成体が運ばれる、請求の範囲第４８項乃至第５０項に記
載の方法。 【００７４】５３．ポリタンパク質抗原の免疫原性部分
の発現を導くベクター構成体。 【００７５】５４．ポリタンバク質抗原の免疫原性部分
及び免疫調節補因子の両方の発現を導くベクター構成
体。 【００７６】５５．請求の範囲第５２項又は５３項に記
載のベクター構成体を運ぶ組換え型レトロウイルス。 【００７７】５６．ポリオウイルス、‘炎ウイルス、ポ
ックスウイルス、カナリヤ痘ウイルス、ワクシニアウイ
ルス、インフルエンザウイルス・アデノウイルス、パル
ボウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、
ＳＶ４０、ＨＩＶ、麻疹及ぴＳｉｎｄｂｉｓウイルスか
ら成るグループの中から選ばれた、請求の範囲第５３項
又は第５４項に記載のベクター構成体を運ぶ組換え型ウ
イルス。 【００７８】５７．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤
と組合わせた形で講求の範囲第５５項に記載の組換え型
レトロウイルスを含む薬学化合物。 【００７９】５８．薬学的に受容可能な担体又は希釈剤
と組合わせた形で請求の範囲第５６項に記載の組換え型
ウイルスを含む薬学化合物。 【００８０】 【発明の実施の形態】本発明について記述する前に、以
下で用いるいくつかの用語をまず定義づけすることが本
発明を理解する上で一助となるものと思われる。以下で
引用する全ての参考文献は本書にその全文が参考として
内含される。 【００８１】本発明の中で利用されている「免疫原性部
分」という語は、適切な条件の下で、免疫応答(すなわ
ち細胞媒介又は体液性のもの)をひき起こすことのでき
るそれぞれの抗原の一部分のことを意味する。「部分」
は、可変的サイズのものであってよいが、好ましくは９
個のアミノ酸という長さをもち、抗原全体を含んでいて
もよい。免疫原性（例えば細胞媒介性免疫応答）を決定
するのに利用できる代表的検定については、以下と例１
２においてさらに詳細に記述される。細胞媒介性免疫応
答は、主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）分類Ｉ提
示、ＭＨＣ分類ＩＩ提示又はその両方を通して媒介され
うる。 【００８２】「ベクター構成体」というのは、問題の単
数又は複数の配列又は遺伝子の発現を導くことのできる
集合体のことである。ベクター構成体はプロモータ要素
を含まなくてはならず、好ましくはポリアデニル化を導
くシグナルを含む。さらにベクター構成体は、転写され
た時点で、問題の配列又は遺伝子に作動的に結合され翻
訳開始配列として作用する配列を含んでいなくてはなら
ない。好ましくは、ベクター構成体は同様にＮｅＯ、Ｓ
Ｖ2Ｎｅｏ、ＴＫ、ハイグロマイシン、フレオマイシ
ン、ヒスチジノール又はＤＨＦＲといった選択可能な標
識ならびに単数又は複数の制限部位及び翻訳終結配列も
含んでいる。さらに、ベクター構成体がレトロウイルス
内に入れられる場合、このベクター構成体は、(また存
在していないならば)使用されるレトロウイルスに該当
するパッケージングシグナル及び長末端反復（ＬＴＲ
ｓ）を含まなくてはならない。 【００８３】「免疫調節補因子」というのは、免疫応答
に関与する細胞のうちの単数又は複数のものにより製造
されたとき、又は外来的に細胞に付加されたとき、免疫
応答をこの補因子の無い状態で起こると考えられるもの
と質又は潜在能の面で異なるものとなるようにする因子
のことである。応答の質又は潜在能は、例えば細胞増殖
を測定するインビトロ検定(例えば、3Ｈチミジン摂取)
及びインビトロ細胞障害検定(例えば51Ｃｒ放出を測定
するもの)を含む、当業者にとっては既知のさまざまな
検定によって測定することができる（ｗａｒｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｈｕｍａｎ
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ７；６４５−６５５，１９
９１年を参照のこと）。免疫調節補因子は、インビボ及
び半ビボの両方で活性をもちうる。このような補因子の
代表的な例としては、インターロイキン２、4及び(なか
んづく)６、アルファインターフェロン、べータインタ
ーフェロン、ガンマインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、
Ｇ−ＣＳＦ及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦｓ）といったサイ
トカインが含まれる。その他の免疫調節補因子として
は、例えばＣＤ３、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦ
Ａ−１、ＬＦＡ−３、ＭＨＣ分類Ｉ分子、ＭＨＣ分類Ｉ
Ｉ分子、Ｂ７／ＢＢ１、β3−ミクログロブリン、チャ
ペローン又はその類似体が含まれる。上述のとおり、本
発明は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎感染ならびに肝細胞ガン
腫を治療するための方法及び組成物に向けられている。
簡単に言うと、外来性病原体を認識しこれに対し防御す
る能力は免疫系の機能の中心を成すものである。この系
は免疫認識を通して「自己」を「非自己」(外来性)と区
別することができ、このことは、宿主組織に対してでは
なくむしろ侵入する実体に向けて防御メカニズムが確実
に導かれるようにするために必須のものである。以下で
さらに詳しく説明する方法は、潜在能ある分類Ｉ制限型
保護・治療用ＣＴＬ応答ならびに体液性応答を誘発する
有効な手段を提供する。 【００８４】上述の通り、本発明の１つの態様において
は、免疫応答が生成されるように、Ｂ型肝炎抗原の少な
くとも1つの免疫原性部分の発現を導く温血動物に対し
てベクター構成体を投与する段階を含む、温血動物体内
のＢ型肝炎感染を治療するための方法が提供されてい
る。簡単に言うと、Ｂ型肝炎ゲノムは、長さ約３．２キ
ロベースの環状ＤＮＡから成り、充分に特徴づけされた
ものである（Ｔｉｏｌｌａｉｓ ｅｔ ａ１．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２１３：４０６−４１１，１９８１；Ｔｉｏ
ｌｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４
８９−４９５，１９８５；及びＧａｎｅｍ及びＶａｒｍ
ｕｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：６５１
〜６９３，１９８７）。Ｂ型肝炎ウイルスはなかんづく
３つのHB「ｓ」抗原（ＨＢｓＡｇｓ）、ＨＢｃ抗原（Ｈ
ＢｃＡｇ）、ＨＢｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）及びＨＢｘ抗原
（ＨＢｘＡｇ）を含むいくつかの異なる抗原を提示する
（Ｂｌｕｍ ｅｔ ａ１．，「Ｂ型肝炎ウイルスの分子
生物学」ＴＩＧ５（５）：１５４−１５８，１９８
９）。簡単に言うと、ＨＢｅＡｇはＰ２２プリコア中間
体のタンパク質分解分割の結果として得られ、細胞から
分泌される。ＨＢｅＡｇは１７ｋＤのタンパク質として
血清中に見い出される。ＨＢｃＡｇは１８３個のアミノ
酸のタンパク質であり、ＨＢｘＡｇは亜型に応じて１４
５〜１５４個のアミノ酸のタンパク質である。 【００８５】ＨＢｓＡｇｓ（「大型」、「中型」及び
「小型」と呼ばれる）は、Ｂ型肝炎ゲノムの3つの領域
すなわちＳ、ｐｒｅ−Ｓ２及びｐｒｅ−Ｓ１によりコー
ドされる。アミノ酸３８９個〜４００個まで変化する長
さをもつ大型タンパク質は、ｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ
１及びＳ領域によってコードされ、グリコシル化された
形及び非グリコシル化形状で発見される。中型タンパク
質は長さがアミノ酸２８１個であり、ｐｒｅ−Ｓ２及び
Ｓ領域によってコードされる。小型タンパク質は長さが
アミノ酸２２６個であり、Ｓ領域によってコードされ
る。これは２つの形状つまりグルコシル化形状（ＧＰ２
７5）及び非グリコシル化形状（Ｐ２４s）で存在する。
これらの領域の各々が別々に発現される場合、ｐｒｅ−
Ｓ１領域は約１１９個のアミノ酸のタンパク質をコード
し、ｐｒｅ−Ｓ２領域は約５５個のアミノ酸のタンパク
質をコードし、Ｓ領域は約２２６個のアミノ酸のタンパ
ク質をコードすることになる。 【００８６】当業者にとっては明白となるように、本脅
に記述されているベクター構成体の１つにより投与され
た時点で免疫応答を提示するように、上述のＳ抗原のさ
まざまな免疫原性部分を組合わせることが可能である。
さらに、ＨＢＶのＳ読取り枠について異なる幾何的領域
内に見い出される大きな免疫学的可変性を理由として、
特定の幾何的領域内での投与のためには特定の抗原組合
せが好まれる可能性がある。簡単に言うと、全てのヒト
Ｂ型肝炎ウイルスのＳ個の試料の中に見い出される実体
は決定基「α」と定義づけされる。しかしながら互いに
排他的な亜型決定基も又２次元２重免疫拡散法によって
同定された（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ，Ｐｒｏｇｒ，Ａ
ｌｌｅｒｇｙ，５：１，１９５８）。これらの決定基
は、「ｄ」又は「ｙ」及び「ｗ」又は「ｒ」と呼称され
た（ＬｅＢｏｕｖｉｅｒ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．１２３：
６７１，１９７１；Ｂａｎｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：８４２，１９７２；Ｃｏ
ｕｒｏｕｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｂｌ．Ｈａｅｍａｔ
ｏｌ．４２：１−１５８，１９７６）。免疫学的可変性
は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ読取り枠の２つの部域内の単
一のヌクレオチド置換によるものである：すなわち
（１）Ｂ型肝炎ウイルスのＳ読取り枠内のアルギニンに
対するリジン−１２２の交換はｄからｙへの亜型シフト
をひき起こし；（２）アルギニン−１６０からリジンへ
の交換は、亜型ｒからｗへのシフトをひき起こす。黒人
アフリカでは、亜型ａｙｗが支配的であり、一方米国及
び北欧では、亜型ａｄｗ2がさらに豊富である（Ｂ型肝
炎ウイルスの分子生物学、 ＭｃＬａｃｈｌａｎ（ｅ
ｄ．），ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９１）。当業者にとっ
ては明白になるように、幾何的な投与領域内で優勢な特
定なＢ型肝炎ウイルス亜型に適切な投与のためのベクタ
ーを構成することが一般に好まれる。特定の領域の亜型
は、２次元２重免疫拡散法によって、或いは又好ましく
はこの領域内で患者から分離されたＨＢＶウイルスのＳ
読取り枠を配列決定することによって決定されうる。 【００８７】ＨＢＶによって同様に提示されるのは、ｐ
ｏｌ（「ＨＢＶｐｏｌ」）、ＯＲＦ５及びＯＲＦ６抗原
である。簡単に言うと、ＨＢＶのポリメラーゼ読取り枠
は、感染を受けた肝臓内のコア様粒子及びウイルス粒子
の中に見い出される逆転写酵素活性をコードする。ホリ
メラーゼタンパク質は少なくとも２つのドメインから成
る：すなわち、アミノ末端ドメインは、逆転写をプライ
ミングするタンパク質をコードし、カルボキシル末端ド
メインは逆転写酵素及びＲＮＡｓｅＨ活性をコードす
る。ＨＢＶｐｏｌの免疫原性部分は、本書に説明する方
法（例えば以下及び例１２Ａｉｉ及び１３に説明されて
いるもの）を利用して決定することができ、以下に記述
するベクター構成体を利用して発現され、温血動物体内
で免疫応答を生成するべく投与されうる。同様にして、
ＯＲＦ５及びＯＲＦ６といったその他のＨＢＶ抗原（Ｍ
ｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
９：３２２−３２７，１９８９）は、本書に記すとおり
のベクター構成体を利用して発現されうる。ＯＲＦ５及
びＯＲＦ６を利用したベクター構成体の代表例が、以下
の例２Ｊ，２Ｋ及び５Ｈ，５Ｉの中に記述されている。 【００８８】Ｂ型肝炎ウイルスをコードする分子クロー
ニングを受けたゲノムは、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国
標準培養コレクション）（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を含むさまざまな供給源から得
ることができる。例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４５０２０
は、ｐＢＲ３２２（Ｍｏｒｉａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
８：２６０６−２６１０，１９８１）のＢａｍＨＩ部位
内に、Ｂ型肝炎の合計ゲノミックＤＮＡ（精製デーン粒
子から抽出されたもの）を含んでいる（Ｂｌｕｍ ｅｔ
ａｌ．，ＴＩＧ５（５）：１５４−１５８，１９８９
の図３参照）。（例２Ａに記述され図２に示されている
ように、補正可能な誤差はＡＴＣＣ Ｎｏ．４５０２０
の配列内に発生するということに留意されたい）。 【００８９】上述のとおり、Ｂ型肝炎抗原の少なくとも
１つの免疫原性部分は、ベクター構成体の中に内含され
ている。ベクター構成体内に内含される免疫原性部分
は、変化する長さをもつものであってよいが、その長さ
が少なくとも９個のアミノ酸であることが一般に好まし
く、抗原全体を含んでいてもよい。特定の配列の免疫原
性は往々にして予想しがたいが、潜在的なＴヘルパー部
位及びＣＴＬ部位についてのコーディング領域を走査す
るためにＴＳＩＴＥＳ（Ｍｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ，Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ）といたコンピュータアルゴリズムを用いて
Ｔ細胞エピトープを予想することが可能である。この分
析に基づきペプチドが合成され、例１３に記されている
もののようなインビトロ細胞障害検定において標的とし
て用いられる。しかしながら、例えば新たに導入された
ベクターに対する抗体の存在を検出するＥＬＩＳＡなら
びにガンマーインターフェロン検定、ＩＬ−２産生検定
及び増殖検定といったＴヘルパー細胞についてテストす
る検定を含む。その他の検定も利用することができる。
特に好ましい検定は、以下の例１２Ｂでより詳細に記述
されている。 【００９０】免疫原性部分はその他の方法によっても選
択可能である。例えば、ＨＬＣＡ２．１遺伝子導入マウ
スは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識のためのモデルと
して有用であることが立証された。簡単に言うと、イン
フルエンザ及びＢ型肝炎ウイルス系において、マウスの
Ｔ細胞レセプタレパートリ（能力範囲）は、ヒトＴ細胞
によって認識されたものと同じ抗原決定基を認識する。
両方の系において、ＨＬＡＡ２．１遺伝子導入マウス内
で生成されたＣＴＬ応答は、ＨＬＡＡ２．１ハプロタイ
プのヒトＣＴＬにより認識されたものとほぼ同じエピト
ームに向けて導かれる。（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７〜１０１
５，１９９１；Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂ型
肝炎ウイルスの分子生物学シンポジウムの摘要、１９９
２）。 【００９１】ベクター構成体の中への内含のために特に
好まれる免疫原性部分には、以下の例の中でさらに詳細
に記述されているようなＨＢｅＡｇ，ＨＢｃＡｇ及びＨ
ＢｓＡｇｓが含まれる。 【００９２】Ｂ型肝炎ウイルスの付加的な免疫原性部分
は、例えばＢｓｔＵＩ，ＳｓｐＩ，ＰｐｕＭｌ及びＭｓ
ｐＩといった部位を含むさまざまな場所でコーディング
配列を切形にすることによって得ることができる（Ｖａ
ｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８
０；８１５−１９， １９７９；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ
ｅｔ ａｌ．，動物ウイルス遺伝学：ＩＣＮ／ＵＣＬ
Ａ Ｓｙｍｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９８
０，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ及びＲ．Ｊａｅｎｉｓｃｈ
（ｅｄｓ．），ｐ５７〜７Ｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ）。適当な免疫原性部分ならびに方法を見
極めるためのさらなる方法も、以下でＣ型肝炎という条
件下で記述されている。 【００９３】上述のとおり、ベクター構成体の中に１つ
以上の免疫原性部分を内含させることもできる。例え
ば、ベクター構成体は、以下で論述するとおり、ＨＥｃ
Ａｇ，ＨＢｅＡｇ，ＨＢｓＡｇｓ，ＨＢｘＡｇならびに
ＨＣＶ抗原の免疫原性部分の全て又は一部分を（個別に
か又は１つの構成体として）発現することができる。さ
らにベクター構成体は同様に、アルファインターフェロ
ン（Ｆｉｎｔｅｒ ｅｔａｌ．，Ｄｒｕｇｓ ４２
（５）：７４９−７６５，１９９１：米国特許第４，８
９２，７４３号；米国特許第４，９６６，８４３号：Ｗ
Ｏ８５／０２８６２；Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ ２８４；３１６−３２０，１９８０；Ｆａ
ｍｉｌｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚ７８：３８７−３９４，１９８１；Ｔｗｕ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８６：２０４６−２０５０，１９８５；Ｆ
ａｋｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（発ガン
遺伝子）５：８６７−８７２，１９９０）、べータイン
ターフェロン（Ｓｅｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６５：６６４−６７１，１９９１）、ガンマインタ
ーフェロン（Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔ
ｏｌｏｇｙ（米国肝臓学学会）２００８２０１５，１９
９１；ワタナベｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８６；９４９
６−９４６０，１９８９；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ガン研
究）５０；７８２０−７８２５，１９９０；Ｍａｉｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２，１９８９；米国特許第
４，７６２，７９１号；米国特許第４，７２７，１３８
号）、Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号及
び４，８１０，６４３号）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＷＯ８５／
０４１８８）、ＴＮＦｓ（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４４：９４２−
９５１，１９９０）、インターロイキン−２（ＩＩ−
２）（Ｋａｒｕｐｉａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ １４４：２９０−２９８，１９９０；Ｗ
ｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６
６：１７１６−１７３３，１９８７；Ｇａｎｓｂａｃｈ
ｅｒ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２
１７−１２２４，１９９０；米国特許第４，７３８，９
２７号）、ＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ ５７：５０３−５１２，１９８９：Ｇｏｌｕｍ
ｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：７１
３−７１６，１９９１；米国特許第５，０１７，６９１
号）、ＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９；４１１６−４１２１，１
９８７；ＷＯ９０／０６３７０）、ＩＣＡＭ−１（Ａｌ
ｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：５１
２−５１４，１９８９）、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡＬ、Ｌ
ＦＡ−３、ＭＨＣ分類Ｉ分子、ＭＨＣ分類ＩＩ分子、β
2−ミクログロブリン、チャプロン、ＣＤ３ Ｂ７／Ｂ
Ｂ１、ＭＨＣ結合型輸送タンパク質又はその類似体、と
いった免疫調節補因子をも同時発現することができる。 【００９４】ベクター構成体内にどの免疫調節補因子を
含み入れるかの選択は、補因子の既知の治療効果に基づ
いてもよいし、或いは実験により決定されてもよい。例
えば、慢性Ｂ型肝炎感染においては、アルファインター
フェロンは、患者の免疫不全を補償しかくして病気から
の回復を補助する上で効めがあることがわかっている。
代替的には、適当な免疫調節補因子を実験により決定す
ることもできる。簡単に言うと、まず、肝臓病を患う患
者から血液試料を採取する。末梢血リンパ球（ＰＢＬ
ｓ）をインビトロで自己由来の又はＨＬＡ照合された細
胞（例えばＥＢＶ形質転換細胞）を用いて再度刺激し、
肝炎抗原の免疫原性部分及び免疫調節補因子の発現を導
くベクター構成体を用いて形質導入する。ＨＬＡ照合さ
れた形質導入細胞を標的として用いて、ＣＴＬ検定にお
いて、刺激されたＰＢＬをエフェクタとして使用する。
抗原を単独でコードするベクターで形質導入された標的
細胞及びＨＬＡ照合された刺激物質を用いて行なわれた
同じ検定において見られたものに比べてＣＴＬ応答が増
大していることは、有用な免疫調節補因子であることを
示している。 【００９５】上述の免疫調節補因子をコードする分子は
さまざまな供給源から得ることができる。例えば、これ
らの配列を含むプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ
Ｃ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）といった
保管所又はＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ）といった市販供給源から得ることができ
る。代表的な例としては、ＢＢＧ１２（１２７個のアミ
ノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子
を含む）、ＢＢＧ６（ガンマインターフェロンをコード
する配列を含む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９６５６（ＴＮ
Ｆをコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０６
６３（アルファインターフェロンをコードする配列を含
む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１９０２， ３１９０２及び
３９５１７（べータインターフェロンをコードする配列
を含む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９４０５，３９４５２，
３９５１６，３９６２６及び３９６７３（インターロイ
キン−２をコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．
５７５９２（インターロイキン−４をコードする配列を
含む）及びＡＴＣＣ６７１５３（インターロイキン−６
をコードする配列を含む）が含まれる。 【００９６】類似の要領で、免疫調節補因子をコードす
る配列を、これらの補因子をコードする配列を発現する
か又は含む細胞から容易に得ることができる。簡単に言
うと、１実施態様においては、ひきつづきＰＣＲによっ
て増幅される望ましい配列のいずれかの側でプライマー
が調製される（米国特許第４，６８３，２０２号、４，
６８３，１９５号及び４，８００，１５９号）（同様に
ＰＣＲ技術：その原理とＤＮＡ増幅に対する応用、Ｅｖ
ｌｉｃｈ（ｅｄ．），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，
１９８９も同様に参照のこと）。特に、２本鎖ＤＮＡ
は、熱安定性Ｔａｑポリメラーゼの存在下で、配列特異
的ＤＮＡプライマ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＴＴＰ
を加熱することによって変性される。２本鎖ＤＮＡは、
合成が完了した時点で産生される。このサイクルは多数
回くり返され、望ましいＤＮＡの階乗増幅という結果が
得られる。 【００９７】免疫調節補因子をコードする配列も同様
に、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉ
ｎｃ．ＤＮＡ合成機（例：ＡＢＩ ＤＮＡ合成機３９２
型（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ））上で合成することができる。このような配列は同
様に相補的末端を通して結合され、その後次いでＰＣＲ
増幅が行なわれて（Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）長い２本鎖のＤＮＡ
分子を形成する（Ｆｏｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：６７４−６７５，１９９
２）。 【００９８】免疫原性部分（単数又は複数）（そして望
ましい場合には免疫調節補因子）がひとたび選択された
ならば、これらのタンパク質をコードする遺伝子が、そ
の発現を導くベクター構成体内へ入れられる。一般に、
かかるベクターはこれらの遺伝子のみをコードし、選択
可能な標識は全くコードしない。特定の抗原及び免疫調
節補因子をコードしその発現へと導くベクターは、当業
者であれば容易に構築することができる。特に、ベクタ
ー構成体の構築ならびに直接注入によるレトロウイルス
構成体の投与については「組換え型レトロウイルス」と
いう題の出願（１９９０年９月２１日提出のＵ．Ｓ．
Ｓ．Ｎ．０７／５８６，６０３）の中でさらに詳細に記
述されている。これらのベクター構成体は、複製受容能
の無いものであるレトロウイルスベクター粒子の産生の
ための産生細胞系統を生成するべく適切なパッケージン
グ細胞系統（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／８００，９２１参
照）の中に導入することによって形質導入受容能あるレ
トロウイルスベクター粒子を生成するのに使用すること
ができる。 【００９９】何らかの複製受容能ある感染性レトロウイ
ルスの存在を検出するために、さまざまな検定を利用す
ることができる。好ましい１つの検定は、例８に記述さ
れている拡張型Ｓ+Ｌ-検定である。 【０１００】特に好ましい実施態様においては、ＳＶ４
０（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３
８：４８３，１９８４参照）、サイトメガロウイルス
（「ＣＭＶ」）（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ ４１：５２１−５３０，１９９１参照）又は内部
リボソーム結合部位（「ＩＲＢＳ」）といったプロモー
タを内含するようにベクター構成体を構築することがで
きる。簡単に言うと、ＩＲＢＳに関しては、免疫グロブ
リン重鎖結合タンパク質の最初の５つの未翻訳領域が、
２シストロンメッセージの内部的係合を支持するもので
あると立証された（Ｊａｃｅｊａｋ及びＳａｒｎｏｗ，
Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４，１９９１参照）。
この配列は小さく（３００ｂｐ）、この配列で始まるシ
ストロンをもつ多シストロンメッセージから多数の遺伝
子を発現するため、容易にレトロウイルスベクター内に
取り込まれ得る。ＩＲＢＳを利用する代表的ベクター構
成体については、以下の例６Ｃ及び６Ｄでさらに詳しく
記述する。 【０１０１】さらに、ベクター構成体は、例えばポリオ
ウイルス（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３３９；３８５−３８８，１９８９；及びＳａｂｉｎ．
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １；
１１５−１１８，１９７３）；鼻炎ウイルス（Ａｒｎｏ
ｌｄ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｌ４０１−４０
５，１９９０）ポックスウイルス例えばカナリア痘ウイ
ルス又はワクシニアウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｈｏｃｈ
ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８６：３１７−３２１，１
９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．ＡｃａｄＳｃｉ．５６９：８６−１０３，１９８
９；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｅｉｎｅ
８：１７−２１，１９９０；米国特許第４，６０３，１
１２号及び４，７６９，３３０号；ＷＯ８９／０１９７
３）；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２７７：１０８−１１４，１９７９）；イン
フルエンザウイルス（Ｌｕｙｔｊｅｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ ５９； １１０７−１１１３，１９８９；Ｍ
ｃＭｉｃｈｅａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．３０９：１３−１７，１９８３；及びＹａｐ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８−２３９，
１９７８）；アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７，１９８
８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５２；４３１−４３４，１９９１）；アデノ随伴
ウイルスなどのパルポウイルス（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２−３８２８，
１９８９；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏ
ｌ．１６６：１５４−１６５，１９８８）；ヘルペス
（Ｋｉｔ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１
５：２１９−２３６，１９８９）；ＳＶ４０；ＨＩＶ
（Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５３２
−５３６，１９９１）；麻疹（ＥＰ ０，４４０，２１
９）；Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１１８８−１１９１，
１９８９）；及びコロナウイルスを含むその他のウイル
ス担体を用いても開発され利用され得る。 【０１０２】ベクター構成体をひとたび調製したなら
ば、Ｂ型肝炎感染を処理するべく温血動物に対してこれ
を投与することができる。（レトロウイルス構成体の直
接注入などによる）レトロウイルスベクターを介してベ
クター構成体を投与する方法は、「組換え型レトロウイ
ルス」という題の出願（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ ０７／５８
６，６０３）の中でさらに詳細に記述されている。この
ような方法としては、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１９，１９８
９）、直接ＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−８１８，１９９１）；
微小放物体ボンバード（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａ
ｌ．，ＰＮＡＳ ８８：２７２６−２７３０，１９９
１）；リポソーム（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ
８４：７８５１〜７８５５，１９８７）；ＣａＰＯ4
（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ８１：７
５２９−７５３３，１９８４）；又はＤＮＡリガンド
（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
４：１６９８５−１６９８７，１９８９）などのさまざ
まな物理的方法を利用する方法によるトランスフェクシ
ョンが含まれる。さらに、ベクター構成体、又は関連す
る免疫原性部分をコードする核酸を患者に対して直接、
すなわち、例えばリポフェクション、直接ＤＮＡ注射、
微小放物体ボンバード、リポソーム、ＣａＰＯ4又はＤ
ＮＡリガンドなどのトランスフェクション方法によって
投与することができる。免疫原性タンパク質自体、ベク
ター構成体、ウイルスベクター又はウイルスベクターと
免疫原性補因子を投与するのに適した組成物及び方法に
ついては、以下で詳述する。 【０１０３】本発明のもう１つの態様においては、免疫
応答が生成されるように、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１
つの免疫原性部分の発現を導くベクター構成体を温血動
物に投与する段階を含むＣ型肝炎感染を治療するための
方法が提供されている。簡単に言うと、前述のとおり、
Ｃ型肝炎（非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎）は、輸血後に発
現する肝炎症例の９０％以上を占める一般的な病気であ
る（Ｃｈｏｏ ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：
３５９−３６２，１９８９）。ＮＡＮＢ肝炎についての
大部分の情報は、チンパンジーの伝染研究から誘導され
たものであり、これらの研究は、ＮＡＮＢ肝炎がわずか
１０2−１０3ＣＩＤ／ｍｌ（１ｍｌあたりのチンパンジ
ー感染用量）という力価で大部分のヒト感染において存
在するということを示していた。さらに、この病気は、
実験的に感染を受けたチンパンジーの肝細胞内で顕著な
膜性細管の出現をひき起こすことがわかった。この「細
管形成」作用因子を以下Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と
呼ぶ。 【０１０４】ＨＣＶのゲノミックＲＮＡは、最近、９３
７９のヌクレオチドの配列を有することが確認された
（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５，１
９９１；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．
Ｂｕｌｌ．４６（２）；４２３−４４１，１９９０；Ｏ
ｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７
２：２６９７−２７０４，１９９１；Ｇｅｎｂａｎｋ受
入れ番号Ｍ６７４６３，Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａも参照のこと）。この配列は、フラビウイルス属のタ
ンパク質に対する有意な相同性を有する３０１１個のア
ミノ酸のポリタンパク質前駆物質をコードする。ポリタ
ンパク質は、Ｃ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｅ
１，Ｅ２／ＮＳ１及び非構造タンパク質ＮＳ２，ＮＳ
３，ＮＳ４及びＮＳ５を含むいくつかの異なるタンパク
質を内含するものと信じられている（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １４：３８１
−３８８，１９９１）。 【０１０５】上述のとおり、本発明の１実施態様におい
ては、Ｃ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分が
ベクター構成体内に取り込まれている。さまざまなＣ型
肝炎ウイルスの中でも最も保存された領域であることか
らＣ及びＮＳ３−ＮＳ４領域の中に、Ｃ型肝炎の好まし
い免疫原性部分を見い出すことができる（Ｈｏｕｇｈｔ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １４：３
８１−３８８，１９９１)。特に好ましい免疫原性部分
はさまざまな方法によって決定することができる。例え
ばＢ型肝炎ウイルスについて前述したとおり、アミノ酸
配列に基づいてポリタンパク質の免疫原性部分の同定を
予測することができる。簡単に言うと、頻繁に免疫原性
の両親媒性α−ヘリックスを有するＴ細胞エピトープを
予測するのに、当業者には既知のものであるさまざまな
コンピュータプログラムを利用することができる。Ｔ細
胞エピトープは、潜在的なＴ−ヘルパー部位及びCTL部
位のためのコーディング領域を走査するべくＴＳｉｔｅ
ｓ（Ｈｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）とい
ったコンピュータアルゴリズムを利用して予測すること
ができる。この解析はまず第1に、(1)タンパク質の構造
的特性(主としてα−ヘリックスの周期性及び両親媒
性)、及び（２）ＭＨＣ分類Ｉ及び分類ＩＩの分子によ
り認識される配列内に見い出されるモチーフ、に基づい
ている。しかしながら、一般に、検定において免疫原性
を決定することが好まれる。代表的検定としては、例１
２Ｂの新たに導入されたベクターに対する抗体の存在を
検出するＥＬＩＳＡ、ならびに例１２Ｃに記されている
ようなガンマーインターフェロン検定、ＩＬ−２産生検
定及び増殖検定といったＴヘルパー細胞についてテスト
する検定などが含まれる。特に好ましい検定は、以下の
例１２Ａｉにおいてさらに詳細に説明されている。 【０１０６】本発明の免疫原性タンパク質は同様に、よ
り免疫原性を高めるべく当該技術分野において既知のさ
まざまな方法によって操作することができる。かかる方
法の代表例としては、Ｔヘルパーエピトープに対応する
アミノ酸配列を付加すること；疎水性残基を加えて細胞
摂取を促進すること；粒子構造を形成すること；又はこ
れらのあらゆる組合せが含まれる（一般にＨａｒｔ．
前掲書中、Ｍｉｌｉｃｈ ｅｔ ａ１．， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８５：１
６１０〜１６１４， １９８８； Ｗｉｌｌｉｓ， Ｎ
ａｔｕｒｅ３４０：３２３−３２４， １９８９ ；
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ． ６５ ： ４５０−４５６，１９９１を参照）。 【０１０７】好ましい免疫原性部分は、以下の要領でも
選択することができる。簡単に言うと、患者の血清中に
どの抗原フラグメントが存在するかを決定するため、個
々のＨＣＶポリタンパク質領域（例えばＨＣＶコア、Ｅ
１、Ｅ２／ＳＮ１及びＮＳ２−ＮＳ５領域）に対する抗
体を用いて、ＨＣＶを有する患者からの血液試料を分析
する。一時的緩解を与えるためアルファインターフェロ
ンで治療を受けた患者においては、幾分か抗原決定因子
が消滅し、抗原に対する内因性抗体により取ってかわら
れることになる。このような抗原は、本発明の状況下で
免疫原性部分として有用である（Ｈａｙａｔａ ｅｔ
ａ１．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １３ ： １０２２
−１０２８， １９９１；Ｄａｕｉｓ ｅｔ ａ１．，
Ｎ．Ｅｎｇ． Ｊ．Ｍｅｄ． ３２１：１５０１−１５
０６， １９８９）。 【０１０８】Ｃ型肝炎の少なくとも1つの免疫原性部分
(そして望ましくは上述のようなHBVの免疫原性部分及び
/又は免疫調節補因子)がひとたび選択されたならば、そ
の発現を導くベクター構成体の中に入れることができ
る。Ｂ型肝炎治療法について上述したように、例えば組
換え型レトロウイルスを含めて、ベクター構成体を運ぶ
のにさまざまな組換え型ウイルスベクターを利用するこ
とができる（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／５８６，６０３参
照）。さらに上述のとおり、例えばポリオウイルス、鼻
炎ウイルス、ポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、
ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノ
ウイルス、パルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘル
ペスウイルス、ＳＶ４０、ＨＩＶ、麻疹、Ｓｉｎｄｂｉ
ｓウイルス及びコロナウイルスを含むその他のウイルス
担体を用いて開発し利用することができる。さらにベク
ター構成体又は関連する免疫原性部分をコードする核酸
は、例えばリポフェクション、直接DNA注入、微小放物
体ボンバード、リポソーム、ＣａＰＯ4又はＤＮＡリガ
ンドといったトランスフェクション方法により直接患者
に投与することもできる。免疫原性タンパク質自体、ベ
クター構成体、ウイルスベクター又はウイルスベクター
と免疫調節補因子を投与するのに適した化合物及び方法
については、以下でより詳細に記述されている。 【０１０９】本発明のその他の態様においては、肝ガン
細胞を破壊するための方法が提供されている。簡単に言
うと、肝細胞ガン腫は、世界的に見て最も一般的なガン
である。これは、毎年約１００万人の死亡原因となって
おり、その大部分は中国及びサハラ砂漠以南のアフリカ
である。肝細胞ガン腫におけるＢ型肝炎感染の病因論学
的役割には強力な証拠が存在する。HBVのキャリヤは、
非キャリヤに比べ肝細胞ガン腫に対し９０倍以上高いリ
スクをもつ。多くの場合において、Ｂ型肝炎ウイルスＤ
ＮＡは腫瘍の細胞ゲノム内に統合されている。同様にし
て、Ｃ型肝炎ウイルスも又最近になって、循環するＨＣ
Ｖ抗体を肝細胞ガン腫を有する幾人かの患者の体内で発
見できるという観察事実に基づいて、肝細胞ガン腫と結
びつけられるということが確認されている。現在のとこ
ろ、化学療法、放射線療法及び免疫療法がさほど有望で
ないことから、肝細胞ガン腫には外科的切除が唯一の治
療法を提供しているにすぎない（Ｃｏｌｏｍｂｏ ｅｔ
ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ１００６〜１００８、１９８
９年１０月２８日 ； Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ ｅｔ ａ
１．， Ａｎｎ． ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄ．
１０８ ： ３９０−４０１， １９８８ ； Ｗａ
ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａ１．， Ｉｎｔ．Ｊ． Ｃａｎ
ｃｅｒ ４８：３４０−３４３， １９９１； Ｂｉｓ
ｃｅｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｇ
ａｓｔｒｏ． ８６：３３５〜３３８， １９９１）。 【０１１０】本発明のもう1つの態様においては、免疫
応答が生成されるように、抗原Xの免疫原性部分の発現
を導くベクター構成体を温血動物に投与する段階を含む
B型肝炎ガン腫細胞を破壊するための方法が提供されて
いる。ＨＢｘＡｇをコードする配列は、本書に提供され
ている開示を仮定すれば、当業者によって容易に得るこ
とのできるものである。簡単に言うと、本発明の一実施
態様においては、６１２ｂｐのＮｃｏＩ−Ｓａｌ Ｉが
ＡＴＣＣ ４５０２０から回収され、その他のＢ型肝炎
抗原について前述した通り、ベクター構成体の中に挿入
される。 【０１１１】しかしながらＸ抗原は、その他の潜在的発
ガン遺伝子(例えばＥｌＡ)に類似した形で機能しうる既
知のトランス作用因子である。従って、ベクター構成体
内に挿入する前に遺伝子産物が腫瘍形成性をもたないよ
うにまずX抗原を変更することが一般に好ましい。例え
ば切形、点突然変異、早発性停止コドンの付加又はリン
酸化部位変更によるものを含むさまざまな方法を用いて
Ｘ抗原を非腫瘍形成性のものにすることができる。1つ
の実施態様においては、Ｘ抗原をコードする問題の配列
又は遺伝子は切形にされる。切形化はさまざまなフラグ
メントを生成しうるが、一般にはコードする遺伝子配列
の５０％以上を保持することが好ましい。その上、どん
な切形化によっても遺伝子産物の免疫原性配列のいくつ
かが無傷の状態に残されることが必要である。代替的に
は、本発明のもう1つの実施態様においては、変更され
たX抗原をコードする遺伝子内に、多数の翻訳終止コド
ンを導入することができる。終止コドンの挿入は、タン
パク質の発現を早期に終止し、かくしてタンパク質の形
質転換部分の発現を防ぐ。 【０１１２】Ｘ遺伝子又はその修正されたバージョンは
さまざまな方法でその腫瘍形成性についてテストするこ
とができる。代表的な検定としては、ヌードマウスにお
ける腫瘍形成（例１４Ａ参照）、軟寒天中のコロニー形
成（例１４Ｂ参照）及び遺伝子導入マウスといった遺伝
子導入動物の調製が含まれる。 【０１１３】ヌードマウス又はラットにおける腫瘍形成
は、腫瘍形成性を決定するための特に重要な敏感な方法
である。ヌードマウスには、機能的細胞免疫系が欠如し
ており（すなわちＣＴＬを有していない）、従って、細
胞の腫瘍形成潜在力とテストすべき有用なインビボモデ
ルを提供してくれる。正常な非腫瘍形成細胞は、ヌード
マウス内に感染させられた場合、無制御の成長特性を示
さない。しかしながら、形質転換された細胞はヌードマ
ウス内で急速に増殖し腫瘍を生成する。簡単に言うと、
1つの実施態様において、ベクター構成体は同系のマウ
ス細胞に投与され、細胞はヌードマウス内に注入され
る。マウスは、腫瘍成長を確認するべく注射後４〜６週
間目視される。腫瘍が存在するか否かを確認するため、
マウスを安楽死させて剖検することもできる（Ｇｉｏｖ
ａｎｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ４８：１５３１−１５３３，１９
７２； Ｆｕｒｅｓｚ ｅｔ ａｌ．，「生物学的薬剤
の生産のために考慮されている細胞系統の腫瘍形成性試
験」、Ａｂｎｏｒｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（異常細胞）、Ｎ
ｅｗ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｒｉｓｋ（新製品と
そのリスク）、Ｈｏｐｐｓ ａｎｄ Ｐｅｔｒｉｃｃｉ
ａｎｉ（ｅｄｓ．）， Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， １９８５ ； Ｌｅｖｅ
ｎｂｏｏｋｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔｄ．
１３：１３５−１４１， １９８５）。腫瘍形成性は同
様に、軟寒天中のコロニー形成を視覚化することによっ
ても評価されうる（Ｍａｃ Ｐｈｅｓｓｏｎ ａｎｄ
Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ， Ｖｉｒｏ１． ２３： ２９
１〜２９４， １９６４）。簡単に言うと、正常な非腫
瘍形成性細胞の1つの特性は、足場依存性成長である。
より特定的に言うと、正常な非腫瘍形成性細胞は、半固
体寒天支持媒地の中に平板固定された時点で増殖を停止
するのに対し、腫瘍形成性細胞は軟寒天内で増殖し続け
コロニーを形成する。 【０１１４】遺伝子導入マウスといった遺伝子導入動物
を、抗原Xの免疫原性部分の腫瘍形成性を評価するのに
利用することも可能である（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａ
１．， Ｃｅｌ１ ３８：６２７〜６３７， １９８
４； Ｑｕａｉｆｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４
８： １０２３−１０３４， １９８７； Ｋｏｉｋｅ
ｅｔ ａ１．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６ ； ５６１５−５６１９，
１９８９）。遺伝子導入動物においては、対象となる
遺伝子は動物の全ての組織内で発現されうる(一般に、
Ｗ０９０／０８８３２を参照のこと)。トランスジーン
のこの調節不良の発現は、新しく導入された遺伝子の腫
瘍形成潜存能についての1つのモデルとして役立ちう
る。 【０１１５】上述のように、抗原Xの免疫原性部分がひ
とたび選択されたならば(これは好ましくは非腫瘍形成
性のものである)、上述のようにこれをベクター構成体
内に挿入し、組換え型ウイルスにより運ぶことができ
る。上述のように、本発明のベクター構成体は、例え
ば、ポリオウイルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイル
ス、カナリア痘ウイルス、ワクシニアウイルス、インフ
ルエンザウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、
アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、Ｈ
ＩＶ、麻疹、コロナ及びＳｉｎｄｂｉｓウイルスから成
るグループの中から選択された組換え型ウイルス又は組
換え型レトロウイルスによるものを含むさまざまな方法
で運ぶことができる。さらに、ベクター構成体又は関連
する免疫原性部分をコードする核酸は、患者に対し直
接、すなわち、リポフェクション、直接DNA注入、微小
放物体ボンバード、リポソーム、ＣａＰＯ4、又はＤＮ
Ａリガンドなどのトランスフェクション方法によって投
与することができる。免疫原性タンパク質自体、ベクタ
ー構成体、ウイルスベクター又はウイルスベクターと免
疫調節補因子を投与するのに適した組成物及び方法につ
いては、以下でさらに詳しく論述する。 【０１１６】本発明のもう１つの態様においては、Ｃ型
肝炎抗原の免疫原性部分の発現を導くベクター構成体を
温血動物に投与する段階を含む、Ｃ型肝炎ガン腫細胞を
破壊するための方法が提供されている。Ｃ型肝炎抗原の
好ましい免疫原性部分（単複）は、コア抗原及びＮＳ１
−ＮＳ５領域を含むポリタンパク質内に見い出すことが
できる（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２４５１
−２４５５， １９９１）。特に好ましい免疫原性部分
はさまざまな方法によって決定できる。例えば、上述の
ように、アミノ酸配列に基づいて好ましい免疫原性部分
を予想することが可能である。簡単に言うと、頻繁に免
疫原性の両親媒性α-ヘリックスを有するT細胞エピトー
プを予測するのに、当業者には既知のものであるさまざ
まなコンピュータプログラムを利用することができる。
免疫原性部分を予測するのに同様に利用することのでき
るもう1つの方法は、レトロウイルスベクターを利用し
てマウス体内でCTL誘発特性を有するのがどの部分であ
るかを決定することにある（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔａ
ｌ．， ＡＩＤＳ， Ｒｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒ
ｅｔｒｏｖｉｒｕｓ７：６４５−６５５， １９９
１）。Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌの中で記されているよ
うに、マウス内のCTL誘発をヒト体内の細胞免疫原性を
予測するのに利用することができる。好ましい免疫原性
部分は同様に、相応する遺伝子のベクター形質導入の後
にフラグメントを発現する標的細胞（例えばＥＢＶ形質
導入を受けたリンパ球）を自己由来の患者のリンパ球に
よって溶解させることのできるのはポリタンパク質抗原
又はペプチドのどのフラグメントであるかを決定するこ
とによっても演繹できる（例１３）。 【０１１７】上述のとおり、免疫原性部分がひとたび選
択されたならば、一般に、それが非腫瘍形成性であるこ
とを確認することが好ましい。これは、切形化、点突然
変異、早発性停止コドン又はリン酸化部位変更を含むさ
まざまな方法によって達成できる。ポリタンパク質又は
その修正されたバージョンは又、上述の方法を利用して
又は例14内に記述されている方法によって、腫瘍形成性
についてテストすることもできる。 【０１１８】免疫原性部分（単複）（ならびに望まれる
場合には免疫調節補因子）はこのときベクター構成体の
中に挿入され上述のとおり組換え型ウイルスにより運ば
れ得る。付加的には、当業者にとっては明白であるはず
であるように、急性及び慢性のHCV感染の治療のための
上述のようなベクターを利用して、肝細胞ガン腫に関連
するHCV感染を治療することも可能である。免疫原性タ
ンパク質自体、ベクター構成体、ウイルスベクター又は
ウイルスベクターと免疫調節補因子を投与するのに適し
た組成物及び方法については以下でさらに詳しく論述す
る。 【０１１９】本発明のもう１つの態様においては、上述
の免疫原性部分（ならびに望ましい場合には免疫調節補
因子）のいくつかの同時発現を導くベクター構成体を調
製することができる。例えば、1つの実施態様において
は、B型肝炎抗原の免疫原性部分ならびにC型肝炎ポリタ
ンパク質の免疫原性部分の両方の同時発現を導くベクタ
ー構成体を調製することができる。かかる構成体は、Ｂ
型又はＣ型のいずれかの急性及び慢性肝炎感染を予防す
るか又は治療するため、以上及び以下で記述されている
通りに投与することができる。同様にその他の実施態様
では、Ｂ型肝炎Ｘ抗原の免疫原性部分ならびにＣ型肝炎
ポリタンパク質の免疫原性部分の両方の同時発現を導く
ベクター構成体を調製することができる。かかる構成体
は、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎のいずれかと結びつけられる
肝細胞ガン腫を治療するために同様にして投与すること
ができる。さらに、Ｂ型及びＣ型肝炎に慢性的に感染し
ている患者は肝細胞ガン腫を発現させるリスクがさらに
高いことから、この疾病の予防的治療としてかかるベク
ターを利用することもできる。 【０１２０】上述のとおり、本発明のベクター構成体又
は上述の免疫原性部分をコードする核酸を人間などの温
血動物に対して直接投与するには、さまざまな方法を利
用することができる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ３
： １４７〜１５４， １９９２）。 【０１２１】さらに、上述の免疫原性部分（単複）をそ
の細胞表面上で発現する細菌の投与によって、免疫応答
（ＣＴＬを含む）を生成することもできる。代表的例と
しては、ＢＣＧ（Ｓｔｏｎｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３５
１； ４５６−４５８， １９９１）及びサルモネラ
（Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａ１．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４４：７０−７２， １９８９）がある。 【０１２２】細胞媒介応答及び体液性応答は、上述の免
疫原性部分(単複)の非経口的投与によっても肝炎に対し
て誘発されうる。簡単に言うと、関連するエピトープを
運ぶ免疫原性部分は、化学合成（Ｂｅｒｇｏｔ ｅｔ
ａｌ．， ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｓ ペプチ
ド合成機ユーザー会報第１６号、１９８６年、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉ
ｔｙ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び、昆虫由来のバキュ
ロウイルス系（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ， Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学に
おける今日の話題）１３１：５１−６８， １９８
６）、哺乳動物由来系（例えばＣＨＯ細胞）（Ｂｅｒｍ
ａｎ ｅｔ ａ１．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６３：３４
８９−３４９８， １９８９）、酵母由来系（ＭｃＡｌ
ｅｅｒ ｅｔ ａ１、，Ｎａｔｕｒｅ ３０７：１７８
−１８０）及び原核系（Ｂｕｒｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ２７９：４３−４７， １９７９）と
いった組換え型系におけるDNAの発現を含む、数多くの
既知の方法において産生できる（Ｅｌｌｉｓ ａｎｄＧ
ｅｒｅｔｙ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏ１． ３１：
５４−５８， １９９０）。 【０１２３】このときタンパク質又はペプチドは、従来
の手段により精製でき、分類Ｉ及び分類ＩＩの応答を含
む細胞媒介応答を誘発するべく数多くの方法により送り
出すことができる。これらの方法の中には、ＩＳＣＯＭ
Ｓ（Ｍｏｒｅｉｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ（免疫学通信） ２５： ２８１−２８４，１９
９０；タカハシ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４
４：８７３−８７５ｍ， １９９０）、リポソーム（Ｇ
ｅｒｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａ１．， Ｖａｃｃｉｎ
ｅ（ワクチン）５：１４５−１５１，１９８７）、脂質
接合（Ｄｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３
４２：５６１−５６４， １９８９）、自己由来細胞上
のペプチドコーティング（Ｈｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ ５４：７７７−７８５， １９８８）、ミ
ョウバン、完全又は不完全フロイントアジュバンド（Ｈ
ａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：９４４８−９４５
２．１９９１）又は有効な非経口投与を可能にするその
他のさまざまな有用なアジュバント（例：Ａｌｌｉｓｏ
ｎ ａｎｄ Ｂｙａｒｓ， Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ワクチ
ン） ８７：５６−５９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８７）（Ｌ
ｉｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，エイズワクチン開発におけ
る進歩、１９９２年８月３０日の第５回全国エイズワク
チン開発グループ年次集会）といったさまざまなタイプ
のアジュバントの使用が含まれている。 【０１２４】代替的には、上述の免疫原性部分に相応す
るタンパク質又はペプチドは、胃腸内放出のため、腸カ
プセル（Ｃｈａｎｎｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ
ｅｒ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． １９５：４４５−４
５２， １９６６）又はポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グ
リコール酸塩）球（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａ１国際
エイズワクチン開発会議議事録中、ＤＡＩＤＳ，ＮＩＡ
ＩＤ、米国保健社会福祉省、１９９１）といった適切な
担体の中に、免疫応答を惹起すべく経口投与するために
カプセル封入することができる。 【０１２５】上述のように、本発明の免疫原性タンパク
質は、より免疫原性を強くするため当該技術分野におい
て既知のさまざまな方法により操作することもできる。
このような方法の代表的例としては、Ｔヘルパーエピト
ープに対応するアミノ酸配列を付加すること;疎水性残
基を付加することによって細胞摂取を促進すること;粒
状構造を形成すること;又はこれらの何らかの組合せが
含まれる（一般に、Ｈａｒｔ，前掲の書中、Ｍｉｌｉｃ
ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：１６１０〜１６１４，
１９８８； Ｗｉ１１ｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ ３４
０； ３２８−３２４， １９８９； Ｇｒｉｆｆｉｔ
ｈｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏ１． ６５：４
５０−４５６，１９９１）。 【０１２６】本発明の好ましい実施態様においては、薬
学的受入れられる担体又は希釈剤と組合わせた形で、ポ
リオウイルス、鼻炎ウイルス、ポックスウイルス、カナ
リア痘ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザ
ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、アデノ随
伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ＨＩＶ、麻
疹、コロナ及びＳｉｎｄｂｉｓウイルスから成るグルー
プの中から選択された組換え型レトロウイルス又は組換
え型ウイルスといった上述の組換え型ウイルスの１つを
含む薬学組成物が提供されている。この組成物は、溶液
としてか或いは又投与前に溶液中に懸濁される固体形態
（例えば凍結乾燥されたもの）として調製されうる。さ
らにこの組成物は、注射、経口又は直腸投与のために適
した担体又は希釈剤と共に調製することもできる。一般
に組換え型ウイルスは、調剤の前に０．２５％〜２５％
好ましくは約５％〜２０％の濃度で利用される。その後
続いて、組成物調製後に組換え型ウイルスは１用量あた
り材料約１μｇを構成し、この量の約１０倍の量の材料
（１０μｇ）を同時精製された汚染物質として伴ってい
る。好ましくは、組成物は、以下で記述するように０．
１〜１．０ｍｌの水溶液の形で調製される。 【０１２７】薬学的に受容可能な担体又は希釈剤は、利
用される用量及び濃度では受容体にとって無毒である。
注射可能な溶液のための担体又は希釈剤の代表例として
は、水、好ましくは生理学的ｐＨで緩衝されている等張
食塩水（例えばリン酸緩衝溶液又はトリス緩衝液）、マ
ンニトール、デキストロース、グリセロール及びエタノ
ールならびにヒト血清アルブミンといったようなタンパ
ク質又はポリペプチドが含まれる。特に好ましい組成物
には１０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１ｍｇ／ｍｌの
ＨＳＡ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．２及び１５０ｍＭ
のＮａＣｌの中にベクター又は組換え型ウイルスが含ま
れている。この場合、組換え型ベクターは約１μｇの材
料を表わすことから、高分子量材料の１％未満で合計材
料（水を含む）の１／１０００００未満でありうる。こ
の組成物は少なくとも６ヵ月間−７０℃で安定してい
る。組成物は静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）
で注射できるが、一般には筋内注射（ｉ．ｍ）すること
が好ましい。通常用いられる個々の用量は１０7〜１０9
ｃ．ｆ．ｕ．（ＨＴｌ０８０細胞上で滴定されたネオマ
イシン耐性のコロニー形成単位）である。これらは、当
初３回又は４回の用量について１〜４週間の間隔で投与
される。その後の追加抗原注射は、６〜１２ヵ月後１回
又は２回の用量として、又その後は年１回与えることが
できる。 【０１２８】セルロース、ラクトース、マンニトール、
ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコール酸塩）球及び／
又はでんぷんなどの炭水化物といった担体又は希釈剤と
共に経口製剤を利用することもできる。組成物は、例え
ば錠剤、ゲルカプセル、丸剤、溶液又は懸濁液の形をと
ることもできるし、付加的には持続放出用に調剤するこ
ともできる。直腸投与のためには、座薬の調製はポリア
ルカレングルコース又はトリグリセリドといった従来の
担体を用いて達成できる。 【０１２９】上述のように、ベクター構成体は、肝炎抗
原の少なくとも１つの免疫原性部分に加えて免疫調節補
因子の発現を導くことができる。しかしながらベクター
構成体が、サイトカインである免疫調節補因子を発現し
ない場合、このサイトカインを上述の組成物中に含み入
れてもよいし、或いは上述の組成物と別に（同時に又は
ひき続き）投与することもできる。簡単に言うと、この
ような実施態様においては、免疫調節補因子は、好まし
くはＴｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ内に規定されているような標準的プロト
コル及び用量に従って投与される。例えば、アルファイ
ンターフェロンは２−４ヵ月間１日１〜５００万単位の
用量で、ＩＬ−２は体重１ｋｇにつき１００００〜１０
００００単位で１日１〜３回２−１２週間投与すること
ができる。ガンマインターフェロンは、２−１２週間２
〜３回１５００００〜１５０００００Ｕ／ｍの用量で投
与することができる。 【０１３０】以下の例は、説明を目的として提供される
ものであり制限的な意味をもつものではない。 【０１３１】 【実施例】例１ ＨＢＶE／CORE配列の分離 Ｂ型肝炎の全プリコア／コアコーディング領域を含む
１．８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＡ
Ｍ６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４５０２０）から得、ＫＳＩＩ
+のＢａｍＨＩ部位内へ連結させる（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）。このプラスミドをＫＳＩＩ+ＨＢｐｃ／ｃ（図
１）と呼ぶ。ＫＳＩＩ+ＨＢｐｃ／ｃ内のプリコア／コ
アのＳｔｕＩ部位にＸｈｏＩリンカーを付加し、結果と
して得られた８７７塩基対のＸｈｏＩ−ＨｉｎｃＩＩプ
リコア／コアフラグメントをＳＫＩＩ+のＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｃＩＩ部位内にクローニングする。このプラスミド
をＳＫ+ＨＢｅ（図１）と呼ぶ。 【０１３２】例２ ＰＣＲを用いた配列の調製 Ａ． ＰＣＲを利用したＨＢＶｅ／ｃｏｒｅ配列の部位
特異的突然変異誘発プラスミドＫＳＩＩ+ＨＢｐｃ／ｃ
内のプリコア／コア遺伝子を配列決定して、プリコア／
コアコーディング領域が正しいか否かを決定する。この
配列は、コドン８４及び８５における２つの連続した枠
内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）ＴＡＧ停止コドンという結果を
もたらすコドン７９におけるフレームシフトをひき起こ
す単一の塩基対の欠失を有することがわかった（図
２）。この欠失は、プラスミドＳＫ+ＨＢｅ内のプリコ
ア／コアコーディング領域のＰＣＲオーバーラップ伸展
によって補正される（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ
７７：５１−５９， １９８９）。欠失を補正するの
に行なわれる３回のＰＣＲ反応のために４つのオリゴヌ
クレオチドプライマが用いられる。 【０１３３】第１の反応は２つのプライマを利用する。
センスプライマ配列は、ａｄｗ株のヌクレオチド配列５
〜２７に対応し、５’末端に２つのＸｈｏＩ制限部位を
含んでいる。ヌクレオチド配列の番号付けはＧｅｎｂａ
ｎｋ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）
から得られている。 【０１３４】（配列ＩＤ番号１）５’−３’：ＣＴＣ
ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＣＡ Ｃ
ＣＡ ＴＧＣ ＡＡＣ ＴＴＴ ＴＴ 第２のプライマ配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのａｄｗ株の
アンチセンスヌクレオチド配列２１５８〜２１３０に対
応し、コドン７９，８４及び８５を含む。 【０１３５】（配列ＩＤ番号２）５−３’：ＣＴＡ Ｃ
ＴＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＴＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＡ
ＴＣＴＴ ＣＣ 第２の反応も又２つのプライマを利用する。センスプラ
イマはａｄｗ株のヌクレオチド配列２１３０〜２１５８
に対応し、コドン７９，８４及び８５を含む。 【０１３６】（配列ＩＤ番号３）５’−３’：ＧＧＡ
ＡＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＴＡＧ ＧＧＡ Ｔ
ＣＴ ＡＧＴ ＡＧ 第２のプライマは、コドン８４及び８５から下流側のＳ
Ｋ+プラスミドポリリンカーからのアンチセンスヌクレ
オチド配列に対応する。 【０１３７】（配列ＩＤ番号４）５’−３’：ＧＧＧ
ＣＧＡ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＣＧＡ Ｔ
ＡＣ ＣＧ 第３の反応は同様に２つのプライマを利用する。センス
プライマはａｄｗ株のヌクレオチド配列５〜２７に対応
し５’末端に２つのＸｈｏＩ制限部位を含む。 【０１３８】（配列ＩＤ番号１）５’−３’ＣＴＣ Ｇ
ＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＴＧ
ＣＡＡＣ ＴＴＴ ＴＴ 第２のプライマ配列はコドン８４及び８５から下流側の
ＳＫ+プラスミドポリリンカーからのアンチセンスヌク
レオチド配列に対応する。 【０１３９】（配列ＩＤ番号４）５−３’ＧＧＧ ＣＧ
Ａ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＣＧＡ ＴＡＣ
ＣＧ 第１のＰＣＲ反応は、アンチセンスストランド内の欠失
を補正し、第２の反応はセンスストランド内の欠失を補
正する。ＰＣＲ反応１及び２は、コドン７９内で起こる
ＣＣからＣＣＡへの突然変異及びコドン８１内のＴＣＡ
からＴＣＴまでの塩基対置換を補正する（図２参照）。
プライマ１は、ＨＢＶｅコーディング領域のＡＴＧコド
ンより１０ｂｐ上流に２つの連続するＸｈｏＩ部位を含
み、プライマ４は、ＨＢＶプリコア／コアコーディング
領域の停止コドンより１３５ｂｐ下流側に１つのＣｌａ
Ｉ部位を含んでいる。第１及び第２のＰＣＲ反応の産物
は、第３のＰＣＲ反応内で伸展させられて、正しい配列
をもつ１つの完全なＨＢＶプリコア／コアコーディング
領域を生成する（図３）。 【０１４０】ＰＣＲ反応は、以下のサイクル条件を用い
て行なわれる：すなわち、まず最初に試料を２分間９４
℃まで加熱する。融解段階と呼ばれるこの段階は２本鎖
ＤＮＡを、合成のため一本鎖へと分離する。次に試料を
３０秒間５６℃で加熱する。アニーリング段階と呼ばれ
るこの段階によりプライマは第１段階で生成された１本
鎖ＤＮＡまでアニールすることができる。次に試料を３
０秒間７２℃で加熱する。この段階は伸展段階と呼ば
れ、第１段階で生成された１本鎖ＤＮＡの相補的ストラ
ンドを合成する。第２の融解段階が、３０秒間９４℃で
行なわれ、その後に３０秒間５６℃でアニーリング段階
が続き、その後３０秒間７２℃で伸展段階が続く。その
後この手順を３５サイクルくり返し、結果として望まし
いＤＮＡ産物の増幅が得られる。 【０１４１】ＰＣＲ反応産物はゲル電気泳動によって精
製され、ＮＡ４５ぺ一パー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａ
ｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐ
ｓｈｉｒｅ）上に移送される。望ましい７８７ｂｐのＤ
ＮＡフラグメントは、４００μｌの高塩分緩衝液（１．
５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、及び
０．１ｍｌのＥＤＴＡ）内で６５℃で３０分間インキュ
ベートすることによりＮＡ４５ぺーパーから溶出され
る。溶出後、５００μｌのフェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（２５：２４：１）を溶液に付加
する。混合物を渦巻運動に付し次に５分間１４０００ｒ
ｐｍで遠心分離させる。望ましいＤＮＡフラグメントを
含む水相を新鮮な１．５ｍｌ入りマイクロフュージュ管
に移し、１．０ｍｌの１００％ＥｔＯＨを付加する。こ
の溶液を５分間ドライアイス上でインキュベートし、次
に１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。上清をデ
カントし、ペレットを５００μｌの７０％ＥｔＯＨで洗
う。真空下１００００ｒｐｍの遠心分離によりペレット
を乾燥させ、次に１０μｌの脱イオン水の中で再懸濁さ
せる。１．５％のアガロースゲル電気泳動により１マイ
クロリットルのＰＣＲ産物を分析する。７８７塩基対の
ＸｈｏＩ−ＣｌａＩプリコア／コアＰＣＲ増幅済みフラ
グメントをＳＫ+プラスミドのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位
内ヘクローニングさせる。このプラスミドをＳＫ+ＨＢ
ｅ−ｃと呼ぶ。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５ａｌｐｈａ，Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）をＳＫ+ＨＢｅ
−ｃプラスミドで形質転換させ、プラスミドＤＮＡを生
成するべく増殖させる。次にプラスミドを、基本的にＢ
ｉｒｎｂｏｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓ．７：１５１３，１９７９：分子クローニング；実
験室マニュアル、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ１．（ｅ
ｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐ
ｒｅｓｓ，１９８９も参照のこと）。ＳＫ+ＨＢｅ−ｃ
プラスミドを分析して、プリコア／コア遺伝子の配列
（図４）を確認する。 Ｂ．ＨＢＶコア配列の分離 プラスミドＳＫ+ＨＢｅ内の単一塩基対欠失は、例２Ａ
に記したとおりＰＣＲオーバーラップ伸展により補正さ
れる。突然変異を補正するべく行なわれるＰＣＲ反応の
ために４つのオリゴヌクレオチドプライマが用いられ
る。 【０１４２】第１の反応は２つのプライマを利用する。
センスプライマはＳＫ+ＨＢｅプラスミドのＴ−７プロ
モータのためのヌクレオチド配列に対応する。 （配列ＩＤ番号５）５’−３’：ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣ
Ｔ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ Ｇ 第２のプライマは、ａｄｗ株のアンチセンス配列２１５
８〜２１３０に対応し、コドン７９，８４及び８５を含
む。 （配列ＩＤ番号２）５’−３’：ＣＴＡ ＣＴＡ ＧＡ
Ｔ ＣＣＣ ＴＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＴＴ
ＣＣ 第２の反応は２つのプライマを利用する。アンチセンス
プライマは、ＳＫ+ＨＢｅプラスミドの中に存在するＴ
−３プロモータのためのヌクレオチド配列に対応する。 （配列ＩＤ番号６）５’−３’：ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＣ
Ｔ ＣＡＣ ＴＡＡ ＡＧ 第２のプライマは、ａｄｗ株のセンスヌクレオチド配列
２１３０〜２１５８に対応し、コドン７９，８４及び８
５を含む。 （配列ＩＤ番号３）５’−３’：ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＣ
Ｃ ＡＧＣ ＡＴＣ ＴＡＧ ＧＧＡ ＴＣＴ ＡＧＴ
ＡＧ 第３の反応は２つのプライマを利用する。アンチセンス
プライマは、ＳＫ+ＨＢｅプラスミド内に存在するＴ−
３プロモータのためのヌクレオチド配列に対応する。 （配列ＩＤ番号６）５’−３’：ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＣ
Ｔ ＣＡＣ ＴＡＡ ＡＧ 第２のプライマは、ＳＫ+ＨＢｅプラスミド内に存在す
るＴ−７プロモータのセンス配列に対応する。 （配列ＩＤ番号７）５’−３’：ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣ
Ｔ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ Ｇ 第３の反応からのＰＣＲ産物は、ＨＢＶプリコア／コア
コーディング領域のための正しい配列を生み出す。 【０１４３】ＨＢＶコアコーディング領域を分離するた
め、コアコーディング領域のＡＴＧ開始コドンの上流に
ＸｈｏＩ制限部位を導入するようにプライマを設計し、
これはＨＢＶプリコアコーディング領域の２９のアミノ
酸リーダー配列を除去する。第４の反応においては、Ｈ
ＢＶコアコーディング領域は、第３の反応からのＰＣＲ
産物及び以下のプライマを用いて生成される。 【０１４４】第４の反応は２つのプライマを利用する。
センスプライマは、ａｄｗ株のヌクレオチド配列１８８
５〜１９０５に対応し、５’末端に２つのＸｈｏＩ部位
を含む。 （配列ＩＤ番号８）５’−３’：ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＣ
Ｔ ＣＧＡ ＧＣＴ ＴＧＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＴＧ
ＧＧＧ ＣＡＴ Ｇ 第２のプライマはＳＫ+ＨＢｅプラスミド内に存在する
Ｔ−３プロモータのためのアンチセンスヌクレオチド配
列に対応する。第４のＰＣＲ反応からの約６００ｂｐの
ＰＣＲ産物は、５’末端にＨＢＶコアコーディング領域
及び新規のＸｈｏＩ制限部位そしてＳＫ+ＨＢｅプラス
ミドのマルチクローニング部位内に存在していた３’末
端にＣｌａＩ制限部位を含んでいる。 （配列ＩＤ番号９）５’−３’：ＡＴＴ ＡＣＣ ＣＣ
Ｔ ＣＡＣ ＴＡＡ ＡＧ 第４のＰＣＲ反応に続いて、溶液は新鮮な１．５ｍｌの
マイクロフュージュ管の中に移される。この溶液に３Ｍ
の酢酸ナトリウムを５０マイクロリットル、次に５００
μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：
１）を付加する。混合物を渦巻運動に付し、次に５分間
１４０００ｒｐｍで遠心分離する。水相を新鮮なマイク
ロフュージュ管に移し、１００％のＥｔＯＨを１．０ｍ
ｌ付加する。この溶液を４．５時間、−２０℃でインキ
ュベートし、次に２０分間１００００ｒｐｍで遠心分離
する。上清をデカントし、ペレットを７０％のＥｔＯＨ
５００μｌで洗う。真空下で１００００ｒｐｍの遠心
分離によりペレットを乾燥させ、次に１０μｌの脱イオ
ン水の中で再懸濁させる。１．５％のアガロースゲルの
中での電気泳動によりＰＣＲ産物１０マイクロリットル
を分析する。 Ｃ．ＨＣＢコア配列の分離 慢性の非Ａ非Ｂ肝炎を患う患者から２００μｌの血清試
料を得、Ｃｈｒｉｓｔｕａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐ
ａｔｏｌｏｇｙ（肝臓学）１４：５１−５５，１９９１
の手順によりウイルスＲＮＡを調製する。４．２Ｍのイ
ソチオシアン酸グアニジニウム（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｉｓ，Ｍｉｓｓ
ｏｕｒｉ）、０．５％のラウリルザルコース酸ナトリウ
ム及び２５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０から成る５
５０μｌの抽出緩衝液と２００μｌの血清を混合し、フ
ェノール：クロロホルム（１：１）で１回、クロロホル
ムで１回抽出する。水相を等量のイソプロピルアルコー
ルで沈降させ、５分間１４０００ｒｐｍで遠心分離す
る。ウイルスＲＮＡを含む結果として得られたペレット
を７０％のエタノールで洗浄し２００μｌのＲＮａｓｅ
を含まない脱イオン水の中に再懸濁させる。４マイクロ
リットルのＲＮａｓｉｎ（４００００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ）を混合物に付加する。この混合物はＨＣＶ
ＲＮＡを含み、次に続く逆転写酵素反応のための鋳型で
ある。ｃＤＮＡ ＣＹＣＬＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を
用いて、全長の第１鎖ｃＤＮＡを、分離されたウイルス
ｍＲＮＡから生成する。１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液
（バイアルＣ１６）、２μｌの２５ｍＭのｄＮＴＰｓ
（バイアルＣ１１）、５％のＤＭＳＯ、４ＵのＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌ
ｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び２μＭずつの２つの
プライマを含む合計量１００μｌの反応混合物中でＰＣ
Ｒにより、上述の逆転写反応を７マイクロリットル（１
００ｎｇの全長第１鎖ｃＤＮＡ）を増幅させる。 【０１４５】センスプライマは、ヌクレオチド配列３１
６〜３３５に対応し、Ｃ型肝炎ウイルスコア読取り枠の
５’領域のためのヌクレオチド配列であり、ＡＴＧ開始
コドンを含む。 （配列ＩＤ番号１０）５’−３’：ＧＴＡ ＧＡＣ Ｃ
ＧＴ ＧＣＡ ＴＣＡ ＴＧＡ ＧＣ 第２のプライマは、Ｃ型肝炎ウイルス外皮読取り枠の中
に存在するアンチセンスヌクレオチド配列１１７２〜１
１５３に対応する。 （配列ＩＤ番号１２）５’−３’：ＡＴＡ ＧＣＧ Ｇ
ＡＡ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＣＡ ＧＣ 反応混合物をＰＣＲ遺伝子ＡＭＰシステム９６００（Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｃｅｔｕｓ，Ｌｏｓ Ａｎｇ
ｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の中に入れる。ＰＣ
Ｒプログラムは、まず１分間９５℃に次に２分間６０℃
に、そして最後に２分間７２℃に反応容器の温度を調整
する。このサイクルは４０回くり返される。４０回目の
サイクルの後、最後のサイクルは反応容器を１分間９５
℃に、次に２分間６７℃にそして最後に７分間７２℃に
調整する。 【０１４６】第１のＰＣＲ反応では、ＡＴＧ開始コドン
から上流側の５’領域からＨＣＶｅ読取り枠までのＨＣ
Ｖコア読取り枠が増幅される。ヌクレオチド番号付け配
列は、ＨＣＶ−Ｊ株に従ったものである（Ｋａｔｏ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８７：９５２４−９５２８，１９９０）。 【０１４７】第１のＰＣＲ反応からの産物は第２のＰＣ
Ｒ反応で増幅される。第２のＰＣＲ増幅は、ヌクレオチ
ド配列３２９〜３６７に対応するセンスプライマを用い
て行なわれる（そして、Ｃ型肝炎ウイルスコア読取り枠
の５’末端のためのヌクレオチド配列である）。センス
プライマの５’末端は２つの連続するＸｈｏＩ制限部位
を含んでいる。プライマは同様に、翻訳開始のための適
切な規則に合致するべくイニシエータＡＴＧ開始コドン
の部域内に導入された一定数のヌクレオチド変更をも含
んでいる（Ｋｏｚａｋ，Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ．１９６：９
４７−９５０，１９８７）。 （配列ＩＤ番号１２）５’−３’：ＣＴＣ ＧＡＧ Ｃ
ＴＣ ＧＡＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＡ ＧＣＡ ＣＡ
Ａ ＡＴＣ ＣＴＡ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＡＡ
ＡＡＡ ＣＣＡ ＡＡＣ Ｇ アンチセンスプライマは、ＨＣＶコア遺伝子と枠を成し
て２つの連続した停止コドンを含むべく設計されてい
る。プライマの５’末端は２つの連続するＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限部位を含む。このプライマは、ヌクレオチド配列
９０２〜８６０に対応し、Ｃ型肝炎ウイルスのコアと外
皮読取り枠の間の接合部である。 （配列ＩＤ番号１３）５−３’：ＧＣ ＡＡＧ ＣＴＴ
ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＴＣＡ ＡＧＣＧＣＡ Ａ
ＧＣ ＴＧＧ ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＡＡ ＡＣＡ ＡＧ
Ａ ＣＡＧＣＡＡ ＡＧＣ ＴＡＡ ＧＡＧ 第１のＰＣＲ反応からの産物は同様に第３のＰＣＲ反応
においても増幅される。センスプライマの５’末端は２
つの連続するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む。このプラ
イマは同様に、翻訳開始のためのＫｏｚａｋ規則に合致
するようヌクレオチド変更を含んでおり、ＨＣＶ−Ｊ配
列のヌクレオチド配列３２９〜３６７に対応する（そし
てＣ型肝炎ウイルスコア読取り枠の５’末端のためのヌ
クレオチド配列である）。 （配列ＩＤ番号１４）５’−３’：ＡＡＧ ＣＴＴ Ａ
ＡＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＡ ＧＣＡ ＣＡ
Ａ ＡＴＣ ＣＴＡ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＡＡ
ＡＡＡ ＣＣＡ ＡＡＣ Ｇ アンチセンスプライマは、ＨＣＶコア遺伝子と枠を成し
て２つの停止コドンを、又プライマの５’末端に２つの
連続するＸｈｏＩ制限部位を含むように設計されてい
る。このプライマは、アンチセンスヌクレオチド配列９
０２〜８６０に対応し、Ｃ型肝炎ウイルスのコアと外皮
読取り枠の間の接合部である。 （配列ＩＤ番号１５）５’−３’：ＧＣ ＣＴＣ ＧＡ
Ｇ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＴＣＡ ＡＧＡＧＧＡ
ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＡＡ ＡＣＡ Ａ
ＧＡ ＣＡＧＣＡＡ ＡＧＣ ＴＡＡ ＧＡＧ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、次
に第２の反応からの５７０ｂｐのＰＣＲ増幅した産物を
ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）内に連結させ、凍
結した受容能あるＥ．ｃｏｌｉ細胞へと形質転換させ
る。ＤＮＡ配列決定による確認の後、この構成体をｐＣ
ＲＩＩＸｈ−ＨＨＣＶコアと呼称する。 【０１４８】上述のとおり、第３の反応からの５７０ｂ
ｐのＰＣＲ増幅された産物をｐＣＲＩＩベクター内に連
結させる。ＤＮＡ配列決定による確認の後、この構成体
をｐＣＲＩＩＨ−ＸｈＨＣＶコアと呼称する。 Ｄ．ＨＣＶＮＳ３／ＮＳ４配列の分離 Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３／ＮＳ４配列を、例１Ｃ内に記
述されているように非Ａ非Ｂ肝炎を有する患者からの２
００μｌの血清から分離する。ウイルスＲＮＡを、ｃＤ
ＮＡ ＣＹＣＬＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により逆転写
し、ＰＣＲにより増幅する。第１のＰＣＲ反応において
は、ＨＣＶＮ５３／Ｎ５４読取り枠が増幅される。 【０１４９】第１のＰＣＲ増幅は２つのプライマを用い
て行なわれる。センスプライマはＣ型肝炎ウイルスＮＳ
２読取り枠のヌクレオチド配列３０８８〜３１０６に対
応する。 （配列ＩＤ番号）５’−３’：ＧＴＧ ＣＡＴ ＧＣＡ
ＴＧＴ ＴＡＧ ＴＧＣ Ｇ 第２のプライマは、Ｃ型肝炎ウイルスＮ５５読取り枠の
アンチセンスヌクレオチド配列６５３０〜６５１１に対
応する。 （配列ＩＤ番号１７）５’−３’：ＣＧＴ ＧＧＴ Ｇ
ＴＡ ＴＧＣ ＧＴＴ ＧＡＴ ＧＧ 第１のＰＣＲ反応からの産物は第２のＰＣＲ反応におい
て増幅される。センスプライマの５’末端には、２つの
連続するＸｈｏＩ制限部位が含まれる。このプライマは
同様に、翻訳開始のためのＫｏｚａｋ規則に合致するべ
くヌクレオチド変更をも含み、ＨＣＶ−Ｊ配列のＮＳ３
読取り枠の５’領域のヌクレオチド配列３３４８〜３３
８５に対応する。 （配列ＩＤ番号１８）５’−３’：Ｃ ＣＴＣ ＧＡＧ
ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧＧＧＡ Ａ
ＧＧ ＡＧＡ ＴＡＣ ＴＴＣ ＴＡＧ ＧＡＣ ＣＧ
Ｇ ＣＣＧＡＴＡ ＧＴＴ ＴＴＧ Ｇ このプライマは、ＨＣＶ−Ｊ配列のＮＳ４読取り枠の
３’領域のＨＣＶ−Ｊのヌクレオチド配列６３６８〜６
３２８に対応する。このプライマは、ＨＣＶコア遺伝子
と枠をなす２つの連続する停止コドン及びその５’末端
にある２つの連続するＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。 （配列ＩＤ番号１９）５’−３’：ＧＣ ＡＡＧ ＣＴ
Ｔ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＴＣＡ ＧＣＧ ＴＴＧ
ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＧＧ ＧＡＧ
ＴＣＣ ＣＧＧ ＴＡＡ ＣＣＧ ＣＣＧ Ｃ 第２のＰＣＲ反応からの３０２０ｂｐのＰＣＲ産物をｐ
ＣＲＩＩプラスミド内に連結し、ＤＮＡ配列決定によっ
て確認し、ｐＣＲＩＩ，Ｘｈ−ＨＨＣＶＮ５３／ＮＳ４
と呼称する。 Ｅ．免疫調節補因子１Ｌ−２の増幅 Ｔ７５フラスコ内で１５８ｍｌの合計体積となるまで１
×１０6細胞／ｍｌでジャーカット細胞を再懸濁させ
る。合計体積の１％（合計１．５８ｍｌ）までフィトヘ
マグルチニン（ＰＨＡ）を付加し、３７℃、５％ＣＯ2
で一晩インキュベートする。翌日、細胞を３本の５０ｍ
ｌ入り遠心分離管の中に採収する。３つのペレットを５
０ｍｌのＰＢＳ内で組合わせ、３０００ｒｐｍで５分間
遠心分離させ、上清をデカントする。この手順を反復す
る。Ｍｉｃｒｏ−Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ分離
キット、バージョン１．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓ
ａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、Ｐ
ｏｌｙ Ａ+ ｍＲＮＡを分離する。分離された無傷のｍ
ＲＮＡを鋳型として用いて、以下のプライマでｃＤＮＡ
ＣＹＣＬＥキットにより全長第１鎖ｃＤＮＡを生成す
る。 【０１５０】このオリゴヌクレオチドは、停止コドンよ
り２５塩基対だけ下流にあるＩＬ−２ ｍＲＮＡのアン
チセンスヌクレオチド配列に相応する。 （配列ＩＤ番号２０）５’−３’：ＡＴＡ ＡＡＴ Ａ
ＧＡ ＡＧＧ ＣＣＴ ＧＡＴ ＡＴＧ 逆転写反応からの産物を、２つの別々の反応において増
幅する。第１のＰＣＲ増幅はＡＴＧ開始コドンの下流３
ｂｐに相応するセンスプライマを用いて行なわれる。こ
のプライマはその５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を内含
し、ＡＴＧ開始コドンを含むＩＬ−２読取り枠の５’領
域を内含する。 （配列ＩＤ番号２１）５’−３’：ＧＣＡ ＡＧＣ Ｔ
ＴＡ ＣＡＡ ＴＧＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＡ
Ｃ ＴＣＣ ＴＧＴ ＣＴ アンチセンス呼ぶライマは、ＩＬ−２読取り枠の３’領
域に対し相補的であり、ＴＧＡ停止コドンの下流３ｂｐ
のところで開始する。このプライマは、その５’末端に
ＸｈｏＩ部位を内含している。 （配列ＩＤ番号２２）５’−３’：ＧＡＣ ＴＣＧ Ａ
ＧＴ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ＧＴＴ ＧＡ
Ｇ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＴ 第１のＰＣＲ反応からの４６７ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣ
ＲＩＩプラスミド内に連結し、ＤＮＡ配列により確認
し、ｐＣＲＩＩＨ−ＸｈＩＬ−２と呼称する。 【０１５１】逆転写反応からの産物を第２のＰＣＲ反応
において増幅させる。ＡＴＧ開始コドンの下流３ｂｐに
対応するセンスプライマを用いて、第２のＰＣＲ増幅を
実施する。このプライマはその５’末端にＸｈｏＩ部位
を内含し、ＡＴＧ開始コドンを含むＩＬ−２読取り枠の
５’領域を内含する。 （配列ＩＤ番号２３）５’−３’：ＧＣＣ ＴＣＧ Ａ
ＧＡ ＣＡＡ ＴＧＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＡ
Ｃ ＴＣＣ ＴＧＴ ＣＴ アンチセンスプライマは、ＩＬ−２読取り枠の３’領域
に対して相補的であり、ＴＧＡ停止コドンの下流３ｂｐ
のところで開始する。このプライマは、その５’末端に
ＡｐａＩ部位を含む。 （配列ＩＤ番号２４）５’−３’：ＧＡＧ ＧＧＣ Ｃ
ＣＴ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ＧＴＴ ＧＡ
Ｇ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＴ 第２のＰＣＲ反応からの４６７ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣ
ＲＩＩプラスミド内に連結し、ＤＮＡ配列決定により確
認し、凍結した受容能あるＥ．ｃｏｌｉ細胞へと形質転
換する。このベクター構成体をｐＣＲＩＩＸｈ−ＡＩＬ
−２と呼称する。 Ｆ．ＰＣＲを利用した免疫調節補因子Ｂ７／ＢＢ１の増
幅 ５本のＴ７５フラスコ内で合計体積１５８ｍｌとなるま
でラージ細胞を１×１０6の細胞／ｍｌで懸濁させ、３
７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートする。翌日、３
本の５０ｍｌ入り遠心分離管の中に細胞を採収する。細
胞ペレットを５０ｍｌのＰＢＳ内で組合わせ、２０００
ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をデカントする。こ
の手順をくり返す。例２Ｅで記述したとおりポリＡ+ ｍ
ＲＮＡを分離する。分離された無傷のｍＲＮＡを鋳型と
して用いて、ｃＤＮＡ ＣＹＣＬＥキットを利用して全
長第１鎖ｃＤＮＡを生成しひきつづき基本的に例２Ｅに
記されているとおりに２回の個別のＰＣＲ増幅反応を行
なう。ヌクレオチド番号づけシステムは、Ｆｒｅｅｍａ
ｎ ｅｔ ａ１．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４３：２７
１４−２７２２，１９８９）から得られる。 【０１５２】第１のＰＣＲ増幅は２つのプライマを用い
て行なわれる。センスプライマは、Ｂ７／ＢＢ１のヌク
レオチド配列３１５〜３５３に対応する。このプライマ
は、ＡＴＧ開始コドンを含むＢ７／ＢＢ１読取り枠の
５’領域を内含し、５’末端に２つのＨｉｎｄＩＩＩ制
限部位を有する。 （配列ＩＤ番号２５）５’−３’：ＣＧ ＡＡＧ ＣＴ
Ｔ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧＣＣＡＣ
ＡＣＡ ＣＧＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＣＡ Ｔ
ＣＡ ＣＣＡＴＣＣ 第２のプライマは、Ｂ７／ＢＢ１のアンチセンスヌクレ
オチド配列１１８７〜１１４９に対応する。このプライ
マは、ＴＡＡ停止コドンで終了するＢ７／ＢＢ１読取り
枠の３’領域に対し相補的であり、５’末端に２つのＸ
ｈｏＩ制限部位を含んでいる。 （配列ＩＤ番号２６）５’−３’：Ｃ ＣＴＣ ＧＡＧ
ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＴＴＡ ＴＡＣＡＧＧ Ｇ
ＣＧ ＴＡＣ ＡＣＴ ＴＴＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＣＡ
Ａ ＴＣＴＣＴＣ 第１のＰＣＲ反応からの８６８ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣ
ＲＩＩの中に連結させ、ＤＮＡ配列決定により確認し、
凍結した受容能あるＥ．ｃｏｌｉ細胞へと形質転換す
る。このベクター構造体をＰＣＲＩＩＨ−Ｘｈ−Ｂ７／
ＢＢ１と呼称し、ＤＮＡ配列によって確認する。 【０１５３】第２のＰＣＲ増幅は２つのプライマーを用
いて行なわれる。センスプライマは、Ｂ７／ＢＢ１のヌ
クレオチド配列３１５〜３５３に対応する。このプライ
マは、ＡＴＧ開始コドンを含むＢ７／ＢＢ１読取り枠の
５’領域を内含し、その５’末端に２つのＸｈｏＩ部位
を有する。 （配列ＩＤ番号２７）５’−３’：Ｃ ＣＴＣ ＧＡＧ
ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧＣＣＡＣ Ａ
ＣＡ ＣＧＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＣＡ ＴＣ
Ａ ＣＣＡＴＣＣ 第２のプライマは、Ｂ７／ＢＢ１のアンチセンスヌクレ
オチド配列１１８７〜１１４９に対応する。このプライ
マは、ＴＡＡ停止コドンで終結するＢ７／ＢＢ１読取り
枠の３’領域に相補的であり、５’末端に２つのＡｐａ
Ｉ制限部位を含む。 （配列ＩＤ番号２８）５’−３’：Ｃ ＧＧＧ ＣＣＣ
ＧＧＧ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＴＡ ＴＡＣＡＧＧ Ｇ
ＣＧ ＴＡＣ ＡＣＴ ＴＴＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＣＡ
Ａ ＴＣＴＣＴＣ 第２のＰＣＲ反応からの８６８ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣ
ＲＩＩプラスミド内に連結し、ＤＮＡ配列決定により確
認し、凍結した受容能あるＥ．ｃｏｌｉ細胞へと形質転
換する。このベクター構成体をｐＣＲＩＩ Ｘｈ−Ａ−
Ｂ７／ＢＢ１と呼称し、ＤＮＡ配列により確認する。 Ｇ．ＰＣＲを利用した免疫調節補因子ＧＭ−ＣＳＦの合
成 ＧＭ−ＣＳＦの合成を、Ｆｏｇｕｅｔ及びＬｕｂｂｅｒ
ｔのプロトコル（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：
６７４−６７５，１９９２）に従って実施する。長さ５
３〜１０６ヌクレオチドの重複するオリゴヌクレオチド
を合成する。第１のオリゴヌクレオチドは、５’末端で
２つのＨｉｎｄＩＩＩ分割部位を含むヌクレオチド配列
番号２９〜８６のヒトＧＭ−ＣＳＦのセンス配列であ
る。 （配列ＩＤ番号２９）５’−３’：ＧＣＡ ＡＧＣ Ｔ
ＴＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＡＧＧ ＡＴＧ ＴＧＧ ＣＴ
Ｇ ＣＡＧ ＡＧＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＴＴＧ
ＧＧＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＴＧＣ ＡＧＣ
ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＣＡ 第２のオリゴヌクレオチドは、５’末端に２つのＸｈｏ
Ｉ部位を含むヌクレオチド番号２９〜８６のヒトＧＭ−
ＣＳＦのセンス配列である。 （配列ＩＤ番号４７）５’−３’：ＧＣ ＣＴＣ ＧＡ
Ｇ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＴ ＧＴＧＧＣＴ
ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＴＴ Ｇ
ＧＧ ＣＡＣＴＧＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＴ
ＣＴＣ ＴＧＣ Ａ 第３のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列番号１
４５〜７０のヒトＧＭ−ＣＳＦのアンチセンス配列であ
る。 （配列ＩＤ番号３０）５’−３’：ＴＣＣ ＴＧＧ Ａ
ＴＧ ＧＣＡ ＴＴＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＴＣＣ ＣＡ
Ｇ ＧＧＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴＧ
ＧＧＣ ＧＡＧ ＣＧＧ ＧＣＧ ＧＧＴ ＧＣＡ
ＧＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ４番目のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号１３
１〜１９１のヒトＧＭ−ＣＳＦのセンス配列である。 （配列ＩＤ番号３１）５’−３’：ＧＡＡ ＴＧＣ Ｃ
ＡＴ ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＧＣ ＣＣＧ ＧＣＧ ＴＣ
Ｔ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＡＧ ＴＡＧ ＡＧＡ
ＣＡＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＴＧＡ ＧＡＴ Ｇ ５番目のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド２８２〜
１７６のヒトＧＭ−ＣＳＦのアンチセンス配列である。 （配列ＩＤ番号３２）５’−３’：ＣＴＴ ＧＴＡ Ｃ
ＡＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＣＧ ＧＧＴ ＣＴＧ ＴＡ
Ｇ ＧＣＡ ＧＧＴ ＣＧＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＡＧ
ＧＴＣ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＴ
ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＧＴ ＴＴＣ ＡＴＴ Ｃ
ＡＴ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＴ ６番目のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド２５６〜
３４６のヒトＧＭ−ＣＳＦのセンス配列である。 （配列ＩＤ番号３３）５’−３’：ＣＣＴ ＧＧＡ Ｇ
ＣＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＧＧ ＣＣＴ ＧＣ
Ｇ ＧＧＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＣＡＣ ＣＡＡ ＧＣＴ
ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＣＣ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＡＴ
ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ Ｇ
ＣＡ ＧＣＡ ＣＴＧ ７番目のオリゴヌクレオチド配列は、ヌクレオチド番号
３３１〜３８９のヒトＧＭ−ＣＳＦのアンチセンス配列
である。 （配列ＩＤ番号３４）５’−３’：ＧＧＴ ＧＡＴ Ａ
ＡＴ ＣＴＧ ＧＧＴ ＴＧＣ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＧ
Ｔ ＴＴＣ ＣＧＧ ＧＧＴ ＴＧＧ ＡＧＧ ＧＣＡ
ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＴ ＧＴＡ Ｇ ８番目のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド番号３７
２〜４３１のヒトＧＭ−ＣＳＦのセンス配列である。 （配列ＩＤ番号３５）５’−３’：ＣＡＡ ＣＣＣ Ａ
ＧＡ ＴＴＡ ＴＣＡ ＣＣＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＴ
Ｔ ＴＣＡ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＣＣ ＴＧＡ ＡＧＧ
ＡＣＴ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＴＧ ＴＣ ９番目のオリゴヌクレオチド配列は、５’末端に２つの
ＸｈｏＩ制限部位を含むヌクレオチド番号５２０〜４１
６のヒトＧＨ−ＣＳＦのアンチセンス配列である。 （配列ＩＤ番号３６）５’−３’：ＧＣ ＣＴＣ ＧＡ
Ｇ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＴＣＡ ＣＴＣＣＴＧ
ＧＡＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＴＣ Ａ
ＡＡ ＧＧＧＧＡＴ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ
ＧＴＣ Ｃ １０番目のオリゴヌクレオチド配列は、それが５’末端
にＸｈｏＩ制限部位ではなく２つのＸｂａＩ制限部位を
含んでいる点を除いて、オリゴヌクレオチド番号９と同
一である。 （配列ＩＤ番号３７）５’−３’：ＧＣ ＴＣＴ ＡＧ
Ａ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＣＡ ＣＴＣＣＴＧ
ＧＡＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＣＣＡ ＧＣＡ ＧＴＣ Ａ
ＡＡ ＧＧＧＧＡＴ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ
ＧＴＣ Ｃ オリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号２９，３６，３７及び
４７を除いて全てのオリゴヌクレオチドはリン酸化され
ている。連結は、各々のオリゴヌクレオチド８ｐｍｏｌ
ずつと７．５μｌの１０×Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液
（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｉｅｖｅｌａｎ
ｄ，Ｏｈｉｏ）を混合して、無菌精製脱イオン水で最終
体積７５μｌになるようにすることによって行なわれ
る。反応を、５分間７０℃で、次に５分間４８℃で加熟
する。２マイクロリットルのｄＮＴＰ混合物（各ｄＮＴ
Ｐ ２．５ｍＭ）及び１０ＵのＳｅｑｕｅｎａｓｅを付
加し、３７℃で３０分間インキュベートする。Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅを失活させるため、連結反応を１０分間７０
℃で加熱する（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物
学における現行プロトコル）、Ｆ．Ｍ．Ａｓｕｂｅｔ
ｅｔ ａｌ．，８．２．８−８．２．１３，１９８
８）。 【０１５４】プライマとしての２つのオリゴヌクレオチ
ド配列番号２９及び３６及びＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌ
ｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたＰＣＲ反応
において、１マイクロリットルの連結混合物を使用す
る。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩベクター内に連結させ、凍
結した受容能あるＥ．ｃｏｌｉ細胞へと形質転換させ
る。この構成体をｐＣＲＩＩＨ−ＸｈＧＭ−ＣＳＦと呼
称し、ＤＮＡ配列決定により確認する。 【０１５５】プライマとしての２つのオリゴヌクレオチ
ド配列ＩＤ番号４７及び３７を伴ってＶｅｎｔポリメラ
ーゼを用いた第２のＰＣＲ反応においては、連結混合物
１マイクロリットルを用いた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲＩ
Ｉベクター内に連結し、凍結した受容能あるＥ、ｃｏｌ
ｉ細胞へと形質転換させる。この構成体をｐＣＲＩＩＸ
ｈ−ＸｂＧＭ−ＣＳＦと呼称し、ＤＮＡ配列により確認
する。 Ｈ．ＨＢＶＰｒｅ−Ｓ２読取り枠の分離 Ｐｒｅ−Ｓ２読取り枠（Ｓを含む）を、２つのプライマ
及びｐＡＭ６プラスミド（ＡＴＣＣ Ｎｏ．４５０２
０）を用いてＰＣＲ増幅させる。センスプライマは、Ｂ
型肝炎ウイルスのａｄｗ株のヌクレオチド３１７８〜３
１に対応する。センスプライマの５’末端は２つの連続
するＸｈｏＩ制限部位を含んでいる。プライマは、Ｐｒ
ｅ−Ｓ２読取り枠の５’領域であり、ＡＴＧ開始コドン
を含む。 （配列ＩＤ番号４９）５’−３’：ＧＣ ＣＴＣ ＧＡ
Ｇ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＴＣ ＣＴＣＡＧＧ
ＣＣＡ ＴＧＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ Ｃ
ＴＧ ＣＣＴＴＧＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＣ ＴＧＣ
ＡＧＧ 第２のプライマは、アンチセンスヌクレオチド９０７〜
８５９に対応し、５’末端に２つのＣｌａＩ部位を含
む。このプライマはＰｒｅ−Ｓｚ読取り枠の３’領域に
対し相補的である。 （配列ＩＤ番号４９）５’−３’：ＧＣ ＡＴＣ ＧＡ
Ｔ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＴＴ ＣＣＣ ＣＡＡＣＴＴ
ＣＣＡ ＡＴＴ ＡＴＧ ＴＡＧ ＣＣＣ ＡＴＧ Ａ
ＡＧ ＴＴＴＡＧＧ ＧＡＡ ＴＡＡ ＣＣＣ Ｃ ９５７ｂｐのＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩプラスミド内に
連結させ、ＤＮＡ配列決定によって確認し、ｐＣＲＩＩ
ＨＢ−Ｐｒｅ−Ｓ２と呼称する。 Ｉ．ＨＢＶポリメラーゼ読取り枠の分離 ＰＣＲ増幅は、２つのプライマ及びｐＡＭ６プラスミド
（ＡＴＣＣ ４０２０２）を用いて実施される。センス
プライマは、Ｂ型肝炎ウイルスのａｄｗ株のヌクレオチ
ド２３０９〜２３７０に対応する。センスプライマの
５’末端は２つの連続するＸｈｏＩ制限部位を含んでい
る。このプライマは同様に、翻訳のためのＫｏｚａｋ規
則に合致するべくヌクレオチド変更も含んでいる。 （配列ＩＤ番号５０）５’−３’：ＧＣ ＣＴＣ ＧＡ
Ｇ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＣＣＣＴＡ
ＴＣＴ ＴＡＴ ＣＡＡ ＣＡＣ ＴＴＣ ＣＧＧ Ａ
ＡＡ ＣＴＡＣＴＧ ＴＴＧ ＴＴＡ ＧＡＣ ＧＡＣ
ＧＧＧ ＡＣＣ ＧＡＧ ＧＣＡＧＧ 第２のプライマは、アンチセンスヌクレオチド配列１６
４５〜１５９４に対応し、２つのＣｌａＩ部位を５’末
端に含んでいる。このプライマは、ポリメラーゼ読取り
枠の３’領域に対し相補的であり、ＴＧＡ停止コドンを
含む。 （配列ＩＤ番号５１）５’−３’：ＧＣ ＡＴＣ ＧＡ
Ｔ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＡＴＣＴＧ
ＡＴＧ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＧＴ Ｃ
ＧＣ ＣＡＴＧＣＡ ＡＣＧ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＧＴ
Ｇ ２５６４ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩプラスミド内に
連結させ、ＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＲＩＩＨ
Ｂ−ｐｏｌと呼称する。 Ｊ．ＨＢＶＯＲＦ５読取り枠の分離 ２つのプライマ及びｐＡＭ６プラスミド（ＡＴＣＣ ４
５０２０）を用いてＰＣＲ増幅を行なう。センスプライ
マは、Ｂ型肝炎ウイルスのａｄｗ株のヌクレオチド１４
３２〜１４８２に対応する。センスプライマの５’末端
は２つの連続するＸｈｏＩ制限部位を含む。プライマは
同様に、翻訳のためのＫｏｚａｋ規則に合致するべくヌ
クレオチド変更をも含んでいる。 （配列ＩＤ番号５２）５’−３’：ＧＣ ＣＴＣ ＧＡ
Ｇ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＴＣＣＣＧＴ
ＣＧＧ ＣＧＣ ＴＧＡ ＡＴＣ ＣＣＧ ＣＧＧ Ａ
ＣＧ ＡＣＣＣＣＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＧＣＣ ＧＣＴ
ＴＧＧ ＧＡＣ 第２のプライマは、アンチセンスヌクレオチド配列１６
９７〜１６４８に対応し、５’末端に２つのＣｌａＩ部
位を含んでいる。このプライマは、ＯＲＦ５読取り枠の
３’領域に対し相補的であり、ＴＡＡ停止コドンを含ん
でいる。 （配列ＩＤ番号５３）５’−３’：ＧＣ ＡＴＣ ＧＡ
Ｔ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＧＧ ＴＣＧＴＴＧ
ＡＣＡ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＡＡ Ｇ
ＡＧ ＴＣＣＴＣＴ ＴＡＴ ＧＴＡ ＡＧＡ ＣＣ ２９３ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩプラスミド内に連
結させ、ＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＲＩＩＨＢ
−ＯＲＦ５と呼称する。 Ｋ．ＨＢＶＯＲＦ６読取り枠の分離 ２つのプライマ及びｐＡＨ６プラスミド（ＡＴＣＣ ４
５０２０）を用いてＰＣＲ増幅を行なう。センスプライ
マは、Ｂ型肝炎ウイルスのａｄｗ株のヌクレオチド１８
４４〜１７８８に対応する。センスプライマの５’末端
は、２つの連続したＸｈｏＩ制限部位を含む。このプラ
イマは同様に、翻訳のためのＫｏｚａｋ規則に合致する
ようヌクレオチド変更をも含んでいる。 （配列ＩＤ番号５４）５’−３’：ＧＣ ＣＴＣ ＧＡ
Ｇ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＴＴＡＧＧ
ＣＡＧ ＡＧＧ ＴＧＡ ＡＡＡ ＡＧＴ ＴＧＣ Ａ
ＴＧ ＧＴＧＣＴＧ ＧＴＧ ＣＧＣ ＡＧＡ ＣＣＡ
ＡＴＴ ＴＡＴ ＧＣＣ 第２のプライマは、アンチセンスヌクレオチド配列１１
８８〜１２４０に対応し、２つのＣｌａＩ部位を５’末
端に含む。このプライマは、ＯＲＦ６読取り枠の３’領
域に対し相補的であり、ＴＡＡを含んでいる。 （配列ＩＤ番号５５）５’−３’：ＧＣ ＡＴＣ ＧＡ
Ｔ ＡＴＣ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＡＣ ＧＣＡＡＣＣ
ＣＣＣ ＡＣＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＧＧＣ ＴＴＡ Ｇ
ＣＣ ＡＴＡＧＧＣ ＣＡＴ ＣＡＧ ＣＧＣ ＡＴＧ
ＣＧ ６８７ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩプラスミド内に連
結させ、ＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＣＲＩＩＨＢ
−ＯＲＰ６と呼称する。 【０１５６】例３ Ａ．ＨＢＶＸ抗原の分離 Ｂ型肝炎ウイルスＸ読取り枠を含む６１２ｂｐのＮｃｏ
Ｉ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＭ６プラスミド（ａ
ｄｗ）（ＡＴＣＣ ４５０２０）から得、クレノウフラ
グメントにより平滑にし、ＳＫ+のＨｉｎｃＩＩ部位
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ）内に連結させる。このプラスミドをＳＫ
−ＸＡｇと呼ぶ。 【０１５７】ＳＫ−ＸＡｇベクター構成体を用いてＥ．
ｃｏｌｉ（ＤＨ５アルファ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ）を形質転換し、増殖させてプラスミド
ＤＮＡを生成する。このプラスミドを次に、基本的にＢ
ｉｒｎｂｏｉｍ ｅｔ ａｌにより記述されているとお
りに（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．７：１５１３，１９
７９；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ，Ｓｏｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８９）分離し精製する。 Ｂ．ＨＢＶＸ抗原の切形化 切形ＸＡｇを生成するため、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を用いた枠内欠失によりＴＡＧ停止コドンを挿入
する（例２Ｃ）。次に切形Ｘ遺伝子をＳＫ+のＨｉｎｃ
ＩＩ部位内に挿入する。このプラスミドをＳＫ−ＤＸＡ
ｇと呼称する。Ｆａｋｔｏｒ ｅｔ ａｌ．（Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ ５：８６７−８７２，１９９０）により記述
されている検定を用いて突然変異体を確認する。 【０１５８】例４ Ａ．レトロウイルスバックボーンＫＴ−３の調製 Ｎ２ベクターからのｇａｇ配列を含むモロニーマウス白
血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）の５’の長末端反復（ＬＴ
Ｒ）（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉ
ｒ．６１：１６４７−１６５０，１９８７：Ｅｇｌｉｔ
ａｓ ｅｔ ａ１．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９
５−１３９８，１９８５）をプラスミドＳＫ+（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）内に連結させる。結果として得られた構成体をＮ
２Ｒ５と呼称する。ＡＴＧ開始コドンをｇａｇ発現を防
ぐＡＴＴに変えるための部位特異的インビトロ突然変異
誘発により、Ｎ２Ｒ５構成体を突然変異させる。この突
然変異誘発を受けたフラグメントは、長さが２００塩基
対（ｂｐ）であり、ＰｓｔＩ制限部位によりフランキン
グされている。ＰｓＩ−ＰｓＩ突然変異を受けたフラグ
メントは、ＳＫ+プラスミドから精製され、プラスミド
ｐＵＣ３１内のＮ２ＭｏＭＬＶ５’ＬＴＲのＰｓｔＩ部
位内に挿入されて突然変異を受けない２００ｂｐフラグ
メントを置換する。プラスミドｐＵＣ３１はｐＵＣ１９
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ）から誘導され、この中で、ポリリンカー
のＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位の間に付加的な制限部位Ｘ
ｈｏＩ、ＢｇｌＩ，ＢｓｓＨＩＩ及びＮｃｏＩが挿入さ
れる。この構成体をｐＵＣ３１／Ｎ２Ｒ５ｇＭと呼称す
る。 【０１５９】Ｎ２からの１．０キロベース（ｋｂ）のＭ
ｏＭＬＶ３’ＬＴＲ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメ
ントをプラスミドＳＫ+へとクローニングし、結果とし
てＮ２Ｒ３-と呼ばれる構成体が得られる。この構成体
から１．０ｋｂ ＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トを精製する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
遺伝子の発現を駆動するＳＶ４０早期プロモータを含む
ｐＡＦＶＸＭレトロウイルスベクターからのＣｌａＩ−
ＣｌａＩ優性選択可能標識遺伝子フラグメント（Ｋｒｉ
ｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３８：４８３，
１９８４；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ
８５：３１５０−３１５４，１９８８）をＳＫ+プラ
スミド内ヘクローニングさせる。ＳＫ+プラスミドから
１．３ｋｂのＣｌａＩ−ＢｓｔＢＩ遺伝子フラグメント
が精製される。 【０１６０】発現ベクターは、問題の遺伝子を含むＸｈ
ｏＩ−ＣｌａＩフラグメント及び１．０ｋｂのＭｏＭＬ
Ｖ３’ＬＴＲ ＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
がｐＵＣ３１／Ｎ２Ｒ５ｇＭプラスミドのＸｈｏＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ部位の中に挿入される３部分連結によって
構築される。ｐＡＦＶＸＭレトロウイルスベクターから
の１．３ｋｂのＣｌａＩ−ＢｓｔＢＩ ｎｅｏ遺伝子フ
ラグメントを次に、センス配位でこのプラスミドのＣｌ
ａＩ部位の中に挿入する。Ｂ．レトロウイルスバックボ
ーンＫＴ−１の調製ＫＴ−１レトロウイルスバックボー
ンベクターは、優性選択可能標識遺伝子ｎｅｏが発現ベ
クター内に挿入されない点を除いて、基本的に例４Ａに
おいてＫＴ−３について記述されたものと同様に構築さ
れる。 【０１６１】例５ レトロウイルスベクターの構築 Ａ．Ｂ型肝炎ウイルスｅ−ｃレトロウイルスベクターの
構築 次に、ＫＴ−３レトロウイルスベクターバックボーンの
ＸｈｏＩ及びＣ１ａＩ部位の中に、例２ＡのＳＫ+ＨＢ
ｅ−ｃからの７８７ｂｐのＸｈｏＩ−ＣｌａＩフラグメ
ントを連結させる。この構成体をＫＴ−ＨＢｅ−ｃと呼
称する。 Ｂ．Ｂ型肝炎ウイルスコアレトロウイルスベクターの構
築 長さが約６００ｂｐの例２ＢからのＰＣＲ産物をＸｈｏ
Ｉ及びＣｌａＩ制限エンドヌクレアーゼで消化させ、
１．５％のアガロースゲルを通して電気泳動させ、Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎＩＩ（Ｂｉｏｌｏｌ，Ｖｉｓｔａ，Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）によりゲル切片からＤＮＡを精製す
る。このＸｈｏＩ−ＣｌａＩ ＨＢＶコアＰＣＲ産物を
ＫＴ−３レトロウイルスベクターバックボーンのＸｈｏ
Ｉ及びＣｌａＩ部位内に挿入する。構成体をＫＴ−ＨＢ
ｃと呼称する。 【０１６２】ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ+ＩＩ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ）のそれぞれの部位内にＫＴ−ＨＢｃからのＨ
ＢＶコアフラグメント（ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ）を挿入す
る。この構成体を、ＫＳ+ＩＩ ＨＢｃと呼称し、ＤＮ
Ａ配列決定により確認する。 Ｃ．Ｃ型肝炎ウイルスコアレトロウイルスベクターの構
築 ｐＳＰ７２のそれぞれの部位内にｐＣＲＩＩＸｈ−ＨＨ
ＣＶコアからのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
を挿入する。この構成体をｐＳＰ７２Ｘｈ−ＨＨＣｃと
呼称する。次にｐＳＰ７２Ｘｈ−ＨＨＣｃからのＸｈｏ
Ｉ−ＣｌａＩフラグメントを切除し、ＫＴ−３バックボ
ーン内に挿入する。この構成体をＫＴ−ＨＣｃと呼称す
る。 Ｄ．Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３／ＮＳ４レトロウイルスベ
クターの構築 ｐＣＲＩＩＸｈ−ＨＨＣＶＮＳ３／ＮＳ４からのＸｈｏ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＳＰ７２のそれぞ
れの部位に挿入する。この構成体をｐＳＰ７２Ｘｈ−Ｈ
ＨＣＶＮＳ３／ＮＳ４と呼称する。ｐＳＰ７２Ｘｈ−Ｈ
ＨＣＶＮＳ３／ＮＳ４からのＸｈｏ−Ｉ−ＣｌａＩフラ
グメントを次に切除し、ＫＴ−３バックボーン内に挿入
する。この構成体をＫＴ−ＨＣＶＮＳ３／ＮＳ４と呼称
する。 Ｅ．Ｂ型肝炎ウイルスＸレトロウイルスベクターの構築 例３ＡからのＳＫ−ＸＡｇ読取り枠を、それがＳＫ+マ
ルチクローニング部位内に存在するＸｈｏＩ及びＣｌａ
Ｉ部位との関係において頭から尾部への配位となるよう
に制限酵素分析によって配位についてチェックする。次
に正しい配位をもつＳＫ−ＸＡｇからのＸ読取り枠をＸ
ｈｏＩ及びＣｌａＩにより切除し、ＫＴ３バックボーン
のそれぞれの部位の中に挿入する。この構成体をＫＴ−
ＨＢ−Ｘと呼称する。 Ｆ．Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ−Ｓ２レトロウイルスベク
ターの構成体 ＰＣＲＩＩＰｒｅ−Ｓ２からのＸｈｏＩ−ＣｌａＩフラ
グメントを切除し、ＫＴ３バックボーンのそれぞれの部
位に挿入する。この構成体をＫＴ−ＨＢ−Ｐｒｅ−Ｓ２
と呼ぶ。 Ｇ．Ｂ型肝炎ウイルスポリメラーゼレトロウイルスベク
ターの構築 ｐＣＲＩＩＨＢ−ｐｏｌからのＸｈｏＩ−ＣｌａＩフラ
グメントを切除しＫＴ３バックボーンのそれぞれの部位
内に挿入する。この構成体をＫＴ−ＨＢ−ｐｏｌと呼称
する。 Ｈ．Ｂ型肝炎ウイルスＯＲＦ５レトロウイルスベクター
の構築 ｐＣＲＩＩＨＢ−ＯＲＦ−５からのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ
フラグメントを切除し、ＫＴ３バックボーンのそれぞれ
の部位の中に挿入する。この構成体をＫＴ−ＨＢ−ＯＲ
Ｆ５と呼称する。 Ｉ．Ｂ型肝炎ウイルスＯＲＦ６レトロウイルスベクター
の構築 ｐＣＲＩＩＨＢ−ＯＲＦ−６からのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ
フラグメントを切除し、ＫＴ３バックボーンのそれぞれ
の部位の中に挿入する。この構成体をＫＴ−ＨＢ−ＯＲ
Ｆ６と呼称する。 【０１６３】例６ 多価レトロウイルスべクターの構築 Ａ．Ｂ型肝炎ｅ／ＧＭ−ＣＳＦレトロウイルスベクター
の構築 ｉ．ＩＲＢＳを伴う多価レトロウイルスベクター ｐＧＥＭ５Ｚ+ＢＩＰ５’（Ｐｅｔｅｒ Ｓａｒｎｏ
ｗ、コロラド大学保健科学センター、Ｄｅｎｖｅｒ、ヒ
ト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質）をＳａｃＩ及び
ＳｐｈＩで消化させる、２５０ｂｐのＢＩＰフラグメン
トを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離し、
ｐＳＰ７２のそれぞれの部位の中ヘサブクローニングす
る。このベクター構成体をｐＳＰ７２ＢＩＰと呼ぶ。 【０１６４】ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ ＧＭ−ＣＳＦ
フラグメントをｐＣＲＩＩＨ−ＸｈＧＭ−ＣＳＦから切
除し、ｐＳＰ７２ＢＩＰのＨｉｎｄＩＩＩ一ＸｈｏＩ部
位内にサブクローニングする。この構成体をｐＳＰ７２
ＢＩＰ−ＧＭ−ＣＳＦと呼称する。 【０１６５】構成体ｐＳＰ７２ＢＩＰＧＭ−ＣＳＦをＸ
ｈｏＩ部位で分割させ、クレノウフラグメントにより平
滑化し、ひきつづきＣｌａＩでの分割を行なう。ＫＴ−
１バックボーンをＣｌａＩにより分割させ、クレノウフ
ラグメントで平滑化し、ひきつづきＸｈｏＩ制限エンド
ヌクレアーゼで分割を行なう。３部分連結において、Ｓ
Ｋ+ＨＢｅ−ｃからのＸｈｏＩ−ＣｌａＩフラグメント
（例２Ａ）及びＣｌａＩ平滑化を受けたＸｈｏＩＢＩＰ
−ＧＭ−ＣＳＦフラグメントをＫＴ−１レトロウイルス
バックボーンのＸｈｏＩ平滑化を受けたＣｌａＩ部位の
中に連結させる。この構成体をＫＴ−ＨＢｅ−ｃ／ＢＩ
Ｐ−ＧＭ−ＣＳＦと呼称する。 ｉｉ．ＣＭＶプロモータを伴う多価レトロウイルスベク
ター ｐＡＦ／ＣＭＶ／ＥｎｖR（米国特許出願Ｎｏ．０７／
３９５，９３２）から４．７ｋｂのＣＭＶＥｎｖRＰｓ
ｔ−ＲＩフラグメントを分離し、ｐＵＣ１８のＰｓｔＩ
及びＥｃｏＲＩ部位の中に挿入する。この構成体をｐＵ
Ｃ１８ＣＭＶＥｎｖRと呼称する。 【０１６６】ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ+／ＣＡ
Ｒを生成するためｐＡＦ／ＣＭＶ／ＥｎｖRからｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＢａｍＨＩ
部位内へＳａｕ３ＡフラグメントとしてＨＩＶ−１ Ｉ
ＩＩB ＣＡＲをサブクローニングする。ＳＫ+ｇａｇ／
ｐｏｌＳＤデルタ（米国特許出願Ｎｏ．０７／３９５，
９３２）からＸｈｏＩ−ＸｂａＩ ＨＩＶ−１ ＩＩＩ
B ｇａｇ／ｐｏｌフラグメントを切除する。ＣＭＶプロ
モータを含むプラスミドバックボーンを、ＸｈｏＩ及び
ＣｌａＩを用いてｐＵＣ１８ＣＭＶ／ＥｎｖRから切除
する。３部分連結において、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ ＨＩ
Ｖ ＩＩＩBｇａｇ−ｐｏｌフラグメント及びＸｂａＩ
−ＣｌａＩ ＣＡＲフラグメントをｐＵＣ１８ＣＭＶ／
ＥｎｖRバックボーンのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位内に挿
入してｐＵＣ１８ＣＭＶｇａｇ／ｐｏｌ／ＣＡＲを生成
する。 【０１６７】ｐＵＣ１８ＣＭＶ−ｇａｇ／ｐｏｌ／ＣＡ
ＲからのＣＭＶＩＥプロモータを含むＨｉｎｄＩＩＩ−
ＸｈｏＩフラグメントをｐＣＤＮＡＩＩのそれぞれの部
位の中にサブクローニングする。この構成体をｐＣＤＮ
Ａ ＩＩ ＣＭＶと呼称する。 【０１６８】ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ ＧＭ−ＣＳＦ ＰＣ
Ｒ産物をｐＣＲＩＩＸｈ−ＸｂＧＭ−ＣＳＦからサブク
ローニングしｐＣＤＮＡＩＩ−ＣＭＶ内のそれぞれの部
位内に挿入する。この構成体をｐＣＤＮＡ ＩＩ ＣＭ
Ｖ−ＧＭ−ＣＳＦと呼称する。 【０１６９】ｐＣＤＮＡ ＩＩ ＣＭＶ ＧＭ−ＣＳＦ
構成体をＸｂａＩ部位で分割させ、クレノウフラグメン
トにより平滑化させ、ひきつづきＨｉｎｄＩＩＩでの分
割を行なう。ＫＴ−１バックボーンをＣｌａＩにより分
割させ、クレノウフラグメントで平滑化し、その後、Ｘ
ｈｏＩでの分割を行なう。３部分連結においては、ＳＫ
+ＨＢｅ−ｃからのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ント（例２Ａ）及びＨｉｎｄＩＩＩで平滑化されたＸｂ
ａＩ ＣＭＶ−ＧＭ−ＣＳＦフラグメントを、ＫＴ−１
レトロウイルスバックボーンのＸｈｏＩで平滑化された
ＣｌａＩ部位に連結させる。このベクター構成体をＫＴ
−ＨＢｅ−ｃ／ＣＭＶ−ＧＭ−ＣＳＦと呼称する。 Ｂ．Ｃ型肝炎コア／ＩＬ−２レトロウイルスベクターの
構築 ｉ．ＩＲＢＳを伴う多価レトロウイルスベクター ｐＣＲＩＩＨ−ＸｈＩＬ−２からＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｈ
ｏＩ ＩＬ−２配列を切除し、ｐＳＰ７２ＢＩＰのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位へとサブクローニングする。
この構成体をｐＳＰ７２ＢＩＰＩＬ−２と呼称する。Ｘ
ｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＣ型肝炎ウイルスコア配列（例
２Ｃ）をｐＣＲＩＩ Ｘｈ−ＨＨＣＶＣコアから切除
し、ｐＳＰ７２のそれぞれの部位へとサブクローニング
する。この構成体をｐＳＰ７２Ｘｈ−ＨＨＣＶコアと呼
称する。 【０１７０】構成体ｐＳＰ７２ＢＩＰ−ＩＬ２をＸｈｏ
Ｉ部位で分割し、クレノウフラグメントにより平滑化
し、その後ＥｃｏＲＩでの分割を行なう。ＸｈｏＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ ＨＣＶコアフラグメントをｐＳＰ７２Ｘｈ−
ＨＨＣＶコアから分離させる。ＫＴ−１バックボーンを
ＣｌａＩにより分割し、クレノウフラグメントで平滑化
し、その後ＸｈｏＩでの分割を行なう。３部分連結で
は、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩＨＣＶコアフラグメント及び
ＥｃｏＲＩ−平滑化されたＸｈｏＩＢＩＰ−ＩＬ−２フ
ラグメントをＫＴ−１レトロウイルスバックボーンのＸ
ｈｏＩ−平滑化されたＣｌａＩ部位内に連結させる。こ
のベクター構成体をＫＴ−ＨＣＶコア／ＢＩＰ−ＩＬ２
と呼称する。 ｉｉ．ＣＭＶプロモータを伴う多価レトロウイルスベク
ター ｐＣＲＩＩＸｈ−ＡＩＬ−２からＸｈｏＩ−ＡｐａＩ
ＩＬ−２フラグメントを切除し、ｐＣＤＮＡＩＩ−ＣＭ
Ｖプロモータのそれぞれの部位へとサブクローニングす
る。この構成体をｐＣＤＮＡＩＩＣＭＶ−ＩＬ−２と呼
称する。 【０１７１】ＫＴ−１バックボーンをＣｌａＩにより分
割させクレノウフラグメントで平滑化し、その後Ｘｈｏ
Ｉでの分割を行なう。構成体ｐＣＤＮＡＩＩＣＭＶ−Ｉ
Ｌ−２をＡｐａＩ部位で分割し、クレノウフラグメント
で平滑化し、その後ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレア
ーゼでの分割を行なう。３部分連結においては、ｐＣＲ
ＩＩＸｈ−ＨＨＣＶコアからのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ ＨＣＶコアフラグメント及びＨｉｎｄＩＩＩ−平滑
化されたＡｐａＩ ＣＭＶＩＬ−２フラグメントをＫＴ
−１レトロウイルスバックボーンのＸｈｏＩ平滑化され
たＣｌａＩ部位内に連結させる。このベクター構成体を
ＫＴ−ＨＣＶコア／ＣＭＶＩＬ−２と呼称する。 Ｃ．Ｂ肝炎コア／Ｂ７／ＢＢ１レトロウイルスベクター
の構築 ｉ．ＩＲＢＳを伴う多価レトロウイルスベクター ｐＣＲＩＩＨ−ＸｈＢ７／ＢＢ１からＨｉｎｄＩＩＩ−
ＸｈｏＩＢ７／ＢＢ１配列を切除し、ｐＳＰ７２ＢＩＰ
のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位へとサブクローニング
する。この構成体をｐＳＰ７２Ｈ−ＸｈＢＩＰ−Ｂ７／
ＢＢ１と呼称する。 【０１７２】構成体ｐＳＰ７２Ｈ−ＸｈＢＩＰ−Ｂ７／
ＢＢ１をＸｈｏＩ部位で分割させ、クレノウフラグメン
トにより平滑化し、その後ＣｌａＩでの分割を行なう。
例５ＢのＫＳＩＩ+ＨＢＶコアからＸｈｏ−Ｉ−Ｃｌａ
Ｉ ＨＢＶコアフラグメントを分離する。ＫＴ−１バッ
クボーンをＣｌａＩにより分割させ、クレノウフラグメ
ントで平滑化させ、その後ＸｈｏＩでの分割を行なう。
３部分連結においては、ＸｈｏＩ−ＣｌａＩＨＢＶコア
フラグメント及びＣｌａＩで平滑化されたＸｈｏＩＢＩ
Ｐ−Ｂ７／ＢＢ１フラグメントを、ＫＴ−１レトロウイ
ルスバックボーンのＸｈｏＩで平滑化されたＣｌａＩ部
位内に連結させる。このベクター構成体をＫＴ−ＨＢＶ
コア／ＢＩＰ−Ｂ７／ＢＢ１（例８）と呼称する。 ｉｉ．ＣＭＶプロモータを伴う多価レトロウイルスベク
ター ＸｈｏＩ−ＡｐａＩＢ７／ＢＢ１配列をｐＣＲＩＩＸｈ
−ＡＢ７／ＢＢ１から切除し、ｐＣＤＡＩＩ−ＣＭＶプ
ロモータのそれぞれの部位へとサブクローニングする。
この構成体をｐＣＤＮＡＩＩＣＭＶ−Ｂ７／ＢＢ１と呼
称する。 【０１７３】ＫＴ−１バックボーンをＣｌａＩにより分
割させ、クレノウフラグメントで平滑化させ、その後Ｘ
ｈｏＩでの分割を行なう。構成体ｐＣＤＮＡＩＩＣＭＶ
−Ｂ７／ＢＢ１をＡｐａＩ部位で分割させ、クレノウフ
ラグメントにより平滑化させ、その後ＨｉｎｄＩＩＩ制
限エンドヌクレアーゼでの分割を行なう。３部分連結で
は、ＫｓＩＩ+ＨＢＶコアからのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ ＨＢＶコアフラグメント及びＨｉｎｄＩＩＩで平
滑化されたＡｐａＩ ＣＭＶＢ７／ＢＢ１フラグメント
をＫＴ−１レトロウイルスバックボーンのＸｈｏＩで平
滑化されたＣｌａＩ部位内に連結する。このベクター構
成体をＫＴ−ＨＢＶコア／ＣＭＶＢ７／ＢＢ１と呼称す
る。 Ｄ．Ｂ型肝炎ｅ／Ｃ型肝炎コアレトロウイルスベクター
の構築 ｉ．ＩＲＢＳを伴う多価レトロウイルスベクター 例２ＣのｐＣＲＩＩＨ−ＸｈＨＣＶコアからＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＸｈｏＩ ＨＣＶコア ＰＣＲ産物をサブクロー
ニングし、ｐＳＰ７２−ＢＩＰ内のそれぞれの部位の中
に挿入する。この構成体をｐＳＰ７２ＢＩＰ−ＨＣＶコ
アと呼称する。 【０１７４】構成体ｐＳＰ７２ＢＩＰ−ＨＣＶコアをＸ
ｈｏＩ部位で分割し、クレノウフラグメントで平滑化
し、その後ＣｌａＩでの分割を行なう。ＫＴ−１バック
ボーンをＣｌａＩにより分割させ、クレノウフラグメン
トで平滑化し、その後ＸｈｏＩでの分割を行なう。３部
分連結ではＳＫ+ＨＢｅ−ｃ（例２Ａ）からのＸｈｏＩ
−ＣｌａＩ ＨＢＶｅフラグメント及びＣｌａＩで平滑
化されたＸｈｏＩ ＢＩＰＨＣＶコアフラグメントは、
ＫＴ−１レトロウイルスバックボーンのＸｈｏＩで平滑
化されたＣｌａＩ部位内に連結される。このベクター構
成体をＫＴ−ＨＢＶｅ／ＢＩＰＨＣＶコアと呼称する。 ｉｉ．ＣＭＶプロモータを伴う多価レトロウイルスベク
ター ｐＳＰ７２Ｘｈ−ＨＨＣＶコア（例６Ｂｉ）からのＸｈ
ｏＩ−ＸｂａＩＨＣＶコアフラグメントをｐＣＤＮＡＩ
ＩＣＭＶプラスミドのそれぞれの部位の中に挿入する。
この構成体をｐＣＤＮＡＩＩＣＭＶＨＣＶコアと呼称す
る。 【０１７５】構成体ｐＣＤＮＡＩＩＣＭＶＨＣＶコア
を、ＸｂａＩ部位で分割し、クレノウフラグメントによ
り平滑化し、その後ＨｉｎｄＩＩＩでの分割を行なう。
ＫＴ−１バックボーンをＣｌａＩにより分割させ、クレ
ノウフラグメントで平滑化させ、その後ＸｈｏＩによる
分割を行なう。３部分連結では、ＳＫ+ＨＢｅ−ｃから
のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＨＢＶｅ配列（例２Ａ）、
つまりＨｉｎｄＩＩＩ−平滑化されたＸｈａＩＣＭＨＣ
Ｖコアフラグメントは、ＫＴ−１レトロウイルスバック
ボーンのＸｈｏＩ−平滑化されたＣｌａＩ部位の中に連
結される。このベクター構成体をＫＴ−ＨＢＶｅ／ＣＭ
ＶＨＣＶコアと呼称する。 【０１７６】例７ パッケージング細胞系統ＨＸ及びＤＡの過渡的トランス
フェクション及び形質導入 Ａ．プラスミドＤＮＡトランスフェクション ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び１０％
のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて、１日目に１０ｃｍ
の組織培養皿上に５×５5の細胞の割合でＤＸ細胞（Ｗ
０９２／０５２６６）を播種する。２日目に、トランス
フェクションの４時間前に５．０ｍｌの新鮮培地で培地
を交換する。合計体積４００μｌとなるまで４０．０μ
ｌの２．５ＭＣａＣｌ2、１０μｇのプラスミドＤＮＡ
及び脱イオン水を混合することによって、標準リン酸カ
ルシウム−ＤＮＡ共沈を行なう。４００μｌの沈降緩衝
液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７，１：
０．２５ＭのＮａＣｌ及び１．５ｍｌのＮａ2ＨＰＯ4−
ＮａＨ2ＰＯ4）になるまで、常時攪拌しながら４００マ
イクロリットルのＤＮＡ−ＣａＣｌ2溶液を滴下により
付加する。この混合物を１０分間室温でインキュベート
する。結果として得られた細かい沈降物を細胞の培養皿
に付加する。３７℃で一晩ＤＮＡ沈降物と共に細胞をイ
ンキュベートする。３日目に、培地を吸収し、新鮮培地
を付加する。ウイルスを含む上清を４日目に除去し、
０．４５μのフィルタに通し、ＤＡパッケージング細胞
系統のマウス線維芽細胞を感染させるのに使用するか又
は−８０℃で保管する。 Ｂ．パッケージング細胞系統の形質導入 １０ｍｌＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ、４μｇ／ｍｌポリ
ブレン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕ
ｒｉ）の中で１０日目に１ｃｍの組織培養皿あたり５×
ｌ０5の細胞の割合でＤＡ（ＷＯ９２／０５２６６）細
胞を播種する。２日目に、収集したばかりのウイルスを
含むＤＸ培地を３．０ml、１．０ｍｌ及び０．２ｍｌ、
細胞に付加する。３７℃で一晩、細胞をウイルスと共に
インキュベートする。３日目に、培地を除去し、８００
μｇ／ｍｌのＧ４１８を伴う１ｍｌのＤＭＥＭ、１０％
ＦＢＳを平板に付加する。ベクターでのトランスフェク
ションを受け ｎｅｏ選択可能標識を含む細胞だけが生
き残ることになる。Ｇ４１８耐性プールを、一週間の期
間にわたり生成する。このプールを、記述どおり（例１
１）発現についてテストする。平板から細胞を除去し細
胞懸濁を計数し、１０細胞／ｍｌに至るまで細胞癒濁液
を希釈し、９６ウエルの平板の各ウエル（１細胞／ウエ
ル）に０．１ｍｌ付加することにより、細胞プールを希
釈クローニングする。１４日間３７℃、１０％ＣＯ2で
細胞をインキュベートする。２４のクローンを選択し、
２４ウエル平板、６ウエル平板次に１０ｃｍ平板まで拡
張させ、その時点で発現についてクローンを検定し、上
清を収集して、ウイルス力価について検定する。 【０１７７】ＨＴ1０８０細胞、ヒト線維芽細胞系統Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ１２１の感染により、個々のクローンの
力価を決定する。１日目に、３．０ｍｌのＤＭＥＭ、１
０％ＦＢＳ及び４μｇ／ｍｌのポリブレンの中で６ウエ
ルのマイクロタイター平板の各ウエル上に５×１０5の
ＨＴｌ０８０細胞を平板固定する。各クローンからの上
清を１０倍に階段希釈し、１．０ｍｌのアリコート内で
ＨＴ１０８０の細胞を感染させるのに用いる。３７℃、
１０％ＣＯ2でベクターと共に細胞をインキュベート
し、２日目に新鮮なＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ培地で培地
を交換する。３日目に、培地を８００μｇ／ｍｌのＧ４
１８を含む新しいＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ培地で交換す
ることによって、形質導入された細胞の選択を行なう。
１４日間３７℃、１０％ＣＯ2で細胞をインキュベート
し、その時点でＧ４１８耐性コロニーを各希釈倍数にて
評点してコロニー形成単位／ｍｌ（ｃｆｕ／ｍｌ）とし
て各クローンのウイルス力価を決定する。 【０１７８】これらの手順を用いて、ＨＢＶコア及びＨ
ＢＶｅ産生細胞系統の力価が以下のとおりであることを
示すことができる： ＤＡｃｏｒｅ−１ ８×１０5ｃｆｕ／ｍｌ ＤＡｃｏｒｅ−１０ １×１０6ｃｆｕ／ｍｌ ＤＡＨＢｅ４−７ ３×１０6ｃｆｕ／ｍｌ ＤＸ上清からのＤＡ細胞の形質導入について記述されて
いるのと同じ要領でＤＡベクター産生細胞系統から生成
されたベクターを用いて、パッケージング細胞系統Ｈ
Ｘ、Ｗ０９２／０５２６６を形質導入する。 【０１７９】ｎｅｏ選択可能標識が欠如している多価ベ
クターでのＤＡ（Ｗ０９２／０５２６６）細胞の形質導
入のためには、上述のような感染手順が用いられる。し
かしながら、３日目に細胞にＧ４１８を付加するのでは
なく、上述のとおり希釈度を制限することにより細胞を
クローニングする。以上で説明したように発現のため５
０のクローンを拡張させ、例９に記されているとおりに
力価が検定する。 【０１８０】例８ 複製受容能あるレトロウイルスの検出 拡張したＳ+Ｌ-検定は、問題の細胞系統の上清内に複製
受容能ある伝染性ウイルスが存在するか否かを決定す
る。この検定は、伝染性レトロウイルスが指示細胞系統
ＭｉＣｌ1（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６４．１）上にフォーカ
スを生成するという経験的観察に基づくものである。Ｍ
ｉＣｌ1細胞系統は、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ）で
の形質導入によりＭｖ１Ｌｕミンク細胞系統（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ６４）から導入される。これは、ＭＳＶゲノム
の存在を示す肉腫を形成する（Ｓ+）ものの複製受容能
あるウイルスの不在を示す白血病をひき起こさない（Ｌ
-）マウス肉腫プロウイルスを含む、非産生的で形質転
換を受けていない復帰変異体クローンである。複製受容
能あるレトロウイルスでのＭｉＣｌ1細胞の感染は、Ｍ
ＳＶゲノムを「活性化」して、フォーカス形成という結
果をもたらす「形質転換」を誘発させる。 【０１８１】複製受容能あるレトロウイルスの存在につ
いてテストするべく細胞系統から上清をとり出し０．４
５μのフィルタを通して全ての細胞を除去する。１日目
に、２ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び８μｇ／ｍ１
のポリブレンの中で６ウエルの平板のウエル１つあたり
１×１０5細胞（テストすべき試料１つあたり１ウエ
ル）の割合でＭｖ１Ｌｕ細胞を播種する。別々の６ウエ
ル平板上に正及び負の対照について同じ要領でＭｖ１Ｌ
ｕ細胞を平板固定する。細胞を一晩３７℃、１０％ＣＯ
2でインキューべ一トさせる。２日目に１．０ｍｌのテ
スト用上清をＭｖ１Ｌｕ細胞に付加する。１．０ｍｌの
培地と共に負の対照平板をインキュベートする。正の対
照は、正の対照ウエル内の細胞に付加されるＭＡウイル
ス（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ１．５：４３１−４３７，１９８５）
の３つの希釈液（各々１．０ｍｌの培地中２００フォー
カス形成単位（ｆｆｕ）、２０ｆｆｕ及び２ｆｆｕ）か
ら成る。細胞を一晩インキュベートする。３日目に、培
地を吸引し、３．０ｍｌの新鮮ＤＭＥＭ及び１０％のＦ
ＢＳを細胞に付加する。細胞を集密性に至るまで成長さ
せ、６日目と１０日目に１：１０に分裂させ、複製受容
能あるレトロウイルスがあればそれを増幅させる。１３
日目に、Ｍｖ１Ｌｕ細胞上の培地を吸引し、２．０ｍｌ
のＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを細胞に付加する。さら
に、２．０ｍｌのＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ及び８μｇ
／ｍｌのポリブレン内で１ウエルあたり１×１０5の細
胞の割合でＭｉＣｌ1細胞を播種する。１４日目にＨｖ
１Ｌｕ細胞からの上清をＭｉＣｌ1細胞の対応するウエ
ルに移し、３７℃、１０％ＣＯ2で一晩インキュベート
する。１５日目に、培地を吸引し、３．０ｍｌの新鮮な
ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを細胞に付加する。２１日
目に、細胞の単層上の（単層にはびこり付着した状態に
とどまる群がった免疫性の細胞として現われる）フォー
カス形成について１０倍の倍率で顕微鏡を通して細胞を
検査する。ＭｉＣｌ1細胞上にフォーカスが現われた場
合、その供試体は複製受容能あるレトロウイルスに汚染
されているものと決定される。 【０１８２】これらの手順を用いて、ＨＢＶコア産生細
胞系統ＤＡｃｏｒｅ−１，ＤＡｃｏｒｅ−１０及びＨＢ
Ｖｅ産生細胞系統ＤＡＨＢｅ４−７が複製受容能あるレ
トロウイルスにより汚染されていないことを示すことが
できる。 【０１８３】例９ 多価ベクターの滴定 多価ベクターはネオマイシン遺伝子といった選択可能標
識を含んでいないことから、ベクターを滴定するもう１
つの方法が記述される。より特定的には、１０ -9ｍｌの
最終希釈度になるまで１．０ｍｌのベクター上清を５倍
希釈させる。次に各希釈液を１ミリリットルずつ用い
て、基本的に例７Ｂに記されているように５×１０5の
ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ１２１）を
形質導入する。ただし、Ｇ４１８を付加する代りにＷｉ
ｌｌｉｓ（Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ２５９：７８４２−
７８４９，１９８４）により記述されているように７日
後に各皿からＤＮＡを抽出する。Ｇｅｎｓｅｔ（フラン
ス，パリ）から得た以下のＰＣＲプライマを用いてＰＣ
ＲによりＨＢＶｅ／ｃｏｒｅを増幅させる。 【０１８４】ＨＢＶｅ／ｃｏｒｅのためのＰＣＲ増幅
は、ａｄｗクローンのヌクレオチド配列１８６５〜１８
８９に対応するセンスプライマを用いて行なわれる。 【０１８５】（配列ＩＤ番号３８）５’−３’：ＴＴＣ
ＡＡＧ ＣＣＴ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＧＴ ＧＣＣ
ＴＴＧ Ｇ このプライマはａｄｗクローンのアンチセンスヌクレオ
チド配列２４３０〜２４０９に対応する。 【０１８６】（配列ＩＤ番号３９）５’−３’：ＴＣＴ
ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＧＧ ＣＧＡ ＴＴＧ ＡＧＡ 望ましいＰＣＲ産物の存在を確認するのに用いられるプ
ロープ配列で、Ｂ型肝炎ウイルスのａｄｗ株のヌクレオ
チド配列１９２６〜１９０７に対応する。 【０１８７】（配列ＩＤ番号４０）５’−３’：ＧＧＡ
ＡＡＧ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＡ Ｃ型肝炎コアのためのＰＣＲ増幅は、ＨＣＶ−Ｊのヌク
レオチド配列３２８〜３４２に対応するセンスプライマ
を用いて行なわれる。 【０１８８】（配列ＩＤ番号４１）５’−３’：ＣＡＴ
ＧＡＧ ＣＡＣ ＡＡＡ ＴＣＣ このプライマは、ＨＣＶ−Ｊクローンのアンチセンスヌ
クレオチド配列８９２〜９０７に対応する。 【０１８９】（配列ＩＤ番号４２）５’−３’：ＧＧＧ
ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＡＡ ＣＡＡ Ｇ 望ましい５６４ｂｐのＰＣＲ産物の存在を確認するのに
用いられるプローブ配列であり、ＨＣＶ−Ｊクローンの
ヌクレオチド配列６７４〜６９３に対応する。 【０１９０】（配列ＩＤ番号４３）５’−３’：ＧＴＣ
ＧＣＧ ＴＡＡ ＴＴＴ ＧＧＧ ＴＡＡ ＧＧ Ｃ型肝炎ＮＳ３／ＮＳ４のためのＰＣＲ増幅は、ＨＣＶ
−Ｊクローンのヌクレオチド配列４８７６〜４８９６に
対応するセンスプライマを用いて行なわれる。 【０１９１】（配列ＩＤ番号４４）５’−３’：ＴＣＣ
ＴＧＴ ＧＴＧ ＡＧＴ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣＧ このプライマは、ＨＣＶ−Ｊクローンのアンチセンスヌ
クレオチド配列６３２１〜６３０２に対応する。 【０１９２】（配列ＩＤ番号４５）５’−３’：ＧＡＡ
ＧＴＣ ＡＣＴ ＣＡＡ ＣＡＣ ＣＧＴ ＧＣ 望まれる１４２６ｂｐのＰＣＲ産物の存在を確認するた
めに用いられるプローブ配列であり、ＨＣＶ−Ｊクロー
ンのヌクレオチド配列５６１８〜５６３７に対応する。 【０１９３】（配列ＩＤ番号４６）５’−３’：ＣＡＣ
ＡＴＧ ＴＧＧ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＡＧ ＰＣＲ産物は、適当な32Ｐ−標識づけされたプローブを
用いてサザンブロット分析により分析される（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ ｅｔ ａ１．，分子クローニング、実験室マ
ニュアル、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。低い方の希釈度の
全てにおいてシグナルが予想され、これは希釈度が高く
なるにつれて漸進的に減少する。シグナルが目に見える
最後の希釈度は、ベクターの伝染性Ｕ／ｍｌを生み出
す。 【０１９４】例１０ Ａ．ベクター構成体を用いたマウス細胞の形質導入 ４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、５８４ｍｇ／ＬのＬ−
グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓ
ａｎｔａ Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び１０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ，Ｃａｌａｂａ
ｓａｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含むＤＭＥＭの中
で、マウス線維芽細胞系統ＢＣ１０ＭＥ（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＴＩＢ８５）Ｂ１６およびＬ−Ｍ（ＴＫ）（ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．ＣＣＬ１．３）を成長させる。 【０１９５】ＢＣ１０ＭＥ，Ｂ１６及びＬ−Ｈ（Ｔ
Ｋ-）線維芽細胞系統を、ＤＭＥＭ、１０％完全ＦＢＳ
及び４μｇ／ｍｌポリブレンの中で１０ｃｍ皿内に各々
１×ｌ０ 5の細胞の割合で平板固定する。各々を、約１
０5ｃｆｕ／ｍｌのベクター力価をもつ１．０ｍｌのレ
トロウイルスベクター１．０ｍｌで形質導入する。ＤＭ
ＥＭ、１０％ＦＢＳ及び８００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８の
中で、例７Ｂに記述されているとおりに、クローンを選
択する。 【０１９６】ＥＬ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ３８）細
胞及びＥＬ４／Ａ２／Ｋb細胞（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｌ．
Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、ＤＡ産生細胞との同
時培養により形質導入される。特定的に言うと、１日目
にＲＰＭＩ１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、
１０％ＦＢＳ及び４μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍ
ａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）内で１×１
０6の照射を受けた（１００００ｒａｄｓ）ＤＡ（約１
０5〜１０6のベクター力価）産生細胞に対して１．０×
１０6のＥＬ４細胞又は１×１０6ＥＬ４／Ａ２／Ｋｂを
付加する。２日目に、同時培養に対して、１．０×１０
6の照射された（１００００ｒａｄ）ＤＡ産生細胞を付
加する。５日目に、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用い
て、形質導入されたＥＬ４又はＥＬ４／Ａ４／ＫＢ細胞
の選択を開始させる。例７Ｂに記述されているように、
プールを希釈クローニングする。 【０１９７】Ｇ４１８内で多価ベクターにより形質導入
されたＢＣ１０ＭＥ，Ｂ１６，Ｌ−Ｍ．（ＴＫ-），Ｅ
Ｌ−４細胞はＧ４１８内で選択されない；これらを例７
Ｂにあるように希釈を制限することによりクローニング
させ、例１１Ａに記すとおり発現について検定する。 Ｂ．ベクター構成体を用いたヒト細胞の形質導入 Ｂ９５−８，ＥＢＶ形質転換されたマルモセット白血球
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１２）の３週間経過培養の上清
からとられた新鮮なエプスタイン−バーウイルス（ＥＢ
Ｖ）でそのＢ細胞を感染させる（形質転換する）ことに
より、各々の患者についてリンパ芽球細胞系統（ＬＣ
Ｌ）を樹立する。ＥＢＶ形質転換から３週間後、ＨＢＬ
ｃｏｒｅ又はｅ抗原を発現するレトロウイルスベクター
で形質導入する。ＬＣＬの形質導入は、４．０ｍｌの培
地及び４．０ｍｇ／ｍｌのポリブレンを含む６ｃｍの平
板の中で１．０×１０6の照射済み（１００００ｒａｄ
ｓ）ＨＸ産生細胞と１．０×ｌ０6のＬＣＬ細胞を同時
培養することによって達成される。培地は、ＲＰＭＩ１
６４０、２０％の熱活性化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎ
ｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、５，０ｍｌのピルビン酸
ナトリウム及び５．０ｍＭの可欠アミノ酸から成る。３
７℃で５％ＣＯ2で一晩同時培養した後、ＬＣＬ懸濁細
胞をとり出し、１×１０6の細胞を、１．０×１０6の照
射済み（１００００ｒａｄｓ）ＨＸ産生細胞を含む新鮮
な平板内でさらに６〜１８時間再度同時培養させる。８
００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を付加することにより形質導
入されたＬＣＬ細胞を選択し、クローニングして高発現
クローンを得る。ジャーカットＡ２／Ｋb細胞（Ｌ．Ｓ
ｈｅｒｍａｎ，Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を基本的
にＬＣＬ細胞の形質導入について記述した通りに形質導
入する。多価ベクターにより形質導入されたＬＣＬはＧ
４１８内で選択されない：これらは、例７Ｂの場合と同
様に希釈を制限することによりクローニングさせ、例１
１Ａの場合と同様に発現について検定する。 【０１９８】例１１ 形質導入された遺伝子の発現 Ａ．ＥＬＩＳＡ ＫＴ−ＨＢｅ又はＫＴ−ＨＢｃにより形質導入された細
胞からの細胞リゼイトは、ＰＢＳで１．０×１０7個の
培養細胞を洗い、ＰＢＳ上合計６００μｌの合計体積に
なるまで細胞を再懸濁し、Ｂｒａｎｓｏｎ音波処理機、
３５０型（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅ
ｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）内で３０の設定値で５秒間ずつ
２回音波処理するか又は３回凍結融解することにより作
製される。５分間１００００ｒｐｍでの遠心分離により
リゼイトを清澄化する。 【０１９９】細胞リゼイト内のコア抗原及びプリコア抗
原及び培養上清中の分泌されたｅ抗原を、Ａｂｂｏｔｔ
ＨＢｅ，ｒＤＮＡ ＥＩＡキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を
用いて検定する。細胞リゼイト内のプリコア抗原及び培
養上清中の分泌されたｅ抗原についてのもう１つの敏感
なＥＩＡ検定を、Ｉｎｃｓｔａｒ ＥＴＩＥＢキット
（Ｉｎｃｓｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｉｌ
ｌｗａｔｅｒ，ＭＮ）を用いて実施する。Ｂｉｏｇｅｎ
（スイス，ジュネーブ）から得た組換え型Ｂ型肝炎コア
及びｅ抗原の希釈液から、標準曲線を生成する。 【０２００】これらの手順を用いて、この例の第１段階
に記したように調製された形質導入された細胞系統の中
で約１０ｎｇ／ｍｌのｅ抗原が発現される（図５参
照）。Ｂ．ウエスタンブロット分析による形質導入され
た遺伝子の発現 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてその分
子量（ＭＷ）に従ってタンパク質を分離する。その後タ
ンパク質をゲルからＩＰＶＨＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）へと移す。ゲルから膜ま
でタンパク質を移送するためには、Ｈｏｅｆｅｒ ＨＳ
ＩＴＴＥトランスファ装置（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａ）を用いる。次に、発現されたタンパク質と特異
的に反応する患者の血清からのポリクローナル抗体を用
いて、膜をプローブする。オートラジオグラフィによる
形質導人されたタンパク質の視覚化を可能にする125Ｉ
−標識づけされたタンパク質Ａを用いて、結合した抗体
を検出する。 Ｃ．免疫沈降法／ウエスタンブロット法 形質導入された細胞により発現されたプレコア／コア及
びｅ抗原の特徴づけは、免疫沈降法とそれに続くウエス
タンブロット分析によって行なわれる。特定的には、
０．５〜１．０ｍｌのＰＢＳ中の細胞リゼイト又は培養
上清を、Ｇ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＬＫ
Ｂ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）に結合されたポリ
クローナルウサギ抗Ｂ型肝炎コア抗原（ＤＡＫＯ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ）と混合し、４℃で一晩インキュベート
する。２０ｍＭのトリス−ＨＣ１、ｐＨ８．０、１００
ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ中で試料を２度洗
浄し、０．５％の２−べータ・メルカプトエタノールを
伴う試料装填緩衝液の中で煮沸する。タンパク質をＩｍ
ｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｉｎｅ）に移送し、ＤＡＫＯポリク
ローナルウサギ抗Ｃ型肝炎抗原とそれに続く12 5Ｉ−タ
ンパク質Ａを用いてプローブする。 【０２０１】これらの手順を用いて、形質導入されたマ
ウス細胞により培養上清内に１７ｋｄのＨＢｅタンパク
質が分泌され、ｐ２２，ｐ２３中間Ｂ型肝炎ｅ産物が形
質導入済みのマウス細胞のリゼイト内に主として存在す
るということを示すことができる（図６）。 【０２０２】例１２ Ａ．細胞障害性検定 ｉ．近交系マウス 生後６週間乃至８週間の雌のＢａｌｂ／ｃ，Ｃ５７Ｂ１
／６及びＣ３Ｈマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ
−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉ
ａｎａ）に、それぞれ１×１０7個の照射済（室温で１
００００ｒａｄｓ）のベクター形質導入されたＢＣ１０
ＭＥ，Ｂ１６及びＬ−Ｍ（ＴＫ-）細胞を２回腹腔内
（ｉ．ｐ．）に注射する。７日後に動物を安楽死させ、
脾細胞（３×１０6／ｍｌ）をＴ−２５フラスコ（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）内で
そのそれぞれの照射・形質導入済み細胞（６×１０4／
ｍ１）と共にインビトロで培養する。培地は、ＲＰＭＩ
１６４０、５％の熱失活ウシ胎児血清、１ｍＭのピルビ
ン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍ１のゲンタマイシン及び
１０-5Ｍのβ2-メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から成る。４〜７
日後にエフェクタ細胞を採収し、標準クロム放出検定内
で９６ウエルのマイクロタイター平板（Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）内でさまざま
なエフェクタ：標的細胞比率を用いてテストする。標的
は、形質導入された及び形質導入されていないＢＣ１０
ＭＥ，Ｂ１６及びＬ−Ｍ（ＴＫ-）であり、ここで形質
導入を受けていない細胞系統は負の対照として用いられ
る。特定的には、Ｎａ2 51ＣｒＯ4−標識づけされた（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔ
ｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）（１００ｕＣｉ、３７℃で１時
間）標識細胞（１×１０4細胞／ウエル）を２００μ１
の最終体積にて、さまざまなエフェクタ対標識細胞比率
で、エフェクタ細胞と混合させる。インキュベーション
の後、１００μｌの培地を取り出し、Ｂｅｃｋｍａｎガ
ンマ分光計（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａ
ｓ）内で分析する。標的プラス培地からのＣＰＭとして
自然放出（ＳＲ）を決定し、標的プラス１ＭのＨＣｌか
らのＣＰＭとして最大放出（ＭＲ）を決定する。〔（エ
フェクタ細胞＋標的ＣＰＭ）−（ＳＲ）／（ＭＲ）一
（ＳＲ）〕×１００として標的細胞溶解百分率を計算す
る。標的の自然放出値は標準的にＭＲの１０％〜２０％
である。 ｉｉ．ＨＬＡＡ２．１遺伝子導入マウス １×１０7個の照射済み（室温で１００００ｒａｄｓ）
のベクター形質導入されたＥＬ４Ａ２／Ｋｂ細胞を、生
後６〜８週間のＨＬＡＡ２．１遺伝子導入マウス（Ｖ．
Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓ ｖｉｌｌ
ｅ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を２回腹腔内に（ｉ．ｐ．）注
射する。７日後に動物を安楽死させ、脾細胞（３×１０
6／ｍｌ）を、フラスコ（Ｔ−２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ，
Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）内で照射済（１０
０００ｒａｄｓ）で形質導入を受けたジャーカットＡ２
／Ｋb細胞（６×１０4／ｍ１）を用いてインビトロで培
養する。クロム放出検定の残りの部分は例１２Ａに記さ
れているとおりに実施され、ここで標的は形質導入を受
けた及び受けていないＥＬ４Ａ２／Ｋb及びジャーカッ
トＡ２／Ｋb細胞である。形質導入を受けていない細胞
系統は負の対照として利用される。 ｉｉｉ．ヒトＣＴＬ検定 ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）勾配遠心分離により分離
する。特定的には、細胞を５分間室温で３０００ｒｐｍ
で遠心分離する。１０日間１０：１のエフェクター：標
的比率にてその自己由来の形質導入されたＬＣＬ（例１
０Ｂ）を用いてＰＢＭＣをインビトロで再刺激する。培
地は、５％の熱失活されたウシ胎児血清、１ｍＭのピル
ビン酸ナトリウム及び５０μｎ／ｍｌのゲンタマイシン
の予めスクリーニングしたロットを伴うＲＰＭＩ１６４
０から成る。結果として得られた刺激されたＣＴＬエフ
ェクタを、標準クロム放出検定において標的として形質
導入された自己由来のＬＣＬ又はＨＬＡ照合された細胞
を用いて、ＣＴＬ活性についてテストする。大部分の患
者はＥＢＶに対する免疫を有することから、負の対照と
して用いられる形質導入を受けていないＥＢＶ形質転換
されたＢ細胞（ＬＣＬ）は同様に、形質導入されたＬＣ
Ｌと共にＥＢＶ特異的ＣＴＬにより標的として認識され
ることになる。ＥＢＶ特異的ＣＴＬが標識づけされた標
的細胞を殺すことによる高いバックグラウンド細胞障害
性を減少させるためには、５０：１の比率で標識づけさ
れた標的細胞に標識づけされていない未形質転換ＬＣＬ
を付加することが必要である。 Ｂ．体液性免疫応答の検出 ＨＢＶｃｏｒｅ及びｅ抗原に特異的な体液性免疫応答を
ＥＬＩＳＡにより検出する。ＥＬＩＳＡプロトコルは、
９６ウエルの平板をコーティングするため、１００μｇ
／ウエルの組換え型ＨＢＶコア及び組換え型ＨＢＶｅ抗
原（Ｂｉｏｇｅｎ、スイス，ジュネーブ）を利用する。
その後、ＨＢＶコア又はＨＢＶｅ抗原を発現する細胞又
は直接的ベクターで免疫化されたマウスからの血清を、
抗原コーティングされたウエル内で階段希釈させ、室温
で１〜２時間インキュベートする。インキュベーション
の後、同等のカ価をもつウサギ抗マウスＩｇＧ１，Ｉｇ
Ｇ２ａ，ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３の混合物をウエルに付
加する。各ウエルに対して、ホースラディッシュペルオ
キシダーゼ（「ＨＲＰ」）で接合されたヤギ抗ウサギ抗
血清を各ウエルに付加し、室温で１〜２時間試料をイン
キュベートする。インキュベーションの後、適切な基質
を付加することにより、反応性を視覚化する。ＨＢＶコ
ア又はＨＢＶｅ抗原に対し特異的な抗体を含むウエルに
おいて顕色することになる。 【０２０３】これらの手順を用いて、ＨＢＶｃｏｒｅ及
びｅ抗原に対する抗体を誘発できるということを示すこ
とができる（図７Ａ及び７Ｂ）。 Ｃ．Ｔ細胞増殖 ＨＢＶコア又はｅ抗原を発現する直接的ベクター調製物
の２回又は３回の注射の結果得られる抗原誘発されたＴ
ヘルパー活性をインビボで測定する。特定的には、免疫
化されたマウスからの脾細胞を、負の対照としてＨＢＶ
ｃｏｒｅ又はｅ抗原を発現しない細胞を用いるか又はＨ
ＢＶｃｏｒｅ又はｅ抗原を発現する細胞を用いて、予め
定められた比率でインビトロで再度刺激する。５％のＦ
ＢＳ、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１０-5の
２−べータメルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ １６
４０培地内で３７℃、５％ＣＯ2で５日間置いた後、特
異的にＨＢＶｃｏｒｅ又はｅ抗原による刺激を受けたＴ
ヘルパー細胞により分泌されるＩＬ−２活性について上
清をテストする。ＩＬ−２活性は、成長のためＩＬ−２
に依存しているＣＴＬクローン、ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣ
Ｃ ＴＩＢ２１４）を用いて測定される。ＣＴＬＬ−２
クローンはＩＬ−２が存在しない場合増殖しない。ＣＴ
ＬＬ−２細胞を、９６ウエルの平板内で上清試料の階段
希釈に付加し、３７℃、５％ＣＯ2で３日間インキュベ
ートする。その後、ＣＴＬＬ−２に０．５μＣｉの3Ｈ
一チミジンを付加する。ＣＴＬＬ−２細胞が増殖する場
合にのみ3Ｈ一チミジンを取り込ませる。一晩のインキ
ュベーションの後、ＰＨＤ細胞採収装置（Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｗａｔｅｒ
ｔｏｗｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて細胞
を採収し、Ｂｅｃｋｍａｎベータカウンタ内で計数す
る。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｒｍ，Ｉｎｄ
ｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）から得た標準組
換え型１Ｌ−２から生成された標準曲線から、試料中の
ＩＬ−２の量を決定する。 【０２０４】例１３ ＨＢＶプリコア／コアの免疫原性ドメインの同定 Ｔ−Ｓｉｔｅｓ（Ｍｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ、Ｍａｒｙｌａ
ｎｄ）といったコンピュータアルゴリズムを利用してＴ
−細胞エピトープを予測することができる。この解析か
ら、ペプチドを合成し、ＣＴＬエピトープを同定するの
にこれを使用する。形質導入された自己由来（例１０
Ｂ）のＬＣＬでインビトロで刺激された急性Ｂ型肝炎感
染を有する患者からのエフェクター細胞を、ペプチドで
コーティングされた自己由来のＬＣＬ上でテストする。
最終濃度１〜１００μｇ／ｍｌに至るまでエフェクター
細胞と共に未形質導入のＮａ2 51ＣｒＯ4標識づけされた
ＬＣＬに対してペプチドが付加されるという点を除い
て、例１２Ａｉｉに記されている通りにクロム放出検定
を実施する。反応を４〜６時間インキュベートし、標準
クロム放出検定を例１２Ａｉに記されているとおりに実
施する。 【０２０５】例１４ 腫瘍形成性と形質転換 Ａ．腫瘍形成性検定 ヌードマウスにおける腫瘍形成は、腫瘍形成性を決定す
る上で特に重要かつ感度の高い方法である。ヌードマウ
スは成熟Ｔ細胞を有しておらず、従って機能的細胞免疫
系に欠け、細胞の腫瘍形成潜在能をテストすべき有用な
インビボモデルを提供する。正常な非腫瘍形成性細胞
は、ヌードマウスに注射された場合無制御成長特性を示
さない。しかしながら、腫瘍形成性の形質転換済み細胞
は、ヌードマウス体内で急速に増殖し腫瘍を生成するこ
とになる。簡単に言うと、ベクター構成体は注射によっ
てヌードマウスに投与される。腫瘍の成長を見極めるた
め注射から４〜１６週間の期間中マウスを目視する。マ
ウスを安楽死させ、腫瘍が存在するか否かを見極めるた
め剖検することもできる（Ｇｉｏｒａｎｅｌｌａ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．４
８：１５３１−１５３３，１９７２；Ｆｕｒｅｓｚ ｅ
ｔ ａ１．，「生物学的薬剤の生産のため考慮される細
胞系統の腫瘍形成性試験」Ａｂｎｏｒｍａｌ Ｃｅｌｌ
ｓ（異常細胞）、Ｎｅｗ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ
Ｒｉｓｋ，Ｈｏｐｐｓ ａｎｄ Ｐｅｔｒｉｃｃｉａｎ
ｉ（ｅｄｓ），Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｓｓ
ｏｃｉａｔｉｏｎ，１９８５：Ｌｅｖｅｎｂｏｏｋ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｓｔｄ.１３：１３５−１
４１，１９８５）。このテストはＱｕａｌｉｔｙ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，（Ｃａｍｄｅｍ，Ｎｅｗ Ｊｅ
ｒｓｅｙ）により実施される。 Ｂ．形質転換検定 腫瘍形成性は形質転換特性と密に相関関係をもつことが
実証されてきた。形質転換を見極めるために利用できる
１つの検定は、軟寒天内に平板固定された細胞のコロニ
ー形成である（Ｍａｃ Ｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｖｉｒ．２３：２９１〜２９４，１９６４）。簡
単に言うと、正常な未形質転換細胞の１つの特性は、足
場依存型成長である。正常な未形質転換細胞は半固体寒
天支持培地内にあるとき増殖を停止するが一方形質転換
された細胞は軟寒天内で増殖し続けてコロニーを形成す
る。 【０２０６】ヒトの線維肉腫から誘導され１００％のヌ
ードマウスにおいて腫瘍をひき起こすものとして知られ
ている新生細胞系統であるＨＴｌ０８０（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ１２１）は、検定の正の対照として用いられる。ヌ
ードマウスにおいて腫瘍形成性をもたない二倍体胚性ヒ
ト肺細胞系であるＷＩ−３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）
は、検定の負の対照として用いられる。 【０２０７】ＷＩ−３８細胞系統を、例７Ｂに記されて
いるようにベクター構成体で形質導入する。形質導入さ
れた細胞系統ＨＴｌ０８０及びＷＩ−３８の各々の重複
試料を寒天内で培養する。簡単に言うと、ＤＭＥＭ１７
％ＦＢＳ中の５．０ｍｌ ０．８％のＢａｃｔｏａｇａ
ｒ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）
の下部層を６０ｍｍの組織培養平板上にセットする。５
ｘｌ０5細胞／ｍｌの濃度で細胞が懸濁させられている
同じ培地内の２．０ｍｌの０．３％Ｂａｃｔｏａｇａｒ
をこれにオーバーレイさせる。バックグラウンド凝塊を
減少させるため、寒天溶液内で懸濁させる前に各細胞系
統を７０μｍのナイロンメッシュを通してろ過する。１
４日間、ＣＯ2 ５％の加湿された雰囲気中で３７℃で平
板をインキュベートする。平板固定から２４時間以内
に、平板固定の時点で存在した細胞凝塊について各細胞
系統の代表的平板を検査する。１３日目に１．０ｍｌの
ＩＮＴウイルス染色剤（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で平板を染色し、１４日目に、
１ｍｍの接眼鏡網線を用いて直径１５０μｍのコロニー
についてこれらを走査する。 【０２０８】あらゆる向きで１５０μｍに広がるコロニ
ーのみが評点される。というのもこのサイズのコロニー
が顕微鏡下で全ての平面内に容易に観察でき、形質転換
されていない細胞がこのサイズのコロニーを形成するこ
とは稀であるからである。検点の終りで、各細胞系統に
ついての平板（コロニー形成）効率をｂ／ａ×１００と
して計算する。なおここでｂは全ての平板上のコロニー
の和に等しく、ｅは細胞平板の合計数に等しい。形質転
換されていない細胞系統は、０．００１％以下の平板効
率を有するものである。従って、形質転換された細胞系
統は０．００１％以上の平板効率を有することになる
（Ｒｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ．５９：４７
７−４８９，１９７４）。 【０２０９】例１５ 投与プロトコル Ａ．マウス ＨＢＶｃｏｒｅ又はｅ抗原をコードするベクターの直接
投与を用いた体液性及び細胞媒介性の免疫応答の誘発を
評価するため、マウス系を使用する。生後６週間〜８週
間の雌のＢａｌｂ／ｃ，Ｃ５７Ｂ１６又はＣ３Ｈマウス
に、０．１ｍｌの再構成され（無菌脱イオン精製水で）
凍結乾燥されたＨＢＶｃｏｒｅ又はＨＢＶｅ発現レトロ
ウイルスベクターを筋内（ｉ．ｍ．）注射する。一週間
おいて２回の注射を行なう。２回目の注射後、動物を安
楽死させる。基本的に例１２Ａｉに記されているとお
り、クロム放出ＣＴＬ検定が好まれる。 Ｂ．チンパンジーの投与プロトコル Ｂ型肝炎ウイルスに慢性的に感染しているチンパンジー
におけるベクターの投与プロトコルを決定するため例１
５Ａからのマウス系内で生成されたデータを使用する。
マウス内のＨＢＶ特異的ＣＴＬの誘発に基づき、連続的
に上昇する２つの容量グループで２８日の間隔をおいて
コア又はｅ抗体をコードするベクターの３回の用量をチ
ンパンジー試験の被験動物に施す。対照の被験動物は、
ＨＢＶ−ＩＴ（Ｖ）製剤培地から成るプラシーボを受け
る。用量は、各注射日に筋内に０．５ｍｌの注射５回で
与えられる１０6又はｌ０7ＨＢＶ−ＩＴ（Ｖ）ｃｆｕで
ある。血液試料を４日目、１２日目、２４日目、３６日
目、５２日目、７０日目及び８４日目、及び６ヵ月目、
１２ヵ月目、１８ヵ月目、２４ヵ月目、３０ヵ月目及び
３６カ月目に採取して、血清ＡＬＴレベル、Ｂ型肝炎ｅ
抗原の存在、Ｂ型肝炎ｅ抗原に対して向けられた抗体の
存在を測定し、治療の安全性及び許容可能性を評価す
る。Ｂ型肝炎ｅ抗原は、例１１Ａに記されているような
ＡｂｂｏｔｔＨＢｅ ｒＤＮＡ ＥＩＡキットにより検
出される。ＨＢｅ抗原に対する抗体はＡｂｂｏｔｔ Ｈ
Ｂｅ ｒＤＮＡ ＥＩＡキットにより検出でき、Ｂ型肝
炎ｃｏｒｅ又はｅ抗原に対するＣＴＬの誘発は、例１２
Ａｉｉｉにある通りに決定できる。チンパンジー研究か
らの安定性及び効力の結果に基づいて、ヒト試験におけ
る被験者に対するベクターの投与について、用量及び接
種スケジュールが決定されることになる。ここで、上述
のとおり、被験者は、血清ＡＬＴレベル、Ｂ型肝炎ｅ抗
原の存在及びＢ型肝炎ｅ抗原に対して向けられた抗体の
存在について監視される。Ｂ型肝炎コア又はｅ抗原に対
するヒトＣＴＬの誘発は、例１２Ａに記したとおりに決
定される。 【０２１０】以上の記述から、ここでは本発明の特定の
実施態様について例示を目的として記してきたものの本
発明の精神及び範囲から逸脱することなくさまざまな修
正を行なうことができるということがわかるだろう。従
って本発明は、添付のクレームによる以下制限を受ける
ものではない。
【図面の簡単な説明】 【図１】図１は、ＡＴＣＣ ４５０２０からのＢ型肝炎
ｅ配列の回収を概略的に示す図である。 【図２】は、ＨＢＶ（ａｄｗ）プリコア/コアのヌクレ
オチド配列（ＳＥＱＩＤ． ＮＯ.56）及び補正した配
列の図式表示である。 【図３】図３は、ｐＡＭ６（ＡＴＣＣ ４５０２０）か
らのＨＢｅ−ｃ配列内の欠失の補正の概要図である。 【図４】図４は、ＳＫ+ ＨＢｅ−ｃからの補正したヌク
レオチド配列を示すDNA配列決定用ゲルである。 【図５】図５は、ＥＬＩＳＡにより決定された通りの、
レトロウイルスで形質導入されたマウス細胞系統ＢＣ１
０ＭＥ、Ｂ１／６、Ｌ−Ｈ（ＴＫ-）、ＥＬ４及びレト
ロウイルスで形質導入されたＥＢＶ−形質転換されたヒ
トＢ細胞系統ＪＹ−ＬＣＬからのＨＢＶｅタンパク質の
発現を示す図である。 【図６】図６は、レトロウイルスで形質導入されたＢＣ
ｌＯＭＥにより分泌されたｐ１７ｋＤＨＢＶｅタンパク
質及びレトロウイルスで形質導入されたＢＣ１０ＭＥ及
びＢ１／６細胞からの細胞リゼイト内のｐ２２及びｐ２
３ｋＤのプリコア中間タンパク質の発現を示すウエスタ
ンブロットである。 【図７Ａ】図７Ａは、抗原を発現する同系細胞と共に注
入されるか又はＨＢＶｅ抗原をコードするレトロウイル
スベクターと共に直接注入によって注射されるＢａｌｂ
／ｃ及びＣ５７Ｂ１／６マウス体内のＨＢＶｅ抗原に対
する抗体応答の誘発を示すグラフである。 【図７Ｂ】図７Ｂは、抗原を発現する同系細胞と共に注
入されるか又はＨＢＶｅ抗原をコードするレトロウイル
スベクターと共に直接注入によって注射されるＢａｌｂ
／ｃ及びＣ５７Ｂ１／６マウス体内のＨＢＶｅ抗原に対
する抗体応答の誘発を示すグラフである。 【図８】図８は、HBVコアとB7/BB1タンパク質の両方を
発現するベクター構成体KT-HBVコア/B7/BB1の図式表示
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スティーブン エム．ダブリュ．チャン アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サン ディエゴ， ビア キャセラス 9838 (72)発明者 ウィリアム ツン−リャン リー アメリカ合衆国，カリフォルニア 92009, カールスバッド，カル ポサダ 7961 (72)発明者 カイ タウンセンド アメリカ合衆国，カリフォルニア 92024, エンシニタス，バーチビュー ドライブ 926 (72)発明者 ジョアン オデア アメリカ合衆国，カリフォルニア 92037, ラジョラ，クリフリッジ アベニュ 8842 Ｆターム(参考） 4C084 AA13 NA01 NA10 NA13 NA14 ZA751 ZA752 ZB261 4C085 AA32 BA89 CC08

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】Ｂ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性
    部分の発現を導くベクター構成体を含有する組成物であ
    って、免疫応答が生成されるように、該組成物を温血動
    物に対して投与することを含む、温血動物体内のＢ型肝
    炎感染を治療する方法に使用するための組成物。
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