JP2002537830A - ヒトサイトメガロウイルス感染後に遊離されるウイルス粒子及び前記粒子のワクチンとしての使用法・用途 - Google Patents
ヒトサイトメガロウイルス感染後に遊離されるウイルス粒子及び前記粒子のワクチンとしての使用法・用途Info
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Abstract
Description
離されるウイルス粒子及びかかる粒子のワクチンとしての使用法・用途に係る。
り、遍在的に存在する病原体の一つである。免疫適格性を有する人においては、
HCMV感染症は、せいぜい中程度で且つ非特異的症状を呈するため、通常は認
知されることはない。これとは逆に、例えばエイズ(AIDS)患者又は臓器被
移植者など免疫抑制状態の患者などいくつかのリスク群においては、非経口感染
を受けた場合、HCMV感染症は、重篤な症状を呈する。
かしながら、HCMV感染症に対する抗ウイルス化学療法剤の成功は、特にこれ
ら医薬品の持つ毒性やまた治療期間が長期になった場合の抵抗性ウイルス変異株
の出現によって限られたものとなっている。さらには、抗ウイルス性の高免疫度
血清を予防目的又は治療目的に使用することは、有効性が限定されたものに過ぎ
ないことが判っている。
。即ち、所望の免疫を誘導するために弱毒化された生ワクチンについて多くの試
みがなされているものの、この種のワクチンは、有効性が限定されたものにすぎ
ないことが判明している。かかる理由としては、なかでも弱毒化ウイルスのヒト
体内での生存可能性が限定されていることや抗原性が種特異的に変化することが
挙げられる。生ワクチンの使用は、終生免疫誘導が不十分であること以外に、危
険が多いものと見なすべきである;即ち、HCMV感染症における病原性機構に
関する知識が欠如しておりまた免疫抑制後においてワクチン株再活性化の危険性
があるため、生ワクチン使用は、臨床の現状においては少なくとも疑問が多いよ
うに思われる。
イルスエンベロープ由来のタンパク質を幾つか含有するHCMVサブユニットワ
クチンを開発するべく、いくつかの研究方針が最近実行されている。このような
エンベロープタンパク質、特にグリコプロテインgB及びgHは、HCMVに対
する中和抗体の必須の標的抗原である。中和抗体は、かかる感染症を防止する性
能を有するものであり、gBサブユニットワクチンによってかかる中和抗体を誘
導せしめることは、実験動物においてもまた臨床試験においても可能であった。
しかしながらヒトにおいては、このようにして誘導した抗体応答は、持続期間が
短く、全ての症例において当該感染症を予防・防止するには適していないことが
判明している。このことは、専らHCMVのgBにのみ依拠したサブユニットワ
クチンを広範に使用するうえで致命的な障害となるものである。逆にこのような
抗体製剤の有効性が限定されることについて示唆されてきた理由としては、免疫
応答における菌株特異的変動があること、充分な細胞性免疫応答が欠落している
こと及び使用する抗原について、そのエピト-プがいくつかの場合立体構造依存
性であることが公知であるため、いくつか用いた抗原に構造的な制約があること
が挙げられる。
が満たすべき要件は、下記する通りである:即ち、 (1)菌株に重複的な態様でHCMV感染症から防御する中和抗体を永続的に
誘導すること。このためには、HCMVに対する所謂“ヘルパー細胞応答”(C
D4−陽性Tリンパ球)を有効に誘導させ、かくして抗体分泌性Bリンパ球の成
熟を支援・助長することが必要である。 (2)HCMVに対抗する細胞障害性T細胞の生成を誘導すること。この種の
リンパ球は、既に発症したHCMV感染症を終結させ且つ体内でのウイルスの感
染拡大を限定するために極めて重要である。 (3)当該ワクチンによる副作用を最小限とすること。接種した生菌ウイルス
は、これまでに知り得る限りでは免疫抑制後に潜伏期を樹立する能力を有してお
り、このことから誘発される可能性があるリスクを評価することは不可能である
。従って目的とすべきことは、ワクチンとして非生菌性ウイルス抗原を調製する
ことであるべきである。
ンは、中和抗体を誘導させ且つヘルパー細胞(THリンパ球)及び細胞障害性細
胞(CTL)を刺激するための適合した抗原を含有するものでなくてはならない
。
ルスエンベロープタンパク質、特にグリコプロテインgB及びgHに対して生成
されるものである。
65(ppUL83)に対して生成されるものであり、さらにはpp65は、H
CMVに対抗するCTLを誘導するためには必須の抗原である。pp65の提示
は、MHCクラスI分子に関連して細胞によるデノボ(de novo)合成の後では常
時生起するだけではない;つまり、所謂“外因性負荷(exogenous loading)”
によってもMHCI提示経路に導入されることが可能なのである。
より合成され、培養培地内に遊離される欠陥ウイルス粒子の必須構成成分である
。これらのデンスボディー(DB)は、電子顕微鏡下でも生存可能な構造物であ
って、そのタンパク質質量の90%以上は、pp65から構成される。これらは
、ウイルス性グリコプロテインで修飾された細胞脂質膜が付与されていること及
び当該細胞から放出されることの二点において、ウイルス粒子に比肩され得るも
のである。かかるウイルス性グリコプロテインは、このエンベロープでは天然の
立体構造として存在する可能性が極めて高い。DBは、ウイルス性DNAもまた
ウイルス性カプシドも一切含有していないため、非伝染性であり、細胞培養物の
上澄み液から確立された方法によって大量に濃縮することが出来る。
ンを提供することである。
離されるウイルス粒子について記述するものであり、かかる粒子は、HCMV感
染症に対する予防又は治療目的のワクチンとして使用することが出来る。
て、当該粒子をいくつかの哺乳動物細胞に融合させて、かくしてその内容物が当
該細胞の原形質内に侵入することが可能となるのである。当該粒子の膜は、ウイ
ルス中和性抗体のための主要抗原を提示するウイルス性グリコプロテインを含有
する。この粒子はまた、ウイルス性DNAもまたカプシドも双方を含有していな
いことを特徴とするものである。更には、ウイルス性T細胞抗原pp65(pp
UL83)を含有しており、この抗原は、Tヘルパー細胞の生成を刺激すると共
にHCMVに対抗する細胞障害性Tリンパ球(CTL)を誘導するために必須の
抗原となる。
力を有する複数の抗原を組合せて有することによって、当該粒子がHCMVワク
チンとして適したものになるのである。
s: Original Article Series 20, 1 (1984) 305-324; Virology 66 (975) 464-
473)。このことに関連して、デンスボディーをワクチンとして使用する可能性
が示唆されていたが、デンスボディーが現実に所望された効果を現出することを
証明する実験は一切報告されたことはなかった。更には、デンスボディーが、抗
原性効果を有することは既に示されている(Jahn et al., J. gen. Virol. 68 (1
987) 1327-1337)。しかしながら、これらの実験は、誘導された免疫応答を特性
化するものではなく、この事実が、ワクチンとしての適性に関する情報を一切推
論できない理由となっている。
いう事実は、実施例1及び2において示されるウイルス中和抗体の誘導は、長時
間継続する(実施例3)のであって、このことは、成功するワクチンのためのも
う一つの要件である。実施例1乃至3において実現された免疫応答は、免疫化を
アジュバントを用いることなく実施しただけにそれだけ一層驚くべきことである
。アジュバントと一緒に投与されたワクチンの副作用は、従ってここでは当ては
まらない。本発明の粒子はまた、細胞障害性Tリンパ球(CTL)を活性化する
のである(実施例4及び5)。
誘導するのである(実施例6)。
証明するものである。
ppUL83)の構成部分の一種以上又はそのタンパク質全体及び他の部分とし
て一種以上の他種タンパク質の構成部分の一種以上とを含んで成る融合タンパク
質を含有する粒子について記載されている。
である。その理由は、このような融合タンパク質が粒子中において大量に存在す
るからである。更には、一分子中において細胞性と体液性の双方の免疫応答が発
現することは、その抗原性を明白に増大させることが出来る、ということも既に
公知となっている。pp65の種々の部位及び他のタンパク質は、直接融合させ
ることが出来るが、例えば関与するタンパク質のうちの一つのタンパク質の天然
構成成分ではないリンカー配列を当該種々の部分の間に介在させることも可能で
ある。この種の配列は、クローニングによって生成させることが出来るし又は当
該抗原の諸特性に影響を及ぼすために慎重に導入することが出来る。しかしなが
ら。かかる融合タンパク質は好ましくは、融合パートナーの構成成分ではない外
来配列を一切含有しないのである。かかる実施態様においては、当該融合タンパ
ク質は、pp65の構成部分の一種以上と一種以上の他種タンパク質の構成部分
の一種以上から構成される。
いてもよいことは、下記する全ての実施態様に対して当てはまる。“pp65(
から構成される)の融合タンパク質”なる表現は、本特許出願の目的のためには
pp65の全体に限定されるものと了解されるものとする。当該融合タンパク質
中に存在する一種のタンパク質の“構成部分“又は”構成区分”とは、当該融合
タンパク質が誘導される元のタンパク質のうちの少なくとも6、好ましくは少な
くとも8、最も好ましくは少なくとも9、15又は20の連続したアミノ酸を含
んで成る。
プロテインgB又はgHの中和エピトープの一種以上との融合タンパク質を含ん
で成る。この種の粒子は、図7Aにおいて示すように産生させることが出来る。
かかる融合タンパク質は、抗原特異的取り込みを経由して、グリコプロテイン特
異的B細胞内に進入し、このB細胞は次に、MHCクラスIIのコンテキストに
おいてpp65及びpp65の双方のエピト-プを提示するのである。更には、
この融合タンパク質のいくつかの部分をMHCクラスIIのコンテキストにおい
て抗原提示機能細胞(APC)を用いて提示させることも可能である。何れの場
合においても、結果的にはpp65及びウイルス性グリコプロテインに対するT H の応答を効率よく刺激することが出来る。これらのTH 細胞は、pp65及び
ウイルス性グリコプロテインのペプチドをMHCクラスIIのコンテキストにお
いて提示し、かくして中和抗体を相同的且つ異種的にも生成するグリコプロテイ
ン特異的B細胞を刺激する能力を有している。その上、この種の粒子は、伝染性
のビリオンと同様に細胞内に取り込まれることが可能であり、pp65ペプチド
をMHCクラスI経路に外因的に負荷することによって導入することが出来る。
このことによって、死滅ワクチンについては異常であるが、HCMVに対するC
TL応答刺激が実現される。
の別のタンパク質であるプロテインIE1(ppUL123)の構成部分の一種
以上とから構成される融合タンパク質を含有する。このIE1タンパク質の構成
部分は、特別に存在するべきもので、ヒト体内で自然感染の過程で生成される細
胞障害性T細胞の対象となる構成部分である。このIE1タンパク質のペプチド
類は、pp65のペプチドとは異なるMHCクラスI分子によって提示される場
合もある。IE1由来の更なる“CTLエピトープ”が付加することによって、
接種された被験者であって、異なるMHCクラスI分子を提示する被験者が免疫
化された場合、可能な限り広範な態様でHCMVに対抗するCTLを産生する能
力を有することが、確保されることになるはずである。
リコプロテインの中和エピト-プの一種以上とIE1のCTLエピトープの一種
以上とから構成される融合タンパク質を含有するのである。pp65を中和エピ
トープとCTLエピト-プとに融合させることによって、中和抗体とCTLの双
方を被験者の体内で可能な限り広範な態様で、即ちMHCクラスIパターンが異
なる最大多数の人々の体内で生成させることが可能であることが確保されること
になるはずである。
病原体のエピトープのとから構成される融合タンパク質を含有する。その他のヒ
ト病原体の適当な構成成分とは、ヒト体内において生成される中和抗体が対抗す
る抗原である。単離した“中和抗原”を使用した場合と比較して、免疫応答(抗
体応答)が顕著に増大することを期待することが、このような“中和抗原”をT
細胞抗原pp65に融合させることによって可能となるのである。ここで付言し
ておくべきかかる“中和抗原”の例としては、B型肝炎ウイルス(HBsAG領
域由来)、C型肝炎ウイルス(例えばE2)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV,
Env領域由来)、インフルエンザウイルス(ヘマグルチニン、ノイラミニダー
ゼ、核タンパク質)の表面タンパク質、又はその他のウイルス性病原体が挙げら
れる。さらに別の適当なヒト病原体としては、Haemophilus influenza、Bordetel
la pertussis、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria meningitidisなどが挙げ
られる。最後ながら、例えばプラスモディア(plasmodia、マラリア)などの真
核性病原体由来の抗原もpp65に融合させることが可能である。
病原体であって、かかる病原体に自然感染した場合ヒト体内において産生される
CTLが対抗する該病原体のタンパク質の構成成分の一種以上とから構成される
融合タンパク質を含有する。かかるCTL抗原の例としては、HIV−1、HB
V、HCV又はインフルエンザウイルスのタンパク質の構成成分が挙げられる。
このような手法の意図は、ヒト体内において異種病原体に対抗する保護性CTL
を産生させる、DBの独自の免疫原性特性を利用することである。
の中和抗原の一種以上及び同一病原体のCTLエピトープの一種以上とから構成
される融合タンパク質を含有する。かかる融合は、接種した被験者が、かかる病
原体に対抗する保護性抗体及びCTLの双方を形成する能力を有することを確保
することを意図するものである。
である、少なくとも二種の異なるグリコプロテインを含有するウイルス粒子に係
る。
wne株に相当する変異体及び残りはHCMV Ad169株に相当する変異体
を含有する。この好ましい実施態様は、かかるTowne株及びAd169株の
双方のグリコプロテインgBを含有する。
じ効率で組み込むことが出来る。かかる組換え型デンスボディーは、二つのプロ
トタイプHCMV株に対する菌株重複型のみならず菌株特異的でもある中和免疫
応答を誘導するのに適している。
調製する方法にも係る。予めHCMVで感染させておいたある細胞集団から粒子
を調製する場合、感染性ウイルス粒子が、当該粒子の精製過程にまで持ち込まれ
るというリスクが生じるが、このようなことは、ワクチンにとって欠点の一つで
ある。
めに、先ず最初に必須遺伝子にある欠失部を有するHCMV株を生成させるので
あるが、このことは、当該遺伝子の機能の欠失を意味する。大抵の場合において
は、このことは、機能性遺伝子産物が存在しないことに依拠するのであるが、あ
る調節遺伝子配列の機能が、当該HCMVが最早や生存しないように変化させる
ことも可能である。このことは、例えば点変異、欠失、挿入又はその他の変異に
よってHCMVの核酸配列を変化させることによって生起させることが出来る。
かかる欠陥ウイルスは、HCMVにおいて予め欠失させておいた遺伝子を発現し
且つビリオン組み立てのために使用可能な状態にある細胞においてのみ増殖する
ことができる。初期線維芽細胞が現在のところ、HCMVのインビトロ増殖のた
めの唯一の許容可能とされるシステムであって、かかる細胞のトランスフェクシ
ョンは、これまではレトロウイルスによる転移法を用いた場合にのみ可能である
に過ぎなかった。しかしながら、かかる細胞を用いてワクチンを製造しなければ
ならない場合、このことは重大な欠点である。本発明の方法は、レトロウイルス
による遺伝子転移を行うことなく産生可能であるが、その内部でHCMVの増殖
も可能であるような安定的にトランスフェクションさせた細胞を提供するもので
ある。
にトランスフェクションさせたヒト包皮線維芽細胞を含んで成る。かかるトラン
スフェクションは、好ましくは極めて高いトランスフェクション効率をもたらす
脂質含有補助剤を用いて実施する。一つの好ましい実施態様において、ロッシュ
ダイアグノスティックス、マンハイム(Roche Diagnostics, Mannheim)から購
入可能である“Fugene試薬”をかかるトランスフェクションのために使用
する。この実施態様は、実施例7において記載する。
このような上記細胞中において増殖させることが出来る。“非相補性”の線維芽
細胞をこのような欠陥ウイルスで感染させた場合、伝染性ウイルス粒子を一切含
まないウイルス性ワクチン粒子をかかる繊維芽細胞から単離することが可能であ
る。
性は、HCMVで感染させることなく当該粒子を細胞中に復元・再構成させるこ
とである。かかる目的のためには、当該粒子の構成成分をコードする遺伝子全て
をこれらの細胞中において発現させねばならない。これらの遺伝子は、かかる目
的のために当該細胞中に挿入させねばならない。
れる。当該粒子のポリペプチド構成成分をコードする遺伝子をバクロウイルス発
現ベクターにクローンする。組換えバクロウイルスの生成させた後、昆虫細胞、
好ましくはSf9細胞を種々のウイルスで同時・共感染させる。これらの遺伝子
を昆虫細胞中で発現させ、得られたポリペプチドが結合して、所望とする粒子を
得るのである。最後に、かかる粒子を当該昆虫細胞から遊離放出させる。このよ
うなことは、ワクチンとして使用することが出来る非感染性粒子の産生させるた
めのひとつの可能性を表す。
IEプロモーター/エンハンサー(MIEP)の制御下に組換えバクロウイルス
にクローン化することである。組換えバクロウイルスは、例えば哺乳動物細胞な
どの高等真核細胞に感染する能力を有すること及び外来遺伝子は、例えばMIE
Pなどの強力な真核細胞プロモーターの制御下においてかかる細胞内において強
力に発現させることとが明らかとなっている。このような手法の利点は、DBの
抗原性タンパク質の重度の修飾、例えば糖化などが、昆虫細胞中におけるよりも
哺乳動物細胞中において一層自然な態様で生起する可能性があるということであ
る。更には、既にワクチン製造のために承認済である多数の細胞系が存在してい
る。
抗体の誘導 2匹のBALB/cJマウス(メス、9−10週令)からなる群を20μgの
精製DB又は20μgの破砕処理DBの何れかをマウスの後足に注射することに
よって免疫処理した。血液を免疫後55日目に心臓窄刺によるサンプル採取し、細
胞分画を凝集させて除去することによって血清を得た。
力について検討したが、かかる検討は下記するプロトコールに従って行った: − これらの血清及び対照抗体14−4b(中和性)とB1B6(非中和性)
を先ず最初は培地で1:3で予備稀釈し、次いで48−ウエルプレート中で、各
回1:2で十倍にまで段階稀釈した。
年12月16日付けの、TCID50が106.3/mlであるAd69(100μ
l+19.9mlとして1:200に予備稀釈したもの))を加えて、慎重に混
合した。このウイルスは、解凍してから20秒間“ボルテックス装置(Vort
ex apparatus)”で予め混合したものであった。
FF)を数え、6x105細胞/ml(1.5x104細胞/μlに相当する)に
調節した。
は抗血毎に清細胞懸濁液を25μlずつ4列に入れた。培養時間として4時間経
過後に、適切なウイルス/抗体稀釈液を100μlずつ添加した。
、PBSで洗浄した。次いで、このマウスモノクローナル抗体p63−27を第
一の抗体として(各ウエルにつき50μlずつ)添加し、37℃にて1時間培養
した。
結合させた抗マウスIgG(Dako, Hamburug、PBS中1:500)を添加し、
37℃にて45分間培養した。この培養に引き続き、PBSでもう一度洗浄しA
EC染色を実施して特異的抗体反応を検出した。
所で37℃にて10−20分間培養した。次にこの反応は、PBSで停止させ、こ
れらのウエルをPBSで数回洗浄した。染色された細胞核を同定し、伝送光線中で
数えた。
(Sigma A-5754) 酢酸緩衝液: 6.8gの酢酸ナトリウム/2.88mlの氷酢酸、1リット
ルの蒸留水当たり(pH4.9) 使用可能AEC溶液: 酢酸緩衝液中にAEC培養株溶液を1:20に稀釈し
、次いで二度濾過する。発色反応の暫く前に1/1000 30%強度のH2O2 を添加する。
的のために、5匹の動物を三回(時間はそれぞれ、0、4週、9週)、何れの場
合にも20μgの未処理DBを用いて腹腔内免疫化した。これら動物のうち三匹
について、採血を12週において行い、また残りに二匹については32週におい
て行った。
て検討した。このために使用した方法は、実施例1に記載した通りであった。得
られた結果を以下に示しが、その結果未処理DBの20μgを三回投与した場合
、足に単回投与した場合と比較して中和抗体の産生が有意に増大することが明ら
かとなった。中和に要した数値は、血清陽性ドナー由来のヒト血清について通常
得られる力価に相当するものである。
答の誘導 Balb/cJマウスを実施例2に記載したスケジュールに従って天然DBを
用いて三回腹腔内免疫化した。第一回免疫化の後32週に、血清を上記した方法
で動物から採り、中和アッセイで検討を行った。その結果、中和抗体は、初回免
疫化処理後は比較的長期間経過後でも高濃度で検出可能の状態に留まることが明
らかとなった。このことは、DBは、以前使用されていた死菌HCMVワクチン
とは異なり継続的な中和抗体応答を誘導する能力を有することを示す。
胞を活性化するのにどの程度適しているかを、本実験アプローチで試験してみた
。抗CD3−媒介リディレクテッド(redirected)溶解方法をこの目的のために用
いた。実験手法は下記する通りである。
培養上澄み液から、その細胞病原性効果が最大となる時点(感染後6―8日)で
精製した。かかる目的のために、培地を採取し、ウイルス粒子をSW28ロータ
ーにおいて24,000rpm(10℃)で1時間遠心分離することによって沈
降沈殿させた。この沈殿物を再度PBS中に懸濁させ、酒石酸グリセリン勾配に
層形成させた。超遠心分離を行った後、透過光中で可視となるデンスボディーに
帰属せしめられるべきバンドを針と1mlの注射器とを使って除去した。一つの
アリコートをSDS−PAGEでの純度について検討し、且つ当該調製標本中に
おけるDBの量を、Raytest社−ドイツーから販売されているTinaソ
フトウエアを使用してBSA標準と比較することによって色強度に基いて定量し
た。DBの外膜がその免疫原性にどの程度関与しているかを解析するために、こ
の調製標本の一部を試験するに際して、外膜を外被ーコア構造部から分離したが
、粒子の粒状性質は保持するようにした。この目的のためには、DBの当該部分
を液体窒素中での冷凍とその後の解凍という繰り返しサイクル10回に供した。
次いで粒子をBranson sonifier(sonifier 250;
設定条件:稼働率、10%、段階 3―出力制御 2.5)中で10分間音波破
砕処理し、このように処理した粒子の構造を電子顕微鏡で可視化し、その物理的
性質をスクローズ勾配で解析した。
れらのマウスを何れの場合においても、試料をPBSに溶解したものの50μl
容量を右後足に投与することによって免疫化した。各群6匹の動物から成る5群
の動物を免疫化した。群1は、PBS中の精製ネズミCMV(MCMV)2x
105 pfuで免疫化し、群2は、それぞれ完全なデンスボディーの50μg(
pp65の含量に標準化したクマシ―ゲル中の量)で免疫化し、また群3は、完
全なデンスボディー2μgで免疫化し、さらに群4は、機械的に損傷したデンス
ボディーの20μg(プロトコールを参照のこと)で免疫化しまた群5は、PB
Sの50μlで免疫化した。8日目に、同側性および対側性膝かリンパ節を切除
した。これらのリンパ節を金属篩に摩擦して通過させ次いで数回洗浄することに
よって、リンパ球を単離したが、リンパ節は群毎にプールした。細胞数を測定し
た後、コエレアのリンパ球は、IL−2含有培地で八日間の中間培養を行った(
組換え型IL−2の100U/T細胞培地の1ml)。MEMアルファをT細胞
培地として使用したが、更に10%のFCS、4mMのL―グルタミン、100
U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、10μg/m
lのカナマイシン、10mMのHepes、0.00035% β―メルカプト
エタノールを含有するものであった。16日目に、リディレクテッド溶解を実施
したが、これは、当初p815肥満細胞種細胞(ATCC番号:TIB−64;
生物:Mus musculus D)をCr−51で標識化することによって
行ったが、具体的には1x106個の細胞を30μlのFCS中に再懸濁させ、
次いで100μCiのCr−50(重クローム酸ナトリウム)を用いて37℃に
て75分間標識化することによって行った。これらの細胞をP815培地中で三
回洗浄して、過剰のクロームを除去した(P815培地:RPMI,10mM
Hepes、5%FCS、2mM L−グルタミン、100U/mlのペニシリ
ン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、0.00035% β―メルカプ
トエタノール)。この細胞集団の一部に抗CD3抗体を負荷した:即ち、このこ
とは、5x105個のP815細胞を5μlの抗CD3抗体と共に室温で15分
間培養することによって行った(ハムスター抗マウスCD3ε;Southern Biote
chnology Associates Inc. Birmingham、AL;0.5mg/ml in PBS)
。これらの細胞は二度洗浄した。
000個の標的細胞(P815又はP815/抗CD3)を各ウエルに添加した
。最大限の溶解を決定するために、100μlの培地を効果器細胞の代わりに添
加した。遠心分離(100g、4分間)を行った後、37℃にて4時間培養を行
った。遠心分離を繰り返し(430g、4分間)100μlの上澄みを除去して
、そのCr−51の放射能をガンマカウンターで測定した。それぞれの効果器細
胞集団に対する溶解準位は、以下のようにして求める。
) 特異的再導向溶解は、対側リンパ節細胞に対して求めた溶解準位を減じれば求め
られる。
nicator中で10分間音波破砕(sonifier 250;設定条件:
稼働率、10%、段階 3―出力制御 2.5)することによって機械的に損傷
させた。
CTLの誘導 天然DBと破砕処理DBの投与が、実験動物体内において細胞障害性効果器細
胞を活性化するのにどの程度適しているかを、かかる実験で試験してみた。ヒト
HLA−A2分子(C57/BL6−A2.kb)に対してトランスジェニック
であるC57/BL6系の8−10週令マウスからなる群を実施例4において記
載したように20μgのDB,20μgのDB又は20μgの破砕処理DBにア
ジュバントを添加することなくそれぞれPBSに溶解したもので足底内免疫化に
供した。膝かリンパ節の細胞を上記したように採取し、数えそして100μU/
mlの組替え型ヒトインターロイキン2を添加したT細胞培地でインビトロにて
8日間培養した。16日目に、これら細胞集団中におけるHCMV特異的細胞障
害活性を測定した。クローム遊離試験に用いた標的細胞は、ヒトT2細胞(AT
CC CRL−1992)及びJurkat細胞(ATCC番号 TIB−15
2)であり、これらは、キメラMHC分子A2.kb遺伝子を安定的に発現する
細胞である。これらの細胞を実施例4において記載したようにCr−51で標識
化し、次いで5x105個の細胞からなる部分群に、一部は腫瘍抑制タンパク質
p53由来のHLA−2が提示する公知のpp65ペプチド(アミノ酸 495
−503;Jerini、Berlinにより合成して調製されたペプチド)で
また別には同じHLA−A2が提示する当該しない対照ペプチド(アミノ酸14
9−157)とを負荷した。この目的のために、これらのペプチドは、10-3の
濃度でPBS中に溶解させ、次いで更に十進法により稀釈した。5x105個の
標的細胞からなる部分をペプチドと共に500μlの容量にて最終濃度として1
0-5乃至10-10Mで37℃にて1時間培養した。未結合ペプチドをT細胞培地
で洗浄した。これら二種類のT細胞系を負荷するための最適ペプチド濃度は、予
備試験によってJurkat細胞に対しては10-6MまたT2細胞に対しては1
0-8Mと決定された。
た(図5)。即ち、該当しないペプチド(腫瘍抑制タンパク質p53由来のHL
A−2が提示するペプチド)を標的細胞に負荷した後での平行実験で得られたク
ローム遊離値を、pp65を負荷した標的細胞の特異的溶解を行った各ケースに
おいて得られた数値から減じた。その結果、DBによる免疫化によって、pp6
5特異的(HCMV特異的)CTLが産生されることが明らかとなった。更に、
2μgのDBにより免疫化した動物の細胞は、E:T比を予め一定に設定した場
合は20μgのDBで免疫化した動物の細胞よりもクローム遊離数値が若干高く
なった。破砕処理した粒子で免疫化した動物の細胞は、矢張りpp65特異的溶
解減少を示したのであるが、その細胞障害性効果器活性の一つの基準・目安であ
るクローム遊離は、特定のE:T比においては未処理DBを投与した動物から得
られた細胞よりも明らかに低くなった。特に、破砕処理した粒子で免疫化した動
物から得られた細胞の細胞障害性活性の一つの基準・目安であるクローム遊離値
を予め一定に設定した場合、かかるE:T比を実現するために必要な効果器細胞
の相対的な数は、明らかに高くなった。これらの結果をまとめると、(I)“死
滅抗原”であるDBで実験動物を免疫化することは、HCMV特異的細胞障害性
T細胞を産生させるために適していること、及び(II)細胞性免疫応答の効率
は、恐らく完全なエンベロープにより介在されるDBの細胞性取り込みに依存し
て異なること、この二点が明らかとなる。このような結果は、細胞内病原体に対
するCTLの効率的な産生が、通常は細胞内での相当する抗原のデノボ合成に依
存することからして、例外的に注目するべきことであると言わねばならない。M
HCクラスI複合体に対するウイルス特異的ペプチドの“外因性負荷”は、DB
によって介在されるのであり、例外的に極めて効率が良いとみなすことが出来、
HCMVのみならず例えばインフルエンザウイルスなど異種性病原体に対しても
作用する保護的細胞障害性効果器の機能を生成させるのに適しているはずである
。
答が誘導されこと 体液性及び細胞性の終生免疫応答を誘導することは、Tヘルパーリンパ球を誘
導することが可能であるか否か、及び如何なる態様にてこれを誘導することが出
来るかに決定的に依存するのである。ウイルス性病原体に対して免疫化が行われ
ると、Th1典型的免疫応答を生成させることが特に望ましい。DBによる免疫
化がどの程度にまでかかる目的に適しているかを検討するために、二つの実験的
アプローチを選択した。
動物から得られたリンパ節細胞が、中間培養を行った場合にTh1典型的リンホ
カイン類(この場合は、ガンマ(γ)―インターフェロン、即ちIFN―γ)又
はTh2典型的(この場合は、インターロイキンー5、即ちIL−5)を合成し
且つ遊離するか否かを試験した。それぞれ6匹のBalb/cJマウスから成る
群を2μgのDB,20μgのDB又は20μgの破砕処理DBをそれぞれPB
Sに溶解したもの又はPBS単独で足底内免疫化に供した。リンパ節細胞を実施
例4において記載したように、免疫化して8日後に採取し、106細胞/mlな
る密度で、2mM L−グルタミン、100U/mlのペニシリン、0.1mg
/mlのストレプトマイシン、5%FCS、5x10-5の2―メルカプトエタノ
ール、10mM Hepesを添加したRPMI 16040培地内に播種した
。これらの細胞は、培養過程で20μgのDB又は20μgの破砕処理DB、M
HCクラスI(HLA−A2)で提示されるペプチド(pp65、495−50
3)又はPBSによってこれらの抗原を培地に添加することによって再刺激した
。最刺激の24時間及び36時間後に、細胞培養上澄み液を集め、Eppend
orf遠心分離機において2500rpmで10分間遠心分離して、細胞残渣を
除去した。培養細胞から得た上澄み液中のIFN―γ及びIL−5の含有量を市
販のELISAテストキット(Engogen,Woburn,U.S.A.)
を使用して測定した(図6)。測定値を標準化するために、同一テストキットに
あわせて提供されている組換え型IFN−γ及びIL−5を細胞培養培地に溶解
し、平行して分析した。
IFN−γを分泌した。破砕処理した粒子で免疫化した動物由来の細胞は、明ら
かに分泌されるIFN−γが少なかった。IL−5は、どの混合物においても有
意な量で測定されることはなかった。これらの結果から、デンスボディーによっ
て動物を免疫化することが、Th1典型的免疫応答を誘導するのに適しているこ
と及び逆にその誘導程度は、DB膜の完全さに依存して変わることが、明らかと
なった。
いることが判っているので、第二の実験的アプローチにおいては、マウスを20
μgのDBを用いて4週間の間隔をおいて三回免疫化した。第一回目の注射から
12週間及び32週間後に、これらの動物からエーテル麻酔下心臓穿刺によって
全血を採血し、27℃で2時間培養して凝集させ、4℃にて一晩貯蔵し、翌日1
4000rpmで10分間遠心分離した。透明な血清上澄み液を取り除いて、狩
猟のアリコートとしてー20℃で貯蔵した。血清中におけるIgG1及びIgG
2aサブクラスのHCMV特異的免疫グロブリン含量を測定した。Th1典型的
免疫応答の過程で、IgG2aクラスの抗体が優先的に生成されるが、これに対
してTh2典型的免疫応答では、IgG1クラスの抗体が優勢となる。これらの
実験動物から得られた血清を56℃で30分間不活性化させ、細胞外HCMV粒
子の抗原をコートした市販のELISA(Biotest AG, Dreie
ich)を用いて試験した。個の目的のために、試験血清の段階稀釈シリーズを
調製し、ピペットでELISAプレートのウエルに移し、37℃にて2時間培養
した。PBS/0.05% Tween2oで三回の洗浄工程を経た後、サブク
ラス特異的HRP結合二次抗体をPBS/2% Tween20/3%FCSに
よる1:2000なる稀釈率で添加し、湿潤雰囲気中37℃にて1時間培養した
。更に4つの洗浄工程を経た後、OPD発色反応を行ったが、この反応は、10
0μlの0.5MH2SO4を添加することによって停止させた。492nmの波
長における吸光度をELISAリーダーで測定した。
清の吸光度の2.5倍に相当する数値を所謂“終点希釈率”として得た。IgG
1:IgG2aに対する終点希釈率の比から、一つのアリコートが得られるが、
これは、免疫化プロトコールの如何に拘わらず常に0.3以下であった(図8)
。IgG1:IgG2a比率が1以下であることは、Th1典型的免疫応答を示
すが、これに対してこの比率が1以上であることは、Th2応答を示すので、個
の実験から、DBによる免疫化は、Th1様のTヘルパー細胞応答を誘導するこ
とが証明された。同様の結果が、DBの足底投与による平行実験で得られた。こ
のことから、投与の形態の如何に拘わらず、DBによる免疫化によって、実験動
物においてはTh1典型的免疫応答が得られることが明らかとなった。
いてHCMVの欠損突然変異株を補完すること 最少数のPassageを有するヒト線維芽細胞を6ウエルプレートに播種し
たが、何れの場合にも105個の細胞を用いる。カバーガラスを対照目的のため
にこれらのウエルのいくつかに用いる。
ョンする。所望のトランスジーン(transgene)を例えば、ブラスチシジン(blast
icidin)デアミナーゼ遺伝子を有するプラスミドpcDNA6/V5−His(
Invitorogen)で発現させる。この遺伝子の発現によって、ブラスチジンSなる
物質に対する抵抗性が付与される。
与するベクターpRG273と共に別の発現プラスミドに所望のトランスジーン
をトランスフェクションさせることである。このベクターは、ベクターpLXS
N16E6E7の誘導体であり、この抵抗性遺伝子以外にヒトパピローマウイル
ス16の形質転換タンパク質E6及びE7を発現する。このことによって、関連
細胞の増殖ポテンシャルをその形質転換によって増大させることが出来る。
Diagnostics)の“Fugene法”によって実施される。かかる目的のために、3μ
lのFugene試薬を97μlのFCSを含まない培地と混合し、室温で5分
間培養する。ほぼ2μgのトランスジーンプラスミドのDNA(ダブルトランス
フェクションの場合は、50ngのpRG273をプラス)を加え、また室温で
15分間経過後に、900μlの血清含有培地を添加する。古い培地を取り除い
た後で、この混合物を細胞に加える。トランスフェクションは、3乃至8時間の
間行われる。この後、トランスフェクション混合物を除去し、培養用培地を加え
る。2日間培養した後、カバーガラスを24ウエルプレートに移し、洗浄し、次
いで90%アセトンで固定化する。このトランスジーンの発現は、抗体を用いて
間接的免疫蛍光顕微鏡でチェックする。
で遊離させ、選択培地(例えば、3μg/mlのブラスチシジン、2μg/ml
のピューロマイシン、250μg/mlのG418など)に播種する。細胞コロ
ニーがこの選択培地で形成された場合は、これらコロニーを単離し、更に選別条
件下で更に培養する。細胞を次に選別条件下で膨張させ、当該トランスジーンの
発現強度を例えばイミュノブロットでチェックする。当該発現が充分であれば、
細胞をいくつかのアリコートに分別し、次に使用するまで液体窒素中で保存する
。
産生させるための策定方針 組換え型DBを産生させるための可能性ある一つ策定方針は、以下の通りであ
る。
Bluescribeにクローニングしたもの)からスタートして、先ずpp6
5遺伝子の3'部分の特異的SrfI切断部位にクローニングした異種核酸区分
を含有するプラスミドクローンを幾つか産生させる。pp65以外のHCMVタ
ンパク質又は他の病原体のタンパク質の種々の抗原性部位をコードするDNA領
域を、UL83(pp65)を有する連続オープンリーディングフレームが生じ
るようにクローニングする。これらの異種DNA区分を基準として3'方向にお
いて、連続オープンリーディングフレームにおけると同様に、所謂グリーン蛍光
タンパク質(GFP)をコードする遺伝子とネオマイシントランスフェラーゼと
から成る融合遺伝子をクローニングすることも可能である。この遺伝子は、何れ
の場合にもファージP1のCreリコンビナ―ゼ認識部位(LoxP部位)によ
って選択されるべきである。これから得られるプラスミド構築物を図7に示す。
、得られた細胞をHCMVAd169株に重複感染させる。同種の組換えの結果
、pp65の代わりにそれぞれの融合遺伝子を含む組換え型HCMVゲノム分子
が得られる。G418を培養用培地に添加することによって、これら組換え型D
NA分子の複製と組換え型ウイルスの濃縮とを行うための選択がなされる。GF
Pの発現によって更には、サイトフルオロメトリー(FACS)を使用して、組
換え型ウイルスゲノムを含む細胞の正の選別を行うことが可能となるのである。
組換え型ウイルスの効率的な濃縮とその後の単離とが、かくして確保されること
になる。
―ゼを発現する細胞系をパッセージさせる。このリコンビナーゼは、DNA分子
中の塩基対の短い配列(loxP部位)を認識し、かかるloxP部位の間に位
置するDNA区分を正確に切り取りする。この結果、選抜を行うために以前に使
用し且つGFP−NeoをコードするDNA区分が欠失されることになる。GF
P陰性細胞をFACSで選別した後、選別のためのpp65融合タンパク質を発
現する純粋ウイルスを単離し且つ精製する。
る。かかるウイルス感染過程においては、組換え型DBが感染細胞において産生
されるので、その後は勾配遠心分離によって細胞培養上澄み液から精製すること
が出来る。
融合タンパク質を発現するウイルス。この種の領域は、文献においてはAD1及
びAD2と記述されてきた領域である。Towne laboratory株のgBに由来するA
D2に相同である領域は、TW2と記述されてきた領域である。
エピトープとから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。
HCMVのIE1タンパク質(IE1)のうちの公知CTLエピトープとから構
成される融合タンパク質を発現するウイルス。
55)の核タンパク質など、他の病原体の公知CTLエピトープとから構成され
る融合タンパク質を発現するウイルス。
TLエピトープ(CTL)とから構成される融合タンパク質を発現するウイルス
。
中におけるHCMV中和抗体を検出するための中和アッセイの結果を示す。実施
例1において記載された染色方法によって4倍混合物中において陽性細胞核が最
早や一切検出可能でない場合(破線)、中和を100%と評価する。特定の血清
稀釈倍率での中和度は、4倍混合物中での陽性細胞の数を抗体を含まない同一混
合物中の陽性細胞の数を基準として比較することから得られる。
それぞれ4週間隔てて三回腹腔内免疫化した場合のマウスの血清中におけるHC
MV中和抗体を検出するための中和アッセイの結果を示す。このアッセイは、図
1において示すように評価した。点線は、100%中和が生起した場合の血清力
価を示す。“ゼロ血清”として用いたものは、HCMV粒子で免疫化しなかった
マウスから得られた血清であった。
いて三回腹腔内免疫化した場合(それぞれ4週間隔てて)中和抗体の持続を検出
するための中和アッセイの結果を示す。評価は、図1に示すように行った。
レクトした溶解によって破砕処理した天然デンスボディーでマウスを免疫化した
場合の全細胞障害活性を解析した結果を示す。それぞれの場合において観察され
た溶解活性を標的細胞に対する作動細胞の比についてプロットしてある。
ーで免疫化した場合のリンパ節細胞が示すHCMV特異的細胞障害活性を解析し
た結果を示す。それぞれの場合において観察された溶解活性を放射性クロームの
遊離放出度により測定し、標的細胞に対する効果器細胞の比(E:Z比)につい
てプロットしてある。破線は参考として、現行レベルの溶解を達成するために必
要な作動細胞の相対的数を示す。明らかなように、同一レベルの溶解を達成する
ためには、未処理DBによって免疫化した動物由来の細胞の使用数は明らかに低
くする必要があった。
ーで免疫化した場合のリンパ節細胞によるリンホカイン放出・遊離に基いた、T
h免疫応答の本質を解析した結果を示す。遊離されたIFN−γの量を再刺激後
の経過時間に対してプロットしてある。図A)20μgのDBで免疫化、図B)
20μgの破砕処理DB(drDB)で免疫化、図C)20μgのDBで免疫化
及び図D)PBSで免疫化(負の対照―ネガティブ コントロール)。再刺激に
用いた抗原は、図D)内のはめ込み部において示してある。IL−5分泌は、平
行して測定した。IL−5の有意の分泌は、何れの場合においても検出不可能で
あった。
生させるための手法を示すが、これは実施例8において記載する。
alb/cJマウスの血清中におけるHCMV特異的抗体のIgGサブクラスの
プロフィールを示す。血清は、第一回目の注入後12週間及び32週間において
採取し、実施例6において記載したように分析した。ELISAでの吸収が、ゼ
ロ血清の吸収の2.5倍に相当するアッセイ血清の終点稀釈率を示す。IgG1
/IgG2比をそれぞれの場合においてこれらの数値から算定した。
Claims (24)
- 【請求項1】 下記を特徴とする、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイル
ス(HCMV)感染後に遊離されるウイルス粒子: a)該粒子が、ウイルス性グリコプロテイン類が内部に包埋される脂質膜によっ
て囲にょうされること; b)該粒子が、ウイルス性DNAおよびカプシドのいずれをも含有しないこと;
及び c)該粒子が、T細胞抗原pp65(UL83)の構成部分の一種以上及びpp
65ではない一種以上のタンパク質の構成部分の一種以上とを含んで成る融合タ
ンパク質を含有すること。 - 【請求項2】該T細胞抗原pp65(UL83)を一種のHCMVグリコプ
ロテインの構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1におい
て記載された粒子。 - 【請求項3】 該T細胞抗原pp65(UL83)をHCMVグリコプロテ
インgBの構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1におい
て記載された粒子。 - 【請求項4】 該T細胞抗原pp65(UL83)をHCMVグリコプロテ
インgHの構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1におい
て記載された粒子。 - 【請求項5】 該T細胞抗原pp65(UL83)をHCMVプロテインI
E1(ppUL123)の構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、
請求項1において記載された粒子。 - 【請求項6】 該T細胞抗原pp65(UL83)を一種のHCMVグリコ
プロテインの構成部分の一種以上及びHCMVプロテインIE1(ppUL12
3)の構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1において記
載された粒子。 - 【請求項7】 該T細胞抗原pp65(UL83)をHCMV以外のヒト病
原体の構成部分である一種のタンパク質の構成部分の一種以上に融合させること
を特徴とする、請求項1において記載された粒子。 - 【請求項8】細胞障害性Tリンパ球(CTL)が、HCMV以外のヒト病原体
に自然感染した場合、該病原体の構成部分である当該タンパク質に対抗してヒト
体内に生成されることを特徴とする、請求項7において記載された粒子。 - 【請求項9】HCMVではない他種ヒト病原体が、HIV−1,HBV、HC
V及びインフルエンザから成る群から選択されることを特徴とする、請求項8に
おいて記載された粒子。 - 【請求項10】該融合タンパク質が、他種ヒト病原体の一種のタンパク質のエ
ピトープの少なくとも一種、感染後直ちにヒト体内に形成される該エピト-プに
対抗する中和抗体及び他種ヒト病原体の一種のタンパク質の他のエピト-プの少
なくとも一種とを含んで成るに際して、CTLが、感染後直ちにヒト体内におい
て他のエピト-プに対抗して生成されることを特徴とする、請求項8において記
載された粒子。 - 【請求項11】該融合タンパク質が、感染後直ちにヒト体内に生成される中和
抗体が対抗するエピトープの少なくとも一種及び感染後直ちにヒト体内において
生成されるCTLが対抗する他のエピト-プの少なくとも一種とを含んで成るに
際して、該エピト-プが、同一病原体のタンパク質から誘導されることを特徴と
する、請求項1乃至9の内の何れか一項において記載された粒子。 - 【請求項12】下記を特徴とする、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス
感染後に遊離されるウイルス粒子: a)該粒子が、ウイルス性グリコプロテイン類を内部に包埋する脂質膜によって
囲にょうされること; b)該粒子が、ウイルス性DNAおよびカプシドのいずれをも含有しないこと;
及び c)該粒子が、他の異なるHCMV株に由来した特定の一種のグリコプロテイン
の変異体である少なくと二種のグリコプロテインの構成部分を含むこと。 - 【請求項13】該特定HCMVグリコプロテインの二種の変異体のうちの一つ
が、HCMV Towne株の変異体であり、また残りの変異体が、HCMV
Ad169株の変異体であることを特徴とする、請求項12において記載された
粒子。 - 【請求項14】該グリコプロテインが、HCMVのgBタンパク質であること
を特徴とする、請求項12において記載された粒子。 - 【請求項15】下記する工程を含んで成る、HCMVを増殖させるための方法
:a)ゲノムにおいて必須の遺伝子が欠失されているHCMVを提供すること;
b)前項a)において欠失されたHCMV遺伝子を発現する安定にトランスフェ
クションされた哺乳動物細胞系を提供すること;及び c)前項b)の細胞において前項a)の欠失遺伝子を増幅させること。 - 【請求項16】ヒト包皮線維芽細胞を工程b)においてトランスフェクション
させることを特徴とする、請求項15において記載された方法。 - 【請求項17】該哺乳動物細胞が、脂質含有試薬によってトランスフェクショ
ンされることを特徴とする、請求項15において記載された方法。 - 【請求項18】該哺乳動物細胞が、“Fugene”試薬によってトランスフ
ェクションされることを特徴とする、請求項15において記載された方法。 - 【請求項19】工程a)におけるHCMVが、主要カプシドタンパク質(UL
86)の遺伝子において欠失を有することを特徴とする、請求項15において記
載された方法。 - 【請求項20】下記する工程を含んで成る、ウイルス粒子を産生させるための
方法: a)請求項15乃至19の内の何れか一項において記載されたHCMVを提供す
ること; b)工程a)において増殖させたウイルスを哺乳動物細胞に感染させること;及
び c)工程b)において感染させた細胞からウイルス粒子を分離するに際して、 α)該粒子をウイルス性グリコプロテインが内部に埋設される脂質膜で囲にょう
すること; 及び β)該粒子が、ウイルス性DNA及びカプシドのいずれをも含有しないこと。 - 【請求項21】下記を特徴とする、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス
感染後に遊離されるウイルス粒子をワクチンとして使用する方法・用途: a)該粒子が、ウイルス性グリコプロテイン類が内部に包埋される脂質膜によっ
て囲にょうされること;及び b)該粒子が、ウイルス性DNAおよびカプシドのいずれをも含有しないこと。 - 【請求項22】該ウイルス粒子が更に付加して、T細胞抗原pp65(UL8
3)の構成部分の一種以上及びpp65ではない一種以上のタンパク質の構成部
分の一種以上とを含んで成る融合タンパク質を含有することを特徴とする、請求
項21において記載された使用法・用途。 - 【請求項23】 該粒子が、他の異なるHCMV株に由来した特定の一種のグ
リコプロテインの変異体である少なくと二種のグリコプロテインの構成部分を含
むことを特徴とする、請求項21において記載された使用法・用途。 - 【請求項24】 該ウイルス粒子が、請求項20において記載された方法によ
って産生されることを特徴とする、請求項21において記載された使用法・用途
。
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