PT100460B

PT100460B - Partiiculas derivadas de virus de herpes e vacinas que as contem

Info

Publication number: PT100460B
Application number: PT100460A
Authority: PT
Inventors: John Mclauchlan; Fraser John Rixon
Original assignee: Medical Res Council
Priority date: 1991-05-07
Filing date: 1992-05-06
Publication date: 1999-07-30
Also published as: AU653483B2; EP0585267A1; AU1659492A; EP0585267B1; IE921459A1; PT100460A; CA2068066A1; DE69232858D1; JPH06509466A; ATE228568T1; NZ242641A; WO1992019748A1; CA2068066C

Description

Il-ÇAMPO-TECNICO-DAJ^NVENÇÃO

A invenção refere-se a uma forma de partículas do vírus da herpes para uso na vacinação e às vacinas que as contêm.

2. DESCRIÇÃO DE TÉCNICAS RELACIONADAS

Nos virioes infecciosos do vírus da herpes simplex, o ADN do vírus está contido numa nucleo-cápside icosaédrica que por sua vez se encontra envolvida por um tegumento proteináceo amorfo e por um envelope que compreende glicoproteínas. (Dargan, 1986).

Durante a purificação duma espécie de vírus da herpes simplex do tipo I (HSV-1), mediante centrifugação de gradiente de velocidade, observaram-se duas bandas de partículas distintas .

Em adição à banda dos viriões existia uma banda de partículas mais claras acima dela. Estas consistem num tegumento envolvido por um envelope, mas não compreendem a cápside e o ADN virais, e, consequentemente, são não-infecciosas. Elas foram então denominadas como partículas L (Szilágyi e Cunningham, 1991).

aspecto e a composição das partículas L sugerem que a sua génese está relacionada com a dos viriões, apesar de co-existirem diferenças de composição dos tipos de partículas, o que indica que as suas formas de associação não são idênticas. As partículas L oferecem potencial para uma vacina sub-unitária. não infecciosa, mas a incapacidade de as produzir substancialmente isentas de viriões contaminantes constitui um obstáculo e prejudica esta linha de pesquisa.

SUMARIO DA INVENÇÃO

Examinámos a produção das partículas relacionadas com o vírus usando para tal ts 1201, um mutante do HSV-1 sensível à temperatura, com um defeito no gene UL26 (Preston et al., 1983, Preston et al., 1991). A temperatura não permissivas, o ts 1201 produz ADN virai e um espectro completo de proteínas víricas, incluindo as espécies estruturais últimas. 0 agrupamento cápside toma lugar a estas temperaturas, mas o ADN virai não se encontra armazenado dentro da cápside e as cápsides vazias são retidas no núcleo das células (Preston et al. , 1983). Logo, os viriões maduros não são produzidos a temperaturas não permissivas.

Descobrimos agora que o mutante ts 1201 produz partículas L a temperaturas não permissivas, em quantidades similares às geradas pelos vírus do tipo natural. A capacidade deste mutante agrupar partículas L mostra que a sua formação pode realizar-se sem o envolvimento das cápsides, Além disso, para ts 1201, e por inferência de outros mutantes do vírus natural, o

agrupamento das partículas L pode realizar-se independentemente do agrupamento de viriões, tornando possível isolar as partículas L substancialmente isentas de viriões contaminantes e, consequentemente, possibilitando o seu uso como ingrediente activo duma vacina. Este facto é surpreendente pois poderia razoavelmente supor-se que a forma de produção das partículas L envolviam·, a capacidade de as células infectadas pelo vírus produzirem viriões. Descobrimos ainda que as partículas L são também produzidas por uma outra espécie do HSV-1 e por outros vírus da herpes.

Perante as descobertas anteriormente descritas, a presente invenção desenvolve as partículas L do vírus da herpes, relacionadas com o vírus (ou um semelhante dum virião), mas não infecciosas compreendendo o tegumento envolvido' por um envelope, mas que não possui uma cápside e o ADN virai dentro da cápside, para uso na vacinação contra as infecções pelo vírus da herpes.

termo partículas L, tal como aqui é usado, não deve ser entendido como indicador de um qualquer processo usado para as produzir, mas, sim, como uma marca conveniente para nos referirmos às partículas acima definidas. Apesar delas serem produzidas a partir do vírus natural e a partir dum mutante sensível à temperatura, apreciar-se-à que as citadas partículas são convenientemente obtidas a partir de técnicas recombinantes de ADN. As descobertas aqui explicadas indicam que, eliminando os processos e sinais responsáveis para a formação ou libertação a partir do núcleo duma estrutura núcleo-cápside, será possível produzir partículas L substancialmente isentas dos viriões infecciosos.

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Usando um vírus da herpes que compreende ADN recombinante que codifica uma proteína ou péptido estranhos, as partículas L podem ser preparadas de forma a compreenderem as referidas proteínas ou péptidos estranhos, permitindo assim que as partículas L sejam usadas no combate de outras doenças que não as infecções pelo vírus da herpes. A invenção, consequentemente, desenvolve ainda partículas L dum vírus da herpes relacionadas com um vírus (ou virião semelhante), mas não infecciosas, em que as partículas L compreendem um péptido ou proteínas estranhos, ambos per se e para uso na vacinação contra qualquer doença (cujo termo inclui qualquer condição medicamente tratável) para as quais quaisquer proteínas ou péptidos estranhos são um imunogene. Apreciar-se-à que a ideia do uso de recombinantes do ADN do vírus da herpes com um ADN estranho apareceu depois de se ter descoberto, através desta invenção, que as partículas L possuiam um potencial real para uso nas vacinas, mais especialmente após se ter mostrado que as partículas L podem ser produzidas essencialmente isentas de viriões a partir duma espécie mutante do HSV-1. Logo, considera-se que a ideia não provém da literatura de Szilágyi e Cunningham (1991).

A invenção inclui também uma preparação baseada no vírus ou consistindo em ou incluindo partículas L dos vírus da herpes e substancialmente isentas de viriões. A expressão substancialmente isenta de viriões indica, evidentemente, que a preparação possui uma isenção em viriões, do que a banda de partículas 1 que se obtém mediante a separação de partículas H das partículas L, por exemplo, como se encontra descrito na literatura de Sziágyi e Cunningham (1991). Descobriu-se que a banda de partículas L é contaminada na extensão duma propor- ção de partículas L : virião de 10 : 1 nesta técnica, pelo que na presente invenção é normal esperar-se uma proporção de

6 pelo menos 10 : 1 e de preferência de pelo menos 10 : 1. A

invenção compreende uma tal preparação de vírus ambos per se e para uso numa vacina.

A invenção inclui ainda a vacina que compreende tais preparações de partículas L ou vírus, de um vírus da herpes. A vacina pode compreender uma substância veicular ou um agente imuno-estimulante, como substâncias auxiliares.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Nos desenhos anexados:

A Figura 1 é uma fotografia que mostra as partículas do vírus separadas num gradiente, para um vírus do tipo natural (A) e o mutante ts 1201 (B);

A Figura 2 é uma fotografia de um gel de poliacrilamida manchado com prata, que mostra as bandas de politpétido obtidas por PAGE a partir de partículas virais separadas num gradiente ;

A Figura 3 é um diagrama de plasmido, que mostra a derivar· ção de um plasmido que comporta o ADN estranho, para inserção dentro do ADN do vírus da herpes , para preparação das partículas L que incorporam uma proteína estranha (ver o Exemplo

2) .

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Quando as partículas L foram primeiro identificadas, não se sabia se estas eram especificas do HSV-1 ou da espécie HSV-1 usada, nomeadamente da espécie 17, ou se ocorriam numa extensão mais vasta. Demonstrou-se agora que estas partículas são também produzidas por uma espécie HSV-1 diferente, a espécie F (Ejercito et al., 1968) e outras, distantemente relacionadas com os o<-vírus da herpes, nomeadamente a espécie vírus pseudorabies Ka (Kaplan e Vatter, 1959) e a espécie de vírus da herpes equina AB4 obtida por E. Telford, MRC Virology Unit, Institute of Virology, Glasgow Gll 5JR, Escócia). A natureza diversa destes vírus torna altamente provável que as partículas L sejam principalmente obtidas a partir dos vírus da herpes do tipo «sí. e de outros tipos de vírus da herpes.

A presente invenção torna possível produzir partículas L substancialmente isentas de viriões infecciosos, usando um vírus que foi submetido a incapacitação genética apropriada. Numa realização preferida, as células são infectadas com um mutante letal condicional, sob condições não permissivas para o desenvolvimento de vírus. A expressão mutante letal condicional refere-se a um mutante letal para o desenvolvimento do vírus sob certas condições. A temperatura é um exemplo comum de uma das tais condições, sendo as células infectadas com um mutante sensível à temperatura, por exemplo ts 1201, a uma temperatura não permissiva. A temperatura não permissiva é uma qualquer temperatura, á qual o vírus natural se desenvolve, ma o mutante não, e está normalmente compreendida no intervalo entre 38²C e 40²C. As células infectadas são incubadas durante um período de tempo sufidente do ADN virai e para permitir que pósteriormente sejam produzidas proteínas traduzidas, permitindo assim que as partículas L se juntem e acumulem. 0 pe-

ríodo requerido deve ser tipicamente de 20 horas ou mais, mas irá variar de acordo com a natureza da mutação.

Muitos outros mutantes sensíveis á temperatura podem ser produzidos e testados para efeitos similares aos descritos na literatura acima mencionada. Muitos mutantes são perdidos, no sentido de que eles produzem viriões a algumas temperaturas dentro do intervalo de temperaturas não permissivas.

Consequentemente, é necessário optimizar a temperatura para minimizar a contaminação por viriões, mas tal é um assunto rotineiro para os peritos na técnica.

Uma condição alternativa para a sensibilidade á temperatura que poderá evitar a formação de viriões é a criação de um vírus, a partir do qual se apagou um gene essencial. Por exemplo, se uma proteína cápside for removida do genoma do vírus, então esse vírus apenas se poderá desenvolver em linhas de células geneticamente preparadas que expressam essa proteína cápside proteína apagada. Sob estas condições, a linha de células desenvolverá a proteína cápside essencial para a produção de viriões. Quando o vírus se desenvolve nesta linha de células, é usado para infectar células que não expressam a cápside de proteínas, não se realizando a produção de viriões. No entanto, as partículas L serão produzidas, pois as cápsides de proteínas não são um componente essencial para a sua produção. Sob estas condições, a eliminação será letal para o desenvolvimento do vírus. Existem outros meios mais sofisticados para a criação de mutantes letais condicionais e a expressão abrange muitas formas de evitar a produção de viriões.

Qualquer um dos genes responsáveis pela formação duma cápside completa pode ser adequadamente incapacitado, por exemplo, por eliminação, mutação ou inserção de nucleóti do(s). Normalmente, a eliminação será o processo preferido, pois os seus efeitos são mais facilmente previsíveis, mas muitos mutantes sensíveis à temperatura existem já e são semelhantes, e assim possivelmente alguns deles suficientes para produzir partículas L substancialmente isentas de viriões infecciosos.

mutante ts 1201 do HSV possui uma mutação no gene UL26, que codifica uma proteína envolvida no armazenamento do ADN. Outros genes do HSV-1, que podem ser tornados incapazes a fim de produzirem partículas L substancialmente isentas de viriões, compreendem:

UL6, um gene que codifica uma outra proteína envolvida no armazenamento do ADN. As mutações de tsN (Matz et al., 1983), tsF18 e tsF43, (Weller et al., 1987) encontram-se neste gene.

UL12, um outro gene que codifica uma proteína, nuclease alcalina, envolvida no armazenamento do ADN (Weller et al., 1990).

UL18, um gene proteico da cápside (Rixon et al., 1990).

UL19, um gene proteico da cápside. As mutações do tsG3 e tsG8 (Weller et al., 1987) encontram -se presentes neste gene.

UL28, um gene que codifica uma proteína envolvida no armazenamento do ADN. Uma mutação de tsl203 (Addison et al., 1990) encontra-se neste gene.

UL33, um outro gene envolvido na produção duma cápside completa (Al-Kobaisi et al., 1991).

UL38, um gene proteico da cápside (pertuiset et al. , 1989) Rixon et al., 1990).

Nas preparações de vírus a partir de vírus do tipo natural, a proporção númerica de partículas L para viriões infec— ciosos na banda de partículas L será normalmente igual a cer3 ca de 10 ; 1. Usando um mutante letal condicional, tal como aqui é proposto, esta proporção será normalmente de pelo menos : 1 e, de preferência, recai no intervalo compreendido entre 10^a 10^2 _: i, sendo tipicamente igual a cerca de 10^ para o mutante ts 1201. Tais preparações de vírus estão incluídas na invenção.

Mesmo uma pequena porção de viriões É indesejada na maior parte dos usos pretendidos de vacinação, portanto, na vacina comercial final, as partículas L devem ser produzidas por tecnologia de ADN recombinante. Assim, o genoma do vírus de herpes integral, sob a forma de um único ou de alguns fragmentos de ADN e apropriadamente tornados incapazes de levar a cabo a formação de viriões, serão clonados e expressos para produzir partículas L artificialmente, evitando assim uma contaminação, mesmo que ligeira, de viriões.

Dois processos para clonar ADN do HSV, no sentido de produzir partículas L isentas de viriões serão agora mencionados a título de ilustração. 0 primeiro dos citados processos usa um sistema de clonação bacteriófago (denominado como sistema de clonação Pl) que permite a clonação do genoma HSV como duas peças largas de ADN ( 50 pares Kilobase). A capacidade de

clonar tais segmentos compridos de ADN é particularmente vantajosa, pois a maior parte dos outros processos de clonação apenas permitem a clonação dos segmentos mais curtos de ADN. Quando estes segmentos compridos são clonados usando-se o sistema de clonação Pl, eles serão facilmente manuseáveis usando processos-padrão. Os tipos de manipulação contemplados dos ADN clonados são aqueles que evitam a associação de viriões. Estes processos incluem a eliminação de um ou mais genes estruturais. No sentido de se formarem partículas L sem que ocorra a formação de viriões, espera-se que seja suficiente evitar a formação duma cápside completa. Uma cápside que não possua os componentes estruturais essenciais será incapaz de criar viriões. Logo, um exemplo duma manipulação é a eliminação duma proteína de cápside. Alternativamente, os sinais localizados dentro do genoma, que são requeridos para o armazenamento do ADN, podem ser removidos, evitando novamente a produção de viriões maduros. A fim de produzir partículas L, estes fragmentos de ADN clonados poderão ser transferidos para células de mamíferos e os processos recentemente desenvolvidos originam elevados níveis de eficiência de transferência.

Um segundo processo consiste em transferir sinais de ADN fúngico para o genoma do HSV e, desta forma, criar um cromossoma de levedura artificial (YAC). Após a transferência para células fúngicas, o YAC comportou-se da mesma forma que os cromossomas de levedura normais e são, consequentemente, herdados pelas células filhas após a divisão celular. Novamente o genoma HSV será manipulado de tal forma que apenas se formarão partículas L e não viriões. 0 ADN produzido a partir de células de levedura compreendendo HSV YAC será então transferido para células de mamíferos e a produção de partículas L será ensaiada. A produção de partículas L num sistema isento de vírus usando esta técnica de ADN recombinante específica é

é uma característica preferida da presente invenção.

As partículas L são aqui definidas como possuidoras de tegumento e um envelope externo, mas isentas de cápside e de ADN virai. Espera-se que as partículas L sejam capazes de estimular as respostas imunes licitadas pelos virioes. Elas serão então capazes de estimular uma resposta, humoral. Além disso, demonstrámos experimentalmente que as partículas L irão ligar-se às células hospedeiras, fundindo-se com elas e libertando o seu contéudo. Desta forma irão auxiliar na aquisição da imunidade mediada pelas células. (A demonstração experimental envolveu o estudo das propriedades das duas proteínas dos tegumentos, nomeadamente (1) proteína de eliminação de viriões do hospedeiro HSV-1 ou HSV-2 (vhs) e (2) activador de transcriçãoe=Z,-HF (Vmw 65). Para estas experiências, foram preparados virioes e partículas L a partir de HSV-1 do tipo natural e HSV-1 mutantes. As partículas L mostraram ser tão eficientes como os viriões no fornecimento das referidas proteínas num estado funcional completo.

Espera-se que estas respostas imunes proporcionem uma protecção contra o tipo de vírus da herpes, da qual derivam as partículas L. Pretende-se que as partículas L desenvolvam uma protecção contra a infecção pelo vírus da herpes da estirpe de que provêm o que desenvolve as proteínas relevantes das partículas L, mas haverá sem dúvida, em muitos casos, um grau de protecção contra outras estirpes com um serotipo ou mesmo contra estirpes dum diferente serotipo.

Embora a invenção aqui descrita se refira a partículas L totalmente compostas por elementos duma única estirpe de vírus de herpes, pode-se desenvolver um intervalo de protecção mais vasto produzindo recombinantes de vírus que possam possuir

capacidade de expressar ADN estranho, de forma a incorporar proteínas ou péptidos epitópicos de outros tipos virais ou doutras estirpes do vírus de herpes nas partículas L. Por exemplq o ADN do vírus varicela -zoster pode ser inserido no ADN do HSV-1 para produzir partículas compreendendo proteínas VZV. De facto, o ADN estranho (não natural ou heterólogo) em tais construções poderia ser ADN de não-vírus herpes que codifica proteínas ou péptidos estranhos. ( 0 termo estranho tal como aqui se usa refere-se a estranho para as estirpes do vírus de herpes a partir das quais as partículas L são obtidas).

Nos casos em que o ADN estranho é apenas estranho no sentido de se derivar duma outra espécie ou tipo de HSV, espera-se que o HSV recombinante contendo o ADN estranho o expresse sem dificuldades, na maioria dos casos, de forma que a proteína expressa se torne incorporada dentro das partículas L (por exemplo, no envelope ou no tegumento). Assim, por exemplo, as partículas L, que compreendem uma proteína estranha na sua estrutura, podem ser preparadas por co-transferência de células apropriadas com ADN que compreende (1) ADN do HSV-1, de preferência dum mutante letal condicional, e (2) um plasmídeo compreendendo (a) ADN do HSV-1 que não é essencial para o desenvolvimento do vírus (denominada região não-essencial | NER |), interrompido por (b) ADN estranho. As células podem ser quaisquer umas adequadas para uso na vacina e aprovadas pelas autoridades de regulamentação. Elas podem ser, por exemplo, de bebés hamster ou de células de rim de macaco. As células transferidas são incubadas para desenvolverem o vírus, e o vírus é então purificado seleccionando placas e re-desenvolvendo-as. A cultura virai é então incubada sob condições não-permissivas adequadas, de preferência durante pelo menos 24 horas, para se obter partículas L, que compreendem proteínas ou péptidos estranhos, expressos a partir de ADN recombinante do vírus de

herpes, substancialmente isentas de viriões. (Alternativamente, poder-se-ia utilizar vírus do tipo natural e partículas H separadas das partículas L, mas esse não é o processo preferido). 0 meio sobrenadante é separado a partir do material celular, tão completamente quanto possível, e desenvolve uma suspensão de partículas L. A descrição anterior aplica-se mutant mutandis a outros vírus da herpes de iniciação.

Um interesse considerável centraliza-se na expressão de ADN estranho, que não é natural para o HSV, por exemplo, de outros vírus da herpes tal como o citomegalovírus humano (HCMV) ou o vírus da varicela zoster (VZV), ou duma outra família de viroses, por exemplo o grupo de vírus da imunodeficiência. Pode ser necessário incorporar o ADN estranho numa região do genoma do vírus da herpes que desenvolverá sinais, pelos quais as protéínas são expressas e marcadas nas partículas L. Tal será matéria de ensaio e erro, mas mostrou-se já no Exemplo 2 que o virião hospedeiro, que anulou o gene proteico (vhs) do HSV-1, é capaz de desenvolver os sinais requeridos. A experimentação com genes marcadores ao longo das linhas indicadas no Exemplo 2 desenvolverá prontamente localizações apropriadas para a construção de recombinantes. A mesma técnica de recombinação homóloga, tal como acima se descreveu, pode ser usada para prodzir o recombinante. Nos casos adequados, o ADN estranho pode ser, por sua vez, introduzido no ADN do vírus da herpes por ligação directa.

Exemplos de proteínas e péptidos estranhos ou 'antigenes heterólogos, que podem ser introduzidos nas partículas L pelas técnicas acima descritas, são qualquer uma das proteínas estruturais do HSV, ou uma combinação de proteínas estruturais tais como gD, gB, o imediato anterior 183, Vmw 183, Vmw 65, e proteínas de outros vírus da herpes, tais como HCMV gB, e as

proteínas ou péptidos do vírus da imunodeficiência humana, tais como HIV-1 ou HIV-2 gp 120 ou gp 160.

A vacina da invenção pode ser uma qualquer formulação, pela qual as partículas L podem estimular a formação de anticorpos para as proteínas relevantes. A vacina compreenderá, consequentemente, um imunoestimulante (por exemplo, um adjuvante) ou substância veicular, bem como as partículas L·. Pode, evidentemente, compreender também outros aditivos convencionais, tais como excipientes. A invenção compreende uma vacina de partículas L vivas, bem como uma vacina de partículas L, que tenham sido inactivadas, por exemplo, com formaldeído ou por irradiação. Particularmente para uma vacina viva, sugere-se que sejam usadas todas as partículas L. Se a vacina for inactivada, as partículas L podem ser usadas em conjunto ou, possivelmente, numa forma diminuída ou interrompida, se se desejar que se libertem proteínas a partir do tegumento. A vacina é, vantajosamente preparada sob a forma de dosagens unitárias. As dosagens apropriadas podem ser obtidas a partir do conhecimento do uso de vacinas para vírus da herpes, por exemplo, do vírus HSV-1 ou Varicela-zoster, mas a dose dependerá também do facto de se pretender que as partículas L protejam contra uma infecção por vírus da herpes, ou que, seja o produto de vectores pelos quais é produzida uma proteína estranha imunogénica. Neste último caso, as dosagens apropriadas para a proteína estranha terão que ser calculadas.

Para a administração das partículas L aos mamíferos adequados, pode ser usada uma qualquer das vias convencionais no campo da vacinação virai, e serão predominantemente injecções subcutâneas ou intramusculares, mas podem ser mais adequadas, em determinadas ocasiões, as vias oral, intravenal, intravaginal e intranasal. Podem ser administradas para a profilaxia

do vírus da herpes, se o ADN estranho for incorporado no ADN do vírus da herpes, para outras doenças para as quais uma proteína ou péptido expresso a partir de ADN estranho é imunoprotector ou serve para estimular o sistema imunitário no sentido de aumentar o efeito iminoprotector. Particularmente, espera-se que a invenção seja útil na profilaxia da SIDA em pacientes susceptíveis ao HIV ou HIV positivos.

Apesar da invenção se aplicar predominantemente a pacientes humanos, é também aplicável, por exemplo, a animais , por exemplo, a vírus da herpes de equinos, e a partículas L de um vírus para administração a cavalos.

Os Exemplos que se seguem ilustram a invenção, é a marca registada.

Ficoll

EXEMPLO__1

Este exemplo mostra como é que as partículas L podem ser obtidas a partir dum vírus mutante, sem que sejam acompanhadas pela produção significativa de viriões infecciosos.

PROCESSOS

Preparação de um mutante sensível à temperatura do vírus da_herpes simplex do tipo I, designado por ts 1201.

Isolou-se um mutante 17tsJC116 seguindo-se UV-multagénese da espécie 17 do HSV-1 pelo Coates (1982). Um fragmento EcoRI F dum clone de ADN deste mutante foi recombinado com a espécie 17 do HSV-1 do tipo natural (WT) para produzir o mutante 1201. (Preston et al., 1983).

Identificação duma mutação

Um fragmento BamHI/Sall da mutação ts 1201 foi sequenciada e a alteração do par base simples da sequência ADN do tipo natural foi identificada. A alteração foi feita a partir do resíduo T na posição 50897 na sequência de McGeoch et al., (1988). Esta alteração resulta na substituição duma tirosina com uma fenilalanina na sequência aminoácida da proteína U126 (Al-Kobaist, 1989).

Depósito da Patente do ts 1201

Sendo provável que esta mutação seja suficiente para produzir a alteração genómica requerida para evitar a formação de cápside e, consequentemente, gerar partículas L, e portanto as partículas L deste mutante do HSV-1 poderem ser produzidas por meio de técnicas recombinantes de ADN, o ts 1201 foi depositado como forma de precaução, para assegurar que a invenção possa ser ainda mais prontamente realizada. 0 depósito foi realizado sob o tratado de Budapeste, no depósito de micro-organismos para as finalidades de processamento de memórias descritivas na Colecção Europeia de Cultura de Células Animais, do Centro PHLS de Microbiologia Aplicada e Investigação, Porton Down Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Inglaterra em 20 de Junho de 1991, sob o número de acesso V91062004.

Desenvolvimento de vírus e purificaçaõ de viriões

As células BHK C13 desenvolveram-se como descrito previamente (Rixon e McLauchlan, 1990). Os stocks da espécie 17 do HSV-1 e ts 1201 foram obtidos infectando 10 garrafas cilíndricas de células, numa proporção de 1/300 pfu por célula. Após a infecção,a 31-C durante 4 dias o vírus foi removido e purificado em gradientes Ficoll 5 a 15%, como se descreveu previamente no Exemplo 1. As bandas foram removidas por punção lateral, diluídas com meio Eagle isento de vermelho de fenol e oeletizadas por centrifugação a 21.000 rpm num rotor Sorvall tst41, durante 2 horas, a 4^eC. As peletes foram ressuspensas no meio Eagle isento de vermelho de fenol e armaze-

nadas a -70²C.

Titulação dos viriões purificados

As preparações dos viriões purificados do WT e do ts 1201 foram tituladas a 31²C (permissiva) e 38,5²C (temperatura não permissiva para o ts 1201) e as suas proporções particula/pfu foram determinadas a 312C, para possuir a mesma ordem de magnitude. A titulação do stock do virião ts 1201 confirmou que era sensível à temperatura sob as condições usadas, com uma redução no título sobre o WT superior a 10 .

Microscopia Electrónica

As células a serem usadas num microscópio electrónico foram desenvolvidas em placas petri de 30mm, compreendendo uma tampa de vidro de 13mm. Em momentos adequados após a infecção, as células foram lavadas com uma solução salina tamponada de fosfato (PBS) e fixadas com glutaraldeído 2,5% em PBS, durante 1 hora a 4⁹C. As células foram então lavadas em PBS e adicionou-se tetróxido de ósmio (1% em PBS), durante 1 hora.

Formação de Réplicas

As tampas foram removidas para placas de culturas de tecidos, desidratadas através de séries de álcool graduado e secas num secador de ponto crítico. As tampas foram sombreadas com Pt/Pd durante 7 segundos, a um ângulo de 75⁵, numa unidade de sombra Balzers, e então sombreadas rotativamente com Carbono para providenciar suporte adicional. A superfície sombreada foi acamada com 50 μΐ de parlodion 0,25% em acetato de anilo e permitiu-se que secasse. Cada tampa foi quebrada ao meio e a superfície sombreada foi repartida em quadrados de aproximadamente 2mm. Para libertar as réplicas, as tampas flutuaram em ácido fluorídrico até se dissolverem. Os quadrados réplica foram removidos por uma agulha de arame Pt e lavados com água destilada. 0 material celular foi removido flutuando as réplicas em ácido crómico 66%, durante uma hora. As réplicas limpas foram lavadas três vezes em água, e então secas sobre grelhas microscópicas de cobre de malha 400. Quando secas, a película suporte de parlodion foi removida por imersão das grelhas em acetato de anilo e as réplicas foram examinadas num microscópio electrónico JEOL 100S.

Seccionamento Fino

As células restantes em cada uma das placas petri de 30mm foram colhidas, peletizadas em cápsulas BEEM, desidratadas e embebidas em resina Epon 812, como se descreveu previamente (Preston et al., 1983). Seccções de 130mm de espessura foram cortadas e manchadas com acetato de uranilo e citrato de chumbo .

ãl££Í£2£2£^e2£_£.2ϋ2££ϋ£21Ξ22

As proteínas foram separadas num gradiente gel poliacrila mida 5 a 12%, as quais foram reticuladas com N,N'-metileno-bisacrilamida usando o sistema tampão descrito por Laemmli (1970).

As proteínas foram visualizadas por manchamento com pra= ta, como descrito por Mclean et al., (1990).

Produção de partículas L

Cinco garrafas cilíndricas de células foram infectadas com ts 1201 gradiente-purifiçado ou vírus WT . Após a incubação a 38,5 C, durante 24 horas, a matéria específica presente no meio sobrenadante foi peletizada, ressuspensa e transformada em bandas em gradientes Ficoll 5 a 15%, como descrito por Szilágyi e Cunningham (1991).

RESULTADOS

a) Amostragem

As células desenvolveram-se em placas petri de 30mm, em que cada uma compreendia uma cobertura de vidro de 13mm. Após a infecção com 5 pfu/célula do vírus WT ou do ts 1201, as células foram incubadas a 38,5²C. Uma porção de cada inoculo foi retida para titulação subsequente (esta constitui a amostra de tempo igual a 0). Na hora 1 após a infecção, os inóculos de entrada foram removidos e foram novamente retidos (estes constituíram a amostra hora 1). As células foram lavadas com ETC10 e a incubação prosseguiu a 38,5²C. As seis, dez e 24 horas,o meio sobrenadante foi removido de cada placa e retido para titulação . As células foram usadas a cada ponto de tempo para formação de réplicas de superfície, enquanto as células restantes nas placas foram preparadas para seccionamento fino.

b)Desenvolvimento do vírus

Tal como se esperava, o vírus WT, após um declínio inicial no título durante a fase elítica, revelou um aumento rápido na produção de vírus para um nível cerca de 10 vezes superior ao vírus de entrada. Contrariamente, os títulos de ts 1201 declinaram durante o período de infecção, para cerca de 10 vezes abaixo do vírus de entrada, confirmando, consequentemente, que o ts 1201 usado nesta experiência possui um comportamento típico deste mutante. Tal assegurou que os resultados obtidos para as células infectadas com ts 1201 não se deveram à ausência ou reversão do mutante.

o)Aspecto das partículas na superfície celular

A examinação das réplicas preparadas a partir de células infectadas com WT revelaram uma série característica de alterações da superfície celular. A ,1 h a superfície celular era macia, e não revelava evidência de infecção comparada com as amostras falsamente infectadas. As 6h, muitas células possuíam pequenos números de partículas com aproximadamente 250 nm de diâmetro na sua superfície e às lOh numerosas partículas acumularam-se na maioria das células. 0 tamanho destas partículas coincidia com o dos viriões. As 24h as células eram decididamente redondas e possuiam coberturas densas de partículas. A distribuição destas partículas sobre a superfície celular era, frequentemente, assimétrica sendo tipicas as concentrações marcadas sobre a área do núcleo e regiões vizinhas à periferia da célula. 0 exame das células infectadas com ts

1201 revelou padrões muito similares de alterações. Consequentemente, lh após a infecção, as suas superfícies eram indistinguíveis da das células falsamente infectadas, a não ser a presença de partículas ocasionais, que presumivelmente derivam do inoculo. Pelas 6h, numerosas pequenas partículas encontravam-se presentes nas superfícies celulares e o seu número aumentou quando comparadas com as encontradas com o vírus WT, mas estas pareciam ligeiramente menos uniformes em tamanho.

d) Natureza das partículas na superfície celular

Para determinar a natureza das partículas presentes nas superfícies das células infectadas, examinaram-se secções finas preparadas a partir do resto de cada amostra. Tanto os viriões, como as partículas, estavam isentos das cápsides óbvias que nós consideramos como partículas L, e encontravam-se presentes nas células infectadas com WT. As partículas similares foram também encontradas com viriões nos vacuolos intrace-

As secções finas das células infectadas com ts 1201 demonstraram o fenotipo típico deste mutante (Preston et al., 1983). Logo, o núcleo compreendia agregações de cápsides coradas, característicamente grandes, isentas de ADN. As cápsides completas, compreendendo ADN não eram aparentes e não persistiu evidência de viriões maduros, quer no citoplasma, quer na superfície celular. As partículas que se encontravam presentes na superfície não possuíam cápsides e assemelhavam-se com as partículas L em termos de aspecto. As partículas de ti po similar foram frequentemente visualizadas nos vacuolos citoplásticos. Foram também observadas numerosas características que poderiam ser consideradas como partículas L no processo de formação por inserção nos vacuolos. No entanto, devido à ausência de cápside de diagnóstico, foi impossível ser dogmático quanto à natureza destas características.

Identificação e composição proteica das partículas libertadas a partir das células infectadas ^c2m_ts_1201.

Referindo a Figura 1 dos desenhos, a fotografia mostra bandas de material específico peletizado separado num gradiente, com bandas L descritas como partículas claras e V para vi-riões. 0 tubo A compreendia o tipo natural e B o mutante. 0 gradiente compreendia a preparação vírus WT (Figura 1, linha

A) que possuía duas bandas que correspondiam às descritas no Exemplo 1: uma banda inferior contínua de virioes e uma banda superior difusa de partículas L. Contrariamente, a banda de virioes não se podia observar no gradiente ts 1201 (Figura 1, linha B). No entanto, a banda difusa estava presente e co-migrava com, e possuia uma intensidade similar à banda de partículas L presente na preparação de vírus WT. Quando removida e examinada por manchamento negativo, esta banda revelou compreender material que p areei a idêntico às p articulas L tipi — cas.

As análises da composição polipéptido do material transformado em bandas no gradiente por meio de PAGE confirmaram o acima assinalado. Referindo a Fig. 2 dos desenhos, as lin-

has 1 e 2 revelam os perfis polipéptidos dos viriões e das partículas L, respectivamente, a partir dos vírus WT, enquanto que a linha 3 revela a composição das partículas produzidas pelo ts 1201 a temperaturas não-permissivas. As posições das bandas para as proteínas codificadas por HSV Vmw 175 (diagnóstico das partículas L) e Vmw 37 e 155 (diagnóstico dos viriões) são apresentadas. (Os números Vmw indicam as massas moleculares relativas em KiolaDaltons). As composições dos viriões WT e das partículas L confirmaram os padrões previamente descritos (Exemplo 1). Logo, as proteínas cápside Vmw 155 (Mr 155000) e Vmw 37 (37000), que eram abundantes em viriões, foram grandemente reduzidas em partículas L, enquanto a Vmw 175 aparentemente apenas possuía partículas L. 0 perfil proteico da banda ts 1201 apresentou-se virtualmente indistingúível das partículas L WT e abanda diagnóstico Vmw 175 mostrava-se claramente visível. (Figura 2, linha 3). Curiosamente, apesar de níveis muito baixos de viriões infecciosos nesta banda, a cápside protíca Vmw 155 (Mr 155000) estava presentes em quantidades similares às encontradas nas partículas L WT.

PREPARAÇÃO DUMA VACINA

Apesar de os viriões serem ainda produzidos a baixos níveis pelas células infectadas com ts 1201, a proporção numérica de partículas L para os viriões é tipicamente igual a cerca de 10 :1; comparado com cerca de 10 :1 nas preparaçês de viriões WT. Para a preparação duma vacina será aconselhável remover todas as possibilidades residuais de infecção por vírus da herpes. Tal pode ser realizado inactivando a preparação, por exemplo com formaldeído ou mediante irradiação UV.

Uma dose de 160 mJ/cm de luz UV de comprimento de onda igual a 254 nm libertada por um UV Stratalinker Modelo 180 será normalmente suficiente e provavelmente esta dose poderia ser mais baixa. No entanto, a possibilidade do uso de uma vacina *

viva não é excluída, pois os processos de purificação posterior das partículas L serão brevemente apresentados.

EXEMPLO__2

Este exemplo demonstra a incorporação dum gene estranho dentro do HSV-1 e expressa-o para produzir como parte duma proteína de fusão nas partículas L, logo, as partículas L servem aqui como vectores. Neste Exemplo, nós reticulámos as sequências que codificam os polipéptidos dum componente estru tural do vírus (neste caso uma proteína denominada proteína de eliminação do virião do hospedeiro, abreviado para vhs) co dificada pelo gene UL41 para as proteínas marcadoras não estruturais (um enzima bacteriano denominado cloramfenicol acetiltransferase, CAT para abreviar). Nós enserimos então este α

gene quimérico dentro do genoma do vírus e pesquisámos a presença duma proteína de fusão vhs-CAT nos viriões e partículas L.

plasmídeo que foi usado como base para a construção dum gene de fusão vhs-CAT foi o pMFl consiste num fragmento 3,7Kb que compreende o gene vhs da espécie G do HSV-2 inserido dentro dum plasmídeo, pTKl que compreendia o gene timidina Kinase (TK) da espécie 17 do HSV-1 inserido dentro do plasmídeo pAT 153 bem conhecido. Este fragmento 3,7Kb foi inserido dentro da sequência TK no pTKl de forma a inactivar o enzima TK. no sentido de ligar as sequências que codificam o CAT para as sequências que codificam o HSV-2 vhs, foram usadas as estratégias que se seguem (ilustradas esquematicamente na Figura

3) :

1) 0 pMFl compreende uma enzima de restrição única HindIII e eétafoi removida do plasmídeo por meio de técnicas padrão de manipulação de genes. 0 plasmídeo resultante (denominado pVHS) não compreendia qualquer região HindIII.

2) Uma zona de enzima restrição Aatll está localizada em contracorrente à extremidade 3' das sequências que codifica a protéina vhs. Um oliginucleótido sintético foi inserido na zona Aatll no pVHSl para criar pVHS2. 0 oligonucleotideo possui duas caracteríáicas essenciais. Primeiramente, as sequências entre a região Aatll e a extremidade 3' da cerca de leitura aberta vhs (ORF), que se encontra presente no pVHSl, e consequentemente irá regenerar a ORF completa.Em segundo lugar, uma região HindIII está presente imediatamente

após o codão que especifica o aminoácido C-terminal de vhs. Esta região HindIII foi incorporada dentro do oligonucleótido, de tal forma que as sequências que codificam o CAT inseridas nesta região (Ver fase 3) estarão na mesma estrutura de leitura, como o gene vhs.

3) Um fragmento HindIII para um plasmídeo pCATl que comporta as sequências que codificam CAT foi então inserido na região HindilII no pVHS2 para originar o plasmídeo pVHS6. Logo, o gene no pVHS6 foi posto em contacto e dentro da estrutura com as sequências que codificam CAT.

Para inserir este gene quimérico vhs-CAT dentro do genoma do virús, o pVHS6 foi recombinado com ADN da espécie 17 do virús HSV1 nas células de culturas de tecidos. Porque o fragmento ADN que comporta a fusão vhs-CAT foi inserido na sequência que codifica o polipéptido VHS-1 TK, a incorporação das sequências vhs-CAT dentro do genoma do virús deverá inactivar o gene TK do virús endógeno, resultando na formação do vírus menor TK. Tais viroses podem, preferencialmente, ser escolhidas pelo desenvolvimento da população de vírus obtida a partir das técnicas de recombinaçao na presença de bromodesoxicitidina (BCdR). Consequentemente, após se ter realizado a recombinaçao, o grupo resultante de viroses foi desenvolvido 2 vezes na presença de BCdR e posteriormente foram removidas da placa de viroses individuais e desenvolvidas. Estas técnicas, incluindo a selecção TK, são processos padrão para produção e purificação recombinante de viroses. Uma das placas individuais que foi removida e desenvolvida mostrou compreender sequências ADN CAT. Uma preparação á escala industrial destes vírus foi desenvolvida e denominada vhs-CAT. A preparação do vírus foi tornada em banda em gradientes Ficoll e foram purificados viriões e partículas L, tal como no Exemplo 1. As proteínas presentes nos viriões e partículas L foram separadas num gel poliacrilamida 7,5% ao longo da preparação das partículas L a partir dum vírus do tipo natural, que não compreenda qualquer sequência CAT. Após a transferência para uma membrana de nitrocelulose, a membrana foi analisada para avaliação da presença da proteína de fusão vhs-CAT. Este anticorpo é preparado pela 5 Prime — 3 Prime Inc., 5603 Arapahoe, Boulder, Colorado Co 80303, USA. Uma auto-radiografia revelou que este anticorpo detectou uma proteína de peso molecular compreendido no intervalo entre aproximadamente 85.000 1 90.000 nos viriões vhs-CAT e nas partículas L, mas não no CAT minus, vírus tipo natural. 0 tamanho desta proteína condiz com o tamanho previsto para o polipéptido de fusão vhs-CAT ( codões ORF 492 do gene vhs = 59 KDa; codões ORF 219 do gene CAT - 24 KDa; li gante entre codões ORFs 14 dos genes vhs e CATs = 1,6 KDa; total = 85 KDa aproximadamente). Uma banda adicional apareceu apenas na amostra do virião vhs-CAT numa posição indicando um peso molecular de cerca de 155.000. Tal é assinalado como uma reacção cruzada entre o anticorpo CAT e a proteína de cápside maior Vmw 155 presente nos viriões, mas não nas partículas L, e tal não é significativo.

Adicionalmente, os extractos das células infectadas com vhs-CAT e purificadas a partir dos viriões vhs-CAT e partículas L foram ensaiadas para a actividade de CAT num único ensaio. Os resultados revelam que a proteína de fusão vhs-CAT retém a actividade CAT. Até à data , consequentemente, as aná lises preliminares do vírus vhs-CAT revelaram que a proteína de fusão vhs-CAT é incorporada dentro dos viriões e das parti cuias L e a porção CAT da protéina mantêm-se enzimaticamente activa. Este facto mostra que é possível introduzir proteínas

não-estruturais heterólogas dentro de viriões e de partículas L, ligando-as a genes estruturais conhecidos.

CAT foi escolhido como um gene adequado para estes estudos, porque facilmente detectado e é um gene bacteriano sem contraparte nas células animais. No entanto, podem ser usadas técnicas similares para introdução de outras proteínas, incluindo as importantes para propósitos de vacinação, dentro das partículas L.

Claims

la. Partículas derivadas de vírus de herpes, apropriadas para utilizar como vacina, caracterizadas pelo facto de serem partículas (L) leves, relacionadas com os vírus, mas não infecciosas, que compreendem um tegumento envolvido por invólucro, mas a que falta uma cápside e o ADN do vírus dentro da cápsida e incorporam uma proteína ou um péptido estranhos.
2a. Partículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo facto de a citada proteína ou péptido estranhos ser de um vírus de imunodeficiência humano.
3a. Partículas (L) leves derivadas de um vírus de herpes, relacionadas . com o vírus mas não infecciosas, para utilização em vacinação, caracterizadas pelo facto de compreenderem tegumento envolvido por um invólucro, mas a que falta uma cápsida e o ADN do vírus dentro da cápsida.
4a. Partículas (L) de acordo com ,a reivindicação 3, caracterizadas pelo facto de serem de um mutante letal condicional que, em condições não permissivas para o desenvolvimento dos vírus, é capaz de produzir ADN do vírus e proteínas ulteriores, mas é incapaz de reunir viriões infecciosos.
5a. Partículas (L) de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo facto de o mutante letal condicional ser um mutante sensível à temperatura e uma das condições não- permissivas para o desenvolvimento do vírus ser a temperatura.
6a. Preparação derivada de vírus à base de partículas de um vírus da herpes, caracterizada pelo facto de as citadas partículas serem partículas leves relacionadas com o vírus, não infecciosas, do vírus da herpes a que falta uma cápside, substancialmente isenta de viriões.
7a. Preparação derivada de vírus de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de a proporção em número entre as partículas (L) e os viriões infecciosos ser pelo menos igual a 10 : 1.
8a. Preparação derivada de vírus de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizada pelo facto de as partículas (L) serem de um mutante letal condicional, o qual sob condições não permissivas para o desenvolvimento

A do vírus é capaz de produzir ADN do vírus e proteínas posteriores mas é incapaz de reunir viriões infecciosos.
9a. Preparação derivada de vírus de acordo com a reivindicação 8 caracterizada pelo facto de o referido mutante letal condicional ser um mutante sensível à temperatura e uma das condições não permissivas para o desenvolvimento do vírus ser a temperatura.
10a.Preparação derivada de vírus de acordo com as reivindicações 6, 7, 8 ou 9, caracterizada pelo facto de as partículas leves incorporarem uma protéina estranha ou um péptido.
11a. Preparação derivada de vírus de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo facto de a mencionada protéina ou péptida estranhos ser de um vírus da imunodeficiência humano.
12a. Preparação derivada de vírus de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo facto de se escolher a citada protéina ou péptido estranhos do grupo formado por HCMV B, HIV-1 gp 120 e 160 e HIV-2 gp 120 e 160.

y
13a.Preparação derivada de vírus de .acordo com qualquer das reivindicações 6, 7 ou 8, caracterizada pelo facto de as partículas leves serem de um vírus de herpes mutante compreendendo um tegumento rodeado por um invólucro, mas a que falta uma cápside e o ADN do vírus dentro da cápside, tendo o citado vírus de herpes mutante um gene estranho incorporado no seu genoma de forma a ser operavelmente ligado aos sinais de vírus de herpes eficazes para a expressão do citado gene para incorporar uma proteína ou um péptido estranhos nas partículas (L) do vírus de herpes e tendo o citado vírus de herpes mutante uma alteração ou uma supressão no tipo de ADN natural eficaz para impedir que a cápside se torne presente dentro das partículas de vírus.
14a.

Preparação derivada de vírus de acordo com qualquer das reivindicações 6, 7, 8, 9, 10,

11, 12 ou 13, caracterizada pelo facto de o mencionado vírus ser vírus de herpes simples (HSV).
15a. Preparação derivada de vírus de acordo com a reivindicação· 14, caracterizada pelo facto de o citado vírus ser o vírus de herpes simples 1 (HSV-1).
16a. Preparação derivada de vírus de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de o referido vírus ser (HSV-1 ts 1201, depositado na colecção Europeia de Cultura de Células Animais, de Centro PHLS de

Microbiológia Aplicada e Investigação, de Inglaterra sob o

Número de Acesso Número V91062004.
17a. Preparação derivada de Vírus de acordo com qualquer das reivindicações 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizada pelo facto de o vírus estar numa forma desactivada.
18a. Vacina à base de partículas de vírus de herpes, caracterizada pelo facto de compreender (1) partículas (L) leves, de vírus de herpes, relacionadas com o vírus, mas não infecciosas, compreendendo um tegumento envolvido por um invólucro mas a que falta uma cápsida e o ADN do vírus dentro da cápside, e (2) um agente estimulante da imunidade ou um agente veicular.
19a. Vacina de acordo com a reivindicação 18, caracterizada. pelo facto de as partículas (L) terem uma ou mais características descritas nas reivindicações 6 a 16.
20a. Vacina à base de partículas do vírus de herpes, caracterizada pelo facto de compreender (1) uma preparação derivada de vírus de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 16, e (2) um agente imunoestimulante ou agente veicular.
21a Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 18,

19 ou 20, caracterizada pelo facto de estar numa forma desactivada.