JP4528447B2 - ヒトサイトメガロウイルス感染後に遊離されるウイルス粒子 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス(HCMV)感染後に遊離されるウイルス粒子及びかかる粒子のワクチンとしての使用法・用途に係る。
【0002】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)は、β―ヘルペスウイルスの一種であり、遍在的に存在する病原体の一つである。免疫適格性を有する人においては、HCMV感染症は、せいぜい中程度で且つ非特異的症状を呈するため、通常は認知されることはない。これとは逆に、例えばエイズ(AIDS)患者又は臓器被移植者など免疫抑制状態の患者などいくつかのリスク群においては、非経口感染を受けた場合、HCMV感染症は、重篤な症状を呈する。
【0003】
【従来の技術】
HCMV感染症を治療するためにいくつかの化学療法剤が利用可能である。しかしながら、HCMV感染症に対する抗ウイルス化学療法剤の成功は、特にこれら医薬品の持つ毒性やまた治療期間が長期になった場合の抵抗性ウイルス変異株の出現によって限られたものとなっている。さらには、抗ウイルス性の高免疫度血清を予防目的又は治療目的に使用することは、有効性が限定されたものに過ぎないことが判っている。
【0004】
HCMVワクチン開発については過去長年にわたり多くの研究がなされてきた。即ち、所望の免疫を誘導するために弱毒化された生ワクチンについて多くの試みがなされているものの、この種のワクチンは、有効性が限定されたものにすぎないことが判明している。かかる理由としては、なかでも弱毒化ウイルスのヒト体内での生存可能性が限定されていることや抗原性が種特異的に変化することが挙げられる。生ワクチンの使用は、終生免疫誘導が不十分であること以外に、危険が多いものと見なすべきである;即ち、HCMV感染症における病原性機構に関する知識が欠如しておりまた免疫抑制後においてワクチン株再活性化の危険性があるため、生ワクチン使用は、臨床の現状においては少なくとも疑問が多いように思われる。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
このようないくつかのリスクを回避するために、種々の発現系で合成されたウイルスエンベロープ由来のタンパク質を幾つか含有するHCMVサブユニットワクチンを開発するべく、いくつかの研究方針が最近実行されている。このようなエンベロープタンパク質、特にグリコプロテインgB及びgHは、HCMVに対する中和抗体の必須の標的抗原である。中和抗体は、かかる感染症を防止する性能を有するものであり、gBサブユニットワクチンによってかかる中和抗体を誘導せしめることは、実験動物においてもまた臨床試験においても可能であった。しかしながらヒトにおいては、このようにして誘導した抗体応答は、持続期間が短く、全ての症例において当該感染症を予防・防止するには適していないことが判明している。このことは、専らHCMVのgBにのみ依拠したサブユニットワクチンを広範に使用するうえで致命的な障害となるものである。逆にこのような抗体製剤の有効性が限定されることについて示唆されてきた理由としては、免疫応答における菌株特異的変動があること、充分な細胞性免疫応答が欠落していること及び使用する抗原について、そのエピト-プがいくつかの場合立体構造依存性であることが公知であるため、いくつか用いた抗原に構造的な制約があることが挙げられる。
【0006】
従って、かかる経験に基けば、有効で且つ広範に使用可能なHCMVワクチンが満たすべき要件は、下記する通りである:即ち、
(1)菌株に重複的な態様でHCMV感染症から防御する中和抗体を永続的に誘導すること。このためには、HCMVに対する所謂“ヘルパー細胞応答”(CD4−陽性Tリンパ球)を有効に誘導させ、かくして抗体分泌性Bリンパ球の成熟を支援・助長することが必要である。
(2)HCMVに対抗する細胞障害性T細胞の生成を誘導すること。この種のリンパ球は、既に発症したHCMV感染症を終結させ且つ体内でのウイルスの感染拡大を限定するために極めて重要である。
(3)当該ワクチンによる副作用を最小限とすること。接種した生菌ウイルスは、これまでに知り得る限りでは免疫抑制後に潜伏期を樹立する能力を有しており、このことから誘発される可能性があるリスクを評価することは不可能である。従って目的とすべきことは、ワクチンとして非生菌性ウイルス抗原を調製することであるべきである。
【0007】
HCMVワクチンについて掲げた上記諸要件を満足するためには、当該ワクチンは、中和抗体を誘導させ且つヘルパー細胞(THリンパ球)及び細胞障害性細胞(CTL)を刺激するための適合した抗原を含有するものでなくてはならない。
【0008】
中和抗体は、現在の技術知識水準に従えば、HCMV感染後において専らウイルスエンベロープタンパク質、特にグリコプロテインgB及びgHに対して生成されるものである。
【0009】
THリンパ球は、主として該ウイルスの外被・被包タンパク質、特に所謂pp65(ppUL83)に対して生成されるものであり、さらにはpp65は、HCMVに対抗するCTLを誘導するためには必須の抗原である。pp65の提示は、MHCクラスI分子に関連して細胞によるデノボ(de novo)合成の後では常時生起するだけではない;つまり、所謂“外因性負荷(exogenous loading)”によってもMHCI提示経路に導入されることが可能なのである。
【0010】
前記した抗原は、ヒト線維芽細胞の初代培養物の感染過程においてHCMVにより合成され、培養培地内に遊離される欠陥ウイルス粒子の必須構成成分である。これらのデンスボディー(DB)は、電子顕微鏡下でも生存可能な構造物であって、そのタンパク質質量の90%以上は、pp65から構成される。これらは、ウイルス性グリコプロテインで修飾された細胞脂質膜が付与されていること及び当該細胞から放出されることの二点において、ウイルス粒子に比肩され得るものである。かかるウイルス性グリコプロテインは、このエンベロープでは天然の立体構造として存在する可能性が極めて高い。DBは、ウイルス性DNAもまたウイルス性カプシドも一切含有していないため、非伝染性であり、細胞培養物の上澄み液から確立された方法によって大量に濃縮することが出来る。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの目的は、HCMVに対する有効で且つ広範に使用可能なワクチンを提供することである。
【0012】
本発明は、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス(HCMV)感染後に遊離されるウイルス粒子について記述するものであり、かかる粒子は、HCMV感染症に対する予防又は治療目的のワクチンとして使用することが出来る。
【0013】
本発明の該粒子は、脂質膜によって囲にょうされており、かかる脂質膜によって、当該粒子をいくつかの哺乳動物細胞に融合させて、かくしてその内容物が当該細胞の原形質内に侵入することが可能となるのである。当該粒子の膜は、ウイルス中和性抗体のための主要抗原を提示するウイルス性グリコプロテインを含有する。この粒子はまた、ウイルス性DNAもまたカプシドも双方を含有していないことを特徴とするものである。更には、ウイルス性T細胞抗原pp65(ppUL83)を含有しており、この抗原は、Tヘルパー細胞の生成を刺激すると共にHCMVに対抗する細胞障害性Tリンパ球(CTL)を誘導するために必須の抗原となる。
【0014】
かかる特質によって、特に中和性抗体と共に充分な細胞応答を誘導せしめる能力を有する複数の抗原を組合せて有することによって、当該粒子がHCMVワクチンとして適したものになるのである。
【0015】
デンスボディーは、既に文献に記載されている(Gibson et al. Birth Defects: Original Article Series 20, 1 (1984) 305-324; Virology 66 (975) 464-473)。このことに関連して、デンスボディーをワクチンとして使用する可能性が示唆されていたが、デンスボディーが現実に所望された効果を現出することを証明する実験は一切報告されたことはなかった。更には、デンスボディーが、抗原性効果を有することは既に示されている(Jahn et al., J. gen. Virol. 68 (1987) 1327-1337)。しかしながら、これらの実験は、誘導された免疫応答を特性化するものではなく、この事実が、ワクチンとしての適性に関する情報を一切推論できない理由となっている。
【0016】
本発明の粒子が、高い抗原性を有し且つ中和抗体を生成させる能力を有するという事実は、実施例1及び2において示されるウイルス中和抗体の誘導は、長時間継続する(実施例3)のであって、このことは、成功するワクチンのためのもう一つの要件である。実施例1乃至3において実現された免疫応答は、免疫化をアジュバントを用いることなく実施しただけにそれだけ一層驚くべきことである。アジュバントと一緒に投与されたワクチンの副作用は、従ってここでは当てはまらない。本発明の粒子はまた、細胞障害性Tリンパ球(CTL)を活性化するのである(実施例4及び5)。
【0017】
最後に、DBは、投与経路の如何に拘わらずTh1型のTヘルバー細胞応答を誘導するのである(実施例6)。
【0018】
これらの実施例は、本発明の粒子がHCMVワクチンとして適していることを証明するものである。
【0019】
また別の実施態様においては、一部分としてウイルス性T細胞抗原pp65(ppUL83)の構成部分の一種以上又はそのタンパク質全体及び他の部分として一種以上の他種タンパク質の構成部分の一種以上とを含んで成る融合タンパク質を含有する粒子について記載されている。
【0020】
このことによって、当該粒子の有する抗原性を最適化することが可能となるのである。その理由は、このような融合タンパク質が粒子中において大量に存在するからである。更には、一分子中において細胞性と体液性の双方の免疫応答が発現することは、その抗原性を明白に増大させることが出来る、ということも既に公知となっている。pp65の種々の部位及び他のタンパク質は、直接融合させることが出来るが、例えば関与するタンパク質のうちの一つのタンパク質の天然構成成分ではないリンカー配列を当該種々の部分の間に介在させることも可能である。この種の配列は、クローニングによって生成させることが出来るし又は当該抗原の諸特性に影響を及ぼすために慎重に導入することが出来る。しかしながら。かかる融合タンパク質は好ましくは、融合パートナーの構成成分ではない外来配列を一切含有しないのである。かかる実施態様においては、当該融合タンパク質は、pp65の構成部分の一種以上と一種以上の他種タンパク質の構成部分の一種以上から構成される。
【0021】
pp65全体又はその一種以上の構成部分が、当該融合タンパク質に存在していてもよいことは、下記する全ての実施態様に対して当てはまる。“pp65(から構成される)の融合タンパク質”なる表現は、本特許出願の目的のためにはpp65の全体に限定されるものと了解されるものとする。当該融合タンパク質中に存在する一種のタンパク質の“構成部分“又は”構成区分”とは、当該融合タンパク質が誘導される元のタンパク質のうちの少なくとも6、好ましくは少なくとも8、最も好ましくは少なくとも9、15又は20の連続したアミノ酸を含んで成る。
【0022】
一つの好ましい実施態様は、pp65(ppUL83)及びウイルス性グリコプロテインgB又はgHの中和エピトープの一種以上との融合タンパク質を含んで成る。この種の粒子は、図7Aにおいて示すように産生させることが出来る。かかる融合タンパク質は、抗原特異的取り込みを経由して、グリコプロテイン特異的B細胞内に進入し、このB細胞は次に、MHCクラスIIのコンテキストにおいてpp65及びpp65の双方のエピト-プを提示するのである。更には、この融合タンパク質のいくつかの部分をMHCクラスIIのコンテキストにおいて抗原提示機能細胞(APC)を用いて提示させることも可能である。何れの場合においても、結果的にはpp65及びウイルス性グリコプロテインに対するTHの応答を効率よく刺激することが出来る。これらのTH 細胞は、pp65及びウイルス性グリコプロテインのペプチドをMHCクラスIIのコンテキストにおいて提示し、かくして中和抗体を相同的且つ異種的にも生成するグリコプロテイン特異的B細胞を刺激する能力を有している。その上、この種の粒子は、伝染性のビリオンと同様に細胞内に取り込まれることが可能であり、pp65ペプチドをMHCクラスI経路に外因的に負荷することによって導入することが出来る。このことによって、死滅ワクチンについては異常であるが、HCMVに対するCTL応答刺激が実現される。
【0023】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、pp65及びHCMVの別のタンパク質であるプロテインIE1(ppUL123)の構成部分の一種以上とから構成される融合タンパク質を含有する。このIE1タンパク質の構成部分は、特別に存在するべきもので、ヒト体内で自然感染の過程で生成される細胞障害性T細胞の対象となる構成部分である。このIE1タンパク質のペプチド類は、pp65のペプチドとは異なるMHCクラスI分子によって提示される場合もある。IE1由来の更なる“CTLエピトープ”が付加することによって、接種された被験者であって、異なるMHCクラスI分子を提示する被験者が免疫化された場合、可能な限り広範な態様でHCMVに対抗するCTLを産生する能力を有することが、確保されることになるはずである。
【0024】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、pp65とHCMVグリコプロテインの中和エピト-プの一種以上とIE1のCTLエピトープの一種以上とから構成される融合タンパク質を含有するのである。pp65を中和エピトープとCTLエピト-プとに融合させることによって、中和抗体とCTLの双方を被験者の体内で可能な限り広範な態様で、即ちMHCクラスIパターンが異なる最大多数の人々の体内で生成させることが可能であることが確保されることになるはずである。
【0025】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、pp65及び他のヒト病原体のエピトープのとから構成される融合タンパク質を含有する。その他のヒト病原体の適当な構成成分とは、ヒト体内において生成される中和抗体が対抗する抗原である。単離した“中和抗原”を使用した場合と比較して、免疫応答(抗体応答)が顕著に増大することを期待することが、このような“中和抗原”をT細胞抗原pp65に融合させることによって可能となるのである。ここで付言しておくべきかかる“中和抗原”の例としては、B型肝炎ウイルス(HBsAG領域由来)、C型肝炎ウイルス(例えばE2)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV,Env領域由来)、インフルエンザウイルス(ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、核タンパク質)の表面タンパク質、又はその他のウイルス性病原体が挙げられる。さらに別の適当なヒト病原体としては、Haemophilus influenza、Bordetella pertussis、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria meningitidisなどが挙げられる。最後ながら、例えばプラスモディア(plasmodia、マラリア)などの真核性病原体由来の抗原もpp65に融合させることが可能である。
【0026】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、pp65及びその他の病原体であって、かかる病原体に自然感染した場合ヒト体内において産生されるCTLが対抗する該病原体のタンパク質の構成成分の一種以上とから構成される融合タンパク質を含有する。かかるCTL抗原の例としては、HIV−1、HBV、HCV又はインフルエンザウイルスのタンパク質の構成成分が挙げられる。このような手法の意図は、ヒト体内において異種病原体に対抗する保護性CTLを産生させる、DBの独自の免疫原性特性を利用することである。
【0027】
さらに別の好ましい実施態様においては、当該粒子は、pp65、異種病原体の中和抗原の一種以上及び同一病原体のCTLエピトープの一種以上とから構成される融合タンパク質を含有する。かかる融合は、接種した被験者が、かかる病原体に対抗する保護性抗体及びCTLの双方を形成する能力を有することを確保することを意図するものである。
【0028】
本発明は更には、異なるHCMV株に由来する同一グリコプロテインの変異体である、少なくとも二種の異なるグリコプロテインを含有するウイルス粒子に係る。
【0029】
一つの好ましい実施態様は、正確に二つの変異体、即ち一つはHCMV Towne株に相当する変異体及び残りはHCMV Ad169株に相当する変異体を含有する。この好ましい実施態様は、かかるTowne株及びAd169株の双方のグリコプロテインgBを含有する。
【0030】
これら二種のタンパク質は、感染細胞中の組換え型デンスボディーの膜内に同じ効率で組み込むことが出来る。かかる組換え型デンスボディーは、二つのプロトタイプHCMV株に対する菌株重複型のみならず菌株特異的でもある中和免疫応答を誘導するのに適している。
【0031】
最後に、本発明はまた、完璧に感染性ウイルス粒子を含まないウイルス粒子を調製する方法にも係る。予めHCMVで感染させておいたある細胞集団から粒子を調製する場合、感染性ウイルス粒子が、当該粒子の精製過程にまで持ち込まれるというリスクが生じるが、このようなことは、ワクチンにとって欠点の一つである。
【0032】
本発明の方法はこのようなリスクを最小限にするものである。かかる目的のために、先ず最初に必須遺伝子にある欠失部を有するHCMV株を生成させるのであるが、このことは、当該遺伝子の機能の欠失を意味する。大抵の場合においては、このことは、機能性遺伝子産物が存在しないことに依拠するのであるが、ある調節遺伝子配列の機能が、当該HCMVが最早や生存しないように変化させることも可能である。このことは、例えば点変異、欠失、挿入又はその他の変異によってHCMVの核酸配列を変化させることによって生起させることが出来る。かかる欠陥ウイルスは、HCMVにおいて予め欠失させておいた遺伝子を発現し且つビリオン組み立てのために使用可能な状態にある細胞においてのみ増殖することができる。初期線維芽細胞が現在のところ、HCMVのインビトロ増殖のための唯一の許容可能とされるシステムであって、かかる細胞のトランスフェクションは、これまではレトロウイルスによる転移法を用いた場合にのみ可能であるに過ぎなかった。しかしながら、かかる細胞を用いてワクチンを製造しなければならない場合、このことは重大な欠点である。本発明の方法は、レトロウイルスによる遺伝子転移を行うことなく産生可能であるが、その内部でHCMVの増殖も可能であるような安定的にトランスフェクションさせた細胞を提供するものである。
【0033】
一つの好ましい実施態様は、主要カプシドタンパク質遺伝子UL86で安定的にトランスフェクションさせたヒト包皮線維芽細胞を含んで成る。かかるトランスフェクションは、好ましくは極めて高いトランスフェクション効率をもたらす脂質含有補助剤を用いて実施する。一つの好ましい実施態様において、ロッシュ ダイアグノスティックス、マンハイム(Roche Diagnostics, Mannheim)から購入可能である“Fugene試薬”をかかるトランスフェクションのために使用する。この実施態様は、実施例7において記載する。
【0034】
主要カプシドタンパク質遺伝子UL86を欠失させておいた欠陥ウイルスは、このような上記細胞中において増殖させることが出来る。“非相補性”の線維芽細胞をこのような欠陥ウイルスで感染させた場合、伝染性ウイルス粒子を一切含まないウイルス性ワクチン粒子をかかる繊維芽細胞から単離することが可能である。
【0035】
本発明の当該粒子を感染のリスクを伴なうことなく産生させるもう一つの可能性は、HCMVで感染させることなく当該粒子を細胞中に復元・再構成させることである。かかる目的のためには、当該粒子の構成成分をコードする遺伝子全てをこれらの細胞中において発現させねばならない。これらの遺伝子は、かかる目的のために当該細胞中に挿入させねばならない。
【0036】
バクロウイルスで感染させた昆虫細胞がかかる目的のために好ましくは使用される。当該粒子のポリペプチド構成成分をコードする遺伝子をバクロウイルス発現ベクターにクローンする。組換えバクロウイルスの生成させた後、昆虫細胞、好ましくはSf9細胞を種々のウイルスで同時・共感染させる。これらの遺伝子を昆虫細胞中で発現させ、得られたポリペプチドが結合して、所望とする粒子を得るのである。最後に、かかる粒子を当該昆虫細胞から遊離放出させる。このようなことは、ワクチンとして使用することが出来る非感染性粒子の産生させるためのひとつの可能性を表す。
【0037】
又、別の可能性は、DBを復元・再構成させるための構成成分をHCMV主要IEプロモーター/エンハンサー(MIEP)の制御下に組換えバクロウイルスにクローン化することである。組換えバクロウイルスは、例えば哺乳動物細胞などの高等真核細胞に感染する能力を有すること及び外来遺伝子は、例えばMIEPなどの強力な真核細胞プロモーターの制御下においてかかる細胞内において強力に発現させることとが明らかとなっている。このような手法の利点は、DBの抗原性タンパク質の重度の修飾、例えば糖化などが、昆虫細胞中におけるよりも哺乳動物細胞中において一層自然な態様で生起する可能性があるということである。更には、既にワクチン製造のために承認済である多数の細胞系が存在している。
【0038】
【実施例】
本発明をさらに下記する実施例において説明する。
【0039】
実施例1
マウスの足に単回免疫した場合における天然DBと破砕処理DBとによる中和抗体の誘導
2匹のBALB/cJマウス(メス、9−10週令)からなる群を20μgの精製DB又は20μgの破砕処理DBの何れかをマウスの後足に注射することによって免疫処理した。血液を免疫後55日目に心臓窄刺によるサンプル採取し、細胞分画を凝集させて除去することによって血清を得た。
【0040】
これらのマウス血清を所謂“中和アッセイ法”によってHCMVを中和する能力について検討したが、かかる検討は下記するプロトコールに従って行った:
− これらの血清及び対照抗体14−4b(中和性)とB1B6(非中和性)を先ず最初は培地で1:3で予備稀釈し、次いで48−ウエルプレート中で、各回1:2で十倍にまで段階稀釈した。
【0041】
− 各稀釈液は250μlずつ得られた。
【0042】
− 各希釈液に250μl(同一容量)のHCMVウイルス培養株(1997年12月16日付けの、TCID50が106.3/mlであるAd69(100μl+19.9mlとして1:200に予備稀釈したもの))を加えて、慎重に混合した。このウイルスは、解凍してから20秒間“ボルテックス装置(Vortex apparatus)”で予め混合したものであった。
【0043】
− 得られたウイルス/抗体混合物を37℃にて4時間培養器中で培養した。
【0044】
− 3.5時間後、予めトリプシンで遊離させておいた人包皮繊維芽細胞(HFF)を数え、6x105細胞/ml(1.5x104細胞/μlに相当する)に調節した。
【0045】
− 何れの場合にも96―ウエルプレートチュでアッセイするべき各抗体毎又は抗血毎に清細胞懸濁液を25μlずつ4列に入れた。培養時間として4時間経過後に、適切なウイルス/抗体稀釈液を100μlずつ添加した。
【0046】
− 更に37℃においてCO2培養器中で一晩培養した。
【0047】
− 翌日、培養上澄み液を捨ててから、培養物を96%エタノールで固定化し、PBSで洗浄した。次いで、このマウスモノクローナル抗体p63−27を第一の抗体として(各ウエルにつき50μlずつ)添加し、37℃にて1時間培養した。
【0048】
− 再度改めて洗浄した後、第二の抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗マウスIgG(Dako, Hamburug、PBS中1:500)を添加し、37℃にて45分間培養した。この培養に引き続き、PBSでもう一度洗浄しAEC染色を実施して特異的抗体反応を検出した。
【0049】
− かかる目的のために、100μlのAEC基質溶液を各ウエルに添加し、暗所で37℃にて10−20分間培養した。次にこの反応は、PBSで停止させ、これらのウエルをPBSで数回洗浄した。染色された細胞核を同定し、伝送光線中で数えた。
【0050】
試薬:
AEC培養株溶液:400mgのAEC/100mlのジメチルホルムアミド(Sigma A-5754)
酢酸緩衝液: 6.8gの酢酸ナトリウム/2.88mlの氷酢酸、1リットルの蒸留水当たり(pH4.9)
使用可能AEC溶液: 酢酸緩衝液中にAEC培養株溶液を1:20に稀釈し、次いで二度濾過する。発色反応の暫く前に1/1000 30%強度のH2O2を添加する。
【0051】
実施例2
マウスを三回腹腔内免疫化した場合における天然DBによる中和抗体の誘導
抗体の誘導を別の免疫化スケジュールを用いることによって検討した。この目的のために、5匹の動物を三回(時間はそれぞれ、0、4週、9週)、何れの場合にも20μgの未処理DBを用いて腹腔内免疫化した。これら動物のうち三匹について、採血を12週において行い、また残りに二匹については32週において行った。
【0052】
得られたマウス血清を中和アッセイ法におきてHCMVを中和する能力について検討した。このために使用した方法は、実施例1に記載した通りであった。得られた結果を以下に示しが、その結果未処理DBの20μgを三回投与した場合、足に単回投与した場合と比較して中和抗体の産生が有意に増大することが明らかとなった。中和に要した数値は、血清陽性ドナー由来のヒト血清について通常得られる力価に相当するものである。
【0053】
実施例3
マウスを三回腹腔内免疫化した場合における天然DBによる継続的中和抗体応答の誘導
Balb/cJマウスを実施例2に記載したスケジュールに従って天然DBを用いて三回腹腔内免疫化した。第一回免疫化の後32週に、血清を上記した方法で動物から採り、中和アッセイで検討を行った。その結果、中和抗体は、初回免疫化処理後は比較的長期間経過後でも高濃度で検出可能の状態に留まることが明らかとなった。このことは、DBは、以前使用されていた死菌HCMVワクチンとは異なり継続的な中和抗体応答を誘導する能力を有することを示す。
【0054】
実施例4
天然DBと破砕処理DBとによる細胞障害性細胞の誘導
天然DBと破砕処理DBの投与が、実験動物体内において細胞障害性効果器細胞を活性化するのにどの程度適しているかを、本実験アプローチで試験してみた。抗CD3−媒介リディレクテッド(redirected)溶解方法をこの目的のために用いた。実験手法は下記する通りである。
【0055】
予めHCMVの実験室株Ad169で感染させておいたヒト包皮繊維芽の細胞培養上澄み液から、その細胞病原性効果が最大となる時点(感染後6―8日)で精製した。かかる目的のために、培地を採取し、ウイルス粒子をSW28ローターにおいて24,000rpm(10℃)で1時間遠心分離することによって沈降沈殿させた。この沈殿物を再度PBS中に懸濁させ、酒石酸グリセリン勾配に層形成させた。超遠心分離を行った後、透過光中で可視となるデンスボディーに帰属せしめられるべきバンドを針と1mlの注射器とを使って除去した。一つのアリコートをSDS−PAGEでの純度について検討し、且つ当該調製標本中におけるDBの量を、Raytest社−ドイツーから販売されているTinaソフトウエアを使用してBSA標準と比較することによって色強度に基いて定量した。DBの外膜がその免疫原性にどの程度関与しているかを解析するために、この調製標本の一部を試験するに際して、外膜を外被ーコア構造部から分離したが、粒子の粒状性質は保持するようにした。この目的のためには、DBの当該部分を液体窒素中での冷凍とその後の解凍という繰り返しサイクル10回に供した。次いで粒子をBranson sonifier(sonifier 250;設定条件:稼働率、10%、段階 3―出力制御 2.5)中で10分間音波破砕処理し、このように処理した粒子の構造を電子顕微鏡で可視化し、その物理的性質をスクローズ勾配で解析した。
【0056】
使用した実験動物は、9−10週例の雌のBALB/cJマウスであった。これらのマウスを何れの場合においても、試料をPBSに溶解したものの50μl容量を右後足に投与することによって免疫化した。各群6匹の動物から成る5群の動物を免疫化した。群1は、PBS中の精製ネズミCMV(MCMV)2x 105 pfuで免疫化し、群2は、それぞれ完全なデンスボディーの50μg(pp65の含量に標準化したクマシ―ゲル中の量)で免疫化し、また群3は、完全なデンスボディー2μgで免疫化し、さらに群4は、機械的に損傷したデンスボディーの20μg(プロトコールを参照のこと)で免疫化しまた群5は、PBSの50μlで免疫化した。8日目に、同側性および対側性膝かリンパ節を切除した。これらのリンパ節を金属篩に摩擦して通過させ次いで数回洗浄することによって、リンパ球を単離したが、リンパ節は群毎にプールした。細胞数を測定した後、コエレアのリンパ球は、IL−2含有培地で八日間の中間培養を行った(組換え型IL−2の100U/T細胞培地の1ml)。MEMアルファをT細胞培地として使用したが、更に10%のFCS、4mMのL―グルタミン、100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、10μg/mlのカナマイシン、10mMのHepes、0.00035% β―メルカプトエタノールを含有するものであった。16日目に、リディレクテッド溶解を実施したが、これは、当初p815肥満細胞種細胞(ATCC番号:TIB−64;生物:Mus musculus D)をCr−51で標識化することによって行ったが、具体的には1x106個の細胞を30μlのFCS中に再懸濁させ、次いで100μCiのCr−50(重クローム酸ナトリウム)を用いて37℃にて75分間標識化することによって行った。これらの細胞をP815培地中で三回洗浄して、過剰のクロームを除去した(P815培地:RPMI,10mM Hepes、5%FCS、2mM L−グルタミン、100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、0.00035% β―メルカプトエタノール)。この細胞集団の一部に抗CD3抗体を負荷した:即ち、このことは、5x105個のP815細胞を5μlの抗CD3抗体と共に室温で15分間培養することによって行った(ハムスター抗マウスCD3ε;Southern Biotechnology Associates Inc. Birmingham、AL;0.5mg/ml in PBS)。これらの細胞は二度洗浄した。
【0057】
細胞毒性試験を96ウエルマイクロタイタープレートで実施した。
【0058】
即ち、種々異なる量のリンパ球を100μl中に播種した。100μl中で1000個の標的細胞(P815又はP815/抗CD3)を各ウエルに添加した。最大限の溶解を決定するために、100μlの培地を効果器細胞の代わりに添加した。遠心分離(100g、4分間)を行った後、37℃にて4時間培養を行った。遠心分離を繰り返し(430g、4分間)100μlの上澄みを除去して、そのCr−51の放射能をガンマカウンターで測定した。それぞれの効果器細胞集団に対する溶解準位は、以下のようにして求める。
【0059】
(測定したクローム遊離量―自然遊離量)x100/(最大遊離量―自然遊離量)
特異的再導向溶解は、対側リンパ節細胞に対して求めた溶解準位を減じれば求められる。
【0060】
プロトコール:デンスボディーの機械的破砕
DBは、液体窒素中での凍結と解凍を十回行い、次いでBranson sonicator中で10分間音波破砕(sonifier 250;設定条件:稼働率、10%、段階 3―出力制御 2.5)することによって機械的に損傷させた。
【0061】
実施例5
HLA−A2.kbトランスジェニックマウスを免疫した場合のpp65特異的CTLの誘導
天然DBと破砕処理DBの投与が、実験動物体内において細胞障害性効果器細胞を活性化するのにどの程度適しているかを、かかる実験で試験してみた。ヒトHLA−A2分子(C57/BL6−A2.kb)に対してトランスジェニックであるC57/BL6系の8−10週令マウスからなる群を実施例4において記載したように20μgのDB,20μgのDB又は20μgの破砕処理DBにアジュバントを添加することなくそれぞれPBSに溶解したもので足底内免疫化に供した。膝かリンパ節の細胞を上記したように採取し、数えそして100μU/mlの組替え型ヒトインターロイキン2を添加したT細胞培地でインビトロにて8日間培養した。16日目に、これら細胞集団中におけるHCMV特異的細胞障害活性を測定した。クローム遊離試験に用いた標的細胞は、ヒトT2細胞(ATCC CRL−1992)及びJurkat細胞(ATCC番号 TIB−152)であり、これらは、キメラMHC分子A2.kb遺伝子を安定的に発現する細胞である。これらの細胞を実施例4において記載したようにCr−51で標識化し、次いで5x105個の細胞からなる部分群に、一部は腫瘍抑制タンパク質p53由来のHLA−2が提示する公知のpp65ペプチド(アミノ酸 495−503;Jerini、Berlinにより合成して調製されたペプチド)でまた別には同じHLA−A2が提示する当該しない対照ペプチド(アミノ酸149−157)とを負荷した。この目的のために、これらのペプチドは、10-3の濃度でPBS中に溶解させ、次いで更に十進法により稀釈した。5x105個の標的細胞からなる部分をペプチドと共に500μlの容量にて最終濃度として10-5乃至10-10Mで37℃にて1時間培養した。未結合ペプチドをT細胞培地で洗浄した。これら二種類のT細胞系を負荷するための最適ペプチド濃度は、予備試験によってJurkat細胞に対しては10-6MまたT2細胞に対しては10-8Mと決定された。
【0062】
クローム遊離試験は、効果器細胞:標的細胞(E:T)比を減少させて実施した(図5)。即ち、該当しないペプチド(腫瘍抑制タンパク質p53由来のHLA−2が提示するペプチド)を標的細胞に負荷した後での平行実験で得られたクローム遊離値を、pp65を負荷した標的細胞の特異的溶解を行った各ケースにおいて得られた数値から減じた。その結果、DBによる免疫化によって、pp65特異的(HCMV特異的)CTLが産生されることが明らかとなった。更に、2μgのDBにより免疫化した動物の細胞は、E:T比を予め一定に設定した場合は20μgのDBで免疫化した動物の細胞よりもクローム遊離数値が若干高くなった。破砕処理した粒子で免疫化した動物の細胞は、矢張りpp65特異的溶解減少を示したのであるが、その細胞障害性効果器活性の一つの基準・目安であるクローム遊離は、特定のE:T比においては未処理DBを投与した動物から得られた細胞よりも明らかに低くなった。特に、破砕処理した粒子で免疫化した動物から得られた細胞の細胞障害性活性の一つの基準・目安であるクローム遊離値を予め一定に設定した場合、かかるE:T比を実現するために必要な効果器細胞の相対的な数は、明らかに高くなった。これらの結果をまとめると、(I)“死滅抗原”であるDBで実験動物を免疫化することは、HCMV特異的細胞障害性T細胞を産生させるために適していること、及び(II)細胞性免疫応答の効率は、恐らく完全なエンベロープにより介在されるDBの細胞性取り込みに依存して異なること、この二点が明らかとなる。このような結果は、細胞内病原体に対するCTLの効率的な産生が、通常は細胞内での相当する抗原のデノボ合成に依存することからして、例外的に注目するべきことであると言わねばならない。MHCクラスI複合体に対するウイルス特異的ペプチドの“外因性負荷”は、DBによって介在されるのであり、例外的に極めて効率が良いとみなすことが出来、HCMVのみならず例えばインフルエンザウイルスなど異種性病原体に対しても作用する保護的細胞障害性効果器の機能を生成させるのに適しているはずである。
【0063】
実施例6
DBによる免疫化をおこなうことによって、Th1典型的Tヘルパー細胞応答が誘導されこと
体液性及び細胞性の終生免疫応答を誘導することは、Tヘルパーリンパ球を誘導することが可能であるか否か、及び如何なる態様にてこれを誘導することが出来るかに決定的に依存するのである。ウイルス性病原体に対して免疫化が行われると、Th1典型的免疫応答を生成させることが特に望ましい。DBによる免疫化がどの程度にまでかかる目的に適しているかを検討するために、二つの実験的アプローチを選択した。
【0064】
第一の実験的アプローチにおいては、予めDBによる足底免疫化を受けた実験動物から得られたリンパ節細胞が、中間培養を行った場合にTh1典型的リンホカイン類(この場合は、ガンマ(γ)―インターフェロン、即ちIFN―γ)又はTh2典型的(この場合は、インターロイキンー5、即ちIL−5)を合成し且つ遊離するか否かを試験した。それぞれ6匹のBalb/cJマウスから成る群を2μgのDB,20μgのDB又は20μgの破砕処理DBをそれぞれPBSに溶解したもの又はPBS単独で足底内免疫化に供した。リンパ節細胞を実施例4において記載したように、免疫化して8日後に採取し、106細胞/mlなる密度で、2mM L−グルタミン、100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、5%FCS、5x10-5の2―メルカプトエタノール、10mM Hepesを添加したRPMI 16040培地内に播種した。これらの細胞は、培養過程で20μgのDB又は20μgの破砕処理DB、MHCクラスI(HLA−A2)で提示されるペプチド(pp65、495−503)又はPBSによってこれらの抗原を培地に添加することによって再刺激した。最刺激の24時間及び36時間後に、細胞培養上澄み液を集め、Eppendorf遠心分離機において2500rpmで10分間遠心分離して、細胞残渣を除去した。培養細胞から得た上澄み液中のIFN―γ及びIL−5の含有量を市販のELISAテストキット(Engogen,Woburn,U.S.A.)を使用して測定した(図6)。測定値を標準化するために、同一テストキットにあわせて提供されている組換え型IFN−γ及びIL−5を細胞培養培地に溶解し、平行して分析した。
【0065】
20μg又は2μgのDBで免疫化した動物から得られたリンパ球は、大量にIFN−γを分泌した。破砕処理した粒子で免疫化した動物由来の細胞は、明らかに分泌されるIFN−γが少なかった。IL−5は、どの混合物においても有意な量で測定されることはなかった。これらの結果から、デンスボディーによって動物を免疫化することが、Th1典型的免疫応答を誘導するのに適していること及び逆にその誘導程度は、DB膜の完全さに依存して変わることが、明らかとなった。
【0066】
Th1典型的免疫応答又はTh2典型的免疫応答は、特に投与形態に依存していることが判っているので、第二の実験的アプローチにおいては、マウスを20μgのDBを用いて4週間の間隔をおいて三回免疫化した。第一回目の注射から12週間及び32週間後に、これらの動物からエーテル麻酔下心臓穿刺によって全血を採血し、27℃で2時間培養して凝集させ、4℃にて一晩貯蔵し、翌日14000rpmで10分間遠心分離した。透明な血清上澄み液を取り除いて、狩猟のアリコートとしてー20℃で貯蔵した。血清中におけるIgG1及びIgG2aサブクラスのHCMV特異的免疫グロブリン含量を測定した。Th1典型的免疫応答の過程で、IgG2aクラスの抗体が優先的に生成されるが、これに対してTh2典型的免疫応答では、IgG1クラスの抗体が優勢となる。これらの実験動物から得られた血清を56℃で30分間不活性化させ、細胞外HCMV粒子の抗原をコートした市販のELISA(Biotest AG, Dreieich)を用いて試験した。個の目的のために、試験血清の段階稀釈シリーズを調製し、ピペットでELISAプレートのウエルに移し、37℃にて2時間培養した。PBS/0.05% Tween2oで三回の洗浄工程を経た後、サブクラス特異的HRP結合二次抗体をPBS/2% Tween20/3%FCSによる1:2000なる稀釈率で添加し、湿潤雰囲気中37℃にて1時間培養した。更に4つの洗浄工程を経た後、OPD発色反応を行ったが、この反応は、100μlの0.5MH2SO4を添加することによって停止させた。492nmの波長における吸光度をELISAリーダーで測定した。
【0067】
種々の血清希釈液について得られた吸光度値を通過する回帰線を引き、ゼロ血清の吸光度の2.5倍に相当する数値を所謂“終点希釈率”として得た。IgG1:IgG2aに対する終点希釈率の比から、一つのアリコートが得られるが、これは、免疫化プロトコールの如何に拘わらず常に0.3以下であった(図8)。IgG1:IgG2a比率が1以下であることは、Th1典型的免疫応答を示すが、これに対してこの比率が1以上であることは、Th2応答を示すので、個の実験から、DBによる免疫化は、Th1様のTヘルパー細胞応答を誘導することが証明された。同様の結果が、DBの足底投与による平行実験で得られた。このことから、投与の形態の如何に拘わらず、DBによる免疫化によって、実験動物においてはTh1典型的免疫応答が得られることが明らかとなった。
【0068】
実施例7
一次ヒト線維芽細胞において異種遺伝子を発現させる方法及びかかる細胞においてHCMVの欠損突然変異株を補完すること
最少数のPassageを有するヒト線維芽細胞を6ウエルプレートに播種したが、何れの場合にも105個の細胞を用いる。カバーガラスを対照目的のためにこれらのウエルのいくつかに用いる。
【0069】
これらの細胞を37℃のCO2培養器中で一晩培養し、翌日トランスフェクションする。所望のトランスジーン(transgene)を例えば、ブラスチシジン(blasticidin)デアミナーゼ遺伝子を有するプラスミドpcDNA6/V5−His(Invitorogen)で発現させる。この遺伝子の発現によって、ブラスチジンSなる物質に対する抵抗性が付与される。
【0070】
又これに代わる別の可能性は、抗生物質ピューロマイシンに対する抵抗性を付与するベクターpRG273と共に別の発現プラスミドに所望のトランスジーンをトランスフェクションさせることである。このベクターは、ベクターpLXSN16E6E7の誘導体であり、この抵抗性遺伝子以外にヒトパピローマウイルス16の形質転換タンパク質E6及びE7を発現する。このことによって、関連細胞の増殖ポテンシャルをその形質転換によって増大させることが出来る。
【0071】
このようなトランスフェクションは、ロッシュ デイアグノステクス社(Rche Diagnostics)の“Fugene法”によって実施される。かかる目的のために、3μlのFugene試薬を97μlのFCSを含まない培地と混合し、室温で5分間培養する。ほぼ2μgのトランスジーンプラスミドのDNA(ダブルトランスフェクションの場合は、50ngのpRG273をプラス)を加え、また室温で15分間経過後に、900μlの血清含有培地を添加する。古い培地を取り除いた後で、この混合物を細胞に加える。トランスフェクションは、3乃至8時間の間行われる。この後、トランスフェクション混合物を除去し、培養用培地を加える。2日間培養した後、カバーガラスを24ウエルプレートに移し、洗浄し、次いで90%アセトンで固定化する。このトランスジーンの発現は、抗体を用いて間接的免疫蛍光顕微鏡でチェックする。
【0072】
トランスフェクションさせる効率が充分である場合は、残存細胞をトリプシンで遊離させ、選択培地(例えば、3μg/mlのブラスチシジン、2μg/mlのピューロマイシン、250μg/mlのG418など)に播種する。細胞コロニーがこの選択培地で形成された場合は、これらコロニーを単離し、更に選別条件下で更に培養する。細胞を次に選別条件下で膨張させ、当該トランスジーンの発現強度を例えばイミュノブロットでチェックする。当該発現が充分であれば、細胞をいくつかのアリコートに分別し、次に使用するまで液体窒素中で保存する。
【0073】
実施例8
pp65及び同種又は異種抗体との融合タンパク質を含有する組換え型DBを産生させるための策定方針
組換え型DBを産生させるための採用可能な一つの策定方針は、以下の通りである。
【0074】
Ad169菌株のゲノムDNA断片BamHI−R(pBamHIRとしてpBluescribeにクローニングしたもの)からスタートして、先ずpp65遺伝子の3'部分の特異的SrfI切断部位にクローニングした異種核酸区分を含有するプラスミドクローンを幾つか産生させる。pp65以外のHCMVタンパク質又は他の病原体のタンパク質の種々の抗原性部位をコードするDNA領域を、UL83(pp65)を有する連続オープンリーディングフレームが生じるようにクローニングする。これらの異種DNA区分を基準として3'方向において、連続オープンリーディングフレームにおけると同様に、所謂グリーン蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子とネオマイシントランスフェラーゼとから成る融合遺伝子をクローニングすることも可能である。この遺伝子は、何れの場合にもファージP1のCreリコンビナ―ゼ認識部位(LoxP部位)によって選択されるべきである。これから得られるプラスミド構築物を図7に示す。
【0075】
この組換え型プラスミドをヒト包皮線維芽細胞にトランスフェクションさせて、得られた細胞をHCMVAd169株に重複感染させる。同種の組換えの結果、pp65の代わりにそれぞれの融合遺伝子を含む組換え型HCMVゲノム分子が得られる。G418を培養用培地に添加することによって、これら組換え型DNA分子の複製と組換え型ウイルスの濃縮とを行うための選択がなされる。GFPの発現によって更には、サイトフルオロメトリー(FACS)を使用して、組換え型ウイルスゲノムを含む細胞の正の選別を行うことが可能となるのである。組換え型ウイルスの効率的な濃縮とその後の単離とが、かくして確保されることになる。
【0076】
かくして精製されたウイルスは、次に一時的に又は安定的にCREリコンビナ―ゼを発現する細胞系をパッセージさせる。このリコンビナーゼは、DNA分子中の塩基対の短い配列(loxP部位)を認識し、かかるloxP部位の間に位置するDNA区分を正確に切り取りする。この結果、選抜を行うために以前に使用し且つGFP−NeoをコードするDNA区分が欠失されることになる。GFP陰性細胞をFACSで選別した後、選別のためのpp65融合タンパク質を発現する純粋ウイルスを単離し且つ精製する。
【0077】
その後は純粋ウイルス集団を使用してヒト線維芽細胞に感染させることが出来る。かかるウイルス感染過程においては、組換え型DBが感染細胞において産生されるので、その後は勾配遠心分離によって細胞培養上澄み液から精製することが出来る。
【0078】
例えば、下記するウイルスを産生させることが可能である(図7を参照):
A)pp65及びHCMVのgBに由来する公知の中和領域とから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。この種の領域は、文献においてはAD1及びAD2と記述されてきた領域である。Towne laboratory株のgBに由来するAD2に相同である領域は、TW2と記述されてきた領域である。
【0079】
B)pp65及びHCMVのIE1タンパク質(IE1)のうちの公知CTLエピトープとから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。
【0080】
C)pp65、HCMVグリコプロテイン(NA)の公知の中和領域及び及びHCMVのIE1タンパク質(IE1)のうちの公知CTLエピトープとから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。
【0081】
D)pp65及び例えばインフルエンザAウイルス(例えばAA 147−155)の核タンパク質など、他の病原体の公知CTLエピトープとから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。
【0082】
E)pp65、別の病原体の中和エピトープ(NA)及び他の病原体の公知CTLエピトープ(CTL)とから構成される融合タンパク質を発現するウイルス。
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例1で得られたデンスボディーで単回免疫化したマウスの血清中におけるHCMV中和抗体を検出するための中和アッセイの結果を示す。実施例1において記載された染色方法によって4倍混合物中において陽性細胞核が最早や一切検出可能でない場合(破線)、中和を100%と評価する。特定の血清稀釈倍率での中和度は、4倍混合物中での陽性細胞の数を抗体を含まない同一混合物中の陽性細胞の数を基準として比較することから得られる。
【図2】 実施例2で記載した天然デンスボディーをその都度P20μg用いそれぞれ4週間隔てて三回腹腔内免疫化した場合のマウスの血清中におけるHCMV中和抗体を検出するための中和アッセイの結果を示す。このアッセイは、図1において示すように評価した。点線は、100%中和が生起した場合の血清力価を示す。“ゼロ血清”として用いたものは、HCMV粒子で免疫化しなかったマウスから得られた血清であった。
【図3】 実施例3で記載した天然デンスボディーをその都度P20μgを用いて三回腹腔内免疫化した場合(それぞれ4週間隔てて)中和抗体の持続を検出するための中和アッセイの結果を示す。評価は、図1に示すように行った。
【図4】 実施例4において記載したように、抗CD3εー媒介によりリディレクトした溶解によって破砕処理した天然デンスボディーでマウスを免疫化した場合の全細胞障害活性を解析した結果を示す。それぞれの場合において観察された溶解活性を標的細胞に対する作動細胞の比についてプロットしてある。
【図5】 実施例5において記載したように、破砕処理した天然デンスボディーで免疫化した場合のリンパ節細胞が示すHCMV特異的細胞障害活性を解析した結果を示す。それぞれの場合において観察された溶解活性を放射性クロームの遊離放出度により測定し、標的細胞に対する効果器細胞の比(E:Z比)についてプロットしてある。破線は参考として、現行レベルの溶解を達成するために必要な作動細胞の相対的数を示す。明らかなように、同一レベルの溶解を達成するためには、未処理DBによって免疫化した動物由来の細胞の使用数は明らかに低くする必要があった。
【図6】 実施例6において記載したように、破砕処理した天然デンスボディーで免疫化した場合のリンパ節細胞によるリンホカイン放出・遊離に基いた、Th免疫応答の本質を解析した結果を示す。遊離されたIFN−γの量を再刺激後の経過時間に対してプロットしてある。図A)20μgのDBで免疫化、図B)20μgの破砕処理DB(drDB)で免疫化、図C)20μgのDBで免疫化及び図D)PBSで免疫化(負の対照―ネガティブ コントロール)。再刺激に用いた抗原は、図D)内のはめ込み部において示してある。IL−5分泌は、平行して測定した。IL−5の有意の分泌は、何れの場合においても検出不可能であった。
【図7】 同種及び異種抗原との融合タンパク質を含有する組換え型DBを産生させるための手法を示すが、これは実施例8において記載する。
【図8】その都度20μgのDBを用いて4週間の間隔で腹腔内免疫化したbalb/cJマウスの血清中におけるHCMV特異的抗体のIgGサブクラスのプロフィールを示す。血清は、第一回目の注入後12週間及び32週間において採取し、実施例6において記載したように分析した。ELISAでの吸収が、ゼロ血清の吸収の2.5倍に相当するアッセイ血清の終点稀釈率を示す。IgG1/IgG2比をそれぞれの場合においてこれらの数値から算定した。
Claims (11)
- 下記を特徴とする、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス(HCMV)感染後に遊離されるウイルス粒子:
a)該粒子が、ウイルス性HCMVグリコプロテイン類が内部に包埋される脂質膜によって囲にょうされること;
b)該粒子が、ウイルス性DNAおよびカプシドのいずれをも含有しないこと;及び
c)該粒子が、T細胞抗原pp65(UL83)の構成部分の一種以上及びpp65ではない一種以上のタンパク質の構成部分の一種以上とを含んで成る融合タンパク質を含有すること。 - 該T細胞抗原pp65(UL83)を一種のHCMVグリコプロテインの構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1において記載された粒子。
- 該T細胞抗原pp65(UL83)をHCMVグリコプロテインgBの構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1において記載された粒子。
- 該T細胞抗原pp65(UL83)をHCMVグリコプロテインgHの構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1において記載された粒子。
- 該T細胞抗原pp65(UL83)をHCMVプロテインIE1(ppUL123)の構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1において記載された粒子。
- 該T細胞抗原pp65(UL83)を一種のHCMVグリコプロテインの構成部分の一種以上及びHCMVプロテインIE1(ppUL123)の構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1において記載された粒子。
- 該T細胞抗原pp65(UL83)をHCMV以外のヒト病原体の構成部分である一種のタンパク質の構成部分の一種以上に融合させることを特徴とする、請求項1において記載された粒子。
- HCMVではない他種ヒト病原体が、HIV−1,HBV、HCV及びインフルエンザから成る群から選択されることを特徴とする、請求項7において記載された粒子。
- 下記を特徴とする、哺乳動物細胞のヒトサイトメガロウイルス感染後に遊離されるウイルス粒子:
a)該粒子が、ウイルス性HCMV−グリコプロテイン類を内部に包埋する脂質膜によって囲にょうされること;
b)該粒子が、ウイルス性DNAおよびカプシドのいずれをも含有しないこと;及び
c)該粒子が、他の異なるHCMV株に由来した特定の一種のグリコプロテインの変異体である少なくとも二種のグリコプロテインの構成部分を含むこと。 - 該特定HCMVグリコプロテインの二種の変異体のうちの一つが、HCMV Towne株の変異体であり、また残りの変異体が、HCMV Ad169株の変異体であることを特徴とする、請求項9において記載された粒子。
- 該グリコプロテインが、HCMVのgBタンパク質であることを特徴とする、請求項10において記載された粒子。
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