JP6548700B2 - ワクチン接種目的のためのエプスタイン・バーウイルス由来の第二世代ウイルス様粒子（ｖｌｐ） - Google Patents

ワクチン接種目的のためのエプスタイン・バーウイルス由来の第二世代ウイルス様粒子（ｖｌｐ） Download PDF

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Description

本発明は、エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを実質的に含まない、エプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）に関する。本発明はまた、(a) BFLF1遺伝子、BBRF1遺伝子、BGRF1遺伝子、BDRF1遺伝子、BALF3遺伝子、BFRF1A遺伝子、およびBFRF1遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの発現可能な遺伝子を欠損し、かつ(b)好適な宿主細胞で本発明のEB-VLPを産生するEBVゲノムを含むポリヌクレオチドにも関する。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、ならびに前記EB-VLPを製造する方法、そのワクチンを製造する方法、該EB-VLPを含むワクチンおよび組成物に関する。
癌原性エプスタイン・バーウイルス（EBV）は、潜在的にヒトBリンパ球に感染できるガンマヘルペスウイルスのファミリーに属する。EBVは、ヒト集団の90％超で、生涯にわたって持続するB細胞感染を確立する（Kieff and B. Rickinson. (2006), Epstein-Barr virus and its replication, D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 5th ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, PA. 2603-2654；Kuppers, R. (2003). B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus, Nat. Rev. Immunol. 3:801-812）。健康な個体では、EBV感染B細胞の大多数は、限られたウイルス遺伝子発現および休眠性表現型を示す。形質細胞への潜伏感染細胞の最終分化は、ウイルス再活性化、産生、およびB細胞の再感染をもたらす（Laichalk, L. L., and D. A. Thorley-Lawson. (2005), Terminal differentiation into plasma cells initiates the replicative cycle of Epstein-Barr virus in vivo. J. Virol. 79:1296-1307）。すべてのウイルス潜伏感染遺伝子の発現は、感染B細胞の増殖形質転換および増殖を引き起こし、これは、in vitroでのEBV形質転換型リンパ芽球様B細胞株の増殖、およびEBVと、in vivoでの様々なタイプのリンパ腫をはじめとする種々のB細胞リンパ増殖性疾患との関連性に反映される。EBV感染は、先天的または医原的に誘導されたT細胞機能不全を有する患者でのEBV関連悪性腫瘍の高い発生率（Rickinson, A. B., and E. Kieff. (2006), Epstein-Barr virus, D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 5th ed. Lippincott- Raven, Philadelphia, PA., 2655-2700）、およびポリクローナルEBV特異的T細胞株の注入により、造血幹細胞移植レシピエントでのEBVに関連する移植後リンパ増殖性疾患の治療が成功したこと（Rooney, C. M., et al., (1998), Infusion of cytotoxic T cells for the prevention and treatment of Epstein-Barr virus-induced lymphoma in allogeneic transplant recipients. Blood 92:1549-1555）により示される通り、T細胞によって制御される。
よって、当技術分野には、EBV感染を予防または除去するためのワクチンを開発する必要性がある。そのようなワクチンは、見かけ上健康な被験体にも適用されるであろうし、したがって、そのようなワクチンの安全性は、主要な関心事であろう。これまでのところ、市販されているEBV gp350に対するペプチドワクチンしかない。しかしながら、このワクチンを用いた最初の臨床試験は、これが、EBV陰性移植レシピエントでのEBV感染を予防しないことを示す（Rees L, et al. (2009), A phase I trial of Epstein-Barr virus gp350 vaccine for children with chronic kidney disease awaiting transplantation. Transplantation 88(8):1025-9）。
ウイルス様粒子（VLP）は、成熟ビリオンと類似または同一であるが、ウイルスゲノムを欠損した構造体である。一般的に、これらは、例えば単量体ペプチドよりも高度に宿主の免疫応答を刺激し、このことが、B型肝炎ウイルスおよびパピローマウイルスなどの数種類のウイルスに対するワクチン接種のためにこれらが優先的に用いられてきた理由である（Greenstone, H. L., et. al. (1998), Chimeric papillomavirus virus-like particles elicit antitumor immunity against the E7 oncoprotein in an HPV16 tumor model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1800-1805；Mandic, A., and T. Vujkov. (2004). Human papillomavirus vaccine as a new way of preventing cervical cancer: a dream or the future? Ann. Oncol. 15:197-200）。VLPワクチンレジメンの極めて重要な安全性の側面は、用いるVLPがウイルスゲノム（DNAまたはRNA）を含有してはならないということであり、なぜなら、そうでなければワクチン接種がウイルス複製および/または該ウイルスによる潜伏感染を誘導し得るからである。
EBVおよび他のヘルペスウイルスのウイルス溶解性複製（viral lytic replication）、すなわち、子孫ウイルス粒子の形成をもたらすプロセスは、様々なタンパク質クラスの連続的活性化の結果生じる複雑なプロセスである。溶解性複製の間、ウイルスゲノムは、異なる複製起点から数千回増幅されて、高度に枝分かれした構造を形成する。次に、これらの大型のコンカテマーが、単位長さの直鎖状ウイルスゲノムに分解され、これは、感染細胞核内でプリフォーム型プロカプシドへとパッケージングされるであろう。ウイルスDNAを含有するカプシドは、さらなるコンホメーション変化および構造変化を受けて、エンベロープビリオン粒子として感染細胞から放出されるであろう（Roizman, B., and D. M. Knipe. (2001), Herpes simplex viruses and their replication, D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, R. A. Lamb, M. A. Martin, B. Roizman, and S. E. Straus (ed.), Fields virology, 4th ed., vol. 2. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2399-2459）。EBVのカプシド封入（encapsidation）をもたらす1つの必須のcisエレメントは、直鎖状ゲノムの両端に位置する末端反復（terminal repeat；TR）であり、これらはウイルス溶解性複製の間に形成されるコンカテマーからの個々のウイルスゲノムの切り出しならびにそれらのパッケージングに関与する。これらの末端反復が欠失したEBV突然変異型株（delTR-EBV）が作製されている。対照EBVを用いる場合の29％と比較して、delTR-EBVを含有する上清を用いて感染させた細胞のうちのわずか0.001％が、該ゲノムからマーカー遺伝子を発現するので、溶解サイクルの誘導後に多量の中空の（empty）EB-VLPが生成されること、およびゲノムカプシド封入の効率が著明に低いことが示されている（Feederle R, et al., (2005), Defective infectious particles and rare packaged genomes produced by cells carrying terminal-repeat-negative Epstein-Barr virus. J. Virol. 79; 7641-7）。このことから、末端反復はゲノムカプシド封入に重要であるが、絶対的に必須ではないことが示される。さらに、delTR-EBVから生成されたVLPが、稀ではあるが、まだ細胞に感染するので、ワクチンとしての使用のためのdelTR-EBV VLPの安全性は保証されないことが示されている。
Kieff and B. Rickinson. (2006), Epstein-Barr virus and its replication, D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 5th ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, PA. 2603-2654 Kuppers, R. (2003). Nat. Rev. Immunol. 3:801-812 Laichalk, L. L., and D. A. Thorley-Lawson. (2005), J. Virol. 79:1296-1307 Rickinson, A. B., and E. Kieff. (2006), Epstein-Barr virus, D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 5th ed. Lippincott- Raven, Philadelphia, PA., 2655-2700 Rooney, C. M., et al., (1998), Blood 92:1549-1555 Rees L, et al. (2009), Transplantation 88(8):1025-9 Greenstone, H. L., et. al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1800-1805 Mandic, A., and T. Vujkov. (2004). Ann. Oncol. 15:197-200 Roizman, B., and D. M. Knipe. (2001), Herpes simplex viruses and their replication, D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, R. A. Lamb, M. A. Martin, B. Roizman, and S. E. Straus (ed.), Fields virology, 4th ed., vol. 2. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2399-2459 Feederle R, et al., (2005), J. Virol. 79; 7641-7
まとめると、既存の必要性にもかかわらず、これまでのところ、EBVに対する安全かつ有効なワクチンを作製する方法は開発されていない。つまり、本発明の元になる技術的課題は、EBVワクチンの効率的な製造を可能にする手段および方法の提供として見ることができる。
上記技術的課題は、特許請求の範囲および以下で本明細書中に特徴づけられる実施形態により解決される。
したがって、本発明は、エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを実質的に含まないエプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）に関する。
本明細書中で用いる場合、「エプスタイン・バーウイルス様粒子」または「EB-VLP」との用語は、溶解的に複製せず、好適な宿主細胞で潜伏感染を確立しない、EBV由来のウイルス粒子を意味する。EB-VLPは、好ましくは、電子顕微鏡により分析した場合に、基本的に典型的なヘルペスウイルス構造を有し、すなわち、カプシド、テグメント、および外膜を有する。しかしながら、正常なヘルペスウイルス粒子とは対照的に、本発明のEB-VLPは中空（empty）であり、すなわち、EBV DNAを含まず、好ましくはDNAをまったく含まない。EB-VLPは、公知のEBVタイプ（例えば、1型EBV：Genbank登録番号：NC_007605.1、GI:82503188；ゲノム：配列番号1；de Jesus O et al. (2003) J. Gen. Virol. 84, 1443-1450および2型EBV：Genbank登録番号NC_009334.1、GI:139424470；Dolan A et al. (2006) Virology Vol.350, 164-170)、ゲノム：配列番号2、M81株（配列番号38）を含む）について当業者に知られているEBウイルスタンパク質（例えば、カプシド、テグメント、コート、シェル、表面タンパク質またはエンベロープタンパク質および糖タンパク質）を含む。
EBVコードタンパク質に加えて、EB-VLPはまた、1つ以上の人工ポリペプチドも含むことができる。「人工ポリペプチド」との用語は、野生型EBVには含まれない、EB-VLPに組み込まれるいずれかのポリペプチドに関する。人工ポリペプチドが組み込まれ、したがって含まれる場合、EB-VLPは、本発明の方法に従ってEB-VLPを取得し、産生細胞からEB-VLPを分離し（例えば、下記の実施例に記載される通りに遠心分離または免疫沈降により）、続いて該EB-VLP中の人工ポリペプチドの存在を決定する（これは、実施例に記載される免疫ブロット法、または特定のポリペプチドに適合し、かつ当業者に公知のいずれかの他の方法により遂行することができる）ことにより、評価することができる。
好ましくは、人工ポリペプチドは、ヘルペスウイルス糖タンパク質の、膜内在性（membrane-integral）の部分を含む融合ポリペプチドである。より好ましくは、人工ポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスgCタンパク質の膜貫通ドメインを含む融合ポリペプチドである。好ましい実施形態では、人工ポリペプチドは、検出可能なタグをさらに含む。「検出可能なタグ」との用語は、本発明の融合ポリペプチドに付加されるかまたはその中に導入される、アミノ酸の伸長を意味する。好ましくは、タグは、本発明の融合ポリペプチドに、C末端またはN末端で付加されるであろう。前記アミノ酸伸長は、タグを特異的に認識する抗体による融合ポリペプチドの検出を可能にし、またはキレート剤などの機能的コンホメーションの形成を可能にし、または蛍光タグによる可視化を可能にするであろう。好ましいタグは、Mycタグ、FLAGタグ、6-Hisタグ、HAタグ、GSTタグまたはGFPタグである、これらのタグはすべて、当技術分野で周知である。さらなる好ましい実施形態では、前記融合タンパク質は、免疫原性タンパク質、好ましくは病原性微生物の免疫原性タンパク質、より好ましくはEBVタンパク質、最も好ましくは潜伏感染EBVタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含む。
しかしながら、本発明では、1つ以上の非必須EBウイルスポリペプチドが、EB-VLPから欠損していることも想定される。本発明の文脈では、「非必須EBVポリペプチド」とは、野生型EBウイルス粒子に組み込まれるが、VLPの形成には必須でないポリペプチドに関する。あるポリペプチドの不在下で本明細書の方法に従ってVLPを生成するように好適な宿主細胞が誘導された後で、電子顕微鏡または本明細書中の実施例に記載の他の方法のうちの1つによりVLPが検出可能である場合、該ポリペプチドは非必須である。例えば、感染後のエンドソームからのEBV粒子の脱出で役割を果たすことが示されたEBV BNRF1遺伝子の産物（Feederle, R, et al. (2006), Epstein-Barr virus BNRF1 protein allows efficient transfer from the endosomal compartment to the nucleus of primary B lymphocytes. J Virol. 80(19):9435-43）は、EB-VLPから欠損させることができる。EBVの溶解性感染の最中に宿主細胞からポリペプチドを除去する方法は、当業者に周知である。好ましくは、ウイルスゲノムから該ポリペプチドをコードする遺伝子を欠失させることにより、または遺伝的操作を用いて該遺伝子を発現不可能にすることにより（例えば、開始コドンを非開始コドンに突然変異させることにより）、ポリペプチドを除去する。
本明細書中で用いる場合、「EBV DNAを実質的に含まない」との用語は、当業者に理解されるであろう。この用語は、すべてのEB-VLPがEBV DNAを含まないことを必ずしも意味しない。しかしながら、この用語は、本発明の方法により生成されたEBV DNA不含EB-VLPの数が、対照EB-VLPと比較して統計学的に有意な部分、増加することを必要とする。対照VLPは、上で本明細書中に記載したdelTR-EBV VLPである。ある部分が統計学的に有意か否かは、種々の周知の統計学的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントt検定、マン・ホイットニー検定などを用いて、当業者がさらなる面倒なしに決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、または0.0001である。さらに、本発明の方法により作製されるEBV DNA含有EB-VLPの数は、好ましくは、対照EB-VLPと比較して少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、または少なくとも10000倍減少する。
好ましくは、EBV DNAを実質的に含まないEB-VLPは、10000個未満のEBVゲノム/mL上清、より好ましくは1000個未満のEBVゲノム/mL上清、さらにより好ましくは100個未満のEBVゲノム/mL上清、最も好ましくは10個未満のEBVゲノム/mL上清（本明細書の実施例に記載された通りに作製し、PCRアッセイでアッセイした場合）を含有するEB-VLPである。好ましくは、EBVゲノムの数は、200個未満/106 EBV-VLP、100個未満/106 EBV-VLP、50個未満/106 EBV-VLP、20個未満/106 EBV-VLP、10個未満/106 EBV-VLP、1個未満/106 EBV-VLP、0.1個未満/106 EBV-VLP、または0.01個未満/106 EBV-VLPである。
好ましくは、EBV DNAを実質的に含まないEB-VLPは、本明細書の実施例に記載された通りに作製し、感染アッセイでアッセイした場合、10個未満の感染細胞/mL上清、より好ましくは1個未満の感染細胞/mL上清、さらにより好ましくは0.1個未満の感染細胞/mL上清、最も好ましくは0.01個未満の感染細胞/mL上清の割合で、Raji細胞での潜伏感染を確立するEB-VLPである。好ましくは、割合は、10個未満の感染Raji細胞/106 EB-VLP、より好ましくは1個未満の感染細胞/106 EB-VLP、さらにより好ましくは0.1個未満の感染細胞/106 EB-VLP、最も好ましくは0.01個未満の感染細胞/106 EB-VLPである。
好ましくは、本発明のEB-VLPは、医薬として用いられる。本明細書中で用いる場合、「医薬としての使用」との用語は、疾患の診断、治癒、治療、または予防における薬剤としてのEB-VLPの使用に関する。
また好ましくは、本発明のEB-VLPは、ワクチン接種のために用いられる。本明細書中で用いる場合、「ワクチン接種」とは、適応免疫を発現させるために被験体の免疫系を刺激するための抗原性物質の投与に関する。ワクチン接種は、治療的または予防的ワクチン接種である。
治療的ワクチン接種とは、本明細書中で言及される疾患もしくは障害またはかなりの程度でそれに付随する症状を改善するかまたは治癒させるためのワクチン接種を意味する。治療的ワクチン接種は、本明細書中で言及される疾患または障害に関して、健康の完全な回復をもたらすことができる。本発明に従って用いられる場合、治療的ワクチン接種は、全ての被験体で有効ではない可能性があることが理解されるべきである。しかしながら該用語は、本明細書中で言及される疾患または障害に罹患した被験体の統計学的に有意な部分を成功裏に治療することができることを必要とするであろう。ある部分が統計学的に有意か否かは、種々の周知の統計学的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントt検定、マン・ホイットニー検定などを用いて、当業者がさらなる面倒なしに決定することができる。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、または0.0001である。好ましくは、治療は、所与のコホートもしくは集団の被験体のうち、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％に対して有効であろう。
予防的ワクチン接種とは、被験体で、一定期間、好ましくは生涯、本明細書中で言及される疾患または障害に関して健康を保持するためのワクチン接種に関する。該期間は、投与されたEB-VLPの量および本明細書中の他の箇所で論じられる被験体の個人的要因に依存することが理解されるであろう。予防的ワクチン接種は、本発明に従ってEB-VLPを用いて治療されるすべての被験体で有効ではない可能性があることが理解されるべきである。しかしながら、該用語は、コホートまたは集団の被験体のうちの統計学的に有意な部分が、本明細書中で言及される疾患もしくは障害またはその付随する症状に罹患することが有効に予防されることを必要とする。好ましくは、この文脈では、通常は、すなわち、本発明に従う予防的ワクチン接種なしでは、本明細書中で言及される疾患または障害を発症するであろう被験体のコホートまたは集団が想定される。ある部分が統計学的に有意か否かは、本明細書中の他の箇所で論じられる種々の周知の統計学的評価ツールを用いて、当業者がさらなる面倒なしに決定することができる。
上記で行なった定義は、以下に準用される。
さらなる実施形態では、本発明は、(a) BFLF1遺伝子、BBRF1遺伝子、BGRF1遺伝子、BDRF1遺伝子、BALF3遺伝子、BFRF1A遺伝子、およびBFRF1遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの発現可能な遺伝子を欠損し、かつ(b)好適な宿主細胞で本発明のEB-VLPを産生させることができるEBVゲノムを含むポリヌクレオチドに関する。
本明細書中で用いる場合、「ポリヌクレオチド」との用語は、直鎖状または環状核酸分子を意味する。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチドとして（すなわち、その天然の環境から単離されている）または遺伝学的に改変された形でのいずれかで提供されるであろう。この用語は、一本鎖ならびに二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。さらに、天然に存在する修飾型ポリヌクレオチド（グリコシル化またはメチル化ポリヌクレオチドなど）または人工的な修飾型誘導体（ビオチン化ポリヌクレオチドなど）をはじめとする化学修飾されたポリヌクレオチドも含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、BFLF1遺伝子（1型EBVに対する遺伝子：配列番号3；タンパク質産物：配列番号4、Genbank登録番号YP_401648.1、GI:82503206；2型EBVに対する遺伝子：配列番号5；タンパク質産物：配列番号6、Genbank登録番号YP_001129444.1、GI:139424479）、BBRF1遺伝子（1型EBVに対する遺伝子：配列番号7；タンパク質産物：配列番号8、Genbank登録番号YP_401682.1、GI:82503238；2型EBVに対する遺伝子：配列番号9；タンパク質産物：配列番号10、Genbank登録番号YP_001129476.1、GI:123811640）、BGRF1/BDRF1遺伝子（1型EBVに対する遺伝子：配列番号11、タンパク質産物：配列番号12、Genbank登録番号YP_401690.1、GI:82503246；2型EBVに対する遺伝子：配列番号13；タンパク質産物：配列番号14、Genbank登録番号YP_001129485.1、GI:139424519）、BALF3遺伝子（1型EBVに対する遺伝子：配列番号15；タンパク質産物：配列番号16、Genbank登録番号YP_401715.1、GI:82503271；2型EBVに対する遺伝子：配列番号17；タンパク質産物：配列番号18、Genbank登録番号YP_001129509.1、GI:139424543）、BFRF1A遺伝子（1型EBVに対する遺伝子：配列番号19；タンパク質産物：配列番号20、Genbank登録番号YP_401728.1、GI:82503279；2型EBVに対する遺伝子：配列番号21；タンパク質産物：配列番号22、Genbank登録番号YP_001129445.1、GI:139424480）、およびBFRF1遺伝子（1型EBVに対する遺伝子：配列番号23；タンパク質産物：配列番号24、Genbank登録番号YP_401649.1、GI:82503207；2型EBVに対する遺伝子：配列番号25；タンパク質産物：配列番号26、Genbank登録番号YP_001129446、GI:139424481）からなる群より選択される少なくとも1つの発現可能な遺伝子を欠損したEBVゲノムを含む。前記遺伝子の産物は、EBVのプロカプシドへのウイルスDNAのパッケージングに必須の活性を有するタンパク質であり、つまり、これらの機能の除去は、本発明のEB-VLPの生成をもたらす。「発現可能な遺伝子を欠損する」との用語は、機能的タンパク質産物が発現できないように、上記で定義した群より選択される少なくとも1つの遺伝子が改変されているEBVゲノムに関する。これは、当業者に公知の種々の方法で達成することができ、下記の実施例に詳述されている。
好ましくは、上記の遺伝子の少なくとも1つが、該遺伝子から生成されるタンパク質の切断、破壊または突然変異をもたらす少なくとも1個のヌクレオチドの欠失、付加および/または置換を導入することにより、改変される。そのような改変は、終止コドンの生成を引き起こす遺伝子中の点突然変異ならびにオープンリーディングフレームのシフトを引き起こす改変を包含する。作製されるそのようなポリペプチドは、異常に短いかまたは異常に長く、生物学的機能を有しない。生物学的機能を有しないかまたは低下した生物学的機能を有するポリペプチドをもたらす、遺伝子中の点突然変異もまた包含される。好ましくはまた、好ましくは遺伝子の発現を支配する転写制御配列（すなわち、プロモーター）の不活性化をもたらす少なくとも1個のヌクレオチドの欠失、付加および/または置換を導入することもできる。さらに、好ましくは、転写されたRNAでRNA分解の増大を引き起こす配列を導入することができる。より好ましくは、上記の遺伝子の少なくとも1つに対する遺伝子座全体を、欠失させるかまたは非機能的もしくは発現可能ではない核酸で置き換える。最も好ましくは、オープンリーディングフレームを、下記の図面および実施例で示す通りに、カナマイシン耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子で置換する。
上記の遺伝子の1つの所与の改変が発現可能ではない遺伝子をもたらすか否かの試験は、当業者に公知である通り、導入される改変の性質に依存するであろう。例えば、遺伝子のコード配列の大部分を欠失させた場合、EBVタンパク質の電気泳動による分離とそれに続く該遺伝子のタンパク質産物に対して特異的な抗体を用いる免疫ブロッティングが適しているであろう。なぜなら、欠失を含む遺伝子の産物が、より低い見かけの分子量を有するからである。一方で、上記の遺伝子のうちの1つが完全に欠失される場合、得られるEBVゲノムの制限解析が十分であり得る。それぞれの場合で、上記の遺伝子のうちの1つの機能の欠損は、下記で本明細書中に詳述される方法に従って、本発明のEB-VLP、すなわちEBV DNAを実質的に含まないEB-VLPを検出することにより、アッセイすることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、好適な宿主細胞での本発明のEB-VLPの生成に向かわせる生物学的活性を有するEBVゲノムを含むポリヌクレオチドである。そのような活性を測定するための好適なアッセイは、添付の実施例に記載される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号27（BFLF1ノックアウトを含む（すなわち、発現可能なBFLF1遺伝子を欠損している）1型EBVゲノム）または配列番号28（BBRF1ノックアウトを含む（すなわち、発現可能なBBRF1遺伝子を欠損している）1型EBVゲノム）に示される核酸配列のうちの1つを含む。
さらに、本発明に従って用いる場合の「ポリヌクレオチド」との用語は、上記の具体的なポリヌクレオチドの変異体をさらに包含する。該変異体は、本発明のポリヌクレオチドの系統変異体またはクローン変異体を表す場合がある。ポリヌクレオチド変異体は、好ましくは、該配列が少なくとも1つのヌクレオチド置換、付加および/または欠失により上記の具体的な核酸配列から誘導することができ、それにより、変異型核酸配列は上記で特定した活性を有するEBVゲノムを未だコードすることを特徴とする核酸配列を含む。上記の核酸配列のいずれかの断片を含むポリヌクレオチドもまた、本発明のポリヌクレオチドとして包含される。断片は、上記で特定した活性を未だ有するEBVゲノムをコードするものである。
本発明のポリヌクレオチドは、上述の核酸配列から本質的になるか、または上述の核酸配列を含むかのいずれかである。つまり、それらは、その上にさらなる核酸配列を含むことができる。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、融合タンパク質の1つのパートナーが上で列挙した核酸配列によりコードされるポリペプチドである融合タンパク質をコードすることができる。そのような融合タンパク質は、発現をモニタリングするためのポリペプチド（例えば、緑色、黄色、青色もしくは赤色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼなど）または検出可能なマーカーとしてもしくは精製目的のための補助的手段として機能し得るいわゆる「タグ」を、追加の部分として含むことができる。種々の目的のためのタグが当技術分野で周知であり、FLAGタグ、6-ヒスチジンタグ、MYCタグなどを含む。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、上で詳述した改変に加えて、変更を含む。特に、EBVの潜伏感染遺伝子産物の一部は、細胞に対する形質転換作用を有することが知られているか、または疑われているので（EBNA2、LMP1、EBNA3A、-Bおよび-C（Hammerschmidt W, Sudgen B (1989) Genetic analysis of immortalizing functions of Epstein-Barr virus in human B-lymphocytes. Nature 340: 393-397；Cohen JI, et al. (1989) Epstein-Barr virus nuclear protein 2 is a key determinant of lymphocyte transformation. PNAS 86:9558-9562；Kaye KM, et al. (1993) Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 is essential for B-lymphocyte growth transformation. PNAS, 90, 9150-9154；Tomkinson B, et al. (1993) Epstein-Barr virus nuclear proteins EBNA3A and EBNA3C are essential for B-lymphocyte growth transformation. J. Virol. 62:6762-6771））、本発明のポリヌクレオチドからこれらの形質転換タンパク質をコードする遺伝子を除去することが望ましい。また、BZLF1遺伝子産物は、その溶解サイクル（すなわち、生活環のウイルス生成部分）へのEBVの進行を媒介する主要な活性化タンパク質であることが知られている。つまり、例えば、ワクチン接種中に、被験体に適用された残余のゲノムからのウイルス産生を回避するために、本発明のポリヌクレオチドからこの機能的部分を除去することが好ましい。該遺伝子を機能的に欠失させる方法は、上で詳述したのと同様である。より好ましくは、前記遺伝子のうち、少なくとも1つ、最も好ましくはすべてを完全に欠失させる。
本明細書中で用いる場合、「好適な宿主細胞」との用語は、EBVの溶解性複製を促進し、EB-VLPの産生をもたらすことができる細胞に関する。好ましくは、該細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、さらにより好ましくはヒト細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は293細胞である。宿主細胞がEBVの溶解性複製に必須のある種の因子を提供することができることも、本発明において想定される。例えば、ウイルスが溶解サイクルに入るのを不可能にする、機能的BZLF1遺伝子が欠損したEBVゲノムを用いる場合、細胞に該BZLF1遺伝子についての発現構築物をトランスフェクトした後で、宿主細胞によりそのような機能が提供される場合がある。
前記改変を生成する方法は当業者に周知であり、相同組み換えに基づく遺伝子標的化法、PCRベースの突然変異誘発、ENUまたはEMSなどの薬剤を用いる化学的突然変異誘発、放射線照射による突然変異誘発その他を含む。特に、下記に添付した実施例に記載された通りの相同組み換えにより、遺伝子座全体を欠失させることができる。
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。好ましくは、ベクターは、細胞中でEBVゲノムを安定的に維持できるプラスミドまたはウイルスベクターである。より好ましくは、ベクターは、大腸菌（E. coli）Fプラスミドに由来し；これらのベクターはF因子ベースのレプリコンまたは細菌人工染色体（BAC）として当業者に公知であり、これらは、大腸菌細菌細胞中で完全なEBVゲノムを安定的に維持することを可能にする。さらに、該用語はまた、ゲノムDNAへの標的化構築物のランダムまたは部位特異的組み込みを可能にする標的化構築物にも関する。そのような標的化構築物は、好ましくは、相同組み換えまたは非相同性挿入のいずれかのために十分な長さのDNAを含む。
本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、宿主での増殖および/または選択のための選択マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野で周知の様々な技術によって、宿主細胞に組み込むことができる。宿主細胞に導入する場合、ベクターは、細胞質に存在するか、またはゲノムに組み込まれることができる。後者の場合、ベクターは、相同組み換えまたは非相同性挿入を可能にする核酸配列をさらに含む場合があることが理解されるべきである。ベクターは、慣用の形質転換またはトランスフェクション技術を介して、原核細胞または真核細胞に導入することができる。ベクターおよび形質転換またはトランスフェクション技術は、当技術分野で周知であり、さらなる面倒なしに当業者により適用することができる。例えば、BACプラスミドベクターを、エレクトロポレーションにより大腸菌細胞に、または荷電脂質を含む複合体で哺乳動物細胞に導入することができる。
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。
本明細書中で言及する場合、宿主細胞とは、真核細胞ならびに原核細胞を包含する。特に、本発明に従って言及される原核細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの増殖に用いることができる細菌細胞であり得る。この目的のために好ましい細菌は、大腸菌細菌、より好ましくはDH10B株である。真核細胞は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターに含まれるEBVゲノムの遺伝子を発現することが可能な細胞である。EBV生活環の潜伏感染サイクルの遺伝子を発現する好ましい細胞は、例えば、Raji細胞である。より好ましくは、該細胞は、エプスタイン・バーウイルス様粒子（EBV-VLP）の構築（アセンブル）が可能であり、すなわち、上記の好適な宿主細胞である。
別の好ましい実施形態では、本発明は、EBV DNAを実質的に含まないEB-VLPの製造方法に関し、該方法は、(a)本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む好適な宿主細胞を培養するステップ、および(b)該細胞からEBV DNAを実質的に含まないEB-VLPを取得するステップを含む。
本発明の方法は、好ましくは、in vitro法である。さらに、上で明示したものに加えて、ステップを含むことができる。例えば、さらなるステップは、好適な宿主細胞の前処理またはEB-VLPを含む回収された上清の後処理に関する場合がある。
「培養する（ステップ）」との用語は、当業者に公知である。特に、該用語は、細胞培養培地中で、生物の外部で生育する細胞に関する。該用語はまた、生物の外部の培養で細胞を生育するプロセスにも関する。好適な細胞培養培地は、当業者に公知であり、市販されている。それらは、栄養素、塩、増殖因子、抗生物質、血清（例えば、ウシ胎仔血清）およびpH指示剤（例えば、フェノールレッド）を含むことができる。好ましくは、該方法は、好適な宿主細胞中で、上で本明細書中に記載した人工ポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子を発現させて、EB-VLPへの該人工ポリペプチドの組み込みを引き起こすステップをさらに含む。
「取得する（ステップ）」との用語は、当業者に公知の単離および/または精製ステップを意味する。好ましくは、該単離および/または精製後に、EB-VLPは、少なくとも80％、好ましくは80％〜90％、より好ましくは90％〜97％、最も好ましくは97％超の純度から、いかなる混入物質も含まない完全に純粋な形態までを示す。「精製」との用語は、クロマトグラフィー装置などの手段および方法を包含する。好ましく用いられる方法としては、密度勾配遠心、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ならびに沈殿およびカラムが挙げられる。好ましくは、EB-VLPを取得するステップは、下で本明細書中の実施例に記載される抗gp350抗体を介して、磁気ビーズにそれらを結合させることによる、EB-VLPの精製を含む。好ましくは、EB-VLPは、好適な宿主細胞の上清から得られ、すなわち、EB-VLPは本発明の方法の間に培地中に放出される。
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の方法のステップおよびEB-VLPをワクチンとして製剤化するさらなるステップを含む、ワクチンの製造方法に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の方法により取得可能なEBV DNAを実質的に含まないEB-VLPを含有するワクチンに関する。
本明細書中で用いる場合、「ワクチン」との用語は、好ましくは、動物、好ましくはヒトに投与した場合に、EBVに対する免疫応答を惹起する、本発明に係るDNAを実質的に含まないEB-VLPを含む組成物に関する。つまり、そのようなワクチンの投与は、免疫系を刺激し、EBVの感染に対する免疫を確立または改善する。好ましくは、本発明のワクチンは、EBVの感染に対する免疫を確立または改善することを可能にする。好ましくは、免疫化は、構造的EBV抗原を特異的に認識するT細胞および/またはB細胞の活性化および増加を引き起こす。より好ましくは、免疫化は、EBVによる体細胞の感染を防止する抗体の産生を引き起こす。
本発明のワクチンは、好ましくは、下で詳細に記載される1つ以上の製薬上許容される担体をさらに含む。本発明のワクチンは、製薬上許容される塩として製剤化することができる。ワクチンは、好ましくは、局所的または全身的に投与される。薬物投与のために慣用的に用いられる好適な投与経路は、経口投与、静脈内投与、または非経口投与、ならびに吸入である。しかしながら、化合物の性質および作用様式に応じて、ワクチンは、さらに他の経路により投与することができる。さらに、化合物は、共通のワクチンで、または別個のワクチンとしてのいずれかで、他のワクチンと組み合わせて投与することができ、ここで、該別個のワクチンは、複数のパーツのキットの形態で提供することができる。
化合物は、好ましくは、慣用の手順に従って標準的な製薬用担体とEB-VLPとを組み合わせることにより調製される慣用の投与剤形で投与される。これらの手順は、適宜、所望の調製物への成分の混合、顆粒化および圧縮または溶解を含むことができる。製薬上許容される担体または希釈剤の形状および特性は、それが組み合わされる予定の活性成分の量、投与経路および他の周知の変数に影響されることが理解されるであろう。
治療上有効な用量とは、本明細書に従う免疫化を誘導する、本発明のワクチンで用いられるべき化合物の量を意味する。投与レジメンは、好ましくは上記の方法のいずれか1つに従って、付き添いの医師および他の臨床的要因により決定されるであろう。医療の分野で周知である通り、いずれか1人の患者に対する投与量は、患者の年齢、投与予定の特定の化合物、性別、投与時間および経路、全身健康状態、および同時に投与される他の薬物をはじめとする数種類の因子に依存し得る。免疫化は、定期的な評価によりモニタリングすることができる。典型的な用量は、例えば、1〜1000μgの範囲であり得るが、しかしながら、特に上述の因子を考慮して、この例示的範囲未満またはこの例示的範囲を超える用量が想定される。
本明細書中で言及されるワクチンおよび製剤は、本明細書中に列挙される疾患または状態を治療または改善または予防するために、少なくとも1回投与される。しかしながら、該ワクチンは2回以上、例えば最大4回投与することができる。
特異的ワクチンは、製薬分野で周知の方法で調製され、製薬上許容される担体もしくは希釈剤と混合するかまたは他の方法で関連づけられて、少なくともEB-VLPを含む。それらの特異的ワクチンを作製するために、EB-VLPを、通常、担体もしくは希釈剤と混合するか、あるいはカプセル、サシェ、カシェ、紙または他の好適な容器もしくはビヒクル中に封入またはカプセル化するであろう。得られる製剤は、投与方法に適合しているべきであり、すなわち、錠剤、カプセル剤、坐剤、溶剤、懸濁剤などの形態である。投与量の推奨は、考慮される受容者に応じた用量調整を予測するために、処方者または使用者用の取扱説明書に示されるであろう。
さらに好ましい実施形態では、該組成物は、少なくとも1つの製薬上許容される担体および/または少なくとも1つの賦形剤をさらに含む。担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味およびその受容者に対して有害でないという意味で、許容可能でなければならないことが理解されるべきである。用いられる製薬用担体は、例えば、固体、ゲルまたは液体のいずれかであり得る。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、リン酸緩衝生理食塩液、シロップ、油（ラッカセイ油およびオリーブ油など）、水、エマルジョン、種々のタイプの湿潤化剤、滅菌溶液などである。
希釈剤は、上記組み合わせの生物学的活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩液、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。また、ワクチンまたは製剤はまた、他の担体、賦形剤、または無毒で非治療的な非免疫原性安定化剤なども含有することができる。無毒で非治療的な非免疫原性安定化剤は、当技術分野で周知であり、単独もしくはワックスと併せたモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどである。好適な担体は、上で言及したものおよび当技術分野で周知のその他のものを含み、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。
組成物の好ましいさらなる構成成分は、賦形剤である。賦形剤は、単独で宿主に投与する場合に免疫応答を惹起しないが、免疫原性ポリペプチドと一緒に投与する場合に宿主の免疫応答をさらに増強し得る化合物である。賦形剤は、大きな表面積で免疫原性ポリペプチドの濃縮を促進する界面活性剤として作用し得るか、または免疫刺激性を有し得ることが、当技術分野で公知である。
別の好ましい実施形態では、本発明は、疾患の治療および/または予防のためのワクチンとしての使用のための、本発明の方法により取得可能なEBV DNAを実質的に含まないエプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）を含む組成物に関する。
「治療のためのワクチンとしての使用」との用語は、上で本明細書中に特定した通りの治療用ワクチンとしての本発明のワクチンの使用に関する。同様に、「予防のためのワクチンとしての使用」との用語は、予防用ワクチンとしての使用に関する。
「被験体」との用語は、該生物に対して外来性の分子に対する免疫応答を生じる能力を有する後生動物に関する。好ましくは、被験体は、動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
本明細書中で用いる場合、「EBV関連疾患」との用語は、EBVによる被験体の感染により引き起こされるすべての障害に関連する。好ましい実施形態では、EBV関連疾患は、伝染性単核球症、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、上咽頭癌、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、胃癌、または移植後リンパ増殖性障害である。これらの疾患を特徴付ける症状は、当技術分野で周知であり、標準的な医学の教科書に記載されている。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）エプスタイン・バーウイルス（EBV）DNAを実質的に含まない、エプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）。
（２）少なくとも1つの人工ポリペプチドをさらに含む、（１）に記載のEB-VLP。
（３）少なくとも1つの非必須EBVポリペプチドを欠損している、（１）または（２）に記載のEB-VLP。
（４）医薬としての使用のための、（１）〜（３）のいずれか1に記載のEB-VLP粒子。
（５）ワクチン接種のための、（１）〜（３）のいずれか1に記載のEB-VLP粒子。
（６）(a) BFLF1遺伝子、BBRF1遺伝子、BGRF1遺伝子、BDRF1遺伝子、BALF3遺伝子、BFRF1A遺伝子、およびBFRF1遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの発現可能な遺伝子を欠損し、かつ(b) 好適な宿主細胞中で（１）〜（６）のいずれか1に記載のEB-VLPを産生することが可能である、エプスタイン・バーウイルス（EBV）ゲノムを含むポリヌクレオチド。
（７）少なくとも1つの発現可能な潜伏感染遺伝子をさらに欠損している、（６）に記載のポリヌクレオチド。
（８）（６）または（７）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（９）（６）もしくは（７）に記載のポリヌクレオチドまたは（８）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（１０）EBV DNAを実質的に含まないEB-VLPの製造方法であって、以下のステップ：(a) （６）もしくは（７）に記載のポリヌクレオチドまたは（８）に記載のベクターを含む好適な宿主細胞を培養するステップ、および(b) 該細胞からEBV DNAを実質的に含まないEB-VLPを取得するステップを含む、上記方法。
（１１）前記EB-VLPが、前記培養細胞の上清から得られる、（１０）に記載の方法。
（１２）ステップ(a)の間に、前記宿主細胞中で、人工ポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子を発現させるステップをさらに含む、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）（１０)〜(１２)のいずれか1に記載の方法のステップおよびEB-VLPをワクチンとして製剤化するさらなるステップを含む、ワクチンの製造方法。
（１４）（１０）〜（１２）のいずれか1に記載の方法により取得可能な、EBV DNAを実質的に含まないEB-VLPを含有するワクチン。
（１５）疾患の治療および/または予防のためのワクチンとしての使用のための、（１０）〜（１２）のいずれか1に記載の方法により取得可能な、EBV DNAを実質的に含まないエプスタイン・バーウイルス様粒子（EB-VLP）を含む組成物。
本明細書を通して引用されるすべての参照文献は、上記で言及されたそれらの特定の開示内容に関して、ならびにその全体で、参照により本明細書中に組み入れられる。
EBVΔBFLF1およびΔBBRF1組み換えウイルスの構築を示す図である。左パネルは、突然変異の導入前および後のBFLF1またはBBF1遺伝子を含むEBVゲノム領域の模式的制限地図を示す。BamHIおよびHindIII制限部位の位置が示される。BFLF1またはBBRF1オープンリーディングフレームのうちの大部分は、カナマイシン耐性遺伝子で置換された。BFLF1欠失の場合、これは、7.4kb BamHI断片から7.5kb BamHI断片への交換または29.3kb HindIII断片から9.1kbおよび20.2kb HindIII断片の組み合わせへの置換をもたらした。BBRF1遺伝子の遺伝子座の9.7kb BamHI断片は10.3kbのBamHI断片により置換され、25.9kb HindIII断片はそれぞれ23kbおよび3.6kbのサイズを有する2つの断片へと置換された。右パネルは、野生型およびΔBFLF1またはΔBBRF1突然変異型ウイルスの制限断片解析を示す。ウイルスDNAは、大腸菌および産生型（producer）293細胞株から単離し、2種類の異なる酵素で消化した。対応する遺伝子の欠失により改変された制限断片を示す。 誘導した産生細胞からの上清中のVLPおよびビリオンの免疫染色を示す図である。野生型ウイルスまたはBFLF1、BBRF1もしくは末端反復を欠損した突然変異体のいずれかを含有する産生細胞株からの上清を、EBV陰性B細胞株と4℃で1時間混合した。B細胞に結合したウイルスを、gp350特異的抗体、およびそれに続くCy3連結二次抗マウス抗体を用いて免疫染色した。 ΔBFLF1、ΔBBRF1、ΔTRまたはEBV野生型ゲノムを含有する293細胞の電子顕微鏡写真を示す図である。ウイルス溶解性複製の誘導後のΔBFLF1、ΔBBRF1、ΔTRまたはEBV野生型ゲノムを含有する293細胞の電子顕微鏡写真、ΔBFLF1またはΔBBRF1突然変異体からのペレット化上清中のVLPを示す電子顕微鏡写真。検査により、ΔBFLF1、ΔBBRF1およびΔTRウイルスからの調製物中の多量のAカプシドおよびBカプシドが明らかになった。感染性のDNA充填成熟Cカプシドは、野生型ウイルスを含有する細胞で観察されたが、突然変異体を含有する細胞では観察されなかった。挿入バー、200nm。 ΔBFLF1、ΔBBRF1、ΔTRまたは野生型ウイルスを用いたRaji B細胞の感染を表す図である。Raji B細胞株に感染する突然変異型および野生型ウイルスの能力を示す。観察された力価は、上清1mL当たりのEBV感染Raji細胞の数、すなわち緑色Raji単位として示される。 免疫精製したVLPを用いたウエスタンブロット分析を表す図である。gp350は、成熟粒子のウイルスエンベロープ中に存在するウイルス糖タンパク質である。本発明者らは、感染性上清からEBVビリオンまたはVLPを精製するために、磁性Dynabeadsに連結した、gp350に特異的なモノクローナル抗体を用いた。誘導された野生型または種々の突然変異型産生細胞株からの上清を、室温で1時間、連結したビーズと共にインキュベートした。結合ウイルス粒子を磁石を用いて回収し、RPMIで3回洗浄し、ウイルスタンパク質またはウイルスDNAの検出のために用いた。EBVテグメントタンパク質であるBNRF1（140kDa）に特異的な抗体を用いて、免疫精製したVLP/ビリオンに対してウエスタンブロット分析を行なった。BNRF1は、野生型ビリオンで検出されたが、ΔBFLF1、ΔBBRF1またはΔTR突然変異体を含有する誘導された産生細胞株からの上清でも検出された。gp350を欠損した突然変異体ウイルス（Δgp350）を、精製実験での陰性対照として用いた。 免疫精製したVLPを用いた定量的PCR（qPCR）分析を表す図である。gp350特異的抗体を用いて精製したVLPまたはビリオンを、ウイルスポリメラーゼ遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いたqPCRを用いて、ウイルスDNAの存在について評価した。野生型ウイルスを陽性対照として用いた。ウイルス力価は、上清1mL当たりのゲノム当量として与えられる。 ΔBFLF1およびΔBBRF1 VLPを用いてパルス処理したB細胞が、EBV特異的T細胞により認識されることを示す図である。示したウイルス上清の1mL中に存在するウイルス粒子を、磁性ビーズと連結したgp350抗体を用いて精製し、新鮮な培地中に再懸濁した。LCL細胞を、示した量のBNRF1ペプチドまたは示した体積の精製ウイルス粒子を用いて前処理した。パルス処理したLCLをBNRF1 CD4+ T細胞と共にインキュベートし、GM-CSFの産生をELISAにより測定した。 VLPが外来性タンパク質を取り込むことができることを示す図である。6個の連続するヒスチジンとインフレームで融合させた単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質であるgCの細胞質内ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするプラスミド（gC-6×His）を、EBV溶解性複製の開始時にΔBFLF1産生細胞株にトランスフェクションした。産生されたウイルス粒子を、Dynabeadsと連結したgp350抗体を用いて精製し、ウエスタンブロットで分析した。gC-6×Hisを用いてトランスフェクトした293/ΔBFLF1細胞から取得したウイルスのみが、このタンパク質を取り込んでいた。 LP/VLPエンベロープへのgC融合タンパク質の挿入および粒子の免疫効率の評価を表す図である。(A)提案されるHSV1-gC-EBV融合タンパク質構築物の概略図（SP、gCシグナルペプチド；His、Hisタグ；エピトープ、EBV T細胞エピトープ；TMD、gC膜貫通ドメイン；およびCT、gC細胞質テイル）。(B) LP/VLPでのHisタグ付加gC融合タンパク質の発現を示すウエスタンブロット。LP/VLPは、gC融合タンパク質をコードするプラスミドの存在下で誘導されたEBV突然変異型産生細胞株から生成された。His特異的抗体を用いた。(C) gC-His-5C11融合タンパク質発現プラスミドまたはpRK5空プラスミドの存在下での、溶解的に誘導された突然変異型産生細胞からの上清とのLCLのインキュベーション後の、EBNA3C 5H11エピトープ特異的T細胞活性化。ELISAを用いて、IFN-γ分泌を測定した。
以下の実施例は、単に本発明を例示するものである。これらは、いかようにも、本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではない。
実施例1：EBVΔBFLF1およびΔBBRF1組み換えウイルスの構築
EBVΔBFLF1およびΔBBRF1ウイルスを、大腸菌でのRecA媒介相同組み換えを用いて、EBV B95.8-BAC組み換えプラスミド（Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jul 7;95(14):8245-50. Propagation and recovery of intact, infectious Epstein-Barr virus from prokaryotic to human cells. Delecluse HJ, Hilsendegen T, Pich D, Zeidler R, Hammerschmidt W. (EBV B95.8株は、BFLF1についての#57131-58568およびBBRF1についての#114204-116042を統合する（登録番号V01555）)に存在する対応するオープンリーディングフレームの大部分から、frt部位と隣接するカナマイシン/ネオマイシンカセット（ΔBFLF1での#57131-58673およびΔBBRF1での114501-116042を統合する）への交換により取得した。BFLF1またはBBRF1を正しく除去したウイルスゲノムを、カナマイシンを用いて選択した。候補クローンをHindIIIおよびBamHI制限酵素を用いた制限解析と組み合わせたプラスミドミニプレップにより分析し、それらの構造を確認した（図1）。配列決定により、標的のオープンリーディングフレームが欠失していることおよび組み換えが予想通りに行なわれたことが確認された。
実施例2：293/ΔBFLF1および293/ΔBBRF1細胞の作製
続いて、EBVΔBFLF1およびΔBBRF1 DNAをそれぞれ293細胞にトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性について選択した；EBV-BAC組み換え体はハイグロマイシン耐性遺伝子を担持し、したがって、組み換えDNAを用いて安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を可能にする。293ハイグロマイシン耐性クローンに存在するEBVΔBFLF1またはΔBBRF1ゲノムを精製し、大腸菌細胞に移し直した。これらの細菌細胞から、EBVΔBFLF1またはΔBBRF1プラスミドを調製して、それらの正体および完全性を確認した。それぞれのクローン（それぞれ、293/ΔBFLF1または293/ΔBBRF1と称される）のうちの1つを、さらなる実験のために選択した。BZLF1トランスアクチベータをコードする発現プラスミドの一過性トランスフェクションが、溶解性複製の開始、したがって感染性ウイルスまたは非感染性VLPの生成を可能にする。対照は、野生型ウイルスを含有する293細胞を含んだ。トランスフェクション3日後に、293/ΔBFLF1および293/ΔBBRF1細胞からのウイルス上清を、EBV陰性Elijah B細胞株からの細胞と共にインキュベートした（図2）。EBVビリオンはB細胞と結合するので、B細胞の表面で結合するウイルスは、ウイルスエンベロープの構成成分であるgp350に対する抗体を用いた免疫染色により明らかにすることができる。この実験は、誘導された293/ΔBFLF1または293/ΔBBRF1細胞のいずれかからの上清が、B細胞に結合するgp350陽性ウイルス構造体を含有することを確認し、VLPまたは成熟ビリオンのいずれかを表すことができた。野生型ウイルスを含有する293クローンを用いて、同様の結果が得られた。末端反復（パッケージングシグナルとして用いられるウイルス配列）（Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 27;96(9):5188-93. A first-generation packaging cell line for Epstein-Barr virus-derived vectors. Delecluse HJ, Pich D, Hilsendegen T, Baum C, Hammerschmidt W.)を欠損する組み換えウイルスを含有する293細胞（293/ΔTR）もまた調査した。本発明者らは以前に、293/ΔTRがVLP（第一世代VLP）を生成することを示し、したがって、この細胞株をこれらのウイルス構造体の検出のための陽性対照として用いた（J Virol. 2005 Jun;79(12):7641-7. Defective infectious particles and rare packaged genomes produced by cells carrying terminal-repeat-negative epstein-barr virus. Feederle R, Shannon-Lowe C, Baldwin G, Delecluse HJ.）。本発明者らは、誘導された293/ΔTRからの上清が、Raji細胞表面に結合するウイルス構造体を含有することを確認できた。
実施例3：ΔBFLF1、ΔBBRF1、ΔTRまたはEBV野生型ゲノムを含有する293細胞の電子顕微鏡分析
誘導された293/ΔBFLF1および293/ΔBBRF1からの上清中に存在するウイルス粒子の構造についてのさらなる情報は、電子顕微鏡を用いたBZLF1誘導突然変異型産生細胞およびそのペレット化上清の両方の直接的観察によりもたらされた（図3）。誘導された293/ΔBFLF1または293/ΔBBRF1細胞のそれぞれからの電子顕微鏡写真は、それらがウイルスDNAを欠損した未成熟EBVビリオンを含有することを示す。同様に、ペレット化した293/ΔBFLF1および293/ΔBBRF1上清は、ウイルスDNAを欠損した成熟EBVビリオンを含有する、すなわち、それらはVLPを表す。対照的に、野生型EBVゲノムを含有する293細胞は、種々の成熟ステージにあるEBV粒子を示し、そのうちの一部は、パッケージングされたEBV DNAに対応する電子密度の高いコアを含有する。上清から単離された野生型EBVビリオンはまた、ウイルスDNAも含有することが見出された。293/ΔTRおよびそれらの上清の分析により、これらの細胞が、予想通り、VLPを豊富に生成することが確認された。
実施例4：ΔBFLF1およびΔBBRF1ウイルスを用いたRaji B細胞の感染
誘導された293/ΔBFLF1および293/ΔBBRF1細胞により生成されるウイルス構造体の感染特性を特徴付けるためのさらなる試みでは、本発明者らは、未希釈上清を含む、96ウェルクラスタープレート中の細胞株からの上清の漸増する5倍希釈と共に、Raji細胞をインキュベートした。感染3日後に、蛍光顕微鏡を用いて、GFP陽性Raji細胞を計数した。Raji B細胞株は、EBV感染に対して非常に感受性が高く、組み換えEBV DNAを用いた感染に際して緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する。実際には、GFP遺伝子が組み換えEBV DNAにクローニングされ、真核細胞の感染時に発現されるようになる。誘導された293/ΔBFLF1および293/ΔBBRF1からの上清1mLと共にRaji細胞をインキュベーションした後、Raji細胞の感染は検出できなかった（図4）。対照的に、同じ体積の誘導された野生型293/EBV細胞からの上清は、十分な感染性ウイルスを含有し、約2×104個のGFP陽性Raji細胞をもたらした。誘導された293/ΔTR細胞からの上清は、野生型ウイルスと比較して2桁低い感染度であったが、にもかかわらず、上清1mL当たり120個のEBV陽性細胞をもたらし、したがって1mL当たり120個の感染性粒子を含有していた。
実施例5：EBVΔBFLF1およびΔBBRF1 VLPでのウイルスタンパク質の検出およびウイルスDNAの定量化
gp350は、成熟EBV粒子の主要な構成成分である。誘導された293/ΔBFLF1、293/ΔBBRF1、293/ΔTR、293/WTからの上清中に存在するウイルス構造体を、磁性Dynaビーズに連結した、gp350に特異的な抗体と共にインキュベートした。続いて、ウイルス構造体を磁石を用いて回収し、同じサンプルをウエスタンブロットおよびqPCR分析の両方に供した。
ウエスタンブロット分析（図5）のために、1mLの上清からの精製ウイルス構造体をPBSに再懸濁し、95℃で5分間、Laemmliバッファー中で変性させた。全サンプルを10％SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離し、Hybond ECLメンブレン（Amersham）に電気ブロットした。PBS中5％ミルク粉末中での30分間のプレインキュベーションの後、ブロットを、BNRF1に対するウサギポリクローナル血清（Feederle et al. (2006), Epstein-Barr virus BNRF1 protein allows efficient transfer from the endosomal compartment to the nucleus of primary B lymphocytes, J Virol ;80(19):9435-43）と共に室温で1時間インキュベートした。BNRF1は、EBVウイルス構造体中に高濃度で存在するテグメントタンパク質である。PBS中0.1％Tweenでの数回の洗浄後、ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼと連結したプロテインAと共に1時間インキュベートした。抗体結合をECL検出試薬（Perkin Elmer）を用いて明らかにした。本実験により、3種類すべての被験上清中のBNRF1陽性ウイルス構造体の存在が確認された（図5）。
ウイルスDNAの存在を評価するため（図6）、PBSに再懸濁した同量のgp350精製ウイルス構造体を、最初にDNaseI（5U/50μL上清）を用いて37℃で1時間消化し、混入した遊離のウイルスDNAを一切除去した。DNaseI熱不活性化（70℃にて10分間）の後、精製ウイルス構造体を溶解バッファー（水中0.1mg/mLプロテイナーゼK）と混合し（1：1 vol/vol）、50℃で60分間インキュベートし、その後、酵素を熱不活性化した（75℃にて20分間）。このステップは、ウイルス粒子にパッケージングされたあらゆるウイルスDNAを放出させる。水希釈サンプル（1：10）を、BALF5 DNAポリメラーゼ（pol）遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いたqPCRに供した。増幅反応は、12.5μLのTaqman Universal master mix（Applied Biosystems）、2.5μLのフォワードおよびリバースpolプライマー（2μM）、1μLの5μM FAM標識polプローブ、1.5μLの水、および5μLの精製・再懸濁ウイルス粒子を含有する25μL体積で実施した。AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼの活性化（95℃にて10分間）に続いて、反応混合物を40サイクルにわたって増幅し（95℃にて15秒間、60℃にて60秒間）、蛍光シグナルをABI 7300 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いて検出した。プライマーおよびプローブ配列は、以下の通りであった：リバースpolプライマー 5’-AGTCCTTCTTGGCTAGTCTGTTGAC-3’（配列番号29）、フォワードpolプライマー 5’-CTTTGGCGCGGATCCTC-3’（配列番号30）、EBV polプローブ 5’-FAM-CATCAAGAAGCTGCTGGCGGCC-TAMRA-3’（配列番号31）。DNA含有量を、標準曲線についての参照としてNamalwa DNA（1細胞当たり2個のEBVゲノムコピーを含有するヒトバーキットリンパ腫細胞株）の連続希釈を用いて算出した。本アッセイの結果を図6に示す。本発明者らは、1mLの野生型上清からのgp350精製ウイルス構造体が、およそ1×106個のウイルスゲノムを含有することを見出した。培地および水対照では、qPCR法は、1×103〜1×104個のゲノムの範囲でのシグナルをもたらし、したがって、本発明者らは、1×104個ゲノム/mLにベースラインを引く。野生型EBVとはまったく対照的に、誘導された293/ΔBFLF1および293/ΔBBRF1からの上清は、ベースラインEBV DNAを超える検出可能なものを何ら含有しなかった。293/ΔTR上清は、上清1mL当たり1×104個を若干超えるウイルスゲノムを含有する1mLの上清として、中間的な結果をもたらした。要するに、本発明者らは、誘導された293/ΔBFLF1および293/ΔBBRF1からのgp350精製ウイルス構造体は、BNRF1タンパク質を担持するウイルス構造体を含有するが、いかなるウイルスDNAも含有せず、すなわち真正（genuine）のVLPを表すと結論づける。
実施例6：ΔBFLF1およびΔBBRF1 VLPを用いてパルス処理したB細胞は、EBV特異的T細胞により認識される
本発明者らは、T細胞特異的応答を誘導するVLPの能力を評価した（図7）。この目的で、本発明者らは、抗原提示細胞として機能するLCL細胞と共に、gp350抗体を用いて精製された示したウイルス上清1mL中に存在するウイルス粒子またはVLPをインキュベートした。並行して、LCLを、示した量のBNRF1ペプチドを用いて前処理し、これらを陽性対照として用いた。パルス処理されたLCLを、次に、BNRF1特異的CD4+ T細胞と共にインキュベートした。BNRF1特異的CD4+ T細胞によるLCLの表面に存在する抗原の特異的認識は、上清中でのIFN-γの産生および放出を惹起し、これはELISAにより評価することができる。本発明者らは、BNRF1特異的T細胞が、野生型EBVビリオンとΔBFLF1およびΔBBRF1 VLPとを同等に良好に認識することを見出した。
実施例7：VLPは外来性タンパク質を取り込むことができる
ここで、本発明者らは、単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質gCの細胞質内ドメインおよび膜貫通ドメインを用いて、VLPに外来性抗原を導入することができることを示す。例えば、これらのgC由来のサブドメインを、6個の連続するヒスチジンとインフレームで融合させ（gC-6×His）、EBV溶解性複製の開始時に、ΔBFLF1産生細胞株に、この融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトした。生成されたウイルス粒子を、Dynabeadsと連結させたgp350抗体を用いて精製した。これらのVLPから調製したタンパク質を、ヒスチジン特異的抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。本発明者らは、gC-6×Hisを用いてトランスフェクトした293/ΔBFLF1細胞で生成されたウイルスのみが、特異的シグナルを生じさせ、したがってこのタンパク質を取り込んでいることを見出した（図8）。
実施例8：外来性抗原を担持するVLPは免疫応答を誘導する
本発明者らは、作製したLP/VLPが免疫原性であり、安全なワクチン調製物の要件を満たすことを示してきたので、本発明者らは、その抗原性スペクトルを拡大することを目指した。EBV感染は、強力なT細胞応答を誘導し、EBV潜伏感染タンパク質および溶解性タンパク質の両方に由来するT細胞エピトープが特定されている。本発明者らは、ウイルスエンベロープに取り込ませるために、EBV潜伏感染タンパク質であるEBNA3Cに由来する免疫優勢エピトープ5H11（配列番号33；コード配列 配列番号32）を選択した。本発明者らは、5H11エピトープおよび単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）の糖タンパク質C（gC）の複数部分（シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質テイルを含む）を含む融合タンパク質を作製した（配列番号35；コード配列 配列番号34；構築物は、プラスミドB599（配列番号37）に含まれる；プラスミドB557（配列番号36）は、5H11エピトープをコードする配列を欠く対照プラスミドである）。また、該構築物は、Hisタグおよびエピトープ挿入を促進するための固有制限部位を含んでいた（図9A）。この構築物の存在下での突然変異型産生細胞株の誘導は、Dynabeads精製LP/VLPのウエスタンブロットにより示される通り、EBV LP/VLP中の融合タンパク質の効率的な組み込みにつながった（図9B）。さらに、gC-His-5H11融合タンパク質が組み込まれたΔBFLF1/BFRF1A VLPの両方が、LCLからの提示後に特異的T細胞活性化を誘導することができた（図9C）。

Claims (17)

  1. エプスタイン・バーウイルス(EBV) DNAを実質的に含まない複数のエプスタイン・バーウイルス様粒子(EB-VLP)から成る集団であって、前記集団において、EBV DNA不含VLPの数が、他の点では同一の条件下で、末端反復が欠失した突然変異型株(deltaTR-EBV)から生成された複数のVLPと比較して増加されている、前記複数のEB-VLPから成る集団。
  2. 前記末端反復が欠失した突然変異型株(deltaTR-EBV)から生成された複数のVLPが、前記複数のEB-VLPが生産された細胞株と同一の細胞株において生産されたものである、請求項１記載の複数のEB-VLPから成る集団。
  3. 前記細胞株が293細胞である、請求項２記載の複数のEB-VLPから成る集団。
  4. 前記複数のEB-VLPが少なくとも1つの人工ポリペプチドをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の複数のEB-VLPから成る集団。
  5. 前記複数のEB-VLPが少なくとも1つの非必須EBVポリペプチドを欠損している、請求項１〜４のいずれか１項記載の複数のEB-VLPから成る集団。
  6. 医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか１項記載の複数のEB-VLPから成る集団の使用。
  7. ワクチンの製造のための、請求項１〜５のいずれか１項記載の複数のEB-VLPから成る集団の使用。
  8. (a) BFLF1遺伝子及び/又はBBRF1遺伝子を欠損し、且つ
    (b) 好適な宿主細胞中で請求項１〜５のいずれか１項記載の複数のEB-VLPから成る集団を産生することが可能である、
    エプスタイン・バーウイルス(EBV)ゲノムを含むポリヌクレオチド。
  9. 少なくとも1つの発現可能な潜伏感染遺伝子をさらに欠損している、請求項８記載のポリヌクレオチド。
  10. 請求項８又は９記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  11. 請求項８若しくは９記載のポリヌクレオチド又は請求項１０記載のベクターを含む宿主細胞。
  12. 請求項１〜５のいずれか１項記載の複数のEB-VLPから成る集団の製造方法であって、以下のステップ：
    (a) 請求項８若しくは９記載のポリヌクレオチド又は請求項１０記載のベクターを含む好適な宿主細胞を培養するステップ、及び
    (b) 該細胞から前記複数のEB-VLPから成る集団を取得するステップ
    を含む、前記方法。
  13. 前記複数のEB-VLPから成る集団が、前記培養細胞の上清から得られる、請求項１２記載の方法。
  14. ステップ(a)の間に、前記宿主細胞中で、人工ポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子を発現させるステップをさらに含む、請求項１２又は１３記載の方法。
  15. 請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法のステップ及び前記複数のEB-VLPから成る集団をワクチンとして製剤化するさらなるステップを含む、ワクチンの製造方法。
  16. 請求項１〜５のいずれか１項記載の複数のEB-VLPから成る集団を含有するワクチン。
  17. 請求項１〜５のいずれか１項記載の複数のEB-VLPから成る集団を含む、疾患の治療及び/又は予防のためのワクチンとしての使用のための組成物。
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