DE69332045T2

DE69332045T2 - Hepatistherapeutikum

Info

Publication number: DE69332045T2
Application number: DE69332045T
Authority: DE
Inventors: M. Chang; J. Jolly; Tsung-Liang Lee; Joann O'dea; Kay Townsend
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1992-02-04
Filing date: 1993-02-04
Publication date: 2002-10-17
Anticipated expiration: 2013-02-05
Also published as: WO1993015207A2; EP0625204A1; ATE219522T1; AU7530996A; JPH07503615A; CA2128896A1; JP2003055265A; JP2000154152A; EP0625204B1; WO1993015207A3; PT625204E; DE69332045D1; ES2174845T3; AU3610293A; DK0625204T3

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Behandlung von Hepatitis wie auch von mit Hepatitis assoziierten Karzinomen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Hepatitis ist eine systemische Krankheit, die vorwiegend die Leber befällt. Die Krankheit ist zu Beginn durch Symptome wie Anorexie, Nausea, Erbrechen, Müdigkeit, Übelkeit, Arthalgie, Myalgie und Kopfschmerzen gekennzeichnet, worauf sich der Beginn einer Gelbsucht anschließt. Die Krankheit kann auch durch erhöhte Serumlevel der Aminotransferasen AST und ALT charakterisiert werden. Eine quantitative Bestimmung dieser Enzyme im Serum zeigt das Ausmaß einer Leberschädigung an.
Es gibt fünf allgemeine Kategorien viraler Agenzien, die mit Hepatitis in Verbindung gebracht wurden: das Hepatitis A-Virus (HAV); das Hepatitis B-Virus (HBV); zwei Typen Nicht-A-, Nicht-B-(NANB)-Agenzien, von denen eins im Blut enthalten ist (Hepatitis C) und das andere enteral übertragen wird (Hepatitis E); und das HBV- assoziierte delta-Agens (Hepatitis D).
Es gibt zwei allgemeine klinische Kategorien von Hepatitis, akute Hepatitis und chronische Hepatitis. Symptome für akute Hepatitis reichen von asymptomatisch und nichtsichtbar bis zu letalen Infektionen. Die Krankheit kann subklinisch und persistierend sein oder rasch zu einer chronischen Leberkrankheit mit Zirrhose und in einigen Fällen zu hepatozellulärem Karzinom fortschreiten. Eine akute Hepatitis B-Infektion bei erwachsenen Kaukasiern in den USA schreitet in etwa 5% bis 10% der Fälle zu chronischer Hepatitis B fort. Bei den restlichen Fällen sind etwa 65% asymptomatisch. Im fernen Osten ist die Infektion normalerweise perinatal und 50% bis 90% der Fälle entwickeln sich zum chronischen Zustand. Es ist wahrscheinlich, daß die unterschiedlichen Progressionsraten eher mit dem Alter bei der Infektion als mit genetischen Unterschieden in den Wirten zusammenhängen. In den USA sind etwa 0,2% der Bevölkerung chronisch infiziert, wobei ein höherer prozentualer Anteil bei Gruppen mit hohem Risiko, wie z.B. bei Ärzten, Drogenabhängigen und Nierendialyse-Patienten vorliegt. In Ländern wie z.B. Taiwan, Hongkong und Singapore kann der Anteil der Bevölkerung mit Hepatitisinfektion in der Höhe von 10% liegen.
In den USA sterben etwa 20% der Patienten mit chronischer Hepatitis an Leberversagen und weitere 5% entwickeln ein mit Hepatitis B assoziiertes Karzinom. Im Fernen Osten ist ein großer Prozentsatz der Bevölkerung mit HBV infiziert und etwa 25% dieser entwickeln nach einer langen chronischen Infektion (20 bis 40 Jahre) ein hepatozelluläres Karzinom.
Bis vor kurzen hatte sich noch keine Therapie als zur Behandlung von akuter oder chronischer Hepatitis B als wirksam erwiesen und Patienten, die mit Hepatitis infiziert sind, müssen im allgemeinen der Krankheit ihren Lauf lassen. Die meisten antiviralen Arzneimittel, z.B. Acyclovir, wie auch Verfahren zur Unterstützung des Immunsystems durch die Verwendung von Corticosteroiden haben sich als unwirksam erwiesen (Alter, "Viral hepatitis and liver disease", Zuckerman (Hrsg.) New York; Alan R. Liss, S. 537-42, 1988). Eine gewisse antivirale Aktivität wurde bei Adenosinarabinosid (Jacyna et al., British Med. Bull. 46: 368-382, 1990) beobachtet, obgleich toxische Nebenwirkungen, die mit diesem Arzneimittel assoziiert sind, eine solche Behandlung inakzeptabel machen.
Eine Behandlung, die einen gewissen Nutzen bei chronischen Hepatitis B- und C- Infektionen brachte, ist die Verwendung von rekombinantem alpha-Interferon (Davis et äl., New Eng. J. Med. 321 (22): 1501-1506, 1989; Perrillo et al., New Eng. J. Med. 323: 295- 301, 1990). Allerdings sprachen von Patienten mit Hepatitis B-Infektionen nur etwa 35% der Infizierten auf eine solche Behandlung an und bei perinatal Infizierten sprachen nur etwa 10% auf die Behandlung an. Außerdem besteht eine weitere Schwierigkeit bei einer alpha-Interferon-Therapie darin, daß die Zusammensetzung häufig toxische Nebenwirkungen hat, die bei empfindlichen Patienten eine reduzierte Dosierung erfordert.
Daher wären therapeutische Mittel, die zur Verstärkung der natürlichen Wirts- Abwehrkräfte gegen Hepatitis oder gegen eine Tumorinduktion oder -progression dienen, die eine reduzierte Toxizität haben oder die eine Behandlung von Personen, die nicht auf Interferon ansprechen, erlauben, sehr vorteilhaft. Die vorliegende Erfindung stellt solche therapeutischen Mittel bereit und bietet darüber hinaus weitere, damit in Verbindung stehende Vorteile.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Kurz festgestellt, die vorliegende Erfindung ist auf rekombinante Retroviren zur Verwendung in Verfahren zur Behandlung von Hepatitis B gerichtet. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Retrovirus, das ein Vektorkonstrukt trägt, welches die Expression mindestens eines immunogenen Teils des Hepatitis B-Antigens HBcAg steuert, zur Verwendung bei der Behandlung von Hepatitis B-Infektionen bereitgestellt. Die Erfindung stellt auch ein rekombinantes Retrovirus, das ein Vektorkonstrukt, das die Expression eines immunogenen Teils des Hepatitis B-Antigens und eines immunmodulatorischen Co-Faktors steuert, trägt, zur Verwendung bei der Behandlung von Hepatitis B-Infektionen bereit.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Retrovirus bereitgestellt, das ein Vektor-Konstrukt trägt, das die Co-Expression mindestens eines immunogenen Teils des Hepatitis B-Antigens HBcAg und eines immunmodulatorischen Co-Faktors steuert. Ebenfalls bereitgestellt werden pharmzeutische Zusammensetzungen, die die rekombinanten Retroviren der Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfassen.
Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zur Behandlung von Hepatitis B-Infektionen bereitgestellt, wobei der Kit ein rekombinantes Retrovirus der Erfindung und einen immunmodulatorischen Co-Faktor umfaßt.
Dieser und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen verständlicher.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung, die die Gewinnung der Hepatitis Be- Sequenz aus ATCC 45020 in groben Zügen darstellt.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Nucleotidsequenz von HBV (adw)- precore/core (SEQ ID NO: 50) und der korrigierten Sequenzen.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Richtigstellung der Deletion in der ncsHBe-c-Sequenz aus pAM6 (ATCC 45020).
Fig. 4 ist ein DNA-Sequenzierungsgel, das korrigierten Nucleotidsequenzen aus SK&spplus;HBe-c zeigt.
Figur ist eine Übersichtstabelle, die die Expression von HBVe-Protein aus den folgenden retroviral tranduzierten murinen Zellinien BC10ME, B1/6, L-M(TK&supmin;), EL4 und der retroviral transduzierten EBV-transformierten humanen B-Zellinie JY-LCL, bestimmt durch ELISA, zeigt.
Fig. 6 ist ein Western-Blot, der die Expression von p17-kD-HBVe-Protein, das durch retroviral transduzierte BC10ME- und B1/6-Zellen sekretiert wird, und p22- und p23- kD-precore-Protein-Zwischenprodukten in Zellysaten aus retroviral tranduzierten BC10ME- und B1/6-Zellen, zeigt.
Fig. 7 ist ein Diagramm, das die Induktion von Antikörperreaktionen gegen HBVe-Antigen in Balb/C- und C57B1/6-Mäusen, denen syngene Zellen, welche das Antigen exprimieren, injiziert wurden oder denen der retrovirale Vektor, der für das HBVe- Antigen codiert, injiziert worden war, zeigt.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung des Vektorkonstrukts KT-HBV- core/B7/BB1, das sowohl HBV-core- wie auch B7/BB1-Proteine exprimiert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Bevor die Beschreibung der Erfindung fortgesetzt wird, kann es zum Verständnis derselben hilfreich sein, zuerst bestimmte Ausdrücke, die im folgenden verwendet werden, zu definieren. Alle Referenzen, die im nachfolgenden zitiert werden, werden hierdurch als Referenz in ihrer Gesamtheit hier aufgenommen.
Der Ausdruck "immunogener Teil", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf einen Teil des jeweiligen Antigens, der unter den geeigneten Bedingungen fähig ist, eine Immunantwort (d.h. eine zellvermittelte oder humorale) hervorzurufen. "Teile" können eine variable Größe haben, sind aber vorzugsweise mindestens 9 Aminosäuren lang und können das ganze Antigen umfassen. Typische Assays, die zur Bestimmung der Immunogenität (z.B. der zellvermittelten Immunantwort) verwendet werden können, werden im folgenden wie auch in Beispiel 12 detailliert beschrieben. Zellvermittelte Immunantworten können durch Major Histocompatability Complex ("MHC")-Klasse I-Präsentation, MHC-Klasse II-Präsentation oder beide vermittelt werden.
Der Begriff "Vektorkonstrukt" bezieht sich auf eine Anordnung, die fähig ist, die Expression der interessierenden Sequenz(en) oder des interessierenden Gens (der interessierenden Gene) zu steuern. Das Vektorkonstrukt muß Promotorelemente enthalten und enthält vorzugsweise ein Signal, das eine Polyadenylierung steuert. Außerdem muß das Vektorkonstrukt eine Sequenz enthalten, die bei Transkription funktionell an die interessierende Sequenz(en) oder das interessierende Gen (die interessierenden Gene) gebunden wird und als Translationsinitiations-Sequenz wirkt. Das Vektorkonstrukt beinhaltet vorzugsweise auch einen selektierbaren Marker, z.B. Neo, SV&sub2; Neo, TK, Hygromycin, Phleomycin, Histidinol oder DHFR, wie auch eine oder mehrere Restriktionsstellen und eine Translations-Terminationssequenz. Außerdem muß das Vektorkonstrukt, wenn es in einem Retrovirus angeordnet wird, auch ein Verpackungssignal und lange terminale Wiederholungen (LTRs), die für das verwendete Retrovirus geeignet sind, (wenn diese nicht bereits vorliegen) enthalten.
Der Begriff "immunmodulatorischer Co-Faktor" bezieht sich auf Faktoren, die, wenn sie durch eine oder mehrere der bei einer Immunantwort involvierten Zellen hergestellt werden, oder die, wenn sie exogen den Zellen zugesetzt werden, bewirken, daß die Immunantwort sich in der Qualität und Wirksamkeit von der unterscheidet, die in Abwesenheit des Co-Faktors auftreten würde. Die Qualität oder Wirksamkeit einer Antwort kann durch eine Vielzahl von Assays gemessen werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind und die z.B. in vitro-Assays, die die Zellproliferation messen (z.B. ³H- Thymidin-Aufnahme) und in cytotoxischen in vitro-Assays (z.B. die eine &sup5;¹Cr-Freisetzung messen) (siehe Warner et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 7: 645-655, 1991) gemessen werden. Immunmodulatorische Co-Faktoren können sowohl in vivo wie auch ex vivo aktiv sein. Typische Beispiele für solche Co-Faktoren umfassen Cytokine, z.B. Interleukine 2, 4 und 6 (unter anderem), alpha-Interferone, beta-Interferone, gamma- Interferone, GM-CSF, G-CSF und Tumornekrose-Faktoren (TNFs). Andere immunmodulatorische Co-Faktoren umfassen z.B. CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-2, MHC Klasse I-Moleküle, MHC Klasse II-Moleküle, B7/BB1, β&sub2;-Mikroglobulin, Chaperone oder Analoga davon.
Wie oben beschrieben wurde, ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Hepatitis B-Infektionen gerichtet. Kurz ausgedrückt, die Fähigkeit, fremde Pathogene zu erkennen und abzuwehren, ist für die Funktion des Immunsystems zentral. Dieses System ist durch die Immunerkennung fähig, "eigen" von "nicht-eigen" (fremd) zu unterscheiden, was essentiell ist, um sicherzustellen, daß Abwehrmechanismen eher gegen eindringende Einheiten als gegen Wirtsgewebe gerichtet werden. Die Verfahren, die im folgenden detaillierter beschrieben werden, liefern geeignete Mittel zur Induzierung wirksamer Klasse I-restringierter schützender und therapeutischer CTL-Reaktionen wie auch humoraler Reaktionen.
Wie oben beschrieben wurde, wird nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Hepatitis B-Infektionen bei warmblütigen Tieren bereitgestellt, das den Schritt einer Verabreichung eines Vektorkonstrukts an warmblütige Tiere umfaßt, welches die Expression mindestens eines immunogenen Teils eines Hepatitis B-Antigens steuert, so daß eine Immunantwort hervorgerufen wird.
Kurz ausgedrückt, das Hepatitis B-Genom besteht aus kreisförmiger DNA mit etwa 3,2 Kilobasen Länge und ist gut charakterisiert (Tiollais et al., Science 213: 406-411, 1981; Tiollais et al., Nature 317: 489-495, 1985 und Ganem und Varmus, Ann. Rev. Biochem. 56: 651-693, 1987). Das Hepatitis B-Virus weist mehrere unterschiedliche Antigene auf, die unter anderem drei HB "S"-Antigene (HBsAgs), ein HBc-Antigen (HbcAg), ein HBe- Antigen (HBeAg) und ein HBx-Antigen (HBxAg) einschließen (siehe Blum et al., "The Molecular Biology of Hepatitis B Virus", TIG (5(5): 154-158, 1989). HBeAg resultiert aus einer proteolytischen Spaltung des P22-precore-Zwischenprodukts und wird aus der Zelle sekretiert. HBeAg wird im Serum als 17 kD-Protein gefunden. HBcAg ist ein Protein aus 183 Aminosäuren und HBxAg ist, abhängig vom Subtyp, ein Protein aus 145 bis 154 Aminosäuren.
Die HBsAgs (als "groß", "mittel" und "klein" bezeichnet) werden von drei Regionen des Hepatitis B-Genoms; S, pre-S2 und pre-S1, codiert. Das große Protein, das eine Länge hat, die zwischen 389 und 400 Aminosäuren variiert, wird durch die Regionen pre-S1, pre-S2 und S codiert und wird in glycosylierten und nicht-glycosylierten Formen gefunden. Das mittlere Protein ist 281 Aminosäuren lang und wird durch die pre-S2- und S-Regionen codiert. Das kleine Protein ist 226 Aminosäuren lang wird durch die S-Region codiert. Es existiert in zwei Formen, glycosyliert (GP 27S) und nicht-glycosyliert (P24S). Wenn jede dieser Regionen getrennt exprimiert wird, wird die pre-S1-Region für ein Protein aus etwa 119 Aminosäuren codieren, wird die pre-S2-Reion für Protein mit etwa 55 Aminosäuren codieren und wird die S-Region für ein Protein mit etwa 226 Aminosäuren codieren.
Wie es einem Fachmann auf dem Fachgebiet klar sein wird, können verschiedene immunogene Teile der oben beschriebenen S-Antigene kombiniert werden, um eine Immunantwort zu zeigen, wenn sie durch eines der hier beschriebenen Vektorkonstrukte verabreicht werden. Infolge der großen immunologischen Variabilität, die in verschiedenen geographischen Regionen für das offene Leseraster S von HBV gefunden wird, können außerdem besondere Antigen-Kombinationen zur Verabreichung in besonderen geographischen Regionen bevorzugt sein. Kurz gesagt, Epitope, die in allen humanen Hepatitis B-Virus-S-Proben gefunden werden, werden als Determinante "a" definiert. Sich wechselseitig ausschließende Subtyp-Determinanten wurden allerdings durch eine zweidimensionale doppelte Immundiffusion identifiziert (Ouchterlony, Progr. Allergy 5: 1, 1958). Diese Determinanten wurden als "d" oder "y" und "w" oder "r" bezeichnet (LeBouvier, J. Infect. 123: 671, 1971; Bancroft et al., J. Immunol. 109: 842, 1972: Courouce et al., Bibl. Haematol. 42: 1-158, 1976). Die immunologische Variabilität ist durch einzelne Nucleotidsubstitutionen in zwei Bereichen des offenen Leserasters S des Hepatitis B-Virus begründet: (1) Austausch von Lysin-122 im offenen Leserater S des Hepatitis B-Virus verursacht eine Subtypverschiebung von d zu y und (2) ein Austausch von Arginin-160 durch Lysin verursacht eine Verschiebung vom Subtyp r zu w. In Schwarzafrika ist der Subtyp ayw dominant, während in den USA und in Nordeuropa der Subtyp adw&sub2; häufiger vorkommt (Molecular Biology of the Hepatitis B Virus, McLachlan (Hrsg.), CRC Press, 1991). Dem Fachmann auf diesem Gebiet wird bekannt sein, daß es im allgemeinen bevorzugt ist, einen Vektor zur Verabreichung aufzubauen, der für den besonderen Hepatitis B-Virus-Subtyp geeignet ist, welcher in der geographischen Region der Verabreichung überwiegt. Subtypen einer besonderen Region können durch zweidimensionale doppelte Immundiffusion oder vorzugsweise durch Sequenzierung des offenen Leserasters S des HBV-Virus, der aus Personen in dieser Region isoliert wurde, bestimmt werden.
Von HBV werden auch pol ("HBV-pol")-, ORF 5- und ORF 6-Antigene gezeigt. D.h. das Polymerase-offene Leseraster von HBV codiert für reverse Transkriptase- Aktivität, die in Virionen und core-artigen Partikeln in infizierter Leber gefunden wird. Das Polymerase-Protein besteht aus mindestens zwei Domänen: die Amino-terminale Domäne codiert das Protein, das eine reverse Transkription startet, und die Carboxyl-terminale Domäne, die die reverse Transkriptase- und RNAse-H-Aktivität codiert. Immunogene Teile des HBV-pol können unter Verwendung von hier beschriebenen Methoden bestimmt werden (z.B. im folgenden und in den Beispielen 11 Aii und 12); sie können unter Verwendung von Vektorkonstrukten, die im folgenden beschrieben werden, exprimiert werden und verabreicht werden, um in einem warmblütigen Tier eine Immunantwort zu erzeugen. Entsprechend können andere HBV-Antigene, z.B. ORF 5 und ORF 6 (Miller et al., Hepatology 9: 322-327, 1989) exprimiert werden, wobei die hier beschriebenen Vektorkonstrukte verwendet werden. Typische Beispiele für Vektorkonstrukte, die ORF 5 und ORF 6 verwenden, werden in den folgenden Beispielen 2J, 2K und 4E, 4F angeführt.
Molekular klonierte Genome, die für das Hepatitis B-Virus codieren, können aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden; diese umfassen z.B. American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland). ATCC-Nr. 45020 enthält z.B. die gesamte genomische DNA von Hepatitis B (extrahiert aus gereinigten Dane-Partikeln) (siehe Fig. 3 von Blum et al., TIG 5(5): 154-158, 1989) in der Bam HI-Stelle von pBR322 (Moriarty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2606-2610, 1981). (Es wird wird auf korrigierbare Fehler hingewiesen, die in der Sequenz von ATCC-Nr. 45020 auftreten, die in Beispiel 2A beschrieben werden und in Fig. 2 dargestellt sind).
Wie oben beschrieben wurde, wird mindestens ein immunogener Teil eines Hepatitis B-Antigens in ein Vektorkonstrukt eingebaut. Der immunogene Teil (die immunogenen Teile), die in das Vektorkonstrukt eingebaut werden, können verschiedene Längen haben, obgleich es im allgemeinen bevorzugt ist, daß die Teile mindestens 9 Aminosäuren lang sind und das gesamte Antigen enthalten können. Immunogenität einer besonderen Sequenz ist oft schwierig vorauszusagen, obgleich T-Zellen-Epitope vorausgesagt werden können, indem Computer-Algorithmen wie z.B. TSITES (MedImmune, Maryland) verwendet werden, um codierende Regionen auf potentielle T- Helferstellen und CTL-Stellen durchzumustern. Aus dieser Analyse werden Peptide synthetisiert und als Ziele in einem in vitro-Cytotoxizitäts-Assay, z.B. der in Beispiel 12 beschriebene, verwendet. Andere Assays können allerdings auch verwendet werden, einschließlich z.B. ELISA, der das Vorliegen von Antikörpern gegen den neu eingeführten Vektor nachweist wie auch Assays, die auf T-Helferzellen untersuchen, z.B. gamma- Interferon-Assays, IL-2-Produktions-Assays und Proliferations-Assays. Ein besonders bevorzugter Assay wird detaillierter nachfolgend in Beispiel 11B beschrieben.
Immunogene Teile können auch durch andere Verfahren selektiert werden. Beispielsweise hat sich die transgene HLA A2.1 Maus als Modell für die humane T- Zellenerkennung viraler Antigene als nützlich erwiesen. Kurz gesagt, in Influenza- und viralen Hepatitis-B-Systemen erkennt das murine T-Zellrezeptor-Repertoir dieselben antigenen Determinanten, die von humanen T-Zellen erkannt werden. In beiden Systemen ist die CTL-Antwort, die in der transgenen HLA A2.1 Maus erzeugt wird, tatsächlich gegen dasselbe Epitop gerichtet, wie bei Erkennung durch humane CTLs des HLA A2.1 Halotyps (Vitielle et al., J. Exp. Med. 173: 1007-1015, 1991; Vitiello et al., Abstract of Molecular Biology of Hepatitis B Virus Symposia, 1992).
Besonders bevorzugte immunogene Teile zum Einbau in Vektorkonstrukte umfassen HBeAg, HBcAg und HBsAgs, wie sie in den folgenden Beispielen näher beschrieben werden.
Zusätzliche immunogene Teile des Hepatitis B-Virus können erhalten werden, indem die codierende Sequenz an verschiedenen Stellen gestützt wird, einschließlich z.B. der folgenden Stellen: Bst UI, Sps L, Ppu M1 und Msp I (Valenzuela et al., Nature 280: 815- 19, 1979; Valenzuela et al. Animal Virus Genetics: ICN/UCLA Symp. Mol. Cell Biol., 1980, B. N. Fields und R. Jaenisch (Hrsg.), S. 57-70, New York: Academic).
Wie oben beschrieben wurde, kann mehr als ein immunogener Teil in das Vektorkonstrukt eingearbeitet werden. Beispielsweise kann ein Vektorkonstrukt HBcAg, HBeAg, HBsAgs, HBxAg wie auch immunogene Teile von HCV-Antigenen ganz oder Teile davon exprimieren (entweder getrennt oder als Ein Konstrukt), was im folgenden diskutiert wird. Außerdem kann das Vektorkonstrukt auch einen immunmodulatorischen Co-Faktor co- exprimieren, z.B. alpha-Interferon (Finter et al., Drugs 42(5): 749-765, US-Patent Nr. 4 895 743; US-Patent Nr. 4 966 846; WO 85/02862; Nagata et al., Nature 284: 316-320, 1980; Familletti et al., Methods in Enz. 78: 387-394; Twu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2046-2050, 1989; Faktor et al., Onocogene 5: 867-872, 1990), beta-Interferon (Seif et al., J. Virol. 65: 664-671, 1991) gamma-Interferone (Radford et al., The American Society of Hetaology 20082015, 1991; Watanabe et al., PNAS 86: 9456-*460, 1989; Gansbacher et al., Cancer Research 50: 7820-7825, 1990; Maio et al., Can. Immunol. Immunother. 30: 34-42, 1989; US-Patent Nr. 4 762 791; US-Patent Nr. 4 727 138), G-CSF (US-Patente Nrn. 4 999 291 und 4 810 643), GM-CSF (WO 85/04188), TNFs (Jayaraman et al., J. Immunology 144: 942-951, 1990), Interleukin-2 (IL-2) (Karupiah et al., J. Immunology 144: 290-298, 1990; Wber et al., J. Exp. Med. 166: 1716-1733, 1987; Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172: 1217-1224, 1990; US-Patent Nr. 4738 927), IL-4 (Tepper et al., Cell 57: 503-512, 1989; Gelumbek et al., Science 254: 713-716; 1991; US-Patent Nr. 5 017 691), IL-6 (Brackenhof et al., J. Immunol. 139-4116-4121, 1987; WO 90/06370), ICAM-1 (Altman et al., Nature 338: 512-514; 1989), ICAM-2, LFA-1, LFA-3, MHC-Klasse I- Moleküle, MHC-Klasse II-Moleküle, β&sub2;-Mikroglobulin, Chaperone, CD3, B7/BB1, MHC- gebundene Transporterproteine oder Analoga davon.
Die Wahl, welcher immunmodulatorischer Co-Faktor in einem Vektorkonstrukt enthalten sein soll, kann auf bekannten therapeutischen Effekten des Co-Faktors basieren oder experimentell bestimmt werden. Bei chronischen Hepatitis B-Infektionen hat sich z.B. alpha-Interferon als bei der Kompensierung des immunologischen Defizits des Patienten und dadurch bei der Unterstützung der Genesung von der Krankheit als wirksam erwiesen. Alternativ kann ein geeigneter immunmodulatorischer Co-Faktor experimentell bestimmt werden. Kurz ausgedrückt, zunächst werden Blutproben von Patienten mit einer hepatischen Krankheit entnommen. Periphere Blutlymphozyten (PBLs) werden in vitro mit autologen oder mit HLA-übereinstimmenden Zellen (z.B. EBV-transformierten Zellen) restimuliert und mit einem Vektorkonstrukt transduziert, das die Expression eines immunogenen Teils eines Hepatitis-Antigens und des immunmodulatorischen Co-Faktors steuert. Stimulierte PBLs werden als Effektor in einem CTL-Assay mit den mit HLA übereinstimmenden transduzierten Zellen als Ziele verwendet. Eine Verstärkung der CTL- Antwort gegenüber der, die in demselben Assay, der unter Verwendung mit HLA-übereinstimmenden Stimulator mit Zielzellen, die mit einem Vektor, der für das Antigen allein codiert, transduziert waren, durchgeführt wurde, zu sehen war, zeigt einen verwendbaren immunmodulatorischen Co-Faktor an.
Moleküle, die für die oben beschriebenen immunmodulatorischen Co-Faktoren codieren, können aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden. Z.B. können Plasmide, die diese Sequenzen enthalten, von einer Hinterlegungsstelle, z.B. American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), oder aus kommerziellen Quellen, z.B. British Biotechnology Limited (Cowley, Oxford England) erhalten werden. Typische Beispiele umfassen BBG 12 (enthält das GM-CSF-Gen, das für das reife Protein aus 127 Aminosäuren codiert), BBG 6 (das Sequenzen enthält, die gamma-Interferon codieren), ATCC-Nr. 39656 (das Sequenzen enthält, die für TNF codieren), ATCC Nr. 20663 (das Sequenzen enthält, die für alpha-Interferon codieren), ATCC-Nrn. 31902, 31902 und 39517 (die Sequenzen enthalten, die für beta-Interferon codieren), ATCC-Nrn. 39405, 390452, 39516, 39626 und 39673 (die Sequenzen enthalten, die für Interleukin-2) codieren, ATCC- Nr. 57592 (das Sequenzen enthält, die für Interleukin-4 codieren) und ATCC 67153 (das Sequenzen enthält, die für Interleukin-6 codieren).
In ähnlicher Weise können Sequenzen, die für immunmodulatorische Co-Faktoren codieren, in einfacher Weise aus Zellen erhalten werden, die Sequenzen exprimieren oder enthalten, die für die Co-Faktoren codieren. Kurz ausgedrückt, in einer Ausführungsform werden Primer an einer Seite der gewünschten Sequenz hergestellt, welche anschließend durch PCR amplifiziert wird (siehe US-Patente Nrn. 4 683 202, 4 683 195 und 4 800 159) (siehe auch PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich (Hrsg.), Stockton Press, 1989). Insbesondere wird eine doppelsträngige DNA durch Erwärmen in Gegenwart von wärmestabiler Taq-Polymerase, sequenzspezifischen DNA- Primern, ATP, CTP und TTP denaturiert. Doppelsträngige DNA wird produziert, wenn die Synthese vollständig ist. Dieser Zyklus kann viele Male wiederholt werden, was zu einer faktorialen Amplifikation der gewünschten DNA führt.
Sequenzen, die für immunmodulatorische Co-Faktoren codieren, können auch z.B. an einem Applied Biosystems Inc. DNA-Synthesizer (z.B. ABI-DNA-Synthesizer, Model 392 (Foster City, California)) synthetisiert werden. Solche Sequenzen können durch komplementäre Enden aneinander gebunden werden, worauf sich eine PCR-Amplifikation (Vent polymerase, New England Biomedical, Beverly, Massachusetts) unter Bildung langer doppelsträngiger DNA-Moleküle anschließt (Foguet et al., Biotechniques 13: 674-675, 1992).
Wenn ein immunogener Teil (immunogene Teile) (und wenn gewünscht, ein immunmodulatorischer Co-Faktor) ausgewählt wurde(n), werden Gene, die für diese Proteine codieren, in einem Vektorkonstrukt angeordnet, das ihre Expression steuert. Im allgemeinen codieren solche Vektoren nur für diese Gene und nicht für selektierbare Marker. Vektoren, die für ein spezifisches Antigen und einen immunmodulatorischen Co- Faktor codieren und zu ihrer Expression führen, können von einem Fachmann auf diesem Gebiet einfach konstruiert werden. Der Aufbau von Vektorkonstrukten wie auch eine Verabreichung retroviraler Konstrukte durch direkte Injektion wird detaillierter in einer Anmeldung mit dem Titel "Rekombinant Retroviruses" (U.S.S.N. 07/586 603, eingereicht am 21. September 1990) beschrieben. Diese Vektor-Konstrukte können auch zur Erzeugung Transduktions-kompetenter retroviraler Vektorpartikel verwendet werden, indem sie in geeignete Verpackungszellinien (siehe U.S.S.N. 07/800 921) eingeführt werden, um Producer-Zellinien für die Produktion retroviraler Vektorpartikel, welche Replikationsinkompetent sind, zu erzeugen.
Es können verschiedene Assays Verwendet werden, um das Vorliegen Replikationskompetenter infektiöser Retroviren nachzuweisen. Ein bevorzugter Assay ist der ausgedehnte S&spplus;L&supmin;-Assay, der in Beispiel 7 beschrieben wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform können Vektorkonstrukte so aufgebaut sein, daß sie einen Promotor, z.B. SV40 (siehe Kriegler et al., Cell 38: 483, 1984), Cytomegalovirus ("CMV") (siehe Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1991) oder eine interne ribosomale Bindungsstelle ("IRBS") enthalten. Kurz gesagt, bezüglich der IRBS hat sich gezeigt, daß die 5'-untranslatierte Region des Immunoglobulin-schwere Kette- Bindungsproteins das das interne Engagement einer bicistronischen Message trägt (siehe Jacejak und Sarnow, Nature 353: 90-94, 1991). Diese Sequenz ist klein (300 bp) und kann einfach in einen retroviralen Vektor eingebaut werden, um mehrere Gene aus einer multicistronischen Message, deren Cistrone mit dieser Sequenz beginnen, zu exprimieren. Ein typisches Vektorkonstrukt, das IRBS verwendet, wird detaillierter in den Beispielen 5C und 5D beschrieben.
Wenn ein Vektorkonstrukt hergestellt wurde, kann es einem warmblütigen Tier verabreicht werden, um eine Hepatitis B-Infektion zu behandeln. Methoden zur Verabreichung eines Vektorkonstrukts über einen retroviralen Vektor (z.B. durch direkte Injektion des retroviralen Konstrukts) werden detaillierter in einer Anmeldung mit dem Titel "Recombinant Retroviruses" (U.S.S.N. 07/586 603) beschrieben. Solche Methoden umfassen z.B. einen Transfektion durch Verfahren, die verschiedene physikalische Methoden ausnützen, z.B. Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413- 7417, 1989), direkte DNA-Injektion (Acsadi et al., Nature 352: 815-818, 1991); mikroprojektile Bombardierung (Williams et al., PNAS 88: 2726-2730, 1991); Liposome (Wang et al., PNAS 84: 7851-7855, 1987); CaPO&sub4; (Dubensky et al., PNAS 81: 7529-7533, 1984); oder einen DNA-Liganden (Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989). Außerdem kann das Vektorkonstrukt oder können die Nucleinsäuren; die für den relevanten immunogenen Teil codieren, einem Patienten direkt, z.B. durch Transfektionsverfahren wie Lipofektion, direkte DNA-Injektion, mikroprojektiles Bombardement, Liposome, CaPO&sub4; oder DNA-Ligand, verabreicht werden. Zusammensetzungen und Verfahren, die zur Verabreichung immunogener Protein selbst, von Vektorkonstrukten, viralen Vektoren oder viralen Vektoren zusammen mit immunmodulatorischen Co-Faktoren geeignet sind, werden nachfolgend detaillierter diskutiert.
Wie oben angegeben wurde, ist es, sobald ein immunogener Teil ausgewählt wurde, im allgemeinen günstig, sicherzustellen, daß er nicht tumorenbildend ist. Dies kann durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen, die z.B. Trunkation, Punktmutation, Anfügung frühreifer Stopp-Codons oder Phosphorylierungsstellen-Alteration einschließen. Das Polyprotein-Antigen oder eine modifizierte Version davon kann ebenfalls unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren oder die Verfahren, die in Beispiel 13 beschrieben werden, auf Karzinogenität untersucht werden.
Ein immunogener Teil (immunogene Teile) (wie auch immunmodulatorische Co- Faktoren, wenn gewünscht) können dann in ein Vektorkonstrukt insertiert werden, und von einem rekombinanten Virus getragen werden, wie es oben beschrieben wurde. Zusammensetzungen und Verfahren, die zur Verabreichung der immunogenen Proteine selbst, von Vektorkonstrukten, viralen Vektoren oder viralen Vektoren zusammen mit immunmodulatorischen Co-Faktoren geeignet sind, werden im folgenden detaillierter diskutiert.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung körnen Vektorkonstrukte hergestellt werden, die direkt die Co-Expression mehrer der oben beschriebenen immunogenen Teile (wie auch der immunmodulatorischen Co-Faktoren, wenn gewünscht) steuern. Beispielsweise können in einer Ausführungsform Vektorkonstrukte hergestellt werden, die die Co-Expression eines immunogenen Teils des Hepatitis B-Antigen steuern. Solche Konstrukte können verabreicht werden, wie es oben und auch im folgenden beschrieben ist, um akute und chronische Hepatitis B-Infektionen zu behandeln oder diesen vorzubeugen.
Wie oben erwähnt wurde, können verschiedene Verfahren verwendet werden, um erfindungsgemäße Konstrukte oder Nucleinsäuren, die für den oben diskutierten immunogenen Teil (die oben diskutierten immunogenen Teil) codieren, warmblütigen Tieren, z.B. Menschen, direkt zu verabreichen (Curiel et al., Human Gene and Therapy 3: 147-154, 1992).
Außerdem kann eine Immunantwort (einschließlich CTL) auch durch Verabreichung eines Bakteriums erzeugt werden, welches den immunogenen Teil (die immunogenen Teile), wie sie oben diskutiert wurden, an seiner Zelloberfläche exprimiert. Typische Beispiele umfassen BCG (Stover, Nature 351: 456-458, 1991) und Salmonella (Newton et al., Science 244: 70-72, 1989).
Zellvermittelte und humorale Antworten können auch gegen Hepatitis induziert werden, und zwar durch parenterale Verabreichung des oben diskutierten immunogenen Teils (der oben diskutierten immunogenen Teile). Kurz ausgedrückt, immunogene Teile, die relevante Epitope tragen, können durch eine Vielzahl bekannter Wege produziert werden (Ellis and Gerety, J. Med. Virol. 31: 54-58, 1990), einschließlich einer chemischen Synthese (Bergot et al., Applied Biosystems Peptide Synthesizer User Bulletin Nr. 16, 1986, Applied Biosystems, Foster City California) und der DNA-Expression in rekombinanten Systemen wie z.B. das von Insekten stammende Baculovirus-System (Doerfler, Current Topics in Immunology 131: 51-68, 1986), von Säugern stammende Systeme (z.B. CHO-Zellen) (Berman et al., J. Virol, 63: 3489-3498, 1989), von Hefen stammende Systeme (McAleer et al., Nature 307: 178-180) und prokaryontische Systeme (Burrel et al., Nature 279: 43-47, 1979).
Die Proteine oder Peptide können dann durch herkömmliche Mittel gereinigt werden und durch eine Reihe von Methoden zugeführt werden, um zellvermittelte Antworten, einschließlich Klasse I- und Klasse II-Antworten, zu induzieren. Diese Verfahren umfassen die Verwendung von Adjuvantien unterschiedlichen Typs, z.B. ISCOMS (Morein, Immunology Letters 25: 281-284, 1990; Takahashi et al., Nature 344: 873-875 m, 1990), Liposome (Gergoriadis et al., Vaccine 5: 145-151, 1987), eine Lipid- Konjugation (Deres et al., Nature 342: 561-564, 1989), Beschichtung des Peptids an autologen Zellen (Staerz et al., Nature 329: 449-451, 1987), Pinosome (Moore et al., Cell 54: 777-785, 1988), Alaun, vollständige oder unvollständige Freund's-Adjuvantien (Hart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9448-9452, 1991) oder verschiedene andere nützliche Adjuvantien (z.B. Allison and Byars, Vaccines 87: 56-59, Cold Spring Harbor Laboratory, 1987) die eine wirksame parenterale Verabreichung erlauben (Litvin et al., Advances in AIDS Vaccine Development, Fifth Annual Meeting of the National Vaccine Development Groups for AIDS, 30. August 1992).
Alternativ können die Proteine oder Peptide, die dem oben diskutierten immunogenen Teil (den oben diskutierten immunogenen Teilen) entsprechen, zur oralen Verabreichung zur Auslösung einer Immunantwort in Magenkapseln (Channock et al., J. Amer. Med. Assoc. 195: 445-452, 1966) oder anderen geeigneten Trägern, z.B. Poly (DL- Lactid-co-glycolat)-Kugeln (Eldrige et al. in Proceedings of the International Conference on Advances in AIDS Vaccine Development, DAIDS, NIAD, U.S. Dept of Health & Human Services, 1991) zur gastrointestinalen Freisetzung eingekapselt sein.
Wie oben erwähnt wurde, können immunogene Proteine der vorliegenden Erfindung auch durch eine Vielzahl von Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, manipuliert werden, um sie immunogener zu machen. Typische Beispiele für solche Verfahren umfassen: Anfügen von Aminosäuresequenzen, die T-Helfer-Epitopen entsprechen;
Förderung der zellulären Aufnahme durch Anfügen hydrophober Reste; durch Bilden partikelförmiger Strukturen; oder durch eine beliebige Kombination der genannten (siehe allgemein Hart, op. cit., Milich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1610-1614, 1988; Willis, Nature 340: 323-324, 1989; Griffiths et al., J. Virol. 65: 450-456, 1991).
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die eines der oben beschriebenen rekombinanten Retroviren in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfassen. Die Zusammensetzung kann entweder als flüssige Lösung oder in fester Form (z.B. lyophilisiert), die vor Verabreichung in einer Lösung suspendiert wird, hergestellt werden. Zusätzlich kann die Zusammensetzung mit geeigneten Trägern oder Verdünnungsmitteln zur Injektion für eine orale oder rektale Verabreichung hergestellt werden. Im allgemeinen wird das rekombinante Virus in einer Konzentration im Bereich von 0,25 bis 25% und vorzugsweise etwa 5% bis 20% vor der Formulierung eingesetzt. Nach Herstellung der Zusammensetzung wird das rekombinante Virus folglich 1 ug Material pro Dosis bei dem etwa 10-fachen dieser Materialmenge (10 ug) als cogereinigte Kontaminate ausmachen. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung in 0,1 bis 1,0 ml wäßriger Lösung, die wie unten beschrieben formuliert ist, hergestellt.
Pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel sind bei den angewandten Dosierungen und Konzentrationen für die Empfänger nicht toxisch. Repräsentative Beispiele für Träger oder Verdünnungsmittel für injizierbare Lösungen umfassen Wasser, isotonische Salzlösungen, die vorzugsweise auf physiologischen pH gepuffert sind (z.B. Phosphat-gepufferte Salzlösung oder Tris-gepufferte Salzlösung), Mannit, Dextrose, Glycerin und Ethanol wie auch Polypeptide oder Proteine, z.B. humanes Serumalbumin. Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung umfaßt einen Vektor oder ein rekombinantes Virus in 10 mg/ml Mannit, 1 mg/ml HSA, 20 mM Tris, pH 7,2 und 150 mM NaCl. Da der rekombinante Vektor etwa 1 ug Material darstellt, kann dies in diesem Fall weniger als 1% an Material mit hohem Molekulargewicht und weniger als 1/100 000 des Gesamtmaterials (einschließlich Wasser) sein. Diese Zusammensetzung ist bei -70ºC für mindestens sechs Monate stabil. Die Zusammensetzung kann intravenös (i.v.) oder subkutan (s.c.) injiziert werden, obgleich es im allgemeinen bevorzugt ist, sie intramuskulär (i.m.) zu injizieren. Die normalerweise verwendeten Einzeldosen sind 10&sup7; bis 10&sup9; kbE (kolonienbildende Einheiten Neomycin-Resistenz, Titerbestimmung an HT1080-Zellen). Diese werden in ein- bis vier-Wochen-Intervallen mit drei oder vier Dosen zu Beginn verabreicht. Nachfolgende Wiederholungsimpfungen können als eine Dosis oder zwei Dosen nach 6 bis 12 Monaten und danach jährlich gegeben werden.
Es können auch orale Formulierungen mit Trägern oder Verdünnungsmitteln wie z.B. Cellulose, Lactose, Mannit, Poly(DL-lactid-co-glycolat)-Kügelchen und/oder Kohlenhydraten wie Stärke verwendet werden. Die Zusammensetzung kann z.B. die Form von Tabletten, Gel, Kapseln, Pillen, Lösungen oder Suspensionen annehmen und kann außerdem zur verzögerten Freisetzung formuliert werden. Zur rektalen Verabreichung kann die Herstellung eines Suppositoriums mit herkömmlichen Trägern, z.B. Polyalkalenglucose oder einem Triglycerid durchgeführt werden.
Wie oben beschrieben wurde, kann das Vektorkonstrukt die Expression eines immunmodulatorischen Co-Faktors zusätzlich zu mindestens einem immunogenen Teil eines Hepatitis-Antigens steuern. Wenn allerdings das Vektorkonstrukt keinen immunmodulatorischen Co-Faktor, der ein Cytokin ist, exprimiert, kann dieses Cytokin in den oben beschriebenen Zusammensetzungen enthalten sein oder kann getrennt (gleichzeitig oder anschließend) von der oben beschriebenen Zusammensetzung verabreicht werden. Kurz, in einer solchen Ausführungsform wird, der immunmodulatorische Co-Faktor vorzugsweise nach Standardprotokollen und in Dosierungen, wie sie in The Physician's Desk Reference vorgeschrieben sind, verabreicht. Beispielsweise kann alpha-Interferon in einer Dosierung von 1 bis 5 Millionen Einheiten/Tag für 2 bis 4 Monate verabreicht werden, und IL-2 kann bei einer Dosierung von 10 000 bis 100 000 Einheit/kg Körpergewicht 1- bis 3-mal/Tag über 2 bis 12 Wochen verabreicht werden. gamma- Interferon kann in Dosierungen von 150 000 bis 1 500 000 E/m, 2- bis 3-mal/Woche über 2 bis 12 Wochen verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung der vorliegenden Erfindung angeführt.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

ISOLIERUNG DER HBV-E/CORE-SEQUENZ

Ein 1,8 Kb BamH I-Fragment, das die gesamte precore/core-codierende Region von Hepatitis B enthält, wird aus Plasmid pAM6 (ATCC-Nr. 45020) erhalten in BamH I-Stelle von KS II&spplus; (Stratagene, La Jolla, Californien) ligiert. Dieses Plasmid wird KS II&spplus; HBpc/c genannt. Fig. 1. Xho I-Linker werden an die Stu I-Stelle der precore/cores in KS II&spplus; HBpc/c angefügt und das resultierende Xho I-Hinc II-precore/core-Fragment mit 877 Basenpaaren wird dien Xho I/Hinc II-Stelle von SK II&spplus; kloniert. Dieses Plasmid wird SK&spplus;HBe genannt, Fig. 1.

BEISPIEL 2

HERSTELLUNG VON SEQUENZEN UNTER ANWENDUNG DER PCR

A. SEQUENZSPEZIFISCHE MUTAGENESE VON HBVe/CORE- SEQUENZEN UNTER ANWENDUNG DER PCR

Das precore/core-Gen in Plasmid KS II&spplus; HBpc/c wird sequenziert, um zu bestimmen, ob die precore/core-codierende Region korrekt ist. Es wurde festgestellt, daß diese Sequenz eine Einbasenpaar-Deletion hat, die eine Rasterverschiebung bei Codon 79 verursacht, die zu zwei aufeinanderfolgenden TAG-Stopp-Codons im Raster bei Codon 84 und 85 führt, Fig. 2. Diese Deletion wird durch PCR-Überlappungsverlängerung (Ho et al., Gene 77: 51-59, 1989) der precore/core-codierenden Region im Plasmid SK&spplus; HBe korrigiert. Für die drei PCR-Reaktionen, die zur Korrektur der Deletion durchgeführt werden, werden vier Oligonucleotid-Primer eingesetzt.
Die erste Reaktion verwendet zwei Primer. Die Sinn-Primersequenz entspricht der Nucleotidsequenz 5 bis 27 des adw-Stamms und enthält zwei Xho I-Restriktionsstellen am 5'-Ende. Die Nucleotidsequenznumerierung wird von Genbank (Intelligenics, Inc. Mountain View, California) erhalten. (SEQUENZ ID NO: 1)
Die zweite Primersequenz entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz 2158 bis 2130 des adw-Stamms von Hepatitis B-Virus und enthält die Codons 79, 84 und 85. (SEQUENZ ID NO: 2)
Die zweite Reaktion verwendet zwei Primer. Der Sinn-Primer, der der Nucleotidsequenz 2130 bis 2158 des adw-Stamms entspricht, enthält die Codons 79, 84 und 85. (SEQUENZ ID NO: 3)
Der zweite Primer entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz aus dem SK&spplus;-Plasmid- Polylinker stromabwärts der Codons 84 und 85. (SEQUENZ ID NO: 4)
Die dritte Reaktion verwendet ebenfalls zwei Primer. Der Sinn-Primer, der der Nucleotidsequenz 5 bis 27 des adw.Stamms entspricht, enthält zwei Xho I-Restriktionsstellen am 5'-Ende. (SEQUENZ ID NO: 1)
Die zweite Primersequenz entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz aus dem SK&spplus;- Plasrmid-Polylinker stromabwärts von Codon 84 und 85. (SEQUENZ ID NO: 4)
Die erste PCR-Reaktion korrigiert die Deletion im Antisinn-Strang und die zweite Reaktion korrigiert die Deletion in den Sinn-Strängen. Die PCR-Reaktionen eins und zwei korrigieren die Mutation von CC in CCA, die in Codon 79 auftritt, und eine Basenpaar- Substitution von TCA in TCT in Codon 81 (siehe Fig. 2). Primer 1 enthält zwei aufeinanderfolgende Xho I-Stellen 10 bp stromaufwärts des ATG-Codons der HBVe- codierenden Regionen und Primer 4 enthält eine Cla I-Stelle 135 bp stromabwärts des Stopp-Codons der HBV-precore/core-codierenden Region. Die Produkte aus der ersten und zweiten PCR-Reaktion werden in einer dritten PCR-Reaktion verlängert, um eine vollständige HBV-precore/core-codierende Region mit der korrekten Sequenz (Fig. 3) zu bilden.
Die PCR-Reaktionen werden unter Verwendung der folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: Die Probe wird zuerst für 2 Minuten auf 94ºC erwärmt. Dieser Schritt, als Schmelzschritt bezeichnet, trennt die doppelsträngige DNA zur Synthese in Einzelstränge. Die Probe wird dann für 30 Sekunden bei 56ºC erwärmt. Dieser Schritt, als "Annealing"- Schritt bezeichnet, ermöglicht es, daß sich die Primer an die Einzelstrang-DNA, die im ersten Schritt produziert wurde, binden. Die Probe wird dann für 30 Sekunden bei 72ºC erwärmt. Dieser Schritt, als Verlängerungsschritt bezeichnet, synthetisiert den komplementären Strang der Einzelstrang-DNA, die im ersten Schritt produziert worden war. Es wird ein zweiter Schmelzschritt bei 94ºC für 30 Sekunden durchgeführt, worauf sich ein "Annealing"-Schritt bei 56ºC für 30 Sekunden anschließt, auf den ein Verlängerungsschritt bei 72ºC für 30 Sekunden folgt. Dieses Verfahren wird dann über 35 Zyklen durchgeführt, was zu einer Amplifikation des gewünschten DNA-Produktes führt.
Das PCR-Reaktionsprodukt wird durch Gel-Elektrophorese gereinigt und auf NA 45-Papier (Schleicher und Schuell, Keene, New Hampshire) transferiert. Das gewünschte 787 bp-DNA-Fragment wird durch 30-minütiges Inkubieren bei 65ºC in 40 ul Puffer mit hohem Salzgehalt (1,5 M NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 und 0,1 mM EDTa) aus dem NA 45-Papier eluiert. Nach der Elution werden 500 ul Phenol : Chloroform : Isoamylaklkohol (25 : 24 : 1) zu der Lösung gegeben. Das Gemisch wird verwirbelt und dann bei 14 000 Upm 5 Minutenlang zentrifugiert. Die wäßrige Lösung, die das gewünschte DNA- Fragment enthält, wird in ein frisches 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen übergeführt und es wird 1,0 ml 100%ige EtOH zugesetzt. Diese Lösung wird 5 Minuten lang auf Trockeneis inkubiert und dann 20 Minuten bei 10 000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und das Pellet wird mit 500 ul 70%igen EtOH gespült. Das Pellet wird durch Zentrifugieren bei 10 000 Upm unter Vakuum getrocknet und dann in 10 ul entionisiertem Wasser resuspendiert. 1 ul des PCR-Produkts wird durch 1,5% Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Das Xho I-Cla I-precore/core-PCR-amplifizierte Fragment mit 787 Basenpaaren wird in die Xho I-Cla I-Stelle von SK&spplus;-Plasmid kloniert. Dieses Plasmid wird SK&spplus;HBe-c bezeichnet. E. coli (DH5 alpha, Bethesda Research Labs., Gaithersburg, Maryland) wird mit dem SK&spplus;HBe-c-Plasmid transformiert und vermehrt, um Plasmid-DNA zu produzieren. Das Plasmid wird dann im wesentlichen, wie es von Birnboim et al. (Nuc. Acid Res. 7: 1513, 1979; siehe auch Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al.. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Press, 1989) beschrieben ist, isoliert und gereinigt. Das SK&spplus;HBe-c-Plasmid wird anylsiert, um die Sequenz des precore/core-Gens zu bestätigen, Fig. 4.

B. ISOLIERUNG DER HBV-CORE-SEQUENZ

Die Einbasenpaar-Deletion in Plasmid SK&spplus;HBe wird durch eine PCR- Überlappungsverlängerung korrigiert, wie es in Beispiel 2A beschrieben ist. Es werden Oligonucleotid-Primer für die PCR-Reaktionen, die zur Korrektur der Mutation durchgeführt werden, verwendet.
Die erste Reaktion verwendet zwei Primer. Der Sinn-Primer entspricht der Nucleotidsequenz für den T-7-Promotor von SK&spplus;HBe-Plasmid. (SEQUENZ ID NO: 5)
Der zweite Primer entspricht der Antisinn-Sequenz 2158 bis 2130 des adw-Stamms und enthält die Codons 79, 84 und 85. (SEQUENZ ID NO: 2)
Die zweite Reaktion verwendet zwei Primer. Der Antisinn-Primer entspricht der Nucleotidsequenz für den T-3-Promotor, der im SK&spplus;HBe-Plasmid vorliegt. (SEQUENZ ID NO: 6)
Der zweite Primer entspricht der Sinn-Nucleotidsequenz 2130 bis 2158 des adw- Stamms und beinhaltet die Codone 79, 84 und 85. (SEQUENZ ID NO: 3)
Die dritte Reaktion verwendet zwei Primer. Der Antisinn-Primer entspricht der Nucleotidsequenz für den T-3-Promotor, der im SK&spplus;HBe-Plasmid vorhanden ist. (SEQUENZ ID NO: 6)
Der zweiter Primer entspricht der Sinn-Sequenz des T-7-Promotors, der im SK&spplus;HBe-Plasmid vorliegt. (SEQUENZ ID NO: 7)
Das PCR-Produkt aus der dritten Reaktion liefert die korrekte Sequenz für die HBV-precore/core-codierende Region.
Um die HBV-core-codierende Region zu isolieren, wird ein Primer aufgebaut, um die Xho I-Restriktionsstelle stromaufwärts des ATG-Start-Codons der core-codierenden Region einzuführen; die 29 Aminosäure-Leadersequenz der HBV-precore-codierenden Region wird eliminiert. In einer vierten Reaktion wird die HBV-core-codierende Region unter Verwendung des PCR-Produktes aus der dritten Reaktion und den folgenden Primern produziert:
Die vierte Reaktion verwendet zwei Primer. Der Sinn-Primer entspricht der Nucleotidsequenz 1885 bis 1905 des adw-Stamms und enthält zwei Xho I-Stellen am 5'-Ende. (SEQUENZ ID NO: 8)
Der zweite Primer entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz für den T-3-Promotor, der im SK&spplus;HBe-Plasmid vorliegt. Das etwa 600 bp-PCR-Produkt aus der vierten PCR- Reaktion enthält die HBV-core-codierende Region und neue Xho I-Restriktionsstellen am 5'-Ende und Cla I-Restriktionsstellen am 3'-Ende, das in der Multiklonierungsstelle von SK&spplus;HBe-Plasmid vorhanden war. (SEQUENZ ID NO: 9)
Nach der vierten PCR-Reaktion wird die Lösung in ein frisches 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen übergeführt. 50 ul 3 M Natriumacetat werden zu dieser Lösung gegeben, danach werden 500 ul Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) zugesetzt. Das Gemisch wird verwirbelt und dann mit 14 000 Upm 5 Minuten zentrifugiert. Die wäßrige Phase wird in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen übergeführt und es wird 1,0 ml 100%iges EtOH zugesetzt. Diese Lösung wird bei -20ºC für 4, 5 Stunden inkubiert und dann mit 10 000 Upm 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und das Pellet wird mit 500 ul 70%igem EtOH gespült. Das Pellet wird durch Zentrifugation mit 10 000 Upm im Vakuum getrocknet und dann in 10 ul entionisiertem Wasser resuspendiert. Ein Mikroliter des PCR-Produktes wird durch Elektrophorese mit einem 1,5% Agarosegel analysiert.

C. AMPLIFIKATION VON IMMUNMODULATORISCHEM CO-FAKTOR IL-2

Jurkat-Zellen werden mit 1 · 10&sup6; Zellen/ml zu einem Gesamtvolumen von 158 ml in T75-Kolben resuspendiert. Zu 1% des Gesamtvolumens (1,58 ml insgesamt) wird Phytohämaglutin (PHA) gegeben, dann wird über Nacht bei 37ºC, 5% CO&sub2; inkubiert. Am folgenden Tag werden Zellen in drei 50 ml-Zentrifugenröhrchen geerntet. Die drei Pellets werden in 50 ml PBS zusammengegeben, 5 Minuten bei 3 000 Upm zentrifugiert und der Überstand wird abgegossen. Dieses Verfahren wird wiederholt. Poly A&spplus; mRNA wird unter Verwendung des Micro-Fast-Test-mRNA-Isolations-Kit, Version 1.2 (Invitrogen, San Diego, Californien), isoliert. Die isolierte intakte mRNA wird als Matrize zur Herstellung des ersten Strangs cDNA voller Länge durch den cDNA-CYCLE-Kit mit dem folgenden Primer verwendet.
Dieses Oligonucleotid entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz der IL-2 mRNA 25 Basenpaare stromabwärts des Stopp-Codons. (SEQUENZ ID NO: 20)
Das Produkt aus der reversen Transkriptionsreaktion wird in zwei getrennten Reaktionen amplifiziert. Die erste PCR-Amplifikation wird mit dem Sinn-Primer durchgeführt, der den drei bp stromaufwärts des ATG-Startcocons entspricht. Dieser Primer enthält eine Hind III-Stelle an seinem 5'-Ende und enthält die 5'-Region des offenen Leserasters von I1-2 einschließlich des ATG-Start-Codons. (SEQUENZ ID NO: 21)
Der Antisinn-Primer ist zu der 3'-Region des offenen Leserasters von IL-2 komplementär und beginnt drei bp stromabwärts des TGA-Stopp-Codons. Dieser Primer enthält eine Xho I-Stelle am 5'-Ende des Primers. (SEQUENZ ID NO: 22)
Das PCR-Produkt mit 467 bp aus der ersten PCR-Reaktion wird in das pCR-II- Plasmid ligiert, durch DNA-Sequenzierung verifiziert und als pCR II H-Xh IL-2 bezeichnet.
Das Produkt aus der reversen Transkriptionsreaktion wird in einer zweiten PCR- Reaktion amplifiziert. Die zweite PCR-Amplifikation wird mit dem Sinn-Primer durchgeführt, der den drei bp-stromaufwärts des ATG-Start-Codons entspricht. Dieser Primer enthält eine Xho I-Stelle an seinem 5'-Ende und enthält die 5'-Region des offenen Leserasters von II-2 einschließlich des ATG-Start-Codons. (SEQUENZ ID NO: 23)
Der Antisinn-Primer ist komplementär zu der 3'-Region des offenen Leserasters von IL-2 und beginnt drei bp stromabwärts der TGA-Stopp-Codons. Dieser Primer enthält eine Apa I-Stelle am 5'-Ende des Primers. (SEQUENZ ID NO: 24)
Das PCR-Produkt mit 467 bp aus der zweiten PCR-Reaktion wird in das pCR II- Plasmid ligiert, durch DNA-Sequenzierung verifiziert und in gefrorene kompetente E coli- Zellen transformiert. Dieses Vektorkonstrukt wird pCR II Hh-A IL-2 genannt.

D. AMPLIFIKATION VON IMMUNMODULATORISCHEM CO-FAKTOR B7/BB1 UNTER VERWENDUNG DER PCR

Raji-Zellen werden mit 1 · 10&sup6; Zellen/ml zu einem Gesamtvolumen von 158 ml in fünf T75-Kolben suspendiert und über Nacht bei 37ºC, 5% CO&sub2; inkubiert. Am folgenden Tag werden die Zellen in drei 50 ml-Zentrifugenröhrchen geerntet. Zellpellets werden in 50 ml PBS zusammengegeben, 10 Minuten bei 2000 Upm zentrifugiert und der Überstand wird dekantiert. Dieses Verfahren wird wiederholt. Poly A&spplus; mRNA wird wie in Beispiel 2E beschrieben isoliert. Die isolierte intakte mRNA wird als Matrize zur Herstellung eines ersten Strangs cDNA voller Länge verwendet, wobei der cDNA-CYCLE-Kit verwendet wird; daran schließen sich zwei getrennte PCR-Amplifikationsreaktionen, im wesentlichen so wie in Beispiel 2E beschrieben an. Das Nucleotid-Numerierungssystem wird von Freeman et al. (J. Immunol. 143: 2714-2722, 1989) erhalten.
Die erste PCR-Amplifikation wird mit zwei Primern durchgeführt. Der Sinn-Primer entspricht der Nucleotidsequenz 315 bis 353 von B7/BB1. Dieser Primer enthält die 5'- Region des B7/BB1-offenen Leserasters einschließlich des ATG-Start-Codons und hat zwei Hind III-Restriktionsstellen am 5'-Ende. (SEQUENZ ID NO: 25)
Der zweite Primer entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz 1187 bis 1149 von B7/BB1. Dieser Primer ist zur 3'-Region des B7/BB1-offenen Leserasters einschließlich des TAA-Stopp-Codons komplementär und enthält zwei Xho I-Restriktionsstellen am 5'-Ende. (SEQUENZ ID NO: 26)
Das PCR-Produkt mit 868 bp aus der ersten PCR-Reaktion wird in das pCR II- Plasmid ligiert, durch DNA-Sequenzierung verifiziert und in gefrorene kompetente E. coli- Zellen transformiert. Dieses Vektorkonstrukt wird PCR-II-H-Hh-B7/BB1 genannt und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die zweite PCR-Amplifikation wird mit zwei Primern durchgeführt. Der Sinn- Primer entspricht der Nucleotidsequenz 315 bis 353 von B7/BB1. Dieser Primer enthält die 5'-Region des B7/BB1-offenen Leserasters einschließlich des ATG-Start-Codons und hat zwei Xho I-Stellen an seinem 5'-Ende. (SEQUENZ ID NO: 27)
Der zweite Primer entspricht der Antinn-Nucleotidsequenz 1187 bis 1149 von B7/BB1. Dieser Primer ist zu der 3'-Region des B7/BB1-offenen Leserasters, die am TAA- Stopp-Codon endet, komplementär und enthält zwei Apa I-Restriktionsstellen am 5'-Ende. (SEQUENZ ID NO: 28)
Das 868 bp PCR-Produkt aus der zweiten PCR-Reaktion wird in das pCR II- Plasmid ligiert, durch DNA-Sequenzierung bestätigt und in gefrorene kompetente E. coli- Zellen transformiert. Dieses Vektorkonstrukt wird pCR II Xh-A-B7/BB1 genannt und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

E. SYNTHESE VON IMMUNMODULATORISCHEM CO-FAKTOR GM- CSF UNTER ANWENDUNG DER PCR

Die Synthese von GM-CSF wird nach dem Protokoll von Foguet und Lubbert (Biotechniques 13: 674-675, 1992) durchgeführt. Zehn überlappende Oligonucleotide werden in einer Länge von 53 bis 106 Nucleotiden synthetisiert. Das erste Oligonucleotid ist die Sinn-Sequenz von humanem GM-CSF von Nucleotidsequenz Nr. 29 bis 86, die zwei Hind III-Spaltungsstellen am 5'-Ende enthält. (SEQUENZ ID NO: 29)
Das zweite Oligonucleotid ist die Sinn-Sequenz von humanem GM-CSF aus den Nucleotidsequenz Nrn. 29 bis 86, die zwei Xho I-Stellen am 5'-Ende enthält. (SEQUENZ ID NO: 41)
Das dritte Oligonucleotid ist die Antisinn-Sequenz von humanem GM-CSF aus Nucleotidsequenz Nrn. 145 bis 70. (SEQUENZ ID NO: 30)
Das vierte Oligonucleotid ist die Sinn-Sequenz von humanem GM-CSF aus Nucleotid Nr. 131 bis 191. (SEQUENZ ID NO: 31)
Das fünfte Oligonucleotid ist die Antisinn-Sequenz von humanem GM-CSF aus Nucleotid Nr. 282 bis 176. (SEQUENZ ID NO: 32)
Das sechste Oligonucleotid ist die Sinn-Sequenz von humanem GM-CSF aus Nucleotid Nr. 256 bis 346. (SEQUENZ ID NO: 33)
Die siebte Oligonucleotidsequenz ist die Antisinn-Sequenz von humanem GM-CSF aus Nucleotid Nr. 331 bis 389. (SEQUENZ ID NO: 34)
Das achte Oligonucleotid ist die Sinn-Sequenz von humanem GM-CSF aus Nucleotid Nr. 372 bis 431. (SEQUENZ ID NO: 35)
Die neunte Oligonucleotidsequenz ist die Antisinn-Sequenz von humanem GM-CSF aus Nucleotid Nr. 520 bis 416, die am 5'-Ende zwei Xho I-Restriktionsstellen enthält. (SEQUENZ ID NO: 36)
Die neunte Oligonucleotidsequenz ist mit Oligonucleotid Nr. neun identisch, außer daß sie zwei Xba I-Restriktionsstellen am 5'-Ende anstelle von Xho I-Restriktionsstellen enthält. (SEQUENZ ID NO: 37)
Alle Oligonucleotide außer den Oligonucleotidsequenzen ID NO: 29, 36, 37 und 47 sind phosphoryliert. Eine Ligation wird durchgeführt, indem 8 umol jedes Oligonucleotids und 7,5 ul 10X Sequenase-Puffer (US Biochemical, Cleveland, Ohio) vermischt werden und mit sterilem destilliertem entionisiertem H&sub2;O auf eine Endvolumen von 75 ul verdünnt werden. Die Reaktion wird für 5 Minuten bei 70ºC, anschließend 5 Minuten bei 48ºC erwärmt. 2 ul dNTP-Gemisch (2,8 mM je dNTP) und 10 E Sequenase werden zugesetzt und das ganze wird für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Um die Sequenase zu inaktivieren wird die Ligationsreaktion 10 Minuten bei 70ºC erwärmt (Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Asubel et al., 8.2.8-8.2.13, 1988).
1 ul des Ligationsgemisches wird in einer PCR-Reaktion mit Vent-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) verwendet und die zwei Oligonucleotidsequenzen ID-NO: 29 und 36 werden als Primer eingesetzt. Das PCR-Produkt wird in den pCR II-Vektor ligiert und in gefrorene kompetente E. coli-Zellen transformiert. Dieses Konstrukt wird pCR II H-Xh GM-CSF genannt und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
1 ul des Ligationsgemisches wird in einer zweiten PCR-Reaktion mit Vent- Polymerase mit den zwei Oligonucleotidsequenzen ID NO: 47 und 37 als Primer eingesetzt.
Das PCR-Produkt wird in den pCR II-Vektor ligiert und in gefrorene kompetente E. coli- Zellen transformiert. Diese Konstrukt wird als pCR II Xh-Xb GM-CSF bezeichnet und durch DNA-Sequenzierung verifiziert.

F. ISOLIERUNG DES HBV-Pre-S2-OFFENEN LESERASTERS

Das Pre-S2-offene Leseraster (einschließlich S) wird mit zwei Primern und dem pAM6-Plasmid (ATCC Nr. 45020) PCR amplifiziert. Der Sinn-Primer entspricht den Nucleotiden 3178 bis 31 des adw-Stamms von Hepatitis B-Virus. Das 5'-Ende des Sinn- Primer enthält aufeinanderfolgende Xho I-Restriktionsstellen. Der Primer ist die 5'-Region des Pre-S2-offenen Leserasters und beinhaltet das ATG-Start-Codon. (SEQUENZ ID NO: 43)
Der zweite Primer entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz 907 bis 859 und enthält zwei Cla I-Stellen am 5'-Ende. Dieser Primer zur 3'-Region des Pre-Sz-offenen Leserasters komplementär. (SEQUENZ ID NO: 43)
Das 957 bp PCR-Produkt wird in das pCR II-Plasmid ligiert, durch DNA Sequenzierung verifiziert und als pCR II HB-Pre-S2 bezeichnet.

G. ISOLIERUNG DES OFFENEN LESERASTERS VON HBV- POLYMERASE

Die PCR-Amplifikation wird mit zwei Primern und dem pAM 6-Plasmid (ATCC 40202) durchgeführt. Der Sinn-Primer entspricht den Nucleotiden 2309 bis 2370 des adw- Stamms von Hepatitis B-Virus. Das 5'-Ende des Sinn-Primers enthält zwei aufeinanderfolgende Xho I Restriktionsstellen. Dieser Primer enthält auch Nucleotidänderungen, um so den Kozak-Regeln zur Translation zu entsprechen. (SEQUENZ ID NO: 44)
Der zweite Primer entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz 1645 bis 1594 und enthält zwei Cla I-Stellen am 5'-Ende. Dieser Primer ist zur 3'-Region des offenen Leserasters von Polymerase komplementär und enthält das TGA-Stopp-Codon. (SEQUENZ ID NO: 45)
Das 2564 bp-PCR-Produkt wird in das pCRII-Plasmid ligiert, durch DNA- Sequenzierung verifiziert und als pCR II HB-pol bezeichnet.

H. ISOLIERUNG DES OFFENEN LESERASTERS VON HBV ORF 5

Die PCR-Amplifikation wird mit zwei Primern und dem pAM 6-Plasmid (ATCC 45020) durchgeführt. Der Sinn-Primer entspricht den Nucleotiden 1432 bis 1482 des adw- Stamms von Hepatitis B-Virus. Das 5'-Ende des Sinn-Primers enthält zwei aufeinanderfolgende Xho I-Restriktionsstellen. Der Primer enthält auch Nucleotid-Änderungen, um den Kozak-Regeln zur Translation zu entsprechen. (SEQUENZ ID. NO: 46)
Der zweite Primer entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz 1697 bis 1648 und enthält zwei Cla I-Stellen am 5'-Ende. Dieser Primer ist zur 3'-Region des offenen Leserasters ORF 5 komplementär und beinhaltet das TAA-Stopp-Codon. (SEQUENZ ID NO: 47)
Das PCR-Produkt mit 293 bp wird in das pCR II-Plasmid ligiert, durch DNA- Sequenzierung verifiziert und als pCR II BH-ORF 5 bezeichnet.

I. ISOLIERUNG DES OFFENEN LESERASTERS HBV-ORF 6

Die PCR-Amplifikation wird mit zwei Primern und dem pAM 6-Plasmid (ATCC 45020) durchgeführt. Der Sinn-Primer entspricht den Nucleotiden 1844 bis 1788 des adw- Stamms von Hepatitis B-Virus. Das 5'-Ende des Sinn-Primers enthält zwei aufeinanderfolgende Xho I-Restriktionsstellen. Der Primer enthält auch Nucleotidänderungen, um den Kozak-Regeln zur Translation zu entsprechen. (SEQUENZ ID NO: 48)
Der zweite Primer entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz 1188 bis 1240 und enthält zwei Cla I-Stellen am 5'-Ende. Dieser Primer ist zur 3'-Region des ORF 6-offenen Leserasters komplementär und beinhaltet TAA. (SEQUENZ ID NO: 49)
Das 687 bp PCR-Produkt wird in das pCR II-Plasmid ligiert, durch DNA- Sequenzierung nach gewiesen und als pCR II HB-ORF 6 bezeichnet.

BEISPIEL 3

A. HERSTELLUNG DES RETROVIRALEN GRUNDGERÜSTS KT-3

Das EcoR I-EcoR I-Fragment der 5'-langen terminalen Wiederholungen (LTR) des Moloney-murinen-Leukämie-Virus (MoMLV) einschließlich gag-Sequenzen aus dem N2- Vektor (Armentano et al., J. Vir. 61: 1647-1650, 1987; Eglitas et al., Science 230: 1395- 1398, 1985) wird in das Plasmid SK&spplus; (Stratagene, La Jolla, Californien) ligiert. Das resultierende Konstrukt wird N2R5 genannt. Das N2R5-Konstrukt wird durch eine auf eine Stelle gerichtete in vitro-Mutagenes mutiert, um das ATG-Start-Codon in ATT zu ändern, was eine gag-Expression verhindert. Dieses mutagenisierte Fragment ist 200 Basenpaare (bp) lang und wird von Pst I-Restriktionsstellen flankiert. Das Pst I-Pst I-mutierte Fragment wird vom SK&spplus;-Plasmid gereinigt und in die Pst I-Stelle der N2 MoMLV 5'-LTR in Plasmid pUC31 insertiert, um das nicht-mutierte 200 bp-Fragment zu ersetzen. Das Plasmid pUC31 stammt aus pUC19 (Stratagene, La Jolla, Californien), in das zusätzliche Restriktionsstellen Xho I, Bgl II, BssH II und Nco I zwischen die EcoR I und Sac I-Stelle des Polylinkers insertiert sind. Dieses Konstrukt wird pUC31/N2RSgM bezeichnet.
Ein MoMLV-3'-LTR-EcoR I-Eco R I-Fragment mit 1,0 Kilobasen (Kb) aus N2 wird in Plasmid S&spplus; kloniert, was zu einem Konstrukt führt, das N2R3&supmin; genannt wird. Ein 1,0 Kb Cla I-Hind III-Fragment wird aus diesem Konstrukt gereinigt. Das Cla I-Cia I- dominante selektierbare Markergen-Fragment aus dem retroviralen Vektor pAFVXM (Kriegler et al., Cell 38; 473, St. Louis et al., PNAS 83: 3150-3154, 1988), der einen SV40- frühen Promotor umfaßt, welcher die Expression des Neomycinphosphotransferase-Gens steuert, wird in das SK&spplus;-Plasmid kloniert: Aus dem SK&spplus;-Plasmid wird ein 1,3 Kb Cla I- BstB I-Genfragment gereinigt.
Der Expressionsvektor wird durch eine Ligation in drei Teilen konstruiert, wobei das Xho I-Cla I-Fragment, das das interessierende Gen enthält, und das 1,2 Kb MoMLV-3'- LTR-Cla I-Hind III-Fragment in die Xho I-Hind III-Stelle des pUC31/N2R5gM-Plasmids insertiert werden. Das 1,3 Kb Cla I-BstB I-neo-Gen-Fragment aus dem retroviralen Vektor pAFVXM wird dann in Sinn-Orientierung in die Cla I-Stelle dieses Plasmids insertiert.

B. HERSTELLUNG DER RETROVIRALEN GRUNDGERÜSTS KT-1

Der KT-1-retrovirale Grundgerüst-Vektor wird im wesentlichen wie es für KT-3 in Beispiel 3A beschrieben ist, konstruiert, mit der Ausnahme, daß das dominante selektierbare Markergen, neo, nicht in den Expressionsvektor insertiert wird.

BEISPIEL 4

KONSTRUKTION VON RETROVIRUSVEKTOREN

A. KONSTRUKTION VON HEPATITIS B-VIRUS e-c RETRO- VIRUSVEKTOR

Das 787 bp Xho I-Cla I-Fragment aus SK&spplus;HBe-c, Beispiel 2A, wird dann in die Xho I- und Cla I-Stelle des KT-3-Retrovektor-Grundgerüsts ligiert. Dieses Konstrukt wird KT-HBe-c genannt.

B. KONSTRUKTION VON HEPATITIS B-VIRUS-CORE-RETROVIRUS- VEKTOR

Das PCR-Produkt aus Beispiel 2B, etwa 600 bp lang wird mit Xho I- und Cla I- Restriktionsendonuclease abgebaut, einer Elektrophorese an 1,5% Agarosegel unterworfen, dann wird die DNA durch Geneclean II (Bio 101, Vista, Californien) aus der Gel-Schicht gereinigt. Dieses Xho I-Cla I-HBV-core-PCR-Produkt wird in die Xho I- und Cla I-Stellen des KT-3-Retrovirus-Grundgerüsts insertiert. Das Konstrukt wird KT-HBc genannt.
Das HBV-core-Fragment (Xho I-Cla I) aus KT-HBc wird in die jeweiligen Stellen von pBluescript KS&spplus; II (Stratagene, La Jolla, Californien) insertiert. Dieses Konstrukt wird KS&spplus; II-HBc genannt und wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

C. KONSTRUKTION VON HEPATITIS B-VIRUS-Pre-S2-RETROVIRUS- VEKTOR

Das Xho I-Cla I-Fragment aus PCR II-Pre-S2 wird ausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen die KT3-Grundgerüsts insertiert. Dieses Konstrukt wird KT-HB- Pre-S2 genannt.

D. KONSTRUKTION VON HEPATITIS B-VIRUS-POLYMERASE-RETRO- VIRUSVEKTOR

Das Xho I-Cla I-Fragment aus pCR II-HB-pol wird ausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen des KT3-Grundgerüsts insertiert. Dieses Konstrukt wird KT-HB-pol genannt.

E. KONSTRUKTION VON HEPATITIS-B-VIRUS-ORF 5-RETRO- VIRUSVEKTOR

Das Xhö I-Cla I-Fragment aus pCR II-HB-ORF-5 wird ausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen des KT3-Grundgerüsts insertiert. Dieses Konstrukt wird KT-HB- ORF 5 genannt.

F. KONSTRUKTION VON HEPATITIS B-VIRUS-ORF 6-RETRO- VIRUSVEKTOR

Das Xho I-Cla I-Fragment aus pCR II-HB-ORF-6 wird ausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen des KT3-Grundgerüsts insertiert. Dieses Konstrukt wird KT-HB- ORF 6 genannt.

BEISPIEL 5

KONSTRUKTION EINES MEHRWERTIGEN RETROVIRUSVEKTOR

A. KONSTRUKTION VON HEPATITIS B-e/GM-CSF-RETRO- VIRUSVEKTOR

i. MEHRWERTIGER RETROVIRUSVEKTOR MIT IRBS

pGEM 5Z&spplus;BIP 5' (Peter Sarnow, University of Colorado, Health Sciences Center, Denver, humanes Immunglobulin-Schwere Kette-bindendes Protein) wird mit Sac I und Sph I abgebaut. Das 250 bp-BIP-Fragment wird durch Elektrophorese an 1,5% Agarose- Gel isoliert und in die entsprechenden Stellen pSP72 subkloniert. Das Vektorkonstrukt wird pSP72BIP genannt.
Das Hind III-Xho I-GM-CSF-Fragment wird aus pCR II-H-Xh-GM-CSF ausgeschnitten und in die Hind III-Xho. I-Stellen von pSP72-BlP subkloniert. Dieses Konstrukt wird pSP72-BIP-GM-CSF genannt.
Das Konstrukt pSP72-BIP-GM-CSF wird an der Xho I-Stelle gespalten und mit Klenow-Fragment geglättet, worauf eine Spaltung mit Cla I folgt. Das KT-1-Gerüst wird durch Cla I gespalten und mit Klenow-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Xho I-Restriktionsendonuclease anschließt. In einer dreiteiligen Ligation wird das Xho I- Cla I-Fragment aus SK&spplus;-HBe-c, Beispiel 2A, und das Cla I-geglättete Xho I-BIP-GM-CSF- Fragment in die Xho I-geglätteten Cla I-Stellen des KT-1-Retrovirus-Grundgerüstes ligiert. Dieses Konstrukt wird KT-HBe-c/BIP-GM-CSF genannt.

ii. MEHRWERTIGER RETROVIRUSVEKTOR MIT CMV-PROMOTOR

Das 4,7 Kb CMV-EnvR-Pst-RI-Fragment wird aus pAF/CMV/EnvR (US-Patentanmeldung Nr. 0,7/395 932) isoliert und in die Pst I- und Eco RI-Stelle von pUC 18 insertiert. Dieses Konstrukt wird pUC 18-CMV-EnvR genannt.
HIV-1-IIIB-CAR wird in ein Sau-3A-Fragment aus pAG/CMV/EnvR in die BamH I-Stelle von pBluescript II KS&spplus; (Stratagene, La Jolla, Californien) subkloniert, wobei pBluescript II KS&spplus;/CAR erhalten wird. Das CAR-Fragment wird aus pBluescript II-KS&spplus;/CAR als eine Xba I-Cla I-Fragment ausgeschnitten. Das Xho I-Xba I-HIV-1-IIIBgag/pol-Fragment wird aus SK&spplus;-gag/pol-SD-delta (US-Patentanmeldung Nr. 07/395 932) ausgeschnitten. Das Plasmidgrundgerüst, das den CMV-Promotor enthält, wird aus pUC17- CMV/EnvR mit Xho I und Cla I ausgeschnitten. In einer dreiteiligen Ligation wird das Xho I-Xba I-HIV-IIIB-gag-pol-Fragment und das Xba I-Cla I-CAR-Fragment in die Xho I- Cla I-Stellen des pUC 18-CMV/EnvR-Grundgerüsts insertiert, um pUC18-CMV- gag/pol/CAR zu bilden.
Das Hind III-Xho I-Fragment, das den CMV-IE-Promotor aus pUC-18-CMV- gag/pol/CAR enthält, wird in die entsprechenden Stellen von pCDNA II subkloniert. Diese Konstrukt wird pCDNA II-CMV genannt.
Das Xho I-XbaI-GM-CSF-PCR-Produkt wird aus dem pCR II-Xh-Xb-GM-CSF- subkloniert und in die jeweiligen Stellen in pCDNA II-CMV insertiert. Dieses Konstrukt wird pCDNA II-CMV-GM-CSF genannt.
Das pCDNA-II-CMV-GM-CSF-Konstrukt wird an der Xba I-Stelle gespalten, durch Klenow-Gruppe geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Hind III anschließt. Das KT-1- Grundgerüst wird durch Cla I gespalten und mit Klenow-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Xho I anschließt. In einer dreiteiligen Ligation wird das Xho I-Hind III- Fragment aus SK&spplus;HBe-c, Beispiel 2A, und das Hind III-geglättete Xba I-CMV-GM-CSF- Fragment in die Xho I-geglätteten Cla I-Stellen des KT-1-Retrovirus-Grundgerüstes ligiert. Dieses Vektorkonstrukt wird KT-HBe-c/CMV-GM-CSF genannt.

B. KONSTRUKTION VON HEPATITIS C-CORE/IL-2-RETROVIRUS- VEKTOR

i. MEHRWERTIGER RETROVIRUSVEKTOR MIT IRBS

Die Hind III-Xho I-IL-2-Sequenz wird aus pCR II-H-Xh-IL-2 ausgeschnitten und in die Hind III-Xho I-Stellen von pSP72-BIP subkloniert. Dieses Konstrukt wird pSP72-BIP- IL-2 genannt. die Xho I-Hind III-Hepatitis C-Virus-core-Sequenz, Beispiel 2C, wird aus pCRII-Xh-H-HCV-C-core ausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen von pSP72 subkloniert. Dieses Konstrukt wird pSP72-Xh-H-HCV-core genannt.
Das Konstrukt pSPO72-BIP-IL2 wird an der Xho I-Stelle gespalten, durch Klenow- Fragment geglättet, anschließend EcoR I gespalten. das Xho I-EcoR I-HCV-core-Fragment wurde aus pSP72-Xh-H-HCV-core isoliert. Das KT-1-Grundgerüst wird durch Cla I gespalten und mit Klenov-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Xho I anschließt. In einer dreiteiligen Ligation wird das Xho I-Eco RI-HCV-Fragment und das EcoR I-geglättete Xho I-BIP-IL2-Fragment in die Xho I-geglätteten Cla-I-Stellen des KT-1-Xho I-BIP-IL2-Fragment in die Xho I-geglätteten Cla I-Stellen des KT-1-Retrovirus- Grundgerüsts ligiert. Diese Vektorkonstrukt wird KT-HCV-core/BIP-IL2 genannt.

ii. MEHRWERTIGER RETROVIRUSVEKTOR MIT CMV-PROMOTOR

Das Xho I-Apa I-IL-2-Fragment wird aus pCR II-Xh-A-IL-2 ausgeschnitten und iri die entsprechenden Stellen des pCDNA II-CMV-Promotors subkloniert. Dieses Konstrukt wird pCDNA II-CMV-IL-2 genannt.
Das KT-1-Grundgerüst wird durch Cla I gespalten und mit Klenow-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Xho I anschließt. Das Konstrukt pCDNA II-CMV- IL-2 wird an der Apa I-Stelle gespalten, mit Klenow-Fragment geglättet und anschließend mit Hind III-Restriktionsendonuclease abgebaut. In einer dreiteiligen Ligation werden das Xho I-Hind III-HCV-core-Fragment aus dem pCR II-Xh-H-HCV-core und das Hind IIIgeglättete Apa I-CMV-IL-2-Fragment in die Xho I-geglätteten Cla I-Stellen des KT-1- Retrovirus-Grundgerüsts ligiert. Dieses Vektorkonstrukt wird KT-HCV-Kern/CMV-IL-2 genannt.

C. KONSTRUKTION VON HEPATITIS B-CORE/B7/BB1-RETRO- VIRUSVEKTOR

i. MEHRWERTIGER RETROVIRUSVEKTOR MIT IRBS

Die Hind III-Xho I-B7/BB1-Sequenz wird aus pCR II-H-Xh-B7/BB1 ausgeschnitten und in die Hind III-Xho I-Stellen von pSP72-BIP subkloniert. Dieses Konstrukt wird pSP72-H-Xh-BIP-B7/BB1 genannt.
Das Konstrukt pSP72-H-Xh-BIP-B7/BB1 wird an der Xho I-Stelle gespalten, mit Klenow-Fragment geglättet und anschließend Cla I gespalten. Das Xho I-Cla I-HBV-core- Fragment wird aus dem KS II&spplus;-HBV-Kern, Beispiel 5B, isoliert. Das KT-1-Grundgerüst wird durch Cla I gespalten und mit Klenow-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Xho I anschließt. In einer dreiteiligen Ligation wird das Xho I-Cla I-HBV-core- Fragment und Cla I-geglättete Xho I-BIP-B7/BB1-Fragment in die Xho I-geglätteten Cla I- Stellen des KT-1-Retrovirus-Grundgerüst ligiert. Diese Vektorkonstrukt wird KG-HBV- Kern/BIP-B7/BB1 genannt, Beispiel 7.

ii. MEHRWERTIGER RETROVIRUSVEKTOR MIT CMV-PROMOTOR

Die Xho I-Apa I-B7/BB1-Sequenz wird aus pCR II-Xh-A-B7/BB1 ausgeschnitten und die entsprechenden Stellen des pCDA II-CMV-Promotors subkloniert. Dieses Konstrukt wird pCDNA II-CMV-B7/BB1 genannt.
Das KT-1-Grundgerüst wird durch Cla I gespalten und mit Klenow-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Xho I anschließt. Da Konstrukt pCDNA II-CMV- B7/BB1 wird an der Apa I-Stelle gespalten, mit Klenow-Fragment geglättet und anschließend mit Hind III-Restriktionsendonuclease gespalten. In einer dreiteiligen Ligation wird das Xho I-Hind III-HBV-core-Fragment aus dem KSII&spplus;-HBV-core und das Hind III- geglättete Apa I-CMV-B7/BB1-Fragment in die Xho I-geglätteten Cla I-Stellen des KT-1- Retrovirus-Grundgerüst ligiert. Dieses Vektorkonstrukt wird KT-HBV-Kern/CMV-B7/BB1 genannt.

D. KONSTRUKTION VON HEPATITIS B-e/HEPATITIS C-CORE- RETROVIRUSVEKTOR

i. MEHRWERTIGER RETROVIRUSVEKTOR MIT IRBS

Das Hind III-Xho I-HCV-core-PCR-Produkt wird aus dem pCR II-H-Xh-HCV-core, Beispiel 2C, subkloniert und in die entsprechenden Stellen pSP72-BIP insertiert. Das Konstrukt wird pSP72-BIP-HCV-core genannt.
Das Konstrukt pSP72-BIP-HCV-core wird an der Xho I-Stelle gespalten, mit Klenow-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Cla I anschließt. Das KT-1- Grundgerüst wird durch Cla I gespalten und mit Klenow-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Xho I anschließt. In einer dreiteiligen Ligation wird das Xho I-Cla I- HBV-e-Fragment aus SK&spplus;-HBe-c, Beispiel 2A und das Cla I-geglättete Xho I-BIP-HCV- core-Fragment in die Xho I-geglätteten Cla I-Stellen des KT-1-Retrovirus-Grundgerüsts ligiert. Dieses Vektorkonstrukt wird KT-HBV-e/BIP-HCV-core genannt.

ii. MEHRWERTIGER RETROVIRUSVEKTOR MT CMV-PROMOTOR

Das Xho I-Xba I-HCV-core-Fragment aus dem pSP72-Xh-H-HCV-core (Beispiel 6B i) wird in die entsprechenden Stellen des pCDNA II-CMV-Plasmids insertiert. Dieses Konstrukt wird pCDNA II-CMV-HCV-core genannt.
Das Konstrukt cCDNA II-CMV-HCV-core wird an der Xba I-Stelle gespalten, mit Klenow-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Hind III anschließt. Das KT-1- Grundgerüst wird durch Cla I gespalten und mit Klenow-Fragment geglättet, worauf sich eine Spaltung mit Xho I anschließt. In einer dreiteiligen Ligation wird die Xho 1-Hind III- HBV-e-Sequenz aus SK&spplus;HBe-c, Beispiel 2A, das Hind III-geglättete Xba I-CMV-HCV- core-Fragment in die Xho I-geglätteten Cla I-Stellen des KT-1-Retrovirus-Grundgerüsts ligiert. Dieses Vektorkonstrukt wird KT-HBVe/CMV-HCV-core genannt.

BEISPIEL 6

TRANSIENTE TRANSFEKTION UND TRANSDUKTION DER VER- PACKUNGSZELLINIEN HX UND DA

A. PLASMID-DNA-TRANSFEKTION

DX-Zellen (WO92/05266) werden mit 5 · 10&sup5; Zellen am Tag 1 mit Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (OMEM) und 10% fötalem Rinderserum (FBS) in eine 10 cm-Gewebekulturschale gesät. Am Tag 2 wird das Medium durch 5,0 ml frisches Medium 4 Stunden vor einer Transfektion ersetzt. Es wird eine Standard-Calciumphosphat- DNA-Co-Präzipitation durchgeführt, indem 40,0 ul 2,5 M CaCl&sub2;, 10 ug Plasmid-DNA und entionisiertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 400 ul vermischt werden. 400 ul der DNA-CaCl&sub2;-Lösung wird tropfenweise unter ständigem Rühren zu 400 ul Präzipitationspuffer (50 mM HEPES-NaOH, pH 7,1; 0,25 M NaCl und 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4;-NaH&sub2;PO&sub4;) gegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das resultierende feine Präzipitat wird in eine Kulturschale mit Zellen gegeben. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC mit dem DNA-Präzipitat inkubiert. Am Tag 3 wird das Medium abgesaugt und es wird frisches Medium zugesetzt. Der Überstand, der das Virus enthält, wird am Tag 4 entfernt, durch ein 0,45 u-Filter geführt und zur Infektion der DA-Verpackungszellinie, murinen Fibroblasten verwendet oder bei -80ºC gelagert.

B. VERPACKUNGSZELLINIEN-TRANSDUKTION

DA (WO92/05266)-Zellen wurden mit 5 · 10&sup5; Zellen/10 cm Gewebekulturschalen in 10 ml DMEM und 10% FBS, 4 ug/ml Polybren (Sigma, St. Louis, Missouri) am Tag 1 gesät. Am Tag werden 3,0 ml, 1,0 ml und 0,2 ml frisch gesammeltes, Virus-enthaltendes DX-Medium zu den Zellen gegeben. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC mit dem Virus inkubiert. Am Tag 3 wird das Medium entfernt und es werden 1 ml DMEM; 10% FBS in 800 ug/ml G418 zu der Platte gegeben. Nur die Zellen, die mit dem Vektor transfiziert wurden und den selektierbaren Neo-Marker enthalten; werden überleben. Ein G418- resistenter Pool wird über einen Zeitraum von einer Woche gebildet. Der Pool wird wie beschrieben auf Expression untersucht (Beispiel 10). Der Zellen-Pool wird verdünnungskloniert, indem die Zellen von der Platte entfernt weiden und die Zellen in der Suspension gezählt werden, wobei die Zellsuspension bis auf 10 Zellen/ml verdünnt wird und 0,1 ml zu jeder Vertiefung (1 Zelle/Vertiefung) einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben wird. Die Zellen werden 14 Tage lang bei 37ºG, 10% CO&sub2; inkubiert. 24 Klone werden selektiert und auf Platten mit 24 Vertiefungen, Platten mit 6 Vertiefungen, dann auf 10 cm-Platten verteilt, als die Klone auf Expression untersucht werden; die Überstände werden gesammelt und auf Virus-Titer untersucht.
Der Titer der einzelnen Klöne wird durch Infektion von HT1080-Zellen, humane Fibroblasten-Zellinie ATCC CCL 121 bestimmt. Am Tag 1 werden 5 · 10&sup5; HT1080-Zellen in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 6 Vertiefungen in 3,0 ml DMEM, 10% FBS und 4 ug/ml Polybren plattiert. Der Überstand aus jedem Klon wird 10-fach reihenverdünnt und zur Infektion der HT1080-Zellen in 1,0 ml Aliquots verwendet. Die Zellen werden mit dem Vektor über Nacht bei 37ºC, 10% CO&sub2; inkubiert und das Medium wird am Tag 2 durch frisches DMEM, 10% FBS-Medium ersetzt. Am Tag 3 wird die Selektion von transduzierten Zellen durchgeführt, indem da Medium durch frisches DMEM-10% FBS- Medium, das 800 ug/ml G418 enthält, ersetzt wird. Zellen werden für 14 Tage bei 37ºC, 10% CO&sub2; inkubiert, wobei G418-resistente Kolonien beurteilt wurden, um den viralen Titer jedes Klons als kolonienbildende Einheiten/ml (kbE/ml) zu bestimmen.
Unter Verwendung dieser Verfahren kann gezeigt werden, daß die Titer der HBVcore- und HBVe-Producer-Zellinien wie folgt sind:
DAcore-1 8 · 10&sup5; kbE/ml
DAcore-10 1 · 10&sup6; kbE/ml
DAHBe 4-7 3 · 10&sup6; kbE/ml
Die Verpackungszellinie HX, WO 92/05266, wird mit Vektor, der von der DA- Vektor-produzierenden Zellinie gebildet wird, in der gleichen Weise wie zur Transduktion der DA-Zellen aus DX-Überstand beschrieben transduziert.
Zur Transduktion der DA (WO 92/05266)-Zellen mit einem mehrwertigen Vektor, dem ein selektierbarer Neo-Marker fehlt, wird das Infektionsverfahren, wie es oben beschrieben wird, verwendet. Allerdings anstelle des Zusetzens von G418 zu den Zellen am Tag 3 werden die Zellen durch limitierende Verdünnung, wie oben erläutert wurde, kloniert. 50 Klone werden zur Expression, wie es oben erläutert wurde, ausgebreitet und der Titer wird, wie in Beispiel 8 beschrieben, bestimmt.

BEISPIEL 7

NACHWEIS VON REPLIKATIONS-KOMPETENTEN RETROVIREN

Der Extended-S&spplus;L&supmin;Assay bestimmt, ob ein Replikations-kompetentes, infektiöses Virus im Überstand der interessierenden Zellinie vorhanden ist. Der Assay basiert auf der empirischen Beobachtung, daß infektiöse Retroviren bei der Indikatorzellinie MiCl&sub1; (ATCC CCL 64.1) Foci erzeugen. Die MiCl&sub1;-Zellinie ist von der Mv1Lu-Nerz-Zellinie (ATCC CCL 64) durch Transuktion mit murinem Sarcoma-Virus (MSV) abgeleitet. Es handelt sich um einen Nicht-Producer-, nicht-transformierten, revertanten Klon, der ein murines Sarcoma-Provirus enthält, welches Sarcom (S&spplus;) bildet, was das Vorliegen des MSV-Genoms anzeigt, das aber keine Leukämie (L&supmin;) verursacht, was das Fehlen eines replikationskompetenten Virus anzeigt. Eine Infektion von MiCl&sub1;-Zellen mit replikationskompetenten Retrovirus "aktiviert" das MSV-Genom unter Auslösung einer "Transformation", was zu Foci-Bildung führt.
Von der Zellinie, die auf Vorliegen von replikationskompetentem Retrovirus zu testen ist, wird Überstand entfernt und durch ein 0,45 um-Filter geführt, um Zellen zu entfernen. Am Tag 1 werden Mv1Lu-Zellen mit 1 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung (eine Vertiefung pro zu testende Probe) in 2 ml DMEM, 10% FBS und 8 ug/ml Polypren in eine Platte mit 6 Vertiefungen gesät. Mv1Lu-Zellen werden in der gleichen Weise in getrennte Platten mit 6 Vertiefungen als positive und negative Kontrollen plattiert. Die Zellen werden über Nacht bei 37ºC, 10% CO&sub2; inkubiert. Am Tag 2 wird 1,0 ml Testüberstand zu den Mv1Lu-Zellen gegeben. Die Platten, die als negative Kontrolle dienen, werden mit 1,0 ml Medium inkubiert. Die positiven Kontrollen bestehen aus drei Verdünnungen (200 Focusbildende Einheiten (fbE), 20 fbE und 2 fbE jeweils in 1,0 ml Medium) des MA-Virus (Miller et al., Molec. and Cell. Biol. 5: 431-437, 1985), das zu den Zellen in den Vertiefungen der positiven Kontrolle gegeben wird. Die Zellen werden über Nacht inkubiert. Am Tag 3 wird das Medium abgesaugt und es werden 3,0 ml frisches DMEM mit 10% FBS den Zellen zugesetzt. Die Zellen werden zur Konfluenz wachsen gelassen und am Tag 6 und Tag 10 1 : 10 aufgeteilt, wobei replikationskompetentes Retrovirus amplifiziert wird. Am Tag 13 wird das Medium über den Mv1Lu-Zellen abgesaugt und es werden 2,0 ml DMEM und 10%iges FBS zu den Zellen gegeben. Zusätzlich werden die MiCl&sub1;-Zellen mit 1 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung in 2,0 ml DMEM, 10 FBS und 8 ug/ml Polybren gesät. Am Tag 14 wird der Überstand der Mv1Lu-Zellen in die entsprechende Vertiefung der MiCl&sub1;-Zellen übergeführt und das ganze wird über Nacht bei 37ºC, 10% CO&sub2; inkubiert. Am Tag 15 wird das Medium abgesaugt und es werden 3,0 ml frisches DMEM und 10% FBS zu den Zellen gegeben. Am Tag 21 werden die Zellen unter dem Mikroskop in 10-facher Vergrößerung auf Fokus-Bildung auf der Zell-Monolayer untersucht (Auftreten von Anhäufungen brechender Zellen, die die Monolayer überwachsen und daran haften bleiben). Es wird festgelegt, daß der Testgegenstand mit dem repliationskompetenten Retrovirus kontaminiert ist, wenn Foci auf den MiCl&sub1;-Zellen auftreten.
Unter Verwendung dieser Verfahren kann gezeigt werden, daß die HBV-core- Producer-Zellinien DA-core-1, DA-core-10 und die HBVe-Producer-Zellinie DA-HBe-4-7 nicht mit replikationskompetenten Retroviren kontaminiert sind.

BEISPIEL 8

TITERBESTIMMUNG VON MEHRWERTIGEN VEKTOREN

Da die mehrwertigen Vektoren keine selektierbaren Marker wie z.B. das Neomycin- Gen enthalten, wird ein anderer Weg der Titerbestimmung des Vektors beschrieben. Spezifischer ausgedrückt, 1,0 ml Vektorüberstand wird 5-fach zu einer Endverdünnung von 10&supmin;&sup9; ml verdünnt. 1 ml jeder Verdünnung wird dann eingesetzt, um 5 · 10&sup5; HT1080-Zellen (ATCC Nr. CCL 121) im wesentlichen wie in Beispiel 7B beschrieben, zu transduzieren. Allerdings anstatt G418 zuzusetzen, wird DNA 7 Tage später aus jeder Schale extrahiert, wie es von Willis (J. Biol. Chem. 259: 7842-7849, 1984) beschrieben wurde. HBV-e/core wird durch PCR amplifiziert, wobei die folgenden PCR-Primer verwendet werden, die von Genset (Paris, Frankreich) erhalten wurden.
Die PCR-Amplifikation für HBV-e/core wird mit Sinn-Primer durchgeführt, welcher der Nucleotidsequenz 1865 bis 1889 des adw-Klons entspricht. (SEQUENZ ID NO: 38)
Dieser Primer entspricht der Antisinn-Nucleotidsequenz 2430 bis 2409 des adw- Klons. (SEQUENZ ID NO: 39)
Die Sondensequenz, die verwendet wurde, um das Vorliegen des gewünschten PCR-Produkts zu bestätigen, entspricht der Nucleotidsequenz 1926 bis 1907 des adw- Stamms des Hepatitis B-Virus. (SEQUENZ ID NO: 40)
Die PCR-Produkte werden durch Southern-Blot-Analyse mit den geeigneten ³²Pmarkierten Sonden (Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) analysiert. Ein Signal wird bei allen niedrigeren Verdünnungen erwartet und nimmt schrittweise bei höheren Verdünnungen ab. Die letzte Verdünnung, bei der ein Signal sichtbar ist, liefert die infektiöse E/ml Vektor.

BEISPIEL 9

A. TRANSDUKTION VON MURINEN ZELLEN MIT VEKTOR- KONSTRUKT

Die murinen Fibroblasten-Zellinien BCIOME (ATCC Nr. TIB85), B16 und L-M(TK) (ATCC Nr. CCL 1.3) werden in DMEM, enthaltend 4500 mg/l Glucose, 584 mg/l L-Glutamin (Irvine Scientific, Santa Ana, Californien) und 10% fötales Rinderserum (BFS) (Gemini, Calabasas, Californien) wachsen gelassen.
Die BC10ME, -B16- und L-M(TK&supmin;)-Fibroblasten-Zellinien werden jeweils mit 1 · 10&sup5; Zellen in eine 10 cm-Schale in DMEM, 10% FBS und 4 ug/ml Polybren plattiert. Jede wird mit 1,0 ml des retroviralen Vektors, der einen Vektortiter von etwa 10&sup5; kbE/ml hat, transduziert. Klone werden in DMEM, 10% FBS und 800 ug/ml G4 18, wie es in Beispiel 6B beschrieben ist, selektiert.
Die EL4 (ATCC Nr. TIB 39)-Zellen und die E14/A2/Kb-Zellen (Sherman, L. Scripps, Institute, San Diego, Californien) werden durch Co-Kultur mit den DA-Producerzellen transduziert. Spezifischer ausgedrückt, 1,0 · 10&sup6; EL4-Zellen oder 1 · 10&sup6; EL4/A2/Kb werden zu 1 · 10&sup6; bestrahlten (10 000 rad) DA (Vektortitier etwa 10&sup5; bis 10&sup6;)- Producer-Zellen in RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, Californien), 10% FBS und 4 ug/ml Polybren (Sigma, St. Louis, Missouri) am Tag 1 gegeben. Am Tag 2 werden 1,0 · 10&sup6; bestrahlte (10 000 rad) DA-Producerzellen der Co-Kultur zugesetzt. Am Tag 5 wird eine Selektion der transduzierten EL4- oder EL/A2/KB-Zellen mit 800 ug/ml G418 initiiert. Der Pool wird verdünnungskloniert, wie es in Beispiel 6B beschrieben ist.
BC10ME-, B16-, L-M(TK&supmin;)-, EL-4-Zellen, die durch mehrfache Vektoren transduziert waren, werden nicht in G418 selektiert; sie werden durch limitierende Verdünnung in Beispiel 7B kloniert und auf Expression untersucht, wie es in Beispiel 10A beschrieben ist.

B. TRANSDUKTION VON HUMANEN ZELLEN MIT VEKTOR- KONSTRUKT

Lymphoblastoid-Zellinien (LCL) werden für jeden Patienten eingeführt, indem ihre B-Zellen mit frischem Epstein-Barr-Virus (EBV), das aus dem Überstand einer drei Wochen alten Kultur von B95-8, EBV-transformierten Krallenaffen-Leukozyten (ATCC CRL 1612) infiziert (transformiert) werden. Drei Wochen nach der EBV-Transformation werden die LCL mit retroviralem Vektor, der HBV-core oder e-Antigen exprimiert, transduziert. Eine Transduktion von LCL wird durch Co-Kultivieren von 1,0 · 10&sup6; LCL- Zellen mit 1,0 · 10&sup6; bestrahlten (10 000 rad) HX-Producerzellen in einer 6 cm-Platte, die 4,0 ml Medium und 4,0 mg/ml Polybren enthält, vollendet. Das Kulturmdeium besteht aus RPMI 1640, 20% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (Hyclone, Logan, Utah), 5,0 mM Natriumpyruvat und 5,0 mM nicht-essentiellen Aminosäuren. Nach einer Co- Kultur bei 37ºC und 5% CO&sub2; über Nacht werden die LCL-Suspensions-Zellen entfernt und 1 · 10&sup6; Zellen werden für weitere 6 bis 18 Stunden in einer frischen Platte, enthaltend 1,0 · 10&sup6; bestrahlte, (10 000 rad) HX-Producerzellen wieder co-kultiviert. Transduzierte LCL- Zellen werden durch Zugabe von 800 mg/ml 6418 selektiert und kloniert, wobei Klone hoher Expression erhalten werden. Die Jurkat As/Kb-Zellen (L. Sherman, Scrips Institute, San Diego, Californien) werden im wesentlich so, wie es für die Transduktion von LCL- Zellen beschrieben ist, transduziert. LCLs, die mit mehrwertigen Vektoren transduziert sind, werden in G418 nicht selektiert; sie werden durch limitierende Verdünnung wie in Beispiel 6B kloniert und auf Expression wie in Beispiel 10A untersucht.

BEISPIEL 10

EXPRESSION TRANSDUZIERTER GENE

A. ELISA

Zellysate von Zellen, die durch KT-HBe oder KT-HBc transduziert wurden, werden hergestellt, indem 1,0 · 10&sup7; kultivierte Zellen mit PBS gewaschen werden, die Zellen zu einem Gesamtvolumen von 600 ul mit PBS resuspendiert werden und für zwei 5-Sekunden-Zeiträume bei der Einstellung 30 mit einem Branson-Ultraschallgerät, Modell 350 (Fisher, Pittsburgh, Pennsylvania) mit Ultraschall behandelt wurden oder durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen behandelt werden. Die Lysate werden durch Zentrifugation bei 10 000 Upm für 5 Minuten geklärt.
Core-Antigen und precore-Antigen in Zellysaten und sekretiertes e-Antigen im Kulturüberstand werden unter Verwendung des Abbott HBe-rDNA-EIA-Kit (Abbott Laboratories Diagnostic Division, Chicago, Illinois) untersucht. Ein anderer empfindlicher EIA-Assay auf precore-Antigen in Zellysaten und sekretiertes e-Antigen in Kulturüberstand wird unter Verwendung des ETI-EB-Kit durchgeführt (Incstar Corporation, Stillwater, MN) durchgeführt. Aus Verdünnungen von rekombinanten Hepatitis B-core und e-Antigen, erhalten von Biogen (Genf, Schweiz) wird eine Eichkurve aufgestellt.
Unter Verwendung dieser Verfahren werden etwa 10 ng/ml e-Antigen in transduzierten Zellinien, die wie oben in Absatz 1 dieses Beispiels beschrieben hergestellt wurden (siehe Fig. 5), exprimiert.

B. EXPRESSION VON TRANSDUZIERTEN GENEN DURCH WESTERN BLOT-ANALYSE

Proteine werden entsprechend ihrem Molekulargewicht (MW) durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Proteine werden dann von dem Gel auf eine IPVH-Immobilon-P-Membran (Millipore Corp., Bedrofd, Massachusetts) übertragen. Die Hoefer HSI TTE-Transferapparatur (Hoefer Scientific Instruments, Californien) wird verwendet, um Proteine vorn Gel auf die Membran zu übertragen. Die Membran wird dann mit polyklonalem Antikörpern aus einem Patientenserum, das mit dem exprimierten Polymerisation spezifisch reagiert, untersucht. Der gebundene Antikörper wird unter Verwendung von ¹²&sup5;I-markiertem Protein A nachgewiesen, welches eine Sichtbarmachung des transduzierten Proteins durch Autoradiographie erlaubt.

C. IMMUNPRÄZIPITATION/WESTERN BLOT

Eine Charakteristierung des precore/cores und von e-Antigenen, die durch transduzierte Zellen exprimiert werden, wird durch Immunpräzipitation mit anschließender Western-Blot-Analyse durchgeführt. Spezifisch ausgedrückt, 0,5 bis 1,0 ml Zellysat in PBS oder Kulturüberstand wird mit polyklonalem Kaninchen-Antihepatitis B-core-Antigen (DAKO Corporation, Carpinteria, Californien), gebunden an G-Sepharose (Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden), vermischt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Proben werden zweimal in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA gewaschen und zum Sieden erhitzt, wobei 0,5% 2-beta-Mercaptoethanol zugesetzt wird. Proteine werden auf Immobilon (Millipore Corp., Bedford, Maine) transferiert und mit DAKO-polyklonalem Kaninchen-Anti-Hepatitis-core-Antigen, anschließend mit ¹²&sup5;I-Protein A als Sonde markiert.
Unter Verwendung dieser Verfähren kann gezeigt werden, daß das 17 Kd HB-e- Protein durch transduzierte Mauszellen in dem Kulturüberstand sekretiert wird und daß die Hepatitis B-e-Zwischenprodukte p22, p23 hauptsächlich in den Lysaten der transduzierten Mauszellen vorliegen, Fig. 6.

BEISPIEL 11

A. CYTOTOXIZITÄT ASSAYS

i. INZUCHTMÄUSE

Sechs bis acht Wochen alten weiblichen Balb/c-, C57B1/6- und C3H-Mäusen (Harlan, Sprague-Dawley, Indianapolis, Indiana) werden zweimal intraperitoneal (i.p.) 1 · 10&sup7; bestrahlte (10 000 rad bei Raumtemperatur) Vektor-transduzierte BC10ME-, B16- bzw. L-M(TK&supmin;)-Zellen injiziert. Die Tiere werden 7 Tage später getötet und die Splenocyten (3 · 10&sup6;/ml) werden in vitro mit ihren jeweiligen bestrahlten transduzierten Zellen (6 · 10&sup4;/ml) in T-25-Kolben (Corning, Corning, New York) kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 1640, 5% wärmeinaktivierten fötalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 50 ug/ml Gentamycin und 10&supmin;&sup5; M β-2-Mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, Missoure). 4 bis 7 Tage später werden Effektorzellen geerntet und unter Verwendung verschiedener Effektor : Ziel-Zellen-Verhältnissen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Corning, Corning, New Yorik) in einem Standard-Chrom-Freisetzungs-Assay untersucht. Ziele sind die transduzierten und nicht-transduzierten PC10ME, B16 und L-M(TK&supmin;), wobei die nicht- transduzierten Zellinien aus negative Kontrollen verwendet werden. Spezifischer ausgedrückt, Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4;-markierte (Amersham, Arlington Heights, Illinois) (100 uCI 1 h bei 37ºC) Zielzellen (1 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung) werden mit Effektorzellen in verschiedenen Effektor-zu-Zielzellen-Verhältnissen in einem Endvolumen von 200 ul vermischt. Nach der Inkubation werden 100 ul Kulturmedium entfernt und in einem Beckman-gamma- Spektrometer (Beckman, Dallas, Texas) analysiert. Eine spontane Freisetzung (SR) wird als CPM aus Zielen plus Medium bestimmt und eine maximale Freisetzung (MR) wird als CPM aus Zielen aus 1 M HCl bestimmt. Die prozentuale Zielzellenlyse wird wie folgt berechnet: [(Effektorzelle + Ziel-CPM) - (SR)/(MR) - (SR)] · 100. Werte für die spontane Freisetzung für Ziele sind typischerweise 10% bis 20% der MR.

ii. TRANSGENE HLA A2.1-MÄUSE

Sechs bis acht Wochen alten weiblichen transgenen HLA A2.1-Mäusen (V. Engelhard, Charlottesville, Virginia) werden zweimal intraperitoneal (i.p.) 1 · 107 bestrahlte (10 000 rad bei Raumtemperatur) Vektor-transduzierte EL4 A2/KB-Zellen injiziert. 7 Tage später werden die Tiere getötet und die Splenocyten (3 · 10&sup6;/ml) werden in vitro mit bestrahlten (10 000 rad) transduzierten Jurkat-As/Kb-Zellen (6 · 10&sup4;/ml) in Kolben (T-25, Corning, Corning, NewYork) in vitro kultiviert. Der Rest des Chrom- Freisetzungs-Assays wird wie in Beispiel 12A beschrieben durchgeführt, wobei die Ziele transduzierte und nicht-transduzierte EL4-A2/Kb- und Jurkat-A2/Kb-Zellen sind. Nicht- transduzierte Zellinien werden als negative Kontrollen verwendet.

iii. HUMANE CTL-ASSAYS

Humane PBMC werden durch Ficoll (Sigma, St. Louis, Missouri)-Grandientenzentrifugation getrennt. Genauer ausgedrückt, Zellen werden bei Raumtemperatur 5 Minuten mit 3 000 Upm zentrifugiert, Die PBMCs werden in vitro mit ihren autologen transduzierten LCL, Beispiel 10B, bei einem Effektor : Ziel-Verhältnis von 10 : 1 für 10 Tage restimuliert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 1640 mit vor-durchgemusterten Chargen an 5% wärmeinkubiertem fötalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat und 50 un/ml Gentamycin. Die resultierenden stimulierten CTL-Effektoren werden auf CTL- Aktivität untersucht, wobei transduzierte autologe LCL- oder HLA-entsprechende Zellen als Ziele im Standard-Chromfreisetzungs-Assay, Beispiel 11A verwendet werden. Da die meisten Patienten gegenüber EBV Immunität aufweisen, werden die nicht-transduzierten EBV-transformierten B-Zellen (LCL), die als negative Kontrollen verwendet werden, durch EBV-spezifische CTL zusammen mit den transduzierten LCL als Ziele erkannt werden. Um eine hohe Hintergrund-Cytotoxizität infolge des Abtötens markierter Zielzellen durch EBV- spezifische CTL zu reduzieren, ist es notwendig, unmarkierte, nicht-transduzierte LCL im Verhältnis 50 : 1 zu markierten Zielzellen zuzusetzen.

B. NACHWEIS DER HUMORALEN IMMUNANTWORT

Humorale Immunantworten, die für den HBV-core und e-Antigene spezifisch sind, werden durch ELISA nachgewiesen. Das ELISA-Protokoll verwendet 100 ug/Vertiefung rekombinanten HBV-core und rekombinantes HBVe-Antigen (Biogen, Genf, Schweiz), um Platten mit 96 Vertiefungen zu beschichten. Sera aus Mäusen, die mit Zellen oder direktem Vektor, die HBV-core, oder HBVe-Antigen immunisiert wurden, werden dann in den mit Antigen überzogenen Vertiefungen einer Reihenverdünnung unterzogen und für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird ein Gemisch aus Kaninchen-Anti-Maus-IgG1, -IgG2a, -IgG2b und -IgG3 mit äquivalenten Titern in die Vertiefungen gegeben. Meerrettichperoxidase ("HRP")-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen- Antiserum wird in jede Vertiefung gegeben und die Proben werden 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird die Reaktivität durch Zugabe des geeigneten Substrats sichtbar gemacht. In den Vertiefungen, die Antikörper enthalten, welche für den HBV-core oder das HBVe-Antigen spezifisch sind, wird sich Farbe entwickeln.
Unter Anwendung dieser Verfahren ist zu erkennen, daß ein Antikörper für HBV- core und e-Antigene induziert werden kann, Fig. 6A und 6B.

C. T-ZELL-PROLIFERATION

Eine Antigen-induzierte T-Helferaktivität, die aus zwei oder drei Injektionen direkter Vektorpräparationen, die HBV-core oder e-Antigen exprimieren, wird in vitro gemessen. Spezifisch ausgedrückt, Splenocyten aus immunisierten Mäusen werden in vitro restimuliert und zwar bei einem vorher festgelegten Verhältnis an Zellen, die HBV-core oder e-Antigen exprimieren oder Zellen, die HBV-core oder e-Antigen nicht exprimieren als negative Kontrolle verwendet werden. Nach fünf Tagen in RPMI 1640-Kulturmedium, enthaltend 5% FBS, 1,0 mM Natriumpyruvat und 10&supmin;&sup5; 2-beta-Mercaptoethanol, bei 37ºC und 5% CO&sub2; wird der Überstand auf IL-2-Aktivität getestet, welches spezifisch durch T-Helferzellen sekretiert wird, die HBV-core oder e-Antigen stimuliert werden. IL-2 Aktivität wird unter Verwendung des CTL-Klones, CTLL-2 (ATCC TIB 214), der zum Wachstum on IL-2 abhängig ist, gemessen. Der CTLL-2-Klon wird sich in Abwesenheit von IL-2 nicht vermehren. CTLL-2-Zellen werden zu Reihenverdünnungen von Überstandstestproben in einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und bei 37ºC und 5% CO&sub2; für 3 Tage inkubiert. Anschließend wird 0,5 u Ci ³H-Thymidin zu dem CTLL-2 gegeben. ³H-Thymidin wird nur eingebaut, wenn die CTLL-2-Zellen sich vermehren. Nach einer Inkubation über Nacht werden die Zellen unter Verwendung einer PHD-Zellernte- Vorrichtung (Cambridge Technology Inc., Watertown, Massachusetts) geerntet und in einem Beckman-beta-Zählgerät gezählt. Die Menge an IL-2 in einer Probe wird aus einer Eichkurve bestimmt, welche aus rekombinantem Standard-IL-2, erhalten von Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) aufgestellt worden war.

BEISPIEL 12

IDENTIFIZIERUNG IMMUNOGENER DOMÄNEN VON HBV- PRECORE/CORE

Die T-Zellenepitope können unter Verwendung von Computer-Algorithmen, z.B. T- Sites (MedImmune, Maryland) vorausgesagt werden. Nach dieser Analyse werden Peptide synthetisiert und verwendet, um CTL-Epitope zu identifizieren. Effektorzellen aus Individuen mit einer akuten Hepatitis B-Infektion, die in vitro mit transduzierten Autologen (Beispiel 10B) LCL stimuliert worden waren, werden an autologen LCLs, die mit dem Peptid überzogen sind, untersucht. Der Chrom-Freisetzungs-Assay wird wie in Beispiel 12A iii beschrieben durchgeführt, außer daß Peptid zusammen mit Effektorzellen zu einer Endkonzentration von 1 bis 100 ug/ml zu nicht-transduzierten Na&sub2;&sup5;¹CrP&sub4;-markierten LCL gegeben wird. Die Reaktion wird 4 bis 6 Stunden inkubiert und es wird ein Standard- Chrom-Freisetzungs-Assay, wie er in Beispiel 11Ai beschrieben ist, durchgeführt.

BEISPIEL 13

TUMORIGENITÄT UND TRANSFORMATION

A. TUMORIGENITÄTS-ASSAY

Eine Tumorbildung bei nackten Mäusen ist eine besonders wichtige und empfindliche Methode zur Bestimmung der Tumorigenität. Nackte Mäuse besitzen keine reifen T-Zellen und daher fehlt ihnen ein funktionelles zelluläres Immunsystem, wodurch ein nützliches in vivo-Modell bereitgestellt wird, um das Tumor-bildende Potential von Zellen zu untersuchen. Normale, nicht-Tumor-bildende Zellen zeigen keine Eigenschaften eines unkontrollierten Wachstums, wenn sie nackten Mäusen injiziert werden. Dagegen werden tumorigen-transformierte Zellen sich in nackten Mäusen schnell vermehren und Tumoren bilden. Kurz ausgedrückt, das Vektorkonstrukt wird durch Injektion in nackte Mäuse verabreicht. Die Mäuse werden über einen Zeitraum von 4 bis 16 Wochen nach Injektion visuell untersucht, um Tumorwachstum zu bestimmen. Die Mäuse werden getötet und einer Autopsie unterzogen, um zu bestimmen, ob Tumore vorliegen (Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 48: 1531-1533, 1972; Furesz et al., "Tumorigerlicity testing of cell lines considered for production of biological drugs", Abnormal Cells, New Products and Risk, Hopps und Petricciani (Hrsg.), Tissue Culture Association; 1985; Levenbook et al., J. Biol. Std. 13: 135-141; 1985). Dieser Test wird durch Quality Biotech Inc. (Camden, New Jersey) durchgeführt.

B. TRANSFORMATIONS-ASSAY

Es hat sich gezeigt, daß Tumorigenität mit dem Transformationsverhalten in enger Beziehung steht. Ein Assay, der verwendet werden kann, um eine Transformation zu bestimmen, ist die Kolonienbildung von Zellen, die in Weichagar plattiert sind (MacPherson et al., Vir. 23: 291-294, 1964). Kurz ausgedrückt, eine Eigenschaft normaler nicht-transformierter Zellen ist ein verankerungsabhängiges Wachstum. Normale nicht- transformierte Zellen werden eine Vermehrung stoppen, wenn sie in halbfestem Agarträgermedium sind, wohingegen transformierte Zellen sich ein Weichagar weiter vermehren und Zellen bilden.
HT1080 (ATCC CCL 121), eine neoplastische Zellinie, die aus humanem Fibrosarcom stammt und von der bekannt ist, daß sie in 100% nackten Mäusen Tumoren verursacht, wird als positive Assay-Kontrolle verwendet. WI-38 (ATCC CCL 75), eine diploide embryonale humane Lungenzellinie, die bei nackten Mäusen nicht tumorigen ist, wird als negative Assay-Kontrolle eingesetzt.
WI-38-Zellinien werden mit dem Vektorkonstrukt, wie es in Beispiel 6B beschrieben ist, transduziert. Doppelproben für jede der transduzierten Zellinien HT1080 und WI-38 werden in Agar kultiviert. Kurz ausgedrückt, eine untere Schicht aus 5,0 m 0,8% Bactoagar (Difco, Detroit, Michigan) in DMEM, 17% FBS, wird auf 60 mm-Gewebekulturplatten gelegt. Dieser wird mit 2,0 ml 0,3% Bactoagar in demselben Medium, das Zellen in einer Konzentration von 5 · 10&sup5; Zellen/ml suspendiert hat, überschichtet. Um Hintergrundklumpen zu reduzieren wird jede Zellinie durch ein 70 um Nylonnetz geführt, bevor in der Agar-Lösung suspendiert wird. Die Platten werden bei 37ºC 14 Tage in angefeuchteter Atmosphäre mti 5% CO&sub2; inkubiert. Im 24-stündigen Plattierungszeitraum werden repräsentative Platten jeder Zellinie auf Zellklumpen, die während der Plattierung vorliegen, untersucht. Am Tag 13 werden die Platten mit 1,0 ml INT-Virusfärbung (Sigma, St. Louis, Missouri) gefärbt und am Tag 14 werden sie auf Kolonien mit einem Durchmesser von 150 um durchgescannt, wobei eine 1,0 mm Okular-Platte verwendet wurde.
Nur Kolonien, die in einer Richtung 150 um groß sind, werden gezählt, da Kolonien dieser Größe unter dem Mikroskop in allen Ebenen leicht betrachtet werden können und nicht-transformierte Zellen selten Kolonien dieser Größe bilden. Am Ende des Assays werden die Plattierungseffizienzen für jede Zellinie als b/a · 100 errechnet, wobei b die Summe der Kolonien auf allen Platten bedeutet und a die Gesamtzahl der Zellplatten bedeutet. Eine nicht-transformierte Zellinie ist eine, die eine Plattierungseffizienz von weniger oder gleich 0,001% hat. Daher wird eine transformierte Zellinie eine Plattierungseffizienz von größer von 0,001% haben (Risser et al., Virol. 59: 477-489, 1974).

BEISPIEL 14

VERABREICHUNGSPROTOKOLE

A. MÄUSE

Das Maulsystem wird verwendet, um die Induktion humoraler und zellvermittelter Immunantworten mit direkter Verabreichung eines Vektors, der für HBV-core oder e-Antigen codiert, zu beurteiln. Sechs bis acht Wochen alten weiblichen Balb/C-, C57B16- oder C3H-Mäusen wurde intramuskulär (i.m.) 0,1 ml auf ursprüngliche Konzentration verdünntes (mit sterilem, entionisiertem, destilliertem Wasser) lyophilisierter HBV-core- oder HBV-e-exprimierender retroviraler Vektor injiziert. Zwei Injektionen werden im Abstand von einer Woche verabreicht. Sieben Tage nach der zweiten Injektion werden die Tiere getötet. Die Chromfreisetzungs-CTL-Assays werden vorzugsweise im wesentlichen wie in Beispiel 11Ai beschrieben durchgeführt.

B. PROTOKOLL EINER VERABREICHUNG AN SHIMPANSEN

Die Daten, die im Maussystem aus Beispiel 14A erhalten wurden, werden verwendet, um das Protokoll einer Verabreichung eines Vektors an Shimpansen, die chronisch mit Hepatitis B-Virus infiziert sind, zu bestimmen. Basierend auf der Induktion von HBV-spezifischen CTLs in Mäusen, werden Subjekten in den Shimpansen-Versuchen drei Dosen an Vektor, der für core oder e-antigen codiert, in Intervallen von 28 Tagen an zwei Gruppen mit ansteigender Dosierung verabreicht. Kontrollsubjekte werden ein Placebo erhalten, das aus HBV-IT (V)-Formulierungsmedium besteht. Die Dosierung wird entweder 10&sup6; oder 10&sup7; HBV-IT (V) kbE betragen, die in vier 0,5 ml Injektionen i.m. an jedem Injektionstag gegeben wird. Blutproben werden am Tag 4, 12, 24, 36, 52, 70 und 84 und nach 6, 12, 18, 24, 30 und 36 Monaten entnommen, um die Serum-ALT-Level, das Vorliegen von Hepatitis B-e-Antigen, das Vorliegen von Antikörpern gegen das Hepatitis B-e-Antigen zu messen und die Sicherheit und Akzeptanz der Behandlung zu untersuchen. Das Hepatitis B-e-Antigen wird durch den Abbott-HB-e-rDNA-EIA-Kit, wie es in Beispiel 10A beschrieben ist, nachgewiesen. Antikörper auf das HB-e-Antigen können durch den Abbott-HB-e-rDNA-EIA-Kit nachgewiesen werden und die Wirksamkeit der Induktion von CTLs gegen Hepatitis B-core oder e-Antigen kann wie in Beispiel 11A iii bestimmt werden. Basierend auf den Resultaten aus den Shimpansen-Untersuchungen über Sicherheit und Wirksamkeit wird der Dosierungs- und Inokulationsplan zur Verabreichung des Vektors an Subjekte in Menschversuchen bestimmt werden. Personen werden bezüglich der Serum-ALT-Level, des Vorliegens von Hepatitis B-e-Antigen und des Vorliegens von Antikörpern, die gegen das Hepatitis B-e-Antigen gerichtet sind, im wesentlichen wie oben beschrieben überwacht. Die Induktion von humanen CTLs gegen Hepatitis B-core oder e- Antigen wird in Beispiel 11A bestimmt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Chiron Corporation
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: HEPATITIS-THERAPEUTIKUM
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 56
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: 93 904 901.1
(B) ANMELDETAG: 4. Februar 1993
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
CTCGAGCTCG AGGCACCAGC ACCATGCAAC TTTTT 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
CTACTAGATC CCTAGATGCT GGATCTTCC 29
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
GGAAGATCCA GCATCTAGGG ATCTAGTAG 29
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GGGCGATATC AAGCTTATCG ATACCG 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5.
AATACGACTC ACTATAGGG 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
ATTAACCCTC ACTAAAG 17
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
AATACGACTC ACTATAGGG 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
CCTCGAGCTC GAGCTTGGGT GGCTTTGGGG CATG 34
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
ATTACCCCTC ACTAAAG 17
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
GTAGACCGTG CATCATGAGC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11
ATAGCGGAAC AGAGAGCAGC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 55 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
CTCGAGCTCG AGCCACCATG AGCACAAATC CTAAACCTCA AAGAAAAACC AAACG 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terininus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 55 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
AAGCTTAAGC TTCCACCATG AGCACAAATC CTAAACCTCA AAGAAAAACC AAACG 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
GTGCATGCAT GTTAGTGCG 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
CGTGGTGTAT GCGTTGATGG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 59 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
CCTCGAGCTC GAGCCACCAT GGGGAAGGAG ATACTTCTAG GACCGGCCGA TAGTTTTGG 59
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: lineär
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
GCAAGCTTAA GCTTCTATCA GCGTTGGCAT GACAGGAAAG GGAGTCCCGG TAACCGCGGC 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
ATAAATAGAA GGCCTGATAT G 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
GCAAGCTTAG AATGTACAGG ATGCAACTCC TGTCT 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
GACTCGAGTT ATCAAGTCAG TGTTGAGATG ATGCT 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
GCCTCGAGAC AATGTACAGG ATGCAACTCC TGTCT 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
GAGGGCCCTT ATCAAGTCAG TGTTGAGATG ATGCT 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 53 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
CGAAGCTTAA GCTTGCCATG GGCCACACAC GGAGGCAGGG AACATCACCA TCC 53
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 52 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
CCTCGAGCTC GAGCTGTTAT ACAGGGCGTA CACTTTCCCT TCTCAATCTC TC 52
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 52 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
CCTCGAGCTC GAGGCCATGG GCCACACACG GAGGCAGGGA ACATCACCAT CC 52
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 52 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
CGGGCCCGGG CCCCTGTTAT ACAGGGCGTA CACTTTCCCT TCTCAATCTC TC 52
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 96 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 90 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
GGTGATAATC TGGGTTGCAC AGGAAGTTTC CGGGGTTGGA GGGCAGTGCT GCTTGTAG 58
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 59 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:
CAACCCAGAT TATCACCTTT GAAAGTTTCA AAGAGAACCT GAAGGACTTT CTGCTTGTC 59
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 69 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 69 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:
TTCAAGCCTC CAAGCTGTGC CTTGG 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS; N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:
TCTGCGACGC GGCGATTGAG A 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:
GGAAAGAAGT CAGAAGGCAA 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 68 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 63 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 79 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 66 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 71 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 64 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 74 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 67 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 655 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:

Claims

1. Rekombinantes Retrovirus, das ein Vektorkonstrukt trägt, welches die Expression mindestens eines immunogenen Teils des Hepatitis-B-Antigens HBcAg steuert, zur Verwendung bei der Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen.

2. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 1, das die Expression mindestens eines immunogenen Teils des Hepatitis-B-Antigens HBcAg steuert, und ein immunmodulatorischer Cofaktor zur Verwendung in der Behandlung von Hepatitis-B- Infektionen.

3. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 1, das mindestens einen immunogenen Teil des Hepatitis-B-Antigens HBcAg und einen immunmodulatorischen Cofaktor co- exprimiert, zur Verwendung bei der Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen.

4. Rekombinantes Retrovirus, das ein Vektorkonstrukt trägt, das die Co-Expression mindestens eines immunogenen Teils des Hepatitis-B-Antigens HBcAg und eines immunmodulatorischen Cofaktors steuert.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein rekombinantes Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.

6. Kit zur Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen, wobei der Kit ein rekombinantes Retrovirus nach Ansprüch 1 und einen immunmodulatorischen Cofaktor umfasst.