PT85108B - Virus da varicela-zoster util como vacina viva recombinante - Google Patents
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Description
A varicela é provocada pelo vírus da varicela-zoster (VZV), um membro da família dos vírus herpes. A doença ocorre em pessoas sem imunidade anterior relativamente ao VZV. Os anticorpos específicos do VZV podem ser demonstrados pouco tempo depois da doença estabelecida, diminuem de número durante a convalescência, mas permanecem detectáveis durante muitos anos e correspondem à imunidade relativamente à doença. A varicela é altamente contagiosa; ceraca de 90% da populaçao é exposta ao VZV antes dos 20 aios de idade. Na maior parte ou em todos os casos, o VZV torna-se latente, possivelmente nas células dos gânglios das raízes dorsais. A partir deste estado de latência, o VZV pode ser reactivado e provocar zoster mesmo na presença de anticorpos específicos, provavelmente como resultado da imunidade celular enfraquecida. A doença é altamente mórbida para os possuidores de imunossupressao e para os que tenham mais de vinte anos.
Em 1974, Takahashi divulgou o isolamento da estirpe Oka do VZV a partir de uma vesícula de uma criança com varicela. Esta estirpe foi então atenuada por passagem em células embrionárias de porquinho da índia e fibroblastos diplóides humanos. A variante atenuada de NZN/ /Oka foi testada clinicamente em milhares de jovens. Ela é capaz de induzir níveis elevados de anticorpos reactivos com a superfície do virião de VZ. Ainda, esta estirpe apresenta eficácia protectora na prevenção de varicela em crianças e nos possuidores de imunodeficiência. Deve-se salientar que esta estirpe de VZV é a única vacina virai disponível que pode ser usada com segurança em doentes imunodeficientes, tornando assim o VZV versátil para aplicações mais vastas.
vírus Epstein - Barr (EBV) é o agente etiológico da mononucleose infecciosa. 0 vriao de EB tem 3 glicoproteinas principais de superfície; gp350 (glicoproteína de 350,000 daltons) gp220 e gp85. Os polipeptideos gp350 e gp220 sao os produtos de um único gene virai. Estas duas glicoproteinas sao capazes de induzir a produção de anticorpos capazes de neutralizar a infecciosodade de EBV in vitro. Portanto, o gene da gp350 e os seus produtos sao úteis para a preparaçao de uma vacina contra a doença induzida pelo EBV através da utilização de técnicas de DNA recombinante. Ainda, seria desejável vacinar pessoas simultaneamente contra doenças induzidas por VZV e por EBV ou como alternativa contra doenças induzidas por EBV e uma outra doença.
vírus da hepatite diferentes infeccioso responsável por fígado no homem, incluindo tocelular, viriao de HB é composto por dois turais, as proteinas do núcleo central (core) e as proteinas do envelope ou de superfície (S). Além de serem as principais proteinas de superfície do viriao, i.e., partícula de Dane, as proteinas S sao os únicos constituintes do antigénio Austrália, ou partículas de 22 nm. As proteinas S sao os produtos de traduçao de uma grande grelha de leitura aberta (ORF) do serótipo.
um dos quais começa com um codao ATG que é capaz de funcionar com um sitio de iniciaçao da traduçao minios sao referidos como preS-1 (108-119 -2 (55 aminoácidos) e S (226 aminoácidos) ordem 5 *-3' no gene, desta ORF têm as seguintes composiçoes:
agente ças do cirrose
B (HBV) é o tipos de doene carcinoma hepaque ceifam centenas de milhares de vidas por ano. grupos de proteinas estru as proteinas do núcleo central (core)
S sao os codificadora de 389-400 Esta ORF está demarcada aminoácidos, dependendo em três dominios, cada in vivo. Estes doaminoácidos), preSna sua respectiva
Os seis produtos proteicos derivados
1) gp42 (glicoproteína de 42,000 daltons) = preS-l/preS-2/ /S (significando preS-1, contígua com preS-2, contígua com S)
2) p39 (p = proteína) = preS-l/preS-2/S
3) gp36 = preS-2/S (dois sitios de glicosilaçao)
4) gp33 = preS-2/S (um sitio de glicosilaçao)
5) gp27 = S (um sitio de glicosolaçao)
6) p24 = S (ou antigénio de superfície HB, i.e., HBsAg)
Além do homem, os chimpanzés sao as únicas espécies que sao totalmente susceptiveis à infecçao pelo HBV, conforme reflectido em marcas quantificáveis tais como HBs , níveis serologicos elevados de enzimas do figado, etc. Vacinaram-se cimpanzés com três doses de partículas de HBsAg purificadas (contendo p24) e depois infectaram-se com uma grande dose de HBV infeccioso. Enquanto os animais com vacinaçao simulada sofrem os sinais de infecça aguda com HBV, os animais vacinados com HBsAg ficaram totalmente protegidos de quaisquer sinais de infecçao. Portanto, neste sistema experimental, as partículas de HBsAg, compostas por gp27 e p24 (apenas domínio S), foram suficientes para induzir imunidade protectora. Estimulados por estas obser vaçoes vários fabricantes produziram vacinas da HB compostas por partículas de HBsAg.
Resultados recentes sugeriram que os domínios preS-1 e preS-2 podem desempenhar sem papel importante na imunidade contra infecçoes por HBV. Tanto anti6
corpos contra preS-1 (induzidos pela imunização com um peptideo consistindo em residuos de aminoácidos 10-32 da preS-1) como anticorpos contra preS-2 (induzidos pela imunização com um peptideo consistindo nos residuos de aminoácidos 1-26 de preS-2) sao capazes de bloquear a ligaçao de HBV a células de hepatoma homano in vitro; anti-HBs (soro de pacientes vacinados com HBsAg sem preS-1 ou preS-2) é incapaz de mediar este bloqueio. Se isto que acontece in vitro simular a infecçao in vivo, então os domínios preS(i.e., preS-1 e preS-2 in toto ligados um ao outro) podem representar o sitio de ligaçao do HBV ao seu receptor das células do figado e anti-pre-S podem bloquear a ligaçao de HBV e iniciaçao da infecçao. Em adição, encontrou-se que anti-pre-S aumenta de titulo durante a fase de recuperação da infecçao aguda por HBV, indicando um papel destes anticorpos na recuperação. Finalmente, foi demonstrado que a vacinaçao de chimpanzés com um polipeptideo pre-S de 108 aminoácidos (residuos 27-119 de preS-1 contíguo com 1-16 de preS-2) era capaz de mediar alguma protecçao mensurável contra HBV. Resumindo, estas obser_ vações experimentais sugeriram que os domínios pre-S sao um aditivo útil às presentes vacinas contra HB, realçando deste modo o interesse na expressão da grande ORF codificadora de preS-l/preS-2/S.
OBJECTIVOS DO INVENTO
Constitui um objectivo do presente invento alterar o genoma natural do VZV para produzir vírus recombinante portador de DNA heterólogo, i.e., nao derivado de VZV. Ê ainda um objectivo utilizar DNA heterólogo que co difique um polipeptideo imunogénico de um outro agente patogénico humano. Ainda um outro objectivo é proporcionar os métodos para a expressão de tal DNA heterólogo como parte do genoma do VZV. ainda mais um outro objectivo é proporcionar um método para vacinaçao de seres humanos de modo a induzir neles uma resposta imune contra polipeptideos heterólogos codificados pelo novo DNA introduzido. Estes e outros objectivos do presente invento serão óbvios a partir da descrição que se segue.
SUMÁRIO DO INVENTO genoma do VZV foi modificado pela introdução de DNA heterólogo que codifica um polipeptideo imunogénico de um outro agente patogénico para o homem. Este polipeptideo heterólogo é expresso em células infectadas pelo vírus recombinante. Uma vez que a estirpe vacinai do VZV, em ensaios clínicos, é capaz de fazer a prevenção de varicela em crianças. VZV recombinante portador de material genético heterólogo é útil como vacina para a varicela assim como para agentes patogénicos heterólogos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figuralé um esquema que mostra a produção de pAM2.
Figura um esquema que mostra produção de pAM3
Figura um esquema que mostra produção de pPK-3
Figura um esquema que mostra produção de pPK-4
Figura um esquema que mostra produção de
VZV recombinante
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO presente invento é dirigido à prc> duçao de VZV recombinante o qual pode funcionar como vacina tanto para a varicela como para outras doenças provocadas por outros agentes patogénicos para o homem. Além do seu pej? fil de segurança e eficácia em ensaios clínicos com crianças saudáveis, a estirpe vacinai do VZV mostrou-se segura e eficaz em ensaios clínicos nos possuidores de imunodeficiência. É indesejável utilizar outros vírus vivos atenuados como vacinas em tais indivíduos dando pois uma vantagem significativa à utilização do VZV e seus derivados recombinantes conforme descrito no presente invento.
É vantajoso apresentar um polipeptideo imunogénico heterólogo na forma de VZV recombinante vivo em vez de uma vacina de subunidades derivada de um recombinante por três razoes básicas. Primeiro, um polipeptideo apresentado ao sistema imune com uma estrutura de repli caçao por vezes pode induzir uma imunidade mais prolongada do que quando apresentada como nao replicativa, i.e., estrutura do tipo subunidade. Segundo, uma apresentaçao numa estrutura replicativa pode induzir imunidade celular mais eficazmente do que a apresentaçao como uma estrutura do tipo subunidade. Finalmente, na medida em que o polipeptideo heterólogo é expresso em células humanas o polipeptideo sofre modificações pós-transducionais que se assemelham mais às que ocorrem quando o polipeptideo é expresso nas infecçoes naturais no homem pelo patogénio heterólogo. Ao contrário as modificações pós-transducionais quando o polipeptideo heterólogo é expresso como produto derivado de recombinantes em células procarióticas ou eucarióticas por vezes diferem das modificações que ocorrem quando o polipeptideo é expresso durante a infecçao natural do homem. Ainda, a expressão do polipeptideo heterólogo como parte de um VZV recombinante evita quaisquer riscos potenciais associados à utilização de um agente patogénico heterólogo, vivo mas atenuado como vacina. Isto é vantajoso uma vez que um agente patogénico heterólogo, vivo mas atenuado tem a possibilidade teórica de reversão para uma forma mais infecciosa e portanto patogénica.
genoma do VZV recombinante vivo é obtido como se segue:
Um clone de DNA que coloca uma sequência promotora natural do VZV imediatamente 5' relativamente à sequência codificadora do gene da gp35O de EBV é cri^ ado como se segue. Um plasmideo de VZV contendo o gene completo de gpl do VZV (incluindo as sequências delimitantes 5’ na sua totalidade) é digerido com SfaNl e dotado de extremos cegos, dando um fragmento de 0,9 kpb contendo o promotor de gpl do VZV assim como os primeiros 34 aminoácidos do produto primário da traduçao de gpl. Um plasmideo de EBV contendo o g_e ne de gp350 é digerido com BamHI e XhoII, dando um fragmento de 4,3 kpb contendo a sequência codificadora completa de gp350 excepto os 21 primeiros aminoácidos. Sintetizaram-se oligonucleotídeos codificadores dos aminoácidos 34-36 de gpl do VZV assim como dos aminoácidos 21-22 de gp35O do EBV. 0 D-NA de 0,9 kpb foi clonado em pUC19, digerido com BamHI e ligado ao fragmento de 4,3 kpb. 0 vector resultante (pAM2) foi digerido com Sphl, BamHI e SfaNI e os fragmentos resultantes de 0,9 e 0,7 kpb foram ligados a oligonucleotideos sintéticos dando pAM3. Um plasmideo de VZV contendo o gene da timidina cinase (tk) (pPK-1) foi digerido com Accl e Taql, dando um fragmento de 1,5 kpb contendo a região codificadora completa de tk a qual á então clonada em pUC13. Este clone de DNA de tk (pPK-2) é digerido com SpHI e dotado de extremos cegos. Como alternativa, o plasmideo de VZV contendo o gene tk (pPK-1) foi digerido com Nsil e dotado de extremos cegos. pAM3 foi digerido com Sphl e Smal, dotado de extremos cegos e clonado no sitio Sphl de extremos cegos de pPK-2 ou no sitio Nsil de extremos cegos de pPK-1. Isto origina um fragmen to de DNA contendo o gene tk de VZV nao essencial circunserevendo o promotor de gpl de VZV e a sequência codificadora de gp350 de EBV (cassette tk) .
de tamanho comcotransfectapor meio de
DNA genómico de VZV pleto e a cassette tk descrita atrás foram, dos na estirpe celular MRC-5 de fibroblastos diploídes humanos. As placas desta transfecçao foram testadas anticorpos monoclonais relativamente à presença de gp350 de EBV. Encontrou-se VZV recombinante que recombinante pode ser passado em sistemas acelulares e tável quando da passagem repetida associada a células, lise por hibridaçao de DNA usando sondas de DNA da gp350 de EBV e de gp350; passado em sistemas acelulares expressa este e es
Anátk de VZV confirmou ainda a estrutura do VZV recom binante
As partículas de Dane foram utilizadas como fonte do ácido nucleico de HBV para o isolamento da ORF preS-l/preS-2/S. A reacçao da polimerase endógena foi empregue para produzir DNA circular de cadeia dupla covalentemente fechado genoma de HBV a partir da forma com cortes e hiatos que é nativa do viriao de HBV. 0 DNA reparado é isq lado e digerido totalmente com EcoRI. 0 vector de clonagem em E.coli pBR322 também foi digerido com EcoRI, ligado ao DNA de HBV e usado para transformar E.coli. Foram seleccionados plasmideos recombinantes contendo o genoma de HBV numa forma cicularmente permutada em que o sitio EcoRI divide toda a sequência codificadora de preS-l/preS-2/S num dominio 5’ de 0,4 quilopares de bases (kpb) e num dominio 3’ de 0,8 kpb. Estes dois domínios foram subclonados para a eventual montagem de todo o gene. Para o dominio 3’, pUC19 foi digerido com EcoRI e BamHI, depois ligado a um oligonu cleotideo sintético que consiste nos 5 últimos nucleotideos da região codificadora, o codao de paragem, um sitio HindIII e um extremo BamHI. A porção 3’ do gene preS-l/preS-2/S, consistindo num fragmento EcoRI-AccI de 0,8 kpb, foi clonado neste vector. pUC18 foi digerido com HindIII E EcoRI e ligado a um oligonucleotideo sintético de 72 pb que reconstitui a ORF completa desde o sitio BamHI a montante, passando pelo ATG distai e sequência condutora nao traduzida de 10 pb, até um extremo HindIII compatível. 0 fragmento BamHI-EcoRI de 0,3 kpb do dominio 5' é então ligado a este vector de clonagem ligado a oligonucleotideos, Os clones 5’ pUC18 e 3’ pUC19 foram amplificados por crescimento em E.coli e as regiões codificadoras foram digeridas a partir dos plasmideos isolados como fragmentos HindIII-EcoRI. Os fragmentos 5’ e 3’ foram ligados, digeridos com HindIII, providos de extremos cegos e a ORF completa com extremos cegos foi clonada em pUC18 o qual tinha sido digerido préviamente com BamHI e provido de extremos cegos.
plasmideo VZV contendo o gene gpl de VZV completo foi digerido com Aval e o fragmento de 3,7 kpb foi purificado por electroforese em gel preparativo de agarose. Quatro oligonucleotideos sintetizados, híbridos e ligados para formar um adaptador Aval-Xbal de 55 pares de bases (pb). Este adaptador é ligado ao fragmento de 3,7 kpb, a mistura é digerida com EcoRV e o fragmento de 0,9 kpb(contendo o promotor de gpl) foi isolado por electroforese em gel preparativo de agarose, dotado de extermos cegos e clonado no sitio Smal do vector pUC18 contendo preS-1/preS-2/S. Este vector (contendo o promotor de gpl do VZV e a região codificadora preS-l/preS-2/S) foi digerido com Saci e PstI, dotado de extremos cegos e clonado no sitio Nsil de extremos cegos do pPK-1. Isto originou um fragmento de DNA contendo o gene tk nao essencial de VZV circunscrevendo o promotor gpl do VZV e a sequência codificadora preS-1/preS-2/S (cassette tk).
DNA genómico do VZV de tamanho completo e a cassette tk descrita atrás foram usados para cotrans fectar células MRC-5. As placas desta transfecçao foram testadas por meio de anticorpos monoclonais quanto à presença de proteínas 5” de HBV. Encontrou-se VZV recombinante que expressa proteínas de HBV; este recombinante pode ser passado liberto de células e é estável quando da passagem repetida em células. A análise por hibridaçao de DNA usando sondas de DNA adequadas confirmou a estrutura do VZV recombinante.
gene gp350 do EBV não é senão ap£ nas um exemplo de uma sequência de DNA nao VZV que pode ser inserida no genoma do VZV. Muitas vezes, mas nem sempre, as sequências deste tipo mais úteis serão as codificadoras de proteínas da superfície de agentes patogenicos para o homem, incluindo vírus e bactérias. A sequência gp350 do EBV nao possui qualidades intrínsecas que a tornem única relativamente a outras sequências de DNA no que respeita à recombinaçao com o genoma do VZV. Assim, é óbvio para os familiarizados com a matéria que o principio da inserção do gene gp350 de EBV como DNA nao VZV no genoma do VZV se estende a qualquer sequência de DNA nao VZV, incluindo mas nao estando limitado à ORF preS-l/preS-2/S do HBV. Ainda, uma vez que o genoma do VZV é muito grande, ele é capaz de acomodar uma sequência de DNA nao VZV de grande tamanho. Caso o DNA nao VZV tenha um único gene completo ou tenha mais de um gene, dar-se-à a expressão do gene estranho ou, se mais de um gene for adicionado, dar-se-á a expressão de vários genes estranhos. Assim, é óbvio para os familiarizados com a matéria que o prin cipio da inserção do gene gp350 do EBV como DNA nao genoma do VZV se estende a mais de um gene.
fisiológicamente muito activo 0 genoma do gpl do VZV é de uma infecçao virai.
res que sao promotor de durante o curso muitos ganas delimitados por promotodirigir a sintese de genes nao VZV sequência codificadora e bem uma vez que pode ser expressa gene diferente. Ainda, foram descritas numerosas de promotores derivados de células de mamíferos que cazes ao dirigirem a expressão de genes estranhos, motores incluem mas nao estão limitados aos da metalotioneira, da repetição terminal longa símio 40. 0 promotor é defenido gir a transcrição de genes, nao é óbvio para os familiarizados com a matéria que a escolha de um promotor na cassette de expressão se estende a qualquer promotor eucariótico, procariótico ou virai capaz de dji rigir a transcrição de genes em células infectadas por VZV
VZV contem úteis para conhecido que uma mesmo se precedida de um promotor de um Ainda, foram descritas numerosas sequências sao efitais prodos retrovírus e do vírus sua utilidade em dirisua origem. Portanto, pela pela recombinante
Foi demonstrado que o gene tk nao e estabilidade do VZV. em seleccionar VZV tk como ponto de inserção no que respeita à sua natureza nao
Isto foi viáveis.
para DNA dePor nao é essencial à replicaçao mostrado pela capacidade tanto, a utilidade de tk VZV é útil em particular essencial na replicaçao do VZV. Dispondo de toda a sequência de DNA genómico do VZV, outras regiões nao essenciais podem ser defenidas e utilizadas portanto será óbvio para os familiarizados com a matéria que a escolha de um ponto de inserção para o DNA nao VZV se estende a qualquer região nao essencial no genoma do VZV.
vírus da vacina tem sido proposto para ser utilizado como vector na expressão de proteínas estranhas, e_.£. , hepatite B. Foi reconhecido que a utilização do vírus da vacina em indivíduos imunodeficientes muitas vezes conduz a morbidez grave e mortalidade. Por outro lado, o uso de uma estirpe atenuada do vírus da varicela zoster como vector para a expressão de proteinas estranhas é útil como uma vacina para indivíduos imunodeficientes, imunizando deste modo contra varicela e igualmenet contra uma doença cujo agente codifique a proteina estranha expressa pelo vector. A vacina pode ser administrada por várias vias incluindo mas nao estando limitado às subcutânea e intramuscular. Sao alguns exemplos de proteinas estranhas as expressas por EBV, hepatite B, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus dos sincícios respiratórios, vírus herpes simplex tipo 1 e tipo 2 e citomegabovírus. Os vectores do presente invento induzem a formaçao de anticorpos protectores em espécies mamíferas, e.g., Callithrix jacchus e homem, num nivel de do-
4 sagem de 10 -10 PFU por receptor individual.
Os exemplos que se seguem ilustram o presente invento sem, no entanto, limitar o mesmo. A divul^
gaçao de cada uma das referências mencionadas nos exemplos que se seguem é aqui incluido por referência.
EXEMPLO 1
Construção de um gene tk de VZV modificado contendo uma cassette11 de expressão codificando gp350 de EBV.
A glicoproteina gpl de VZV representa uma das principais glicoproteinas das no viriao de VZV / Ellis et al., J. (1985)7; a taxa de transcrição dirigida estruturais contiVirology, 53:81 pelo promotor de gpl do VZV é relativamente alta.
et al.,
J. Gen. Virol.
fragmento G Saci /Davidson (1983)7 de VZV, que circunscreve todo o gene gpl, foi clonado num pBR322 modificado (pRES), criado por digestão do pBR322 com BamHI, criaçao de extremos cegos com o fragmento klenow da DNA polimerase I, ligaçao com um oligonucleotideo octâmero contendo o sitio de restrição para Saci (Collaborative Reserch) e digestão com
Saci. 0 plasmideo resultante (pVSGO-12) foi digerido com Sf aNl e o fragmento de 0,9 kpb contendo as sequências de promotor a montante e região codificadora dos primeiros 34 aminoácidos da gpl do VZV foi purificado por electroforese em gel preparativo de agarose (Fig. IA). 0 fragmento de 0,9 kpb foi dotado de extremos cegos com DNA polimerase de T4 e clonado no sitio HincII do pUC19 /Yanisch-Perral et al., Gene 33:103 (1985)7, formando assim pAMl. 0 gene estrutural para gp350 e gp220 de EBV é idêntico e está todo contido no fragmento L BamHI de DNA genómico do plasmideo B68’ /Uummel et. al. , J. Virology 4/):413 (1984)7. 0 plasmideo B68' contendo
BamHI-L foi digerido com BamHI e o fragmento BamHI-L de 5,0 kpb foi purificado por electroforese preparativa em gel de agarose. Este fragmento foi então digerido com XhoII e o fragmento de 4,3 kpb contendo todo o gene estrutural excepto os primeiros 63 pb da região codificadora de gp350, mas incluindo a sequência de terminação da transcrição, foi purificado por electroforese preparativa em gel de agarose (Fig. 1B. pAMl) foi digerido com BamHI e ligado ao fragmento de 4,3 kpb. 0 plasmideo resultante (pAM2, Fig. 1C) foi digerido com Sphl e BamHI e os fragmentos de 0,9 kpb e 7,0 kpb foram purificados por electroforese preparativa em gel de agarose (Fig. 2A). 0 fragmento de 0,9 kpb foi digerido com Sf aNl, o que originou um outro fragmento de 0,9 kpb que foi isolado por electroforese preparativa em gel de agarose.
Foi sintetizado um oligonucleotideo adaptador contendo a seguinte sequência (Fig. 2B):
5’-TGCGATACGATGAA
TATGGTACTTCTAG-5’
Este adaptador contem SfaNl e BamHI 5' overhangs e representa a sequência codificadora dos aminoácidos 34-36 do gene gpl do VZV seguido dos aminoácidos 21-22 de gp350 do EBV. 0 adaptador, o fragmento de 0,9 kpb, e o fragmento de 7,0 kpb foram ligados um ao outro. 0 plasmideo resultante (pAM3, Fig. 2C) foi digerido com Sphl e Smal e o fragmento de 3,7 kpb foi purificado por electroforese preparativa em gel de agarose e subsequentemente provido de extremos cegos com DNA polimerase de T4 (Fig. 3A). 0 fragmento Saci H /n π τη v-is/ 1101
--- -Davidson et al., J. Gen. Virol. 64:1181 (1983)7 do VZV, que circuscreve todo o gene tk, foi clonado em pRES. 0 plasmideo resultante (pPK-1) foi digerido com Accl e Taql, dando origem a um fragmento de 1,5 kpb contendo toda a região codificadora de tk (Fig. 3B). Este fragmento foi purificado por electroforese preparativa em gel de agarose, dotado de extremos cegos com DNA polimerase de T4 e clonado no sitio Smal de pUC13 /Pharmacia Inc., 1984 Catalog # 27-4954-017. 0 plasmideo resultante (pPK-2, Fig. 3C) foi digerido com SphI, que digere em dois sitios dentro da região codificadora de tk, dotado de extremos cegos com DNA polimerase de T4 e ligado ao fragmento de 3,7 kpb. 0 plasmideo resultante (pPK-3, Fig. 3D) contem a casette de expressão de gpl de VZV/gp350 de EBV dentro do gene tk do VZV. pPK-3 foi usado para gerar um VZV recombinante expressando gp350 de EBV, conforme descrito no Exemplo 3 e contem as seguintes caracteristicas principais: 1) sequências delimitantes de tk do VZV para a geraçao de recombinação homóloga entre o DNA de VZV e o plasmideo recombinante. 2) o promotor de gpl de VZV para dirigir niveis altos de expressão de gp350 de EBV durante a replicaçao virai. 3) a sequência condutora de gpl do VZV para a inserção de gp350 no reticulo endoplasmatico rugoso e expressão na membrana plasmatica de células infectadas. 4) região codificadora de gp350 para a expressão das proteínas gp350 de EBV. 5) sequência de ancoragem à membrana de gp350, terminação da traduçao e adiçao de poli A.
EXEMPLO 2
Construção de um gene tk de VZV modificado contendo uma cas sette de expressão codificadora de gp350 de EBV.
pAM3 (Exemplo 1) foi digerido com
Sphl e Smal e o fragmento de 3,7 kpb foi purificado por eleetoforese preparativa em gel de agarose e subsequentemente dotado de extermos cegos com DNA polimerase de T4 (Fig. 4), pPK-1 (Exemplo 1) foi digerido com Nsil, provido de extremos cegos com DNA polimerase de T4 e ligado ao fragmento de 3,7 kpb de pAM3. 0 plasmideo resultante (pPK-4) contem a casset te de expressão de gpl de VZV/gp35O de EBV dentro do gene tk do VZV. pPK-4 foi usado para gerar um VZV recombinante expressando gp350 de EBV conforme descrito no Exemplo 3 e contem as mesmas características importantes do pPK-3 (Exemplo 1) com a seguinte excepçao: As sequências delimitantes de tk foram prolongadas de modo a incluir todo o fragmento SacIH do VZV, aumentando a sequência delimitante 5’em 3,7 kpb e a sequência delimitante 3’ em 0,6 kpb relativamente ao pPK-3.
EXEMPLO 3
Geraçao de vírus VZV recombinante expressando EBMA
VZV/DNA genómico Oka e pPK-3 ou pPK-4, um pg de cada, em 200 ^1 de HBS 2X (NaCl 274 mM, KC1 10 mM, Na2HP04 1,4 mM, dextrose 12 mM, Hepes 42 mM, pH6,9)
mais água destilada estéril (para um volume final de 380 jpl) foi adicionado a um tubo de 12 x 75 mm. Adicionou-se então 20 jil de fosfato de cálcio 2M, Hepes lOmM, pH5,5 e um coprecipitado de DNA formou-se durante 30 minutos a 23°C. 0 precipitado foi adicionado a 1,5 ml de meio de crescimento / Meio de Eagle Modificação de Dulbecco (DMEM) mais 10% de soro fetal de vitela7 cobrindo células MRC-5, semeadas no dia anterior a 3 x 10^ células/placa de cultura de tecidos de 35 mm e incubadas durante 4 horas numa 37°C (Figura 5).
ml de meio de crescimento e
Os meios foram removidos lavadas com células 15% lulas foram de glicerol em HBS IX durante lavadas uma vez mais com meio estufa de C02 a , as células foram adicionou-se às minutos. As céde crescimento e incubadas em 1,5 ml de meio de crescimento durante 24 horas numa estufa de C02 a 37°C. As células foram então tripsinizadas e passadas para placas de 260 mm contendo 4ml de meio de crescimento por placa e incubadas numa estufa de C02 a 37°C até se terem observado placas virais. Cinco a dez dias mais tarde, as células contendo vírus em replicaçao, confor foram tripsi nizadas e passadas para uma monocamada de células MRC-5 B0-90% confluentes. Dois dias mais tarde, quando se observaram placas virais, os meios de crescimento foram substituídos por meio de crescimento fresco contendo 10 jug/ml de um anticorpo monoclonal (McAb) especifico de gp350 EBV / Cl.4, Thorley - Lawson et al. ,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5307 (1980)7 e incubou-se durante 1 hora a 37°C. As células foram então lavadas 3 vezes com DMEM e incubadas durante 1 hora a 37°C na presença de meios de crescimento contendo eritrócitos humanos aos quais imunoglobulina de coelho anti-ratinho foi aco piada de acordo com o seguinte processo: Eritrócitos humanos (tipo AB positivos) foram lavados 5 vezes a 23°C em NaCl 150 mM. Dois ml de IgG de coelho anti-ratinho (1 mg/ml) foram adicionados com vortex suave a 1 ml de eritrócitos lavados e sedimentados. Dois ml de cloreto cromico a 0,033% (p/v), ρΗ 5,0, foram adicionados gota a gota aos eritrócitos com agitaçao constante. As células foram então agitadas durante 7 minutos a 23°C, lavados 5 vezes a 4°C em solução salina, lavadas 1 vez a 4°C em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) e ressuspensas em 50 ml de HBSS para usar a uma diluição de 1:10. Após 1 hora de incubaçao, as células infectadas com vírus foram lavadas mais 3 vezes com DMEM e observadas relativamente à formaçao de rosetas de eritrócitos em placas de VZV; tais rosetas sao indicativas das células que expressam gp350. Aproximadamente 10% das placas eram positivas para rosetas usando o McAb Cl.4. Dois outros McAb específicos de gp350 designados 2L10 e BMA-17 e um soro humano policlonal anti-EBV+ também induziram a formaçao de rosetas, enquanto que o soro humano normal nao. Anticorpos contra gp350 nao foram capazes de induzir a formaçao de rosetas em placas geradas pela transfecçao de VZV/Oka sozinho. Um McAb dirigido contra VPI do vírus da hepatite A foi incapaz de induzir a formaçao de rosetas em placas de VZV recombinante, indicando assim a especificidade deste ensaio para a detecção da expres_ sao de gp350. Vírus sem células foi produzido por sonicaçao de células infectadas durante 2 minutos a 4°C em DMEM e passagem do sobrenadante sonicado através de um filtro de 0,22 jim. 0 VZV recombinante expressando gp350 de EBV pode ser passado como vírus infeccioso sem células e tais clones podem ser passados na presença de 0,01% (p/v) de 5-bromo-2 ’-desoxji uridina, demonstrando assim a recombinaçao dentro do gene tk. Em adiçao, o VZV recombinante foi passado na forma associada a células durante mais de 30 passagens sem revogaçao da sua capacidade para exprimir gp350 de EBV, conforme avaliado pela ligação aos 3 McAb anti-gp350 mencionados atrás.
Prepararam-se Usados a partir de células MRC-5 infectadas com VZV recombinante ou com VZV/Oka parental sujeitos a electroforese em géis de 6% de poliacrilamida e transferidos para nitrocelulose. Com a utilização de um soro policlonal humano anti-EBV+, verificou-se estarem presentes gp350 e gp22O em extratos de células infectadas com VZV recombinante mas nao no extrato
VZV parental. Estas glicoproteinas comigram com estávelmente gp350 trans das com e gp22O produzidas em células L de ratinho fectadas com um plasmideo de expressão eucariótica para gp350.
DNA genómico de VZV de vírus recombinante e parental foi então caracterizado por análise de transferência Southern.
DNA virai purificado, 20pg, foi digerido com BglII, HpaI, Kpnl ou Sall, sujeito a electroforese num gel de 0,8% de agarose, transferido para nitrocelulose e sondado com DNA do —32 gene gp350 que foi marcado comod/ P7dCTP por nick-translation. Apenas fragmentos de DNA presentes nas calhas contendo VZV recombinante hibridaram com a sonda de gp350, demonstrando a ligaçao do gene gp350 dentro do genoma de VZV.
| EXEMPLO 4 | |
| Construção | de um gene tk de VZV modificado contendo uma cas- |
sette de expressão codificadora de preS-l/preS-2/S de HBV.
Purificou-se particulas de Dane (subtipo ayw) a partir do plasma de individuos infectados por técnicas estabelecidas / Landers et al., J. Virology 23:368 (1977)7. 0 DNA genómico de HBV existe numa forma com cortes e hiatos no viriao / Hruska et al., J. Virology 21:666(1977)7. Para preparar este DNA por clonagem molecular usou-se a reacçao de polimerase endógena para produzir DNA de cadeia dupla, circular, covalentemente fechado / Landers et al., J. Viro22
logy 23:368 (1977)7. 0 DNA foi des proteinizado por incubaçao em tampao em tampao contendo dodecilsulfato de sódio e Proteinase K seguido de extracçao com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e concentração por precipitação com etanol. Este DNA purificado é totalmente digerido com EcoRI. 0 vector de clonagem em E. coli, pBR322, também é digerido com EcoRI, ligado com DNA de HBV digerido e usado para transformar E.coli. Isolaram-se plasmideos recombinantes contendo o genoma de HBV numa orientação circularmente permutada à vol ta do único sitio EcoRI, o qual divide toda a região codificadora preS-l/preS-2/S num domínio 5’ de 0,4 kpb e num domínio 3' de 0,8 kpb / Galibert et al., Nature 281:646 (1979)7. Estes dois domínios foram subclonados para a eventual montagem de todo o gene. pUC19 foi digerido com EcoRI e BamHI, depois ligado a um oligonucleotideo sintético que consiste nos 5 últimos nucleotideos da região codificadora, o codao de paragem, um sitio HindIII e um extremo BamHI. A estrutura deste oligonucleotideo é:
ATACATTTAAAGCTTG
TGTAAATTTCGAACCTAG
A porção 3' do gene preS-1/preS-2/S consistindo num fragmento EcoRI-AccI de 0,8 kpb foi clonado neste vector (pUC19/DSD). pUC18 / Yanisch-Perran et al., Gene 33:103 (1985)7 foi digerido com HindIII e EcoRI e ligado ao oligonucleotideo sintético de 72 pb que reconstitui a ORF completa desde o sitio BamHI a montante do ATG distai passando por uma sequência condutora nao traduzida de 10 pb até um extremo compatível HindIII. A estrutura deste oligonucleotideo é:
AGCTTACAAAACAAAATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTTT
T
ATGTTTTGTTTTACCCCGTCTTAGAAAGGTGGTCGTTAGGAGACCCTAAAA
A
TCCCGACCACCAGTTG
AGGGCTGGTGGTCAACCTAG (* a sequência natural contem C em vez de T; a alteraçao acji ma destrói o sitio HinfI sem alterar o aminoácido codificado). 0 fragmento BamHI - EcoRI de 0,4 kpb do domínio 5' foi então ligado a este vector de clonagem (pUC19/DSD) ligado a oligonucleotideo. Os clones 5' pUC18 e 3’ pUC19 foram amplificados por crescimento em E.coli e as regiões codificadoras foram retiradas dos plasmideos isolados por digestão como fragmentos HindIII - EcoRI. Estes fragmentos foram ligados, digeridos com HindIII, dotados de extremos cegos com o fragmento PoII da DNA polimerase I e a ORF completa com extremos cegos foi clonada em pUC18 que foi digerido com BamHI e provido de extremos cegos com o fragmento Poli da DNA polimerase I (pUC18/PSSC).
Para se obter um fragmento contendo o promotor de gpl do VZV, pHSGO-12 foi digerido com Aval e o fragmento de 3,7 kpb foi purificado por electroforese preparativa em gel de agarose. Este fragmento contem as sequências do promotor de gpl do VZV excluindo 0,05 kpb imediatamente 5' em relaçao ao codao de iniciaçao da traduçao ATG da gpl do VZV. Sintetizaram-se quatro oligonucleotideos com as seguintes sequências:
1# 5’ - TCGGGCGAATTGCGTGGTTTTAAG #2 CGCTTAACGCACCAAAATTCACTGAT - 5' #3 5' - TGACTATATTCCGAGGGTCGCCTGTAT #4 ATAAGGCTCCCAGCGGACATAGATC - 5'
Os oligonucleotideos #1 e #2 foram hibridados e da mesma forma os oligonucleotideos #3 e #4. Os dois pares foram então ligados um ao outro originando um adajj tador de 55 pb contendo projecçoes 5’ Aval e Xbal o que representa a sequência do promotor de gpl do VZV imediatamente 5' relativamente à sequência codificadora de gpl do VZV. Este adaptador de 55 pb foi ligado ao fragmento de 3,7 kpb de pVSGO-12, a mistura foi digerida com EcoRV e o fragmento de o,9 kpb foi purificado por electroforese preparativa em gel de agarose e subsequêntemente dotado de extremos cegos com DNA polimerase de T4. 0 fragmento de 0,9 kpb purificado foi então clonado no sitio Smal de pUC18/PSSC. Este vector (contendo o promotor de gpl do VZV e a região codificadora de preS-1/preS-2/S) foi digerido com Saci e PstI, dotado de extremos cegos com DNA polimerase de T4 e clonado no sitio Nsil de extremos cegos (pela DNA polimerase de T4) do pPK-1, originando assim pPK-5. Este plasmídeo (pPK-5) foi usado na obtenção de uma linha de células Vero expressando preSl/preS2/S que contem as seguintes características principais: 1) o promotor de gpl do VZV e o sitio de cap do RNA; 2) toda a sequência codificadora da proteína preSl/preS2/S de HBV; e 3) a sequência de terminação da transcrição e de adiçao de poliA.
EXEMPLO 5
Obtenção de VZV recombinante que expressa preS-1/preS-2/S.
| pPK-5 e DNA genómico VZV/Oka, um | |
| jig de cada, exactamente | foram coprecipitados e adicionados a células MRC-5 conforme dsecrito no Exemnlo 3. As células infec- |
tadas com VZV recombinante foram testadas quanto à produção de preS-l/preS-2/S de HBV por meio de um anticorpo especifico e de eritrócitos humanos indicadores exactamente conforme descrito no Exemplo 3, resultando na identificação de aproximadamente 10Z das placas como positivas para preS-l/preS-2/ /S de HBV. Os anticorpos contra proteínas ”S” de HBV nao sao capazes de induzir a formaçao de rosetas em placas obtidas por transfecçao de VZV/Oka sozinho. Um McAb dirigido contra VPI do vírus da hepatite A é incapaz de induzir a formaçao de rosetas em placas de VZV recombinante, indicando assim a especificidade deste ensaio para a detecçao da expressão de preS-l/preS-2/S: 0 vírus sem células foi obtido por sonicaçao de células infectadas durante 2 minutos a 4°C em DMEM e passagem do sobrenadante sonicado através de um filtro de 0,22 ^im. 0 VZV recombinante expressando preS-1/preS-2/S de HBV pode ser passado como vírus infeccioso sem células e tais clones podem ser passados na presença de 0,01Z (p/v) de 5-bromo-2-desoxiuridina, demonstrando a recombinação dentro do gene tk. A expressão foi ainda confirmada pela detecçao de HbsAg por reactividade em AUSTRIA (Abbott) em lisados de culturas.
Os lisados sao preparados a partir de células MRC-5 infectadas com VZV recombinante o VZV/Oka parental, submetido a electroforese em géis de 6Z de poliacrilamida e passados para nitrocelulose por transferência VJes tern. Com a utilização de um soro anti-proteina S” de HBV assim como um soro anti-preS, encontrou-se a presença de proteínas preS-l/preS-2/S em extratos de células infectadas com VZV recombinante mas nao em extratos de células infectadas com VZV parental. Estas proteínas comigram com proteínas S derivadas das partículas Dane de HBV. 0 DNA genómico de VZV de vírus recombinante e parental foi então caracterizado por análise de transferências Southern. 0 DNA virai purificado, 20 ^ug, foi digerido com BglII, Hpal,Kpnl ou Sall, sujeito a electroforese num gel de 0,8% de agarose, transferido para nitrocelulose e sondado com DNA do gene preS-1/ /preS-2/S de HBV que foi marcado com <^/_ P7dCTP por nicktranslation. Apenas fragmentos de DNA presentes nas calhas contendo VZV recombinante hibridam com a sonda gp350, demonjs trando a ligaçao do gene preSl/preS2/S do HBV dentro do genoma do VZV.
EXEMPLO 6 vírus sem células obtido de acordo com o exemplo 3 por sonicaçao de células infectadas foi administrado subcutâneamente a um grupo de 4 macacos Callithrix jacchus num nivel de dosagem de 107 PFU/animal. Um placebo de soro fisiológico foi administrado subcutâneamente a um grupo testemunha de quais 4 macacos Callithrix jac8 chus. Após 30 dias ambos os grupos foram testados com 10 PFU de EBV. Durante um período de observação de 6 meses após o ensaio nenhum dos macacos do primeiro grupo mostrou qualquer sinal de replicaçao de EBV enquanto que todos os animais na testemunha apresentavam sinais de replicaçao do EBV. Este
resultado demonstra o desenvolvimento de uma resposta imune no primeiro grupo antes do ensaio.
Claims (11)
1-. - Vírus de varicela-zoster (VZV) caracterizado por se apresentar modificado pela presença no seu genoma de DNA nao-VZV.
2a. - VZV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o DNA nao-VZV conter a sequência codificadora de um polipeptideo adjacente a uma sequência de promotor adaptada a dirigir a transcrição do DNA nao-VZV.
3a. - VZV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o DNA nao-VZV conter mais de uma sequência codificadora, cada uma das sequências codificando um polipeptideo diferente e cada sequência estando adjacente a uma sequência de promotor adaptada a dirigir a trans crição do DNA nao-VZV adjacente.
4a. - VZV de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência codificadora especificar uma proteina imunogénica de um agente patogénico para o homem.
5a. - VZV de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência codificadora especificar gp 350 do vírus Epstein-Barr.
6a. - VZV de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência codificadora especificar preSl/preS2/S de HBV.
com reivindicação 1,
9a. - Método para produzir VZV de caracterizado por compreender acordo a aplicaçao a uma monocamada celular, de um melo contendo DNA de VZV e nao-VZV, em que o DNA nao-VZV está ligado a sequências colineares com o DNA presente numa região nao essen ciai ao genoma do VZV.
10a. - Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a região nao essencial ser o gene da timidina cinase.
11a. - Processo para a preparaçao de uma vacina caracterizado por se incluir na referida vacina VZV, de acordo com a reivindicação 1, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
12§. - Processo para a preparaçao de uma vacina caracterizado por se incluir na referida vacina VZV, de acordo com a reivindicação 3, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
13â. - Método de imunização contra a varicela e pelo menos um outro agente patogénico, caracterizado por compreender a administraçao, a um membro de uma espécie susceptível, do produto da reivindicação 2, numa quantidade eficaz para induzir uma resposta imune, sendo a gama de dosagem de 100 a 10.000 PFU (Unidades Formadoras de Placa).
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