ES2581576T3 - Polinucleótidos que permiten la expresión y la secreción de pseudovirus recombinantes que contienen epítopos extraños, su producción y utilización - Google Patents

Abstract

Virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicación que comprende: un genoma de virus de la hepatitis B defectuoso para la expresión de la proteína de cápside del virus de la hepatitis B (HBc), en el que el virus contiene una secuencia de nucleótidos de hasta aproximadamente 195 nucleótidos codificante de un péptido extraño que no se encuentra en el virus de la hepatitis B de tipo natural que comprende por lo menos un epítopo inmunodominante, en el que dicho péptido extraño comprende epítopo(s) que provoca(n) la respuesta de linfocitos T, y en el que el gen dianizado para la inserción de epítopo es el gen codificante de la nucleocápside.

Description

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DESCRIPCION

Polinucleotidos que permiten la expresion y la secrecion de pseudovirus recombinantes que contienen epftopos extranos, su produccion y utilizacion.

La presente invencion se refiere a un virus recombinante defectuoso para la replicacion implicado en una infeccion persistente, y a pseudovirus recombinantes y competentes para la replicacion, que comprenden el virus recombinante defectuoso para la replicacion, y a la produccion de los virus en celulas huesped. El virus recombinante defectuoso para la replicacion y el pseudovirus competente para la replicacion pueden contener uno o mas epftopos extranos, tal como residuos aminoacidos extranos de un patogeno. El virus defectuoso para la replicacion y el pseudovirus competente para la replicacion resultan particularmente utiles en composiciones inmunogenicas y como vacunas terapeuticas. La presente invencion se refiere ademas a respuestas de linfocitos T a la infeccion vfrica y a virus recombinantes que administran epftopos antigenicos extranos en el hfgado e inducen respuestas inmunitarias especfficas de epftopo.

Antecedentes de la invencion

Desde hace mas de dos decadas se dispone de una vacuna eficaz contra la infeccion por el virus de la hepatitis B (VHB). Sin embargo, 400 millones de personas (mas del 5% de la poblacion mundial) se encuentran cronicamente infectados por el VHB. Mas de 1 millon de personas mueren cada ano de cirrosis hepatica relacionada con el VHB y de carcinoma hepatocelular (Ganem D., Prince A.M., Hepatitis B virus infection: natural history and clinical consequences, N. Engl. J. Med. 350:1118-29, 2004).

El VHB es principalmente, no directamente, citopatico. La respuesta inmunitaria contra los antfgenos vfricos se cree que es responsable tanto de la enfermedad hepatica como de la eliminacion vfrica tras la infeccion por el VHB (Ganem et al., 2004). Las respuestas inmunologicas con linfocitos T citotoxicos CD8+ (LTC) especfficos de virus y linfocitos T auxiliares (Th) cD4+ desempenan funciones efectoras y reguladoras clave tanto en la patogenesis hepatica como en la eliminacion vfrica. La infeccion aguda por el VHB en adultos inmunocompetentes habitualmente resulta en una enfermedad hepatica autolimitada transitoria seguida de la eliminacion vfrica y se caracteriza por respuestas vigorosas de LTC policlonales y de Th tipo 1 para varios epftopos presentes en las protefnas vfricas del VHB.

Los pacientes con infeccion vfrica aguda que eliminan con exito el virus manifiestan una respuesta de linfocitos T citotoxicos (LTC) policlonal multiespecffica que es especffica para varios epftopos en las protefnas de nucleo, polimerasa y cubierta. Tambien resultan activadas las celulas Th especfficas de virus, por ejemplo especfficas del VHB. Las respuestas de tipo Th1 multiespecfficas han sido detectadas en pacientes que eliminan con exito el VHB tras la infeccion aguda (Chisari et al., Hepatitis B virus immunopathogenesis, Annu. Rev. Immunol. 13:29-60, 1995).

La respuesta de linfocitos T especffica del VHB es debil o indetectable en pacientes que desarrollan una infeccion cronica y los mecanismos responsables de la hiper-respuesta de linfocitos T o la tolerancia en la infeccion cronica no se conocen por completo. En los pacientes infectados cronicamente, la respuesta de linfocitos T CD8+ perifericas es indetectable o debil y la respuesta de linfocitos T CD4+ es mucho menos vigorosa que en pacientes que eliminan la infeccion.

Aunque las linfocitos T efectores funcionales se generan inicialmente durante los estadios tempranos de la infeccion, pierden gradualmente funcion durante el curso de una infeccion cronica debido a la regulacion positiva del receptor inhibidor 1 de muerte programada (MP-1) (Chisari et al., 1995). En consecuencia, en pacientes cronicas que eliminan espontaneamente el antfgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y desarrollan anticuerpos anti-HB neutralizadores, se han detectado respuestas de linfocitos T especfficos del VHB en sangre inmediatamente antes de la seroconversion. Tambien se ha demostrado que la reduccion terapeutica eficaz de la carga vfrica de VHB resulta en una restauracion transitoria de las respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ especfficos del VHB en la sangre de los pacientes con hepatitis B cronica.

Los mecanismos responsables de la hiposensibilidad y agotamiento de los linfocitos T durante la infeccion persistente por el VHB todavfa no se conocen por completo (Rehermann B., Nascimbeni M., Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection, Nat. Rev. Immunol. 5:215-29, 2005). El agotamiento de las respuestas de linfocitos T observado durante la infeccion vfrica persistente refleja un equilibrio entre las funciones efectoras requeridas para eliminar el patogeno y el potencial de los linfocitos T de causar inmunopatologfas. Las funciones alteradas de las celulas dendrfticas y la presencia de linfocitos T reguladores CD4+CD25+ tambien contribuyen a la persistencia vfrica. Ademas, el hfgado inclina particularmente la respuesta intrahepatica de linfocitos T hacia la tolerancia o la anergia.

La inmunoterapia activa basada en epftopos vfricos especfficos y la inyeccion de vacuna de la hepatitis proporciona enfoques prometedores en la induccion de respuestas inmunitarias celulares eficientes. Un estudio anterior de un ensayo clfnico de fase I sugiere que la vacunacion con ADN del VHB podrfa restaurar especfficamente la capacidad de respuesta de los linfocitos T en portadores cronicas del VHB. Sin embargo, la activacion de los linfocitos T

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especfficos del VHB aparentemente era transitoria y se vefa seguida de un declive progresivo con posteriores inyecciones de ADN (Mancini-Bourgine M., Fontaine H., Scott-Algara D., Pol S., Brechot C., Michel M.L., Induction or expansion of T-cell responses by a hepatitis B DNA vaccine administered to chronic HBV carriers, Hepatology 40:874-82, 2004). Por lo tanto, sortear la potencial tolerancia de los linfocitos T a los antfgenos del VHB resulta ser el punto mas crucial en la inmunoterapia.

En conjunto lo expuesto anteriormente sugiere que, para tratar la hepatitis cronica, por ejemplo la infeccion por el VHB, las respuestas intrahepaticas de linfocitos T deberfan conmutarse de un estado de agotamiento o anergia a un estado en el que los linfocitos T efectores fuesen plenamente eficientes (Bertoletti A., Gehring A.J., The immune response during hepatitis B virus infection, J. Gen. Virol. 87:1439-49, 2006; Rehermann et al., 2005).

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, existe una necesidad en la tecnica de nuevas terapias para el tratamiento de la infeccion de la hepatitis cronica, por ejemplo la infeccion de la hepatitis B. Estas terapias tambien deberfan ser generalmente utiles en el tratamiento de otras infecciones vfricas persistentes. Las terapias tambien deberfan ser especfficas para celulas infectadas por el virus implicado en la infeccion persistente. Por ejemplo, en el caso de una infeccion vfrica de hepatitis, las terapias deberfan ser especfficas para las celulas infectadas por el virus de la hepatitis, especialmente para los hepatocitos humanos (Rehermann et al., 2005).

Sumario de la invencion

La presente invencion ayuda a satisfacer dichas necesidades de la tecnica. Para conseguir dichos resultados, la presente invencion da a conocer un virus recombinante defectuoso para la replicacion que se mantiene simultaneamente in vivo con el virus de tipo natural en las celulas infectadas por dicho virus y que contribuye inmunologicamente, tras la complementacion, a la eliminacion del virus mediante la expresion de epftopos antigenicos extranos en las celulas infectadas por virus. La invencion proporciona un pseudovirus para conseguir dichos resultados. El virus recombinante defectuoso de la invencion comprende un genoma defectuoso para la expresion de una protefna esencial para la replicacion del virus. Son ejemplos de estas protefnas, las protefnas estructurales y, mas particularmente, las protefnas de capside.

La invencion da a conocer ademas una nueva estrategia de vacuna modelada a partir de la utilizacion de virus de la hepatitis como vector para la administracion de epftopos antigenicos extranos en el hfgado. La presentacion de estos epftopos por parte de las celulas hepaticas atraerfa, a su vez, respuestas de linfocitos T eficientes (es decir, no agotados) contra el tejido diana, por ejemplo el hfgado, y contribuirfa a la eliminacion del virus.

En un primer aspecto de la invencion, el virus recombinante defectuoso para la replicacion es el virus de la hepatitis B que se mantiene simultaneamente in vivo con el virus de la hepatitis de tipo natural en los hepatocitos infectados por el virus de la hepatitis y que contribuye inmunologicamente, tras la complementacion, a la eliminacion del virus de la hepatitis mediante la expresion de epftopos antigenicos extranos en hepatocitos infectados por el virus de la hepatitis. La invencion proporciona un pseudovirus de la hepatitis B para conseguir dichos resultados.

Mas particularmente, la invencion da a conocer el diseno de polinucleotidos y proporciona vectores de expresion para la clonacion y expresion de peptidos o polipeptidos extranos, tales como poliepftopos Flu, en el pseudovirus. En una forma de realizacion, los polinucleotidos y vectores de expresion se disenan para la clonacion y expresion de peptidos o polipeptidos extranos, tales como poliepftopos Flu, en el pseudovirus de la hepatitis. Se han disenado polinucleotidos y vectores de expresion que comprenden dichos polinucleotidos, la totalidad de los cuales conserva la capacidad de formar pseudovirus de hepatitis recombinantes.

En una forma de realizacion, la presente invencion proporciona un virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion que comprende un genoma de virus de la hepatitis defectuoso para la expresion de la protefna de capside del virus de la hepatitis (HBc). El virus contiene una secuencia de nucleotidos de hasta aproximadamente 195 nucleotidos codificante de por lo menos un epftopo inmunodominante de un patogeno. La secuencia de nucleotidos se encuentra situada entre el residuo nucleotfdico 1981 y el residuo nucleotfdico 2308 del genoma ayw3 del VHB (la numeracion se inicia en el sitio EcoRI del genoma del vHb, n° de acceso de NCBI V01460). La hepatitis B es un virus preferente para la utilizacion en la practica de la invencion.

Se proporciona ademas una celula de vertebrado, transfectada por el virus recombinante sin capacidad de recombinacion de la invencion. En una forma de realizacion, la celula de vertebrado es una celula hepatocito aislada y el virus es el virus de la hepatitis B. Se da a conocer que el virus recombinante puede producirse mediante cotransfeccion de una lfnea celular hepatocftica, tal como Huh 7 (11) o Hep G2 (12) con uno de los dos constructos prHBV1.3-III o prHBV1.3-IV con un plasmido codificante de la capside tipo natural (pCMV-nucleo o pMAS-nucleo) o mediante transfeccion con un plasmido tal como prHBV1.3/HB, que porta 1,3 copias del genoma VHBr y un casete de expresion adicional para la protefna nuclear de tipo natural del VHB. La celula hepatocito puede comprender ademas una secuencia de nucleotidos codificante de HBc para la complementacion del virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion para formar el pseudovirus de la hepatitis.

De esta manera, la presente invencion proporciona un pseudovirus competente para la replicacion que comprende el

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virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion, complementado con la protefna de capside del virus, en el que el pseudovirus se replica in vitro en las celulas humanas. En una forma de realizacion, el pseudovirus competente para la replicacion es un pseudovirus de la hepatitis B que comprende el virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion complementado con HBc, en el que el pseudovirus se replica in vitro en los hepatocitos humanos.

Ademas, la presente invencion proporciona una celula de vertebrado que expresa el pseudovirus. En una forma de realizacion, la celula de vertebrado es una celula hepatocito que expresa el pseudovirus de la hepatitis.

Ademas, la presente invencion proporciona un metodo de formacion de un pseudovirus competente para la replicacion, en el que el metodo comprende cultivar las celulas aisladas infectadas de la invencion bajo condiciones para la expresion de la secuencia de nucleotidos codificante de la protefna de capside del virus y la complementacion del virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion para formar los pseudovirus, que opcionalmente puede ser secretado de la celula hospedadora al espacio extracelular. En una forma de realizacion, el metodo puede utilizarse para formar un pseudovirus de la hepatitis competente para la replicacion mediante el cultivo de las celulas hepatocitos infectados de la invencion bajo condiciones para la expresion de la secuencia de nucleotidos codificante de HBc y la complementacion del virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion para formar el pseudovirus de la hepatitis B, que opcionalmente puede secretarse de la celula hospedadora al espacio extracelular.

Se da a conocer ademas un polinucleotido que se hibrida bajo condiciones restrictivas con el virus recombinante defectuoso para la replicacion o su complemento. Se describe que el polinucleotido se hibrida bajo condiciones restrictivas al virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion o su complemento.

Se proporciona ademas un vector de clonacion y/o de expresion que comprende el virus recombinante defectuoso para la replicacion. En una forma de realizacion, el vector de clonacion y/o expresion comprende el virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion.

Se describen ademas polipeptidos codificados por el virus recombinante defectuoso para la replicacion y por el pseudovirus competente para la replicacion. Se da a conocer ademas que los polipeptidos se encuentran codificados por el virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion y por el pseudovirus de la hepatitis competente para la replicacion.

Ademas, la presente invencion proporciona una celula hospedadora eucariotica aislada que comprende un vector de la invencion. Se da a conocer que el vector en la celula hospedadora eucariotica comprende una secuencia promotora eucariotica operablemente ligada a una secuencia de nucleotidos para la expresion de pseudovirus de la hepatitis. Opcionalmente, el vector puede comprender una secuencia de nucleotidos codificante de una protefna de fusion que comprende un polipeptido extrano y una protefna vfrica, en el que la celula hospedadora eucariotica produce pseudovirus que comprenden la protefna de fusion. En una forma de realizacion, la protefna de fusion comprende una protefna de la hepatitis y la celula hospedadora eucariotica produce pseudovirus de la hepatitis que comprenden la protefna de fusion.

Se da a conocer ademas un vector derivado del genoma del VHB. El genoma del VHB se modifica con el fin de expresar uno o mas epftopos antigenicos extranos fusionados dentro de la parte N-terminal de la protefna de capside del VHB, rindiendo un virus VHB recombinante que se mantendra simultaneamente en el hfgado de los individuos infectados por el VHB mediante complementacion con la capside de tipo natural. El genoma del VHB puede modificarse adicionalmente para permitir la expresion y presentacion de uno o mas epftopos extranos en la superficie de los hepatocitos tras la infeccion con dicho virus VHB recombinante. El epftopo o epftopos antigenicos extranos pueden obtenerse de patogenos comunes que se presentan asociados a moleculas del CMH de clase I y sirven como dianas de la respuesta inmunologica de linfocitos T CD8+ del huesped. De esta manera, la replicacion del vector del VHB recombinante en hepatocitos ya infectados por el VHB puede contribuir inmunologicamente a la eliminacion del VHB mediante la expresion del epftopo o epftopos antigenicos extranos en los hepatocitos infectados por el VHB.

Solo las celulas infectadas por virus que permiten la replicacion del vector virus recombinante de la invencion son las dianas de la respuesta inmunologica. En una forma de realizacion, las celulas infectadas por virus son hepatocitos infectados por virus de la hepatitis que permiten la replicacion del vector del virus de la hepatitis recombinante de la invencion. El virus recombinante defectuoso para la replicacion transmite uno o mas epftopos antigenicos (por ejemplo poliepftopos) mediante el pseudovirus competente para la replicacion de la invencion en las celulas de un vertebrado y seguidamente induce fuertes respuestas inmunologicas especfficas de (poli)epftopo. En una forma de realizacion, el virus recombinante defectuoso para la replicacion es un virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion y las celulas de vertebrado son hepatocitos aislados. El virus de la hepatitis se elimina mediante mecanismos citolfticos o no citolfticos.

El pseudovirus de la invencion resulta en la induccion de respuestas inmunologicas robustas y la potenciacion del estado de activacion de los linfocitos T CD4+ y CD8+ especfficos de secuencia de manera que el pseudovirus puede

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utilizarse en aplicaciones terapeuticas. En una forma de realizacion, el pseudovirus de la invencion es un pseudovirus de la hepatitis.

El DAN de prHBV1.3 puede utilizarse como vacuna de ADN para la intervencion terapeutica en pacientes infectados cronicamente por el VHB. Este constructo expresa las tres protefnas de cubierta del VHB, la polimerasa y la protefna HBx. El vector no es replicante al administrarlo en forma de ADN mediante una via sistemica. El constructo pCMV- rHBe codifica una forma secretada de HBeAg que porta epftopos extranos. Induce respuestas de linfocitos T especfficos para el epftopo extrano y puede utilizarse como vector para la inmunizacion con ADN contra patogenos que portan dichos epftopos.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la invencion proporciona una composicion que comprende el virus defectuoso para la replicacion de la invencion y una vacuna que comprende dicha composicion. Las vacunas de la invencion pueden administrarse en un paciente infectado persistentemente con un virus con el fin de estimular una respuesta de linfocitos T contra las celulas infectadas con el virus. De esta manera, la invencion contempla ademas la utilizacion de los virus recombinantes defectuosos para la replicacion de la invencion, para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un paciente infectado persistentemente con el virus de tipo natural. La invencion contempla ademas un metodo para dirigir la expresion de un epftopo en una celula infectada por un virus al proporcionar a la celula el virus recombinante defectuoso para la replicacion de la invencion.

Se dan a conocer ademas anticuerpos contra las protefnas de fusion antigenicas quimericas producidas por los pseudovirus de la invencion.

La invencion da a conocer ademas un raton, por ejemplo un raton doble transgenico HLA-A2/DR1 o HbsAg/HLA-A2, que comprende un plasmido indicado en la presente memoria. El plasmido puede haber entrado en las celulas del raton utilizando cualquier metodo conocido de la tecnica para la produccion de animales transgenicas. En una forma de realizacion, el animal recibe una inyeccion intramuscular o hidrodinamica, por ejemplo en una vena de la cola.

El animal puede comprender prHBV-1.3, por ejemplo prHBV-1.3-III o prHBV-1.3-IV. En una forma de realizacion, el animal transgenico comprende un plasmido que comprende una secuencia polinucleotida codificante de rHBe_111, rHBe_IV, polftopo III o polftopo IV.

Se da a conocer que el porcentaje de linfocitos T CD8+ del animal transgenico se incrementa en respuesta a la infeccion con un pseudovirus de la invencion.

Se da a conocer que el animal transgenico monta una respuesta de linfocitos T especffica de epftopo contra un pseudovirus de la invencion. En una forma de realizacion, se expresa un rHBV en las celulas hepaticas, con un antfgeno extrano codificado que se procesa en polipeptidos para el reconocimiento inmunologico.

La invencion describe un metodo de vacunacion de un animal infectado cronicamente por un virus patogenico, mediante la provision de un pseudovirus recombinante competente para la replicacion que comprende el virus recombinante defectuoso para la replicacion, complementado por la protefna de capside del virus. En una forma de realizacion, el animal es un mamffero, por ejemplo un ser humano. En una forma de realizacion, el plasmido es cualquiera de los plasmidos de la invencion, tal como se indica en mayor detalle en la presente memoria.

Breve descripcion de los dibujos

El archivo de la patente o solicitud contiene por lo menos un dibujo realizado en color. La Oficina proporcionara copias de la presente patente o solicitud publicada de patente con uno o mas dibujos en color previa solicitud y pago de las tasas requeridas.

La presente invencion se describe haciendo referencia a los dibujos, en los que:

la figura 1 es un diagrama esquematico de un vector recombinante denominado VHBr complementado con un plasmido que expresa HBc para formar un pseudovirus de la invencion que contiene epftopos extranos, los cuales pueden estimular respuestas de CD4+ y CD8+ a hepatocitos infectados por el pseudovirus.

La figura 2 representa un constructo denominado prHBV-1.3-IV que contiene un polftopo (poliepftopo), asf como el constructo denominado polftopo IV.

Las figuras 3A-3C ilustran el rescate de ADN del VHBr a partir de una lfnea celular hepatocftica humana cotransfectada con prHBV-1.3-111 y un plasmido que expresa la capside (nucleo PMAS).

Figura 3A: el ADN del VHB se amplifico por PCR.

Figura 3B: representa la produccion de HBsAg portador de partfculas en el sobrenadante a partir de dichas celulas.

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Figura 3C: representa el rescate de viriones LHB. Lo anterior tambien se ilustra en la figura 12D.

La figura 4 muestra la deteccion mediante transferencia western del antfgeno recombinante rHBe tras la transfeccion transitoria en la lfnea celular HepG2 (ATCC numero HB-8065).

Las figuras 5A-5B muestran la deteccion mediante tincion inmunofluorescente con anticuerpos del antfgeno recombinante rHBe tras la transfeccion transitoria en la lfnea celular HepG2. Lo anterior tambien se muestra en la figura 12B.

Las figuras 6A-6D muestran la inmunotincion del antfgeno recombinante extrano en secciones de hfgado tras la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3-III en ratones (ATCC numero HB-8065). Lo anterior tambien se muestra en la figura 12C.

La figura 7 muestra respuestas celulares al poliepftopo en el genoma del VHBr de ratones HLA-A2/DR1 Tg, detectadas mediante ensayo ELISPOT (panel izquierdo) y mediante un ensayo de proliferacion (panel derecho; lo anterior tambien se muestra en la figura 14C).

La figura 8 muestra la respuesta inmunologica de ratones HLA-A2/DRB1 Tg inmunizados con pCMV-rHBe-IV. El panel izquierdo muestra la respuesta inmunodominante a un epftopo derivado de la protefna matricial del virus influenza. Lo anterior tambien se muestra en la figura 14A. El panel derecho muestra la deteccion en celulas de bazo de linfocitos T CD8+ especfficos de Flu marcadas con tetrameros HLA-A2 portadores del epftopo Flu en ratones HLA-A2/DRB1 no inmunizados (parte superior derecha) o inmunizados (parte inferior derecha). Lo anterior tambien se muestra en la figura 14B.

La figura 9 muestra la respuesta de linfocitos T tras la inyeccion hidrodinamica de prHBV-1.3III a traves de la vena de la cola del raton (ensayo ELISPOT).

Las figuras 10A-10C muestran las respuestas de linfocitos T a un poliepftopo in vivo y la localizacion de linfocitos T especfficos de Flu en el hfgado de ratones tras la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3. Lo anterior tambien se muestra en las figuras 15A-15D.

La figura 10A: lfnea temporal de inmunizacion; prHBV1.3 (caja con puntos), pCMV-pGal (plasmido de control, cuadrado blanco), pCMV-rHBe (cuadrado gris).

La figura 10B: analisis de separacion celular activada por fluorescencia (FACS) de linfocitos infiltrantes en el hfgado; ratones no inyectados (panel B1), ratones que recibieron pCMV-pGal (panel B2), ratones receptores de prHBV1.3 (panel B3); paneles inferiores que muestran la tincion de linfocitos T especfficos de Flu para cada tratamiento.

La figura 10C: localizacion de linfocitos T y linfocitos T especfficos de Flu en bazo (panel superior) e hfgado (panel inferior); ratones receptores de inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 (columnas con puntos), ratones receptores de pCMV-pGal (columnas blancas), ratones receptores de pCMV-rHBe (columnas grises).

Las figuras 11A-11D muestran una representacion esquematica de constructos y plasmidos de VHBr.

Figura 11A: El ARN pregenomico de HBV (HBV/pgARN) es representado mediante una lfnea azul delgada con un sitio de colocacion de caperuza (cap), senales de encapsidacion (e), de poliadenilacion (An) indicados. La distancia entre los codones AUG del nucleo y los marcos de lectura abiertos de polimerasa (pol) es de 406 nucleotidos (nts).

Figura 11B: Es representado el ARN pregenomico de rHBV; una secuencia de ADN corta (en azul) que codifica el poliepftopo antigenico extrano es insertada enmarcada ("in-frame") dentro del marco de lectura abierto de nucleo, permitiendo la expresion de una protefna quimerica (rHBc).

Figura 11C: Una representacion esquematica del dominio que codifica rHBc representa dos codones ATG enmarcados para la expresion del antfgeno HBe y para la protefna nuclear, respectivamente. Un polipeptido que comprende un epftopo de linfocitos B (FLAG) utilizado como un marcador de deteccion; tres epftopos de linfocitos T CD8 de HLA-A2 restringidos derivados respectivamented de Gag de VIH, matriz de gripe, y protefnas de EBV BMLF-1; y un epftopo de linfocitos T CD4- PADRE universal. Las secuencias de poliepftopo son insertadas enmarcadas dentro de la parte aminoterminal del gen nuclear.

Figura 11D: Es presentada una representacion esquematica de los plasmidos. El plasmido pCMVrHBc permite la expresion de rHBc asf como el genoma de rHBV bajo el control del promotor genico temprano CMV (P-CMV). El plasmido prHBV1.3 es portador de las copias 1.3 del genoma de rHBV. El plasmido prHBV1.3/HBc es portador, ademas de las copias 1.3 del genoma de rHBV, de un casete para la expresion del gen nuclear de HBV de tipo

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natural, bajo el control de un promotor genico temprano SV40 (P-SV40), y utiliza una o mas senales derivadas genicamente de hormona de crecimiento bovina (BGH pA). Las posiciones de los ORF de nucleo con la secuencia codificante de poliepftopo son indicadas mediante unas flechas. Las posiciones de nucleotidos son indicadas segun la secuencia del subtipo D ayw del genotipo de HBV. La posicion 0 corresponde al sitio EcoRI y la posicion 1981 corresponde al extremo 3'de la senal de poliadenilacion para el ARNm en el genoma de HBV.

Las figuras 12A a 12D representan la expresion de rHBV y la protefna antigenica quimerica. Figura 12A: Analisis de transferencia western del lisado celular obtenido tras la transfeccion de la estirpe celular HepG2 (numero de ATCC HB-8065) con los plasmidos pFLAG-PCNA o prHBV1.3. Los pesos moleculares del antfgeno nuclear de celulas en proliferacion (PCNA) fusionado con Flag (lfnea 1; control) y rHBc (lfnea 2) son estimados segun los marcadores de peso molecular (kilodaltons (KDa)).

Figura 12B: tincion inmunofluorescente de celulas HepG2 transfectadas con plasmido prHBV1.3 utilizando anti- HB (panel superior) o anticuerpos anti-FLAG (panel inferior). Los nucleos tenidos con dApI se muestran en azul.

Figura 12C: marcaje de anticuerpos (anti-HB, panel izquierdo y anti-FLAG, panel derecho) y tincion inmunofluorescente en seccion de hfgado obtenidas de ratones (ATCC numero HB-8065) cuatro dfas despues de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3.

Figura 12D: cuantificacion de partfculas de HBsAg que contienen protefna VHB-L mediante ELISA de tipo sandwich. Se utilizaron anticuerpos monoclonales especfficos de PreS1 (5a91 y 18-7) como anticuerpos de captura para detectar la protefna L en sobrenadantes de cultivo de celulas Huh-7 transfectadas con dos proporciones diferentes de plasmidos prHBV1.3 (VHBr) y pMAS-c (CORE) o con un plasmido de control plRES- EGFP (EGFP). Los resultados se expresan como densidades opticas (DO) a 450 nm, mediante ELISA.

Las figuras 13A-13D muestran la encapsidacion del genoma de VHBr con protefna nuclear de tipo natural.

Figura 13A: ADN vfrico detectado mediante ensayo de transferencia southern con una sonda especffica del VHB en los sobrenadantes de cultivo celular de celulas Huh 7 transfectadas con dos concentraciones diferentes de los plasmidos prHBV1.3 (carriles 1 y 3) o prHBV1.3/HBc (carriles 2 y 4). Se extrajo el ADN del VHB de tipo natural de la lfnea celular HepAD38 como control (carril 5). Se indican las bandas correspondientes al ADN del VHB circular relajado (CR), lineal de doble cadena (LDC) y de cadena sencilla (CS). M: marcadores de peso molecular (Kb). HBc + indica la expresion de protefna de capside por el vector utilizado en experimentos de transfeccion.

Figura 13B: resultados del ensayo ELISA de comparacion de la produccion de HbsAg (izquierda) y LHBsAg (derecha) en medio de cultivo (desde el dfa 3-5) de celulas Huh 7 transfectadas con prHBV1.3 (columnas blancas) o prHBV1.3/HBc (columnas grises). Se cuantifico HBsAg (ng/ml) mediante el kit de deteccion Monolisa (Bio-Rad, Hercules, CA). La produccion de LHBsAg se expresa como densidades opticas (DO) a 450 nm.

Figura 13C: ensayo de transferencia southern del ADN vfrico en celulas Huh 7 3 dfas despues de la cotransfeccion con payw 1.2 y prHBV 1.3. Se muestran las concentraciones de cada uno en la tabla en la parte inferior a la transferencia.

Figura 13D: deteccion de ADN vfrico mediante PCR en sueros de ratones C57/BL6 cuatro dfas despues de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 con pMAS-C (carriles 1 a 3) o pCMV-bGal (carriles 4 a 6). Se utilizo el plasmido pFC80 como control positivo (carril 7).

Las figuras 14A-14C muestran las respuestas de linfocitos T especfficos de poliepftopo en ratones en los que se ha inyectado pCMV-rHBe.

Figura 14A: ensayo ELlspot realizado en esplenocitos procedentes de diez ratones transgenicos HLA-A2/DR1 extrafdos 15 dfas despues de una inyeccion intramuscular de pCMV-rHBe. Cada columna representa el numero de linfocitos T secretores de IFN-y por cada millon de esplenocitos para cada raton individual. Los peptidos utilizados para estimular los esplenocitos ex vivo se obtuvieron de las protefnas VIH gag (VIH-G), matriz de virus influenza (Flu-M), VEB-BMLF1 (VEB-B), capside del VHB (HBc/18-27) y cubierta del VHB (HBs 5). PADRE es un peptido promiscuo de union a HLA-clase ll.

Figura 14B: analisis de FACS de linfocitos T especfficos de Flu procedentes de un raton no inmunizado (panel izquierdo) y de un raton transgenico HLA-A2/DR1 representativo (panel derecho) obtenidas 15 dfas despues de una inyeccion intramuscular de pCMV-rHBe. Se tineron celulas de bazo con un anticuerpo anti-CD8 marcado con APC y un pentamero HLA-A2 portador del peptido Flu. Los linfocitos T especfficos de Flu representaban aproximadamente 10% de los linfocitos T CD8 del bazo (cfrculos rojos).

Figura 14C: respuesta proliferativa de esplenocitos de ratones transgenicos HLA-A2/DR1 inmunizados con pCMV-rHBc tras la estimulacion in vitro con peptido PADRE. Las respuestas se expresan como fndice de proliferacion. La lfnea de puntos corresponde al valor medio del fndice de estimulacion. lE>2 se considera

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positivo.

Las figuras 15A-15D muestran las respuestas de linfocitos T en hfgado y bazo de ratones transgenicos HLA- A2/DR1 tras la inyeccion hidrodinamica de VHBr.

Figura 15A: el protocolo de inmunizacion activa incluye la induccion inicial de respuestas de linfocitos T el dfa 0 (D0) mediante la inyeccion intramuscular de pCMV-rHBc. El dfa 15 (D15), los ratones recibieron una inyeccion por via hidrodinamica de plasmido prHBV1.3 o plasmido de control pCMV-pGal. Se recolectaron linfocitos de bazo e hfgado el dfa 22 (D22) para el analisis de FACS.

Figura 15B: analisis de FACS de linfocitos intrahepaticos tenidos con los anticuerpos anti-CD3-PerCP y anti- CD8-APC (paneles superiores) y con tetramero especffico de gripe marcado con Pe y anti-CD8 marcado con APC (paneles inferiores). Se prepararon linfocitos a partir de ratones no inmunizados (B1, paneles izquierdo), ratones receptores de inyeccion hidrodinamica de induccion inicial con pCMVrHBc/pCMVpGal (B2, paneles intermedios) y ratones receptores de inyeccion hidrodinamica de induccion inicial con pCMVrHBc/prHBV1.3 (B3, paneles derechos). Se indican los porcentajes de linfocitos T CD8+ (cfrculos) y CD4+ (cuadrados) entre esplenocitos.

Figura 15C: analisis de los linfocitos intrahepaticos de tres grupos de ratones. El primer grupo recibio la inyeccion hidrodinamica de induccion inicial con pCMVrHBc/pCMVpGal (columnas blancas, n=5); el segundo grupo recibio la inyeccion hidrodinamica de induccion inicial con pCMVrHBc/prHBV1.3 (columnas con puntos, n=6); el tercer grupo eran ratones en los que se habfa inyectado pCMVrHBc por via intramuscular (columnas grises, n=3). Los resultados se proporcionan como medias ± SEM de porcentaje de linfocitos T CD8+, CD4+ y especfficos de gripe en la poblacion total de linfocitos.

Figura 15D: analisis de los linfocitos intraesplenicos de los ratones indicados en la figura 15C.

Las figuras 16A a 16F muestran un analisis de linfocitos infiltrantes en el hfgado.

Figura 16A: analisis histologico de secciones de hfgado obtenidas cuatro dfas despues de la inyeccion hidrodinamica. La tincion de hematoxilina/eosina de las secciones hepaticas de un raton HLA-A2/DR1 representativo receptor de inyeccion hidrodinamica de induccion inicial con pCMVrHBc/pCMVpGal (panel izquierdo, 100x); y de un raton representativo receptor de inyeccion hidrodinamica de induccion inicial con pCMVrHBc/prHBV1.3 (panel intermedio, 100x). El panel derecho muestra un area del panel intermedio a una magnificacion de 200x. Las agrupaciones de celulas de focos inflamatorios se indican con cajas. Las flechas senalan flechas en degeneracion.

Figura 16B: fenotipo de linfocitos intrahepaticos obtenidos de un raton representativo tras la inyeccion hidrodinamica de induccion inicial con pCMVrHBc/prHBV1.3. Se separaron los linfocitos T CD8+ para el analisis de las celulas Flu+ o Flu-negativas tras el marcaje de pentameros Flu (panel izquierdo). La cuantificacion de las celulas CD69+ y CD62L+ se llevo a cabo en linfocitos T CD8 positivos para pentamero (panel intermedio) y negativos para pentamero (panel derecho).

Figura 16C: perfil funcional de los linfocitos T intrahepaticos CD3+ CD8+. Las celulas se analizaron para CD107, un marcador de superficie, IFNy intracelular y FNTa, tras la estimulacion ex vivo con peptidos derivados de poliepftopo (mezcla de tres) (panel inferior) o sin estimulacion (panel superior).

Figura 16D: inmunotincion de HBsAg en secciones hepaticas obtenidas cuatro dfas despues de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 de ratones que habfan recibido la induccion inicial mediante inyeccion intramuscular de pCMVrHBc (panel izquierdo) o no inducidos (panel derecho) antes de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3

Figura 16E: nivel medio de HBsAg (ng/ml) en sueros de ratones de la figura 16D con induccion (columnas blancas) o sin induccion (columnas grises), antes de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3.

Figura 16F: nivel medio de transaminasa (ALT mU/ml) en sueros de ratones tras la inyeccion hidrodinamica de induccion inicial con pCMV-rHBc/prHBV1.3 (columnas grises, n=11) y de ratones con inyeccion hidrodinamica de induccion inicial con pCMV-rHBc/pCMV-pGal (columnas blancas, n=4). Se utilizo la inyeccion de concanavalina A (ConA) como control positivo para el incremento de ALT.

Las figuras 17A-17C muestran el control de la expresion de HBsAg en ratones transgenicos HBsAg/HLA-A2. Figura 17A: protocolo para la inmunizacion activa en ratones transgenicos HBsAg/HLA-A2.

Figura 17B: reduccion de HBsAg en sueros de ratones transgenicos HBsAg/HLA-A2 individuales tras la induccion inicial mediante inyeccion intramuscular de pCMV-rHBc en la semana 0 (S0), seguido de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 dos semanas despues (S2). Se obtuvieron muestras de sangre de los ratones cada semana y se cuantifico HBsAg (ng/ml) utilizando un ELISA comercial.

Figura 17C: porcentaje de reduccion de HBsAg durante ocho semanas en los sueros de ratones receptores de

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prHBV1.3 (columnas negras) o pCMV-pGal (columnas blancas). Se fijo la concentracion de HBsAg en la semana 0 en 100% y se expresan los resultados como medias ± SEM.

La figura 18 muestra la secuencia de prHBV-1.3-111 (SEC ID n° 4) (la secuencia del poliepftopo (polftopo) esta sombreada (SEC ID n° 5)).

La figura 19 muestra la secuencia de rHBe_III_ (SEC ID n° 6) (protefna recombinante; la secuencia de poliepftopo (polftopo) sombreada (SEC ID n° 7)).

La figura 20 muestra la secuencia del polftopo III (SEC ID n° 8) (los aminoacidos en minuscula son residuos flanqueantes).

La figura 21 muestra la secuencia del polftopo IV (SEC ID n° 9) (los aminoacidos en minuscula son residuos flanqueantes).

La figura 22 muestra la secuencia de prHBV-1.3-IV (SEC ID n° 10) (la secuencia del poliepftopo (polftopo) esta sombreada (SEC ID n° 11)).

La figura 23 muestra la secuencia de rHBe_IV_ (SEC ID n° 12) (protefna recombinante; la secuencia del poliepftopo (polftopo) esta sombreada (SEC ID n° 13)).

La figura 24 muestra el numero de acceso del NCBI: genoma del virus de la hepatitis B V01460 (cepa ayw), secuencia de ADN (N° DE ACCESO V01460 J02203 VERSION V01460.1 GI:62276, VRL 28-ENERO-2003) (SEC ID n° 14).

Descripcion detallada de la invencion

Los hepadnavirus son virus de ADN hepatotropicos con cubierta pequehos. El miembro prototipo de esta familia es el virus de la hepatitis B humano (VHB). El genoma hepadnavfrico consiste de un ADN circular relajado parcialmente de doble cadena, que presenta una organizacion compacta que utiliza marcos de lectura abierta ampliamente solapantes y secuencias reguladoras. El genoma del VHB esta organizado con precision mediante diversos elementos en cis o en trans que se solapan entre sf.

Mediante la investigacion del genoma vfrico, se ha encontrado que podrfa incluir un trozo de secuencia extraha en la parte N-terminal de la region codificante de la capside para crear un pseudovirus que se mantendrfa en los hepatocitos, mientras que la protefna interrumpida resultana complementada en trans por el VHB de tipo natural durante la infeccion natural (Gunther S., Piwon N., Jung A., Iwanska A., Schmitz H., Will H., Enhanced replication contributes to enrichment of hepatitis B virus with a deletion in the core gene, Virology 273:286-99, 2000). De esta manera, el VHB recombinante actuarfa como vector director con tropismo para el hfgado para la administracion genica (ver la figura 1).

De esta manera, la presente invencion proporciona un vector derivado del genoma del virus de la hepatitis. El genoma del virus de la hepatitis fue modificado con el fin de expresar epftopos extrahos fusionados en la parte N- terminal de la protefna de capside del virus de la hepatitis. El virus resultante no presenta capacidad de replicacion. Dicho virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion se mantiene simultaneamente en el hfgado de los individuos infectados por virus de la hepatitis mediante complementacion de capside de tipo natural. Las infecciones con dicho virus recombinante conducen a la expresion y presentacion de epftopos extrahos en la superficie de los hepatocitos. Estos epftopos presentados en asociacion con las moleculas del CMH son la diana de la respuesta inmunitaria de linfocitos T del huesped. Por lo tanto, solo los hepatocitos infectados por el virus de la hepatitis que permitan la replicacion del vector virus recombinante de la hepatitis seran la diana de la respuesta inmunitaria y resultaran curados. La invencion aprovecha la inmunidad preexistente contra los epftopos extrahos, por ejemplo de patogenos comunes tales como el virus influenza. Se elimina el virus de la hepatitis mediante mecanismos citolfticos o no citolfticos.

En los pacientes, la eliminacion del virus puede cuantificarse mediante la medicion del ADN del VHB en sueros utilizando kits disponibles comercialmente. La eliminacion en el hfgado puede cuantificarse mediante la medicion del ADN en la biopsia. La seroconversion de HBeAg, que es un marcador de replicacion vfrica, en anticuerpos anti-HBe puede utilizarse como marcador de eliminacion vfrica. La eliminacion HBsAg de los sueros y la seroconversion a anticuerpos anti-HB indica la eliminacion completa del virus.

Se describe un pseudovirus de la hepatitis recombinante competente para la replicacion basado en el virus de la hepatitis defectuoso para la replicacion de la invencion. El pseudovirus comprende el virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion de la invencion complementado con HBc, en el que el pseudovirus se replica in vitro en los hepatocitos humanos. En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion que comprende un genoma de virus de la hepatitis B defectuoso para la expresion de la protefna de capside del virus de la hepatitis B (HBc), en el que el virus contiene

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una secuencia de nucleotidos de hasta aproximadamente 195 nucleotidos codificante de un peptido extrano no presente en el virus de la hepatitis B de tipo natural que comprende por lo menos un epftopo inmunodominante en el que dicho peptido extrano comprende uno o mas epttopos inductores de una respuesta de celulas T, y en el que el gen diana para dicha insercion de epftopo es el gen codificante de la nucleocapside.

En una forma de realizacion, dicho peptido extrano se expresa fusionado dentro de la parte N-terminal de la protema de capside del VHB.

En una forma de realizacion, dicha secuencia de nucleotidos se encuentra localizada entre el residuo nucleotfdico 1981 y el residuo nucleotidico 2308 del genoma ayw3 de VHB, en el que la numeracion se inicia desde el cuarto nucleotido en el sitio EcoRI del genoma del VHB, n° de acceso del NCBI V01460).

En una forma de realizacion, dicho peptido extrano comprende uno o una multiplicidad de epttopos de uno o mas ongenes diferentes.

Dicho virus se denomina en la presente memoria "virus de la hepatitis recombinante sin capacidad de recombinacion" de la invencion.

En un segundo aspecto, se proporciona una celula hepatocito aislada de un vertebrado no humano infectado por un virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion segun la presente invencion.

En una forma de realizacion, dicha celula aislada comprende ademas una secuencia de nucleotidos codificante de HBc para la complementacion del virus de la hepatitis recombinante con el fin de formar un pseudovirus de la hepatitis.

En otra forma de realizacion, dicho pseudovirus de la hepatitis se replica in vitro en los hepatocitos humanos.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a una celula hepatocito aislada de un vertebrado infectado por el pseudovirus de la hepatitis de la presente invencion.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para formar un pseudovirus de la hepatitis, en el que el metodo comprende cultivar la celula hepatocito segun la presente invencion bajo condiciones para la expresion de la secuencia de nucleotidos codificante de HBc y la complementacion del virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion para formar un pseudovirus de la hepatitis.

El virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion de la invencion resulta complementado en la celula infectada por la expresion de HBc por el virus de la hepatitis que infecta la celula. El genoma del virus defectuoso para la replicacion se encuentra completamente incluido dentro de la capside producida por el virus de la hepatitis de tipo natural que infecta la celula. El virus complementado se denomina en la presente memoria "pseudovirus de la hepatitis".

Se describen polinucleotidos y vectores de expresion para la produccion de protemas, que se ensamblan formando pseudovirus y que son producidos eficientemente en las celulas huesped. De esta manera, resulta posible producir pseudovirus autoensamblantes y recombinantes con residuos de un peptido extrano. Lo expuesto anteriormente proporciona composiciones inmunogenicas monovalentes, bivalentes y multivalentes eficientes y vacunas terapeuticas.

Aunque el virus de la hepatitis defectuoso para la replicacion y el pseudovirus de la hepatitis de la invencion se describiran en detalle en referencia al VHB, se da a conocer que la presente invencion es aplicable a otros virus de la hepatitis, entre ellos el virus de la hepatitis A (VHA) (Picornavirus), el virus de la hepatitis Delta (VHD) (Deltavirus), el virus de la hepatitis C (VHC) (Flavivirus) y el virus de la hepatitis E (VHE). De esta manera, tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "hepatitis" incluye el virus de la hepatitis B y otros virus de hepatitis. La hepatitis B es el virus preferido para la utilizacion en la practica d ela presente invencion. De manera mas general, se da a conocer que la invencion resulta aplicable a otros virus.

En la practica de la invencion utilizando otros virus hepatotropicos, tales como el VHC, y mas generalmente todos los virus que participan en la infeccion persistente, el genoma vmco puede examinarse con el fin de identificar un sitio apropiado para la insercion de epttopos extranos. Por ejemplo, debido a los marcos de lectura abierta solapantes que codifican las protemas vmcas estructurales y no estructurales del VHB, el unico gen que puede ser diana para la insercion de epftopo es el gen codificante de la nucleocapside. Sin embargo, otros virus de ARN o ADN presentan diferentes tolerancias a las inserciones genomicas. Ademas, diferentes virus infectan diferentes tejidos que pueden ser la diana y resultar destruidos por las respuestas inducidas de celulas T, sin danar otros tejidos no infectados.

El termino "peptido" se entiende de manera general en la tecnica como referido a una molecula de aminoacidos pequena, mientras que el termino "polipeptido" se entiende de manera general como referido a una molecula de

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aminoacidos de mayor tamano. Tanto los peptidos como los polipeptidos se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invencion. De esta manera, por ejemplo, las secuencias extranas pueden ser un peptido o un polipeptido. Los terminos se utilizan intercambiablemente en la presente memoria.

Se describen pseudovirus de la hepatitis que comprenden partes portadoras de epftopo de uno o mas peptidos o polipeptidos extranos. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones peptidos y polipeptidos o epftopos extranos se refieren a un peptido o polipeptido o a un epftopo que no se encuentra en el virus de la hepatitis de tipo natural.

Los epftopos son inmunogenicos o epftopos antigenicos de los peptidos o polipeptidos extranos. Un "epftopo inmunogenico" se define como parte de una protefna que induce una respuesta humoral o celular in vivo en el caso de que el polipeptido completo, o un fragmento del mismo, sea el inmunogeno. Una region de un polipeptido al que puede unirse un anticuerpo se define como "determinante antigenico" o "epftopo antigenico". El epftopo antigenico tambien puede inducir una respuesta humoral o celular in vivo al utilizarse en el pseudovirus de la hepatitis. De esta manera, tambien se dan a conocer pseudovirus de la hepatitis que contienen tanto epftopos inmunogenicos como epftopos antigenicos, o cualquiera de ellos. Los peptidos o polipeptidos extranos que comprenden epftopos inmunogenicos o antigenicos presentan una longitud de por lo menos 8 residuos aminoacidos para los epftopos que se unen a las moleculas del CMH de clase I y una longitud de por lo menos 12 aminoacidos para los epftopos que se unen a las moleculas del CMH de clase II (respuesta celular). Los epftopos de las celulas B (respuesta humoral) presenta una longitud de por lo menos cuatro aminoacidos.

El peptido o polipeptido extrano puede contener entre aproximadamente 8 y aproximadamente 140 residuos aminoacidos, preferentemente entre aproximadamente 20 y aproximadamente 140 residuos aminoacidos, especialmente entre aproximadamente 60 y aproximadamente 140 residuos aminoacidos. En el caso del VHB, puede contener hasta aproximadamente 68 aminoacidos. En una forma de realizacion, en el caso del VHB, el peptido o polipeptido extrano contiene 68 aminoacidos. En otra forma de realizacion, contiene aproximadamente 65 aminoacidos. Pueden anadirse residuos flanqueantes a los extremos N-terminal, C-terminal o ambos del peptido o polipeptido extrano para generar los pseudovirus de la hepatitis.

El peptido o polipeptido extrano tambien puede derivarse de cualquiera de entre varias protefnas extranas. El peptido o polipeptido extrano puede obtenerse de cualquier protefna de cualquier organismo vegetal, animal, bacteriano, vfrico o parasitario.

En una forma de realizacion, el peptido o polipeptido extrano puede obtenerse de un polipeptido de un patogeno. El termino "patogeno" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un agente causativo especffico de una enfermedad y puede incluir, por ejemplo, cualquier bacteria, virus o parasito.

El termino "enfermedad" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una interrupcion, cese o trastorno de una funcion, sistema u organo corporal. Entre las enfermedades tfpicas se incluyen las enfermedades infecciosas. Por ejemplo, el peptido o polipeptido extrano puede ser uno de entre las protefnas inmunogenicas de un virus ARN, tal como VIH-1, VIH-2, VIS, vHc, virus ebola, virus Marburg, HTLV-I y HTLV-II (por sus siglas en ingles). Son ejemplos especfficos de protefnas estructurales o NS1 del virus Dengue, las protefnas G1, G2 o N del virus Hantaan, las protefnas HA del virus influenza A, las protefnas Env del virus de la leucemia murina de Friend, las protefnas Env del virus HTLV-1, las protefnas preM, E, NS1 o NS2A del virus de la encefalitis japonesa, las protefnas N y G del virus Lassa, las protefnas G y NP del virus de la coriomeningitis linfocftica, las protefnas HA o F del virus del sarampion, la protefna F o HN del virus parainfluenza 3, la protefna F o HN del virus parainfluenza SV4, las protefnas G del virus de la rabia, las protefnas F y G del virus sincitial respiratorio, las protefnas HA y F del virus de la peste bovina o las protefnas G del virus de la estomatitis vesicular. Las anteriores son meramente algunas de las posibilidades y no representan una lista exhaustiva o limitada.

El peptido o polipeptido extrano tambien puede derivarse de las protefnas inmunogenicas de un virus de ADN, tal como gp89 del citomegalovirus, gp340 del virus Epstein-Barr, gp13 o 14 del virus herpes equino, gB del virus herpes simplex-1, gD del virus herpes simplex-1, gD del virus herpes simplex-2, o gp50 del virus de la pseudorrabia. Nuevamente, las anteriores son unicamente algunas de las posibilidades y no representan una lista exhaustiva o limitada.

Ademas, el peptido o polipeptido extrano puede obtenerse de las protefnas inmunogenicas de bacterias, tales como los antfgenos M6 de los estreptococos A o los antfgenos tumorales, tales como p97 del melanoma humano, p185 del oncogen Neu de rata, ETA del tumor epitelial humano o los antfgenos del virus del papiloma humano. Nuevamente, las anteriores no comprenden una lista exhaustiva o limitada.

Se da a conocer que el peptido o polipeptido extrano puede obtenerse de un virus de la inmunodeficiencia humana. A continuacion se proporcionan epftopos del VIH-1 que pueden utilizarse en el diseno del peptido o polipeptido extrano.

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GAG P17 (77-85) P24 (19-27) POL (79-88)

SLYNTVATL (S9L) TLNAWVKW (T9V)

LLDTGADDTV (L10V) VLDVGDAYFSV (V11V)

(263-273)

(334-342)

(464-472)

(576-584)

(669-679)

(671-680)

(956-964)

ELVNQIIEQL (E10L) LLWKGEGAV (L9V) RLRDLLLIV (R9V) AFHHVAREL (A9L)

VIYQYMDDL (V9L) ILKEPVHGV (I9V) PLVKLWYQL (P9L)

ESELVNQIIEQ (E11Q)

ENV Gp41 (260-268) NEF (188-196)

La numeracion se basa en la secuencia de aminoacidos del clon WEAU 1.60 del VIH-1 (GenBank n° de acceso U21135). La secuencia WEAU puede no ser identica en todos los casos a la del peptido reactivo y simplemente indica su localizacion en las protefnas vfricas.

El peptido o polipeptido vfrico puede comprender un epftopo o una multiplicidad de epftopos unidos entre si. Ademas, debe apreciarse que el pseudovirus de la hepatitis de la invencion puede contener multiples epftopos de uno o mas orfgenes, tal como epftopos de diferentes protefnas inmunogenicas del mismo patogeno. Debe apreciarse tambien que el pseudovirus de la hepatitis puede contener uno o mas epftopos de diferentes orfgenes, tal como epftopos de diferentes patogenos. Ademas, se encuentran comprendidas en la presente invencion mezclas de pseudovirus de la hepatitis que presentan diferentes epftopos en diferentes partfculas.

Las protefnas que contienen la secuencia extraha pueden exponerse sobre la superficie de las celulas infectadas por el virus de tipo natural. Los epftopos expuestos resultantes proporcionan mimetizan la configuracion de los epftopos de manera excelente ya que existen, por ejemplo, en patogenos tales como otros virus infecciosos. Por estos motivos, las celulas infectadas por virus resultan adecuadas para el aprovechamiento como portadores para peptidos o polipeptidos extrahos, tal como determinantes protectores de agentes etiologicos, mediante el virus de la hepatitis defectuoso para la replicacion y el pseudovirus de la hepatitis de la invencion resultante.

En otro aspecto, la invencion se refiere a un vector de clonacion y/o expresion que comprende un virus de la hepatitis recombinante defectuoso para la replicacion segun la presente invencion.

La invencion se refiere ademas a una celula hospedadora eucariotica aislada que comprende un vector de la

En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo in vitro de produccion de pseudovirus de la hepatitis, en el que el metodo comprende:

- proporcionar una celula hospedadora de la presente invencion,

- expresar las protefnas de la hepatitis bajo condiciones en las que las protefnas se ensamblan en pseudovirus de la hepatitis que son liberados de la celula hospedadora al espacio extracelular, y opcionalmente;

- recuperar el pseudovirus de la hepatitis.

Los vectores de expresion recombinantes que contienen un acido nucleico codificante de protefnas de los pseudovirus de la invencion pueden prepararse utilizando metodos bien conocidos. Los vectores de expresion incluyen la secuencia codificante del peptido o polipeptido extraho ligado funcionalmente a secuencias de nucleotidos reguladores de la transcripcion o traduccion adecuados, tales como los obtenidos de un gen de mamffero, virus o insecto. Una secuencia de nucleotidos reguladoras de la transcripcion o traduccion se encuentra operablemente ligado en el caso de que la secuencia de nucleotidos controle la transcripcion o traduccion de otra secuencia de ADN codificante. Entre los ejemplos de secuencias reguladoras se incluyen promotores de la transcripcion, operadores o intensificadores, un sitio de union ribosomica de ARNm, promotores especfficos de tejidos y elementos reguladores post-transcripcionales (ERP) y secuencias apropiados que controlan el inicio o la terminacion de la transcripcion y la traduccion. La capacidad de replicarse en las celulas hospedadoras deseadas, habitualmente conferida por un origen de replicacion, y un gen de seleccion por el que se identificar los transformantes, pueden incorporarse adicionalmente en el vector de expresion.

Entre los vectores eucarioticos para la utilizacion en la preparacion de vectores de la invencion se incluyen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG, disponibles de Stratagene (La Jolla, CA), y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL, disponibles de Pharmacia (Piscataway, NJ). Otros vectores adecuados resultaran facilmente evidentes para el experto en la materia.

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Entre los vectores para la utilizacion en la preparacion de un vector de la invencion, los vectores eucarioticos no integradores no solo resultan utiles, sino que tambien pueden utilizarse vectores integradores/transformantes (es decir, vectores que integran una parte de su material acido nucleico en el genoma de la celula hospedadora eucariotica). Tfpicos de estos vectores son vector lentivfrico Trips, adenovirus y vectores integradores de levadura.

Se describe que los vectores de expresion de la invencion pueden incluir por lo menos un marcador seleccionable. Entre dichos marcadores se incluyen, por ejemplo, la dihidrofolato reductasa, G418, la resistencia a la ampicilina o a la neomicina para el cultivo de celulas eucarioticas.

Puede utilizarse cualquier promotor fuerte conocido por el experto en la materia para controlar la expresion. Entre los promotores adecuados se incluyen promotores adenovfricos, tales como el promotor tardfo mayor adenovfrico, los promotores heterologos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus sincitial respiratorio (VSR), promotores inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor de metalotionefna, los promotores de choque termico, el promotor albumina, el promotor ApoAl, los promotores de globina humana, los promotores vfricos de timidina cinasa, tales como el promotor timidina cinasa del virus herpes simplex, las RTL retrovfricos, el promotor de la p-actina y los promotores de la hormona del crecimiento humano. El promotor tambien puede ser un promotor nativo de un virus de la hepatitis, tal como el VHB.

La administracion in vivo de los virus recombinantes de la invencion requiere la produccion de reservas vfricas. En el caso del virus de la hepatitis, lo anterior puede conseguirse mediante la utilizacion de una lfnea celular hepatocftica que expresa capside de virus hepatico de tipo natural. Se describe un metodo para la produccion de reservas vfricas en Gunther S. et al., Virology 273:286-99, 2000.

Entre las celulas hospedadoras adecuadas para la expresion de pseudovirus se incluyen celulas eucarioticas superiores. Por ejemplo, en el caso del virus de la hepatitis, se requieren hepatocitos diferenciados para la replicacion del VHB, VHC y VHD. Se describen vectores de clonacion y expresion apropiados para la utilizacion con huespedes celulares vegetales, fungicos, de levadura y de mamffero en, por ejemplo, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985. Entre los ejemplos representativos de huespedes apropiados se incluyen, aunque sin limitacion, celulas fungicas, tales como celulas de levadura; celulas de insecto, tales como celulas de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9; celulas animales, tales como CHO, COS, 293 y de melanoma de Bowes, y celulas vegetales. Los medios y condiciones de cultivo apropiados para las celulas hospedadoras anteriormente indicadas son conocidos de la tecnica.

La introduccion del vector de la invencion en la celula hospedadora puede llevarse a cabo mediante transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por lfpidos cationicos, electroporacion, transduccion, infeccion u otros metodos. Dichos metodos se describen en muchos manuales de laboratorio estandares, tales como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology, 1986.

Se describe ademas un metodo in vitro para producir pseudovirus, que comprende cultivar in vitro, en un medio de cultivo adecuado, una celula que incorpora un vector de expresion de la invencion y recolectar en el medio de cultivo pseudovirus producidos por dichas celulas.

Por lo tanto, la invencion se refiere ademas a celulas eucarioticas aisladas, infectadas, transformadas o transfectadas por un polinucleotido o vector de la invencion para la expresion del pseudovirus. Los metodos para producir dichas celulas y los metodos para utilizar dichas celulas en la produccion de virus recombinantes son bien conocidos de la tecnica. Los pseudovirus pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante metodos bien conocidos, incluyendo la precipitacion con sulfato amonico, la cromatograffa de intercambio anionico o cationico, la cromatograffa en fosfocelulosa, la cromatograffa de interaccion hidrofobica, la cromatograffa de afinidad, la cromatograffa en hidroxiapatito y la cromatograffa de lectina o heparina.

Auqnue la presente invencion se refiere a pseudovirus de la hepatitis que portan uno o mas (poli)epftopos de peptidos o polipeptidos extranos, tambien se da a conocer la utilizacion de (poli)epftopos que han sido optimizados para la incorporacion en pseudovirus de la hepatitis. Las secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos del (poli)epftopo pueden modificarse con el fin de incrementar la hidrofilicidad global del (poli)epitopo y garantizar un procesamiento modificado de los epftopos. Los epftopos en un poliepftopo pueden permutarse con el fin de obtener el mejor perfil hidrofilo. Pueden anadirse espaciadores hidrofflicos para compensar los epftopos generalmente hidrofobos.

Los polipeptidos o polinucleotidos dados a conocer pueden encontrarse en forma aislada o purificada. Los terminos "aislado" o "purificado", tal como se utilizan en el contexto de la presente memoria para definir la pureza, se refieren a que la protefna, polipeptido o polinucleotido se encuentra sustancialmente libre de otras protefnas de origen natural o endogeno y a que contienen menos de aproximadamente 1% en masa de protefna o polinucleotido, de otros contaminantes residuales de los procedimientos de produccion.

En la practica del metodo dado a conocer, el virus defectuoso para la replicacion se administra en el huesped utilizando uno de los modos de administracion utilizados comunmente para administrar farmacos en el ser humano y

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en otros animales. De esta manera, por ejemplo, el virus defectuoso para la replicacion puede administrarse en el huesped mediante la via oral o por via parenteral, tal como mediante inyeccion intravenosa o intramuscular. Tambien pueden utilizarse otros modos de administracion, tales como las vfas intraesplenica, intrahepatica, la perfusion, intradermica y mucosal. Preferentemente, el virus defectuoso para la replicacion de la invencion se administra segun la via natural de infeccion del virus. Para los fines de inyeccion, el virus defectuoso para la replicacion tal como se ha indicado anteriormente puede prepararse en forma de soluciones, suspensiones o emulsiones en vehmulos utilizados convencionalmente para este fin.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la invencion contempla composiciones que comprenden el virus recombinante defectuoso para la replicacion de la invencion en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable. La invencion contempla ademas una vacuna que comprende dicha composicion. Las vacunas de la invencion pueden administrarse en un paciente infectado persistentemente por un virus con el fin de estimular una respuesta de linfocitos T contra celulas infectadas por el virus. De esta manera, la invencion tambien contempla la utilizacion de los virus recombinantes defectuosos para la replicacion de la invencion para la preparacion de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente infectado cronica o persistentemente por un virus de la hepatitis B. La invencion describe ademas un metodo para reconocer la expresion de un epttopo en una celula infectada por un virus proporcionando a la celula el virus recombinante defectuoso para la replicacion de la invencion.

Debe apreciarse que los virus defectuosos para la replicacion de la invencion pueden utilizarse en combinacion con otros antfgenos de microorganismos, anticuerpos o mitogenos u otras sustancias profilacticas o terapeuticas. Por ejemplo, pueden utilizarse mezclas de antfgenos de diferentes parasitos, anticuerpos o mitogenos o mezclas de diferentes antfgenos vmcos o bacterianos, anticuerpos o mitogenos, en el metodo de la invencion. De manera similar, pueden utilizarse en la misma composicion mezclas de diferentes virus defectuosos para la replicacion. Los virus defectuosos para la replicacion tambien pueden combinarse con otros agentes de vacunacion, tales como vacunas basadas en epttopos inmunodominantes, inmunopatologicas e inmunoprotectoras, o vacunas atenuadas o de subunidades inactivadas.

Los virus defectuosos para la replicacion de la invencion se utilizan en una cantidad eficaz suficiente para proporcionar una concentracion adecuada para eliminar virus en celulas infectadas. De esta manera, la cantidad de virus de la hepatitis defectuoso para la replicacion depende de la absorcion, distribucion y eliminacion por parte del huesped. Evidentemente la eficacia de los virus de la hepatitis defectuosos para la replicacion esta relacionada con la dosis. La dosis de los virus defectuosos para la replicacion debena ser suficiente para producir un efecto detectable mmimo, aunque la dosis preferentemente debe ser inferior a la dosis que activa una respuesta policlonal no espedfica de linfocitos.

La dosis de los virus defectuosos para la replicacion de la invencion administrada en el huesped puede modificarse dentro de amplios lfmites. Los virus pueden administrarse en la cantidad minima, que resulta terapeuticamente eficaz, y la dosis puede incrementarse segun se desee hasta la dosis maxima tolerada por el paciente. Los virus defectuosos para la replicacion pueden administrarse en una cantidad relativamente elevada, seguido de una dosis de mantenimiento mas baja o los virus pueden administrarse en dosis uniformes.

La dosis y la frecuencia de la administracion variaran con los virus defectuosos para la replicacion utilizados en el metodo dado a conocer. La cantidad administrada en un ser humano puede variar entre aproximadamente 50 ng por kg de peso corporal y aproximadamente 1 pg por kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 100 ng por kg de peso corporal y aproximadamente 500 ng por kg de peso corporal. Para la infeccion en el chimpance, se requieren 2x107 a 5x107 equivalentes de genoma del VHB (que corresponde a aproximadamente 35 a 90 pg de ADN) (Guidotti L.G. et al., Science 284:825-29, 1999). Lo anterior corresponde a 0,7 a 1,8 pg/kg e peso corporal. Pueden determinarse las cantidades optimas con un mmimo de experimentacion utilizando tecnicas analfticas convencionales de dosis-respuesta o escalando a partir de estudios basados en modelos animales de enfermedad.

El termino "aproximadamente" tal como se utiliza en la presente memoria para indicar intervalos de dosis se refiere a una cantidad que presenta el mismo efecto que la cantidad numericamente indicada tal como indica la eliminacion de la infeccion vmica cronica en el huesped en el que se administran los virus defectuosos para la replicacion, con una ausencia o una reduccion en el huesped de los determinantes de la patogenicidad, incluyendo una ausencia o una reduccion de la persistencia del virus infeccioso in vivo, y/o la ausencia de patogenesis y enfermedad clmica, o una gravedad reducida de la misma, en comparacion con los individuos no tratados mediante el metodo de la invencion.

La dosis de virus defectuoso para la replicacion de la invencion se especifica en relacion a un adulto de tamano medio. De esta manera, se entendera que la dosis puede ajustarse en 20% a 25% para pacientes con una corpulencia mas ligera o mas pesada. De manera similar, al dosis para un nino puede ajustarse utilizando formulas de calculo de la dosis bien conocidas.

Los virus defectuosos para la replicacion de la invencion pueden utilizarse en terapia en forma de pfldoras, comprimidos, pastillas, trociscos, capsulas, supositorios, inyectables en soluciones ingeribles y similares en el

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tratamiento de la infeccion de hepatitis en seres humanos y primates no humanos susceptibles y otros animales vertebrados y mamfferos.

Los portadores, diluyentes y adyuvantes farmaceuticamente aceptables apropiados pueden combinarse con los virus defectuosos para la replicacion indicados en la presente memoria con el fin de preparar las composiciones farmaceuticas para la utilizacion en el tratamiento de condiciones patologicas en animales. Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion contienen los virus defectuosos para la replicacion conjuntamente con un portador no toxico farmaceuticamente aceptable solido o lfquido. Dichos portadores farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos originados en el petroleo, o de origen animal, vegetal o sintetico. Son ejemplos de lfquidos adecuados, el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral, el aceite de sesamo y similares. El agua es un portador preferente al administrar la composicion farmaceutica por via intravenosa. Tambien pueden utilizarse soluciones fisiologicas como portadores lfquidos, particularmente para soluciones inyectables.

Entre los excipientes farmaceuticos adecuados se incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sflice, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, estearato sodico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sodico, leche desnatada seca, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. Los portadores farmaceuticos adecuados se indica en "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W. Martin. Las composiciones farmaceuticas contienen una cantidad terapeutica eficaz del virus defectuoso para la replicacion de la invencion conjuntamente con una cantidad adecuada de portador de manera que proporcionar la forma para la administracion apropiada al huesped.

La capacidad de los virus defectuosos para la replicacion de la invencion de inducir proteccion en un huesped puede incrementarse mediante emulsificacion con un adyuvante, la incorporacion en un liposoma, el acoplamiento con un portador adecuado, o mediante combinaciones de dichas tecnicas. Por ejemplo, los virus defectuosos para la replicacion de la invencion pueden administrarse con un adyuvante convencional, tal como fosfato de aluminio y gel de hidroxido de aluminio. De manera similar, los virus defectuosos para la replicacion pueden unirse a membranas lipfdicas o incorporarse en membranas lipfdicas para formar liposomas. Con este fin pueden utilizarse lfpidos no pirogenicos sin acidos nucleicos ni otras materias extranas.

El huesped o paciente puede ser un animal susceptible a la infeccion por un virus, y preferentemente es un mamffero. Mas preferentemente, el mamffero se selecciona de entre el grupo que consiste de un ser humano, un perro, un gato, un bovino, un cerdo y un caballo. En una forma de realizacion especialmente preferente el mamffero es un ser humano.

Se describe ademas la administracion de acidos nucleicos codificantes del virus defectuoso para la replicacion de la invencion con o sin moleculas portadoras en un individuo. El experto en la materia conocera el concepto, la aplicacion y la eficacia de las vacunas de acidos nucleicos (por ejemplo las vacunas de ADN) y la tecnologfa de las vacunas de acidos nucleicos, asf como las tecnologfas basadas en protefnas y polipeptidos. La tecnologfa basada en acidos nucleicos permite la administracion de acidos nucleicos codificantes del virus defectuoso para la replicacion de la invencion, desnudo o encapsulado, directamente en tejidos y celulas, especialmente celulas musculares o queratinocitos, sin necesidad de producir protefnas codificadas antes de la administracion. La tecnologfa se basa en la capacidad de dichos acidos nucleicos de ser incorporados por celulas del organismo receptor y expresarse para producir un virus defectuoso para la replicacion al que responde el sistema inmunologico del receptor. Dicha tecnologfa de vacunas de acidos nucleicos incluye, aunque sin limitacion, la administracion de vectores de expresion codificantes de un virus defectuoso para la replicacion de la invencion. Aun que la tecnologfa se denomina "vacuna", es igualmente aplicable a composiciones inmunogenicas que no resultan en una resulta completamente curativa. Dichas composiciones y metodos inductores de proteccion parcial se encuentran comprendidos dentro de la presente invencion.

Se describe ademas la administracion de virus defectuoso para la replicacion como parte de composiciones mas grandes o mas complejas. Entre estos sistemas de administracion se incluyen virus, partfculas de tipo vfrico o bacterias que contienen los acidos nucleicos que codifican el virus defectuoso para la replicacion de la invencion. Ademas, se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invencion complejos de los acidos nucleicos de la invencion y moleculas portadoras con compuestos permeabilizadores de las celulas, tales como liposomas. Otros compuestos, tales como vectores moleculares (documento EP 696.191, Samain et al.) y sistemas de administracion para vacunas de acidos nucleicos son conocidos por el experto en la materia y se encuentran ejemplificados en, por ejemplo, los documentos WO 93/06223 y WO 90/11092, y patentes US n° 5.580.859 y n° 5.589.466 (patentes vfricas), los cuales se incorporan como referencia en la presente memoria, y pueden prepararse y utilizarse sin necesidad de experimentacion indebida o excesiva.

Durante el ciclo de replicacion, el ARN pregenomico del VHB sirve como ARNm molde para la traduccion de las protefnas de nucleo y polimerasa vfricos. Se encapsida conjuntamente con la polimerasa vfrica en una nucleocapside que consiste de aproximadamente 200 subunidades de la protefna nuclear. La cubierta vfrica se encuentra densamente empaquetada con las protefnas de cubierta vfrica grandes (G), intermedias (I) y

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predominantemente pequenas (P). Ademas de las protefnas de cubierta, el virus codifica una protefna reguladora (X), todas traducidas a partir de ARN subgenomicos.

El VHB infecta unicamente seres humanos y chimpances. Como modelos animales alternativos, se describen ratones transgenicos de VHB o HBsAg, que replican o expresan genes del VHB en el hfgado. La expresion del transgen desde el nacimiento induce tolerancia inmunologica en las respuestas de linfocitos T especfficos de VHBd en estos animales.

Se da a conocer que la inyeccion hidrodinamica de VHBr para imitar la expresion genica en hfgados de raton evita la induccion de tolerancia de la respuesta de linfocitos T especffica de VHBd.

Se da a conocer que, en ratones transgenicos de HLA, la induccion inicial con un vector de ADN codificante de epftopos restringidos a HLA-A2 extranos activa las respuestas de linfocitos T que posteriormente se localizan en el hfgado de ratones tras la inyeccion hidrodinamica de VHB recombinante (VHBr). Debido a que se espera que el VHBr se replique unicamente en hepatocitos que portan el VHB de tipo natural y compartan el mismo mecanismo en el ciclo vfrico, las fuertes respuestas inmunologicas inducidas por el polipeptido extrano dominan sobre las respuestas de linfocitos T agotados presentes durante la infeccion persistente natural del VHB.

Una cuestion clave durante el desarrollo de estrategias inmunoterapeuticas contra la infeccion cronica de hepatitis B es si los linfocitos T especfficos del VHB pueden restaurarse funcionalmente utilizando la vacunacion u otros enfoques inmunomoduladores. Tambien resulta importante evaluar si la vacuna o linfocitos T activados de otra manera pueden entrar en el hfgado y eliminar las celulas infectadas por el VHB. En el presente estudio, los presentes inventores utilizaron el VHB como vector de inmunoterapia para administrar una protefna nuclear modificada que se habfa fusionado con los epftopos inmunogenicos extranos en las celulas hepaticas. Tras la expresion genica de dicho virus modificado, se atrajeron linfocitos T especfficos de epftopo funcionales al hfgado, en el que podfan controlar la expresion genica del VHB en los hepatocitos.

Un vector ideal para la terapia genica puede presentar como diana celulas anormales sin danar las celulas vecinas sanas. La invencion proporciona un VHBr artificial, con el gen del nucleo interrumpido por la insercion de una secuencia corta codificante de epftopos inmunodominantes derivados de virus comunes. Dicho virus modificado no era competente para la replicacion excepto en hepatocitos que proporcionaban capsides vfricas de tipo natural en trans. Por lo tanto, el VHBr no se espera que se mantenga en hepatocitos sanos, sino unicamente en celulas de pacientes con replicacion cronica del VHB. Tras eliminar la infeccion natural del VHB, seguidamente se interrumpe la vida pseudovfrica del VHBr.

El genoma del VHB de 3,2 Kb esta altamente compactado, con marcos de lectura abierta (ORF, por sus siglas en ingles) solapantes para genes estructurales y diversos elementos reguladores. Resulta tecnicamente diffcil manipular dicho virus, principalmente debido a las limitaciones de espacio. La presente invencion proporciona la insercion de la secuencia extrana en el VHBr en una region situada entre la senal de poliadenilacion para el ARNm del VHB y el inicio del marco de lectura de la polimerasa. No se ha encontrado ningun elemento de accion en cis evidente en dicha region que pueda participar en la replicacion vfrica. Sin embargo, se ha descrito un potencial sitio interno para la entrada ribosomica. De esta manera, la traduccion de la polimerasa es un suceso de probabilidad reducida, con un mecanismo de lanzadera ribosomica del ARN mensajero. La polimerasa del VHB funciona en cis encontrando la senal epsilon en el ARNpg e iniciando la replicacion vfrica. Por lo tanto, el tamano de la insercion extrana deberfa ser compatible con la traduccion de la polimerasa del VHB. Resulta interesante que el VHBr en el estudio de los presentes inventores es similar a una variante del VHB naturalmente presente (DC-144), identificada por Will H. et al. durante la hepatitis fulminante. Esta variante podrfa producir 2 a 4,5 veces mas ADN progenie que el VHB de tipo natural en el caso de que fuese suficientemente complementado con la protefna nuclear de tipo natural (Gunther S., Piwon N., Jung A., Iwanska A., Schmitz H., Will H., Enhanced replication contributes to enrichment of hepatitis B virus with a deletion in the core gene, Virology 273:286-99, 2000). Ademas, el VHBr presenta un genoma vfrico corto que favorece el empaquetamiento del ARNpg. De esta manera, se espera que el VHBr podrfa dominar el pool de ADNccc en el nucleo celular, conduciendo a la inhibicion de la replicacion del VHB de tipo natural.

Existen pruebas crecientes que sugieren que la respuesta inmunitaria del huesped desempena un papel crftico en la determinacion de los diversos resultados de la infeccion por el VHB. En particular, las respuestas de linfocitos T CD8 especfficos del VHB se cree que son de considerable importancia en el control vfrico y la enfermedad mediada inmunologicamente. Sin embargo, durante la infeccion cronica, estas respuestas son generalmente debiles y de foco estrecho. Los linfocitos T especfficos de virus procedentes de pacientes cronicos se agotan con rapidez. La disfuncion de los linfocitos T se ha atribuido a los niveles elevados de antfgenos vfricos persistentes. Sin embargo, en pacientes cronicas, las respuestas inmunologicas a otros patogenos permanecen intactas. Por lo tanto, los presentes inventores decidieron disenar un nuevo enfoque terapeutico basado en la activacion de los linfocitos T no especfficos del VHB que resultaron adicionalmente redirigidas al hfgado tras la inyeccion de VHBr.

En resumen, la presente invencion da a conocer un nuevo enfoque al diseno de un virus con un ciclo de replicacion defectuoso que puede rescatarse mediante la coinfeccion con virus de tipo natural, y que expresa epftopos

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antigenicos extranos que contribuyen a la eliminacion de las celulas infectadas por virus y a la eliminacion vinca. El vector de la invencion, mediante la expresion de epitopos derivados de patogenos comunes, evita la tolerancia existente de las respuestas de linfocitos T especificos de virus. El vector solo se replicara en las celulas infectadas por virus.

En un aspecto particular, la presente invencion da a conocer un nuevo enfoque al diseno de un virus de la hepatitis con un ciclo de replicacion defectuoso que puede rescatarse mediante la co-infeccion con virus de la hepatitis de tipo natural, y que expresa epitopos antigenicos extranos que contribuyen a la eliminacion de los hepatocitos infectados por el virus de la hepatitis y a la eliminacion vfrica. El vector de la invencion, mediante la expresion de epitopos derivados de patogenos comunes, evita la tolerancia existente de las respuestas de linfocitos T especificos del virus de la hepatitis. El vector solo se replicara en los hepatocitos infectados por el virus de la hepatitis.

Segun la presente invencion, el poliepftopo antigenico extrano puede romper o ayudar a romper la tolerancia inmunitaria a la hepatitis. Las respuestas de linfocitos T inducidos pueden silenciar, especffica o no especfficamente, los genes de la hepatitis mediante mecanismo no citolfticos. El virus de la hepatitis recombinante portador del poliepftopo puede someterse a ensayo para la replicacion en hepatocitos de ratones UPA-SCID reconstituidos con celulas hepaticas humanas.

Las cepas de E. coli portadoras de los plasmidos siguientes fueron depositadas en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), 25, rue du Docteur Roux, F-75724 Paris, Cedex 15, Francia, y se les asigno los numeros de acceso siguientes:

Plasmido

N° de acceso

prHVB1.3-IV

CNCM I-3833

pCMVrHbc-IV

CNCM I-3834

prHVB1.3-111

CNCM I-3832

pCMVrHBc

CNCM I-4077

prHBV1.3

CNCM I-4078

prHBV1.3/HBc

CNCM I-4079

Con respecto a los intervalos de valores, la invencion comprende cada valor intermedio entre los lfmites superior e inferior del intervalo hasta por lo menos un decimo de la unidad del lfmite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Ademas, la invencion comprende cualquier otro valor intermedio indicado. Ademas, la invencion comprende ademas intervalos que incluyen el lfmite superior o inferior, o ambos, del intervalo, a menos que se excluya especfficamente del intervalo indicado.

A menos que se indique lo contrario, los significados de todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria son los entendidos comunmente por el experto en la materia a la que se refiere la presente invencion. El experto en la materia tambien apreciara que tambien pueden utilizarse cualesquiera metodos y materiales similares o equivalentes a los indicados en la presente memoria, para la practica o ensayo de la invencion.

Debe indicarse que, tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" o "una, "o" y "el" o "la" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a un "polipeptido de la invencion" incluye una pluralidad de dichos polipeptidos y la referencia a "el agente" incluye la referencia a uno o mas agentes y equivalentes de los mismos conocidos por el experto en la materia, etc.

Ademas, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reaccion, % de pureza, longitudes de polipeptido y polinucleotido, etc., utilizados en la memoria y en las reivindicaciones, son modificados por el termino "aproximadamente", a menos que se indique lo contrario. De acuerdo con lo anterior, los parametros numericos indicados en la memoria y en las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas de la presente invencion. Como mfnimo, y no como intento de limitar la aplicacion de la doctrina de los equivalentes al alcance segun las reivindicaciones, cada parametro numerico debe interpretarse como mfnimo a partir del numero de dfgitos significativos informados, aplicando tecnicas ordinarias de redondeo. Sin embargo, los valores numericos indicados en los ejemplos especificos se informan tan exactamente como resulte posible. Sin embargo, cualquier valor numerico contiene inherentemente determinados errores de la desviacion estandar de su medicion experimental.

Ejemplos

Los ejemplos, proporcionados unicamente como ejemplificativos de la invencion y, por lo tanto, no deben considerarse limitativos de la misma en modo alguno, tambien describen y detallan aspectos y formas de realizacion de la invencion comentada anteriormente. Los ejemplos no pretenden representar que los experimentos, proporcionados posteriormente, son la totalidad o los unicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos por garantizar la exactitud con respecto a los numeros utilizados (por ejemplo las cantidades, las temperaturas, etc.),

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pero deben considerarse algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular medio en peso, la temperatura se expresa en grados centfgrados y la presion es la atmosferica o una presion proxima a la misma.

Ejemplo 1: ensayo in vitro para la replicacion del VHB recombinante (VHBr)

Se inserto una secuencia de poliepftopo en una copia 1.3 de genoma del VHB en la parte N-terminal del fragmento original codificante de capside con el fin de crear el VHB recombinante (prHBV-1.3 y sus derivados III o IV, ver la figura 2). La cotransfeccion de prHBV1.3-III con el plasmido que expresa el gen de capside bajo un promotor de CMV (pMAScore) en una lfnea celular hepatica se llevo a cabo para iniciar un ciclo de replicacion que imitase la replicacion in vitro del VHB de tipo natural (deteccion del genoma ADNccc y otras formas intermediarias mediante ensayo de transferencia southern). Los resultados se presentan en la figura 3A (deteccion mediante PCR del genoma del VHB en partfculas vfricas secretadas).

La lfnea celular hepatocftica humana Huh7 (Nakabayashi H., Taketa K., Miyano K., Yamane T., Sato J., Growth of human hepatoma cell lines with differentiated functions in chemically defined medium, Cancer Res. 42(9):3858-63, 1982) se transfecto con prHBV1.3-III con o sin pMAS-core, con pMAS-core solo o con pFC80 (control positivo, plasmido que contiene dos genomas de VHB en tandem). Se recogieron los sobrenadantes y se precipitaron las partfculas vfricas utilizando PEG 8000. Tras un tratamiento de ADNasa para eliminar el ADN plasmfdico residual, se lisaron las partfculas y se amplifico por PCR el genoma del VHB (cebadores de PCR en la parte N del gen nuclear y parte intermedia del gen codificante de HB). Alternativamente, los cebadores pueden encontrarse en cualquier parte del genoma del VHB, mas particularmente, antes del gen S. Se muestran los resultados en la figura 3A. El fragmento esperado se detecto unicamente tras la cotransfeccion de prHBV1.3 y pMAS-core, pero no despues de la transfeccion de pMAS-core o prHBV1.3 solo.

Tambien se detecto el antfgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en el sobrenadante de celulas cotransfectadas con prHBV1.3 y pMAS-core o transfectadas con pFC80, pero no tras la trasnfeccion de pMAScore solo (ver la figura 3B).

Con el fin de evaluar el rescate de virion LHB, se utilizaron dos proporciones diferentes para la cotransfeccion (1:1 y 1:2) y un plasmido de control que no expresaba el nucleo pero sf EGFP. Tras la cotransfeccion de los plasmidos prHBV1.3-III y pMAScore en la lfnea celular hepatocftica Huh 7, se recolectaron los sobrenadantes de las celulas transfectadas. Se cuantificaron las partfculas vfricas que contenfan la protefna de cubierta grande del VHB (LHB) mediante un ELISA especffico utilizando dos anticuerpos monoclonales especfficos para la protefna de cubierta grande del VHB (MoAb 5a91 y MoAb 18-7) como anticuerpos de captura y un MoAb anti-HB marcado para la deteccion. Se muestran los resultados en la figura 3C. Dicho experimento demuestra que la expresion del nucleo resulta necesaria para la secrecion eficiente de partfculas que contienen los LHB de manera dependiente de la dosis. Las LHB es conocido que se localizan sobre la superficie de las partfculas de Dane de VHB de 42 nm.

Ejemplo 2: ensayo in vivo para la infeccion de VHBr

Se llevo a cabo una investigacion para determinar si el virion de VHBr producido in vitro podia ser infeccioso in vivo. Debido a que no existe ningun modelo de animal pequeno, puede resultar util un raton transgenico UPA con tejido hepatico humano trasplantado (Morosan S. et al., Liver-stage development of Plasmodium falciparum, in a humanized mouse model, J. Infect. Dis. 193:996-1004, 2006). Para la infeccion, resulta necesaria una reserva pequena de VHBr infeccioso. Lo anterior se obtuvo creando en primer lugar una lfnea celular HepG2 estable (ATCC numero HB-8065) que expresaba el genoma del VHBr constitutivamente y en segundo lugar mediante la transduccion de dicha lfnea celular con un vector lentivfrico que expresaba el gen nuclear del VHB.

Ejemplo 3: creacion de una sucesion de epftopos inmunodominantes

Basandose en los conocimientos disponibles de la biologfa molecular del VHB, el espacio para alojar una secuencia extrana en el genoma del VHB se limito a aproximadamente 195 nucleotidos. Debido a esta limitacion de espacio, se introdujo una secuencia corta codificante de epftopos inmunodominantes extranos (poliepftopo) en el genoma del VHB recombinante con el fin de inducir una respuesta inmunologica robusta. Con respecto al poliepftopo, este se organizo con 3 epftopos de linfocitos T CD8+ en combinacion con un epftopo promiscuo de celula T CD4+ (PADRE), que puede alojar universalmente varias moleculas prevalentes del CMH de clase II. Para la respuesta de linfocitos T CD8+, considerando la relevancia clfnica, se seleccionaron tres epftopos restringidos a HLA-2 bien conocidos derivados de virus humanos comunes (gag del VIH, protefna matriz del virus Influenza, BML-F1 del VEB). Ademas, se introdujo un epftopo corto de celula B (FLAG) en la secuencia extrana como marcador de deteccion conveniente para los ensayos de biologfa molecular (ver las figuras 2 y 6A-6D). Se encuentra presente un epftopo derivado de capside restringido a HLA-A2 (nucleo 18-27) en la parte N-terminal de la protefna de capside.

Ejemplo 4: evaluacion de la expresion de poliepftopo in vitro

La region prenuclear del VHB codifica el antfgeno nuclear de la hepatitis (HBcAg) que se autoensambla formando

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las capsides vfricas, y un polipeptido secretado, el antfgeno e de la hepatitis (HBeAg). Estas dos protefnas se derivan mediante inicio alternativo de la traduccion en dos codones dentro del marco (ver la figura 2). La protefna HBe de 16 Kd se deriva mediante corte proteolftico a partir de una protefna precursora iniciada en el primer codon de inicio. Con el fin de evaluar la expresion del poliepftopo por el VHB recombinante, la lfnea celular de hepatoma HepG2 se transfecto con prHBVl.3-IV y tres dfas despues, se recolecto el lisado para el analisis de inmunotransferencia. La deteccion de la protefna rHBe recombinante utilizando el anticuerpo monoclonal anti-Flag se muestra en la figura 4.

La expresion del poliepftopo realizada por el virus recombinante tambien se detecto tras la transfeccion de las celulas Huh7 con prHBV1.3 en ensayos de inmunofluorescencia utilizando el MoAb anti-FLAG (ver la figura 5, panel B). La expresion de HBsAg tambien se detecto en las celulas Huh7 utilizando el MoAb anti-HB (figura 5, panel A). La localizacion del HBsAg intracelular era de dispersion homogenea en el citoplasma, mientras que el antfgeno HBc recombinante etiquetado se localizaba en el area perinuclear con cierta polarizacion.

Ejemplo 5: evaluacion de la expresion in vivo de poliepftopo

La expresion del poliepftopo llevada a cabo por el virus recombinante tambien se evaluo tras la inyeccion hidrodinamica de los ratones con ADN de prHBV1.3-III (Yang P.L. et al., Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13825-30, 2002; Pajot A et a., A mouse model of human adaptive immune functions: HLA-A2.1/HLA-DR1-transgenic H-2 class I/class II-knockout mice, Eur. J. Immunol. 34(11):3060-9, 2004).

Tres dfas despues de la inyeccion de ADN de prHBV1.3-III, se recolecto el hfgado y se llevo a cabo el analisis histoqufmico en secciones de hfgado. Se observo la expresion de HBsAg en las celulas hepaticas utilizando MoAb anti-HB para la deteccion (figuras 6A y 6C). El HBeAg recombinante portador de los epftopos extranos se detecto utilizando un MoAb anti-FLAG (figuras 6B y 6D). Los ratones de control recibieron una inyeccion hidrodinamica de PBS.

Ejemplo 6: evaluacion de la respuesta de linfocitos T al poliepftopo in vivo

Con el fin de evaluar la respuesta de linfocitos T contra el poliepftopo extrano, se sometio a ensayo un plasmido con el poliepftopo controlado por el promotor del CMV (pCMV-rHBe) mediante inmunizacion con ADN por via intramuscular (dos inyecciones) en ratones transgenicos HLA-A2/DRB1*01 (Pajot et al., 2004). Se analizaron las respuestas especfficas de linfocitos T contra los epftopos extranos mediante proliferacion y ensayos ELISPOT una semana despues de la segunda inyeccion en ratones. El epftopo de linfocitos T CD4 PADRE activo las celulas secretoras de IFN-y (figura 7, panel izquierdo) y fue capaz de inducir la proliferacion de linfocitos de ratones inmunizados (figura 7, panel derecho).

El epftopo Flu derivado de la matriz fue el mas frecuentemente reconocido de entre los epftopos CD8+ presentes en el poliepftopo (4/6 ratones respondedores). Las respuestas de linfocitos T al VEB y los epftopos derivados del nucleo se observaron en unicamente un raton. La respuesta inmunodominante al epftopo derivado de Flu probablemente resulto de la competicion entre peptidos para la fijacion a la molecula HLA-A2. Lo anterior se confirmo en un segundo experimento con 8/10 ratones inmunizados que presentaban respuestas de linfocitos T al epftopo derivado de Flu y solo 3/10 al epftopo HLA-A2 derivado de HBc 18-27 (figura 8, panel izquierdo). Sin embargo, los linfocitos T activados por epftopos derivados de Gag y del VEB eran detectables tras la estimulacion in vitro de una semana de esplenocitos con los peptidos correspondientes antes de los ensayos ELISPOT de IFN-y.

Las respuestas de linfocitos T al epftopo Flu de matriz tambien se cuantificaron utilizando un tetramero de HLA-A2 que portaba el epftopo Flu en esplenocitos de ratones inmunizados con ADN (dos inyecciones de pCMV-rHBe). Los linfocitos T especfficos de Flu representan aproximadamente 10% de los linfocitos T CD8+ del bazo (figura 8, panel derecho).

La respuesta inmunitaria al poliepftopo expresado por el virus recombinante tambien se evaluo tras una inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3-III en ratones transgenicos HLA-A2/DRB1*01. Se llevaron a cabo ensayos ELISPOT de IFN-y en esplenocitos obtenidos 16 dfas despues de la inyeccion hidrodinamica. Se detectaron linfocitos T especfficos para el epftopo Flu de matriz en 4 de 5 ratones (figura 9). En el presente experimento, se inmunizaron 2 ratones mediante inyeccion intramuscular con prHBV1.3-III como control (ratones 6 y 7). La inyeccion intravenosa de VHB recombinante es menos inmunogenica que la inyeccion intramuscular. Lo anterior podrfa relacionarse con la via de inyeccion y con la expresion de antfgenos en el hfgado, el cual es conocido que es un organo tolerogenico.

Ejemplo 7: evaluacion de la respuesta de linfocitos T a poliepftopo in vivo y localizacion de linfocitos T especfficos de Flu

Se inmunizaron grupos de ratones HLA-A2/DRB1*01 (Pajot et al., 2004) por via intramuscular con el plasmido pCMV-rHBe para inducir inicialmente respuestas de linfocitos T especfficos para epftopos extranos. Quince dfas despues de la induccion inicial, los ratones recibieron una inyeccion por la via hidrodinamica de prHBV1.3 o pCMV-

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pGal (plasmido de control) o una inyeccion intramuscular de pCMV-rHBe. La figura 10A presenta una ilustracion grafica de la lrnea temporal de la inmunizacion.

Se prepararon linfocitos infiltrantes en el tugado y se tineron con anticuerpos anti-CD8 anti-CD3 y con tetrameros de Flu para el analisis de FACS. Se utilizaron ratones de control no inmunizados como control. Se llevo a cabo la cuantificacion de los linfocitos T CD8 tras la tincion con anticuerpos anti-CD8 anti-CD3. Las celulas CD3+ CD8" como linfocitos T CD4+. El analisis de FACS mostro que el numero de linfocitos T CD8+ infiltrantes en el tugado era mucho mas alto en ratones receptores de prHBV1.3 (figura 10B, panel B3, 37,4%) en comparacion con los que recibieron pCMV-pGal (figura 10B, panel B2, 7,31%) y los ratones que no recibieron ninguna inyeccion (figura 10B, panel B1, 5,11%). La tincion de los linfocitos T espedficos de Flu se muestran en los paneles inferiores para los ratones no inmunizados, para los ratones receptores de pCMV-pGal o para los ratones receptores de prHBV1.3 mediante inyeccion hidrodinamica. Para los ratones receptores de prHBV1.3, el 17% de los linfocitos T eran espedficos de Flu. Estas celulas representan 42% de los linfocitos T cD8+. Se llevo a cabo un analisis comparable en linfocitos derivados del bazo.

Se localizaron linfocitos T y linfocitos T espedficos de Flu en el bazo y el Idgado. Se muestran los resultados en la figura 10C. Se demostro un fuerte incremento del % de linfocitos T cD8+ infiltrantes en el tugado y en menor grado en el bazo tras la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3, en comparacion con los ratones receptores de pCMV-pGal o pCMV-rHBe. En contraste, el porcentaje de linfocitos T CD4 en bazo o tugado era comparable para los tres grupos de ratones. En el tugado, la mayona de la poblacion de linfocitos consistfa de linfocitos T CD8+ espedficos de Flu, detectada mediante tincion de tetrameros. Estos experimentos indican que tras la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3, los linfocitos T espedficos de Flu cambian de localizacion, del bazo al Idgado.

Ejemplo 8: construccion de genoma de VHBr portador de un poliepftopo extrano

Se construyo prHBV1.3 en un fondo de genotipo ayw3 del VHB (n° de acceso V01460, GenBank). La invencion proporciona un plasmido de pCMV-Pol portador de una longitud completa de gen de polimerasa y la totalidad de los elementos vfticos posteriores en el genoma del VHB. La secuencia contigua al codon de inicio del gen de polimerasa se modifico por 5'CCGAACATGGAG (SEC ID n° 1), de modo consistente con la regla de Kozak. Ademas, se introdujeron dos sitios de enzima de restriccion (Hindlll y PstI) antes de un codon de inicio ATG, con el fin de adoptar un fragmento de 180 nucleotidos codificante del poliepftopo extrano (sintetizado por Genscript Corp., Piscataway, NJ), resultando en un nuevo plasmido denominado pCMV-F-Pol. La secuencia extrana incluida (F) comparte el mismo marco de lectura con los fragmentos de nucleo de VHB remanentes (figuras 11A-11D).

Para generar 1,3 copias del genoma del VHBr, se amplifico por PCR un fragmento de ADN que cubna el tramo nt1075 a nt1981 del genoma del VHB, ocupando el sitio del promotor del CMV en el plasmido parental mediante digestion con Nrul e Hindlll. pCMV-rHBc codifica el antfgeno extrano recombinante (rHBc) controlado por el promotor del CMV. pMAS-C comprende el gen nuclear del VHB, bajo un promotor del CMV. El plasmido prHBV1.3HBc presenta un casete de expresion adicional de protema nuclear del VHB. Brevemente, se amplifico por PCR una secuencia de promotor temprano del SV40 (de pCDNA3, lnvitrogen) y se inserto cadena abajo del genoma de VHBr en prHBV1.3, estando separados por un origen f1. El gen nuclear del VHB, conjuntamente con un sitio de procesamiento BGH poliA, se subclono adicionalmente bajo el promotor temprano del SV40 (figura 11D). Los plasmidos se purificaron utilizando columnas de purificacion de ADN Qiagen (Endofree Plasmid KitTM, Qiagen, Hilden, Alemania).

La amplificacion por PCR se lleva a cabo mediante extraccion del ADN vftico de sueros de raton con QlAamp DNA Blood Kit™ (Qiagen). El ADN extrafdo se trato mediante digestion con Pvull, a fin de linearizar el plasmido contaminante de ADN prHBV1.3 residual. Las bandas de ADN que cubnan un area de 2,5 a 3,5 kb en el gel tras la electroforesis se purificaron como molde para la amplificacion por PCR, con los cebadores espedficos (3042F, 5'GTGGAGCCCTCAGGCTCAGGG (SEC lD n° 2); 459R, 5'GGACAAACGGGCAACATACC (SEC lD n° 3)).

Se construyo VHBr de manera que compartiese la mayona de sus caractensticas con el genoma del VHB de tipo natural (figuras 11A y 1B) , con la excepcion de un fragmento de 325 pb dentro del gen nuclear del VHB, que se elimino y sustituyo por una secuencia extrana de 190 pb dentro del marco, codificante de una cadena de epftopos de celula T inmunodominantes (figura 11C). Como consecuencia de la delecion, se desplazo hacia adelante el marco de lectura abierta del gen de polimerasa en 135 pb, llevando el codon ATG del ORF pol a una posicion mucho mas proxima al 5' CAP en el ARN pregenomico del VHB (figuras 11A y 11B). La senal de inicio ATG del gen de polimerasa se optimizo siguiendo las reglas de Kozak con el fin de facilitar la entrada ribosomica para la traduccion.

El poliepftopo extrano se manipulo con tres epftopos de linfocitos T CD8+ inmunodominantes en combinacion con un epftopo de celula T CD4+ promiscuo (PADRE) que podfa corresponder universalmente con la mayona de las moleculas prevalentes de CMH de clase ll. Considerando la relevancia clmica, se seleccionaron tres epftopos limitados a HLA-A2 bien conocidos derivados de virus humanos comunes (gag del VlH, protema matriz del virus lnfluenza, BML-F1 del VEB), con el fin de inducir una respuesta inmunologica vigorosa in vivo. En dicho constructo, se conservo el bien conocido epftopo restringido HBc18-27 HLA-A2 presente en la parte amino-terminal del gen nuclear. Ademas, se introdujo un epftopo de celula B corto (FLAG) en la parte N-terminal de la secuencia extrana

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como marcador de deteccion conveniente (figura 11C). El gen nuclear del VHB codifica dos tipos de protefna, pre- nucleo/HBeAg y las protefnas nucleares, las cuales se traducen a partir de dos especies de ARN mensajero diferentes. Se utilizaron dos codones de inicio dentro de marco para la traduccion de los dos tipos de protefna. La protefna nuclear es el constituyente principal de la nucleocapside, que porta HBcAg. HBeAg es una protefna secretada producida mediante modificaciones post-traduccionales de una protefna precursora iniciada en el primer ATG del ORG nuclear. Por lo tanto, pudo generarse una protefna antigenica quimerica denominada rHBc, con el poliepftopo extrano fusionado dentro de marco con las protefnas HBe/capside truncadas (figura 11C).

El prHBV1.3/HBc es un plasmido con dos casetes de expresion, uno para la expresion del genoma del VHBr y el otro para la expresion de la protefna de capside (figura 11D). El plasmido prHBV1.3 porta 1,3 copias del genoma de VHBr unicamente. Se utilizaron ambos plasmidos para los ensayos de replicacion in vitro e in vivo. En pCMVrHBc, la expresion de rHBc esta controlada por el promotor genico temprano del CMV. Una senal de poliadenilacion para el ARNm es proporcionada por las secuencias del VHB (figura 11D). Este plasmido se encuentra entre los utilizados para inmunizar los ratones.

Ejemplo 9: expresion de la protefna recombinante portadora del poliepftopo

La expresion de la protefna rHBc quimerica se estudio en primer lugar en un sistema de cultivo celular. Las lfneas celulares de hepatoma humano HepG2 y Huh 7 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero de feto bovino (SFB) al 10%. Se obtuvo polietilenimina (PEI) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y se utilizo para los ensayos de transfeccion transitoria. Se recolecto el sobrenadante del cultivo celular el dfa cuatro despues de la transfeccion con PEI y se utilizo para preparar el ADN vfrico del VHBr.

Se llevaron a cabo experimentos de inmunofluorescencia con celulas HepG2 tres dfas despues de la transfeccion de ADN, utilizando metodos publicados. Brevemente, se fijaron las celulas con paraformaldehfdo al 4% en solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Las celulas o secciones de tejido se incubaron con mAb anti-Flag (1084, 1:100, Sigma-Aldrich) o mAb anti-HB (3E7, 1:100, Dako, Glostrup, Dinamarca) a 4°C durante la noche. Tras un lavado extensivo, el anticuerpo primario unido se detecto con inmunoglobulina G de conejo antiraton marcada con Alexa 488 (Molecular Probes, Carlsbad, CA).

Se llevo a cabo la tincion histologica en hfgado de raton recien preparado, congelado en isopentano preenfriado en nitrogeno lfquido y se incluyo en compuesto OCT en criomoldes. Se montaron secciones de criostato de cinco micrometres de grosor sobre portaobjetos Superfrost plus y se almacenaron a -80°C. Antes de la tincion, los portaobjetos se fijaron en acetona helada durante 5 a 10 minutos. Se tineron las secciones de hfgado con hematoxilina y eosina o se inmunotineron con anticuerpo anti-HB marcado con FITC (1:50, ab32914, Abcam, Cambridge, MA). Tras un lavado extensivo con PBST y PBS, las secciones de hfgado se montaron con un reactivo anti-fade que contenfa DAPI.

Tras la transfeccion transitoria del plasmido prHBV1.3 en la lfnea celular HepG2 derivada de hepatocitos, se detecto una protefna recombinante con el tamano esperado (15 kD) mediante transferencia western en lisados celulares utilizando el anticuerpo anti-FLAG (figura 12A). Tambien se detecto la protefna rHBc mediante tincion de anticuerpos e inmunofluorescencia en el citoplasma de las celulas HepG2 transfectadas, utilizando el anticuerpo anti-Flag (figura 12B, panel inferior). La expresion de las protefnas de cubierta del VHB en celulas transfectadas con el VHBr se detecto utilizando un anticuerpo contra HBsAg, que es el determinante antigenico principal de la cubierta (figura 12B, panel superior). Resulta interesante que el marcaje del HBsAg intracelular se encontraba dispersado homogeneamente en el citoplasma, mientras que el rHBe se localizaba en el area perinuclear, con polarizacion. Ademas, las partfculas de HBsAg portadoras de la protefna de cubierta grande (G) del VHB tambien fueron detectadas mediante ELISA en el sobrenadante de cultivo celular tras la transfeccion de prHBV1.3 (ver posteriormente y en la figura 12D).

Ejemplo 10: rescate de partfculas de VHBr y replicacion mediante encapsidacion en trans

El VHBr es un virus VHB defectuoso debido a la interrupcion del gen nuclear. Sin embargo, se replica y se mantiene en los hepatocitos con ayuda de una capside de VHB de tipo natural producida en trans en los hepatocitos infectados. La invencion proporciona formas replicantes del ADN vfrico del VHBr en el sobrenadante de cultivo celular, por ejemplo de la lfnea celular hepatica Huh-7, tras la transfeccion del plasmido prHBV1.3/HBc codificante tanto del genoma del VHBr como de la protefna de capside, pero no tras la transfeccion de prHBV1.3.

Se extrajo el ADN vfrico asociado a los viriones de VHBr de los sobrenadantes de cultivo celular de las celulas HepG2 o Huh-7 transfectadas. Brevemente, las partfculas vfricas en el medio se precipitaron mediante incubacion con PEG 8000 al 10% durante la noche sobre hielo. Tras la centrifugacion a 11.000 rpm durante 30 minutos, los pellets se suspendieron en tampon (Tris/HCl 100 mM (pH 8,0)) y se trataron adicionalmente con ADNasa I (Invitrogen, Carlsbad, CA) en presencia de MgCl2 10 mM, Tras la digestion con proteinasa K (1 mg/ml), se precipito el ADN vfrico utilizando etanol y glucogeno como portador. Se llevo a cabo un ensayo de transferencia southern mediante metodos conocidos de la tecnica con una sonda marcada con 32P especffica para el genoma del VHB.

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Tras la extraccion del ADN y la hibridacion de sonda especffica del VHB en ensayos de transferencia southern, se detecto el ADN vfrico, tanto en su forma circular relajada (CR) tfpica como en la forma lineal de doble cadena (LDC) (figura 13A), indicando un empaquetamiento y maduracion normales de la nucleocapside del VHBr. Ademas, el VHBr de nucleo rescatado mostro un ciclo vfrico mas eficiente que el VHB de tipo natural. Con la cotransfeccion con VHBpwt, los intermediarios replicantes de VHBr se expresaron a niveles significativamente superiores que las formas replicantes de tipo natural, indicando el rescate, empaquetamiento y maduracion de los viriones de VHBr en presencia de protefna de capside de tipo natural (figura 13C).

La tecnologfa de inyeccion hidrodinamica (Liu F., Gene Therapy, 1999) se utilizo para introducir el genoma del VHBr en el hfgado de raton. Cuatro dfas despues de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 por la vena de la cola, se detectaron ambas protefnas antigenicas recombinantes (rHBc) y protefnas de cubierta del VHB mediante tincion inmunofluorescente de secciones de hfgado con anticuerpos anti-FLAG y anti-HB, respectivamente (figura 12C). Conjuntamente estos experimentos sugieren que las protefnas de cubierta del VHB y la protefna rHBc portadora del poliepftopo se expresan tras la transfeccion in vitro e in vivo del plasmido portador de 1,3 copias del genoma del VHBr.

Ademas, se detectaron los viriones recombinantes de VHBr en los sueros de los ratones que habfan recibido tanto prHBV13 como pMAS-C mediante inyeccion hidrodinamica, utilizando la amplificacion por PCR especffica el dfa cuatro despues de la inyeccion. En contraste, en ausencia de pMAS-C, la inyeccion de prHBV1.3 por sf solo o con la coinyeccion de un plasmido codificante de beta-galactosidasa (pCMV-pGal), no se detecto ADN vfrico (figura 13D). Por lo tanto, el genoma del VHBr puede complementarse en trans con protefnas de capside in vitro e in vivo, dando lugar a partfculas vfricas completas que contienen formas replicantes de ADN vfrico.

La protefna de cubierta grande (G) es conocido que se localiza sobre la superficie de las partfculas vfricas completas del VHB de 42 nm y sobre las partfculas subvfricas filamentosas presentes en el suero de los individuos infectados por el VHB. Con el fin de demostrar que pueden producirse partfculas vfricas completas a partir del genoma del VHBr, se llevaron a cabo experimentos de cotransfeccion de prHBV1.3 y un plasmido codificante de la protefna nuclear (pMAS-C) en la lfnea celular Huh-7. La cotransfeccion con el plasmido codificante de protefna nuclear resulto en un incremento de la produccion de partfculas portadoras de protefna G en el sobrenadante de cultivo celular, en comparacion con la transfeccion de prHBV1.3 solo o la cotransfeccion con pIRES-GFP como control. El incremento de la produccion de protefna G era dependiente de la dosis, tal como se muestra en un ELISA especffico utilizando dos anticuerpos monoclonales diferentes que reconocen la parte aminoterminal de la protefna G (figura 13B).

Ejemplo 11: activacion de respuestas de linfocitos T especfficos de poliepftopo

Se cuantificaron los esplenocitos productores de IFN-y mediante ensayos Elispot ex vivo tras la estimulacion con peptido, tal como es conocido de la tecnica. Brevemente, se recubrieron placas de nitrocelulosa-HA de 96 pocillos (Millipore, Bedford, MA) mediante la incubacion durante la noche a 4°C con anticuerpo de captura contra IFN-y (551216, BD Pharmingen, San Diego, CA). Se incubaron los esplenocitos recien aislados (106/pocillo) con peptido individual a una concentracion de 1 pg/ml en medio a-MEM complementado, durante 24 horas. Se revelaron los puntos con un anticuerpo secundario conjugado con biotina (554410, BD Pharmingen, San Diego, CA) y estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Roche, Basel, Suiza). Se utilizo un contador automatico Elispot de Zeiss para registrar el numero de puntos. La respuesta se considero positiva en el caso de que la mediana de celulas formadoras de punto (CFP) en pocillos por triplicado fuese por lo menos el doble del numero en los pocillos de control, que contenfan medio solo.

Para el ensayo de proliferacion, se incubaron esplenocitos (106 celulas/pocillo) con 20 pg/ml de peptido durante tres dfas en medio sin suero HL1 complementado (Biowhitaker, Walkersville, Maryland) (Pajot et al., 2004). Las celulas recibieron un pulso de 1 pCi de (3H)-timidina en cada pocillo para las 16 h finales. La radioactividad incorporada se midio en un contador micro-p.

Con el fin de evaluar las respuestas de linfocitos T contra el poliepftopo extrano, se utilizo un plasmido de ADN codificante de rHBc (pCMV-rHBc, tal como se indica en el Ejemplo 1) para inmunizar ratones transgenicos HLA- A2/DR1 (Pajot et al., 2004). Dos semanas despues de la inyeccion intramuscular, nueve de los diez ratones sometidos a ensayo habfa producido respuestas de linfocitos T especfficos de epftopo, tal como se detecto utilizando ensayos IFNy-ELISPOT ex vivo (figura 14A).

El epftopo derivado de matriz de Flu evidentemente es el mas frecuentemente reconocido y el mas potente de entre los tres epftopos extranos de linfocitos T CD8+ (9 de cada 10 ratones respondedores). La respuesta de linfocitos T especffica de Flu incluso era superior a la respuesta al bien descrito epftopo HBc18-27 HLA-A2 derivado de la capside que se encuentra presente en la parte N-terminal de la protefna. La respuesta inmunodominante del epftopo derivado de Flu probablemente resulto de la competicion entre peptidos para la fijacion a la molecula HLA-A2. Sin embargo, los linfocitos T especfficos de Gag y de VEB eran detectables tras una semana de estimulacion in vitro de esplenocitos con peptidos individuales. Tambien se cuantificaron las respuestas de linfocitos T al epftopo de matriz Flu utilizando un pentamero de HLA-A2 (ProImmune, Oxford, Reino Unido) que portaba el peptido Flu para marcar

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esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con ADN. De acuerdo con lo anterior, los linfocitos T especfficos de Flu representaban aproximadamente 10% de los linfocitos T CD8+ del bazo (figura 14B, panel derecho).

Los ratones receptores de la inyeccion de pCMV-rHBe tambien desarrollaron respuestas de linfocitos T auxiliares contra el epftopo restringido a CMH de clase II PADRE, tal como demuestran tanto el ensayo de IFNy-ELISPOT (figura 14A) como la proliferacion especffica observada en cinco de seis ratones inmunizados, tras la estimulacion de los esplenocitos con el peptido PADRE (figura 14C).

Ejemplo 12: redireccion de las respuestas de linfocitos T especfficos de poliepftopo al hfgado

Se perfundieron ratones con 20 ml de PBS a traves de la via ventricular. Se trituro el hfgado con un embolo de jeringa en un filtro celular de 100 pm (Nylon de 100 pm, BD, Franklin Lakes, NJ). Los pellets celulares se resuspendieron en 15 ml de Purcell al 40% (Sigma, St. Louis, MO) y se centrifugaron a 2.000 rpm durante 20 minutos para eliminar los agregados de hepatocitos. Los linfocitos intrahepaticos en los pellets se purificaron adicionalmente mediante centrifugacion en gradiente de Ficoll al igual que para la separacion de los esplenocitos de raton. Se tineron linfocitos recien aislados utilizando anti-CD3 marcado con PerCP, anticuerpos anti-CD8 marcados con APC o tetramero de HLA de clase I marcado con PE conjugado con peptido Flu.

Para el analisis de FACS, se analizaron por lo menos 10.000 sucesos separados en la poblacion de interes, en un citometro FACSCalibur utilizando el programa CellQuest (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Con el fin de demostrar que el VHBr se mantiene simultaneamente con el virus VHB de tipo natural en el hfgado y en ausencia de un modelo de raton de la infeccion y replicacion del VHB, la invencion proporciona un protocolo de inmunoterapia activa basada en el VHBr en ratones transgenicos HLA-A2/DR1 (figura 15a).

Los ratones HLA-A2/DR1 se inmunizaron mediante inyeccion intramuscular de plasmido pCMV-rHBc el dfa 0 para inducir inicialmente respuestas de linfocitos T especfficas del poliepftopo en la periferia. Dos semanas despues, se inyecto prHBV1.3 mediante una via hidrodinamica para eludir la infeccion de los hepatocitos e imitar la replicacion del VHB en el hfgado (Yang P., Althage L.A., Chung J., Chisari F.V., Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13825-30, 2002). De esta manera, el VHBr puede expresarse en las celulas hepaticas en las que el antfgeno extrano codificado se procesa para formar peptidos y se presenta in situ proporcionando, a su vez, dianas para una respuesta de linfocitos T CD8+. SE utilizo pCMV-pGal como plasmido de control para la inyeccion hidrodinamica.

Tras la induccion inicial y la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3, los ratones montaron una respuesta intrahepatica vigorosa de celulas T, con un gran numero de linfocitos T CD8+ infiltrantes en el hfgado. Los linfocitos T CD8+ se acumularon en los hfgados de raton, segun se detecto mediante analisis de FACS de los linfocitos infiltrantes en el hfgado obtenidos los dfas 3, 4 y 7. El dfa 7, el porcentaje de linfocitos T CD8+ infiltrantes en el hfgado representaba hasta 37,4% de los linfocitos totales en ratones receptores de prHBV1.3, en comparacion con los ratones receptores de pCMV-pGal (7,31%) y con ratones no inmunizados (5,11%) (figura 15B). El 17% de las celulas T, lo que representa el 42% de los linfocitos infiltrantes totales en el hfgado, en los ratones que habfan recibido prHBV1.3 eran especfficas de Flu. En comparacion, solo el 0,36% de los linfocitos T CD8+ especfficos de Flu inducidos inicialmente por la inyeccion intramuscular se encontraban presentes en el hfgado siete dfas despues de la inyeccion hidrodinamica de pCMV-pGal.

Las figuras 15C y 15D muestran la distribucion relativa de los linfocitos T CD8+ y CD4+ en los hfgados y bazos de grupos de ratones inducidos inicialmente que recibieron prHBV1.3 o pCMV-pGal mediante inyeccion hidrodinamica, o que recibieron dos inyecciones intramusculares de pCMV-rHBc. Se observo un fuerte incremento del porcentaje de linfocitos T CD8+ en el hfgado y, en menor grado, en los bazos de los ratones tras la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3, en comparacion con los ratones que recibieron pCMV-pGal y con los ratones que recibieron pCMV-rHBc solo.

Notablemente, se observo un gran incremento del porcentaje de linfocitos T CD8+ especfficos de Flu en los hfgados de los ratones receptores de prHBV1.3. Tras la inmunizacion, los linfocitos T CD8+ especfficos de Flu comprendfan un porcentaje muy alto de linfocitos hepaticos, en comparacion con el porcentaje de linfocitos esplenicos (p=0,0002). En contraste, los porcentajes de linfocitos T CD4+ en el bazo y en el hfgado no eran significativamente diferentes en los tres grupos de ratones. En presencia de la vigorosa respuesta de linfocitos T CD8+, el reservorio de linfocitos T CD4+ era relativamente reducido en el hfgado, pero no en el bazo. Estos experimentos demuestran que la mayorfa de los linfocitos T CD8+ perifericos especfficos de Flu cambiaron de localizacion, al hfgado, tras la inmunizacion activa basda en VHBr.

El incremento del porcentaje de linfocitos totales obtenidos tras la inmunizacion alcanzo significancia estadfstica tanto en el hfgado como en el bazo. Tal como se muestra en la figura 15C, el porcentaje de linfocitos CD8+ observado en los hfgados de ratones receptores de la induccion inicial con pCMVrHBe seguido de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 era significativamente mas elevada que en los hfgados de los ratones receptores de induccion inicial de pCMVrHBe seguido de la inyeccion hidrodinamica de pCMVpGal (p=0,0001) y significativamente mas ala que los ratones doblemente inyectados con pCMVrHBe por la via intramuscular (p=0,0009).

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Un incremento similar del porcentaje de linfocitos CD8+ en los bazos de ratones receptores de induccion inicial con pCMVrHBe seguido de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 fue significativamente superior que en los bazos de los ratones receptores de induccion inicial con pCMVrHBc seguida de la inyeccion hidrodinamica de pCMVpGal (p=0,0011) y significativamente superior que en ratones inyectados doblemente con pCMVrHBe por la via intramuscular (p=0,0114).

Ejemplo 13: control no citolftico de la expresion genica del VHB en el hfgado mediada por linfocitos T especfficos de poliepftopo

Los linfocitos T CD8+ eran la poblacion principal en infiltrados hepaticos el dfa siete posterior a la inyeccion hidrodinamica, tal como se ha indicado anteriormente. El analisis adicional de los infiltrados hepaticos se llevo a cabo mediante analisis histoqufmico de secciones de hfgado obtenidas cuatro dfas despues de la inyeccion de prHBV1.3 (figura 16A). Se observo una notable infiltracion de celulas inflamatorias en el hfgado, predominantemente centrada en agregados de diversos tamanos, lo que sugiere que se desarrollaron rapidamente para formar focos inflamatorios. La presencia de estos infiltrados era dependiente del cebado inicial de respuestas perifericas de celulas T, ya que se encontraron algunos agrupados de celulas en secciones de hfgado obtenidas de ratones receptores de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 sin induccion inicial previa. Se observaron pocos o ningun infiltrado agrupado en los ratones receptores de induccion inicial con pCMV-rHBe seguida de la inyeccion hidrodinamica de pCMV-pGal (figura 16A).

Los linfocitos T especfficos de Flu se fenotiparon adicionalmente como CD44+, CD62Llow y CD69high (figura 16B), correspondiendo a linfocitos T activados o de memoria efectores que experimentaban una expansion in vivo. Tras la estimulacion ex vivo con el peptido Flu, dichas celulas, recien aisladas del hfgado, produjeron principalmente IFNy, aunque tambien produjeron FNTa, detectado mediante tincion intracelular (figura 16C). Aproximadamente 58% de los linfocitos T CD8+ eran positivos para la tincion superficial con CD107a, un marcador de degranulacion celular (figura 16C). Conjuntamente estos datos demuestran que las celulas infiltrantes en el hfgado eran predominantemente linfocitos T efectores CD8+ funcionales.

Al conocer que la expresion genica del VHB en el hfgado es susceptible al control no lftico por linfocitos T secretores de IFN-y tras el reconocimiento de antfgeno, los presentes inventores realizaron un seguimiento de la expresion del VHBr en el hfgado y los sueros de los ratones. Cuatro dfas despues de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3, la expresion intrahepatica de HBsAg era indetectable en los ratones receptores del cebado inicial con pCMV-rHBe (figura 16D, panel izquierdo) en comparacion con los ratones receptores de prHBV1.3 solo (figura 16D, panel derecho). De acuerdo con lo anterior, se observo una reduccion de 100 veces de HBsAg en los sueros de los ratones en los que los linfocitos T habfan sido inicialmente inducidos antes de la inyeccion de prHBV1.3 (figura 16E). En contraste, en ausencia de linfocitos T inducidos inicialmente en la periferia, los ratones mostraron una fuerte expresion de HBsAg tras la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3. Se demostro la expresion de HbsAg mediante tincion inmunofluorescente de las secciones de hfgado (figura 16D, panel derecho) y la medicion de HbsAg en suero utilizando un kit de deteccion comercial (Monolisa HBsAg ULTRA, Bio-Rad) (figura 16E, panel izquierdo). Conjuntamente estos experimentos demuestran un rapido control no citolftico de la expresion genica del VHBr por los linfocitos T CD8+ activados por poliepftopo.

Dichos linfocitos T infiltrantes hipoteticamente pueden ser responsables del dano hepatico. Sin embargo, no se observo ningun incremento significativo del marcador de dano ALT en los sueros de los ratones receptores de prHBV1.3 mediante inyeccion hidrodinamica, en comparacion con los que recibieron pCMV-pgal como control, cuatro dfas despues de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 (figura 16F). El dfa cuatro despues de la inyeccion hidrodinamica, el nivel medio de alanina transferasa serica (ALT) era de 94,18 ± 30,33 mU/ml en los 11 ratones receptores de inmunizacion basada en VHBr. En comparacion, los niveles sericos de ALT permanecieron normales en los ratones receptores de induccion inicial con pCMV-rHBc seguida de la inyeccion hidrodinamica de pCMV-pGal (media=38,00 ± 5,35), mientras que se observo un drastico incremento en los sueros de los ratones con hepatitis aguda inducida con concanavalina A (figura 16F) (Zhu R. et al., The Pro-Th1 cytokine IL-12 enhances IL-4 production by invariant NKT cells: relevance for T cell-mediated hepatitis, J. Immunol. 178:5435-42, 2007). Por lo tanto, sugiere que, en presencia de la respuesta de linfocitos T construida perifericamente, la expresion del VHBr atrajo rapidamente la respuesta de linfocitos T al hfgado sin provocar ningun dano mayor en el mismo.

Ejemplo 14: inmunoterapia activa en ratones transgenicos de HBsAg

La invencion demuestra ademas el direccionamiento y la expresion vfricos especfficos de organo de los pseudovirus de la invencion utilizando un linaje de raton transgenico que expresa protefnas de cubierta del VHB en el hfgado y secreta HBsAg en el suero. Este linaje se retrocruzo previamente con ratones transgenicos HLA-A2 y no presentaba moleculas del CMH de clase I murino. Los ratones transgenicos HLA-A2/DR1 (transgenicos HLA-A02.01/DR1, H-2 clase l/clase II KO) y los ratones transgenicos HbsAg/HLA-A2 utilizados en el presnete estudio se criaron en las instalaciones para naimales del Institut Pasteur (Pajot et al., 2004).

El linaje doblemente transgenico HbSAg/HLA-A2 (H-2 clase l KO) esta dotado de un fondo de HLA-A2 y produce

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HBsAg en el hfgado del raton tras la expresio ndel transgen. Se llevo a cabo la inmunizacion intramuscular con ADN mediante la inyeccion de 100 pg de aDn plasmfdico en los musculos tibiales anteriores en regeneracion (es decir, tratados con cardiotoxina). Para la inyeccion hidrodinamica, se utilizaron ratones hembra de aproximadamente 12 a 15 semanas de edad. Brevemente, se inyectaron 25 pg de ADN plasmfdico por la vena de la cola en un volumen de PBS equivalente a 8% del peso corporal del raton. Se administro el volumen total en cinco segundos. Se extrajeron muestras de sangre y suero de los ratones y se sometieron a ensayo para HBsAg mediante ELISA especffico en los tiempos indicados. Todos los experimentos con ratones se realizaron siguiendo las directrices europeas.

Tras la induccion inicial y la inyeccion hidrodinamica, se extrajeron muestras de sangre de los ratones cada semana para realizar un seguimiento de la concentracion de HBsAg en el suero. Se observo por primera vez una reduccion de HBsAg en el suero dos semanas despues de la induccion inicial y le siguio una segunda reduccion acusada en todos los ratones examinados una a dos semanas despues de la inyeccion hidrodinamica de prHBV1.3 (figura 17B). La reduccion posterior a la induccion inicial corresponde al flujo de entrada de los linfocitos T especfficos de polipeptido de la circulacion hacia el hfgado. La reduccion de HBsAg alcanzo el 90%, en comparacion con el nivel inicial en algunos de los ratones sometidos a ensayo (figura 17B). En contraste, en los ratones receptores de pCMV- pGal a modo de control, no se observo una reduccion significativa de HBsAg tras la inyeccion hidrodinamica (figura 17C).

La eliminacion de HBsAg no fue completa y el nivel de antfgeno fluctuo en torno a 25% del nivel basal durante el seguimiento a los dos meses. Sin embargo, la eliminacion de HbsAg fue fuerte y duradera en comparacion con los animales de control con pCMV-pGal ocho semanas despues de la inmunizacion (p<0,0001).

Los presentes inventores han demostrado anteriormente que el ARNm del VHB en el hfgado es susceptible de regulacion negativa por el IFN-y secretado por los linfocitos T activados por vacuna especfficas de HBsAg (Mancini- Bourgine et al., 2004). Los ratones con fondos de HBsAg/HLA-A2 transgenicos para HbsAg tambien manifestaron una respuesta antivfrica a la inmunizacion activa basada en VHBr.

La eliminacion de HBsAg demostrada mediante los metodos de la invencion probablemente esta relacionada con el flujo de entrada no del VHB, especffico del poliepftopo de linfocitos T especfficos de Flu al hfgado y a un efecto observador de los linfocitos T secretores de IFN-y sobre los hepatocitos expresantes de HBsAg. Lo anterior sugiere que dichos linfocitos T efectores funcionales no solo controlan la expresion del VHBr, tal como se muestra en la figura 16E, sino que tambien demuestran la expresion del transgen del VHB en el hfgado.

En resumen, la presente solicitud presenta una nueva estrategia eficiente y viable para la utilizacion de la inmunizacion activa para el tratamiento de las infecciones vfricas persistentes, que satisface una necesidad sentida desde largo tiempo de la tecnica.

Durante toda la presente solicitud, los terminos "rHBe" y "rHBc" se refieren, sin distincion, a los productos de traduccion del marco de lectura abierta preCC modificado.

Referencias

En la presente memoria se mencionan las referencias siguientes. La divulgacion en su totalidad de cada referencia mencionada a continuacion, y asimismo de las mencionadas anteriormente, depende de y es incorporada como referencia a la presente memoria.

1. Bertoletti A., and A.J. Gehring. 2006. The immune response during hepatitis B virus infection. J Gen Virol 87:1439-49.

2. Chisari F.V., and C. Ferrari. 1995. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Annu Rev Immunol 13:29-60.

3. Ganem D., and A.M. Prince. 2004. Hepatitis B virus infection-natural history and clinical consequences. N Engl J Med 350:1118-29.

4. Guidotti L.G., and F.V. Chisari. 2001. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. Annu Rev Immunol 19:65-91.

5. Gunther S., N. Piwon, A. Jung, A. Iwanska, H. Schmitz, and H. Will. 2000. Enhanced replication contributes to enrichment of hepatitis B virus with a deletion in the core gene. Virology 273:286-99.

6. Mancini M., M. Hadchouel, H. L. Davis, R. G. Whalen, P. Tiollais, and M. L. Michel. 1996. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12496-12501.

7. Mancini-Bourgine M., H. Fontaine, D. Scott-Algara, S. Pol, C. Brechot, and M. L. Michel. 2004. Induction or expansion of T-cell responses by a hepatitis B DNA vaccine administered to chronic HBV carriers. Hepatology

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40:874-82.

8. Morosan S., S. Hez-Deroubaix, F. Lunel, L. Renia, C. Giannini, N. Van Rooijen, S. Battaglia, C. Blanc, W. Eling, R. Sauerwein, L. Hannoun, J. Belghiti, C. Brechot, D. Kremsdorf, and P. Druilhe. 2006. Liver-stage development of Plasmodium falciparum, in a humanized mouse model. J Infect Dis 193:996-1004.

9. Rehermann B., and M. Nascimbeni. 2005. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. Nat Rev Immunol 5:215-29.

10. Yang P.L., A. Althage, J. Chung, and F.V. Chisari. 2002. Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 99:13825-30.

11. Nakabayashi H., K. Taketa, K. MIyano, T. Yamane, and J. Sato. 1982. Growth of human hepatoma cell lines with differentiated functions in chemically defined medium. Cancer Res. 42(9):3858-63.

12. ATCC number HB-8065.

13. Pajot A., M.L. Michael, N. Fazilleau, V. Pancre, C. Auriault, D.M. Ojcius, F.A. Lemonnier, and Y.C. Lone. 2004. A mouse model of human adaptive immune functions: HLA-A2.1/HLA-DR1-transgenic H-2 class I/class II-knockout mice. Eur J Immunol. 34(11):3060-9.

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   REIVINDICACIONES

   1. Virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion que comprende:

   un genoma de virus de la hepatitis B defectuoso para la expresion de la protefna de capside del virus de la hepatitis B (HBc), en el que el virus contiene una secuencia de nucleotidos de hasta aproximadamente 195 nucleotidos codificante de un peptido extrano que no se encuentra en el virus de la hepatitis B de tipo natural que comprende por lo menos un epftopo inmunodominante, en el que dicho peptido extrano comprende epftopo(s) que provoca(n) la respuesta de linfocitos T, y en el que el gen dianizado para la insercion de epftopo es el gen codificante de la nucleocapside.
2. 2. Virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion segun la reivindicacion 1, en el que dicho peptido extrano se expresa fusionado dentro de la parte N-terminal de la protefna de capside del VHB.
3. 3. Virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha secuencia de nucleotidos se encuentra localizada entre el residuo nucleotfdico 1981 y el residuo nucleotfdico 2308 del genoma de ayw3 de VHB, en el que la numeracion se inicia a partir del cuarto nucleotido en el sitio EcoRI del genoma de VHB, n° de acceso de NcBl V01460.
4. 4. Virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho peptido extrano comprende uno o una pluralidad de epftopos de uno o mas orfgenes diferentes.
5. 5. Virus de la hepatitis B recombinante defectuoso para la replicacion segun una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho peptido extrano se obtiene a partir de un patogeno.
6. 6. Celula hepatocito aislada de un vertebrado no humano infectada por el virus de la hepatitis recombinante, defectuoso para la replicacion, segun una de las reivindicaciones 1 a 5.
7. 7. Celula hepatocito segun la reivindicacion 6, en la que la celula comprende ademas una secuencia de nucleotidos codificante de HBc para la complementacion del virus de la hepatitis recombinante para formar un pseudovirus de la hepatitis.
8. 8. Pseudovirus de la hepatitis recombinante que comprende el virus de la hepatitis recombinante, defectuoso para la replicacion, segun una de las reivindicaciones 1 a 5, complementado con HBc, en el que el pseudovirus se replica in vitro en los hepatocitos humanos.
9. 9. Celula hepatocito aislada de un vertebrado infectada por el pseudovirus de la hepatitis segun la reivindicacion 8.
10. 10. Metodo de formacion de un pseudovirus de la hepatitis, en el que el metodo comprende cultivar la celula hepatocito segun la reivindicacion 7 bajo unas condiciones para la expresion de la secuencia de nucleotidos codificante de HBc y la complementacion del virus de la hepatitis B recombinante, defectuoso para la replicacion, para formar un pseudovirus de la hepatitis.
11. 11. Vector de clonacion y/o expresion que comprende un virus de la hepatitis recombinante, defectuoso para la replicacion, segun una de las reivindicaciones 1 a 5.
12. 12. Celula hospedadora eucariotica aislada que comprende un vector segun la reivindicacion 11.
13. 13. Metodo in vitro de produccion de un pseudovirus de la hepatitis, en el que el metodo comprende:

    - proporcionar una celula hospedadora segun la reivindicacion 12;

    - expresar las protefnas de la hepatitis bajo unas condiciones en las que las protefnas se ensamblan en un pseudovirus de la hepatitis, que se liberan de la celula hospedadora en el espacio extracelular, y opcionalmente;

    - recuperar el pseudovirus de la hepatitis.
14. 14. Composicion que comprende el virus recombinante, defectuoso para la replicacion, segun una de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
15. 15. Vacuna que comprende la composicion segun la reivindicacion 14.
16. 16. Composicion que comprende el virus recombinante, defectuoso para la replicacion, segun una de las reivindicaciones 1 a 5 para su utilizacion como un medicamento para el tratamiento de un paciente infectado cronica o persistentemente por un virus de la hepatitis B.