JPH01240182A - 新規なＢ型肝炎ウイルス表面抗原産生株ＭＳ１２８、及び該細胞株によるｐｒｅ Ｓ２蛋白質を含有するＢ型肝炎ウイルス表面抗原を生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＢ型肝炎の予防に有効なｐｒｅ　Ｓ２蛋白質を
含有するＢ型肝炎ウィルス表面抗原（以下、ＨＢｓＡｇ
という）を著量（従来知られているＨＢｓＡｇ自発産生
株であるアレキサンダー細胞の１０倍以上の産生量を持
つ）産生ずる新規な細胞株、および該細胞株を用いてｐ
ｒｅ　５２蛋白質を含有するＨ　Ｂ−ｓ　Ａ　ｇを生産
する方法に関するものである。

更に詳しくはＢ型肝炎ウィルス（以下、ＨＢＶという’
）　ＤＮＡの一部を培養細胞にトランスフェクトして形
質転換することによりＨＢｓＡｇを産生ずる形質転換体
を得、更に該形質転換体をクローニングすることにより
得られた新規な細胞株ＭＳ１２８、および該細胞株を用
いてｐｒｅ　Ｓ２蛋白質を含有する）ＩＢｓＡｇを生産
する方法に関するものである。

本発明の細胞株および該細胞株を用いてｐｒｅ　５２蛋
白質を含有するＨＢｓＡｇを生産する方法は、Ｈ８ワク
チン製造の原料となるｐｒｅ　５２蛋白質を含む）ｌＢ
ｓＡｇを得る上で産業上有用なものである。

（従来の技術） １（８ｖはウィルス性肝炎の一つであるＢ型肝炎の病原
ウィルスであり、）ＩＢＭの感染により引き起こされる
疾病に急性肝炎（一部は劇症肝炎となる）、慢性肝炎（
肝硬変に移行することが多い）等がある。

また、最近では）ＩＢＶの持続感染と肝細胞癌の発症と
の間に密接な関連があることを示唆する知見が得られて
いる。そしてＨＢＶの無症状の感染者（以下、単にキャ
リアという）は日本を含むアジア諸国に特に多く、未感
染者や新生児をこれらの感染者からの感染を防御する上
で、Ｈｅワクチンの大量かつ安価な生産が求められてい
る。

ＨｅワクチンはＨＢＶの構造の一部であるＨＢｓＡｇを
原料として製造されるが、ＨＢＶはヒトの他にはチンパ
ンジーにしか感染せず、また培養細胞については他の動
物の培養細胞は勿論、ヒト及びチンパンジーの培養細胞
中でも増殖しない。そのためにＨＢｓＡｇの量産は困難
なものと考えられてきた。

現在ＨＢｓＡｇを得るのには、下記の２つの方法が用い
られている。

Ａ）キャリアの血液を原料としてこれからＨＢｓＡｇを
精製する。

８）大腸菌、酵母あるいは動物細胞を親細胞株として遺
伝子組換えによりＨＢｓＡｇを産生する形質転換体を創
製し、該形質転換体を用いて生産する。

これらのうちＡ）の方法はＨｅワクチンの生産の試みの
最初から行なわれている方法であり、既に商品が市場に
出回っている。

一方Ｂ）は遺伝子工学の昨今の急速な発展によって確立
された技術を基礎にした方法であり、すでにかなりの研
究がなされ、特許出願も数多い（例えばＣｈａｒｎａｙ
、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　■、　８
９３−８９５（１９８０）、旧ｙａｎｏｈａｒａ、　Ａ
、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　ｄＯ，１−５（１９８３）
、特開昭６０−８９４３１、特開昭５９−８０６１５、
特開昭５９−３１７９９）。

（発明が解決しようとする問題点） 上記の方法Ａ）は原料がキャリアの血液であることに重
大な原料供給上の限定条件があって、膨大な需要を満た
すことは事実上不可能であるといってよい、しかも原料
血液に存在するＨＢＶは感染性があるので、製造工程に
於ける作業者への感染の危険性があり、また最終的なワ
クチン製品への混入の可能性も否定できない。

方法Ｂ）は、方法Ａ〉の如き原料供給上の制限や感染性
のＨＢＶ混入の危険性がないものであるために、大腸菌
、酵母或は鴫乳動物細胞株などを宿主として用いた非常
に数多くの研究がなされてきている。

しかしながら殆どの宿主に於いては）１８ｓＡｇの発現
は決して能率の良いものではない。特に宿主が大腸菌の
場合は他の蛋白質を発現させた場合と同様にＨＢｓＡｇ
は菌体内で破壊され易く、又大腸菌の生育が阻害される
という欠点がある（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ、　Ａ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０．１−５（１９８３））、
　　又宿主が哺乳動物細胞の場合、トランスフェクトさ
れたＭｌえプラスミドが継代されてゆくうちに失われ易
く、形質転換体自体が株として不安定であるものが多い
。

（問題点を解決するための手段及び発明の効果）本発明
者らは以上のような問題点を解決すべく研究を重ねてき
たが、ウシパピローマウィルス由来の発現ベクターにＨ
ＢＶ（７）　ＯＮＡ　（以下、）ＩＢＶ−（ＩＳＡトｌ
、Ｎう）の一部を組み込み、これをＲ−ｍマウス由来の
培！ＩＩＡ胞Ｃ１２７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）にト
ランスフェクトしたところ、得られた形質転換細胞株の
中にｐｒｅ　Ｓ２を含むＨＢｓＡｇを産生ずるものを得
た。そして該細胞株は染色体ＤＮＡに）１８Ｖ−ＤＮＡ
が組み込まれた安定な細胞株であることが判明した。本
発明者らはこの細胞株を８）１５２１と命名して、先に
第３４回日本ウィルス学会総会演説抄録、ｐ、１４４（
１９８６年）にて発表した。

本発明者らはこの細胞株ＢＨＳ２１を更に限界希釈法で
培養してＨＢｓＡｇ産生量を目安にしてクローニングし
たところ、単位細胞数当たりで親株のＢＨ３２１や、公
知の自発性ＨＢｓＡｇ産生株（肝癌細胞由来のアレキサ
ンダー株など）よりも遥かに大量のＨＢｓＡｇを産生ず
る株を得ることに成功した。これが本願発明の細胞株Ｍ
Ｓ１２８であり、該細胞株を常法により培養し、培養上
清液からｐｒｅ　Ｓ２蛋白質を含有するＢ型肝炎ウィル
ス表面抗原を抽出・精製する方法が本願発明の方法であ
る。

なお本細胞株ＭＳ　１２８は微生物工業技術研究所に寄
託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−９７７３として寄託されている。

ｐｒｅ　５２蛋白質は）ＩＢＶの表面抗原蛋白質をコー
ドしているＳ遺伝子の上流に存在するｐｒｅ　Ｓ２領域
がコードする５５個のアミノ酸からなるペブタイド部位
であり、）ＩＢＶ粒子上のｐｏｌｙ−Ｈ５Ａ（ｇｌｕｔ
ａｒａｌｄｅｈｙｄｅ−ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ　ｈｕ
ｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕａ＋ｉｎ）受容体を含む
ことが知られている。またｐｒｅ　Ｓ２領域のペプチド
をチンパンジーに接種することにより、ＨＢＶの感染を
予防できることも知られている。更にマウスを用いた動
物実験においては、ｐｒｅ　Ｓ２を含むＨＢｓＡｇを接
種することにより、ｐｒｅ　Ｓ２を含まないＨＢｓＡｇ
を接種した場合と比較して低濃度で抗体産生量も多く、
しかも低応答性のマウスにも有効に抗体産生をもたらす
ことが明らかにされている（Ｍｉｌｉｃｈ、　Ｄ、　Ｒ
、ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　ηＬ１１９５−１１
９９（１９８５））−このように、ｐｒｅ　Ｓ２を含む
ＨＢｓＡｇの製造はワクチンの有効性をより高めるため
に有効であると考えられる。

また、）ＩＢＶのｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄであるコア
粒子の構成蛋白質をコードしているＣ遺伝子が除去され
たＤＮＡ断片はｐｒｅ　Ｓｌ、　　ｐｒｅ　５２および
ＨＢｓＡｇをコードする部位は含まれるがコア抗原をコ
ードする部位を含む部位は含まれず、従って該ＤＮＡ断
片を導入された細胞は感染性のあるＨＢＶを産生ずるこ
とは有り得ない、そのため、製造工程および最終製品に
於いて安全であり、安全性の試験のために製品をチンパ
ンジーに投与する動物実験を行う必要もないのである。

次に本願発明細胞株の創製方法の概略を記す。

１、　　Ｍ株ＢＨ３２１（７）創製 上に記したように本願細胞株は本願発明者らにより先に
創製されたＢＨ３２１を親株とするものであり、その創
製方法は公知である（第３４回日本ウィルス学会講演要
旨集、ｐ、１４４（１９８６年））が、以下にその方法
の概略を記載する。

（１）ＨＢＶ−ＤＮＡの取得 調製方法は公知であり、例えばＦｕｊｉｙａｍａ、　Ａ
。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、　１１．４６０１−４６１０（１９８３）
に記載された方法に従えばよい。以下にその概要を記す
。

キャリアの血液中に含まれるＨＢＶから感染性のウィル
ス粒子を常法により分離し、ＮＰ−４０（Ｓｃｈｅｌ１
社＄１）で）ＩＢＶ粒子の外被（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を
除去し、内在性ＤＮＡポリメラーゼと４種（アデニン、
シトシン、グアニン、チミンに対応する）のデオキシヌ
クレトチドートリフォスフエートを用いてウィルスＤＮ
Ａを完全な環状２本鎖に修復した後、ＨＢＶ−ＤＮＡの
中に１箇所の切断部位を持つ制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで切断
して線状とする。これを大＆ｉｌ系のファージベクター
に挿入し、大腸菌菌体内で増殖させてＨＢＶ−ＤＮＡの
全ゲノムを含むクローンを得る。

こうして得られたＩＢＶ−ＯＮＡの全長ゲノム（約３，
２００ｂｐ）をプラスミドベクターに挿入し直す、常法
により宿主大腸菌からＨＢＶ−ＤＮＡを含むプラスミド
ベクターを抽出精製し、制限酵素ＢａｎＨＩでＨＢＶ−
ＤＮＡを切り出す、２分子の線状ＨＢＶ−ＤＮＡｔｔｈ
ｅａｄ　ｔｏ　ｔａｉｌに連結したｄｉｍｅｒＤＮＡ分
子を作り、このｄｉｍｅｒ　ＤＮＡ分子を制限酵素Ｂｇ
ｌＩＩにて処理し、ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄであるコ
ア粒子の構成蛋白質をコードしているＣ遺伝子が除去さ
れた約２，８００ｂｐのＤＮＡ断片とする。先にも記し
たように、このＣ遺伝子が欠損したＤＮＡ断片にはｐｒ
ｅ　Ｓｔ、　　ｐｒｅ　５２およびＨＢｓＡｇをコード
する部位は一含まれるがコア抗原をコードする部位は含
まれず、従って該ＤＮＡ断片を導入された細胞は感染性
のあるＨＢＶを産生ずることは有り得ないために、製造
工程および最終製品に於ける安全性が確保されるのであ
る。

（２）発現ベクター 発現ベクターとして、Ｌａｗ、　Ｍ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｌ、　２１１０−２１１５（１９８
３）記載のプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏを使用
する。

なおｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏは大ＨＭのプラスミドｐ
ＭＬ２に、ウシパピローマウィルス全ゲノム、抗生物質
ネオマイシン耐性遺伝子、５Ｖ−４０由来のスプライシ
ング及びポリＡ付加シグナル、マウス・メタロチオネイ
ンプロモーターを組み込んだものである。

（３）Ｍｉ換えプラスミドの構築 （２）のｐｄ８ＰＶ−ＭＭＴｎｅｏをＢａｍＨＩで切断
し、該切断箇所に（１）のＤＮＡ断片を挿入する。

（４）宿主細胞 使用されるのはＲ−ｍマウス由来の細胞株Ｃ１２７でア
ル、なお、この細胞株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にＣ
ＲＬ１６１６として保存されており、誰でも自由に人手
可能である。

（５）宿主細胞の形質転換 （３）で得られた組換えプラスミドを（４）の宿主細胞
に燐酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、、　ｅ
ｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５２．４５６−４６
７（１９７３））でトランスフェクトし、ネオマイシン
（１ｍｇ／ｍｌ）耐性の形質転）負された細胞株を選択
する０選択された細胞株の内で大量にＨＢｓＡｇを産生
し、かつ安定してＨＢｓＡｇを士音養液中に放出する細
胞株Ｂ）ｌｓ２１を樹立する。

■０本願発明の細胞株のクローニング ■、に記載された方法により得られた細胞株ＢＨ３２１
を親株として、限界希釈法で１個の細胞にまで希釈し、
その状態で培養してＩＩの細胞由来の細胞クローンを得
る。そして再度ＨＢｓＡｇ産生量を目安にして最も良好
な株を選択し、ＭＳ１２８を得る。

次に本願発明を実施例により、具体的に説明する。

（実施例） 実施例１（細胞株の取得） （１）３７℃、水蒸気飽和、５　ＸＣＯ２を含む空気中
、面積２５ｃｗ＋２の培養フラスコ（コーニング社製）
内に１０％ウシ胎児血清（ベル・フリーズ社製；以下、
Ｆｅ２という）を含むＤＭＥ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ旧ｎｉｍｕｎ＋　
Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；　　日永製薬＄り
５ｍｌの培養液を加えてＢＨ３２１を静置培養し、はぼ
−層の細胞層をフラスコ底面に形成させた。培養液を除
き、ＣａおよびＭｇを含まないＨａｎｋｓの平衡塩類溶
液で細胞層を３回洗浄してから０．０５χトリプシン（
ギブコ社！りを約１１加え、３７℃で５分間保持し、そ
の後室温に冷却して同量の培養液を加えることによりト
リプシンの作用を止めた。

（２）ピペットで軽く吸引と噴出を行なって、集塊を形
成している細胞を培養液中に分散させることにより細胞
浮遊液を作った。この細胞浮遊液の１滴を取って血球計
数板で細胞数を求め、培養液で希釈して２０細胞／１の
細胞濃度にした。

（３）９６大の平底マイクロプレート（ヌンク社！りの
各ウェルにＩＯＸのＦｅ２を含む口ＭＥを０．１ｓｌ加
え、更に（２）で作った細胞浮遊溶液を０．１１づつ加
えて、３７℃、水蒸気飽和、５　＄ＣＣｈを含む空気中
で培養した。

（４）　　４４日後、単一の細胞から形成されたコロニ
ーを１５０個得九０これらのコロニーの培養上清のＨＢ
ｓＡｇを発明者らの自家製のモルモット抗）ＩＢｓＡｇ
抗体を使フたＥＬＩＳＡ法で定量し、ＨＢｓＡｇの産生
量の最も多いクローンを選び、本願発明の細胞株ＭＳ１
２８を得た。

本細胞株は継代を重ねるに従い、ウシパピローマウィル
スＤＮＡベクターによる形質転換体に特徴的な紡錘状の
形態を呈するようになった。第３因に本細胞株の顕微鏡
写真を示す、なお、本細胞株は４０代の継代を重ねても
ＨＢｓＡｇの産生能は安定であった。

実施例２　（ｐｒｅ　Ｓ２蛋白質およびＨＢｓＡＨの生
産）実施例１で得られた細胞株ＭＳ１２８を３７℃、水
蒸気飽和、５　ＸＣＯ２を含む空気中、面積７５ＣＩ１
２の培養フラスコに５　ＸＦＣ５を含むＤＭＥ　２０ｍ
１の培養液で培養したところ、約２　Ｘ　１０’まで増
殖し、培養液中に放出されるＨＢｓＡｇの産生量は１〜
４μｇ／ａｌｌ／ｄａ７であった。

この産生量を本細胞株の親株であるＢＨ３２１およびア
レキサンダー細胞として知られる）ｌＢｓＡｇ自発産生
細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ１５と比較したのが表１である。

第１表 ＰＬＣ／ＰＲＦ１５　　　　　０．１２ＢＨ５２１０，
０８ Ｍ５１２８　　　　　　１．６ この表から判るように本細胞株は親株の２０倍、ＰＬＣ
／ＰＲＦ１５の１０倍以上の産生量を示した。

また第１図に示すように本細胞株は３日毎の培養液交換
で５０日以上ＨＢｓＡｇを産生じ続け、その総産生量は
５１日で３．５Ｂに達した。

次に培養上溝中にｐｒｅ　Ｓ２蛋白質が存在することを
証明するために、以下の実験を行なった。

ＭＳ１２８約４Ｘ　１０’ｃｅｌｌを５　％ＦＣ５を含
むＤＭＥ　１ｍｌに浮遊し、直径３５ｍｎ＋の培養デイ
ツシュに入れ、これに３５５−メチオニン（アマージャ
ム社！りｔＳＯμＣｉを加え、３７℃、水蒸気飽和、５
χＣＯ２を含む空気中で１８時間培養した。培養上清を
取り、０．０５＄　ＮＰ−４０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ
、　　５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｐＨ７，４の５０ｍＭ　
）リス緩衝液にウサギ抗）ＩＢｓＡｇ抗体（化学及血清
療法研究所より分与）を４℃で６０分間反応させて沈澱
物を得た。この沈澱物を１３％ポリアクリルアミドゲル
にかけ、アトー社のスラブゲル装置を用いて３０Ｖ、１
４時間（定電圧・電流装置はバイオラド社製）、５ＤＳ
−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動）を行なった。ゲルを取り出して乾
燥させ、コダック社のフィルムＸＡＲ−５に一７０℃で
３日間露光させてオートラジオグラフを作った。この結
果を第２図に示す、レーンＭは分子量マーカーである。

レーンｌは上記の方法で得られた標識培養上清の５Ｏ５
−ＰＡＧＥのオートラジオグラフィーである。レーン２
はＭＳ１２８を５ｓ５−メチオニンで標識する１時間前
にツニカマイシン（シグマ社製）をｌＯμｇ／ｍｌ加え
ておいて、その後は上記と同じ操作を行なったものであ
る。レーン３はウサギ抗ＨＢｓＡｇ抗体の代わりに免疫
前のウサギ血清を用いた陰性対照である。第２図のレー
ン１の２２ｋｄおよび２６ｋｄのバンドは主要Ｈ８ｓＡ
ｇ蛋白質（＋ａｊｏｒ　Ｓ）であり、３５ｋｄのバンド
はｐｒｅ　Ｓ２とｎ＋ａｊｏｒ　Ｓとから成る中型ＨＢ
ｓＡｇ蛋白質（ｍｉｄｄｌｅ　Ｓ）である、糖鎖形成阻
害剤ツニカマイシン処理をしたレーン２では２６ｋｄお
よび３５ｋｄのバンドは検出されない。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明細胞株を面積７５ｃ■２の培養フラスコ
で培養し、３日毎に培養液交換をした時の産生Ｈ８ｓＡ
ｇの積算量を示す。 第２図は本発明細胞株の培養上清のウサギ抗ＨＢｓＡｇ
抗体沈降画分を５Ｏ５−ＰＡＧＥにかけ、オートラジオ
グラフをとったものである。 第３図は本発明細胞株の顕微鏡写真である。 第１図 ＨＢｓＡｇ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｙ 第２図 〆 ”　Ｍ１２３ 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｐｒｅＳ２蛋白質を含有するＢ型肝炎ウィルス表面
   抗原を著量産生する新規な細胞株ＭＳ１２８。 ２、サブタイプａｄｒ型のＢ型肝炎ウィルスＤＮＡのＣ
   遺伝子部分が除去されているＤＮＡ断片を挿入された発
   現ベクターを、Ｒ−IIIマウス由来の細胞株Ｃ１２７（
   ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）にトランスフエクトして該細
   胞株を形質転換し、クローニングすることにより得られ
   る、紡錘状の形態を有しｐｒｅＳ２蛋白質を含有するＢ
   型肝炎ウィルス表面抗原を著量産生する新規な細胞株Ｍ
   Ｓ１２８。 ３、請求項１記載の新規な細胞株ＭＳ１２８を常法によ
   り培養し、培養上清液からｐｒｅＳ２蛋白質およびＢ型
   肝炎ウィルス表面抗原を抽出・精製することを特徴とす
   る、ｐｒｅＳ２蛋白質を含有するＢ型肝炎ウィルス表面
   抗原を生産する方法。 ４、請求項２記載の新規な細胞株ＭＳ１２８を常法によ
   り培養し、培養上清液からｐｒｅＳ２蛋白質およびＢ型
   肝炎ウィルス表面抗原を抽出・精製することを特徴とす
   る、ｐｒｅＳ２蛋白質を含有するＢ型肝炎ウィルス表面
   抗原を生産する方法。