JPS6384498A - Ｐｒｅ Ｓ−ＨＢｓＡｇの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵母発現系を用いたＰｒｅＳ領域を含むＨＢ
ｓＡｇの製造方法に関する。

〔従来の技術〕

Ｂ型肝炎を予防するためのＨＢワクチンは近年実用化さ
れた。ＨＢワクチンはＨＢｓＡｇ陽性血漿よりＨＢウィ
ルス（ＨＢ　Ｖ）の表面抗原タンパクのみを精製して製
造される。しかしこの血漿由来のＨＢワクチンは人のＨ
ＢｓＡｇ陽性血漿より製造されるために十分な量を供給
することが困難で又、価格も高価なものになるという問
題点があった。

そこで最近発達してきた遺伝子工学の手法を用いてＨＢ
ウィルスゲノムＤＮＡのクローニングが行われ、そのＤ
ＮＡ中より表面抗原をコードする遺伝子の単離が行われ
た。このＨＢｓＡｇ遺伝子を酵母を宿主とした系（Ｋ、
Ｍｕｒｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、、　３　、
３，６４５，１９８４、Ｇ、Ａ、Ｂｉｔｔｅｒ　＆　Ｋ
、Ｍ、　Ｅｇａｎ。

Ｇｅｎｅ、　３２．２６３．１９８４）、動物細胞を宿
主とした系（Ｍ。

Ｆ、Ｄｕｂｏｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｔ、＋７Ｌ４５４９、　１９８のな
どを用いて大量に発現することが可能となった。

ＨＢウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は２２ｎｍ粒子を
形成し、分子量２万４千の表面抗原タンパク（Ｐ２４と
略称する）、Ｐ２４に糖鎖のついたＰ２７からなってい
る。さらにご＜微量のＰ３１（Ｐ２４のＮ末端側に５５
個のアミノ酸残基が付加したもの、以降３ｒｄ　　Ｐｒ
ｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇと略称）、Ｐ３３　（Ｐ３１に糖
鎖がついたもの）を含有する。ＨＢウィルスは更にＰｄ
２（Ｐ３１のＮ末端側に１０８あるいは１１９個のアミ
ノ酸が付加したもの）、Ｐ４３　　（Ｐｄ２に糖鎖がつ
いたもの）を表面抗原として含有している。

Ｐ３１はＳ抗原遺伝子の上流に存在するＰｒｅ３　ｉ］
域の５５残基のアミノ酸が付加している。この５５アミ
ノ酸からなる領域はヒトポリアルブミンと結合する機能
をもつことがわかった（Ｍａｃｈｉｄａｅｔ　ａｌ、、
Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏ１．、８５＋２６８＋１９８
３）。ＨＢウィルスはヒトポリアルブミンを介してヒト
肝臓内へ侵入し、感染することが考えられる。よってア
ルブミンレセプターに対する抗体はＨＢウィルスの感染
の防御に大きな役割をはたすことが予想できる。そこで
ｐｒｅ　　Ｓ領域を含むＨＢｓＡｇは含まないＨＢｓＡ
ｇよりＨＢワクチンとしてより有用性の高いワクチンと
なりうろことが期待できＰｒｅ　　Ｓ全領域とＳ抗原か
らなるＰｄ２とＰｒｅｓｊＪ域の５５アミノ酸を含むＳ
抗原からなるＰ３１のタンパク（以降３ｒｄＰｒｅＳ−
ＨＢｓＡｇと略称）は遺伝子工学の手法を用いることに
よって酵母を宿主として（Ｐ、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　
ｅｔ　ａｌ、、ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、　３．
３１７．１９８５）、あるいは動物細胞を宿主として（
Ｍル、Ｍｉｃｈｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、、　８１，７７０８．１９８４）大
量に発現することが可能となった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

Ｐ４１のタンパク（以後１ｓｔＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇと
略称：完全長ＰｒｅＳｗ４域を含むＨＢｓＡｇ）は酵母
あるいは動物細胞を用いても大量に発現することができ
なかった。

〔問題点を解決するための手段〕

遺伝子工学を用いてＨＢｓＡｇを発現させた場合、ＨＢ
ｓＡｇ、３ｒｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢ５Ａｇ、３ｒｄ
　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇのＮ末端側に３５アミノ
酸残基の付加した２ｎｄ　　ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇはそ
れぞれ単独で粒子を形成し大量に発現できるが１ｓｔ　
　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇは単独で大量に発現できな
い。そこでＨＢｓＡｇあるいは３ｒｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ
−ＨＢｓＡｇあるいは２ｎｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓ
Ａｇと１ｓｔＰｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇとを１つの細胞
内で同時に発現することによってｌｓｔＰｒｅｓ−ＨＢ
ｓＡｇを発現しようと試みた。その結果１ｓｔＰｒｅ　
　Ｓ−ＨＢｓＡｇを他のＨ８表面抗原タンパクと同時に
発現することに成功した。その方法は次の通りである。

１（ＢｓＡｇ遺伝子あるいは３ｒｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−
ＨＢｓＡｇ遺伝子あるいは２ｎｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−Ｈ
ＢｓＡｇ遺伝子に適当な酵母プロモーター及び適当な酵
母ターミネータ−を機能するように接続し、このＤＮＡ
配列を酵母・大腸菌シャトルベクターにつないだプラス
ミドを作成した。又、１ｓｔ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓ
Ａｇ遺伝子に適当な酵母プロモーター及び適当な酵母タ
ーミネータ−を機能するように接続し、このＤＮＡ配列
を前者とは異なる酵母マーカー遺伝子を有する酵母・大
腸菌シャトルベクターにつないだプラスミドを作成した
。この両方のプラスミドを用いて酵母を形質転換した。

両方のプラスミドにある酵母マーカーを目安として、両
方のプラスミドを有する酵母を選抜した。

又、あるいは適当な酵母プロモーター及び適当な酵母タ
ーミネータ−を機能するように接続したＨＢｓＡｇ遺伝
子あるいは３ｒｄＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子あるいは
２ｎｄＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子を含むＤＮＡ配列と
適当な酵母プロモーター及び適当な酵母ターミネータ−
を機能するように接続した１ｓｔ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−Ｈ
ＢｓＡｇ遺伝子を含むＤＮＡ配列とを１つの酵母・大腸
菌シャトルベクターに同時に接続したプラスミドを作成
した。このプラスミドを用いて酵母を形質転換し、この
プラスミドを有する酵母を選抜した。　これらの酵母を
培養後、菌体を集め、適当な方法（望ましくはダイノミ
ル、フレンチプレッシャーセル、ソニケーター等）で菌
体を破壊し上清を得た。この上清にはＥＩＡ法を用いて
ＨＢｓＡｇ活性及びポリアルブミンレセプター活性が、
あることを確認した。又、ＲＰＨＡ法を用いてもＨＢｓ
Ａｇ活性及びポリアルブミンレセプター活性を確認した
。そこでこの上清をヒトポリアルブミンをゲルにコーテ
ィングしたアフィニティーカラムに吸着後、吸着画分を
回収した。このアフィニティーカラムにはアルブミンレ
セプターを有するタンパク分子が吸着される。回収した
タンパクを５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動）にかけたところ分子量４万１千（Ｐｄ２）
と分子ｔ２万４千（Ｐ２４）　　（ＨＢｓＡｇ遺伝子を
同時に発現した場合）あるいは３万１千（Ｐ３１）　　
（３ｒｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇ遺伝子の場合）
あるいは３万４千（Ｐ３４）（２ｎｄ　　ＰｒｅＳ−Ｈ
ＢｓＡｇの場合）にバンドが確認された。またこのゲル
をウェスタンブロッティング（標識ポリアルブミンある
いは標識抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いること）によりＰｄ２
、Ｐ３１、Ｐ３４にはポリアルブミンレセプターが、Ｐ
ｄ２．Ｐ゛　　２４、Ｐ３１、Ｐ３４には、ＨＢｓＡｇ
活性が存在することを確認した。

以上　ＥＩＡ、ＲＰＨＡ、５ＤＳ−ＰＡＧＥ。

ウェスタンブロッティングの結果より、１ｓｔＰｒｅ　
　Ｓ−ＨＢｓＡｇが大量に発現できたことを確認した。

又、このｌｓｔ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇがＨＢｓ
Ａｇあるいは３ｒｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇある
いは２ｎｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇと共に粒子を
形成していることが予測される。

Ｐｒｅ　　ＳのＤＮＡ配列は、公知でこれを担持するプ
ラスミドも公知〔「モレキュラークローニング」コール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−（ｒＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））　）
である。例えば、ＰｒｅＳの完全長ＤＮＡ配列としては
、第１表のものが知られている。

本発明者等は、バイオジエンより入手したプラスミドｐ
Ｐｒｅ　　Ｓ（第８図）を用いた。

第１表 Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｓｅｒ　ＡｓｎＡＴＧ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＡＡＴ
　ＣＴＴ　ＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＰｒｏ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇ
ｉｎ　ＬｅｕＣＣＴ　　ＣＴＧ　　ＧＧＡ　　ＴＴＣＴ
ＴＴ　　ＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＧ　　ＴＴＧＡｓｐ　
Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔ
ｈｒ　Ａｓｎ　ＡｓｎＧＡＴ　　ＣＣＡ　　ＧＣＣＴＴ
ＣＡＧＡ　　ＧＣＡ　　ＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＡＴＰｒ
ｏ　　Ａｓｐ　　Ｔｒｐ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ａｓ
ｎ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　ＡｓｐＣＣＡ　
　ＧＡＴ　　ＴＧＧ　　ＧＡＣＴＴＣＡＡＴ　　ＣＣＣ
ＡＡＣＡＡＧ　　ＧＡＣＴｈｒ　　Ｔｒｐ　　Ｐｒｏ　
　Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　
　Ｇｌｙ　　Ａｌａ八Ｃへ　　ＴＧＧ　　ＣＣＡ　　Ｇ
ＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＧ　　ＧＴＡ　　ＧＧＡ　　ＡＣ
ＴＧｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　
Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

ＧＧＡ　　ＧＣＡ　　ＴＴＣＧＧＧ　　ＣＴＡ　　ＧＧ
Ｇ　　ＴＴＣＡＣＣＣＣＡ　　ＣＣＧＨｉｓ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐ
ｒｏ　ＧｉｎＣＡＣＧＧＡ　　ＧＧＣＣＴＴ　　ＴＴＧ
　　ＧＧＧ　　ＴＧＧ　　ＡＧＣＣＣＴ　　ＣＡＧＡｌ
ａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ
　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＡｌａＧＣＴ　ＣＡＧ　ＧＧＣＡＴ
Ａ　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＡＣＣＴＴＧ　ＣＣＡ　ＧＣＡ８
〇 八ｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　
Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　ＧｌｎＡＡ
Ｔ　　ＣＣＧ　　ＣＣＴ　　ＣＣＴ　　ＧＣＣＴＣＴ　
　ＡＣＣＡＡＴ　　ＣＧＣＣＡＧＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒ
ｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ
　Ｐｒ。

ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＡＣＣＣＣ
Ｇ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＣＡＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　
Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＡｌａＣＣ
Ｔ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＡＣＣＡＣＴ　ＣＡＴ　ＣＣＴ　
ＣＡＧ　ＧＣＣＭｅｔ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅ
ｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ＾ＴＧ　
ＣＡＣＴＧＧ　ＡＡＣＴＣＣＡＣＡ　ＡＣＣＴＴＣＣＡ
ＣＣＡＡＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａ
ｒｇ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ＾ＣＴ　ＣＴＧ
　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＣＣＣＡＧＡ　ＧＴＡ　ＡＧＡ　Ｇ
ＧＣＣＴＧＴｙｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＴＡＴ　ＴＣ
ＣＣＣＴ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＴＣＣＡＧＴ　ＴＣ
Ａ　ＧＧＧＴｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　
Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　５ｅｒＡＣＡ　ＧＴ
Ａ　ＡＡＣＣＣＴ　ＧＴＴ　ＣＣＧ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　
ＡＣＣＴＣＴＰｒｏ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ
　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　ＧｌｙＣＣＣＡＴ
Ａ　ＴＣＧ　ＴＣＡ　ＡＴＣＴＴＣＴＣＧ　ＡＧＧ　Ａ
ＴＴ　ＧＧＧＡｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ａｒａ　　Ｌｅｕ　
　ＡｓｎＧＡＣＣＣＴ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣＨＢｓ
ＡｇのＤＮＡ配列も、公知であり、これを担持するプラ
スミドも公知である。

ＨＢｓＡｇの型は、ａｄｗ型（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　
ｅｔａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ、　２８０．８１５〜８
１９，１９８７）、ａ　ＶＷ型（Ｃｈａｒｎａｙ　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ、＋Ｕ、Ｓ、Ａ　、、　　７６、２２２２−２２２
６．１９７９）、ａ　ｄ　／　ｙ　ｗ型（Ｐａｓｅｋ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８２．５７５〜５
７９．１９７９）等が知られているが、本発明ではａ　
ｄ　／　ｙ　ｗ型のＨＢｓＡｇを用いた。

本発明で用いられるベクターは、酵母の遺伝子と大腸菌
の遺伝子とを含みかつ酵母の小型化ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子
を担持したベクターである。ベクターは、形質転換大腸
菌及び形質転換酵母のマーカーとなる遺伝子を担持して
おり、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、２−イソプロ
ピルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝子、アミノグリコシ
ド３′−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子等を好適に担
持する。

形質転換される酵母としては、挿入されるプラスミドが
担持する選択マーカー遺伝子によって相補される変異を
もった変異株、例えばロイシン要求性変異株であるサツ
カロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　ＡＨ２２（ａｌ　ｈｉｓ
　４＋１１ｅｕ　２＋　ｃａｎ　１）等が好適に用いら
れる。得られた形質転換株は、宿主に適した公知の培地
で培養する。培地としては、たとえば、ＹＮＢ液体培地
〔０，７％Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ　
　（Ｄｉｆｃｏ社）、２％グルコース〕、およびＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社
）、２％ポリペプトン（大五東養社）２％グルコース〕
が好適に用いられる。培養は、１５〜３２℃で、２０〜
５０時間行い、必要により通気や攪拌を行うこともでき
る。培養後、公知の方法、例えば、遠心分離性によって
菌体を集め、例えば、適当な緩衝液に懸濁させた後、例
えば超音波処理後、遠心分離によって上澄みを回収する
。この上澄み中に目的とするＰｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇ
が産生されており、例えば、モノクローナル抗体やポリ
アルブミンを用いた固定化カラムや疎水性基によるアフ
ィニティクロマトによって目的物質の精製が行われ得る
。

なお本発明において多くの技法、反応及び分析方法は当
業界においてよく知られている。特にことわらない限り
、全ての酵素は商業的供給源、例えば宝酒造；ニューイ
ングランド　バイオラプス（ＮＥＢ）　　（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））　、マサチ
ューセック。米国；アマージャム（Ａｍｅｒｓｃｈａｍ
）、英国及びベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｌａｔｏ
ｒｉｅｓ（ＢＲＬ））　、メリーランド、米国から入手
することができる。

酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特に断わらない
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。

ファージを用いた大腸菌の形質転換法、プラスミドを用
いた大腸菌の形質転換法、プラークハイブリダイゼーシ
ョン法、電気泳動法及びＤＮＡのゲルからの回収法は、
「モレキュラークローニング」コールドスプリングハー
バ−ラボラトリ−（ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））に記載されている方法
により行った。酵母の形質転換法は、「メソッド・イン
・イースト・ジェネティクス」コールドスプリングハー
バ−ラボラトリ−（ｒ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｙｅａｓ
ｔＧｅｎｅｔｉｃｓＪ　）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８１）
に記載されている方法で行った。

〔効果〕

かくして得られた１ｓｔ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇ
はワクチンとして用いた場合、抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生
を促す他、抗アルブミンレセプター抗体の産生を促す能
力を有する。

又、Ｂ型肝炎羅患者やブラスマＨＢワクチン経験者の血
中には、１ｓｔ　　Ｐｒｅ　　ＳｉＩ域のＮ末側のペプ
チドに対する抗体が存在し、この抗体はＢ型肝炎の各ウ
ィルスマーカーの推移とよく一致している（Ｎｅｕｒａ
ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、＋　　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　８６＋　
　３７１−３７５、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。

この抗体はＨＢウィルスの感染の防御に何らかの役割を
はたしていると考えられ、今回産生に成功した１ｓｔ　
　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇはこの抗体の産生を促すこ
とが期待される。

〔参考例　実施例〕

以下に本発明の詳細な説明するために参考例・実施例を
記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

参考例１　酵母ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のクローニング 酵母染色体ＤＮＡより酵母ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子配列を有
するＤＮＡを次のようにして調製した。

酵母サツカロミセス・セレビシェ７ ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）　ＧＲＦ　１８　（α
、Ｊｅｕ、ｔｒ　　。

ｈｉｓ、ｍｅｔ）よりシー・アール・クライヤー（Ｃ，
Ｒ，Ｃｒｙｅｒ）ら「メソド・イン・セル・バイオロジ
ーＪ　　（ｒＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙＪ　）第１８巻。

第３節、３９頁、アカデミックスプレス、ニューヨーク
（１９７５）の方法に従って染色体ＤＮＡを調製した。

この染色体ＤＮＡ　　２０μｇを制限酵素Ｈｉｎｄｌ［
［（宝酒造社製、以下同じ）２０単位（Ｕ）を用いて完
全消化し、同じ＜　Ｈｉ、ｎ　ｄ　ｍ　Ｉ　Ｕを用いて
完全消化したラムダファージｃｈａｒｏｎ２８（ｂ１０
０７．ＫＨ５４，ＮｌＮ５）ＤＮＡ　　１μｇと連結し
た。連結にはＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、以下同
じ）を用い、推奨されている方法に従って１６℃で１晩
反応させることによって連結を行った。以下に述べるＤ
ＮＡの連結にも同じ方法を用いた。この連結したＤＮＡ
をインビトロパフケージングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ
社製）を用いてパッケージング後、大腸菌ＬＥ３９２株
（旦二、ｈｓｄＲ５１４（ｒｋ−、ｍ、−）、ｓ且ｚＥ
４４、土且且Ｆ５８、士土且Ｙ１．．ｌｌ工に２、Ｊｄ
土Ｔ２２、工！１Ｂｌ、土工［Ｒ５５、スー）に感染さ
せ４０．０００個のプラークを得た。パッケージング方
法は、Ａｍｅｒｓｈａｍ社の推奨する方法に従って行い
、大腸菌への感染は「モレキュラー　クローニング」　
（前述）に従って行った。

この４０，０００個のプラークをニトロセルロースフィ
ルターに固定後３２ｐを用いてラベルした合成りＮＡと
ハイブリダイズさせることによりスクリーニングを行っ
た（プラークハイブリダイゼーション法）。プラークハ
イブリダイゼーション法は「モレキュラー　クローニン
グ」　（前述）に従って行った。その結果強くハイブリ
ダイズし、しかも制限酵素マツピングも一致する２つの
ファージを得た。

このファージＤＮＡ　　１０ｐｇをＨｉｎｄｌｎｌＯＵ
で完全消化することにより、２．ｌｋｂの酵母染色体由
来のＤＮＡ断片を調製した。２．１ｋｂＤＮＡ断片は）
（ｉｎｄＩＩ［完全消化後のＤＮＡを低融点アガロース
（Ｂ　ＲＬ社製）で電気泳動後２゜１ｋｂＤＮＡ断片を
切り出し、ＢＲＬ社製の推奨する方法に従って６５℃１
０分間の熱処理後フェノール抽出し水層をエタノール沈
澱することによって得た。以下ＤＮＡ断片の回収にはこ
の方法を用いた。

この２．１ｋｂＨｉｎｄｌＩ［ＤＮＡ断片１μｇを大腸
菌の代表的なプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ１μｇを）
（ｉｎｄｌＩＩＩＵを用いて完全消化したものとＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ５Ｕを用いて連結し、大１１Ｍ菌ＨＢ１０
１株（−肛一、ｈｓｄｓ２０　（ｒ＊−。

ｍ１ｌ−）、ｒｅｃＡ１３、ａｒａ−１４，１工文Ａ２
、±１且Ｙ１、工立±に２、工且土Ｌ２０（Ｓｍ’　）
　、五り土−５、エエ土−１、土且且Ｅ４４、スー）を
形質転換し、リクローニングを行った。大腸菌のプラス
ミドによる形質転換法は「モレキュラー　クローニング
」　（前述）に従って行った。リクローニングによって
得たプラスミドをｐＧＡＰ３０１と命名した。

参考例２　　ＨＢｓＡｇ発現用ベクターの作成酵母中で
ＨＢｓＡｇ　（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原）を発現する
ためのＧＡＰ−ＤＨプロモーターを用いるプラスミドベ
クターｐＧＧ５を第５〜６図に示すようにして構築した
。以下、図に従って説明する。

ｐＧＡＰ　　３０１ＤＮＡ４μｇをＴａｑｌ（ＮＥＢ社
製）４Ｕを用いて完全消化し電気泳動によって分離する
ことによりＧＡＰ−ＤＨｉｌｉ伝子１の鉗子１始点の塩
基を＋１としたところの−６７６から−２５までの６５
２ｂｐのＧＡＰ−ＤＨプロモーター２の領域からＤＮＡ
断片３調製した。

このＤＮＡ断片３をＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｐｏｉ
ｌ）（宝酒造社製）ＩＵと０．１．ｃｒｇｄＮＴＰ（デ
オキシＮＴＰ）を用いて処理し、接着末端を平滑末端と
した。このＤＮＡ断片をｐＵＣ９１μｇをＳｍａＩ（宝
酒造社製）ＩＵを用いて完全消化したものに図に示す方
向でＴ４ＤＮＡリガーゼ５Ｕを用いて連結した。このＤ
ＮＡを大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転換した結果得られたプ
ラスミドをｐＧＧ２と命名した。

次にｐＧＡＰ３０１　１０８ｇを５ａｌＩ（宝酒造社製
）１０Ｕ、及びＨｉｎｄＩｎ　（宝酒造社製）ＩＯＵを
用いて完全消化し、電気泳動で分離することによりＧＡ
Ｐ−ＤＨ遺伝子のターミネータ配列４を含む１４０ｂｐ
ＤＮＡ断片５を調製した。又、ｐＧＧ２ＤＮＡ１μｇを
３ａｌｌ（宝酒造社製）ＩＵ及びＨｉｎｄＩ［ＩＩＵを
用いて消化し、電気泳動によって３．４ｋｂｐＤＮＡ断
片を調製シタ。、：の３．４ｋｂｐＤＮＡ断片と１４０
ｂｐＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
５Ｕを用いて連結し、得られたプラスミドをｐＧＧ３と
命名した。

ｐＰｒｅ　　Ｓ（第５図（Ａ））４μｇをＸｈ。

Ｉ　（宝酒造社製）ＩＵ、及び５ａｉｌ（宝酒造社製）
ＩＵを用いて完全消化し電気泳動によって１．３ｋｂｐ
ＤＮＡ断片６を調製してくることによってＨＢｓＡｇ遺
伝子７を含むＤＮＡを得た。

ｐＧＧ３ＤＮＡ１μｇを５ａｌｌ（宝酒造社製）で完全
消化したＤＮＡ断片とＨＢｓＡｇを含む１゜３ｋｂｐ断
片とを７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）５Ｕを用いて
連結し得られたプラスミドをｐＧＧ４　（第５図（Ｂ）
）と命名した。

ＨＢｓＡｇ遺伝子を酵母内で発現させるためには、酵母
内で自己増殖するＤＮＡ上にＨＢ　ｓ　Ａｇが存在する
ことが望ましいが、ｐＧＧ４は酵母内で自己複製できな
い。そこで大腸菌・酵母シャトルベクターｐＪＤＢ２１
９　　（ディー・ディー・ペックス、ネイチャー　（Ｊ
、Ｄ、Ｂｅｇｇｓ　−、Ｎａｔｕｒｅ）　、２７５．１
０４．１９７８）ＤＮＡ５μｇをＨ４ｎｄｎｌ完全消化
し、３．２ｋｂｐＤＮＡ断片を調製した。大腸菌のプラ
スミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ１μｇを１（ｉｎｄＩ［［を
用いて完全消化し、３．２ｋｂｐＤＮＡ断片とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ５Ｕを用いて連結した。このようにして）（
ｉｎｄｎＩ部位２カ所を持つシャトルベクターｐＧＬ５
を作成した。

ｐＧＬ５の２カ所のＨｉｎｄＩＩＩ部位のうちの一方を
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて平滑末端に
することにより１カ所のＨｉｎｄＩ［［部位を持つプラ
スミドをｐＧＬ６　（第６図）を作成した。

ｐＧＬ５は、酵母２μｇＤＮＡ由来の複製開始点と酵母
のマーカー遺伝子であるＬＥＵ２遺伝子を３．２ｋｂｐ
ＨｉｎｄＩ［［ＤＮＡ断片上に持ち、もう一方のＤＮＡ
断片上に大腸菌の複製開始点と大腸菌のマーカー遺伝子
であるアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｃ）をもつ。酵母
複製開始点とＬＥＵ２遺伝子とを得るためにｐＧＬ５Ｄ
ＮＡ２μｇをＨｉｎｄＩＩｒｌＵを用いて完全消化後、
電気泳動によって３．２ｋｂｐ断片を調製した。ｐＧＧ
４ＤＮＡ１　μｇをＨｉｎｄＩ［［ＩＵを用いて完全消
化後、３．２ｋｂｐＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼ５
Ｕを用いて連結しプラスミドｐＧＧ５を作成した（第５
図（Ｂ））。これによってＧＡＰ−ＤＨプロモーターと
して充分な長さく６５２ｂｐ）プロモーター領域とＨＢ
ｓＡｇ遺伝子とＧＡＰ−ＤＨターミネータ−を含む酵母
内ＨＢｓＡｇ産生ベクターｐＧＧ５　（第５図（Ｂ））
が作成できた。

参考例３　　ＧＡＰ−ＤＨプロモーター領域の限定 Ｇ　Ａ　Ｐ　−’Ｄ　Ｈ遺伝子のプロモーター領域がど
こにあるか不明であるため、各種制限酵素を用いてプロ
モーター領域を限定していった。ｐＧ０４２μｇを制限
酵素Ｘｍｎ　　Ｉ　　（ＮＥＢ社製）２ＵとＨｔｎｄＩ
Ｉ［（宝酒造社製）２Ｕで完全消化し電気泳動でｌ、３
ｋｂｐのＤＮＡ断片（小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーター
（−１６５ｂｐ〜−２５）、ＨＢｓＡｇ遺伝子、ＧＡＰ
ターミネータ−を含む）を調製した。ｐｃＬ６　１．Ｉ
ＪｇをｐｖｕＩＩ　（宝酒造社製）ＩＵとＨｉｎｄＩ［
［（宝酒造社製）ＩＵで完全消化し電気泳動で５．５ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。ｌ、３ｋｂｐのＤＮＡ断
片と５．６ｋｂｐのＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を用いて連結し第４図に示したＧＡＰ−
ＤＨプロモーターを有するプラスミドを作成しｐＧＧ６
と命名した（第７図）。

次にｐＣＧ６及びｐＧＧ５を用いて酵母サツカロマイセ
ス０セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉ−ｓｉａｅ）　ＧＲＦ　１８　（前述）を形質転
換した。得られた形質転換体をロイシンを含まない最小
培地平板（０，７％イーストナイト口ジエンベース（Ｙ
ｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ）（Ｄ　ｔ　ｆ
　ｃ　ｏ）　、２％デキストロース、１．５％寒天）で
純化した。純化したｐＧＧ６／サツカロマイセス・セレ
ビシェＧＲＦ１８を上記最小培地（寒天は除く）で３０
°Ｃで２日間振盪培養したものを前培養として同最小培
地３ＱｍＡに１％植菌し３０℃で２日間培養した。遠心
により集菌し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ　−Ｈ（１！ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）
に懸濁した。この緩衝液をトミー精工社製超音波発生装
置ＵＲ−２００Ｔ）を用いて氷冷下、レベル１０にて９
分間処理した後０℃、１３，０００ＸｇｌＯ分間遠心し
得られた上清のＨＢｓＡｇ活性をアンチヘブセルの　（
ミドリ十字社製）によるＲＰＨＡにて測定した（表２）
。

表２ ＧＧ５ ｐＧＧ６　　　　　　１２ ＊：ｎは希釈数を表わす。

参考例４　　ｐＧＧ５３の作成 ｐＧＧ５１＃ｇをＢａｍＨＩ（宝酒造社製）２Ｕを用い
て完全消化し、電気泳動によって、７ｋｂｐＤＮＡ断片
を調製してくることによってベクターを得た。

ｐＰｒｅ　　Ｓ２＃ｇ　（第８図）をＭｓｔＩ［（ＮＥ
Ｂ社製）２ＵとＢａｎ　　Ｉｔ（ＮＥＢ社製）２Ｕを用
いて完全消化し、電気泳動によって、１゜４　ｋ　ｂ　
ｐ　ＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片はポリアル
ブミンレセプターを含む５５アミノ酸をＨＢｓＡｇのＮ
末側にもつＰｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇをコードしている
。これらの２つのＤＮＡ断片をそれぞれＤＮＡポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）２Ｕ（！：ｄＮＴＰ　（デオキシＮ
ＴＰ）を用いて処理し、接着末端を平滑末端とした。こ
れらのＤＮＡ断片を７４ＤＮＡＩＪガーゼ（宝酒造社製
）５Ｕを用いて連結した。このＤＮＡを大腸菌ＨＢＩＯ
Ｉに形質転換した結果得られたプラスミドをｐＧＧ５３
と命名した。　（第８図）。

参考例５　　ｐＧＧ６３の作成 小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーターとＨＢｓＡｇ遺伝子を
担持するｐＧＧ６．１μｇをＢａｍＨＩ（宝酒造社製）
２Ｕを用いて完全消化し、電気泳動によって、６　ｋ　
ｂ　ｐ　ＤＮＡ断片を調製してくることによってベクタ
ーを得た。

Ｐｒｅ　　Ｓ遺伝子８とＨＢｓＡｇ遺伝子を担持するｐ
Ｐｒｅ　　Ｓ２．ｌｊｇをＭｓｔ　　ＩＩ（ＮＥＢ社製
）２ＵとＢａｎ　　ＩＦＣＮＥＢ社製）２Ｕを用いて完
全消化し、電気泳動によって、１．４ｋｂｐＤＮＡ断片
を調製した。このＤＮＡ断片はｐｒｅＳ−ＨＢＳＡｇを
コードしている。

これら２つのＤＮＡ断片をそれぞれＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）２ＵとｄＮＴＰ　（デオキシＮＴＰ）を
用いて処理し、接着末端を平滑末端とした。これらのＤ
ＮＡ断片を７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）５Ｕを用
いて連結した。このＤＮＡを大腸菌ＨＢＩＯＩに形質転
換した結果得られたプラスミドをｐＧＧ６３と命名した
。　（第９図）。

次にｐＧＧ６３及びｐＧＧ５３を用いて酵母サツカロマ
イセス◆セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＡＨ２２（前述）を形質転換した
。

得られた形質転換体をロイシンを含まないＹＮＢ寒天平
板（０，７％イースト・ナイトロジエン・ベース（Ｄｉ
ｆｃｏ）、２％デキストロース、１゜５％寒天）で純化
した。純化したｐＧＧ６３／サツカロマイセス・セレビ
シェＡＨ２２及びｐＧＧ５３／サツカロマイセス・セレ
ビシェＡＨ２２を上記最小培地（寒天は除く）で３０℃
で２日間振盪培養したものを前培養として同最小培地８
０ｍ１に１％植菌し３０℃で２日間培養した。遠心によ
り集菌し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐ　Ｈ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１
ｍＭ　　ＰＭＳＦ）に懸濁した。この緩衝液をトミー精
工社製超音波発生装置ＵＲ−２００ｐを用いて氷冷下、
レベル１０にて９分間処理した後０℃、１３、ＯＯＯＸ
ｇ　　１０分間遠心し得られた上清のＨＢｓＡｇ活性を
アンチヘブセル■　（ミドリ十字社製）を用いて測定し
た。又、ポリアルブミンレセプター活性をポリアルブミ
ンを羊赤血球に感作した血球凝集反応試薬を用いて測定
した（表３）。

ポリアルブミン感作赤血球は、次のようにして作成した
。

ヒト血清アルブミン（マイルス・サイエンティフィク社
）１００ｍｇを９ｍＡの０．１ｍｏｌ＋Ｊン酸緩衝液ｐ
Ｈ６，８に溶解し、次いで１ｍＭの２．５％ゲルタール
アルデヒド水を加えて混合液を作成した。

試験管に入れ、傾斜回転器（第１ラジオアイソトープ社
）を用いて５Ｑｒｐｍ、２０℃、３時間のゆるやかな回
転で攪拌した。

透析チューブにうつし、０．０１ｍｏｉｌＪ７酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７，２を頻回にかえながら３時
間透析し、余分のゲルタールアルデヒドを排除した。

チューブの中のゲルタールアルデヒド処理ｐＨ３Ａを０
．２ｍｏｌトリスー塩酸緩衝液０．２ｍｏ１１食塩水ｐ
Ｈ８，０（ＴＢＳ）にひたした５ｅｐｈａ−ｄｅｘＧ−
２００の８５Ｘ１．５ｃｍのカラムにかけ、ＴＢＳで５
ｍｌずつの分画を行った。

各分画について２８０ｎｍの吸光度を測定して、第１ピ
ークの分画をとり、透析チューブに入れて、ＰＢＳで十
分透析し、ポリアルブミンを作成した。

１０％に懸濁した羊赤血球４ｍｌと等量のポリアルフ゛
ミン（３０ｍｇ／ｍＪ）をン昆ぜ２ｍｌの２゜５％グル
グルアルデヒドを滴下、ゆるやかにかくはんしながら室
温で２時間おく。ＰＢＳで３回洗滞後１％うさぎ血清と
１％ショ糖（牛丼化学社製）の入ったＰＢＳに懸濁した
ものをポリアルブミン感作血球として使用した。

表３ ＨＢｓＡｇ　　　　ポリアルブミン プラスミド　　活性（２”）　　　レセプター活性（２
”）ＧＧ６３ ｐＧＧ５３　　　　　１１　　　　　　１０この上清を
塩化セシウム密度勾配遠心分離法を用いて精製した。こ
の精製サンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量をも
とめたところ約３０゜ＯＯＯ±２，０００であった。こ
のことによりＰｒｅｓ−ＨＢｓＡｇをｐＧＧ６３を形質
導入した酵母が産生していることを確認した。又得られ
たＨＢｓＡｇの粒子は、電子顕微的観察によって、約２
２ｎｍの粒径を有することを確認した。

実施例１　１ｓｔ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇ産生用
ベクターの作成 ｐＰｒｅ　　Ｓ　　ＤＮＡ４μｇをＥｃｏＲＩ　（宝酒
造社製）４Ｕ及びＥｃｏＲＶ　（宝酒造社製）４Ｕを用
いて完全消化し電気泳動によって１．５ｋｂＤＮＡ断片
を調製してくることによって１ｓｔＰｒｅ　　Ｓ−ＨＢ
５Ａｇ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。

ｐＧＧ６ＤＮＡ２＃ｇをＢａｍＨＩ（宝酒造社製）２Ｕ
を用いて完全消化し電気泳動によって６ｋｂＤＮＡ断片
を調製した。

これらのＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製
）を用いて平滑末端にした後Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社製）を用いて連結し得られたプラスミドをｐＧＧ６
１と命名した（第１図）。

ｐＧＧ６１ＤＮＡ５μｇをＨｉｎｄＩ［ＩＯ，ＩＵを用
いて部分消化し、ＨｉｎｄＩ［Ｉで１ケ所のみ切断され
た８、０ｋｂＤＮＡ断片を調製した。

ファルマシア社より商業的に入手したクローニングベク
ターｐＵＣ−４ｋＤＮＡ５μｇを５ａｊ２Ｉ　（宝酒造
社製）で完全消化し０４１８耐性遺伝子を含む１．７ｋ
ｂＤＮＡ断片を調製した。

これらのＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製
）を用いて平滑末端にした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結し、得られたプラスミドをｐＧＧ６１／Ｔｎと
命名した（第２図）。

ｐＧＧ６１／ＴｎＤＮＡ５＃ｇをＥｃｏＲＩ（宝酒造社
製）０．ＩＵを用いて部分消化し、３ケ所のＥｃｏＲ１
部位のうち２ケ所で切断された８、７ｋｂＤＮＡ断片を
調製した。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ（前出
）を用いて連結し得られたプラスミドをｐＧＧ６１／Ｔ
ｎ−１と命名した（第３図）。

実施例２　酵母を用いたｌｓｔｐｒｅＳ−ＨＢｓＡｇの
産生 ｐｃｃ６及びｐＧＧ６１／Ｔｎ−（ｌを用いて酵母サツ
カロマイセス・セレビシェＡ　Ｈ２２（Ｓａｃ−ｃｈａ
ｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換し
ｐＧＧ６及びｐＧＧ６１／Ｔｎ−１を１つの細胞内に２
個のプラスミドを有する酵母を得た。

プロトプラスト化した酵母にｐＧＧ６及びｐｃＧ６１／
Ｔｎ−ｆＤＮＡを加え、プロトプラスト再生用ＹＮＢ寒
天培地（０，７％イーストナイト口ジェンベース（１）
ｉｆｃｏ社製）、２％グルコース（牛丼化学社製）、３
％寒天（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．２Ｍ　　ソルビトール
（牛丼化学社製））にて混釈し３０°Ｃ１夜培養後、４
０Ｍｇ／ｍβになるようにＧ４１８（Ｄｉｆｃｏ社製）
を添加し３０℃で２日間培養し形質転換体を得た。

出現したコロニーをＹＮＢ培地（前出）４ｍｌに移植し
２日間培養後４０１１ｇ１ｍｌ　　Ｇ４１８（前出）を
含んだＹＰＤ培地（前出）で１日間培養した。

遠心により集菌し生理食塩水で１回洗浄後緩衝液（５０
ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣｌｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、
１ｍＭ　　ＰＭＳＦ）に懸濁した。この緩衝液をトミー
精工社製超音波発生装置ＵＲ−２００ｐを用いて氷冷下
、レベル１０にて９分間処理した後Ｏ℃、１３．ＯＯＯ
Ｘｇ　　１０分間遠心し得られた上清のＨＢＳＡｇ活性
をアンチヘブセル■（ミドリ十字社製）を用いて測定し
た。又、ポリアルブミンレセプター活性をポリアルブミ
ンを羊赤血球に感作した血球凝集反応試薬を用いて測定
したく表４）。

表４ ＧＧ６ ＋　　　　　　１１　　　６ ｐＧＧ６３　　　　１２　　　１２ 又、ＥＩＡ法を用いてもＨＢｓＡｇ活性及びポリアルブ
ミンレセプター活性を測定した。ＨＢｓＡｇ活性はオー
スザイム（アボット社）、ポリアルブミン活性はＥＩＡ
　　ＨＢＡＲテスト（医学生物学研究所）を用いて測定
した。測定方法は製造業者の推奨する方法に従って行っ
た。

その測定結果を表５に示す。

表５ ＧＧ６ ＋　　　　　　０．３６ｍｇ／ｊ？　　　ｌｌ０Ｕ／ｌ
グルタルアルデヒド（牛丼化学社製）を用いてヒトアル
ブミン（マイルス　サイエンティフック社製）をポリマ
ー化し、ヒトポリアルブミンを作成した。このヒトポリ
アルブミンをＣＮＢｒアクチベイテソドセファロース４
Ｂ（ファルマシア社製）に吸着させ、ポリアルブミンア
フィニティーカラムを作成した。

このカラムに上清をアプライしゲルの２０（＠量の洗浄
用バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（牛丼化学社製）
　、５ｍＭ　　ＰＭＳＦ（シグマ社製）、１０ｍＭＥＤ
ＴＡ（牛丼化学社製）、０．１％アジ化ナトリウム（牛
丼化学社製）、０．１５Ｍ　　ＮａＣｊ２（牛丼化学社
製）で十分に洗浄後、ゲルの２倍量の５Ｍ塩酸グアニジ
ン（牛丼化学社製）を含む洗浄用バッファーで抽出した
。

抽出液で透析後遠心し上清をセントリコン１０（アミコ
ン社製）を用いて濃縮した。

濃縮液を１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、分子量４万
１千と２万４千のところにバンドを検出した。又、この
ゲルを＋０１標識抗ＨＢｓＡｇ抗体を用いてウェスタン
ブロッティングしたところ分子量４万１千と２万４千の
ところにバンドを検出した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーターを担持する
１ｓｔ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇ産生用プラスミド
ｐＧＧ６１の作成を説明する図。第２図は、Ｇ４１８耐
性とロイシンマーカー遺伝子をもつｐＧＧ６１／Ｔｎの
作成を説明する図。第３図は、Ｇ４１８耐性をもちロイ
シンマーカーをもたないｐＧＧ６１／Ｔｎ−βの作成を
説明する図である。第４図は、ＧＡＰ−ＤＨ小型化プロ
モーターの塩基配列（−２５から一１６４ｂｐ）を示し
、第５図（Ａ）および第５図（Ｂ）はＧＡＰ−ＤＨプロ
モーターを担持するＨＢｓＡｇ産生用プラスミドｐＧＧ
５の調製を説明する図であり、第６図はｐＧＬ５及びｐ
ＧＬ６の調製を説明する図、第７図はＧＡＰ−ＤＨ小型
化プロモーターを担持するＨＢｓＡｇ産生用プラスミド
ｐＧＧ６の作成を説明する図である。第８図はＧＡＰ−
ＤＨプロモーターを担持する３ｒｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−
ＨＢｓＡｇ産生用プラスミドｐＧＧ５３の作成を説明す
る図。第９図は小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーターを担持
する３ｒｄ　　Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇ産生用プラス
ミドＰＧＧ６３の作成を説明する図である。 符号の説明 ３　・・・　ＧＡＰ−ＤＨプロモーターのＤＮＡ断片５
　・・・・・・　４を含むＤＮＡ断片ＨｒｎｄＩＬ 身２ ＝１５０ ＴｈＧＧＴＡＧＧＴ八 八ＴＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＴＴＣＴΔＣ
１ｌ　Ｉ　ＩＡＩＡＧＩＴＡＧＴｃＴＴＴｒＴＧＡＴＴ
ＧＴΔＡＴＴＣＴＧＴΔＡＡＴＣＴｒＴＴＴＴＡＧＴＴ
ＴＴＡＡＡＡＣΔＣＣＡＡＧΔＡＣＩ　ＴＡＧＩ　Ｉ　
＋にＧ第　　８　　図 ライク−シーン 第９図 ライケ゛−ジョン 手続補正書 昭和６１年１２月Ｖ日 ３、補正をする者 ７、補正の対象 ■、明細書の発明の詳細な説明の記載を以下の通り補正
する。 １、　明細書第５頁２行目の「Ｐｒｅ　Ｓ全領域とＳ抗
原からなるＰ４１と」の記載を削除する。 λ　同書第９頁１５行目のｒ（１９ｓ２））ｌ）Ｊを「
（１９８２））、ジエー・ディー・ベッグス、ネイチャ
ー（Ｊ−Ｄ、Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ）、　２７５　
、１０４　、１９７８）Ｊと補正する。 ３、同書第９頁末行の「第８図」を「第１図」と補正す
る。 ４、同舎第１３頁下から１０行目の「１９８７Ｊを「ｌ
　９７９Ｊと補正する。 ５、回書第１６頁下から６行目の「酵母の」の後に「プ
ロモーター、例えば」を加入する。 ５；　同店１３頁下から２行目の「遺伝子」の後に「の
プロモーター」を加入する。 ６、同書１４頁１７行目の「太五東養社」を「犬五栄養
化学社」と補正する。 Ｚ　同書２３頁１５〜１６行目の「ペックス」を「ペッ
クス」と補正する。 ８、同書２５頁１３行目の「（」を「〔」と同頁１５５
行目「）」を「〕」と補正する。 ９、　同省２６頁１２行目のｒＲＦ１８Ｊの後に「及び
ｐＧＧ５／サツカロマイセス・セレビシェＧＲＦ１８Ｊ
　　を追加する。 １０、　　同ｆ３１頁６〜７行目のｌ’−ｐＨ８ＡＪを
「ポリアルブミン」と補正する。 １１、　　ＰＪ＠３１頁８行目の「ひたした」を「平衡
化した」と補正する。 １２、同書６１頁９行目の「８５×１．５ｃ！ＩＬ」を
「１．５αグ×８５０」と補正する。 １６、同省６１頁１２行目の「分画」を「画分」と補正
する。 １４、同書３４頁下から２行目の「２個」を「２神類」
と補正する。 １５、同省３５頁８行目の「Ｇｉｆｃｏ」を「Ｇ　ｉ　
ｂ　ｃ　ｏＪと補正する。 １６、同書３５頁１１行目の「４０」を「２５　ＱＪと
補正する。 特許請求の範囲 ＋１１　　ＨＢウィルスのＰｒｅ　Ｓ領域を含むＨＢｓ
Ａｇ（Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇ）の遺伝子組換え技術
を利用した製造方法において、宿主として酵母（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉａｅ）、プロモー
ターとして酵母プロモーターを用い全Ｐｒｅ　　Ｓ領域
を含むＨＢｓＡｇを生産することからなるＰｒｅＳ−Ｈ
ＢｓＡｇの製造方法。 （２）酵母プロモーターがＧＡＰ−ＤＨツロモークー１
ある特許請求の範囲第＋１１項記載の製造方法〇［３）
　　酵母プロモーターがＧＡＰ−ＤＨ蛋白質の開始コド
ンの少なくとも上流−２５ｂりから−１６４ｂｐよりな
る小型化ＧＡＰ−Ｄ）（プロモーターである特許請求の
範囲第＋１１項記載の製造方法。 （４）完全長Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇの発現を、第２
ＡＴＧもしくは第３ＡＴＧ部位〒切断したＰｒｅＳ領域
を含むＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ又はＨＢ　ｓ　Ａ　ｇと同一細
胞系でおこなう特許請求の範囲第（１）項記載の製造方
法。 （５）完全長Ｐｒｅ　　Ｓ−ＨＢｓＡｇの発現を、第２
ＡＴＧもしくは第３ＡＴＧ部位で切断したＰｒｅＳ領域
を含むＨＢｓＡｇ又はＨＢｓＡｇと同一プラスミドを共
用した同一発現系〒おこなう特許請求の範囲第（１１項
記載の製造方法。 （６）　　プロモーターを共用又は共用しない発現系で
おこなう特許請求の範囲第（５）項記載の製造方法。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＢウィルスのＰｒｅＳ領域を含むＨＢｓＡｇ（
   ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ）の遺伝子組換え技術を利用した
   製造方法において、宿主として酵母（￥Ｓａｃｃｈａｒ
   ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）、プロモータ
   ーとして酵母プロモーター、基本ベクターとしてＹＥｐ
   型ベクタ−を用い全ＰｒｅＳ領域（１０８あるいは１１
   ９個のアミノ酸よりなる）を含むＨＢｓＡｇを生産する
   ことからなるＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇの製造方法。
2. （２）酵母プロモーターがＧＡＰ−ＤＨプロモーターで
   ある特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。
3. （３）酵母プロモーターがＧＡＰ−ＤＨ蛋白質の開始コ
   ドンの少なくとも上流−２５ｂｐから−１６４ｂｐより
   なる小型化ＧＡＰ−ＤＨプロモーターである特許請求の
   範囲第（１）項記載の製造方法。
4. （４）完全長ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇの発現を、第２ＡＴ
   Ｇもしくは第３ＡＴＧ部位で切断したＰｒｅＳ領域を含
   むＨＢｓＡｇ又はＨＢｓＡｇと同一細胞系でおこなう特
   許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。
5. （５）完全長ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇの発現を、第２ＡＴ
   Ｇもしくは第３ＡＴＧ部位で切断したＰｒｅＳ領域を含
   むＨＢｓＡｇ又はＨＢｓＡｇと同一プラスミドを共用し
   た同一発現系でおこなう特許請求の範囲第（１）項記載
   の製造方法。
6. （６）プロモーターを共用又は共用しない発現系でおこ
   なう特許請求の範囲第（５）項記載の製造方法。