KR0137256B1

KR0137256B1 - B형간염바이러스adr혈청타잎p24표면항원의발현벡터및그를이용한전기표면항원의제조방법

Info

Publication number: KR0137256B1
Application number: KR1019940021809A
Authority: KR
Inventors: 최근범; 박두홍; 윤영대; 문홍모
Original assignee: 허영섭; 재단법인목암생명공학연구소
Priority date: 1994-08-31
Filing date: 1994-08-31
Publication date: 1998-04-25

Abstract

본 발명은 신규한 B형 간염 바이러스 adr 혈청타잎 p24 표면항원 유전자, 발현벡터 및 그를 이용한 p24 표면항원의 제조 방법을 제공한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 신규한 B형 간염 바이러스 adr 혈청타잎 p24 표면항원의 유전자를 분리하고, 메틸영양 요구성(methylotrophic)의 효모로부터 유래한 FMD(formate dehydrogenase) 프로모터를 갖는 벡터에 서브클로닝하여 제조된 재조합 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리머파(Hansenula polymorpha) 및 그로부터 B형 간염 바이러스 adr 혈청타잎 p24 표면항원을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의해 제조된 HBV adr 혈청타잎 p24 표면항원은 HBV의 처지에 유용한 백신 개발에 이용될 수 있을 것이다.

Description

혐신규한 B형 간염 바이러스 adr 혈청타입 p24 표면항원의 유전자 및 그를 발현시키는 방법

제 1도는 B형 간염 바이러스의 유전자가 클로닝된 pHBV100의 유전자 지도이다.

제 2도는 adr 혈청타잎 p24 유전자를 함유하는 pHBS105의 작제과정을 나타내는 도식이다.

제 3도는 adr 혈청타잎 p24 유전자의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

제 4도는 효모 한세눌라 폴리머파에서 단백질을 발현할 수 있는 벡터 pMH101의 유전자 지도이다.

제 5도는 발현 벡터 pGM834를 작제하는 과정을 나타낸는 도식이다.

제 6도는 발현 벡터 pGM834의 유전자 지도를 나타낸다.

제 7도는 형질전환체들로 부터 표면항원 p24가 발현됨을 방사선 면역측정법으로 확인한 사진이다.

본 발명은 B형 간염 바이러스 adr 혈청타잎 p24 표면항원의 발현벡터 및 그를 이용한 전기 표면항원의 제조방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 신규한 B형 간염 바이러스 adr 혈청타잎 p24 표면항원의 유전자를 분리하고, 메틸영양 요구성(methylotrophic)의 효모로부터 유래한 유도성 FMD(formate dehydrogenase) 프로모터를 갖는 벡터에 서브클로닝하여 제조된 재조합 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리머파(Hansenula polymorpha) 및 그로부터 B형 간염 바이러스 adr 혈청타잎 p24 표면항원을 제조방법에 관한 것이다.

B형 간염은 바이러스에 의한 간질환의 일종으로서 열대 아프리카, 동남아시아 및 극동 아시아에 널리 퍼져있으며, B형 간염환자의 5 내지 10%는 만성보균자이고 이들 중 상당수는 간경변이나 간암으로 발전하게된다. B형 간염 바이러스(B-type hepatitis B virus: 이하, 'HBV'라 한다.)는 데인(Dane) 입자라고 불리우는 42nm 크기의 구형입자로서 일부의 단일나선 부분을 포함하는 이중 나선구조의 DNA 및 내인성 중합효소(endogeneous poly merase), 핵항원(core antigen) 및 외피(envelope)를 형성하는 표면항원으로 구성되어 있다. 이중에서 표면항원은 항원성의 차이에 따라 adr, ayr 및 ayw와 같은 아형으로 분류할 수 있으며, 한국에서는 주로 adr형만이 검출되고 있다.

표면항원은 환자의 혈액내에서 데인입자 외에 22nm 크기의 구형 및 관상형 입자로도 발견되는데, 이들 표면항원은 다른 바이러스의 경우와 마찬가지로 백신으로서의 역할을 할 수 있으나, 인간과 침팬지만이 HBV로 감염될 수 있는 유일한 숙주동물이기 때문에 다른 배양세포를 HBV로 감염시켜 백신을 생산코자한 시도는 모두 실패하였다. 한편, 백신의 원료로 사용하는 표면항원은 지금까지 확인된 226개의 아미노산으로 구성된 주표면항원(S-antigen)의 앞쪽에 108 내지 119개의 아미노산으로 구성된 pre-S1부위 및 55개의 아미노산으로 구성된 pre-S2부위가 부착된 여러 가지 형태가 존재함을 알 수 있다. 즉, pre-S1 및 pre-S2부위가 부착된 39kDa의 P39 표면항원; pre-S2부위만이 부착된 31kDa p31 표면항원; pre-S부위가 부착되지 않은 24kDa의 p24 표면항원; 및, p24 표면항원에 글리코실화(glycosylation)된 형태의 gp42, gp33, gp27 표면항원이 존재한다.

또한, 데인입자의 표면에는 중합된 인혈청 알부민(polymerized humanserum albumin)과 결합할 수 있는 수용체를 갖고 있기 때문에, 알부민과 결합하여 간세포 표면에 부착되어 감염하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근에는 지금까지 백신의 주성분으로 사용되었던 p24표면항원과 더불어, pre-S2부위가 부착된 p31과 p39도 백신으로서의 좋은 효과를 나타낼 수 있다고 보고되었다.

최근 분자 생물학의 발전은 재조합 DNA 기술을 이용하여 특정 유전자를 선별, 증폭하여 유전자의 구조 및 기능을 정확하게 규명하는데 성공하였을 뿐만아니라, 많은 외래성 단백질들을 대장균(E. coli) 및 효모에서 발현시킬 수 있게 되었다. 따라서, 혈장유래 B형 간염백신의 안정성 및 대량생산의 문제점을 해결하기 위해 많은 연구자들은 재조합 DNA 기술을 응용한 B형 간염백신의 생산에 박차를 가하게 되었다.

재조합 단백질의 발현에 가장 통상적으로 사용되는 미생물계는 대장균과 사카로마이세스 세레비지에이나, 사카로마이세스 세레비지에에서 발현된 표면항원을 백신화하였을 때 혈장유래의 표면항원과 마찬가지로 인간에 대한 임상적 시험에서 면역학적으로 유효하므로, HBV의 감염 예방을 위한 백신의 개발에 사카로마이세스 세레비지에에서 발현된 표면항원을 이용하고 있다. 그러나, 사카로마이세스 세레비지에에서 표면항원을 대량생산할 경우, 표면항원의 생산성이 떨어지고 규주내로 형질전환된 외래 유전자의 안정성이 낮기 때문에 발현율을 높일 수 없는 단점이 있었다.

한편, 재조합 DNA 기술을 이용하여 유용한 단백질을 미생물계에서 대량 생산하고자 할 때에는 다음과 같은 몇가지 중요한 문제들을 선결하지 않으며 안되었다 :

첫째, 대량생산을 위해서는 유전자 발현의 양을 조절하는 프로모터 및 정지코돈(terminator)의 올바른 선택이 필요하다. 즉, 사용하고자 하는 숙주 미생물에서 과량생산되고 있는 단백질 유전자의 강력한 프로모터 및 정지코돈를 사용하여야 한다.

둘째, 발현시키고자 단백질의 고유성질을 변형시키지 않고 활성을 갖고있는 형태로 생산할 수 있는 숙주를 선택하여야 한다. 예를 들면, 원하는 단백질이 면역원성이나 생화학적 성질을 갖기 위해서 그리코실화나 인사화(phosphorylation)되어야 한다면, 발현시키고자 하는 숙주에서도 이러한 기능을 수행할 수 있어야만 생산 균주로 사용할 수 있다.

셋째, 단백질을 가능한한 정제하기 용이한 형태로 발현시켜야 한다. 즉, 아무리 많은 양을 발현시킨다하더라도 정제과정이 어렵다면 최종적으로 사용가능한 양을 매우 적어지기 때문이다.

넷째, 형질전환된 미생물이 매우 안정하여야 한다는 것이다. 즉, 항시 일정한 생산성을 나타내어야만 규모확장이나 대량배양의 문제점들을 배재시킬 수 있는 것이다.

이외에도, 일반적으로 여러 가지 재조합 미생물 발현계에서 많은 양의 이종 단백질을 합성하도록 한 경우, 숙주 미생물에 해로운 것으로 알려져 있다. 결과적으로 이러한 이종 단백질의 발현에 대한 선택압(selertion pressure)이 있어 대량배양을 할 경우, 이종 단백질의 발현을 중지하거나 발현을 극소화하여 비경제적인 공급원으로 변형되게 된다. 따라서, 이러한 현상을 극복하는 한가지 방법으로, 평상시에는 발현이 억제되었다가 유도물질(inducer)에 의해 이종 단백질의 합성이 유도가능한 프로모터를 사용할 수 있다. HBV의 표면항원 p24를 발현하기에 유용한 것으로 알려진 사카로마이세스 세레비지에의 경우에도 이용 가능한 여러 종류의 프로모터들이 있으나, 대부분의 경우 많은 양의 표면항원을 안정적으로 발현시키는데는 문제점이 있다고 알려져 있다.

이에, 본 발명의 발명자들은 신규한 HBV adr 혈청타잎 p24 표면항원의 발현벡터 개발을 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 전술한 문제점들을 극복할 수 있는 강력한 유도성 FMD 프로모터하에 adr 형청타잎 p24 표면항원의 발현이 조절되는 발현벡터를 개발하고, 이것을 한세눌라 폴리머파에 형질전환시켜 이로부터 p24 표면항원을 제조하는 방법을 알아내고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 메틸영양 요구성의 효모로부터 유래한 FMD 프로모터, MOX 정지코돈 및 HBV의 p24 표면항원 유전자를 함유한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 전기의 재조합 발현벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리머파 및 그로부터 HBV의 p24 표면항원을 재조하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

adr 혈청타잎의 표면항원(HBsAg) 및 e항원(HBeAg)에 양성인 환자의 혈청으로부터 분리한 DNA에 BamHI 제한효소를 가하여 절단한 다음, BamHI 제한효소로 절단된 pBR322 플라스미드와 연결시켜 플라스미드 pHBV100을 제조한다. 이렇게 제조된 플라스미드 pHBV100에 EcoRI 및 AccI 제한효소를 처리하여 얻은 3kb의 DNA단편과; AccI 제한효소 부위가 존재하고 소실된 1개의 아미노산 서열과 정지코돈 및 PstI, BamHI 제한효소 부위를 갖도록 합성된 올리고뉴클레오티드를 연결한 다음, EcoRI BamHI로 절단된 pUC19 플라스미드와 다시 연결하여 플라스미드 pHBS103을 제조한다. 플라스미드 pHBS103은 정확한 3'말단을 갖는 표면항원 p24 유전자를 함유하고 있다. pHBS103 플라스미드부터 표면항원 p24 유전자의 5' 말단의 불필요한 부위를 제거하기 위하여, pHBS103 플라스미드에 BamHI 제한효소를 가하여, 2.6kb DNA 단편을 분리하고 다시 XhoI과 TaqI으로 절단하여 450bp의 DNA 단편을 분리한다. 분리된 450bp의 DNA 단편에 클레노우 효소(Klenow's fragment)를 처리하고 EcoRI 링커를 T4 DNA 연결효소로 연결한다. 이렇게 제조된 DNA 단편을 EcoRI과 XhoI으로 절단된 pHBS103 플라스미드에 삽입하여 pHBS105를 제조한다. pHBS105 플라스미드를 EcoRI 및 BamHI으로 절단하여 13kb의 DNA단편을 분리한 다음, 13mp19(Boehringer Manheim, Germany)에 삽입하여 플라스미드 pHBS107을 제조한다. 플라스미드 pHBS107에 삽입된 표면항원 p24 유전자의 5` 말단에 EcoRI 부위를 제조하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 5'-AAGTAGCCCTTAAGTACCTCTCG-3'로 부위특이적 돌연변이(sitedirected mutagenesis)를 일으켜서 플라스미드 pHBS109를 제조한다. 표면항원 p24 유전자를 함유한 pHBS109를 EcoRI 및 BamHI으로 절단하여 분리한 0.7kb의 DNA단편을, EcoRI 및 BamHI으로 절단된 효모에서 단백질을 발현할 수 있는 벡터 pMH101(FMD 프로모터-MOX 정지코돈-Ampr-URA3 유전자-HARS유전자를 함유한 벡터)에 삽입하여 재조합 발현벡터 pGM834를 제조한다. 이렇게 제조된 재조합 발현벡터 pGM834는 메틸영양 요구성의 효모로부터 유래한 FMD 프로모터, MOX 정지코돈 및 HBV의 표면항원 p24 유전자를 함유하고 있으며, MOX 정지코돈은 표면항원 유전자의 3'말단에 연결되어 있다.

한편, 한세눌라 폴리머파 균주를 UV에 노출시켜서 돌연변이를 유발하고 우라실 요구성 돌연변이 균주 YU305를 선별한 다음, 전기에서 제조된 발현벡터 pGM834는 형질전환시킨다. 이렇게 제조된 형질전환체들을 진탕배양한 다음 메탄올을 첨가하여 표면항원의 발현을 유도하고, 표면항원이 발현됨을 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, Abbott Co., Austria)으로 검정한다.

본 발명에 의해 제조된 HBV adr 혈청타잎 p24 표면항원은 HBV의 처치에 유용한 백신 개발에 이용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: HBV 게놈의 클로닝

adr 혈청타잎의 표면항원 및 e항원에 양성인 환자의 혈청을 20 내지 65% 수크로즈(sucrose) 농도구배 용액상에서 초원심분리시켜 데인입자를 침전시킨 다음, 이를 0.1M NaCI, 20mM MgCl₂, 40mM NH₄Cl, 0.4% NP-40, 10mM 2-머캡토에탄올(mercaptoethanol) 및 0.2mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 함유하는 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 37℃에서 3시간 반응시켜 내인성 중합효소로 HBV 게놈의 단일나선 부분을 이중나선으로 합성하였다. 이 현탁액을 다시 10mM EDTA 및 0.1% SDS를 함유하는 10mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.6)으로 희석하고, 단백질 가수분해효소(proteinase) K(0.8㎎/㎖)를 가하여 56℃에서 2시간 반응시켰다. 이어, 페놀/크로로포롬/이소아밀알코올(v/v, 25:24:1)로 2회 추출하여 단백질을 제거하고, 상층용액 부피의 2배에 해당하는 에탄올을 상층용액에 가하여 DNA만을 침전시켰다. 침전된 DNA를 미량의 완충용액(150mM NaCl, 6mM MgCl₂, 6mM 2-머캡토에탄올 및 100㎎/㎖ BSA을 함유한 6mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.9)에 현탁시키고, BamHI 제한효소를 가하여 37℃에서 3시간 반응시켜 HBV DNA를 절단하였다. 여기에 BamHI 제한효소를 절단하고 탈인산화시킨 100ng의 pBR322 플라스미드를 가하여, 상술한 바와 같이 페놀로 추출한 다음, 에탄올로 침전시켰다. HBV의 DNA와 pBR322 플라스미드가 혼합 침전된 DNA를 20㎖의 완충용액(10mM MgCl₂, 20mM DTT(dithiothreitol), 1mM ATP 및 50㎎/㎖ BSA을 함유한 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.8)에 현탁시키고 400 단위의 T₄DNA 연결효소(ligase)를 가하여 16℃에서 12시간 반응시켜 DNA를 연결하였다. 이렇게 제조된 플라스미드를 pHBV100으로 명명하고, 그의 유전자 지도를 제 1도에 나타내었다.

플라스미드 pHBV100으로 대장균(E. coli) HB101을 형질전환시키기 위하여, 배양된 대장균 균주 HB101 10⁸개 정도를 원심분리하여 침전시키고, 이를 1㎖의 완충용액(10mM RbCl₂를 함유한 10mM MOPS (morphorinopropane sulfonic acid)완충용액(pH 7.0))에 현탁시켜 다시 원심침전시켰다. 침전물을 1㎖의 완충용액(50mM CaCl₂및 10mM RbCl₂를 함유한 0.1M MOPS완충용액(pH 6.5))에 현탁시키고, 얼음속에 15분간 방치한 다음 원심침전시켰다. 그런 다음 침전물을 0.2㎖의 상기 완충용액에 현탁시키도, 3μ1의 DMSO(dimethylsulfoxide)와 플라스미드 pHBV100 10μ1를 가하였다. 이 용액을 얼음속에 30분간 방치하고 43.5℃의 수조에서 30초간 열처리한 다음, 5㎖ 의 LB배지를 가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양된 균주들을 다시 원심침전시키고, 200μ1의 LB배지에 현탁하여 50μg/m1의 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 한천 고형배지에 도말하여 37℃에서 20시간 배양시켰다. 콜로니를 형성한 각각의 형질전환체들을 다시 50μg/m1의 앰피실린과 테트라사이클린(tetracycline)이 각각 첨가된 고형배지에 옮겨, pBR322의 BamHI제한효소 부위에 HBV DNA가 삽입되어 앰피실린에는 내성이 있고 테트라사이클린에 내성이 없는 콜로니만을 선별하였다. 이러한 형질전환체로부터 플라스미드 pHBV100을 분리하고 BamHI 제한효소로 절단한 다음, 아가로스 겔상에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 관찰한 결과, 약 4300bp의 pBR322 절편과 3200bp의 HBV DNA 절편이 나타남을 확인하였다.

실시예2 : 표면항원 p24 유전자의 서브클로닝 adr 혈청타잎의 HBV DNA를 합유한 pHBV100 플라스미드 10μg, 10단위의 EcoRI 및 AccI 제한효소를 100μ1의 반응혼합물(6mM NaCl, 6mM MgCl₂, 6mM 2-머캡토에탄욜 및 100㎎/㎖ BSA을 함유한 6mM Tris-HCl(pH 7.5))에 가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그런다음, 1% 저융해점 아가로스 겔상에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드로 염색하여, 3kb의 DNA단편을 함유한 겔을 잘라낸 다음, 65℃에서 5분간 방치하여 녹이고 페놀 추출 및 에탄올로 침전시켰다. 이렇게 정제된 DNA는 표면항원 p24 유전자의 3'말단 부위의 불필요한 부분을 완전히 제거한 형태아나 1개의 아미노산 서열과 정지코돈이 소실되었으므로, 이를 재생하기 위하여 DNA 합성기(Applied Biosystems Inc., USA)로 아래와 같은 서열의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다

: ATACATTTAACTGCAGGATCCA TGTAAATTGACGTCCTAGGTTCGA 합성 올리고뉴클레오티드는 한쪽에 AccI 제한효소 부위가 존재하고 1개의 아미노산 서열과 정지코돈 및 PstI, BamHI 제한효소 부위를 갖도록 합성된 것이다. 정제된 DNA와 합성 올리고뉴클레오티드를 혼합한 다음, EcoRI과 BamHI로 절단된 pUC19 플라스미드와 다시 혼합하고, T₄DNA 연결효소로 DNA 단편들을 연결하였다. 이렇게 제조된 DNA를 플라스미드 pHBS103으로 명명하였으며, 플라스미드 pHBS103은 정확한 3'말단을 갖는 표면항원 p24 유전자를 함유하고 있다. pHBS103 플라스미드로부터 표면항원 p24 유전자의 5'말단의 불필요한 부위를 제거하기 위하여, pHBS103 플라스미드에 BamHI 제한효소를 가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 1% 저융해점 아가로스 겔상에서 전기영동하여 2.6kb DNA 단편을 분리하였다. 분리된 DNA를 다시 XHoI과 TaqI으로 절단하고, 다시 저융해점 아가로스 겔상에서 전기영동하여 450bp의 DNA 단편을 분리하였다. 분리된 450bp의 DNA 단편을 분리하였다. 분리된 450bp의 DNA 단편에 클레노우 효소를 가하여 상온에서 30분간 반응시킨 다음, 70℃에서 5분간 열처리하여 클레노우 효소를 실활시키고 EcoRI 링커를 T₄DNA 연결효소로 연결시켰다. 이렇게 제조된 DNA 단편을 EcoRI과 XhoI으로 절단된 pHBS103 플라스미드에 삽입하여 pHBS105를 제조하였다. 플라스미드 pHBS105의 작제과정을 제2도에 나타내었다.

실시예 3 : 표면항원 p24 유전자의 염기서열

pHBS105 플라스미드를 EcoRI 및 BamHI으로 절단하여 1% 저융해점 아가로스 겔상에서 1.3kb의 DNA 단편을 분리한 다음, EcoRI 및 BamHI 절단된 M13mp19에 삽입하여 플라스미드 pHBS107을 제조하였다. 그런 다음, 디데옥시 사슬종결 방법(Sanger F., Science, 214 : 1205-1210(1981))으로 adr 혈청타잎 p24 유전자의 염기서열을 결정하고, 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 제3도에 나타내었다. 본 발명의 HBV adr 혈청타잎 p24 유전자는 신규한 것으로 확인되었으며, 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 포함하는 HBV adr 혈청타

잎 p24 표면항원 역시 신규한 것으로 확인할 수 있었다.

실시예 4 : 발현벡터 pGM834의 제조

플라스미드 pHBS107에 삽입된 표면항원 p24 유전자의 5'말단에 EcoRI 부위를 제조하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 5'-ATTGTACCCTTAATACCTCTCG-3'로 부위특이적 돌연변이를 일으켰다. 그런 다음, 대장균 TGI 균주를 형질전환시키고 형질전환된 대장균 TGI 균주를 3㎖의 TBY 배지(1% 박토-트립톤, 0.5% 박토-효모 추출물 및 0.5% NaCl로 구성된 배지)에서 20시간 배양한 다음, 플라스미드 DNA를 추출하고 EcoRI 및 BamHI으로 절단하여 약 0.7kb의 DNA 단편이 나타나는지를 아가로스 겔상에서 확인하였다. 전기의 플라스미드 DNA를 pHBS109로 명명하였다. 표면항원 p24 유전자를 함유한 pHBS109를 EcoRI 및 BamHI으로 절단하여 분리한 0.7kb의 DNA 단편을, EcoRI 및 BamHI으로 절단된 효모에서 단백질을 발현할 수 있는 벡터 :Pmh101(FM 프로모터MOX 정지코돈-Amp^r-URA3 유전자-HARS 유전자를 함유한 벡터 : Rhein Biotech,Germany)에 삽입하여 발현벡터 pGM834를 제조하였다. 제4도에 벡터 pHM101의 유전자 지도를 나타내었으며, 제5도는 발현벡터 pGM834를 작제하는 과정을 나타내는 도식이고, 제6도는 발현벡터 pGM834 의 유전자 지도를 나타낸다.

실시예 5 : 우라실(uracil)요구성 숙주세포의 제조

한세눌라 폴리머파(Hansenula polymorpha, ATCC 34438) 균주를 YEPD 배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤 및 2% 덱스트로스로 구성된 배지)에서 중간 대수기까지 배양하고 원심분리한 후 수확하였다. 그런 다음, 균체를 0.1% NaCl로 2차례 세척하고 UV에 노출시켜서 돌연변이를 유발시켰다. 돌연변이가 유발된 세포들을 0.1% NaCl로 2회 세척하고 0.1% 5-플로우로-오로틱 에시드(5-fluoroorotic acid, Sima, USA)를 함유한 최소 아가배지에 도말하고 30℃에서 5일간 배양하였다. 그런 다음, 생장한 콜로니를 우라실이 첨가된 최소 아가배지 및 우라실이 첨가되지 않은 최소 아가배지에 평판반복법(replica plating megthod)으로 도말하여, 우라실이 첨가된 최소 아가배지에서만 생장하는 콜로니들로부터 오로티딘-5 -인산탈카르복시화효소(orotidine-5`-phosphatedecarboxylase, ODCase) 분석을 통하여 ODCase의 활성이 없는 요구성 돌연변이 균주 한세눌라 폴리머파 YU305를 얻었다.

실시예 6 : 발현벡터 pGM834로 형질전환된 효모의 제조

실시에 5에서 제조된 URA3 유전자가 불활성화된 한세눌라 폴리머파 YU305균주를 10㎖의 YEPD 배지에서 37℃로 18시간 진탕배양한 다음, 20㎖의 YEPD 배지에다시 접종하여 세포농도가 OD₆₀₀이 0.6 내지 1.0 정도가 되도록 37℃에서 18시간 동안 진탕배양시켰다. 그런다음, 원심침전시켜 완충용액 A(1M 솔비톨(sorbitol), 10mM 비신(bicin) 및 3% 에틸렌글리콜로 구성된 용액(pH 8.35))로 현탁 세척하고 1㎖의 전기 완충용액 A에 재현탁시켜 200㎕로 각각 분주하였다. 그런 다음, 11㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하고 -70℃에서 적어도 1시간 이상 보관하여 현탁액을 동결시켰다. 발현벡터 pGM834 10㎍과 0.1M CaC_l2 100㎕를 동결된 현탁액에 넣고 37℃에서 5분간 진탕시켜 현탁액을 융해시켰다. 1㎖의 완충용액B(40% PEG 3350 및 200mM 비신으로 구성된 용액(pH 8.35))를 넣고 흔들어서 완전히 혼합한 다음, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이를 낮은 회전수로 원심분리하여 침전시키고, 1㎖ 완충용액 C(150mM NaCl 및 10mM 비신으로 구성된 용액(pH 8.35))로 세척하고 다시 원심침전시켰다. 200㎕의 완충용액 C를 가하여 현탁시키고, 2% 아가를 함유한 선택배지에 도말한 다음 37℃에서 5일간 배양하였다.

이렇게 제조된 형질전환체들을 다시 YEPD 액상배지에 접종하고 37℃에서 진탕배양한 다음, 형질전환체로부터 염색체 DNA를 분리 정제하고 제한효소로 절단하여 아가로스 겔상에서 전기영동하였다. 이를 니트로셀룰로즈(nitrocellulose) (BA85, Scheicher andSchull, Germany)을 사용하여 서던 블롯(Southern blot) 하고³²P로 표지된 p24 유전자를 프로브(probe)로 사용하여 혼성화 실험을 함으로써, 발현벡터 pGM834로 형질전환된 형질전환체들을 확인하였다. 이 형질전환체는 한세눌라 폴리머파(Hansenula polymorpha) YU305로 명명되었으며, 사단법인 한국종균협회(KFCC)에 수탁번호 KFCC-10840로 1994년 8월 30일자에 기탁되었다.

실시예 7 : 형질전환체에서 표면항원 p24의 발현 형질전환체들을 YEPD 액상배지에 접종하여 37℃에서 진탕배양한 다음, 배양세포의 농도가 600mM에서 5 내지 10의 흡광도에 도달했을 때, 최종농도가 1%이 되도록 메탄올을 첨가하여 표면항원의 발현을 유도하였다. 메탄올 첨가후, 24시간 경과한 배양액을 원심침전시켜 유리구슬(glass bead) 및 완충용액(0.5% 트윈(Tween) 20, 2mM EDTA 및 2mM PMSF(phenylmethyl sulfonylfuoride)를 함유한 25mM 인산 완충용액(pH 8.0))으로 세포를 분쇄하였다. 그런다음, 원심분리하여 상층액을 얻어서 표면항원이 발현됨을 방사선 면역 측정법으로 검정하였다(참조 : 제 7도). 제 7도에서, 제 1 및 7 레인은 단백질 표준 시료물질로서 a는 인산화효소 B(106kDa), b는 소혈청알부민(80kDa), c는 오발부민(49.5kDa), d는 카보닉 안하이드라제(32.5kDa), e는 소이빈 트립신 억제자(29.5kDa), f는 리소자임(18.5kDa)을 나타내며, 제 2, 3, 4, 5 및 6레인은 표면항원 p24를 함유한 상등액을 나타낸다. 제 7도에서 보듯이, 표면항원 p24의 분자량인 약 24kDa에서 강한 단백질 띠를 볼 수 있으며, 그의 이량체를 나타내는 48kDa에서도 약한 단백질 띠를 볼 수 있다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 HBV adr 혈청타잎 p24 유전자, 그를 효모로부터 발현시킬 수 있는 재조합 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리머파 및 그로부터 HBV adr 혈청타잎 p24 표면항원을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제조된 HBV adr 혈청타잎 p24 표면항원은 HBV의 처치에 유용한 백신 개발에 이용될 수 있을 것이다.

Claims

(ⅰ) 메틸영양 요구성(methylotrophic)의 효모로부터 유래한 FMD(formate dehydrogenase) 프로모터;

(ⅱ) MOX 정지코돈; 및,

(ⅲ) 제 3도에 개시된 B형 간염 바이러스 adr 혈청타잎의 표면항원 p24 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터 pGM834.
제 1 항의 발현벡터 pGM834로 형질전환된 한세눌라 폴리머파(Hansenula polymorpha) YU305(KFCC -10840).
메탄올이 첨가된 배지에 제 2항의 한세눌라 폴리머파(Hansenula polymorpha) YU305(KFCC-10840)를 배양하여, B형 간염 바이러스 adr 혈청타잎 표면항원 p24를 정제하는 공정을 포함하는, B형 간염 바이러스 adr 혈청타잎의 표면항원 p24를 제조하는 방법.