JPH1084968A - 新規遺伝子、ベクター、それを用いた 形質転換体及びその利用 - Google Patents
新規遺伝子、ベクター、それを用いた 形質転換体及びその利用Info
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- JPH1084968A JPH1084968A JP26770196A JP26770196A JPH1084968A JP H1084968 A JPH1084968 A JP H1084968A JP 26770196 A JP26770196 A JP 26770196A JP 26770196 A JP26770196 A JP 26770196A JP H1084968 A JPH1084968 A JP H1084968A
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- transformant
- aspergillus oryzae
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 米麹で発現するグルコアミラーゼ遺伝子
及びｃＤＮＡのクローニングが行われ、その塩基配列も
決定された。また、このクローニングされた上記の新規
遺伝子をベクターに挿入することにより宿主（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換した。 【効果】 形質転換体を培養することにより上記酵素を
著量生産することができ、液体培養のみでなく、特に固
体培養においても顕著な効果が奏される点で特徴的であ
る。
及びｃＤＮＡのクローニングが行われ、その塩基配列も
決定された。また、このクローニングされた上記の新規
遺伝子をベクターに挿入することにより宿主（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換した。 【効果】 形質転換体を培養することにより上記酵素を
著量生産することができ、液体培養のみでなく、特に固
体培養においても顕著な効果が奏される点で特徴的であ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアスペルギルス・オ
リゼーから得られた新規グルコアミラーゼ遺伝子、これ
を含むベクター、そのベクターをアスペルギルス・オリ
ゼーまたはサッカロミセス・セレビシアエに移入した形
質転換体及びその利用に関するものである。アスペルギ
ルス・オリゼーのグルコアミラーゼは産業上重要な酵素
であり、本発明によって得られた形質転換体は、特に固
体培養においても本酵素を著量生産し、これらの酵素を
用いる産業界に大いに貢献するものである。
リゼーから得られた新規グルコアミラーゼ遺伝子、これ
を含むベクター、そのベクターをアスペルギルス・オリ
ゼーまたはサッカロミセス・セレビシアエに移入した形
質転換体及びその利用に関するものである。アスペルギ
ルス・オリゼーのグルコアミラーゼは産業上重要な酵素
であり、本発明によって得られた形質転換体は、特に固
体培養においても本酵素を著量生産し、これらの酵素を
用いる産業界に大いに貢献するものである。
【０００２】
【従来の技術】グルコアミラーゼは澱粉を非還元末端か
らグルコース単位で分解する酵素であり、清酒醸造をは
じめ味噌、醤油製造の産業において原料澱粉を糖化する
工程に広く利用されている。これらの産業においてグル
コアミラーゼはアスペルギルス・オリゼーの固体培養物
（麹）から得られている。特に清酒醸造においては本酵
素の生産性は非常に重要で、麹のグルコアミラーゼ活性
が低い場合、その後の発酵工程に悪影響を及ぼす。そこ
でこの麹中のグルコアミラーゼ活性を高めるためアスペ
ルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の単離が
試みられている（特公平７−５７１９４、Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５ ９４１−９４９）。取得さ
れたアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝
子（ｇｌａＡ）はグルコアミラーゼ活性を有する蛋白を
コードしていることが、本遺伝子に対応するｃＤＮＡを
サッカロミセス・セレビシアエに移入した形質転換体が
グルコアミラーゼ活性を発現することによって確認され
ている。また本遺伝子をアスペルギルス・オリゼーに移
入した形質転換体は、液体培養においてグルコアミラー
ゼを顕著に増加したが、清酒醸造などで用いる固体培養
においては親株と同程度のグルコアミラーゼしか生産し
なかった。従って、固体培養でグルコアミラーゼを高生
産させるには、ｇｌａＡ以外の別の遺伝子の働きが必要
であると考えられ、現在清酒醸造などの実際に利用しう
るグルコアミラーゼ活性のみが上昇した実用菌株の育種
は成功していない。
らグルコース単位で分解する酵素であり、清酒醸造をは
じめ味噌、醤油製造の産業において原料澱粉を糖化する
工程に広く利用されている。これらの産業においてグル
コアミラーゼはアスペルギルス・オリゼーの固体培養物
（麹）から得られている。特に清酒醸造においては本酵
素の生産性は非常に重要で、麹のグルコアミラーゼ活性
が低い場合、その後の発酵工程に悪影響を及ぼす。そこ
でこの麹中のグルコアミラーゼ活性を高めるためアスペ
ルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の単離が
試みられている（特公平７−５７１９４、Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５ ９４１−９４９）。取得さ
れたアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝
子（ｇｌａＡ）はグルコアミラーゼ活性を有する蛋白を
コードしていることが、本遺伝子に対応するｃＤＮＡを
サッカロミセス・セレビシアエに移入した形質転換体が
グルコアミラーゼ活性を発現することによって確認され
ている。また本遺伝子をアスペルギルス・オリゼーに移
入した形質転換体は、液体培養においてグルコアミラー
ゼを顕著に増加したが、清酒醸造などで用いる固体培養
においては親株と同程度のグルコアミラーゼしか生産し
なかった。従って、固体培養でグルコアミラーゼを高生
産させるには、ｇｌａＡ以外の別の遺伝子の働きが必要
であると考えられ、現在清酒醸造などの実際に利用しう
るグルコアミラーゼ活性のみが上昇した実用菌株の育種
は成功していない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来技術はたしかにす
ぐれた技術ではあるが、未だ充分に満足できるものでは
なく、特にわが国においては、麹といった固体培養が多
用されており、醸造工業や医薬品製造工業等において重
要な位置を占めている現状に鑑み、固体培養においても
グルコアミラーゼを顕著に増産しうる系の開発が求めら
れている。
ぐれた技術ではあるが、未だ充分に満足できるものでは
なく、特にわが国においては、麹といった固体培養が多
用されており、醸造工業や医薬品製造工業等において重
要な位置を占めている現状に鑑み、固体培養においても
グルコアミラーゼを顕著に増産しうる系の開発が求めら
れている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような技
術の現状に鑑み、従来技術が有している問題点を更に改
良、解決するためになされたものであって、液体培養の
みでなく固体培養においてもグルコアミラーゼを著量生
産する微生物を新たに開発することを目的になされたも
のである。
術の現状に鑑み、従来技術が有している問題点を更に改
良、解決するためになされたものであって、液体培養の
みでなく固体培養においてもグルコアミラーゼを著量生
産する微生物を新たに開発することを目的になされたも
のである。
【０００５】上記目的を達成するために各方面から検討
の結果、遺伝子組換え技術が最適であるとの観点に至っ
た。そして、グルコアミラーゼ生産菌であるアスペルギ
ルス・オリゼーを用いて固体培養を行い、そのグルコア
ミラーゼを精製し、その酵素の機能や蛋白質の１次構造
を詳細に検討した。その結果、固体培養で生産されるグ
ルコアミラーゼは既にクローニングされているｇｌａＡ
以外の遺伝子の産物であることを見いだした。そこでこ
の固体培養で高発現しているグルコアミラーゼのアミノ
酸配列の情報をもとに、このグルコアミラーゼをコード
すると考えられるｃＤＮＡおよび染色体ＤＮＡ断片をク
ローニングすることに成功した。
の結果、遺伝子組換え技術が最適であるとの観点に至っ
た。そして、グルコアミラーゼ生産菌であるアスペルギ
ルス・オリゼーを用いて固体培養を行い、そのグルコア
ミラーゼを精製し、その酵素の機能や蛋白質の１次構造
を詳細に検討した。その結果、固体培養で生産されるグ
ルコアミラーゼは既にクローニングされているｇｌａＡ
以外の遺伝子の産物であることを見いだした。そこでこ
の固体培養で高発現しているグルコアミラーゼのアミノ
酸配列の情報をもとに、このグルコアミラーゼをコード
すると考えられるｃＤＮＡおよび染色体ＤＮＡ断片をク
ローニングすることに成功した。
【０００６】そしてこのグルコアミラーゼをコードする
ｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエに移入するこ
とにも成功し、得られた形質転換体においてグルコアミ
ラーゼが発現することを確認した。さらにクローニング
した染色体ＤＮＡ断片を移入したアスペルギルス・オリ
ゼー形質転換体においてもグルコアミラーゼ生産性が顕
著に増大することも確認した。すなわち本発明者らは、
アスペルギルス・オリゼーの新規なグルコアミラーゼ遺
伝子に着目し、アスペルギルス・オリゼーのゲノムＤＮ
Ａ制限酵素断片よりグルコアミラーゼをコードするＤＮ
Ａ断片をクローン化し、これをアスペルギルス・オリゼ
ー宿主ベクター系に移入することにより、グルコアミラ
ーゼを著量生産する形質転換体（Ａ）を得ることに成功
した。ここで得られた形質転換体（Ａ）はＦＥＲＭ Ｐ
−１５８２６として生命研に寄託されている。さらにア
スペルギルス・オリゼーの全ｍＲＮＡを固体培養菌体
（麹）から調製し、これに基づいてｃＤＮＡを合成して
ｃＤＮＡライブラリーを作製し、その中からアスペルギ
ルス・オリゼーのグルコアミラーゼをコードするクロー
ンを分離した。そしてこのｃＤＮＡを発現ベクターに連
結した後サッカロミセス・セレビシアエに移入すること
により、アスペルギルス・オリゼーを生産するグルコア
ミラーゼと同等のグルコアミラーゼを生産する形質転換
体（Ｂ）を得ることにも成功した。ここで得られた形質
転換体（Ｂ）はＦＥＲＭ Ｐ−１５８２７として生命研
に寄託されている。
ｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエに移入するこ
とにも成功し、得られた形質転換体においてグルコアミ
ラーゼが発現することを確認した。さらにクローニング
した染色体ＤＮＡ断片を移入したアスペルギルス・オリ
ゼー形質転換体においてもグルコアミラーゼ生産性が顕
著に増大することも確認した。すなわち本発明者らは、
アスペルギルス・オリゼーの新規なグルコアミラーゼ遺
伝子に着目し、アスペルギルス・オリゼーのゲノムＤＮ
Ａ制限酵素断片よりグルコアミラーゼをコードするＤＮ
Ａ断片をクローン化し、これをアスペルギルス・オリゼ
ー宿主ベクター系に移入することにより、グルコアミラ
ーゼを著量生産する形質転換体（Ａ）を得ることに成功
した。ここで得られた形質転換体（Ａ）はＦＥＲＭ Ｐ
−１５８２６として生命研に寄託されている。さらにア
スペルギルス・オリゼーの全ｍＲＮＡを固体培養菌体
（麹）から調製し、これに基づいてｃＤＮＡを合成して
ｃＤＮＡライブラリーを作製し、その中からアスペルギ
ルス・オリゼーのグルコアミラーゼをコードするクロー
ンを分離した。そしてこのｃＤＮＡを発現ベクターに連
結した後サッカロミセス・セレビシアエに移入すること
により、アスペルギルス・オリゼーを生産するグルコア
ミラーゼと同等のグルコアミラーゼを生産する形質転換
体（Ｂ）を得ることにも成功した。ここで得られた形質
転換体（Ｂ）はＦＥＲＭ Ｐ−１５８２７として生命研
に寄託されている。
【０００７】また、ここで得られた形質転換体（Ａ）を
用いて清酒醸造を行ったところ、従来の菌株やｇｌａＡ
遺伝子を移入した形質転換体（特公平７−５７１９４、
Ｇｅｎｅ．１０８ １４５−１５０）に比べて著量のグ
ルコアミラーゼ活性を有する麹が得られたので、麹歩合
を低減させたり、粕歩合を低下させたりし、原料コスト
を大きく低減させることが可能となった。また、形質転
換体（Ｂ）を用いることにより液化した澱粉原料を糖化
酵素などによって糖化することなく、直接アルコール発
酵が可能となることも確認した。本発明は、これらの有
用新知見に基づき、遂に完成されたものである。
用いて清酒醸造を行ったところ、従来の菌株やｇｌａＡ
遺伝子を移入した形質転換体（特公平７−５７１９４、
Ｇｅｎｅ．１０８ １４５−１５０）に比べて著量のグ
ルコアミラーゼ活性を有する麹が得られたので、麹歩合
を低減させたり、粕歩合を低下させたりし、原料コスト
を大きく低減させることが可能となった。また、形質転
換体（Ｂ）を用いることにより液化した澱粉原料を糖化
酵素などによって糖化することなく、直接アルコール発
酵が可能となることも確認した。本発明は、これらの有
用新知見に基づき、遂に完成されたものである。
【０００８】以下、本発明について詳しく説明するが、
あくまでもこの方法に限定されるものではない。本発明
に用いた染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびグルコアミラー
ゼ供与体はアスペルギルス・オリゼーであり、具体的に
はＯＳＩ−１０１３株である。本発明においては、本菌
株の精製グルコアミラーゼを得るため、精白米と本菌株
の分生胞子を用いて固体麹を調製する。アスペルギルス
・オリゼーのグルコアミラーゼ精製方法はＡｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，１７０７−１７１１（１
９８９）に記載された方法に準じて行われる。
あくまでもこの方法に限定されるものではない。本発明
に用いた染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびグルコアミラー
ゼ供与体はアスペルギルス・オリゼーであり、具体的に
はＯＳＩ−１０１３株である。本発明においては、本菌
株の精製グルコアミラーゼを得るため、精白米と本菌株
の分生胞子を用いて固体麹を調製する。アスペルギルス
・オリゼーのグルコアミラーゼ精製方法はＡｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，１７０７−１７１１（１
９８９）に記載された方法に準じて行われる。
【０００９】次に、得られた精製グルコアミラーゼを
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，９８，３０５−３１８に準
じてリシルエンドペプチダーゼによって消化し、さらに
逆相高速液体クロマトグラフィーにより、ペプチド断片
を分離回収する。得られたペプチド断片をＪ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，７９９０（１９８１）に準じ
てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の自動ペプチ
ドシーケンサーＭＯＤＥＬ４７０Ａにて、そのアミノ酸
配列を決定する。得られたアミノ酸配列に基づいてオリ
ゴＤＮＡを合成し、これを後述のプラークハイブリダイ
ゼーションのプローブとして使用する。
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，９８，３０５−３１８に準
じてリシルエンドペプチダーゼによって消化し、さらに
逆相高速液体クロマトグラフィーにより、ペプチド断片
を分離回収する。得られたペプチド断片をＪ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，７９９０（１９８１）に準じ
てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の自動ペプチ
ドシーケンサーＭＯＤＥＬ４７０Ａにて、そのアミノ酸
配列を決定する。得られたアミノ酸配列に基づいてオリ
ゴＤＮＡを合成し、これを後述のプラークハイブリダイ
ゼーションのプローブとして使用する。
【００１０】また、アスペルギルス・オリゼーＯＳＩ−
１０１３株より染色体を、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）に
記載された方法にて抽出し、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５３，５９３（１９８７）に準じて染色体ジ
ーンライブラリーを作製する。この染色体ジーンライブ
ラリーより、上記で得られたオリゴＤＮＡをプローブと
してプラークハイブリダイゼーション法により、新規グ
ルコアミラーゼ遺伝子を単離する。得られたＤＮＡ断片
は、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有していた。
（図１）。
１０１３株より染色体を、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）に
記載された方法にて抽出し、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５３，５９３（１９８７）に準じて染色体ジ
ーンライブラリーを作製する。この染色体ジーンライブ
ラリーより、上記で得られたオリゴＤＮＡをプローブと
してプラークハイブリダイゼーション法により、新規グ
ルコアミラーゼ遺伝子を単離する。得られたＤＮＡ断片
は、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有していた。
（図１）。
【００１１】上記で得られたＤＮＡ断片をアスペルギル
ス・オリゼーのベクターとして例えばｎｉａＤ遺伝子を
マーカーに持つｐＳＴＡ２４（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９））に挿
入し、得られたＤＮＡをｎｉａＤ欠損株のアスペルギル
ス・オリゼーに移入し、形質転換体を得る。ｎｉａＤ欠
損株は具体的にはアスペルギルス・オリゼーＯＳＩ−１
０１３株よりＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１
８，９９−１０４（１９８９）記載の方法に準じて、塩
素酸ナトリウム耐性株として得られる。形質転換法とし
ては、公知の方法、例えばＡｇｉｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）に記載され
た方法あるいはこれに準じた方法がとられる。この方法
により形質転換体（Ａ）を得る。
ス・オリゼーのベクターとして例えばｎｉａＤ遺伝子を
マーカーに持つｐＳＴＡ２４（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９））に挿
入し、得られたＤＮＡをｎｉａＤ欠損株のアスペルギル
ス・オリゼーに移入し、形質転換体を得る。ｎｉａＤ欠
損株は具体的にはアスペルギルス・オリゼーＯＳＩ−１
０１３株よりＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１
８，９９−１０４（１９８９）記載の方法に準じて、塩
素酸ナトリウム耐性株として得られる。形質転換法とし
ては、公知の方法、例えばＡｇｉｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）に記載され
た方法あるいはこれに準じた方法がとられる。この方法
により形質転換体（Ａ）を得る。
【００１２】次に、アスペルギルス・オリゼーの分生胞
子と精白米から固体麹を調製し、この固体麹の表面に生
育するアスペルギルス・オリゼーの菌体よりＡｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，１９０５（１９９
０）に記載された方法によりｍＲＮＡを抽出し、Ｇｅｎ
ｅ，２５，２６３−２６９（１９８３）の方法にてｃＤ
ＮＡを合成した。一方、グルコアミラーゼ遺伝子のグル
コアミラーゼのコーディング領域の開始コドンを含む配
列と、終止コドンを含む配列を基にオリゴＤＮＡを合成
する。このオリゴＤＮＡをプライマーとして、得られた
ｃＤＮＡを鋳型として、例えばＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ．（１９８９）
に記載されたＰＣＲ法によりグルコアミラーゼｃＤＮＡ
を合成した。単離したグルコアミラーゼｃＤＮＡは、配
列表の配列番号２に示す塩基配列を有していた（図
２）。
子と精白米から固体麹を調製し、この固体麹の表面に生
育するアスペルギルス・オリゼーの菌体よりＡｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，１９０５（１９９
０）に記載された方法によりｍＲＮＡを抽出し、Ｇｅｎ
ｅ，２５，２６３−２６９（１９８３）の方法にてｃＤ
ＮＡを合成した。一方、グルコアミラーゼ遺伝子のグル
コアミラーゼのコーディング領域の開始コドンを含む配
列と、終止コドンを含む配列を基にオリゴＤＮＡを合成
する。このオリゴＤＮＡをプライマーとして、得られた
ｃＤＮＡを鋳型として、例えばＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ．（１９８９）
に記載されたＰＣＲ法によりグルコアミラーゼｃＤＮＡ
を合成した。単離したグルコアミラーゼｃＤＮＡは、配
列表の配列番号２に示す塩基配列を有していた（図
２）。
【００１３】上記で得られたアスペルギルス・オリゼー
のグルコアミラーゼｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビ
シアエの発現ベクター、例えば酵母ガラクトースキナー
ゼ（ＧＡＬ１）のプロモーターを持つ酵母発現ベクター
ｐＹＥＳ２に挿入し、サッカロミセス・セレビシアエに
移入することにより形質転換体を得る。形質転換法とし
ては、公知の方法、例えばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１
５３，１６３−１６８（１９８３）に記載されている方
法あるいはそれに準じた方法がとられる。この方法によ
って形質転換体（Ｂ）を得る。
のグルコアミラーゼｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビ
シアエの発現ベクター、例えば酵母ガラクトースキナー
ゼ（ＧＡＬ１）のプロモーターを持つ酵母発現ベクター
ｐＹＥＳ２に挿入し、サッカロミセス・セレビシアエに
移入することにより形質転換体を得る。形質転換法とし
ては、公知の方法、例えばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１
５３，１６３−１６８（１９８３）に記載されている方
法あるいはそれに準じた方法がとられる。この方法によ
って形質転換体（Ｂ）を得る。
【００１４】次にこの形質転換体（Ａ）を蒸米上で生育
させ、分生胞子を形成させ、得られた分生胞子を用いて
公知の方法によって米麹を製造し、これに水、酵母及び
蒸米を加え、発酵させることにより、酒類、エタノール
などを製造する。形質転換体（Ａ）を用いて製造した麹
には固体培養で発現するグルコアミラーゼの力価が高い
ため、酒類、エタノールなどを効率よく製造することが
できる。
させ、分生胞子を形成させ、得られた分生胞子を用いて
公知の方法によって米麹を製造し、これに水、酵母及び
蒸米を加え、発酵させることにより、酒類、エタノール
などを製造する。形質転換体（Ａ）を用いて製造した麹
には固体培養で発現するグルコアミラーゼの力価が高い
ため、酒類、エタノールなどを効率よく製造することが
できる。
【００１５】またこのグルコアミラーゼのｃＤＮＡを含
むベクターをサッカロミセス・セレビシアエに移入し
て、アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼを分
泌する形質転換体（Ｂ）を得る。この形質転換体（Ｂ）
を用いることにより、グルコアミラーゼなどの糖化酵素
を加えることなく、サッカロミセス・セレビシアエによ
る澱粉から直接アルコール発酵を行うことが可能であ
る。
むベクターをサッカロミセス・セレビシアエに移入し
て、アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼを分
泌する形質転換体（Ｂ）を得る。この形質転換体（Ｂ）
を用いることにより、グルコアミラーゼなどの糖化酵素
を加えることなく、サッカロミセス・セレビシアエによ
る澱粉から直接アルコール発酵を行うことが可能であ
る。
【００１６】当然のことながら、形質転換体（Ａ、Ｂ）
は、常法にしたがってこれを培養することにより、酵素
を効率よく製造することができ、発酵工業のみならず、
食品工業、医薬品工業その他各種の工業において様々な
用途に利用することができる。特にアスペルギルス・オ
リゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼは糖含量
が高く、熱やプロテアーゼに対する安定性が高いため、
これらの工業で安定に利用することができる。次に本発
明の実施例を示す。
は、常法にしたがってこれを培養することにより、酵素
を効率よく製造することができ、発酵工業のみならず、
食品工業、医薬品工業その他各種の工業において様々な
用途に利用することができる。特にアスペルギルス・オ
リゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼは糖含量
が高く、熱やプロテアーゼに対する安定性が高いため、
これらの工業で安定に利用することができる。次に本発
明の実施例を示す。
【００１７】
【実施例１】 アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコ
アミラーゼの精製と部分アミノ酸配列の決定
アミラーゼの精製と部分アミノ酸配列の決定
【００１８】アスペルギルス・オリゼーの分生胞子を蒸
米に接種し、常法に従い米麹を調製する。この米麹１ｋ
ｇに３Ｌの抽出バッファー（１％ＮａＣｌ，１０ｍＭ
Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５））を加えて、
４℃で１６時間放置後、アドバンテック濾紙Ｎｏ．５Ａ
にてろ過した。ろ過液に９０％飽和になるよう硫酸アン
モニウムを加えて溶解させた後、４℃１６時間放置し塩
析を行った。これを遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０
分）し、上清を集め、流水１日、水１日、緩衝液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７））で
さらに１日透析を行った。この透析液をあらかじめ上記
緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカ
ラム（３００ｍｌ）にロードし、グルコアミラーゼをカ
ラムに吸着させた。カラムを緩衝液で十分洗浄後、１Ｍ
ＮａＣｌを含む緩衝液５００ｍｌでグルコアミラーゼ
画分を溶出した。
米に接種し、常法に従い米麹を調製する。この米麹１ｋ
ｇに３Ｌの抽出バッファー（１％ＮａＣｌ，１０ｍＭ
Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５））を加えて、
４℃で１６時間放置後、アドバンテック濾紙Ｎｏ．５Ａ
にてろ過した。ろ過液に９０％飽和になるよう硫酸アン
モニウムを加えて溶解させた後、４℃１６時間放置し塩
析を行った。これを遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０
分）し、上清を集め、流水１日、水１日、緩衝液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７））で
さらに１日透析を行った。この透析液をあらかじめ上記
緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカ
ラム（３００ｍｌ）にロードし、グルコアミラーゼをカ
ラムに吸着させた。カラムを緩衝液で十分洗浄後、１Ｍ
ＮａＣｌを含む緩衝液５００ｍｌでグルコアミラーゼ
画分を溶出した。
【００１９】このグルコアミラーゼ画分を限外ろ過装置
にて濃縮し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ
Ｑカラムにロードし、０−０．５Ｍ ＮａＣｌの直線グ
ラジエントにて溶出し、グルコアミラーゼ画分を集め
た。このグルコアミラーゼ画分をさらにグルコアミラー
ゼの特異的インヒビターであるアカボースを固定化した
アフィニティーカラム（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，５２，１７０７−１７１４）にて精製した。最終
的には１５０ｍｇの精製グルコアミラーゼを得た。
にて濃縮し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ
Ｑカラムにロードし、０−０．５Ｍ ＮａＣｌの直線グ
ラジエントにて溶出し、グルコアミラーゼ画分を集め
た。このグルコアミラーゼ画分をさらにグルコアミラー
ゼの特異的インヒビターであるアカボースを固定化した
アフィニティーカラム（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，５２，１７０７−１７１４）にて精製した。最終
的には１５０ｍｇの精製グルコアミラーゼを得た。
【００２０】得られた精製グルコアミラーゼ１０ｍｇを
３ｍｌの７Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅを含む０．５Ｍ Ｔ
ｒｉｓバッファーに溶解し、Ｎ2ガス下でＤｉｔｈｉｏ
ｔｈｒｅｉｔｏｌとヨード酢酸にて還元カルボキシメチ
ル化（Ｃｍ化）を行った。このＣｍグルコアミラーゼを
４Ｍ尿素存在下でリシルエンドペプチダーゼにて消化
し、グルコアミラーゼ蛋白をペプチドに分解した。これ
を逆相ＨＰＬＣにて各ペプチド断片を分離、回収した。
各ペプチドは気相式自動ペプチドシーケンサーにて、そ
のＮ末端付近のアミノ酸配列を決定した。
３ｍｌの７Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅを含む０．５Ｍ Ｔ
ｒｉｓバッファーに溶解し、Ｎ2ガス下でＤｉｔｈｉｏ
ｔｈｒｅｉｔｏｌとヨード酢酸にて還元カルボキシメチ
ル化（Ｃｍ化）を行った。このＣｍグルコアミラーゼを
４Ｍ尿素存在下でリシルエンドペプチダーゼにて消化
し、グルコアミラーゼ蛋白をペプチドに分解した。これ
を逆相ＨＰＬＣにて各ペプチド断片を分離、回収した。
各ペプチドは気相式自動ペプチドシーケンサーにて、そ
のＮ末端付近のアミノ酸配列を決定した。
【００２１】得られたペプチド断片のアミノ酸配列と、
それから類推して合成したオリゴＤＮＡプローブ（Ｎ
ｏ．１及びＮｏ．２）を図５に示す。
それから類推して合成したオリゴＤＮＡプローブ（Ｎ
ｏ．１及びＮｏ．２）を図５に示す。
【００２２】
【実施例２】 アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコ
アミラーゼをコードする染色体ＤＮＡ断片の単離と塩基
配列の決定
アミラーゼをコードする染色体ＤＮＡ断片の単離と塩基
配列の決定
【００２３】実施例１記載のオリゴＤＮＡをＥＣＬオリ
ゴＤＮＡラベリングシステムにより、蛍光ラベルしたも
のをプローブとして用いて、アスペルギルス・オリゼー
のλＥＭＢＬ３を用いたファージ染色体ライブラリーよ
り、プラークハイブリダイゼーション法によりグルコア
ミラーゼ遺伝子を含むクローン選択を行った。一連の操
作はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ６３−
６７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の常法に従った。約
２０，０００個のプラークより、蛍光ラベルしたプロー
ブにハイブリダイズするクローン１個を得た。
ゴＤＮＡラベリングシステムにより、蛍光ラベルしたも
のをプローブとして用いて、アスペルギルス・オリゼー
のλＥＭＢＬ３を用いたファージ染色体ライブラリーよ
り、プラークハイブリダイゼーション法によりグルコア
ミラーゼ遺伝子を含むクローン選択を行った。一連の操
作はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ６３−
６７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の常法に従った。約
２０，０００個のプラークより、蛍光ラベルしたプロー
ブにハイブリダイズするクローン１個を得た。
【００２４】このクローンよりファージＤＮＡを単離
し、蛍光プローブにハイブリダイズするＤＮＡ断片
（７．０ｋｂ ＳａｌＩ断片）をｐＵＣ１１８にサブク
ローニングした。その制限酵素地図を図３に示す。この
７ｋｂのＳａｌＩ断片のなかで蛍光プローブにハイブリ
ダイズする領域を特定し、ジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２１４、１２９５−１３１０（１９８０））にてそ
の領域周辺の塩基配列を決定した。その結果この遺伝子
断片中に、プローブに用いたペプチド断片をコードする
塩基配列が見いだされた。他のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
属のグルコアミラーゼ遺伝子と比較した結果、２つのイ
ントロンに分断された３つのエキソン中に４９３アミノ
酸残基をコードするオープンリーディングフレームがあ
ると推定された。この新規グルコアミラーゼ遺伝子のコ
ーディング領域とその上流、下流領域の塩基配列を配列
番号１に示す（図１）。
し、蛍光プローブにハイブリダイズするＤＮＡ断片
（７．０ｋｂ ＳａｌＩ断片）をｐＵＣ１１８にサブク
ローニングした。その制限酵素地図を図３に示す。この
７ｋｂのＳａｌＩ断片のなかで蛍光プローブにハイブリ
ダイズする領域を特定し、ジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２１４、１２９５−１３１０（１９８０））にてそ
の領域周辺の塩基配列を決定した。その結果この遺伝子
断片中に、プローブに用いたペプチド断片をコードする
塩基配列が見いだされた。他のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
属のグルコアミラーゼ遺伝子と比較した結果、２つのイ
ントロンに分断された３つのエキソン中に４９３アミノ
酸残基をコードするオープンリーディングフレームがあ
ると推定された。この新規グルコアミラーゼ遺伝子のコ
ーディング領域とその上流、下流領域の塩基配列を配列
番号１に示す（図１）。
【００２５】
【実施例３】 アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコ
アミラーゼを多量に発現するアスペルギルス・オリゼー
の形質転換体の作製
アミラーゼを多量に発現するアスペルギルス・オリゼー
の形質転換体の作製
【００２６】実施例２に記載するグルコアミラーゼ遺伝
子を含む７．０ｋｂ−ＳａｌＩの染色体ＤＮＡ断片をア
スペルギルス・オリゼーのｎｉａＤ変異を相補する遺伝
子を持つベクターｐＮＩＡ−２に連結し、図３に示すプ
ラスミドｐＮＧＢ−１を作製した。挿入したＳａｌＩ断
片はグルコアミラーゼのコーディング領域１．７ｋｂと
その上流部分２．８ｋｂ下流分２．４ｋｂを含んでお
り、グルコアミラーゼのアスペルギルス・オリゼーでの
発現に必要な領域はすべて含んでいると考えられる。そ
こでこのプラスミドをアスペルギルス・オリゼーに移入
した。
子を含む７．０ｋｂ−ＳａｌＩの染色体ＤＮＡ断片をア
スペルギルス・オリゼーのｎｉａＤ変異を相補する遺伝
子を持つベクターｐＮＩＡ−２に連結し、図３に示すプ
ラスミドｐＮＧＢ−１を作製した。挿入したＳａｌＩ断
片はグルコアミラーゼのコーディング領域１．７ｋｂと
その上流部分２．８ｋｂ下流分２．４ｋｂを含んでお
り、グルコアミラーゼのアスペルギルス・オリゼーでの
発現に必要な領域はすべて含んでいると考えられる。そ
こでこのプラスミドをアスペルギルス・オリゼーに移入
した。
【００２７】アスペルギルス・オリゼーの硝酸還元酵素
欠損変異株（ｎｉａＤ）をプラスミドｐＮＧＢ−１によ
り、Ａｇｉｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３
−３２８（１９８７）の記載の方法に準じて形質転換を
行った。宿主として用いる硝酸還元酵素欠損変異株はＮ
ａＮＯ3を窒素源として利用できないのに対し、ｎｉａ
Ｄ遺伝子を含むプラスミドが移入された形質転換体はＮ
ａＮＯ3を単一窒素源として生育が可能であった。次に
この形質転換体をプレートに塗布し分生胞子を集めた。
この分生胞子を蒸米に接種し、定法に従い米麹を調製し
た。得られた米麹のグルコアミラーゼ活性を醸協，８
１，４９０−４９４（１９８６）記載の方法に従って測
定した。その結果を下記表５に示す。
欠損変異株（ｎｉａＤ）をプラスミドｐＮＧＢ−１によ
り、Ａｇｉｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３
−３２８（１９８７）の記載の方法に準じて形質転換を
行った。宿主として用いる硝酸還元酵素欠損変異株はＮ
ａＮＯ3を窒素源として利用できないのに対し、ｎｉａ
Ｄ遺伝子を含むプラスミドが移入された形質転換体はＮ
ａＮＯ3を単一窒素源として生育が可能であった。次に
この形質転換体をプレートに塗布し分生胞子を集めた。
この分生胞子を蒸米に接種し、定法に従い米麹を調製し
た。得られた米麹のグルコアミラーゼ活性を醸協，８
１，４９０−４９４（１９８６）記載の方法に従って測
定した。その結果を下記表５に示す。
【００２８】
【表５】
【００２９】上記のようにこのグルコアミラーゼ遺伝子
をアスペルギルス・オリゼーに移入することにより、グ
ルコアミラーゼ活性のみ上昇する形質転換体が得られ
た。なおこの形質転換体（Ａ）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＧＬＢ−０１と命名し、これを工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５
８２６として寄託した。
をアスペルギルス・オリゼーに移入することにより、グ
ルコアミラーゼ活性のみ上昇する形質転換体が得られ
た。なおこの形質転換体（Ａ）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＧＬＢ−０１と命名し、これを工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５
８２６として寄託した。
【００３０】
【実施例４】 アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコ
アミラーゼのｃＤＮＡの単離と塩基配列の決定
アミラーゼのｃＤＮＡの単離と塩基配列の決定
【００３１】実施例２で得られたアスペルギルス・オリ
ゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列から推定され
る開始コドン上流と終止コドン下流に対応する２種のプ
ライマーＰ１、Ｐ２を合成した（図６）。
ゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列から推定され
る開始コドン上流と終止コドン下流に対応する２種のプ
ライマーＰ１、Ｐ２を合成した（図６）。
【００３２】アスペルギルス・オリゼーを固体培養した
米麹から、ＤＮＡ，２，３２９−３３５（１９８３）記
載の方法によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＴ
ｏｔａｌ ＲＮＡよりＱＤ Ｒａｐｉｄ ｐｏｌｙ
（Ａ）＋ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ
（５′Ｐｒｉｍｅ−３′Ｐｒｉｍｅ Ｉｎｃ）を用いて
ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを単離した。さらにＳｕｐｅｒ
Ｓｃｒｉｐｔ Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ
ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ λｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いてｍＲＮＡ
よりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンペレート
として先の２種類の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣ
Ｒ反応を行い、ｇｌａＢ遺伝子に対応するｃＤＮＡ断片
を得た。このｃＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８にサブクロー
ニングし、実施例２に記載の方法と同様にしてその塩基
配列を決定した。配列番号２に示すように、全塩基配列
は１４８２ｂｐであり、Ｍｅｔで始まる４９３個のアミ
ノ酸をコードしていた（図２）。
米麹から、ＤＮＡ，２，３２９−３３５（１９８３）記
載の方法によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＴ
ｏｔａｌ ＲＮＡよりＱＤ Ｒａｐｉｄ ｐｏｌｙ
（Ａ）＋ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ
（５′Ｐｒｉｍｅ−３′Ｐｒｉｍｅ Ｉｎｃ）を用いて
ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを単離した。さらにＳｕｐｅｒ
Ｓｃｒｉｐｔ Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ
ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ λｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いてｍＲＮＡ
よりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンペレート
として先の２種類の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣ
Ｒ反応を行い、ｇｌａＢ遺伝子に対応するｃＤＮＡ断片
を得た。このｃＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８にサブクロー
ニングし、実施例２に記載の方法と同様にしてその塩基
配列を決定した。配列番号２に示すように、全塩基配列
は１４８２ｂｐであり、Ｍｅｔで始まる４９３個のアミ
ノ酸をコードしていた（図２）。
【００３３】
【実施例５】 アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼを発現す
るサッカロミセス・セレビシアエの形質転換体の作製
るサッカロミセス・セレビシアエの形質転換体の作製
【００３４】実施例４のグルコアミラーゼｃＤＮＡ断片
を酵母発現ベクターに連結し、図４に示すプラスミドｐ
ＹＧＢ−１を作成した。使用した発現ベクターはｐＹＥ
Ｓ２（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）である。このプラスミドは
ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧ
ＡＬ１プロモータとＣＹＣ１ターミネーターを含んでお
り、ＧＡＬ１プロモーター下流に連結されたｃＤＮＡ断
片はこのプロモータ制御を受けて酵母内で発現されると
考えられる。次にこのグルコアミラーゼｃＤＮＡを含む
プラスミドｐＹＧＢ−１をＩｔｏらのＪ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ、１５３、１６３−１６８，（１９８３）
記載の方法に従って、酵母宿主（ＩＮＶＳｃｌａ，ｈｉ
ｓ３，ｔｒｐ１，ｕｒａ３）に導入した。プラスミドに
含まれるＵＲＡ３遺伝子により、ウラシル要求性が相補
された形質転換体（Ｂ）を選択した。
を酵母発現ベクターに連結し、図４に示すプラスミドｐ
ＹＧＢ−１を作成した。使用した発現ベクターはｐＹＥ
Ｓ２（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）である。このプラスミドは
ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧ
ＡＬ１プロモータとＣＹＣ１ターミネーターを含んでお
り、ＧＡＬ１プロモーター下流に連結されたｃＤＮＡ断
片はこのプロモータ制御を受けて酵母内で発現されると
考えられる。次にこのグルコアミラーゼｃＤＮＡを含む
プラスミドｐＹＧＢ−１をＩｔｏらのＪ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ、１５３、１６３−１６８，（１９８３）
記載の方法に従って、酵母宿主（ＩＮＶＳｃｌａ，ｈｉ
ｓ３，ｔｒｐ１，ｕｒａ３）に導入した。プラスミドに
含まれるＵＲＡ３遺伝子により、ウラシル要求性が相補
された形質転換体（Ｂ）を選択した。
【００３５】この形質転換体（Ｂ）を次に示す組成の合
成培地１００ｍｌに接種し、３０℃、７２時間培養し
た。合成培地：２％ガラクトース、２％ポリペプトン、
１％イーストエキス、５０ｍｇ／ｌトリプトファン）培
養終了後、３，０００ｒｐｍの遠心処理にて酵母菌体を
除いた後、上清のグルコアミラーゼ活性を実施例３と同
様の方法にて測定した。その結果を下記表６に示す。こ
の結果から明らかなように、グルコアミラーゼｃＤＮＡ
が移入された形質転換体（Ｂ）においては、グルコアミ
ラーゼが検出された。なお、この形質転換体（Ｂ）は、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ｃＧＬＢ−０１と命名し、これを工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８２７として寄託し
た。
成培地１００ｍｌに接種し、３０℃、７２時間培養し
た。合成培地：２％ガラクトース、２％ポリペプトン、
１％イーストエキス、５０ｍｇ／ｌトリプトファン）培
養終了後、３，０００ｒｐｍの遠心処理にて酵母菌体を
除いた後、上清のグルコアミラーゼ活性を実施例３と同
様の方法にて測定した。その結果を下記表６に示す。こ
の結果から明らかなように、グルコアミラーゼｃＤＮＡ
が移入された形質転換体（Ｂ）においては、グルコアミ
ラーゼが検出された。なお、この形質転換体（Ｂ）は、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ｃＧＬＢ−０１と命名し、これを工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８２７として寄託し
た。
【００３６】
【表６】
【００３７】
【実施例６】 ノザン解析によるグルコアミラーゼ遺伝子の発現様式の
検討
検討
【００３８】実施例４記載と同様に米麹からｔｏｔａｌ
ＲＮＡを抽出しノザン解析によりグルコアミラーゼの発
現について検討した。同一菌株を３％デンプン、１％ポ
リペプトンを含むツァペックドックス液体培地にて、振
とう培養し、得られた菌体より同様な方法にてＴｏｔａ
ｌＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをそれぞれ２０μ
ｇをＣｕｒｒ．Ｃｅｎｅｔ，２２，８５−９１（１９９
２）に記載の方法にて、変性アガロース電気泳動しナイ
ロンメンブレンにブロット後、グルコアミラーゼ断片を
プローブとしたノーザンハイブリダイゼーションを行っ
た。
ＲＮＡを抽出しノザン解析によりグルコアミラーゼの発
現について検討した。同一菌株を３％デンプン、１％ポ
リペプトンを含むツァペックドックス液体培地にて、振
とう培養し、得られた菌体より同様な方法にてＴｏｔａ
ｌＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをそれぞれ２０μ
ｇをＣｕｒｒ．Ｃｅｎｅｔ，２２，８５−９１（１９９
２）に記載の方法にて、変性アガロース電気泳動しナイ
ロンメンブレンにブロット後、グルコアミラーゼ断片を
プローブとしたノーザンハイブリダイゼーションを行っ
た。
【００３９】今回取得されたグルコアミラーゼ遺伝子を
プローブとした場合、固体培養から抽出したＲＮＡには
非常に強いシグナルが検出されたが、デンプン培地での
液体培養ではほとんどシグナルは検出されなかった。一
方既にクローニングされているアスペルギルス・オリゼ
ーのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）をプローブと
した場合、固体培養、液体培養ともシグナルが認められ
た。しかし固体培養でのシグナルは今回クローニングさ
れたグルコアミラーゼ遺伝子のものと比較して、非常に
弱いものであった。よって固体培養では今回取得された
グルコアミラーゼ遺伝子が優先的に発現しているものと
考えられた。以上の結果よりこの新規グルコアミラーゼ
遺伝子は固体培養で特異的、かつ強力に発現する遺伝子
であることが確認された。
プローブとした場合、固体培養から抽出したＲＮＡには
非常に強いシグナルが検出されたが、デンプン培地での
液体培養ではほとんどシグナルは検出されなかった。一
方既にクローニングされているアスペルギルス・オリゼ
ーのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）をプローブと
した場合、固体培養、液体培養ともシグナルが認められ
た。しかし固体培養でのシグナルは今回クローニングさ
れたグルコアミラーゼ遺伝子のものと比較して、非常に
弱いものであった。よって固体培養では今回取得された
グルコアミラーゼ遺伝子が優先的に発現しているものと
考えられた。以上の結果よりこの新規グルコアミラーゼ
遺伝子は固体培養で特異的、かつ強力に発現する遺伝子
であることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】本発明によって、米麹で発現するグルコ
アミラーゼ遺伝子およびｃＤＮＡのクローニングに成功
し、その塩基配列も解明された。また本発明において
は、クローニングされた上記遺伝子をベクターに挿入し
て宿主の形質転換を行うことにも成功したものである。
したがって、得られた形質転換体を培養することにより
グルコアミラーゼを著量生産することができる。
アミラーゼ遺伝子およびｃＤＮＡのクローニングに成功
し、その塩基配列も解明された。また本発明において
は、クローニングされた上記遺伝子をベクターに挿入し
て宿主の形質転換を行うことにも成功したものである。
したがって、得られた形質転換体を培養することにより
グルコアミラーゼを著量生産することができる。
【００４１】たとえばグルコアミラーゼ遺伝子をアスペ
ルギルス・オリゼーに導入した形質転換体では、米麹に
おいてもグルコアミラーゼのみを著量生産することがで
きる。酒類の製造やアルコール発酵において、発酵もろ
み中のグルコアミラーゼ活性は発酵速度に大きな影響を
与えることが知られている。清酒もろみ中ではグルコア
ミラーゼ活性が不足すると酵母の発酵速度が低下し発酵
期間が増加するばかりか、清酒の重要な香味の一つであ
るエステル類の生産が顕著に抑制され最終製成酒の品質
が低下する。従ってグルコアミラーゼを著量生産する麹
を用いることはこれらの醸造物の効率的かつ高品質な生
産に大きく寄与する。
ルギルス・オリゼーに導入した形質転換体では、米麹に
おいてもグルコアミラーゼのみを著量生産することがで
きる。酒類の製造やアルコール発酵において、発酵もろ
み中のグルコアミラーゼ活性は発酵速度に大きな影響を
与えることが知られている。清酒もろみ中ではグルコア
ミラーゼ活性が不足すると酵母の発酵速度が低下し発酵
期間が増加するばかりか、清酒の重要な香味の一つであ
るエステル類の生産が顕著に抑制され最終製成酒の品質
が低下する。従ってグルコアミラーゼを著量生産する麹
を用いることはこれらの醸造物の効率的かつ高品質な生
産に大きく寄与する。
【００４２】またグルコアミラーゼｃＤＮＡを導入した
形質転換体酵母はデンプンなどの高分子の糖質を資化し
アルコール発酵を行うことが可能である。よってデンプ
ンから直接アルコールを製造したり、穀類原料から直接
酒類を製造することができる。これは当該発酵産業の効
率化に大きく寄与する。
形質転換体酵母はデンプンなどの高分子の糖質を資化し
アルコール発酵を行うことが可能である。よってデンプ
ンから直接アルコールを製造したり、穀類原料から直接
酒類を製造することができる。これは当該発酵産業の効
率化に大きく寄与する。
【００４３】
【配列表】本発明に係るアスペルギルス・オリゼーの新
規グルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示
し、そのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。下記
表１〜４に、配列番号１〜２で示される各配列を示す。
規グルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示
し、そのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。下記
表１〜４に、配列番号１〜２で示される各配列を示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
【図１】本発明に係るアスペルギルス・オリゼーのグル
コアミラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
コアミラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図２】そのｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図３】プラスミドｐＮＧＢ−１の作成法及び制限酵素
地図を示す。
地図を示す。
【図４】プラスミドｐＹＧＢ−１の作成法及び制限酵素
地図を示す。
地図を示す。
【図５】オリゴＤＮＡプローブ（Ｎｏ．１及びＮｏ．
２）を示す。
２）を示す。
【図６】ＰＣＲ用プライマー（Ｐ１及びＰ２）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 9/34 9/34 Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｐ 7/06 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/34 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/34 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 杉並 孝二 城陽市寺田宮の谷５−52 (72)発明者 今安 聰 京都市伏見区桃山筑前台町６
Claims (9)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１の塩基配列で示さ
れ、アスペルギルス・オリゼーから単離したグルコアミ
ラーゼ遺伝子のプロモーター及び／又は蛋白質コード領
域を含む塩基配列を有するＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号２の塩基配列で示され、アスペ
ルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼｍＲＮＡから合
成したｃＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項第１項記載のＤＮＡを含んだアス
ペルギルス・オリゼーのベクター。 - 【請求項４】 請求項第２項記載のｃＤＮＡを含んだサ
ッカロマイセス・セレビシアエのベクター。 - 【請求項５】 請求項第３項記載のベクターをアスペル
ギルス・オリゼーに移入することによって得られたグル
コアミラーゼ酵素生産が上昇した形質転換体。 - 【請求項６】 請求項第４項記載のベクターをサッカロ
マイセス・セレビシアエに移入することによって得られ
るグルコアミラーゼを生産する形質転換体。 - 【請求項７】 請求項第５項又は第６項に記載の形質転
換体を使用することを特徴とするアルコール及び／又は
酒類の製造方法。 - 【請求項８】 請求項第５項又は第６項に記載の形質転
換体を培養し、培養物からグルコアミラーゼを採取する
ことを特徴とするグルコアミラーゼの製造法。 - 【請求項９】 該形質転換体を固体培養することを特徴
とする請求項第８項に記載のグルコアミラーゼの製造
法。
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Applications Claiming Priority (1)
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ID=17448349
Family Applications (1)
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| JP26770196A Expired - Lifetime JP3759794B2 (ja) | 1996-09-19 | 1996-09-19 | 新規遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体及びその利用 |
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| JP (1) | JP3759794B2 (ja) |
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2001046078A (ja) * | 1999-06-01 | 2001-02-20 | Gekkeikan Sake Co Ltd | タンパク質の高発現システム |
| JP2006211966A (ja) * | 2005-02-04 | 2006-08-17 | Takara Shuzo Co Ltd | 新規麹菌及びその用途 |
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-
1996
- 1996-09-19 JP JP26770196A patent/JP3759794B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| US6558920B1 (en) | 1999-06-01 | 2003-05-06 | Gekkeikan Sake Company Limited | High expression system of proteins |
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| JP2012157315A (ja) * | 2011-02-02 | 2012-08-23 | Gekkeikan Sake Co Ltd | ラクダ科動物抗体の重鎖可変ドメイン（ｖｈｈ）の生産方法 |
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