JPS6394981A - トリコダ−マの形質転換 - Google Patents

トリコダ−マの形質転換

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JPS6394981A
JPS6394981A JP62104838A JP10483887A JPS6394981A JP S6394981 A JPS6394981 A JP S6394981A JP 62104838 A JP62104838 A JP 62104838A JP 10483887 A JP10483887 A JP 10483887A JP S6394981 A JPS6394981 A JP S6394981A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、トリコダーマの形質転換に使用するためのベ
クターシステム、上ユニ久二ヱにおけるタンパク質の高
レベルでの発現及び分泌のための方法、ＤＮＡ組換え体
ベクター及び形質転換されたトリコダーマ菌株に関する
。
〔発明の背景〕
繊維状菌類は、種々の発酵生成物を製造するために生物
工学に広く使用される下等真核生物である。菌類は多く
の工業的に重要な酵素、たとえばグルコアミラーゼ、プ
ロテアーゼ、ラクターゼ、ペクチナーゼ及びグルコヒド
ロラ−ゼを分泌する。
繊維状菌類は多くの生物工学的利点を存する。
それらは一般的に高い量のタンパク質を産生し、大規模
での培養は複雑でなく、そして発酵の後、培養液体から
の菌糸体の分離が容易である。
中温性不完全菌頻上ユニ久ニヱ　リーセイ〔以前は工、
ビリデ（工、　ｖｉｒｉｄｅ）　）　　（参照１）は、
セルロースバイオマスの転換に必要とされる酵素を産生
じ、そしてたぶん最っとも広く研究されたセルラーゼ産
生生物である。
セルロースのグリコースへの加水分解のためには、３種
のタイプの酵素活性が必要とされる；通常、置換された
可溶性基質を攻撃し、そして結晶性セルロースに親和性
を示さない、ランダム切断性エンドグルカナーゼ（１，
４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ、ＥＣ，３
，２，１，４）；結晶性セルロースを分解することがで
きるが、しかし誘導体化されたセルロースに対する活性
を持たないセルロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−
グルカン　セルロビオヒドロラーゼ、ＥＣ，３゜２．１
．９１）及びグルコースを得るためにセロビオース及び
セローオリゴ糖を攻撃するβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ
−グルコシド　グルコヒドロラーゼ、ＥＣ，３，２，１
，２１）。いくらかのこれらの酵素間の相乗作用が示さ
れた（参照２〜４）。
菌類のセルラーゼが精製され、そして特徴づけられ、そ
してすべての３種の主要タイプの酵素は、多種の形で存
在することが示された（参照５）。
２つの免疫学的に異なるセルロビオヒドロラーゼ、すな
わちＣＢＨＩ及びＣＢＨＩＩは、工、ユニ立不の培養培
地から検出された（参照４．６）。５〜８の電気泳動的
に異なるエンドグルカナーゼが報告され、それらの多く
は、基質特異性を変えることを示した（参照７．８．９
．１０）、２つの細胞外β−グルコシダーゼの特徴化が
報告された（参照１１）。
突然変異及びスクリーニングの直接的アプローチを用い
て開発された多くの菌株は、いくつかの高収率の工、ユ
ニー１＝４突然変異株を好結果をもたらして産生した（
参照１１〜２２）。最良の工、見二旦突然変異体によっ
て産生された細胞外タンパ。
り質の量は、培養流体１１当り２０〜３０ｇであり、こ
れは合計細胞タンパク質の５０％以上である。
分泌されたタンパク質の主要部分は、セルラーゼを含み
、そしてその間には、ＣＢＨＩ成分が最っとも豊富であ
り、そして分泌されたセルラーゼタンパク質の６０％ま
で示す。
ＣＢ）ｌ　Ｉのための遺伝子は、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒな
ど（参照２３）及びＴｅｅｒｉなど（参照２４）によっ
てクローンされ、そして該遺伝子の完全なヌクレオチド
配列は公表されている（参照２３）。工、北二五からま
た、主なエンドグルカナーゼＨＧＴのための遺伝子がク
ローンされ、そして特徴づけられた（参照２５　、２６
　、２７）。他の単離されたセルラーゼ遺伝子はρ声２
（参照２８　、２９＞及び」１３（参照３０）である。
産業的に重要な繊維状菌類の分子生物学は、一般的に良
く知られていない。これは一部、有性生殖サイクル及び
／又は遺伝的な形質転換システムの不十分な認識による
。最近、形質転換システムが１．木りｏ７．ポラ−文豆
並（参照３１）、人、三乏工立ｌ久（参照３２　、３３
　、３４）及び人、ニガー（Ａ　、　恒ｌ猛）参照３５
）のために開発され、そしてそれらは、ベクター分子に
よって担持されるそれぞれの機能性遺伝子により突然変
異宿主の相補性においてそれらの主成分を一般的に有す
る。
しかしながら、これらの菌類の中で人、ニガーのみが当
座は、産業的興味の対象である。
菌類の分類において、属１ｊ（≦男盛Ｌ）２２は、綱ア
スコマイセテイス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）　、サブ
クラスユーアスコマイセテイス（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅ
ｔｅｓ）に含まれる。ユーアスコマイゼティスは、子実
体に基づいて３つの群、すなわちプレクトマイセーイス
（Ｐｌｅｃｔｏｍ　ｃｅＬｏｓ）　、ピレノマイセテイ
ス（ハエ凹！旺藏士狙）及びジノ≦Ｅ４歪ｊｊし仁入（
肚匹旦と１競）に分けられる。最っとも重要な属は、ヱ
久ユ夾２立ス及び玉三之ユヱ人（参照５６）である。代
わりに、上ユニ久二ヱが不完全菌類のメンバーとして分
類される。不完全菌類は、有性生殖又は有性生殖属との
明確な類似性を持たない菌類、たとえばひじょうに特徴
的なアスペルク立久のキャッチ−オール　カテゴリーで
ある。
−Ｌ±コｊ−ニヱは、完全なアスコマイセティス種二イ
ポクレア（打匹肛競）　（参照５７）の不完全状態であ
る不十分に定義された生殖段階を有することを報告され
たけれども、属ヱメ！９諭と１入及び上ユニ久ニヱは明
らかに、分類学上ひじょうに異なると思われる。アスペ
ルジラス　三乏玉立ヱ久からのＪ」］−遺伝子及び４泣
」５（茎孟　文立孟からのｍ遺伝子は、非ストリンジェ
ント条件下でそれぞれの−Ｌユｐ）−二Ｚ−の遺伝子に
ハイブリダイズせず、従ってトリコダーマは他のアスコ
マイセ土ス（ル匹μＵ旦耐旦幻−と進化論的にまったく
異なるという考えを推定できることもまた示された（Ｖ
ａｎａｎｅｎ、　Ｓ、、調製において）。
増殖培地中にタンパク質を分泌する、その例外的能力に
よって、−り史２ｊ−ニヱ　リーセイは、タンパク質の
産生のための可能な宿主として良好な候補者であると思
われる。しかしながら、これまでは、ヱ、ユニ皇土の遺
伝研究は、該菌類のセルラーゼ産生特性を改良すること
にほとんど向けられ、そしてハイパーセルロチツク（Ｈ
ｙｐｅｒ−ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃ）上ユ且交ニヱ菌株の
開発のために使用される技術は、単に従来の突然変異生
成及びスクリーニングであった。上１ユ久ニ二のための
形質転換システムは、今まで開発されていない。
上エユ久ニヱ　ユニ土工のための有効な宿主−ベクター
システムを提供し、上ユニｌニス中に異質のタンパク質
の高い発現及び分泌レベルを得、又は同質のタンパク質
の産生を高めることが本発明の主な目的である。
本発明の明細書において、表現“上ユ且ダニヱに異質の
タンパク質゛とは、上ユニ久ニヱによって天然に産生さ
れないタンパク質を意味し、とこロカ“上ユニ交ニヱに
同質のタンパク質”とは、上ユニ久二ヱ自体によって産
生されるタンパク質を意味する。
初めに開発された菌類の形質転換システムにおいて、す
なわち−アノばＳ四個Ｌプクヨ及び２木り」じ（ポラ−
においては、形質転換がプロトプラストを用いて行なわ
れる。形質転換性ＤＮＡが通常、宿主のゲノム中に組込
まれる。安定した形質転換体を同定するための選択シス
テムを得るためには、ベクターシステムが、宿主ゲノム
の対応する突然変異を補足するか、又は特定の増殖培地
上での原栄養株の増殖のために必要な活性、通常酵素を
供給する機能的な遺伝子（選択マーカー）を担持すべき
かである。
〔発明の要約〕
本発明は、−ヒルコノ（二ニーの形質転換のための組換
え体ＤＮＡクローニングベクターシステムを記載する。
このＤＮＡクローニングベクターシステムが目的とする
タンパク質生成物をコードするＤＮＡ配列を含有する場
合、本発明のベクターシステムによる上ユ旦しニヱの形
質転換は、形質転換された微生物が適切な培養培地中に
おいて増殖される場合、目的とするタンパク質の高レベ
ルの発現及び分泌を提供するであろう。
その第１の観点によれば、本発明は、 ａ）目的とするタンパク質生成物をコードする遺伝子、 ｂ）目的とする生成物の発現を制御するために機能可能
的に結合されたプロモーター／エンハンサ−を含む遺伝
子発現を促進する機能、Ｃ）場合によっては、目的とす
る生成物のために該遺伝子の５′末端の上流に融合され
たシグナル／リーダー配列及び ｄ）選択マーカーを含んで成るベクターシステムを提供
する。
その第２の観点によれば、本発明は、上ユニ１ニヱの形
質転換のための方法を提供し、ここで適切な上ユ旦ｔニ
ヱ菌株が本発明のベクターシステムにより形質転換され
る。
その第３の観点によれば、本発明は、本発明のベクター
システムにより−Ｌ並ｊノにニーを形質転換し、該形質
転換された菌株を適切な培地中で培養し、そして発現さ
れ、そして分泌された生成物を該培地から回収すること
を含んで成る、上エユ久ニヱにおけるタンパク質の産生
のための方法を提供する。
本発明はまた、ｔ−ＩＪ≦Ｌダ：コニ中にタンパク質の
産生のための方法も提供し、この方法によって、ベクタ
ーシステムにより形質転換された上ユニ交ニヱ菌株は、
適切な培地中で培養され、そして発現され、そして分泌
されたタンパク質が該培養培地から回収される。
本発明はざらに、安定して形質転換されたＵユ久ニヱ菌
株を提供する。
本明細書に使用される場合、“ベクターシステム”とは
、宿主ゲノム中に組込まれるべきＤＮＡ−情報を共に含
む単一のベクター又はプラスミドもしくは複数のベクタ
ー又はプラスミドを含む。
該ベクター又はプラスミドは、線状又は閉環状分子であ
る。上ユニ久ニヱ中における自己複製プラスミドは現在
知られていないが、本発明はまた、のちに見出されるに
ちがいない、そのような自己複製プラスミドも包含する
。
本発明のベクターシステムは、プロモーター、エンハン
サ−及び転写開始部位並びにターミネータ−を含む遺伝
子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ−配列、形質
転換体の選択のためのマーカー及び目的のタンパク質を
コードするＤＮＡ配列を含んで成る。
発現された生成物の分泌を確保する・ために、目的とす
る生成物のための遺伝子は、好ましくは、細胞の分泌路
中に、発現された生成物の有効な方向を確保する前領域
を提供される。この前領域（天然に存在するシグナル又
はリーダーペプチドもしくはその一部である）は一般的
に、分泌の間、目的の生成物から切断され、この後、そ
の成熟した生成物は、培養培地から単離され得る。
目的とする生成物のための遺伝子は、ゲノム遺伝子又は
ｃＤＮＡクローンから得られる。ＤＮＡ−配列はまた、
合成され得る。
シグナル／リーダー配列は、目的とするタンパク質をコ
ードする遺伝子のシグナル／リーダー配列に由来し、又
は上ユニ久二ヱ又は他の生物源のいづれかからの他の分
泌されたタンパク質のための遺伝子に由来する。−Ｌ■
２ノ６二１−によって分泌されるタンパク質をコードす
る遺伝子に由来するシグナル／リーダー配列の例は、０
九上シグナル配列又はｍ上シグナル配列又はその一部で
ある。
−り隻λｊ６二１−に異質の分泌されたタンパク質をコ
ードする遺伝子に由来するシグナル／リーダー配列は、
７７＜）Ｌｔ’；−７ヨのアミラーゼ又はグルコアミラ
ーゼのための遺伝子に由来する。また合成シグナル／リ
ーダー配狗も使用され得る。
プロモーターは、−ト四】ノロ：ニー中に転写活性を示
すＤＮＡ配列であり、そして−ト■１ノに１−に同質か
又は異質の遺伝子に由来することができる。
トリコダーマに同質のタンパク質をコードする遺伝子に
由来するプロモーターの例は、ＣＢＩＩ　Ｉプロモータ
ー又はＥＧＩプロモーターもしくはその一部である。−
ヒュ≦しダ：ゴ乙に異質のタンパク質のための遺伝子に
由来するプロモーターの例は、アスペ及り立ムのグルコ
アミラーゼ　プロモーターである。転写ターミネータ−
は、プロモーターと同じ源に由来する。また合成プロモ
ーター又はターミネータ−配列も使用され得る。
特別に言及されたすべてのＤＮＡ配列は、コードされた
生成物の機能に不可欠な塩基の数個を補正又は欠失する
ことによって変性され得ることが理解され、そしてそれ
は当業者にとっては明らかである。たとえば、ｃｂｈ　
１又はｌｉ上シグナル又はプロモーター配列に実質的に
類似するＤＮＡ配列は、それらが上ユニ交二ヱ中におい
て意図された機能を示すかぎり使用され得る。また目的
とす、るタンパク質のための遺伝子は、これがタンパク
質の活性に対して悪影響を持たないかぎり、変えられ得
る。
異なった選択マーカー、たとえばと１ｌ（Ａ。
上ｙ）己と孔入又は工、ニー−１−±）、ａｎ＋止ｉ（
人。
工とツ、ヨとｚ２工）及びｍ（ネウロスポラ　旦−サー
又は工、エニ皇土）が使用され得る。
宿主菌株は、形質転換方法に使用される選択マーカーに
依存して、原栄養性又は栄養要求性上１ユ久二ヱ菌株で
ある。本明細書の実験部分に示されているように、人、
三ｊ）己と乙入からの堕止ジ遺伝子は、原栄養性■、リ
ーセイの形質転換のために使用され得る。工、ユニーｔ
−４は単一の窒素源としてアセトアミド上で完全に増殖
せず、そしてその増殖は培地上にＣｓＣ１２を添加する
ことによってさらに阻害され得る。従って、ＣｓＣｌの
存在下で単一の窒素源としてアセトアミド上での増殖は
、ａｉｄ　Ｓ　”形質転換体を同定するために選択培地
として使用され得る。
宿主ゲノムの対応する突然変異を相補する選択マーカー
が使用される場合、栄養要求性上丈ユ久二ヱ突然変異体
が構成されるべきである。栄養要求性上ユニ久二ヱ突然
変異体は、突然変異株を産生ずるための既知方法によっ
て製造され得る。
増殖のためにウラシル、トリプトファン又はアルギニン
を必要とする栄養要求性上ユニＬニヱ突然変異体は、Ｎ
ｅｖａｌａｔｎｅｎ　（参照３６）によって記載されて
いるようにして、濾過濃縮技法（ｆ　ｉｌ　ｔｒａｔｉ
ｏｎｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によ
って単離された。アルギニン要求性栄養要求体から、ｍ
遺伝子を欠失する突然変異体が、アルギニン生合成にお
いて異なった中間体によって供給される一連の最少プレ
ートを用いることによって同定された。ウラシル要求性
突然変異体から、ｍ遺伝子を欠失する菌株を、菌糸体調
製物（参照３７）においてオロチジン−５′−ホスフェ
ートデカルボキシラーゼ（ＯＭＰ　ｄｅｃａｓｅ）の活
性を測定することによって見出すことができる。
封且上遺伝子欠失の突然変異体は、それらの菌糸体にお
けるＰＲＡイソメラーゼ−ＩｎＧＰシンセターゼ活性の
欠失によって特徴づけられる（参照４０）。酵素活性を
示さない突然変異体の旦１上−特性は、たとえばＮ、ク
ラサの１１」−プラスミド（参照４１）又・は人、三ｊ
）郵と孔入の旦Ｌｑ−プラスミド（参照３４）による形
質転換及び相補性によって確認され得る。
使用される形質転換技法は、人工三乏上旦ｌスの形質転
換法（参照３２　、３３）から改造された方法である。
プロトプラストは、寒天プレート上で菌糸体を増殖し、
そしてＮｏｖｏｚｙｍ９２３４の緩衝溶液中に菌糸体を
懸濁することによる既知の方法によって調製される。従
来のＮｏｖｏｚｙｍ９２３４のスクロース溶液の代わり
に、ソルビトール溶液が好都合に使用され得る。次に、
本発明の実験部にさらに詳しく記載しているようにして
、形質転換性ＤＮＡが前記プロトプラスト溶液に添加さ
れる。形質転換は普通、同時形質転換として行なわれ、
それによって、選択不可能なプラスミドがもう１つのプ
ラスミド中に挿入される選択可能なマーカー（たとえば
ｐ３ＳＲ２中へのａｎｄ　Ｓ又はｐｓａ１４３中へのＪ
」」−）を用いて高頻度で工、リーセイ中に同時形質転
換される。等モル量のＤＮＡが形質転換のために使用さ
れる場合、高い割合の形質転換体が、ゲノム中に組込ま
れた選択不可能なプラスミドを含む。担」Ｊ−ニーユニ
土工菌株が、等モル量のプラスミドｐ３ＳＲ２及びｐｓ
ａ１４３による形質転換に使用される場合、形質転換体
を、二重選択培地（最少培地、アセトアミド、ＣｓＣｌ
１）上に得ることができる。他方、単鎖のプラスミドは
、形質転換のために使用され得、ここでまた、マーカー
が挿入される。
次に、形質転換体は、適切な培地中で培養される。単純
な培地中に目的とする生成物を産生ずることができるた
めには、グルコース誘導性プロモーターが使用される。
−ヒ刀≦Ｌり〉二ニーが１％グルコースを含む培地上で
増殖される場合、プロテアーゼを含む、すべての細胞外
タンパク質の分泌が強く抑制される。目的とする酵素を
コードする遺伝子がグルコース含有性培地中において強
く発現されるプロモーターに連結される場合、目的とす
る酵素は増殖培地に分泌される。他のタンパク質はこれ
らの条件下で産生されないので、目的とする酵素は、培
地中に分泌される主なタンパク質である。
菌類の菌糸体が除去される場合、目的とするタンパク質
は、種々の純粋な形でその得られた溶液に存在する。必
要により、それはさらにひじょうに容易に、精製され得
る。なぜならば、それはほとんどタンパク質のみである
からである。
本発明はまた、宿主生物のある酵素活性を産生ずる遺伝
子を変性又は不活性化するためにも使用され得る。例と
して、セルラーゼ−陰性工、ユニーｌ−（菌株が構成さ
れ得る。この突然変異生成は、欠失されたセルラーゼ遺
伝子を担持するプラスミドによる一ヒ四コ」６二１−　
ユニ丈ヱの形質転換に基づかれる。染色体セルラーゼ遺
伝子産でのプラスミドの同質組換えは、内在性工、リー
セイ　セルラーゼ遺伝子の挿入不活性化を引き起こす、
形質転換のために使用されるプラスミドは、セルラーゼ
コード領域の一部のみを含み、そして不活性タンパク質
を産生ずる。５′を末端とする配列は含まれない。フレ
ームシフト変異がまた、切断されたコード領域に導入さ
れ得る。選択マーカー（Ｊ」」−）又はスクリーニング
のためのマーカー（ｌ　ａｃ　Ｚ　）が形質転換のため
に使用されるプラスミドに連結され得る。組換えの後、
マーカーは、２種の得られた欠陥性セルラーゼ遺伝子の
間に、配置されるであろう。その方法の原理は第１図に
示される。
本発明は、キモシン及び上ユユダニヱ　ユニ丈−ゴーの
エンドグルカナーゼＩ（ＩＩ！Ｇｌ）によって例示され
る。プロモーター、シグナル及びリーダー並びにターミ
ネータ−配列は、ヱスニ土グ立ス　三Ｘ二からのグルコ
アミラーゼ遺伝子又は上ユニ久ニヱ　ユニ土工の０九上
遺伝子のいづれかに由来した。選択マーカーとして、人
、ニジューンスからのａｍｄ　Ｓ−遺伝子が使用された
。
林−料 プラスミド： ｐ２８５　：ＡＴＣＣ２０６８１ ｐｃＡＭＧ９１　：参照５６ ｐｉｃ１９Ｒ：参照５７ ｐｓａ１４３　：参照４８　＋　５１ ｐ３Ｒ２：参照３０　＋　３２ ｐＤＪＢ２　：参照３５ ＰＭｃ１８１７　：参照４３ ｐＴＴＯｌ、ｐＴＴｌｌ　：参照２７ ｐＬｌｃ　９．ｐＵｃ１３　：参照５９ｐＵｃ１Ｂ、ｐ
Ｕｃ１９　：参照５５ 菌株： 旦、２ｉ（旦０匹旦）株、月１０１　、　ＪＭ　１０９
及びＤＨＩ（参照５９）が旦、２２Ｌ　クローニングに
おいて宿主として使用される。−１≦しグー７　　ｉ−
セイ菌株叶９４１４（ＡＴＣＣ２６９２１）及びＲＵＴ
　−Ｃ−３０（ＡＴＣＣ５６７６５）が菌類の形質転換
及び発現研究に使用される。
上ユニ久二ヱの最少培地ニ ゲルコース　　　　２ｇ ＜ＮＨａ）ｚｓＯａ　　　　　５　ｇ ＫｌＩ□ＰＯ４１５ｇ Ｍｇ５Ｏｎ　　　　　　　０．６　ｇ ＣａＣＩｌｏ、６ｇ Ｆｅ５０＊、７　Ｈ２Ｏ５ｍｇ ＭｎＳＯａ、Ｈｚｏ　　　　　１．５６ｍｇＺｎＳＯ４
＋　７８２０　　　１．４　ｍｇＣｏＣＩｔ　ｚ　　　
　　　　２■／ｌｏ、。
スニ」狡 栄養要求性工、ユニｌ突然変異菌株の誘導、濃縮及び単
離。
増殖のためにウラシル、トリプトファン又はアルギニン
を必要とする栄養要求性突然変異体を、Ｎｅｖａｌａｉ
ｎｅｎ　（参照３６）によって記載されているようにし
て、濾過濃縮法を用いて単離する。使用される突然変異
誘発剤は、紫外線である。アルギニン要求性の栄養要求
体から、ｍ−遺伝子を欠失する突然変異体が、アルギニ
ン生合成において異なった中間体によって供給される一
連の最少プレートを用いることによって同定される（参
照３６）、増殖のためにシトルリンを必要とする突然変
異体は、可能性あるｉ！Ｊｆｉ−突然変異体として考慮
される。単離された突然変異体のａｙ、　Ｂ　−特性は
、人、三図玉ｉｌ囚の但」」−遺伝子（例４）を含むプ
ラスミドｐＳａ１４３を用いて原栄養体中にそれらを形
質転換することによって確認される。
ウラシル要求性突然変異体から、ｍ遺伝子を欠失する菌
株が捜し求められる。
これらの突然変異体のυＬ１−特性を、Ｎ、り旦のｐｙ
ｒ　４遺伝子（参照３８）を含むプラスミドによる形質
転換によって確認した。
プロトプラストの調製。
菌糸体をポテトデキストロース寒天プレート（Ｄｉｒｃ
ｏ）上のセロファン　ディスク上で増殖する。
５枚のセロファン培養物からの菌糸体を、０．１Ｍリン
酸カリウムによりｐＨ５，６で緩衝化された、１．２Ｍ
ソルビトール中Ｎｏｖｏｚｙｍ＠　２３４の５■／−溶
液１５ｒＲ１中に懸濁する。その混合物を３０℃で１．
５〜２時間、インキュベートする。焼結ガラス濾過（多
孔度１）により菌糸体破壊物がらプロトプラストを分離
し、４０００　ｇで５分間ペレット化し、そして１．２
Ｍソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ　、　ｆｌ（Ｊ！
（ｐ）Ｉ　７．５　）溶液により２度洗浄する。
プロトプラストのより良好な精製は、Ｔｉ１ｌｂｕｒｎ
など（参照３３）によって記載された方法を用いること
によって達成され得る。ＰＨ５，８で緩衝化された、１
．２　ＭのＭｇ５Ｏ，中、ＮｏｖｏｚｙｍＯ２３４の５
■ｌｔｒｉｍ液を、プロトブラスティングのために使用
する。インキュベーション及び濾過の後、そのプロトプ
ラスト懸濁液を、０．６Ｍソルビトール−１００１１Ｍ
のＴｒｉｓ　、　ＨＣｊ！　（ｐＨ７，０）の等体積と
共に４０００　ｇで１５分間、遠心分離する。プロトプ
ラストは、管の中間に鋭いバンドを形成する。そのプロ
トプラストを、１．２Ｍソルビトール−１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ　。
ＨＣ１溶液（ｐＨ７，５）１体積中に懸濁し、回転沈殿
せしめ、そして１．２Ｍソルビトール−１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ　、　ＨＣｊ！溶液（ｐＨ７，５）により２度洗浄
する。
そのプロトプラストを、５Ｘ１０ｂ〜５Ｘ１０’個のプ
ロトプラスト／ａｆの濃度で、１．２Ｍソルビトール−
１Ｏｎ＋ＭのＣａＣ１ｚ　−１０ｍＭのＴｒｉｓ　、　
ＩＩＣｊ！　’を容液（ｐＨ７，５）中に懸濁する。
プロトプラストの生存率を、浸透圧安定剤として１Ｍソ
ルビトールを含む上ユニ交二ヱの最少培地上で評価する
。その再生頻度は、菌株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２６９
２１）のためには４０〜８０％である。
肪り−１ 人、三茗五ｉｌ入のアセトアミダーゼ道組旦）を用いて
工、ユニ皇工の形質転換。
プラスミドｐ３ＳＲ２を、形質転換に使用する。それは
、完全なアセトアミダーゼ構造遺伝子ａｎｄ　Ｓ及びそ
の調節領域す止１を担持する人、ニジュラヱ久ＤＮＡを
含む（参照４５及び３３）。
形質転換性ＤＮＡ２０ＩＩｌ（４〜１０■）を、プロト
プラスト溶液２００Ｉ中に添加する。２５％ＰＥＧ　６
０００−５０ｍＭのＣａＣ１ｚ　　１０＋ｓＭのＴｒｉ
ｓ　、　１ｌ（Ｊ！温溶液ｐＨ７，５）５０ｍを添加し
、そしてその混合物を、氷上で２０分間、インキュベー
トする。ＰＥＧ溶液２−を添加し、そしてその混合物を
、室温でさらに５分間、インキュベートする。１．２Ｍ
ソルビトール−１０ｍＭのＣａＣ１ｚ−１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ　、　ｏｃｚ溶液（ｐＨ７，５）　　４ｍｊを添加
し、そしてそのプロトプラストを３％寒天表面上にプレ
ートする。その選択培地は、（ＮＨｔ）ｚｓＯ４の代わ
りに単一の窒素源として１０ｍＭアセトアミドを有する
上１最少培地であり、そして浸透圧安定剤として１Ｍソ
ルビトール及びバックグラウンド増殖を抑制するために
１２．５ｍＭのＣｓＣｊｌ！により補充される。
４０〜６００個の形質転換体／　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｎの形質
転換頻度を、菌株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２６９２１）
のために得る。
最っとも高い頻度は、ＤＮＡが２サイクルのＣｓＣ１／
工チジウムプロミド遠心分離により精製される場合に得
られる。
胞子形成は選択培地上ではめったに観察されないが、し
かしポテト　デキストロース寒天に移される場合、通常
、その形質転換体は胞子形成する。
アセトアミド上で増殖するそれらの能力は多様である。
選択培地上でのコロニイーの直径は、１１１以下から１
０〜２０ｍｍの範囲である。
形質転換体の有糸分裂安定性を調べた。種々のサイズの
１０個の大きな形質転換体を、アセトアミド−ＣｓＣｊ
！プレート上に継代培養し、ポテトデキストロース（Ｐ
　Ｄ）上に胞子形成し、そしてＰＤ上に再プレートした
。ヘテロ力リオシスによって引き起こされた異質性（ｈ
ｅｔｅｒｏｇｅｉｌｅｉ　ｔｙ）を除くために、１つの
胞子から生まれる個々のコロニイーをＡｔａｄＳ＋表現
型について試験した。おのおのの元の形質転換体からの
１つの陽性クローンを、非選択性培地上で連続プレーテ
ング（５増殖サイクル）にゆだね、そしておのおのの世
代の後、表現型を選択培地上で試験した。１つのサイク
ルの後、１０個の大きな形質転換体を非選択培地上で試
験し、その１０個の形質転換のうち６個は１００％のＡ
ｍｄ　Ｓ″分生子を与え、３個は４７〜８７％の分生子
を与え、そして１一つの形質転換体は、Ａｍｄ　Ｓ　”
分生子を与えなかった。この結果は、５つの非選択性増
殖サイクルを通して同様のままであり、初めの不安定な
Ａｍｄ　Ｓ　”表現型が後で安定化され得ることを示唆
した。
元の１０個の小さなコロニイーのうち、３個は、種々の
頻度のＡｍｄ　Ｓ　”表現型を有する胞子を与えた（９
４％、４４％及び５％の胞子）。他の７個のクローンは
、アセトアミド上で増殖し得ない胞子のみを与えた。興
味あることには、得られたすべてのＡｍｄ　Ｓ＋は、大
きなコロニイーの形質転換体の特徴を有する、活発な増
殖をアセトアミドプレート上で示した。
形質転換体におけるプラスミドＤＮＡの存在を全ＤＮＡ
のサザン法によって分析し、形質転換体がら単離しくＲ
ａｅｄｅｒ及びＢｒｏｄａに従って、参照４４）、Ｘｈ
ｏ　Ｉ又はＳａｊ！Ｉ及びＥｃｏＲＩにより切断した。
ベクターｐＵｃ１８及びプラスミドｐ３ＳＲ２のａｍｄ
Σ遺伝子を含む５ａｌｌｌ−ＥｃｏＲＩフラグメントを
、プローブとして使用する。その形質転換体は、上ユニ
久ニヱのゲノムＤＮＡ中の多くの異なった部位で、すな
わちゲノム当り１一数個のコピイーでの組換えによって
生じることが示された。
■−１ 人、ニジューンス及び−Ｎ−、、Ｌ２ｉのプラスミドに
よる工、リーセイの形質転換。
異質ＤＮＡによる栄養要求性突然変異の相補性を工、ユ
ニ土工において示す。Ａ６士ユし、ブック、からの肛ｌ
Ｗ遺伝子を含むプラスミドｐｓａ１４３を使用して、工
、リーセイの現」」ニー突然変異体株を形質転換する。
Σ、−タ」ヒｉからのツエ土遺伝子を含むプラスミドｐ
ＤＪＢ　２を用いて、工、リーセイのｕＬ土−突然変異
体株を形質転換する。その形質転換体を、アルギニン又
は３０ｎ／ｍｌウラシルを含まない最少培地上でそれぞ
れ選択した。両者の場合の形質転換の頻度は、約３００
個の形質転換体／ＤＮＡ鱈である。
染色体ＤＮＡを、その形質転換体がら単離し、そしてサ
ザン　ハイブリダイゼーション実験のために使用し、工
、ユニｉ−（の染色体ＤＮＡ中へのプラスミドＤＮＡの
正しい組込みを確めた。
複数のタンデムコピーのｐＳａβ１４３を、ゲノム中に
組込んだ。サザン及びドツト　プロット　ハイブリダイ
ゼーションは、分析された形質転換において、倶」」−
のコピー数がおよそ２〜１００以上異な以上色を示した
。ＡｒｇＢ”形質転換体は、少なくとも３世代を通して
、表現型的に１００％安定していることが示された。こ
れは、完全培地上で５個の形質転換からの分生子の連続
プレーテングによって試験し、そしてその後、最少培地
（５０〜８０個のコロニイー／形質転換体）上でＡｒｇ
”表現型を試験した。
別−ｊ− Ｖ吐Σ及びとｌ几プラスミドによる工、ユニ！凱瓜の同
時形質転換。
非選択性プラスミドにより上ユニ久ニヱを同時形質転換
するための可能性は、アルギニン栄養要求性変異体によ
り最初に示された。
Ｊ」」−工、ユニ土工株を、等モル量の人、三ジｊ２Ｌ
乙入プラスミドｐｓａ１４３　（現」Ｊ−）及びｐ３Ｓ
Ｒ２（ａｍｄ　Ｓ　）により形質転換し、形質転換体を
＾ｒ　ｇ　（ｊ表現型について選択し、そしてアセトア
ミド−ＣｓＣ１−プレート上で画線培養することによっ
てａｍｄｓの取得について試験した。釘１ｗ形質転換体
のうち、８６％がまたＡｍｄＳ’であった。同時形質転
換体のサザン分析は、両プラスミドが、ゲノム中のいく
つかの異なった位置に種々の量のコピーとして組込まれ
たことを指摘した（データは示されていない）。
アセトアミド−ＣｓＣ１２最少培地上での二重選択は、
ＤＮＡｆｉ当り約１００個のＡｍｄ’Ａｒｇ”形質転換
体及びａｍｄΣ形質転換の特徴を示す多くの小さなコロ
ニイーをもたらした。
川１　と吐Σ同時形質転換体のＡｒｇＢ”表現型の安定
性を試験する場合、５個のうち３個が１００％安定して
いると判明され、ところが他は、分析された子孫の７％
又は８０％においてＡｒｇＢ”特性を失っていた。同じ
個々のコロニイーはまた、Ａｍｄ　３０表現型も失なっ
ていた。この不安定性が、たとえば、同じ染色体位置へ
のａｍｄ二と共に但」」工の同時組込みによって引き起
こされたかどうかは、知られていない。
Ｅ　、　二ユ９１　ａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＡ
Ｎ５−４１Ｂがプロモーターに位相が一敗して結合し、
そして人、ニジュランスのグリセルアルデヒデホスフェ
ート　デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＪＪＬＬ）（参照６２
）のＮ−末端タンパク質コード領域をまた同時形質転換
のために使用した。さらに、このプラスミドは、人、玉
乏ｊ郵り４五の倶」」−遺伝子及びｐＢＲ３２２配列を
含む。原栄養性工、悲二ｌ（（０Ｍ９４１４）を、プラ
スミドｐ３ＳＲ２（印±影）及びｐＡＮ５−４１Ｂによ
り同時形質転換し、形質転換体をＡｍｄ”表現型につい
て選択し、そしてＸｇａ　Ｉｔを含むアセトアミド−Ｃ
ｓＣｌ−プレート上でβ−ｇａ１発現についてスクリー
ンした。グルコースが培地中に存在し、そしてＸｇａｌ
プレートのｐＨが中性である場合、内在性工、リーセイ
のβ−ガラクトシダーゼ活性は検出され得なかった。
１〜４日の増殖の後、青色が見られた。１．０１０、７
のモル比のプラスミド（ｐ３ＳＲ２／ｐＡＮ５−４　Ｉ
Ｂ）を形質転換に使用する場合、１３％の大きなＡｍｄ
　”クローン及び６％の小さなＡｍｄ“クローンがβ−
ガラクトシダーゼ活性を示し、そして１．０　／　２．
６モル比で、３９％及び７％のＸｇａ　１＋クローンが
それぞれ得られた。青色を示す／Ｉｗｄ”形質転換体に
おける両プラスミドの存在は、サザンハイプリダイゼー
ションによって確められた（データは示されていない）
。
劃−」− 劇団１　上ユニ久ニヱ、悲二皇土株の構成。
記載された方法による異なったセルラーゼ遺伝子の活性
化は、特定の組合せの劇止１−株を産生する一連の工、
ユニーｔ１株の構成を可能にする。
α虫１−株はまた、山１プロモーターを用いる場合、異
質タンパク質の有効な産生のためにも重要である。上」
≦すにヱ　北二土工株ＱＭ９４１４　（ＡＴＣＣ２６９
２１）は、小１特異性プローブを用いるサザンハイプリ
ダイゼーションによって小１遺伝子の１つの染色体コピ
ーのみを含むことが示され、そしてその結果、１回の組
換え結果が、その遺伝子を不活性化すべきである。不活
性遺伝子を次のようにして構成した。ベクターｐＵｃａ
中の劇止１遺伝子の完全な長さのｃＤＮ＾クローンを含
むプラスミドｐＴＴＯ１（参照２７）を、制限酵素Ｂｇ
ＩＩＩ及びＢｇ／Ｉｆにより切断した。小１遺伝子の５
′末端領域からの０．８Ｋｂフラグメントを、従来の技
法によって、アガロースゲルから単離した。そのフラグ
メントを、Ｓ１ヌクレアーゼを用いてプラント末端化し
、そしてそれを、ＥｃｏＲＴにより切断され、プラント
末端化されたｐＵｃ　１８ベクターに連結し、そしてＥ
　、　２ｉＪＭ１０９に形質転換した。」虫１遺伝子フ
ラグメントを含むクローンからのＤＮＡを単離し、そし
て劇±１のＢｇｊ！　Ｉ　−Ｂｇｊ２　ＩＩフラグメン
トの中間を切断する制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化した
。ＥｃｏＲＩにより生成された末端をフィルインし、そ
してバック連結した。切断された劇止１遺伝子フラグメ
ントの中間にフレームシフト変異を含むプラスミドｐＭ
Ｓ　４を得た（第２図）。
上刃≦じにヱを、プラスミドｐＭ３４及び３〜４倍のモ
ル過剰のプ゛ラスミドｐＭＳ　４と共にプラスミドｐ３
ＳＲ２を含む人、２三壬Ｌムラ−２ノヨ　堕止Σにより
同時形質転換した。
形質転換体を、例３に記載しているようにしてＶ（４）
Σ゛表現型に基づいて選択し、そして単一の炭素源とし
てアセトアミドを含む選択培地上で精製した。精製され
た形質転換体を、炭素源として１％５ｏ１ｋｌＬ　ｆｌ
ｏｃセルロース及び窒素源として０．２％プロテオース
ペプトンを含む上ユニ久二ヱ最少培地２００　ｍのマイ
クロタイタープレート上で増殖した。そのセルラーゼ表
現型を、参照５９に記載しているようにしてＣＢ）ｌ　
Ｉ特異的抗血清（羊）に対する希釈されていない増殖培
地を用いるオクテルロニーの免疫拡散によって試験した
。多くの形質転換体く正常な量のＣＢＨＩＩを産生ずる
が、しかし検出できるＣＢＨＩを産生しない）が同定さ
れた。
劃−ｊ− ■、プロキモリン遺伝子を含むプラスミド２８５′ｐｒ
ｏ　Ｃの調製（第３図）。
工、リーセイにおける異質タンパク質の例として、本発
明者は、プロキモリンｃＤＮＡを発現することを選択し
た（第３図）。プレプロキモリン遺伝子を子牛の胃のｃ
ＤＮＡライブラリィから単離し、そしてＧ−Ｃティリン
グ（参照４９及び５０）によってｐＢＲ３２２のｐｓｔ
１部位中に挿入し、ｐＲ２６を得た。
ｐｕｃ　９をＳａｊ！１により切断し、そしてクレノウ
ボリマラーゼにより補充し、そしてＴ４リガーゼにより
連結した。その得られたプラスミドをＢａ１ｌＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩにより切断し、そして２．７ＫｂＯ大フラグメ
ントを、ｐＲ２６からの０．４７ＫｂのＢａｍＨＩ　−
ＥｃｏＲＩフラグメントと連結し、プロキモリン遺伝子
のＮ−末端に旧ｎｄＩ［Ｉ部位を含むｐＵＣ９’を得た
。ｐＵｃ１３をＢａｍＨＩ　−Ｎａｒ　Ｉ及びＮａｒ　
Ｉ　−Ｘｍａ　Ｉにより切断し、そしてそれぞれ大小の
フラグメントをｐＲ２６の０．６４にｂのＸｍａ　Ｉ　
−Ｂｃｆ　Ｉフラグメントと連結し、プロキモリン遺伝
子のＣ−末端にＸｂａ　Ｉ一部位を含むプラスミドｐＵ
ｃ１３　’を得た。ｐＵｃ１３　’からの０．６５Ｋｂ
のＸｍａ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントを、第５図に
示されているようにしてｐＵｃ９’の０．４６Ｋｂの旧
ｎｄＩ［Ｉ　−Ｘｍａ　Ｉフラグメント及びｐＳａ５の
１１ＫｂのＸｂａ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントと
連結し、プロキモリン遺伝子を含むプラスミドｐ２８５
　’　ｐｒｏ　Ｃを得た。
■、プラスミドｐＡＭＧ／Ｔｅｒｌ１１の構成。
ｐｃＡＭＧ９１をＳａｊ！！及びＰｓｔｌ制限エンドヌ
クレアーゼにより消化する。そのような消化物から６９
８ｂｐのフラグメントをアガロースゲル上に単離した。
このＳａｌ　Ｉ−ＰｓｔＩフラグメントは、グルコアミ
ラーゼｍＲＮＡの１４０ｂｐ３　’非翻訳部＋５４０ｂ
ｐの３′〜ポリ　（Ａ）付加部位をコードする領域を含
む。
Ｘｂａ　Ｉリンカ−の添加及びＸｂａ　Ｉ制限酵素によ
る消化の前、この３′フラグメントを７４−ＤＮＡポリ
マラーゼにより処理し、その制限部位を“ブラント末端
”にした。このグルコアミラーゼ遺伝子の３′末端を、
Ｘｂａ　Ｉにより線状にされたρｔｌｃ１３にに連結し
、グルコアミラーゼ遺伝子ｐｏｌｙ（１）付加領域を含
むプラスミドｐＡＭＧ／Ｔｅｒｎ＋を得た。
■、プラスミドｐＭＴ８３７の構成。
プロモーター及びグルコアミラーゼ（ＡＭＣ）シグナル
及びリーダーペプチドをコードする配列を含むｐｃｌＩ
ＭＧ９１の０．５ＫｂのＳｍａ　ＩＩ　−Ｂｓ５ＨＩＩ
フラグメントを、５ＩＩＩａｌ　−ＢａｍＨＩにより消
化されたｐＵｃ１３及びプロキモリンの最初の６個のア
ミノ酸をコードする合成りｓｓＨＩＩ　−ＢａｍＨＩア
ダプターに連結した。
この得られたプラスミド、ｐＭＴ６２６から、０．８Ｋ
ｂのＮｄｅ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメントを単離し、
そしてｐｒｏ　ＣのＮ末端半分についての配列を含むｐ
Ｓａ５　’肛ｌｑからの０．５ＫｂのＢａｍＨＩ　−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメント及び肛立ｑについての配列のＣ末
端部を含むｐＭＴ６２２の３．ＯＫｂのＥｃｏＲＩ　−
Ｎｄｅ　Ｉフラグメントに連結した。（ｐＭＴ６２２は
単に、ｐＵｃ１３においてｐＳａ５　’厄立ｑのＥｃｏ
ＲＴ　−Ｘｂａ　Ｉサブクローンである）。その得られ
たプラスミドｐＭＴ６４８　（第４図を参照のこと）は
、完全なプロキモリン遺伝子、その先にＡＭＣプロモー
ター及びシグナル／リーダーコード配列を含む。ｐＭＴ
６４Ｂは、人、２孔ジ」仁Σンノ、のどｌ几遺伝子を含
むようにさらに変性された（参照５１）。１．８Ｋｂの
Ｎａｒ　Ｉ−フィルインされたｐＭＴ６４８のＸｂａ　
Ｉフラグメントを、６．８ｋｂのＣ１ａ　Ｉ−フィルイ
ンされたｐＳａ　１２４３のＥｃｏＲＩフラグメントに
連結し、ｐＭＴ６５１を得た。ＡＭＣプロモーターのさ
らに上流の配列（上流の活性化配列１ＵＡｓ）をさらに
挿入した。これは、元のクローンｐｃＡＭＧ９１からの
３．７ＫｂのＣｌ　ａ　Ｉ　−Ｂｓｓｔｌ　Ｉｆフラグ
メントを、肛立ｑ配列を含むｐＭ７６４８からの１．Ｉ
ＫｂのＢｓ５ｌｌ　ＩＩ　−フィルインされたＸｂａ　
Ｉフラグメント及びｐＭＴ８１３からの３．　Ｉ　Ｋｂ
のＣ１ａＩ−フィルインされたＥｃｏＲＩフラグメント
としてｍ遺伝子（ｐＭＴ８１３は、ＥｃｏＲＶ　−Ｂｇ
　ｊ！　ＩＩにより切断されたｐｉｃ１９Ｒ中にクロー
ンされた３、　Ｉ　ＫｂのＢａｍＨＩ　−Ｎｒｕ　Ｉフ
ラグメントとしてクローンされたｍ遺伝子である）に連
結することによって達成された。その得られたプラスミ
ドｐＭＴ８３０は、ＡＭＣからのＵＡＳ、プロモ−ター
、シグナル及びリーダー配列及び肛ｌｑのための完全な
遺伝子、を含む発現ユニットを有する。
最後に、ＡＭＣのターミネータ−配列は、プラスミドｐ
ＡＭＧ／Ｔｅｒｍから０．６　ＫｂのＸｂａ　Ｉ　−Ｘ
ｂａ　Ｉフラグメントとして取られ、そしてＸｂａ　Ｉ
により切断され、そして脱リン酸化されたｐＭＴ８３０
中に挿入され、ｐＭ７８３７が得られた。ｐＭＴ８３７
の構成が第５図に例示される。
劃−」− ｐＭＴ８３７を用いてキモシンの産生。
工、リーセイ株ＱＭ９４１４及びＲＯＴ　−Ｃ−３０を
、プラスミドｐＭＴ８３７及びｐ３ＳＲ２により同時形
質転換した。
プラスミドｐＭＴ８３７は、プロキモリン遺伝子の先に
ＡＭＣプロモーター及びシグナル／リーダー配列を含む
。プラスミドｐＭ７８３７の構成法は例７に記載されて
いる（また第３〜５図を参照のこと）。同時形質転換及
び選択を例５におけるようにして行なった。
キモシン産生のためには、１％５ｏｌｋａ　ｆｌｏｃセ
ルロース及び０．２％プロテオースベプトンを含む最少
培地上で形質転換体を培養した。
その菌糸体を集め、そして必要な場合、ＴＣＡ沈殿沈殿
水ってその上清液を濃縮し、そして２ＭのＮａＯＨ，１
０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（ｐｔ１８．５　）中に希釈した
。そのサンプルを５ＤＳ−ページ（７，５％〜１５％の
ポリアクリルアミドグラジェント）上で分別し、そして
ニトロセルロースフィルターにエレクトロプロットした
。そのフィルターを、ウサギプロキモリン抗血清と共に
インキュベートし、そしてシグマから購入されたα−ウ
サギ−ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ接合体を用いて４−ク
ロロ−１−ナフトールにより染色した。
キモシンは、およそ１　ｔｔｇ　／　ｊ！のレベルで培
地中に分泌されることを示された。ＡＭＣプロモーター
は、明らかに工、ユニ土工において非能率的に機能する
ので、相同の工、ユニー１−４プロモーター−ターミネ
ータ−ベクターが、キモシンの産生レベルを改良するた
めに構成された。
■−Ｉ Ｃｂｈ　１プロモーターを用いて、工、リーセイ中にお
いて子牛プロキモリンの産生のための異質発現ベクター
の構成。
Ｉ、ｃｂｈｌターミネータ−領域へのプロキモリン遺伝
子の連結。
子牛プロキモリン遺伝子を、プラスミドｐＲ２７から得
た（第６図）。はとんど全体の遺伝子を含むＰｓｔ　Ｉ
　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメント（約１１１０ｂｐ）を、従
来の技法によってアガロースゲルから単離し、そしてｐ
Ｕｃ１９のＰｓｔ１部位に連結した。
このプラスミドをＰｓｔｌにより一部消化し、末端を８
１ヌクレアーゼによりプラント化し、そして回虫１遺伝
子（フレノウフラグメントによるプラント末端）のＡｖ
ａ　■ターミネーターフラグメント（〜７５０ｂｐ）を
このプラスミドに連結した。處１１遺伝子のターミネー
タ−領域を、ｐＢＲ３２２（参照２４）中にサブクロー
ンされたｃｂｈ　１　ｃＤＮＡの末端の１．８　ＫｂＢ
ａｍＨＩフラグメントから得た。ｐＵｃ１９において、
回虫１遺伝子のターミネータ−領域と連結した肛立ｑフ
ラグメントを含むこのプラスミドをｐＡＭＩ＋１００（
第７図）と言及した。
ＩＩ、　ＢｇＡ’　ｌ−５ａｃＩｒアダプターを用いて
、ＣＢ）ｌ　Ｉプロモーター領域及びプロキモリンコー
ド領域の融合。
プロキモリンのＮ−末端領域をコードするＳａｃ　Ｕ−
Ｐｓｔｌフラグメント（８０ｂｐ）を、プラスミドｐＲ
２７（第６図を参照のこと）から単離した。ゲノムクロ
ーンλ４４Ａからのα１」−プロモーター領域をまず、
２．８Ｋｂの長さのＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメ
ントとしてｐＵｃ１８（プラスミドｐＵＡＯ１、第８図
）中にサブクローンし、そして次に約２．２Ｋｂの長さ
のＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｊ２　Ｉフラグメントをこのサブ
クローンから単離した。Ｂｇ／Ｉ部位は、ｃｂｈ　１遺
伝子のシグナル配列の中間に配置される。ｃｂｈ上遺伝
子のプロモーター及びシグナルペプチドのコード領域の
約半分を含む、約２．２Ｋｂの長さのＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ｇ　ｌ　Ｉフラグメントの約５ｏｂｐの５ａｃｌＩ　−
Ｐｓｔ　Ｉプロキモリン　フラグメントへの正確な連結
は、８ｇ７！ｌ−３ａｃ　Ｉ［アダプター（ＮＯＲ２０
２＋　Ｎ０Ｒ２０３、第１０図）によって仲介される。
アダプターと共にこれらのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ
　−Ｐｓｔ　Ｉにより消化されたｐＵｃ１９中に連結し
た。このプラスミドは、プロキモリンの第１アミノ酸に
融合されたＣＢＨＩの完全なシグナル配列、次にそのＮ
−末端配列のいくらかをコードする。最後に、この構造
体からＥｃｏＲＩ　−ｐｃｂｈ　１５ｓ−ｐｒｏＣ−Ｐ
ｓｔ　Ｉフラグメントを単離し、５ａｉＩ及びＰｓｔｌ
により消化されたｐＡＭＨ１００中にその３′末端から
連結した。そのフラグメントの５′末端及びプラスミド
ｐＡＭＨ１００のＥｃｏＲ１末端をフレノウによりフィ
ルインし、そして連結した。劇±１遺伝子のプロモータ
ー及び但Ｃ′フラグメントを、劇庚１ターミネーター領
域の前の’ｐｒｏＣの前に移した。この構成体を、ｐＡ
ＭＨ１０２（第１１図）と名付けた。
■、クロモシン発現プラスミドへの選択マーカーの付加
。
発現プラスミドにおける選択マーカーとして、人、、ニ
ジ」ニ九ンノ、の朋止Σ遺伝子（参照４２　、３０）又
は人、２とジ」ヨＸンノヨの但」」−遺伝子（参照４８
）のいづれかを使用することができる。
ａｍｄ　Ｓ遺伝子を、ｐ３ＳＲ２からＰｖｕ　Ｉ　−Ｓ
ａ　ＩＩ　Ｉフラグメントとして単離し、そしてｐＡＭ
Ｈ１０２の６Ｋｂの長さのＰｖｕ　Ｉ　−５ａ　１１フ
ラグメントに連結する。
この選択可能なベクターを、ｐＡＭＨ１０４（第１１図
）として命名した。
■、オリゴヌクレオチドを用いてｃｂｈ上プロモーター
及びプレプロキモリンコード酸列の正確な融合。
プレプロキモリンのアミノ末１Ｐｓｔｌフラグメント（
約１５０ｂｐ）を、ｐＢＲ３２２においてＰｓｔ１部位
に挿入されたＡＴＧから１２ｂｐ上流で始まる、完全な
プレプロキモリンｃＤＮＡクローンを含むｐＲ２６（第
３図）から単離した。このフラグメントを、ｐＴＺ１９
Ｒのポリリンカー中に、世Ｉ　（第８図）のシグナル配
列のコードする領域も含む、ｃｂｈ　ＩＥｃｏＲＩ　−
５ａｃ　Ｉ　　（約２．６　Ｋｂ）プロモーターフラグ
メントと共にサブクローンした。ｃｂｈ　Ｉ　ＥｃｏＲ
Ｉ　−５ａｃ　Ｉフラグメントを、元のλ４４Ａクロー
ン（参照２４）の、ｐＵｃｌＢ　（ｐＵＡＯｌ、第８図
）における２、８ＫｂのＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＥサブ
クローンから得た。
ｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、複製のＦ１起
源及びオリゴヌクレオチドの突然変異生成のために単鎖
鋳型の使用を可能にするＴ７プロモーターを含む、ｐＵ
ｃ１９基礎プラスミドである。この得られたプラスミド
（ｐＡＭＨ１０５）の構成法は第８図に例示されている
。このプラスミドから、劇±１プロモーター領域と因Ｉ
ＣＡＴＧとの間の配列を、特定のオリゴヌクレオチド、
ＯＡＭＩ＋３　（第１０図）を用いてループ−突然変異
生成によって削除した。オリゴヌクレオチド指図の突然
変異生成の実施は第９図に例示されている。問題のオリ
ゴヌクレオチドをリン酸化し、それぞれモル比２０：１
でｐＡＭＩ＋１０５の単鎖ＤＮＡ（参照６０、単鎖ＤＮ
Ａは、Ｐｈａｒｍａｃｉａによって記載されているよう
にしてＪＭ１０３／ｐＡＭＨ１０５から単離された）に
アニールした。オリゴヌクレオチド　プライマーを、参
照６０に記載しているようにしてタレノウポリマラーゼ
及びＴ４リガーゼを用いて延長した。その延長された混
合物を、Ｓｍａ　Ｉ　　（ｐＴＺ１９Ｒのポリリンカー
に存在する、第９図を参照のこと）により消化し、その
後、Ｅ、コリの懸１し不適正修復欠失性株、ＢＭＨ７１
，１８中に形質転換した。形質転換体のプールを、５ｍ
ｌの液体培養（１００ｇ／−のアンピシリンを含む、参
照６２に記載のようなＬｕｒｉａブイヨン）中で１晩増
殖した。プラスミドＤＮＡを、形質転換体のプールから
単離し、そしてそれをＳｍａ　Ｉにより再消化し、そし
て一旦エエッｉ　ＪＭ１０９株中に再形質転換した。可
能性ある欠失クローンのスクリーニングを、異なった制
限酵素を用いる消化によって行ない、そして欠失の特異
性もさらに、配列決定することによって確認した。その
得られたプラスミドをｐＡＭ）１１１０１　（第１２図
）と呼ぶ。このプラスミドを、さらにＥｃｏＲＩ及びＰ
ｓｔＩにより消化し、そしてその得られた四ｙｕ−ＰＩ
ＰｌＳ−フラグメントを単離しく第１４図）、そしてＰ
ｓｔｌ及びＳａｌ！１により消化されたｐＡＭ）１１０
０プラスミドにそのＰｓｔＩ末端で連結した。その得ら
れた連結フラグメントの末端を、フレノウによってフラ
ントし、そして連結した。その得られたプラスミドをｐ
ＡＭＩ＋１０１と呼び、そしてそれは、プロキモリンの
シグナル配列に融合されたφ１１プロモーター及びｃｂ
ｈ上遺伝子のターミネータ−領域に融合された全プロキ
モリンコード領域を含む（第１４図）。
■、オリゴヌクレオチドを用いることによって行なわれ
たシグナル配列融合による、０１上プロモーター及びｐ
ｒｅｐｒｏ　Ｃ遺伝子の正確な融合。
前のチャプター■に詳しく記載されたｐＡＭ！（１１０
１の構成と本質的に同じようにしてプラスミドｐＡＭＩ
（１１０３（第１２図）の構成を行なった。但し、この
構成のために使用された特異的オリゴヌクレオチドはＯ
ＡＭ）ＩＩ　　（第１０及び９図）であった。その得ら
れたプラスミドｐＡＭＨ１１０３は、肛立ｑ遺伝子のコ
ード領域のアミノ末端部分（〜１４０ｂｐ）の先の［Ｃ
シグナル配列からのａａ１２〜１６に融合された、ｃｂ
ｈ　１シグナル配列からのアミノ酸（ａａ）１〜１２を
含むシグナル配列融合体を含む（第１２図）。プラスミ
ドｐＡＭ旧１０３からのｐｃｂｈ　１−ｓｓ。
−臣ｃ　’　　（０＝融合）フラグメントを、本質的に
前のチャプター■に記載しているようにしてｐＡＭＨｌ
ｏｏにサブクローンした（第１２図を参照のこと）。こ
の得られたプラスミドｐＡＭｆｌ１０３は、」庚１ター
ミネーター領域に融合された刀１０コード領域の先の劇
声１のプロモーター領域及びぐ仇１及び［Ｃのシグナル
配列融合体を含む。
■、オリゴヌクレオチドを用いることによるＰ１０コー
ド領域への怠１１コード領域の正確な融プラスミドｐＡ
ＭＨ１１０６（第１３図）の構成を、本質的に前のチャ
プター■に詳しく記載されたｐＡＭ旧１０１の構成と同
じようにして行なった。但し、この構成のために使用さ
れた特異的オリゴヌクレオチドはＯＡＭＨ２（第１０及
９図）であった。劇±１のプロモーター領域、小１のシ
グナル配列及び肛立ｑのコード領域に融合された、成Ｐ
ＣＢＨＩの初めの１〜２０のａａのコード領域を含むそ
の得られたプラスミドｐＡＭ旧１０６からの、ｐｃｂｈ
　１成熟。−肛立ｑ’を含むフラグメントを、本質的に
前のチャプター■に記載しているようにしてｐＡＭ）１
１００中にサブクローンした（第１２図）。その得られ
たプラスミドｐＡＭｌ＋１０６は、處山１のプロモータ
ー領域、回虫１のシグナル配列、Ｊｌｏのコード領域に
融合された成ＰＣＢｌ１１のアミノ酸１〜２０のコード
領域を含む。
■土工 ｐＡＭ旧０２及びｐＡＭＨ１０４を用いてキモシンの産
生。
工、−男：Ｉ旦ゴー株叶９４１４及びＲＯＴ−Ｃ−３０
を、それぞれ５：１のモル比でプラスミドｐＡＭＨ１０
２及びｐ３ＳＲ２により同時形質転換した。プラスミド
ｐＡＭＨ１０２の構成法は例９のチャプター■に記載さ
れた。同時形質転換及び選択を例５におけるようにして
行なった。その形質転換体を、例３に記載されたように
して、選択性アセトアミドプレート上で精製した。
キモシン産生のために、形質転換体を、１％５ｏｌｋ　
ｆｌｏｃセルロース及び０．２％プロテオースペプトン
を含む最少培地（１０〜５０ｍ１）上で培養した。
その菌糸体を集め、そしてその上滑液をＴＣＡ沈殿法に
よって濃縮し、そして２ＭのＮａＯＨ，１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ　（ｐＨ８，５）の溶液中に希釈した。その菌糸体
を液体窒素の存在下で破壊し、その破壊された細胞をベ
レット化し、そしてその上清液を、前記培養培地と同じ
方法で処理した。そのサンプルを、ＳＯ５−ｐａｇｅ　
（７，５％〜１５％のポリアクリルアミド　グラジェン
ト）上で両分し、そしてニトロセルロースフィルターに
エレクトロプロットした。
そのフィルターを、ウサギプロキモリン抗血’ｌｆｔ及
びα−ウサギ−１ｇＧ−ＡＰ　（アルカリホスファター
ゼ）接合体と共にインキエベートし、そしてＰｒｏｍｅ
ｇａ　Ｂｉｏｔｅｃから購入されたニトロブルーテトラ
ゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
により染色した。菌糸体の内部及び外部のキモシンの量
を比較した（第１７図）。菌糸染色体ＤＮＡ中に組込ま
れたプラスミドｐＡＭＨ１０２の高い数のコピイーを含
むクローンがまたよりキモシンを産生じたことが、サザ
ン　ハイブリダイゼーションによって示された。１つの
コピイーの形質転換体を用いる場合、分泌されたキモシ
ンの量は１１の培養培地当り１００河であった（ウェス
ターンゲルから近づいた場合）（第１７図）。分泌され
たプロキモリンは、ウェスターンゲルによって及び凝乳
活性（β−カセイン決定基の切断によるキモシン凝乳）
によって活性キモシンにプロセスされることが示された
（参照６３）。菌糸体の内部の種々の形のキモシン（ｐ
ｒｅｐｒｏ　Ｃ、ｐｒｏ　Ｃ、Ｃ及び細胞の内部の分解
生成物に由来したキモシン）の量は、菌糸体の合計タン
パク質の０．０４％であることが測定され（第１７図）
、そして分泌されたキモシンの量は、産生された合計キ
モシンの６０％であった。これは、菌糸体の外部でさえ
異質遺伝子生成物を分泌するニーユニー１？−（の能力
を示す。
プラスミドｐＡＭＨ１０４（第１１図）のいくつかのコ
ピイーを有する形質転換体（多量のプロキモリンを分泌
できる）を、増殖培地の凝乳活性を決定することによっ
て、スクリーンした。研究された４０のうち最良の形質
転換体は、ウェスターンゲル上で及び凝乳活性によって
測定される場合、培養培地１１当り５００ｎを分泌する
ことが見出された。
培養物が小規模な培養（１０〜５０−）と比べて、５１
ラボラトリイフアーメンター中において増殖される場合
、分泌される、活性キモシンの量は、２００倍増大され
るので、この型の菌株によって産生されたキモシンの量
は、約１００ｍｇ／ｊ！　Ｔニアｏル。
■土工 Ｔ、リーセイにおける同質及び異質のタンパク質の産生
のための一般的発現ベクターの構成。
−エエＪ＝二±〕−において種々のタンパク質の産生の
ためのベクターを構成するために、劇小１遺伝子のプロ
モーター及びターミネータ−領域を含む一般的発現ベク
ターを構成した。劇団１ターミネータ−を、３個の読み
枠が整合して５ＴＯＰコドンＴＡＡを含むアダプターと
共に、ｐＵｃ１９のｐｓｔ１部位にサブクローンし、プ
ラスミドｐＡＭＨ１１０’　　（第１５図）を得た。ｐ
ｓｔｌターミネータ−フラグメントをｐ静旧１０′から
単離し、劇声１プロモーターを、ＪＩＣ遺伝子のアミノ
末端を含むＥｃｏＲＩ　−ＰｓｔＩフラグメントとして
ｐＡＭＨ１０２から単離し、そしてこれらのフラグメン
トを、ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉにより消化されたｐｔ
ｌｃ１９’″（これから、このサブクローン段階の前、
１つのＮｄｅ　１部位がフレノウによりプラントされた
）中にサブクローンした。その得られたプラスミドｐＡ
ＭＩ１１１０は、劇±１遺伝子のプロモーター及びター
ミネータ−及びこれらの配列の間に、Ｓａｃ　ＩＩ及び
Ｎｄｅ　Ｉによる消化によって除去され得るスタツフ−
（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントを含む。末端がプラン
トされた後、遺伝子のｃＤＮＡ又は染色体コピイーを、
プロモーター及びターミネータ−の間に挿入することが
できる（第１５図）。
■土１ 小１プロモーター下で、エエニシ＝±Ａ−エンドグルカ
ナーゼＩの発現。
産生されるエンドグルカナーゼの量を増大せしめるため
に、邸」ｊ遺伝子を、より強力な山１プロモーターに連
結した。エエ」−セイエンドグルカナーゼＩのためのｃ
ＤＮＡを、スタファーフラグメントを削除するためにま
ずＳａｃ　Ｕ　−Ｎｄｅ　Ｉにより消化された一般的な
発現ベクターｐＡＭＨ１１０（例１１に記載された）中
にＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントとしてサブク
ローンした（第１６図）。劇±１遺伝子のプロモーター
及びターミネータ−の間に用１１遺伝子を含む、その得
られたプラスミドｐＡＭＨ１１１を、それぞれ５：１の
−ＩＬ／比テｐ３ＳＲ２と共ニＴ　、　　ＩＪ　−−１
＝　イＱＭ９４１４　（ＡＴＣＣ２６９２１）　ニ同時
形質転換した。形質転換体を、Ａｍｄｓ”表現型につい
て選択し、そしてさらに選択培地上で精製した。６個の
個々の形質転換体を、５０ｍ１の液体培養において、セ
ルラーゼ含有培地（炭素源として５ｏｌｋａｆｌｏｃ、
１％）中で４日間、増殖せしめた。次にその培養上清液
を、ヒドロキシエチルセルロース（０，１％、参照１２
）からの還元性糖の放出を測定することによってエンド
グルカナーゼ活性について試験した。形質転換体のＥＧ
Ｉ活性を対照（０Ｍ９４１４）と比較し、そして最良の
形質転換体は、対照菌株のエンドグルカナーゼ活性の４
倍分泌することが示された。この例は、それぞれのプロ
モーターを変えることによって、Ｔ、リーセイにおいて
、異なったセルロース分解酵素の量を調整することが可
能であることを示す。
参考文献 １、Ｓｔｍｍｏｎｓ＋　Ｅ、Ｇ１　　いくつかのセルラ
ーゼ産生上Ｊ≦す６：二種の分類（Ｃ１ａｓｓｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｍｅｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｐｒ
ｏｄｕｃｉｎｇ−Ｔｒ：ｃｈｏｄｅｒｍａ　５ｐｅｃｉ
ｅｓ）。
Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　５ｅｃｏｎｄ　Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ　ＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｇｒ
ｅｓｓ、　　Ｔａｍｐａ＋　　Ｆｌｏｒｉｄａ、　　Ｕ
ＳＡ、　　Ｈ，Ｅ、　　八ｉｇｅｌｏｗ＆　Ｅ、Ｇ、　
Ｓｉｍｍｏｎｓ（Ｅｄｓ、）１９７７．６１８ページ。
２、　　Ｂｅｒｇｈｅｎ＋＋　Ｌ、Ｅ、Ｒ，＆　Ｐｅｔ
ｔｅｒｓｓｏｎ＋　Ｌ、Ｇ、＋酵素によるセルロース分
解の機構（Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ　ｅｎｚｙ
ｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｔ
ｏｎ）　　。高く指図されたセルロースに対して活性化
する上１ユｌ二ヱ　竺１元からセルロース分解酵素の精
製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌｏ
ｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ　ｆｒｏｎ＋Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａ　　ｖｉｒｉｄｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｏｎ　ｈｉ
ｇｈｌｙ　ｏｒｄｅｒｅｄｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、　　Ｅ
ｕｒ　　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　　’ｄ　（１９７３Ｌ
２１〜３０ページ。
３、　　Ｇｏｎｇ、　Ｃ，Ｓ、、　Ｌａｄｉｓｃｈ、　
Ｍ、Ｒ，＆　Ｔｓａｏ＋　Ｇ、Ｔ、ｔＢｉｏｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ、　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏ
ｄｅ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎｏｆ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｓ
　ｏｆ　　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　　ｒｅｅｓｅｉ。
Ａｄｖ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｅｒ、　１８１　（１９７９
）、　２６１〜２８７ページ。
４、　　Ｆｆｆｉｇｅｒｓｔａｍ、　Ｌ、Ｇ、　＆　Ｐ
ｅｔｔｅｒｓｓｏｎ＋　Ｌ、Ｇ、＋　Ｔｈｅｌ、４−β
−ｇｌｕｃａｎ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ
ｓ　ｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　　ｒｅｅｓｅｉ　０
Ｍ９４１４．　Ａ　ｎｅｗ　ｔｙｐｅ　ｏｆｓｙｎｅｒ
ｇｉｓｍ、　　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　　１１９（
１９８０）、　７９〜１００ページ。
５、　　Ｅｎａｒｉ、　Ｔ、　　−Ｍ、、　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅｓ。
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｗ、Ｍ。
Ｆｏｇａｒｔｙ（版）　、　Ａｐｐｌｉｅｄ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。
Ｌｏｎｄｏｎ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８３
．１８３〜２２３ページ。
６、　　Ｇ１１ｂｅｒｔ＋　１．Ｇ、　＆　Ｔｓａｏ、
　Ｇ、Ｔ、、　Ｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
　　ｏｆ　　Ｔ、　　　ｖｉｒｔｄｅ　　ｃｅｌｌｕｌ
ａｓｅ、　　八ｎｎ。
Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｏｎ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｐ
ｒｏｃｅｓｓ　６　　（１９８３）＋３２３〜３５８ペ
ージ。
７、　　Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｓ、Ｐ、　＆　Ｂｒｏ
ｗｎ、　Ｊｒ、＋　Ｒｏｎ、ＩＥｎｚｙｍｉｃ　ａｃｔ
ｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｅｎｄｏ　−１、４−β−ｇｌ
ｕｃａｎａｓｅｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　　Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　　ｖｉｒｉｄｅ。
Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ　　５
２３（１９７８）＋１３３〜１４６ページ。
８、　　Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ＋　Ｓ、Ｐ、　＆　Ｂｒｏ
ｗｎ、　Ｊｒ、＋　Ｒ，Ｄ、。
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏ　
−１、４−β−ｇｌｕｃａｎａｓｅｓｐｕｒｉｆｉｅｄ
　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ、
　Ｂｉｏｃｈｉｍ。
Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ　　５２３（１９７８）、１
４７〜１６１ページ。
９、　　　Ｂ１５ｓｅｔｔ、　　Ｆ、Ｈ，、八ｎａｌｙ
ｓｉｓ　　ｏｆ　　ｃｅｌｌｕｌａｓｅｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑ
ｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ｊ、Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏ　、　　１７８（１９７９）、５１７〜５２３
ページ。
１０、　Ｆａｒｋａｓ、　Ｖ、Ａ、、　Ｊａｌａｎｋｏ
、　Ａ、　＆　Ｋｏｌａｒｏｖａ。
Ｎ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌ
ｌｕｌａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃ
ｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ　９４１４　ａｎ
ｄ　ｉｔｓｍｕｔａｎｔｓ　ｂｙ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ　　７０６（１９Ｂ２）＋１
０５〜１１０ページ。
１１、　Ｅｎａｒｉ、　Ｌ−１’１．ｌ　Ｎ１ｋｕ−Ｐ
ａａｖｏｌａ、　Ｍ、−Ｌ、　＆Ｎｕｍｍｉ、　Ｍ、、
　Ｃｏｍｐａｒｔｓｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔ
ｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓｆｒｏｍ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ　ｒｅｅｓｅｉ　ａｎｄ　Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　
ｎｉ　ｅｒ。
Ｉｎ：　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　２ｎｄ　Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　Ｂ
ｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。
Ｔ、に、　Ｇｈｏｓｅ　（Ｅｄ、）、Ｉｎｄｉａｎ　Ｉ
ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋Ｎｅ
ｗ　Ｄｅｌｈｉ上（１９８０）　、８７〜９５ページ。
１２、８ａｉｌｅｙ、　Ｍ、Ｊ、　＆　Ｎｅｖａｌａｉ
ｎｅｎ、　Ｋ、Ｍ、Ｈ，。
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ、　　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ
　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ｓｔａｂｌｅＴｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　
ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏ−ｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓ
ｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、　　ｈ
ｕ剋Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、　　３　　（１９
８１）　＋　１５３〜１５７ページ。
１３、＾ｎｄｒｅｏｔｔｉ、Ｒ，，Ｍｅｄｅｉｒｏｓ＋
　　、ｙ、Ｉ　　Ｒｏｃｈｅ、Ｃ。
＆　Ｍａｎｄｅｌｓ、Ｍｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　　ｏｆ　
　５ｔｒａｉｎ　　ａｎｄ　　５ｕｂｓｔｒａｔｅｏｎ
　　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ
ｓ　ｂｙ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ　　ｍ
ｕｔａｎｔｓ、Ｉｎ：　　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏ
ｆ　２ｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ａｎｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、
　　Ｔ、に、　　Ｇｈｏｓｅ（Ｅｄ、）　　Ｉｎｄｔａ
ｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、　Ｎｅｗ　Ｄｅｌｈｉ上（１９８０）　、　３５３〜
３８８ページ。
１４、Ｐａｒｋａｓ、Ｖ、＋　　Ｌａｂｕｄｏｖａ、Ｃ
Ｉ　　Ｂａｕｅｒ＋　　Ｓ、＆Ｆｅｒｅｎｃｚｙ＋　　
Ｌ、、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔｓ
　ｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　　ｖｉｒｉｄｅ　ｗｉ
ｔｈ　　１ｎｃｒｅａｓｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏ
ｆ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、　Ｆｏｌｉａ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、　２６　（１９８１Ｌ１２９〜１３２ページ。
１５、　　Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ、　　Ｂ、Ｓ、　
　＆　Ｅｖｅｌｅｉｇｈ、　　Ｄ、Ｅ、。
５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　　ｆｏｒ　
　ｔｈｅ　　ｔｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　　ｈｉｇｈｙ
ｉｅｌｄｉｎｇ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｍｕｔａｎｔｓ
　ｏｆ　Ｔ、ｒｅｅｓｅｒ　　Ａｄｖ。
Ｃｈｅｍ、Ｓｅｒ、耳＋１（１９７９）、２８９〜３０
１ページ。
１６、Ｍａｎｄｅｌｓ＋　　Ｍ、、Ｗｅｂｅｒ、Ｊ、＆
　　Ｐａｒｉｚｅｋ、Ｒ，。
Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ　　ｂｙ　ａ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆＴｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ、　　Ａ　　１．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　２１　　（１９７１）＋１５２〜１５４
ページ。
１７．　Ｇａ１ｌｏ、　　Ｂ、Ｊ、＋　　Ａｎｄｒｅｏ
ｔｔｉ、　　Ｒ０＋　　Ｒｏｃｈｅ、　　Ｃ，＋Ｒｕｙ
＋　Ｄ、　＆　Ｍａｎｄｅｌｓ＋　Ｍ、＋　Ｃｅ１ｌｕ
ｌａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙ　ａ　ｎｅｗ　ｍ
ｕｔａｎｔ　５ｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｍａ　ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ　７７、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ、　Ｓｙｍｐ、　　８（
１９７９）、　８９〜１０２ページ。
１Ｂ、　Ｗａｒｚｙｗｏｄａ＋　　Ｍ−＋　　Ｖａｎｄ
ｅｃａｓｔｅｅｌｅ、　　Ｊ、Ｐ、　＆Ｐｏｕｒｑｕｉ
ｅ＋　Ｊ、＋　Ａ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｇｅ
ｎｅｔｉｃａｌｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄ　５ｔｒａｉｎｓ
　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ　ｆｕｎｇ
ｕｓＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ、　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　　５（１９８３）　、
　２４３〜２４６ページ。
１９、　　Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ、　　Ｂ、Ｓ、　
　＆　Ｅｖｅｌｅｉｇｈ、　　Ｄ、Ｅ、＋Ｐｒｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉｗｉｔｈ　ｅｎｈａｎｃｅ
ｄ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　勧
襄ＬＥｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　３４
　（１９７７）、　１１１〜７８２ページ。
２０、　５ｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ、　　Ｇ、　＆　Ｍｏ
ｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ＋　　ｓ、ｓ、ＩＣｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　　ｔｈｅ　５ｅｃｒｅｔｅ
ｄ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ　ｒｅｅｓｅｉ　　ｗｉｌｄ　　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　
ｍｕｔａｎｔｓｄｕｒｉｎｇ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ、Ａ　　、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ。
１１ｉｏｔｅｃｈｎｏ１．２０　（１９８４）、４６〜
５３ページ。
２１、　　Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　　Ｓ、Ｐ、＋　　Ｒ
ａｙｍｏｎｄ、　　Ｊ、Ｃ，＆　Ｂｒｕｎｅｒ＋Ｒ，、
Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅｓ：　　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｍ
ｏｎｇｓｔ　　ｉｍｐｒｏｖｅｄＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ　　５ｔｒａｉｎｓ、Ｉｎ：　　Ｔｒｅｎｄｓ　　ｉ
ｎ　　ｔｈｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　　ＦｅｒｌＩａ
ｎｔａｔｉｏｎｓ　　ｆｏｒ　　Ｆｕｅｌｓ　　ａｎｄ
　　Ｃｈｅ＋ｙ＋１ｃａｌｓ　　Ａ、Ｅ。
Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ　　（Ｅｄ、）、Ｐｌｅｎｕｌｌ
ｌ　Ｐｒｅｓｓ、（１９８１Ｌ　　８９〜１０９ページ
。
２２、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ、に、Ｍ、Ｈ，、Ｐａ１ｖ
ａ、Ｅ、Ｔ、＆Ｂａ１ｌｅｙ、Ｍ、Ｊ、Ｂ、、Ａ　ｈｉ
ｇｈ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｍｕｔ
ａｎｔ　５ｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
　ｒｅｅｓｅｉ、　Ｌ区が１Ｍ１ｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎ
ｏｌ、　　３　　（１９８０）、５９〜６０ページ。
２３、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｓ、、Ｓｃｈｗｅｉｃｋａ
ｒｔ＋　　Ｖ、、Ｌａｄｎｅｒ。
Ｍ、＋　　Ｇｅ１ｆａｎｄ、ｏ、ｌ　　Ｋｗｏｋ、ｓ、
、Ｍｙａｍｂｏ、に、＆　　Ｉｎｎ１ｓ＋Ｍ、、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　　ｅｘｏｃｅｌ
ｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅＩ　　ｄｅｒｉｖｅｄ　
　ｆｒｏｍ　　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　　ｒｅｅｓｅ
ｉ　　５ｔｒａｉｎ　　Ｌ２７゜Ｂ　１０／ＴＥＣＨＮ
ＯＬＯＧＹ　　上（１９８３）、　６９１〜６９６ペー
ジ。
２４、Ｔｅｅｒｉ、Ｔ、、５ａｌｏｖｕｏｒｉ、１．＆
　Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｊｌ　　　　　’Ｔｈｅ　ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　　ｔｈｅ　ｍａｊ
ｏｒ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　　ＢＩＯ／ＴＥＣＩ
ＩＮＯＬＯＧＹ±（１９８３）、　６９６〜６９９ペー
ジ。
２５、　　ＰｅｎｔｔｉｌＭ、　　Ｍ、ｔ　　Ｌｅｈｔ
ｏｖａａｒａ、　　Ｐ、＋　　Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ。
Ｈ，、Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ、　Ｒ，＆　Ｋｎｏｗｌｅ
ｓ＋　Ｊ、　１９８６．　Ｈｏｍｏｌｏｇｙｂｅｔｗｅ
ｅｎ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ　
５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａ
ｎａｓｅ　Ｉ　ｇｅｎｅ。
何匹（１９８６）４５：　２５３〜２６３ページ。
２６、ヨーロッパ特許出願１３７．２８０゜２７、　Ｖ
ａｎ　Ａｒ５ｔｅｌ、　Ｊ、Ｎ、Ｖ、＋　Ｋｗｏｋ、　
Ｓ、＋　Ｓｃｈｗｅｉｃｋａｒｔ。
Ｖ、Ｌ、＋　Ｌａｄｎｅｒ＋　Ｍ、Ｂ、、　Ｇｅ１ｆａ
ｎｄ、　Ｔ、Ｈ，＆　Ｉｎｎ１ｓ＋　Ｍ、　Ａ、ｔＣｌ
ｏｎｉｎｇ、　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａ
ｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍ　
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｌｕ
ｃａｎａｓｅｌｆｒｏｏ＋　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　
ｒｅｅｓｅｉ、　ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　５　
：　６０〜６４ページ。
２８、特許出願ＷＯ８５１０４６７２ ２９、Ｃｈｅｎ＋　ｃ、Ｍ、ｌ　Ｇｒｉｔｚａｌｉ、　
Ｍ、　＆　５ｔａｆｆｏｒｄ。
Ｔ、　Ｗ、、　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃ
ｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｐｒｉｍａｒｙｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓ
ｅ　ＩＩ　ｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓ
ｅｉ、　ＢＩＯ／ＴＥＣＩＩＮＯＬＯＧＹ　（１９８７
）　　５　：２７４〜２７８ページ。
３０、５ａｌｏｈｅｉｎ＋ｏ、　Ｍ、、　Ｌｅｈｔｏｖ
ａａｒａ、　Ｐ、、　Ｐｅｎｔｔｉｌ；ｉ。
Ｍ、、　Ｔｅｅｒｉ、　Ｔ、Ｔ、＋　Ｓｔａｈｌｂｅｒ
ｇ、　Ｊ、＋　Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、　Ｇ、。
Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ＋　　Ｇ、、　　Ｃ１ａｅｙｓｓ
ｅｎｓ＋　　ＬＩ　　Ｔｏｍｍｅ、　　Ｐ、　　＆Ｋｎ
ｏｗｌｅｓ、Ｊ、、Ａ　ｎｅｗ　ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎ
ａｓｅ　ｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　　ｒｅｅｓ
ｅｉ：　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　
　ｂｏｔｈｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ、　　Ｓｕ
ｂｍｉｔｔｅｄ　ｆｏｒ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　　
１ｎＢ１０／ＴＥＣ）ＩＮＯＬＯＧＹ。
３１、Ｃａ５ｅ＋　　Ｍ、Ｉ　　Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、
Ｍ、、Ｋｕｓｈｎｅｒ、Ｓ、Ｒ。
＆　Ｇ１１ｅｓ、Ｎ、Ｈ，＋　　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　
　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆＮｅｕｒｏｓ　
ｏｒａ　ｃｒａｓｓａ　ｂｙ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｈ
ｙｂｒｉｄ　ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡ、　　　Ｐｒｏｃ　
　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　　　コ−６（
１９７９）、　　５２５９〜５２６３ページ。
３２、Ｂａ１ｌａｎｃｅ、Ｊ、、Ｂｕｘｔｏｎ、Ｆ、Ｐ
、＆　Ｔｕｒｎｅｒ、Ｇ、。
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　　Ａｓ　ｅｒ　
　１ｌｌｕｓ　　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　　ｂｙ　　ｔｈｅ
ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’　−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄ
ｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅｏｆ　　Ｎｅｕｒ
ｏｓ　　ｏｒａ　　ｃｒａｓｓａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏ　　ｈ　　ｓ、Ｒｅｓ。
Ｃｏｍｍｕｎ、　　月、２（１９８３）、２８４〜２８
９ページ。
３３、Ｔｉ１ｂｕｒｎ、ｏｒ、ｌ　　５ｃｈａｚｚｏｃ
ｃｈｉｏ、Ｃ０＋　　Ｔａｙｌｏｒ。
Ｇ、Ｔ、、　　Ｚａｂｉｃｋｙｚｉｓｓｍａｎ＋　　Ｊ
、Ｈ９＋　　Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ＋　　Ｒ，Ａ。
＆　Ｄａｖｉｅｓ、Ｒ，Ｗ、、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ　　ｂｙ　　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｉｎ倶匝虹
且ｕ１す」Ｕ±ｔｌａｔ型、卵重！　筐（１９８３）　
２０５〜２２１ページ。
３４、　　Ｙｅｌｔｏｎ＋　　Ｍ、、　　ｌａｍｅｒ、
　　Ｊ、Ｅ、　　＆　Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ。
Ｗ、Ｅ、＋　　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　　ｏｆ
　　Ａｓ　　ｅｒ　　１ｌｌｕｓ　　ｎ１ｄｕｌａｎｓ
ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ↓ｒｐ５　ｐｌａｓｍｉｄ、　　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８１　
（１９８４）、１４７０〜１４７４ページ。
３５、　　Ｋｅｌｌｙ、　　Ｊ、Ｍ、　　＆　Ｈｙｎｅ
ｓ、　　Ｍ、Ｊ、、　　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ−ｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ａｓ　ｅｒ　　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　　ｅｒ　
ｂｙ　　ｔｈｅ　ａｍｄＳ　ｇｅｎｅｏｆ　Ａｓ　ｅｒ
　１ｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎ
ａｌ　　４　　（１９８５Ｌ４７５〜４７９ページ。
３６、　　Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ＋　　Ｈ，、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆｅｎｚｙｍｅ　
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　ｉｎ　　１ｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌｌｙ　　ｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｕｎｇａｌ　　５ｔｒ
ａｉｎｓ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆＦｉｎｌａｎｄ、　　Ｐｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ　２６　　（１９８５）。
３７、　　Ｂｅｃｋｗｉｔｈ、　　Ｊ、Ｒ，、Ｐａｒｄ
ｅｅ、　　Ａ、Ｂ、、　　Ａｕ５ｔｒｉａｎ。
Ｒ，＆　Ｊａｃｏｂ、　　Ｆ、、　　Ｃｏｏｒｄｉｎａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　　ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　
　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ　　ｉｎ　　ｔｈｅ　ｐｙｒ
ｉｄｉｍｉｄｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆＥ、ｃｏｌｔ、
　Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、　　５　　（１９６２）、　
６１８〜６３４ページ。
３８、　Ｂａ１ｌａｎｃｅ、　　Ｄ、Ｊ、　＆　Ｔｕｒ
ｎｅｒ、　Ｇｅｌ　　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ　ａ
　ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ八ｓへ　ｅｒ　　１ｌｌ
ｕｓ　　ｎ１ｄｕｌａｎｓ、　　Ｇｅｎｅ　　　３６　
　（１９８５Ｌ　　３２１〜３３１ページ。
３９、　　Ａｒｒｏｙｏ−Ｂｅｇｏｖｉｃｈ、　　Ａ、
　　＆　ＤｅＭｏｓｓ＋　　Ｊ、Ａ、、　　Ｔｈｅｉｓ
ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
ｓ　ｏｆ　　ｔｈｅ　ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅｓｙｎ
ｔｈａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　　ｆｒｏｍ　Ｎｅｕｒｏ
ｓ　ｏｒａ　ｃｒａｓｓａ。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌｌ、　　２４８（１９７３）
、　１２６２〜１２６７ページ。
４０、　　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　　Ｔ、Ｅ、＋　　Ｎ
−（５’　−ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）ａｎｔｈ
ｒａｎｉｌａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ−ｉｎｄｏｌ−
３−ｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｐｈｏｐｈａｔｅ　５ｙｎｔ
ｈｅｔａｓｅ　ｏｆ　　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｂｉｏ
ｓｙｎｔｈｅｓｆｓ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　　１２０（１９７０）、６９９
〜７０７ページ。
４１、　Ｋｅｅｓｅｙ、　　Ｊ、に、Ｊ、Ｒ，＆　Ｄｅ
Ｍｏｓｓ、　　Ｊ、Ａ、＋Ｃ１ｏｎｉｎｇｏｆ　　ｔｈ
ｅ　↓Ｉユｇｅｎｅ　ｆｒｏ＋ａ　Ｎｅｕｒｏｓ　ｏｒ
ａ　　ｃｒａｓｓａ　ｂｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　ａ　ＩＵ弔ｍｕｔａｔｉｏｎ　１ｎＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　　１５２（１９８２）＋９５４〜９５８ペー
ジ。
４２、　Ｍａｎｉａｔｉｓ＋　　ＬＩ　　Ｐｒ１ｔｓｃ
ｈ、　　Ｒ，Ｆ、　　＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。
Ｊ、＋　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　
Ａ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ。
Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｊ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　　　　　　
’Ｈａｒｂｏｕｒ　　１９８２゜ ４３、　　Ｆｒ１ｓｃｈａｕｆ、　　Ａ、Ｍ、＋　　Ｌ
ｅｈｒａｃｈ、　　Ｍｏｌ　　Ｐｏｕｔｓｋａ、Ａ。
＆　Ｍｕｎａｙ、　Ｎ、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　
１７０（１９８３）、８２７ベージ。
４４、　ＰｅｎｔｔｉｌＭ、　Ｍ、Ｅ、＋　Ｎｅｖａｌ
ａｉｎｅｎ、　Ｋ、Ｍ、Ｈ，。
Ｒａｙａｌ、　Ａ、＆　ｋｎｏｗｌｅｓ、　Ｊ、に、Ｃ
，、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ハ匹ＬｉｌｌｕＳｎｉｅｒ
ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ、　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ　ｏｆｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　Ａｓ　ｅｒ
　１ｌｌｕｓ　　β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ。
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　　１９４（１９８４）
、４９４〜４９９ページ。
４５、　Ｈｙｎｅｓ　Ｍ、Ｊ、、　Ｃｏｒｒｉｃｋ＋　
Ｃ，Ｍ、　＆　Ｋｉｎｇ＋　Ｊ、Ａ。
ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｃｌｏｎ
ｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅａｍｄＳ　ｇｅｎ
ｅ　ｏｆ　Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ
　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｎａｌ
ｙｓｉｓ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄｒｅｇ
ｕｌａｔｏｒｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ、　Ｍｏ１．Ｃｅ
１１．Ｂｉｏｌ、　　３（１９８３）、　１４３０〜１
４３９ページ。
４６、　Ｃａ５ａｄａｂａｎ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｍａｒｔ
ｉｎｅｚ−Ａｒｉａｓ、　Ａ、＋５ｈａｐｉｒａ、　Ｓ
、に、　＆　Ｃｈｏｎ、　Ｊ、＋　　β−ｇａｌａｃｔ
ｏｓｉｄａｓｅｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ａ
ｎａｌｙｚｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉ
ｎ　ｔｉｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ旦ａｎｄ　ｙｅ
ａｓｔ、　ＭｅｔｈｏｄｓｂスＬがユ削用（１９８３）
、　２９３〜３０８ページ。
４７、　Ｒａｅｄｅｒ、　Ｕ、　＆　Ｂｒｏｄａ、　Ｐ
、、　Ｒａｐｉｄ　ｐｒｅｐａｒａ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　
ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ｆｕｎｇ
ｉ、　Ｌｅｔｔ、　ｉｎ八へｐ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、土（１９８５）　１７〜２０ページ。
４８、Ｂａ１ｌｅｙ、Ｍ、Ｊ、＆　０ｋｓａｎｅｎ、Ｊ
、、Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　
ｍｕｔａｎｔ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ　ｏｎ　ｎｏｎ−ｃｅｌｌｕｌｏ
ｓｉｃ　ｍｅｄｉａ、　Ｔｈ１ｒｄ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、　Ｍｕｎｉｃｈ　１０−１１０−１４Ｓｅｐｔｅ　１
９８４．　　Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ、　　ｖｏｌ　　ＩＩ
＋　　１５７〜１６２ページ。
４９、５ｏｌｌａｚｚｏ＋　Ｍ、ｌ　Ｆｒａｎｋ＋　Ｒ
，＆　Ｃｅ５ａｒｅｎｉ、　Ｇ、ＩＨｉｇｈ−１ｅｖｅ
ｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡ５　ａｎｄ　
ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｃｉ
ｓｅｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｄｉｎｇ−ｔｏ−ｒｅｇ
ｕｌａｔｏｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｓ。
釦胚　釘（１９８５）、　１９９〜２０６ページ。
５０、　Ｋｕｎｋｅｌ＋　Ｔ、ａ、ｔ　Ｒａｐｉｄ　ａ
ｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ　ｌｌｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｐｈ
ｅｎｏｔｙｐｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ　　８２　（１９
８５）。
４８８〜４９２ページ。
５１、　Ｊｏｈｎ、　Ｍ、Ａ、　＆　Ｐｅｂｅｒｄｙ、
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ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　１Ｉａｒｂｏｒ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。
６７、　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ　ｃｈｙｍ
ｏｓｉｎ　ｉｎ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ｍ１ｌｋ　
β−ｋａｓｅｉｎ　ｈａｓｂｅｅｎ　ｄｅｓｃｒｉｂｅ
ｄ　ｂｙ　５ｉｉｋａ−ａｈｏ、　Ｍ、（１９８３）Ｍ
ｉｋｒｏｂｉｒｅｎｎｉｉｎｉｎ　ｔｕｏｔｔａｍｉｎ
ｅｎ、　ＭＳｃ　Ｔｈｅｓｉｓ。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
ＶＴＴ＋　Ｔｉｅｔｏｔｉｅ　２，０２１５０Ｅｓｐｏ
ｏ＋　Ｆｉｎｌａｎｄ。
【図面の簡単な説明】
本発明は、添付図面に関してより詳しく下記に説明され
ている。 第１図は、染色体セルラーゼ遺伝子の不活性化の原理を
示す。 第２図は、工、リーセイの染色体ＣＢＨＩ　ｌ伝子座の
挿入突然変異生成のために使用されるプラスミドｐＭＳ
４の構成を示す。ＥｃｏＲ１部位の不活性化によって生
成されたフレームシフト突然変異の位置は＊によりマー
クされている。 第３図は、プラスミドｐ２８５　’　ｐｒｏＣの構成法
を示す。 第４図は、プラスミドｐＭＴ６４８及び１５ｐＭＴ８１
３の構成法を示す。 第５図は、プラスミドｐＭＴ８３７の構成法を示す。 第６図は、プラスミドｐＲ２７の制限地図を示す。 第７図は、プラスミドｐＡＭ旧ＯＯの制限地図を示す。 第８図は、プラスミドｐＡ）ｌＨ１０５の構成法を示す
。 第９図は、合成されたオリゴヌクレオチド、ＯＡＭＨ１
、ＯＡＭ）ｌ　２及びＯＡＭＨ３を用いてループ−突然
変異生成することによるプラスミドｐＡＭ旧１０３゜ｐ
ＡＡｌ５Ｏ１２びｐＡＭＨｌｌｏｌの構成法を示す。 第１０図は、リンカ−ＮＯＲ２０２、Ｎ０Ｒ２０３、Ｏ
ＡＭＩＩ　１　。 ＯＡＭＨ２及びＯＡＭＨ３を示す。 第１１図は、プラスミドｐＡＭＨ１０２及びｐＡＭＨ１
０４の制限地図を示す。 第１２図は、プラスミドｐＡＭＨ１１０３の制限地図及
びｐＡＭ旧０３の構成法を示す。 第１３図は、プラスミドｐＡＭ旧１０６の制限地図及び
ｐＡＭＨ１０６の構成法を示す。 第１４図は、プラスミドｐＡＭＨ１１０１の制限地図及
びｐＡＭ旧０１の構成法を示す。 第１５図は、プラスミドｐＡＭＨ１１０の構成法を示す
。 第１６図は、ＣＧ）ｌ　Ｉプロモーター機能下でＥＧＩ
の発現のために使用されるプラスミドｐＡＭＨ１１１の
構成法を示す。 第１７図は、エエユ−−ｔｌにおけるキモシンの発現を
示す。ウェスターンプロットレーン１；精製されたプロ
キモリンの対照、微量のブスウドウキモシン及びキモシ
ンを含む、レーン２　；ｐＡＭＨ１０２を含む株の増殖
からの培養上清液、レーン３；プラスミドを含まない株
からの培養上清液、レーン４　；　ｐＡＭＨ１０２を含
む株からの菌糸体。これは、図面に代わる写真である。 手続補正３（方式） 昭和６２年ノ月２２　日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第１０４８３８号 ２、発明の名称 トリコダーマの形質転換 ３、　補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　アルコ　リミティド ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番ＩＯ号静光
虎ノ門ビル　電話５０４−０７２１５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１１願書の「出願人の代表者」の欄 （２）委任状 （３）明細書 （４）図面 （５）法人証明書 ７、補正の内容 ＋１１　（２）　＋５１　　別紙の通り（３）明細書の
浄書（内容に変更なし）（４）図面の浄書（内容に変更
なし） ８、添附書類の目録

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、トリコダーマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転
    換に使用のためのベクターシステムであって、 ａ）目的とするタンパク質生成物をコードする遺伝子、 ｂ）目的とする生成物の発現を制御するために機能可能
    的に結合されたプロモーター／エンハンサーを含む遺伝
    子発現を促進する機能、及び ｃ）選択マーカーを含んで成るベクターシステム。 ２、目的とするタンパク質生成物のために該遺伝子の５
    ′末端の上流に融合されたシグナル／リーダー配列をさ
    らに含んで成る特許請求の範囲第１項記載のベクターシ
    ステム。 ３、前記プロモーターがトリコダーマ中において機能す
    ることができる特許請求の範囲第１又は第２項記載のベ
    クターシステム。 ４、前記プロモーターが、トリコダーマと異質のタンパ
    ク質のための遺伝子に由来する特許請求の範囲第１項記
    載のベクターシステム。 ５、前記シグナル／リーダー配列が、トリコダーマによ
    って分泌されたタンパク質のための遺伝子に由来する特
    許請求の範囲第２項記載のベクターシステム。 ６、前記シグナル／リーダー配列が、トリコダーマと異
    質の分泌されたタンパク質に由来する特許請求の範囲第
    ２項記載のベクターシステム。 ７、前記シグナル／リーダー配列が、目的とするタンパ
    ク質のシグナル／リーダー配列に由来する特許請求の範
    囲第５又は６項記載のベクターシステム。 ８、前記シグナル配列がトリコダーマ　リーセイ（Ｔｒ
    ｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のｃｂｈ I シグ
    ナル配列である特許請求の範囲第５項記載のベクターシ
    ステム。 ９、前記シグナル配列がアスペルジラス（Ａｓｐｅｒｇ
    ｉｌｌｕｓ）のグルコアミラーゼ　シグナル配列である
    特許請求の範囲第６項記載のベクターシステム。 １０、前記目的とするタンパク質がトリコダーマと同質
    である特許請求の範囲第１項記載のベクターシステム。 １１、前記目的とするタンパク質がトリコダーマと異質
    である特許請求の範囲第１項記載のベクターシステム。 １２、前記目的とする生成物がプロキモリンである特許
    請求の範囲第１１項記載のベクターシステム。 １３、前記目的とするタンパク質がＴ．リーセイのエン
    ドグルカナーゼ（ＥＧ I ）である特許請求の範囲第１
    ０項記載のベクターシステム。 １４、前記プロモーターがトリコダーマ　リーセイの￥
    ｃｂｈ￥ I プロモーターである特許請求の範囲第３項
    記載のベクターシステム。 １５、前記プロモーターがアスペルジラスのグリコアミ
    ラーゼ　プロモーターである特許請求の範囲第４項記載
    のベクターシステム。 １６、前記選択マーカーがアスペルジラス　ニジュラン
    ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａ
    ｍｄＳ遺伝子、アスペルジラス　ニジュランス又はトリ
    コダーマ　リーセイのａｒｇＢ遺伝子又はネウロスポラ
    クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）又はト
    リコダーマリーセイのｐｙｒ４遺伝子に由来する特許請
    求の範囲第１項記載のベクターシステム。 １７、少なくとも２種のプラスミド又はベクターを含ん
    で成る特許請求の範囲第１項記載のベクターシステム。 １８、前記選択マーカーを１つのプラスミド上に配置し
    、そして宿主ゲノムに導入されるべき残存するＤＮＡ−
    配列をもう１つのプラスミド上に配置する特許請求の範
    囲第１７項記載のベクターシステム。 １９、前記特許請求の範囲第１〜１８項のいづれか１項
    記載のベクターシステムにより安定して形質転換された
    トリコダーマ菌株。 ２０、トリコダーマの形質転換方法であって、適切なト
    リコダーマ菌株を、前記特許請求の範囲第１〜１８項の
    いづれか１項記載のベクターシステムにより形質転換す
    る方法。 ２１、トリコダーマ中にタンパク質生成物を産生するた
    めの方法であって、適切な宿主微生物を、特許請求の範
    囲第１〜１８項のいづれか１項記載のベクターシステム
    により形質転換し、該形質転換された菌株を適切な培養
    培地中で培養し、そして分泌されたタンパク質生成物を
    該培養培地から回収する方法。 ２２、トリコダーマ中にタンパク質生成物を産生するた
    めの方法であって、特許請求の範囲第１〜１８項のいづ
    れか１項記載のベクターシステムにより形質転換された
    適切な宿主微生物を適切な培養培地中で培養し、そして
    発現され、そして分泌されたタンパク質生成物を前記培
    養培地から回収することを含んで成る方法。 ２３、前記宿主微生物が原栄養性Ｔ．リーセイ菌株であ
    る特許請求の範囲第２１又は２２項記載の方法。 ２４、前記宿主微生物が栄養要求性Ｔ．リーセイ菌株で
    ある特許請求の範囲第２１又は２２項記載の方法。 ２５、前記宿主菌株が目的としない生成物をコードする
    いづれの遺伝子も欠失する特許請求の範囲第２１〜２４
    項のいづれか１項記載の方法。 ２６、前記宿主の５鎖が￥ｃｂｈ１￥遺伝子に欠失する
    特許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、特許請求の範囲第１〜１８項のいづれか１項記載
    のベクターシステムにより形質転換されるべき宿主菌株
    として用いることができる栄養要求性トリコダーマ菌株
    。
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