JP2769305B2 - トリコダーマにおいてタンパク質生成物を産生するための方法 - Google Patents

トリコダーマにおいてタンパク質生成物を産生するための方法

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Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、トリコダーマの形
質転換に使用するためのベクターシステム、トリコダー
マにおけるタンパク質の高レベルでの発現及び分泌のた
めの方法、ＤＮＡ組換え体ベクター及び形質転換された
トリコダーマ菌株に関する。 【０００２】 【発明の背景】繊維状菌類は、種々の発酵生成物を製造
するために生物工学に広く使用される下等真核生物であ
る。菌類は多くの工業的に重要な酵素、たとえばグルコ
アミラーゼ、プロテアーゼ、ラクターゼ、ペクチナーゼ
及びグルコセオキシダーゼを分泌する。 【０００３】繊維状菌類は多くの生物工学的利点を有す
る。それらは一般的に高い量のタンパク質を産生し、大
規模での培養は複雑でなく、そして発酵の後、培養液体
からの菌糸体の分離が容易である。 【０００４】中温性不完全菌類トリコダーマ リーセイ
〔以前はＴ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）〕（参照１）
は、セルロースバイオマスの転換に必要とされる酵素を
産生し、そしてたぶん最も広く研究されたセルラーゼ産
生生物である。 【０００５】セルロースのグリコースへの加水分解のた
めには、３種のタイプの酵素活性が必要とされる；通
常、置換された可溶性基質を攻撃し、そして結晶性セル
ロースに親和性を示さない、ランダム切断性エンドグル
カナーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラ
ーゼ、ＥＣ．３，２，１，４）；結晶性セルロースを分
解することができるが、しかし誘導体化されたセルロー
スに対する活性を持たないセルロビオヒドロラーゼ
（１，４−β−Ｄ−グルカン セルロビオヒドロラー
ゼ、ＥＣ．３，２，１，９１）及びグルコースを得るた
めにセロビオース及びセロ−オリゴ糖を攻撃するβ−グ
ルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシド グルコヒドロラー
ゼ、ＥＣ．３，２，１，２１）。いくらかのこれらの酵
素間の相乗作用が示された（参照２〜４）。 【０００６】菌類のセルラーゼが精製され、そして特徴
づけられ、そしてすべての３種の主要タイプの酵素は、
多種の形で存在することが示された（参照５）。２つの
免疫学的に異なるセルロビオヒドロラーゼ、すなわちＣ
ＢＨＩ及びＣＢＨIIは、Ｔ．リーセイの培養培地から検
出された（参照４，６）。５〜８の電気泳動的に異なる
エンドグルカナーゼが報告され、それらの多くは、基質
特異性を変えることを示した（参照７，８，９，１
０）。２つの細胞外β−グルコシダーゼの特徴化が報告
された（参照１１）。 【０００７】突然変異及びスクリーニングの直接的アプ
ローチを用いて開発された多くの菌株は、いくつかの高
収率のＴ．リーセイ突然変異株を好結果をもたらして産
生した（参照１１〜２２）。最良のＴ．リーセイ突然変
異体によって産生された細胞外タンパク質の量は、培養
流体１ｌ当り２０〜３０ｇであり、これは合計細胞タン
パク質の５０％以上である。分泌されたタンパク質の主
要部分は、セルラーゼを含み、そしてその間には、ＣＢ
ＨＩ成分が最も豊富であり、そして分泌されたセルラー
ゼタンパク質の６０％まで示す。 【０００８】ＣＢＨＩのための遺伝子は、Ｓｈｏｅｍａ
ｋｅｒなど（参照２３）及びＴｅｅｒｉなど（参照２
４）によってクローンされ、そして該遺伝子の完全なヌ
クレオチド配列は公表されている（参照２３）。Ｔ．リ
ーセイからまた、主なエンドグルカナーゼＥＧＩのため
の遺伝子がクローンされ、そして特徴づけられた（参照
２５，２６，２７）。他の単離されたセルラーゼ遺伝子
はｃｂｈ２（参照２８，２９）及びｅｇｌ３（参照３
０）である。 【０００９】産業的に重要な繊維状菌類の分子生物学
は、一般的に良く知られていない。これは一部、有性生
殖サイクル及び／又は遺伝的な形質転換システムの不十
分な認識による。最近、形質転換システムが、ネウロス
ポク クラサ（参照３１）、Ａ．ニジュランス（参照３
２，３３，３４）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）参
照３５）のために開発され、そしてそれらは、ベクター
分子によって担持されるそれぞれの機能性遺伝子により
突然変異宿主の相補性においてそれらの主成分を一般的
に有する。しかしながら、これらの菌類の中でＡ．ニガ
ーのみが当座は、産業的興味の対象である。 【００１０】菌類の分類において、属アスペルジラス
は、綱アスコマイセティス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ
ｓ）、サブクラス ユーアスコマイセティス（Ｅｕａｓ
ｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に含まれる。ユーアスコマイセテ
ィスは、子実体に基づいて３つの群、すなわちプレクト
マイセティス（Ｐｌｅｃｔｏｍｙｃｅｔｏｓ）、ピレノ
マイセティス（Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）及びジス
コマイセティス（Ｄｉｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に分けら
れる。最も重要な属は、アスペルジラス及びペニシリア
ム（参照５６）である。代わりに、トリコダーマが不完
全菌類のメンバーとして分類される。不完全菌類は、有
性生殖又は有性生殖属との明確な類似性を持たない菌
類、たとえばひじょうに特徴的なアスペルジラスのキャ
ッチ−オール カテゴリーである。トリコダーマは、完
全なアスコマイセティス種ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒ
ｅａ）（参照５７）の不完全状態である不十分に定義さ
れた生殖段階を有することを報告されたけれども、属ア
スペルジラス及びトリコダーマは明らかに、分類学上ひ
じょうに異なると思われる。アスペルジラス ニジュラ
ンスからのａｒｇｂ遺伝子及びネウロスポラ クラサか
らのｐｙｒ４遺伝子は、非ストリンジェント条件下でそ
れぞれのトリコダーマの遺伝子にハイブリダイズせず、
従ってトリコダーマは他のアスコマイセテス（Ａｓｃｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ）と進化論的にまったく異なるという考
えを推定できることもまた示された（Ｖａｎａｎｅｎ，
Ｓ．，調製において）。 【００１１】増殖培地中にタンパク質を分泌する、その
例外的能力によって、トリコダーマリーセイは、タンパ
ク質の産生のための可能な宿主として良好な候補者であ
ると思われる。しかしながら、これまでは、Ｔ．リーセ
イの遺伝研究は、該菌類のセルラーゼ産生特性を改良す
ることにほとんど向けられ、そしてハイパ−セルロチッ
ク（Ｈｙｐｅｒｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃ）トリコダーマ菌
株の開発のために使用される技術は、単に従来の突然変
異生成及びスクリーニングであった。トリコダーマのた
めの形質転換システムは、今まで開発されていない。 【００１２】トリコダーマ リーセイのための有効な宿
主−ベクターシステムを提供し、トリコダーマ中に異質
のタンパク質の高い発現及び分泌レベルを得、又は同質
のタンパク質の産生を高めることが本発明の主な目的で
ある。 【００１３】本発明の明細書において、表現“トリコダ
ーマに異質のタンパク質”とは、トリコダーマによって
天然に産生されないタンパク質を意味し、ところが“ト
リコダーマに同質のタンパク質”とは、トリコダーマ自
体によって産生されるタンパク質を意味する。 【００１４】初めに開発された菌類の形質転換システム
において、すなわちアスペルジラス及びネウロスポラに
おいては、形質転換がプロトプラストを用いて行なわれ
る。形質転換性ＤＮＡが通常、宿主のゲノム中に組込ま
れる。安定した形質転換体を同定するための選択システ
ムを得るためには、ベクターシステムが、宿主ゲノムの
対応する突然変異を補足するか、又は特定の増殖培地上
での原栄養株の増殖のために必要な活性、通常酵素を供
給する機能的な遺伝子（選択マーカー）を担持すべきか
である。 【００１５】 【発明の要約】本発明は、トリコダーマの形質転換のた
めの組換え体ＤＮＡクローニングベクターシステムを記
載する。このＤＮＡクローニングベクターシステムが目
的とするタンパク質生成物をコードする ＤＮＡ配列を
含有する場合、本発明のベクターシステムによるトリコ
ダーマの形質転換は、形質転換された微生物が適切な培
養培地中において増殖される場合、目的とするタンパク
質の高レベルの発現及び分泌を提供するであろう。 【００１６】その第１の観点によれば、本発明は、 ａ）目的とするタンパク質生成物をコードする遺伝子、 ｂ）目的とする生成物の発現を制御するために機能可能
的に結合されたプロモーター／エンハンサーを含む遺伝
子発現を促進する機能、 ｃ）場合によっては、目的とする生成物のために該遺伝
子の５′末端の上流に融合されたシグナル／リーダー配
列及び ｄ）選択マーカーを含んで成るベクターシステムを提供
する。 【００１７】その第２の観点によれば、本発明は、トリ
コダーマの形質転換のための方法を提供し、ここで適切
なトリコダーマ菌株が本発明のベクターシステムにより
形質転換される。 【００１８】その第３の観点によれば、本発明は、本発
明のベクターシステムによりトリコダーマを形質転換
し、該形質転換された菌株を適切な培地中で培養し、そ
して発現され、そして分泌された生成物を該培地から回
収することを含んで成る、トリコダーマにおけるタンパ
ク質の産生のための方法を提供する。 【００１９】本発明はまた、トリコダーマ中にタンパク
質の産生のための方法も提供し、この方法によって、ベ
クターシステムにより形質転換されたトリコダーマ菌株
は、適切な培地中で培養され、そして発現され、そして
分泌されたタンパク質が該培養培地から回収される。本
発明はさらに、安定して形質転換されたトリコダーマ菌
株を提供する。 【００２０】本明細書に使用される場合、“ベクターシ
ステム”とは、宿主ゲノム中に組込まれるべきＤＮＡ−
情報を共に含む単一のベクター又はプラスミドもしくは
複数のベクター又はプラスミドを含む。該ベクター又は
プラスミドは、線状又は閉環状分子である。トリコダー
マ中における自己複製プラスミドは現在知られていない
が、本発明はまた、のちに見出されるにちがいない、そ
のような自己複製プラスミドも包含する。 【００２１】本発明のベクターシステムは、プロモータ
ー、エンハンサー及び転写開始部位並びにターミネータ
ーを含む遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ
−配列、形質転換体の選択のためのマーカー及び目的の
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んで成る。 【００２２】発現された生成物の分泌を確保するため
に、目的とする生成物のための遺伝子は、好ましくは、
細胞の分泌路中に、発現された生成物の有効な方向を確
保する前領域を提供される。この前領域（天然に存在す
るシグナル又はリーダーペプチドもしくはその一部であ
る）は一般的に、分泌の間、目的の生成物から切断さ
れ、この後、その成熟した生成物は、培養培地から単離
され得る。目的とする生成物のための遺伝子は、ゲノム
遺伝子又はｃＤＮＡクローンから得られる。ＤＮＡ−配
列はまた、合成され得る。 【００２３】シグナル／リーダー配列は、目的とするタ
ンパク質をコードする遺伝子のシグナル／リーダー配列
に由来し、又はトリコダーマ又は他の生物源のいづれか
からの他の分泌されたタンパク質のための遺伝子に由来
する。トリコダーマによって分泌されるタンパク質をコ
ードする遺伝子に由来するシグナル／リーダー配列の例
は、ｃｂｈ１シグナル配列又はｅｇｌ１シグナル配列又
はその一部である。トリコダーマに異質の分泌されたタ
ンパク質をコードする遺伝子に由来するシグナル／リー
ダー配列は、アスペルジラスのアミラーゼ又はグルコア
ミラーゼのための遺伝子に由来する。また合成シグナル
／リーダー配列も使用され得る。 【００２４】プロモーターは、トリコダーマ中に転写活
性を示すＤＮＡ配列であり、そしてトリコダーマに同質
か又は異質の遺伝子に由来することができる。トリコダ
ーマに同質のタンパク質をコードする遺伝子に由来する
プロモーターの例は、ＣＢＨＩプロモーター又はＥＧＩ
プロモーターもしくはその一部である。トリコダーマに
異質のタンパク質のための遺伝子に由来するプロモータ
ーの例は、アスペルジラスのグルコアミラーゼ プロモ
ーターである。転写ターミネーターは、プロモーターと
同じ源に由来する。また合成プロモーター又はターミネ
ーター配列も使用され得る。 【００２５】特別に言及されたすべてのＤＮＡ配列は、
コードされた生成物の機能に不可欠な塩基の数個を補正
又は欠失することによって変性され得ることが理解さ
れ、そしてそれは当業者にとっては明らかである。たと
えば、ｃｂｈ１又はｅｇｌ１シグナル又はプロモーター
配列に実質的に類似するＤＮＡ配列は、それらがトリコ
ダーマ中において意図された機能を示すかぎり使用され
得る。また目的とするタンパク質のための遺伝子は、こ
れがタンパク質の活性に対して悪影響を持たないかぎ
り、変えられ得る。 【００２６】異なった選択マーカー、たとえばａｒｇＢ
（Ａ．ニジュランス又はＴ．リーセイ）、ａｍｄＳ
（Ａ．ニジュランス）及びｐｙｒ４（ネウロスポラ ク
ラサ又はＴ．リーセイ）が使用され得る。 【００２７】宿主菌株は、形質転換方法に使用される選
択マーカーに依存して、原栄養性又は栄養要求性トリコ
ダーマ菌株である。本明細書の実験部分に示されている
ように、Ａ．ニジュランスからのａｍｄＳ遺伝子は、原
栄養性Ｉ．リーセイの形質転換のために使用され得る。
Ｔ．リーセイは単一の窒素源としてアセトアミド上で完
全に増殖せず、そしてその増殖は培地上にＣｓＣｌを添
加することによってさらに阻害され得る。従って、Ｃｓ
Ｃｌの存在下で単一の窒素源としてアセトアミド上での
増殖は、ａｍｄＳ+ 形質転換体を同定するために選択培
地として使用され得る。 【００２８】宿主ゲノムの対応する突然変異を相補する
選択マーカーが使用される場合、栄養要求性トリコダー
マ突然変異体が構成されるべきである。栄養要求性トリ
コダーマ突然変異体は、突然変異株を産生するための既
知方法によって製造され得る。 【００２９】増殖のためにウラシル、トリプトファン又
はアルギニンを必要とする栄養要求性トリコダーマ突然
変異体は、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ（参照３６）によって
記載されているようにして、濾過濃縮技法（ｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅ）によって単離された。アルギニン要求性栄養要求体
から、ａｒｇＢ遺伝子を欠失する突然変異体が、アルギ
ニン生合成において異なった中間体によって供給される
一連の最少プレートを用いることによって同定された。
ウラシル要求性突然変異体から、ｐｙｒ４遺伝子を欠失
する菌株を、菌糸体調製物（参照３７）においてオロチ
ジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ（ＯＭＰ
ｄｅｃａｓｅ）の活性を測定することによって見出す
ことができる。 【００３０】ｔｒｐ１遺伝子欠失の突然変異体は、それ
らの菌糸体におけるＰＲＡイソメラーゼ−ＩｎＧＰシン
セターゼ活性の欠失によって特徴づけられる（参照４
０）。酵素活性を示さない突然変異体のｔｒｐ１−特性
は、たとえばＮ．クラサのｔｒｐ１プラスミド（参照４
１）又はＡ．ニジュランスのｔｒｐＣ−プラスミド（参
照３４）による形質転換及び相補性によって確認され得
る。 【００３１】使用される形質転換技法はＡ．ニジュラン
スの形質転換法（参照３２，３３）から改造された方法
である。プロトプラストは、寒天プレート上で菌糸体を
増殖し、そしてＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）２３４の緩
衝溶液中に菌糸体を懸濁することによる既知の方法によ
って調製される。従来のＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）２
３４のスクロース溶液の代わりに、ソルビトール溶液が
好都合に使用され得る。次に、本発明の実験部にさらに
詳しく記載しているようにして、形質転換性ＤＮＡが前
記プロトプラスト溶液に添加される。形質転換は普通、
同時形質転換として行なわれ、それによって、選択不可
能なプラスミドがもう１つのプラスミド中に挿入される
選択可能なマーカー（たとえばｐ３ＳＲ２中へのａｍｄ
Ｓ又はｐＳａ１４３中へのａｒｇＢ）を用いて高頻度で
Ｔ．リーセイ中に同時形質転換される。等モル量のＤＮ
Ａが形質転換のために使用される場合、高い割合の形質
転換体が、ゲノム中に組込まれた選択不可能なプラスミ
ドを含む。ａｒｇＢ- Ｔ．リーセイ菌株が、等モル量の
プラスミドｐ３ＳＲ２及びｐＳａ１４３による形質転換
に使用される場合、形質転換体を、二重選択培地（最少
培地、アセトアミド、ＣｓＣｌ）上に得ることができ
る。他方、単鎖のプラスミドは、形質転換のために使用
され得、ここでまた、マーカーが挿入される。 【００３２】次に、形質転換体は、適切な培地中で培養
される。単純な培地中に目的とする生成物を産生するこ
とができるためには、グルコース誘導性プロモーターが
使用される。トリコダーマが１％グルコースを含む培地
上で増殖される場合、プロテアーゼを含む、すべての細
胞外タンパク質の分泌が強く抑制される。目的とする酵
素をコードする遺伝子がグルコース含有性培地中におい
て強く発現されるプロモーターに連結される場合、目的
とする酵素は増殖培地に分泌される。他のタンパク質は
これらの条件下で産生されないので、目的とする酵素
は、培地中に分泌される主なタンパク質である。 【００３３】菌類の菌糸体が除去される場合、目的とす
るタンパク質は、種々の純粋な形でその得られた溶液に
存在する。必要により、それはさらにひじょうに容易
に、精製され得る。なぜならば、それはほとんどタンパ
ク質のみであるからである。 【００３４】本発明はまた、宿主生物のある酵素活性を
産生する遺伝子を変性又は不活性化するためにも使用さ
れ得る。例として、セルラーゼ−陰性Ｔ．リーセイ菌株
が構成され得る。この突然変異生成は、欠失されたセル
ラーゼ遺伝子を担持するプラスミドによるトリコダーマ
リーセイの形質転換に基づかれる。染色体セルラーゼ
遺伝子産でのプラスミドの同質組換えは、内存性Ｔ．リ
ーセイ セルラーゼ遺伝子の挿入不活性化を引き起こ
す。形質転換のために使用されるプラスミドは、セルラ
ーゼコード領域の一部のみを含み、そして不活性タンパ
ク質を産生する。５′を末端とする配列は含まれない。
フレームシフト変異がまた、切断されたコード領域に導
入され得る。選択マーカー（ａｒｇＢ）又はスクリーニ
ングのためのマーカー（ｌａｃＺ）が形質転換のために
使用されるプラスミドに連結され得る。組換えの後、マ
ーカーは、２種の得られた欠陥性セルラーゼ遺伝子の間
に、配置されるであろう。その方法の原理は第１図に示
される。 【００３５】本発明は、キモシン及びトリコダーマ リ
ーセイのエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）によって例示
される。プロモーター、シグナル及びリーダー並びにタ
ーミネーター配列は、アスペルジラス ニガーからのグ
ルコアミラーゼ遺伝子又はトリコダーマ リーセイのｃ
ｂｈ１遺伝子のいづれかに由来した。選択マーカーとし
て、Ａ．ニジュランスからのａｍｄＳ遺伝子が使用され
た。 【００３６】材 料 プラスミド： ｐ２８５：ＡＴＣＣ ２０６８１ ｐＣＡＭＧ９１：参照５６ ｐｉＣ１９Ｒ：参照５７ ｐＳａ１４３：参照４８＋５１ ｐ３Ｒ２：参照３０＋３２ ｐＤＪＢ２：参照３５ ｐＭＣ１８１７：参照４３ ｐＴＴ０１，ｐＴＴ１１：参照２７ ｐＵＣ ９，ｐＵＣ１３：参照５９ ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９：参照５５ 【００３７】菌株：Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、ＪＭ
１０１，ＪＭ １０９及びＤＨＩ（参照５９）がＥ．
コリ クローニングにおいて宿主として使用される。ト
リコダーマリーセイ菌株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ ２６
９２１）及びＲＵＴ−Ｃ−３０（ＡＴＣＣ ５６７６
５）が菌類の形質転換及び発現研究に使用される。 【００３８】トリコダーマの最少培地： グルコース ２ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ５ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 １５ｇ ＭｇＳＯ4 ０．６ｇ ＣａＣｌ ０．６ｇ ＦｅＳＯ4 ，７Ｈ2 Ｏ ５mg ＭｎＳＯ4 ，Ｈ2 Ｏ １．５６mg ＺｎＳＯ4 ，７Ｈ2 Ｏ １．４mg ＣｏＣｌ2 ２mg／１Ｈ2 Ｏ 【００３９】 【実施例】 実 験 例 １ 栄養要求性Ｔ．リーセイ突然変異菌株の誘導、濃縮及び
単離。 増殖のためにウラシル、トリプトファン又はアルギニン
を必要とする栄養要求性突然変異体を、Ｎｅｖａｌａｉ
ｎｅｎ（参照３６）によって記載されているようにし
て、濾過濃縮法を用いて単離する。使用される突然変異
誘発剤は、紫外線である。アルギニン要求性の栄養要求
体から、ａｒｇＢ遺伝子を欠失する突然変異体が、アル
ギニン生合成において異なった中間体によって供給され
る一連の最少プレートを用いることによって同定される
（参照３６）。増殖のためにシトルリンを必要とする突
然変異体は、可能性あるａｒｇＢ- 突然変異体として考
慮される。単離された突然変異体のａｒｇＢ- 特性は、
Ａ．ニジュランスのａｒｇＢ遺伝子（例４）を含むプラ
スミドｐＳａ１４３を用いて原栄養体中にそれらを形質
転換することによって確認される。 【００４０】ウラシル要求性突然変異体から、ｐｙｒ４
遺伝子を欠失する菌株が捜し求められる。これらの突然
変異体のｐｙｒ４- 特性を、Ｎ．クラサのｐｙｒ４遺伝
子（参照３８）を含むプラスミドによる形質転換によっ
て確認した。 【００４１】例 ２ プロトプラストの調製。 菌糸体をポテトデキストロース寒天プレート（Ｄｉｆｃ
ｏ）上のセロファンディスク上で増殖する。５枚のセロ
ファン培養物からの菌糸体を、０．１Ｍリン酸カリウム
によりpH５．６で緩衝化された、１．２Ｍソルビトール
中Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）２３４の５mg／ml溶液１
５ml中に懸濁する。その混合物を３０℃で１．５〜２時
間、インキュベートする。焼結ガラス濾過（多孔度１）
により菌糸体破壊物からプロトプラストを分離し、４０
００ｇで５分間ペレット化し、そして１．２Ｍソルビト
ール−１０mMのＴｒｉｓ，ＨＣｌ（pH７．５）溶液によ
り２度洗浄する。 【００４２】プロトプラストのより良好な精製は、Ｔｉ
ｌｌｂｕｒｎなど（参照３３）によって記載された方法
を用いることによって達成され得る。pH５．８で緩衝化
された、１．２ＭのＭｇＳＯ4 中、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登
録商標）２３４の５mg／ml溶液を、プロトプラスティン
グのために使用する。インキュベーション及び濾過の
後、そのプロトプラスト懸濁液を、０．６Ｍソルビトー
ル−１００mMのＴｒｉｓ，ＨＣｌ（pH７．０）の等体積
と共に４０００ｇで１５分間、遠心分離する。プロトプ
ラストは、管の中間に鋭いバンドを形成する。そのプロ
トプラストを、１．２Ｍソルビトール−１０mMのＴｒｉ
ｓ，ＨＣｌ溶液（pH７．５）１体積中に懸濁し、回転沈
殿せしめ、そして１．２Ｍソルビトール−１０mMのＴｒ
ｉｓ，ＨＣｌ溶液（pH７．５）により２度洗浄する。そ
のプロトプラストを、５×１０6 〜５×１０7 個のプロ
トプラスト／mlの濃度で、１．２Ｍソルビトール−１０
mMのＣａＣｌ2 −１０mMのＴｒｉｓ，ＨＣｌ溶液（pH
７．５）中に懸濁する。 【００４３】プロトプラストの生存率を、浸透圧安定剤
として１Ｍソルビトールを含むトリコダーマの最少培地
上で評価する。その再生頻度は、菌株ＱＭ９４１４（Ａ
ＴＣＣ ２６９２１）のためには４０〜８０％である。 【００４４】例 ３ Ａ．ニジュランスのアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）を用
いてＴ．リーセイの形質転換。 プラスミドｐ３ＳＲ２を、形質転換に使用する。それ
は、完全なアセトアミダーゼ構造遺伝子ａｍｄＳ及びそ
の調節領域ａｍｄＩを担持するＡ．ニジュランスＤＮＡ
を含む（参照４５及び３３）。 【００４５】形質転換性ＤＮＡ２０μｌ（４〜１０μ
ｇ）を、プロトプラスト溶液２００μｌ中に添加する。
２５％ＰＥＧ ６０００−５０mMのＣａＣｌ2 −１０mM
のＴｒｉｓ，ＨＣｌ溶液（pH７．５）５０μｌを添加
し、そしてその混合物を、氷上で２０分間、インキュベ
ートする。ＰＥＧ溶液２mlを添加し、そしてその混合物
を、室温でさらに５分間、インキュベートする。１．２
Ｍソルビトール−１０mMのＣａＣｌ2 −１０mMのＴｒｉ
ｓ，ＨＣｌ溶液（pH７．５）４mlを添加し、そしてその
プロトプラストを３％寒天表面上にプレートする。その
選択培地は、（ＮＨ 4 ）2 ＳＯ4 の代わりに単一の窒素
源として１０mMアセトアミドを有するトリコダーマ最少
培地であり、そして浸透圧安定剤として１Ｍソルビトー
ル及びバックグラウンド増殖を抑制するために１２．５
mMのＣｓＣｌにより補充される。 【００４６】４０〜６００個の形質転換体／ＤＮＡμｇ
の形質転換頻度を、菌株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ ２６
９２１）のために得る。最も高い頻度は、ＤＮＡが２サ
イクルのＣｓＣｌ／エチジウムブロミド遠心分離により
精製される場合に得られる。 【００４７】胞子形成は選択培地上ではめったに観察さ
れないが、しかしポテト デキストロース寒天に移され
る場合、通常、その形質転換体は胞子形成する。アセト
アミド上で増殖するそれらの能力は多様である。選択培
地上でのコロニィーの直径は、１mm以下から１０〜２０
mmの範囲である。 【００４８】形質転換体の有糸分裂安定性を調べた。種
々のサイズの１０個の大きな形質転換体を、アセトアミ
ド−ＣｓＣｌプレート上に継代培養し、ポテト デキス
トロース（ＰＤ）上に胞子形成し、そしてＰＤ上に再プ
レートした。ヘテロカリオシスによって引き起こされた
異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を除くために、
１つの胞子から生まれる個々のコロニィーをＡｍｄＳ+
表現型について試験した。おのおのの元の形質転換体か
らの１つの陽性クローンを、非選択性培地上で連続プレ
ーチング（５増殖サイクル）にゆだね、そしておのおの
の世代の後、表現型を選択培地上で試験した。１つのサ
イクルの後、１０個の大きな形質転換体を非選択培地上
で試験し、その１０個の形質転換のうち６個は１００％
のＡｍｄＳ+ 分生子を与え、３個は４７〜８７％の分生
子を与え、そして１つの形質転換体は、ＡｍｄＳ+ 分生
子を与えなかった。この結果は、５つの非選択性増殖サ
イクルを通して同様のままであり、初めの不安定なＡｍ
ｄＳ+ 表現型が後で安定化され得ることを示唆した。 【００４９】元の１０個の小さなコロニィーのうち、３
個は、種々の頻度のＡｍｄＳ+ 表現型を有する胞子を与
えた（９４％，４４％及び５％の胞子）。他の７個のク
ローンは、アセトアミド上で増殖し得ない胞子のみを与
えた。興味あることには、得られたすべてのＡｍｄＳ+
は、大きなコロニィーの形質転換体の特徴を有する、活
発な増殖をアセトアミドプレート上で示した。 【００５０】形質転換体におけるプラスミドＤＮＡの存
在を全ＤＮＡのサザン法によって分析し、形質転換体か
ら単離し（Ｒａｅｄｅｒ及びＢｒｏｄａに従って、参照
４４）、ＸｈｏＩ又はＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩにより切
断した。ベクターｐＵＣ１８及びプラスミドｐ３ＳＲ２
のａｍｄＳ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメ
ントを、プローブとして使用する。その形質転換体は、
トリコダーマのゲノムＤＮＡ中の多くの異なった部位
で、すなわちゲノム当り１〜数個のコピィーでの組換え
によって生じることが示された。 【００５１】例 ４ Ａ．ニジュランス及びＮ．クラサのプラスミドによる
Ｔ．リーセイの形質転換。 異質ＤＮＡによる栄養要求性突然変異の相補性をＴ．リ
ーセイにおいて示す。Ａ．ニジュランスからのａｒｇＢ
遺伝子を含むプラスミドｐＳａ１４３を使用して、Ｔ．
リーセイのａｒｇＢ- 突然変異体株を形質転換する。
Ｎ．クラサからのｐｙｒ４遺伝子を含むプラスミドｐＤ
ＪＢ２を用いて、Ｔ．リーセイのｐｙｒ４ - 突然変異体
株を形質転換する。その形質転換体を、アルギニン又は
３０μｇ／mlウラシルを含まない最少培地上でそれぞれ
選択した。両者の場合の形質転換の頻度は、約３００個
の形質転換体／ＤＮＡμｇである。 【００５２】染色体ＤＮＡを、その形質転換体から単離
し、そしてサザン ハイブリダイゼーション実験のため
に使用し、Ｔ．リーセイの染色体ＤＮＡ中へのプラスミ
ドＤＮＡの正しい組込みを確めた。複数のタンデムコピ
ーのｐＳａｌ１４３を、ゲノム中に組込んだ。サザン及
びドット ブロット ハイブリダイゼーションは、分析
された形質転換において、ａｒｇＢのコピー数がおよそ
２〜１００以上異なることを示した。ＡｒｇＢ+ 形質転
換体は、少なくとも３世代を通して、表現型的に１００
％安定していることが示された。これは、完全培地上で
５個の形質転換からの分生子の連続プレーチングによっ
て試験し、そしてその後、最少培地（５０〜８０個のコ
ロニィー／形質転換体）上でＡｒｇ+ 表現型を試験し
た。 【００５３】例 ５ ａｍｄＳ及びａｒｇＢプラスミドによるＴ．リーセイの
同時形質転換。 非選択性プラスミドによりトリコダーマを同時形質転換
するための可能性は、アルギニン栄養要求性変異体によ
り最初に示された。 【００５４】ａｒｇＢ- Ｔ．リーセイ株を、等モル量の
Ａ．ニジュランスプラスミドｐＳａ１４３（ａｒｇＢ）
及びｐ３ＳＲ２（ａｍｄＳ）により形質転換し、形質転
換体をＡｒｇ+ 表現型について選択し、そしてアセトア
ミド−ＣｓＣｌ−プレート上で画線培養することによっ
てａｍｄＳの取得について試験した。ＡｒｇＢ形質転換
体のうち、８６％がまたＡｍｄＳ+ であった。同時形質
転換体のサザン分析は、両プラスミドが、ゲノム中のい
くつかの異なった位置に種々の量のコピーとして組込ま
れたことを指摘した（データは示されていない）。 【００５５】アセトアミド−ＣｓＣｌ最少培地上での二
重選択は、ＤＮＡμｇ当り約１００個のＡｍｄ+ Ａｒｇ
+ 形質転換体及びａｍｄＳ形質転換の特徴を示す多くの
小さなコロニィーをもたらした。 【００５６】ａｒｇＢ ａｍｄＳ同時形質転換体のＡｒ
ｇＢ+ 表現型の安定性を試験する場合、５個のうち３個
が１００％安定していると判明され、ところが他は、分
析された子孫の７％又は８０％においてＡｒｇＢ+ 特性
を失っていた。同じ個々のコロニィーはまた、ＡｍｄＳ
+ 表現型も失なっていた。この不安定性が、たとえば、
同じ染色体位置へのａｍｄＳと共にａｒｇＢの同時組込
みによって引き起こされたかどうかは、知られていな
い。 【００５７】Ｅ．コリのｌａｃＺ遺伝子を含むプラスミ
ドｐＡＮ５−４ＩＢがプロモーターに位相が一致して結
合し、そしてＡ．ニジュランスのグリセルアルデヒデホ
スフェート デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄ）（参照
６２）のＮ−末端タンパク質コード領域をまた同時形質
転換のために使用した。さらに、このプラスミドは、
Ａ．ニジュランスのａｒｇＢ遺伝子及びｐＢＲ３２２配
列を含む。原栄養性Ｔ．リーセイ（ＱＭ９４１４）を、
プラスミドｐ３ＳＲ２（ａｍｄＳ）及びｐＡＮ５−４Ｉ
Ｂにより同時形質転換し、形質転換体をＡｍｄ+ 表現型
について選択し、そしてＸｇａｌを含むアセトアミド−
ＣｓＣｌ−プレート上でβ−ｇａｌ発現についてスクリ
ーンした。グルコースが培地中に存在し、そしてＸｇａ
ｌプレートのpHが中性である場合、内在性Ｔ．リーセイ
のβ−ガラクトシダーゼ活性は検出され得なかった。 【００５８】１〜４日の増殖の後、青色が見られた。
１．０／０．７のモル比のプラスミド（ｐ３ＳＲ２／ｐ
ＡＮ５−４ＩＢ）を形質転換に使用する場合、１３％の
大きなＡｍｄ+ クローン及び６％の小さなＡｍｄ+ クロ
ーンがβ−ガラクトシダーゼ活性を示し、そして１．０
／２．６モル比で、３９％及び７％のＸｇａｌ+ クロー
ンがそれぞれ得られた。青色を示すＡｍｄ+ 形質転換体
における両プラスミドの存在は、サザンハイブリダイゼ
ーションによって確められた（データは示されていな
い）。 【００５９】例 ６ ｃｂｈ１ トリコダーマ リーセイ株の構成。 記載された方法による異なったセルラーゼ遺伝子の活性
化は、特定の組合せのｃｂｈ１- 株を産生する一連の
Ｔ．リーセイ株の構成を可能にする。ｃｂｈ１-株はま
た、ｃｂｈ１プロモーターを用いる場合、異質タンパク
質の有効な産生のためにも重要である。トリコダーマ
リーセイ株 ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ ２６９２１）
は、ｃｂｈ１特異性プローブを用いるサザン 【００６０】ハイブリダイゼーションによってｃｂｈ１
遺伝子の１つの染色体コピーのみを含むことが示され、
そしてその結果、１回の組換え結果が、その遺伝子を不
活性化すべきである。不活性遺伝子を次のようにして構
成した。ベクターｐＵＣ８中のｃｂｈ１遺伝子の完全な
長さのｃＤＮＡクローンを含むプラスミドｐＴＴＯ１
（参照２７）を、制限酵素ＢｇｌＩ及びＢｇｌIIにより
切断した。ｃｂｈ１遺伝子の５′末端領域からの０．８
Kbフラグメントを、従来の技法によって、アガロースゲ
ルから単離した。そのフラグメントを、Ｓ１ヌクレアー
ゼを用いてブラント末端化し、そしてそれを、ＥｃｏＲ
Ｉにより切断され、ブラント末端化されたｐＵＣ１８ベ
クターに連結し、そしてＥ．コリＪＭ１０９に形質転換
した。ｃｂｈ１遺伝子フラグメントを含むクローンから
のＤＮＡを単離し、そしてｃｂｈ１のＢｇｌＩ−Ｂｇｌ
IIフラグメントの中間を切断する制限酵素ＥｃｏＲＩに
より消化した。ＥｃｏＲＩにより生成された末端をフィ
ルインし、そしてバック連結した。切断されたｃｂｈ１
遺伝子フラグメントの中間にフレームシフト変異を含む
プラスミドｐＭＳ４を得た（第２図）。 【００６１】トリコダーマを、プラスミドｐＭＳ４及び
３〜４倍のモル過剰のプラスミドｐＭＳ４と共にプラス
ミドｐ３ＳＲ２を含むＡ．ニジュランス ａｍｄＳによ
り同時形質転換した。形質転換体を、例３に記載してい
るようにしてａｍｄＳ+ 表現型に基づいて選択し、そし
て単一の炭素源としてアセトアミドを含む選択培地上で
精製した。精製された形質転換体を、炭素源として１％
Ｓｏｌｋａ ｆｌｏｃセルロース及び窒素源として０．
２％プロテオースペプトンを含むトリコダーマ最少培地
２００μｌのマイクロタイタープレート上で増殖した。
そのセルラーゼ表現型を、参照５９に記載しているよう
にしてＣＢＨＩ特異的抗血清（羊）に対する希釈されて
いない増殖培地を用いるオクテルロニーの免疫拡散によ
って試験した。多くの形質転換体（正常な量のＣＢＨII
を産生するが、しかし検出できるＣＢＨＩを産生しな
い）が同定された。 【００６２】例 ７ Ｉ．プロキモシン遺伝子を含むプラスミド２８５′ｐｒ
ｏＣの調製（第３図）。 Ｔ．リーセイにおける異質タンパク質の例として、本発
明者は、プロキモシンｃＤＮＡを発現することを選択し
た（第３図）。プレプロキモシン遺伝子を子牛の胃のｃ
ＤＮＡライブラリィから単離し、そしてＧ−Ｃテイリン
グ（参照４９及び５０）によってｐＢＲ３２２のｐｓｔ
１部位中に挿入し、ｐＲ２６を得た。ｐＵＣ９をＳａｌ
Ｉにより切断し、そしてクレノウポリマラーゼにより補
充し、そしてＴ４リガーゼにより連結した。その得られ
たプラスミドをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩにより切断し、
そして２．７Kbの大フラグメントを、ｐＲ２６からの
０．４７KbのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと連
結し、プロキモシン遺伝子のＮ−末端にＨｉｎｄ III部
位を含むｐＵＣ９′を得た。ｐＵＣ１３をＢａｍＨＩ−
ＮａｒＩ及びＮａｒＩ−ＸｍａＩにより切断し、そして
それぞれ大小のフラグメントをｐＲ２６の０．６４Kbの
ＸｍａＩ−ＢｃｌＩフラグメントと連結し、プロキモシ
ン遺伝子のＣ−末端にＸｂａＩ−部位を含むプラスミド
ｐＵＣ１３′を得た。ｐＵＣ１３′からの０．６５Kbの
ＸｍａＩ−ＸｂａＩフラグメントを、第５図に示されて
いるようにしてｐＵＣ９′の０．４６KbのＨｉｎｄ III
−ＸｍａＩフラグメント及びｐ２８５の１１KbのＸｂａ
Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメントと連結し、プロキモシン
遺伝子を含むプラスミドｐ２８５′ｐｒｏＣを得た。 【００６３】II．プラスミドｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構
成。 ｐＣＡＭＧ９１をＳａｌＩ及びＰｓｔＩ制限エンドヌク
レアーゼにより消化する。そのような消化物から６９８
bpのフラグメントをアガロースゲル上に単離した。この
ＳａｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントは、グルコアミラーゼ
ｍＲＮＡの１４０bp３′非翻訳部＋５４０bpの３′〜ポ
リ（Ａ）付加部位をコードする領域を含む。ＸｂａＩリ
ンカーの添加及びＸｂａＩ制限酵素による消化の前、こ
の３′フラグメントをＴ４−ＤＮＡポリマラーゼにより
処理し、その制限部位を“ブラント末端”にした。この
グルコアミラーゼ遺伝子の３′末端を、ＸｂａＩにより
線状にされたｐＵＣ１３に連結し、グルコアミラーゼ遺
伝子ｐｏｌｙ（Ａ）付加領域を含むプラスミドｐＡＭＧ
／Ｔｅｒｍを得た。 【００６４】III ．プラスミドｐＭＴ８３７の構成。 プロモーター及びグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）シグナル
及びリーダーペプチドをコードする配列を含むｐＣＡＭ
Ｇ９１の０．５KbのＳｍａII−ＢｓｓＨIIフラグメント
を、ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩにより消化されたｐＵＣ１３
及びプロキモシンの最初の６個のアミノ酸をコードする
合成ＢｓｓＨII−ＢａｍＨＩアダプターに連結した。こ
の得られたプラスミド、ｐＭＴ６２６から、０．８Kbの
ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを単離し、そしてｐ
ｒｏＣのＮ末端半分についての配列を含むｐ２８５′ｐ
ｒｏＣからの０．５KbのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグ
メント及びｐｒｏＣについての配列のＣ末端部を含むｐ
ＭＴ６２２の３．０KbのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフラグメ
ントに連結した。（ｐＭＴ６２２は単に、ｐＵＣ１３に
おいてｐ２８５′ｐｒｏＣのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩサブ
クローンである）。その得られたプラスミドｐＭＴ６４
８（第４図を参照のこと）は、完全なプロキモシン遺伝
子、その先にＡＭＧプロモーター及びシグナル／リーダ
ーコード配列を含む。ｐＭＴ６４８は、Ａ．ニジュラン
スのａｒｇＢ遺伝子を含むようにさらに変性された（参
照５１）。１．８KbのＮａｒＩ−フィルインされたｐＭ
Ｔ６４８のＸｂａＩフラグメントを、６．８KbのＣｌａ
Ｉ−フィルインされたｐＳａｌ４３のＥｃｏＲＩフラグ
メントに連結し、ｐＭＴ６５１を得た。ＡＭＧプロモー
ターのさらに上流の配列（上流の活性化配列；ＵＡＳ）
をさらに挿入した。これは、元のクローンｐＣＡＭＧ９
１からの３．７KbのＣｌａＩ−ＢｓｓＨIIフラグメント
を、ｐｒｏＣ配列を含むｐＭＴ６４８からの１．１Kbの
ＢｓｓＨII−フィルインされたＸｂａＩフラグメント及
びｐＭＴ８１３からの３．１KbのＣｌａＩ−フィルイン
されたＥｃｏＲＩフラグメントとしてａｒｇＢ遺伝子
（ｐＭＴ８１３は、ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌIIにより切断さ
れたｐｉＣ１９Ｒ中にクローンされた３．１KbのＢａｍ
ＨＩ−ＮｒｕＩフラグメントとしてクローンされたａｒ
ｇＢ遺伝子である）に連結することによって達成され
た。その得られたプラスミドｐＭＴ８３０は、ＡＭＧか
らのＵＡＳ、プロモーター、シグナル及びリーダー配列
及びｐｒｏＣのための完全な遺伝子を含む発現ユニット
を有する。最後に、ＡＭＧのターミネーター配列は、プ
ラスミドｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍから０．６KbのＸｂａＩ−
ＸｂａＩフラグメントとして取られ、そしてＸｂａＩに
より切断され、そして脱リン酸化されたｐＭＴ８３０中
に挿入され、ｐＭＴ８３７が得られた。ｐＭＴ８３７の
構成が第５図に例示される。 【００６５】例 ８ ｐＭＴ８３７を用いてキモシンの産生。 Ｔ．リーセイ株ＱＭ９４１４及びＲＵＴ−Ｃ−３０を、
プラスミドｐＭＴ８３７及びｐ３ＳＲ２により同時形質
転換した。プラスミドｐＭＴ８３７は、プロキモシン遺
伝子の先にＡＭＧプロモーター及びシグナル／リーダー
配列を含む。プラスミドｐＭＴ８３７の構成法は例７に
記載されている（また第３〜５図を参照のこと）。同時
形質転換及び選択を例５におけるようにして行なった。 【００６６】キモシン産生のためには、１％Ｓｏｌｋａ
ｆｌｏｃセルロース及び０．２％プロテオースペプト
ンを含む最少培地上で形質転換体を培養した。その菌糸
体を集め、そして必要な場合、ＴＣＡ沈殿法によってそ
の上清液を濃縮し、そして２ＭのＮａＯＨ、１０mMのＴ
ｒｉｓ溶液（pH８．５）中に希釈した。そのサンプルを
ＳＤＳ−ページ（７．５％〜１５％のポリアクリルアミ
ドグラジェント）上で分別し、そしてニトロセルロース
フィルターにエレクトロブロットした。そのフィルター
を、ウサギプロキモシン抗血清と共にインキュベート
し、そしてシグマから購入されたα−ウサギ−ＩｇＧ−
ペルオキシダーゼ接合体を用いて４−クロロ−１−ナフ
トールにより染色した。 【００６７】キモシンは、およそ１μｇ／ｌのレベルで
培地中に分泌されることを示された。ＡＭＧプロモータ
ーは、明らかにＴ．リーセイにおいて非能率的に機能す
るので、相同のＴ．リーセイプロモーター−ターミネー
ターベクターが、キモシンの産生レベルを改良するため
に構成された。 【００６８】例 ９ ｃｂｈ１プロモーターを用いて、Ｔ．リーセイ中におい
て子牛プロキモシンの産生のための異質発現ベクターの
構成。 Ｉ．ｃｂｈ１ターミネーター領域へのプロキモシン遺伝
子の連結。 子牛プロキモシン遺伝子を、プラスミドｐＲ２７から得
た（第６図）。ほとんど全体の遺伝子を含むＰｓｔＩ−
ＰｓｔＩフラグメント（約１１１０bp）を、従来の技法
によってアガロースゲルから単離し、そしてｐＵＣ１９
のＰｓｔ１部位に連結した。 【００６９】このプラスミドをＰｓｔＩにより一部消化
し、末端をＳ１ヌクレアーゼによりブラント化し、そし
てｃｂｈ１遺伝子（クレノウフラグメントによるブラン
ト末端）のＡｖａIIターミネーターフラグメント（〜７
５０bp）をこのプラスミドに連結した。ｃｂｈ１遺伝子
のターミネーター領域を、ｐＢＲ３２２（参照２４）中
にサブクローンされたｃｂｈ１ｃＤＮＡの末端の１．８
KbＢａｍＨＩフラグメントから得た。ｐＵＣ１９におい
て、ｃｂｈ１遺伝子のターミネーター領域と連結したｐ
ｒｏＣフラグメントを含むこのプラスミドをｐＡＭＨ１
００（第７図）と言及した。 【００７０】II．ＢｇｌＩ−ＳａｃIIアダプターを用い
て、ＣＢＨＩプロモーター領域及びプロキモシンコード
領域の融合。 プロキモシンのＮ−末端領域をコードするＳａｃII−Ｐ
ｓｔＩフラグメント（８０bp）を、プラスミドｐＲ２７
（第６図を参照のこと）から単離した。ゲノムクローン
λ４４Ａからのｃｂｈ１プロモーター領域をまず、２．
８Kbの長さのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとし
てｐＵＣ１８（プラスミドｐＵＡ０１、第８図）中にサ
ブクローンし、そして次に約２．２Kbの長さのＥｃｏＲ
Ｉ−ＢｇｌＩフラグメントをこのサブクローンから単離
した。ＢｇｌＩ部位は、ｃｂｈ１遺伝子のシグナル配列
の中間に配置される。ｃｂｈ１遺伝子のプロモーター及
びシグナルペプチドのコード領域の約半分を含む、約
２．２Kbの長さのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩフラグメントの
約８０bpのＳａｃII−ＰｓｔＩプロキモシン フラグメ
ントへの正確な連結は、ＢｇｌＩ−ＳａｃIIアダプター
（ＮＯＲ２０２＋ＮＯＲ２０３、第１０図）によって仲
介される。アダプターと共にこれらのフラグメントを、
ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩにより消化されたｐＵＣ１９中に
連結した。このプラスミドは、プロキモシンの第１アミ
ノ酸に融合されたＣＢＨＩの完全なシグナル配列、次に
そのＮ−末端配列のいくらかをコードする。最後に、こ
の構造体からＥｃｏＲＩ−ｐｃｂｈ１ｓｓ−ｐｒｏＣ−
ＰｓｔＩフラグメントを単離し、ＳａｌＩ及びＰｓｔＩ
により消化されたｐＡＭＨ１００中にその３′末端から
連結した。そのフラグメントの５′末端及びプラスミド
ｐＡＭＨ１００のＥｃｏＲＩ末端をクレノウによりフィ
ルインし、そして連結した。ｃｂｈ１遺伝子のプロモー
ター及びｐｒｏＣ′フラグメントを、ｃｂｈ１ターミネ
ーター領域の前の′ｐｒｏＣの前に移した。この構成体
を、ｐＡＭＨ１０２（第１１図）と名付けた。 【００７１】III ．クロモシン発現プラスミドへの選択
マーカーの付加。 発現プラスミドにおける選択マーカーとして、Ａ．ニジ
ュランスのａｍｄＳ遺伝子（参照４２，３０）又はＡ．
ニジュランスのａｒｇＢ遺伝子（参照４８）のいづれか
を使用することができる。ａｍｄＳ遺伝子を、ｐ３ＳＲ
２からＰｖｕＩ−ＳａｌＩフラグメントとして単離し、
そしてｐＡＭＨ１０２の６Kbの長さのＰｖｕＩ−Ｓａｌ
Ｉフラグメントに連結する。この選択可能なベクター
を、ｐＡＭＨ１０４（第１１図）として命名した。 【００７２】IV．オリゴヌクレオチドを用いてｃｂｈ１
プロモーター及びプレプロキモシンコード酸列の正確な
融合。 プレプロキモシンのアミノ末端ＰｓｔＩフラグメント
（約１５０bp）を、ｐＢＲ３２２においてＰｓｔＩ部位
に挿入されたＡＴＧから１２bp上流で始まる、完全なプ
レプロキモシンｃＤＮＡクローンを含むｐＲ２６（第３
図）から単離した。このフラグメントを、ｐＴＺ１９Ｒ
のポリリンカー中に、ｃｂｈＩ（第８図）のシグナル配
列のコードする領域も含む、ｃｂｈＩＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｃＩ（約２．６Kb）プロモーターフラグメントと共にサ
ブクローンした。ｃｂｈＩＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩフラグ
メントを、元のλ４４Ａクローン（参照２４）の、ｐＵ
Ｃ１８（ｐＵＡ０１、第８図）における２．８KbのＥｃ
ｏＲＩ−ＥｃｏＲＩサブクローンから得た。ｐＴＺ１９
Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、複製のＦ１起源及びオリ
ゴヌクレオチドの突然変異生成のために単鎖鋳型の使用
を可能にするＴ７プロモーターを含む、ｐＵＣ１９基礎
プラスミドである。この得られたプラスミド（ｐＡＭＨ
１０５）の構成法は第８図に例示されている。このプラ
スミドから、ｃｂｈ１プロモーター領域とｐｒｏＣ Ａ
ＴＧとの間の配列を、特定のオリゴヌクレオチド、ＯＡ
ＭＨ３（第１０図）を用いてループ−突然変異生成によ
って削除した。オリゴヌクレオチド指図の突然変異生成
の実施は第９図に例示されている。問題のオリゴヌクレ
オチドをリン酸化し、それぞれモル比２０：１でｐＡＭ
Ｈ１０５の単鎖ＤＮＡ（参照６０、単鎖ＤＮＡは、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａによって記載されているようにしてＪＭ
１０３／ｐＡＭＨ１０５から単離された）にアニールし
た。オリゴヌクレオチド プライマーを、参照６０に記
載しているようにしてクレノウポリマラーゼ及びＴ４リ
ガーゼを用いて延長した。その延長された混合物を、Ｓ
ｍａＩ（ｐＴＺ１９Ｒのポリリンカーに存在する、第９
図を参照のこと）により消化し、その後、Ｅ．コリのｍ
ｕｔＬ不適正修復欠失性株、ＢＭＨ７１．１８中に形質
転換した。形質転換体のプールを、５mlの液体培養（１
００μｇ／mlのアンピシリンを含む、参照６２に記載の
ようなＬｕｒｉａブイヨン）中で１晩増殖した。プラス
ミドＤＮＡを、形質転換体のプールから単離し、そして
それをＳｍａＩにより再消化し、そしてＥ．コリＪＭ１
０９株中に再形質転換した。可能性ある欠失クローンの
スクリーニングを、異なった制限酵素を用いる消化によ
って行ない、そして欠失の特異性もさらに、配列決定す
ることによって確認した。その得られたプラスミドをｐ
ＡＭＨ１１０１（第１２図）と呼ぶ。このプラスミド
を、さらにＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより消化し、そし
てその得られたｐｃｂｈ１−ｐｒｅｐｒｏＣフラグメン
トを単離し（第１４図）、そしてＰｓｔＩ及びＳａｌＩ
により消化されたｐＡＭＨ１００プラスミドにそのＰｓ
ｔＩ末端で連結した。その得られた連結フラグメントの
末端を、クレノウによってフラントし、そして連結し
た。その得られたプラスミドをｐＡＭＨ１０１と呼び、
そしてそれは、プロキモシンのシグナル配列に融合され
たｃｂｈ１プロモーター及びｃｂｈ１遺伝子のターミネ
ーター領域に融合された全プロキモシンコード領域を含
む（第１４図）。 【００７３】Ｖ．オリゴヌクレオチドを用いることによ
って行なわれたシグナル配列融合による、ｃｂｈ１プロ
モーター及びｐｒｅｐｒｏＣ遺伝子の正確な融合。 前のチャプターIVに詳しく記載されたｐＡＭＨ１１０１
の構成と本質的に同じようにしてプラスミドｐＡＭＨ１
１０３（第１２図）の構成を行なった。但し、この構成
のために使用された特異的オリゴヌクレオチドはＯＡＭ
Ｈ１（第１０及び９図）であった。その得られたプラス
ミドｐＡＭＨ１１０３は、ｐｒｏＣ遺伝子のコード領域
のアミノ末端部分（〜１４０bp）の先のｐｒｅｐｒｏＣ
シグナル配列からのａａ１２〜１６に融合された、ｃｂ
ｈ１シグナル配列からのアミノ酸（ａａ）１〜１２を含
むシグナル配列融合体を含む（第１２図）。プラスミド
ｐＡＭＨ１１０３からのｐｃｂｈ１−ｓｓｏ−ｐｒｏ
Ｃ′（０＝融合）フラグメントを、本質的に前のチャプ
ターIVに記載しているようにしてｐＡＭＨ１００にサブ
クローンした（第１２図を参照のこと）。この得られた
プラスミドｐＡＭＨ１０３は、ｃｂｈ１ターミネーター
領域に融合されたｐｒｏＣコード領域の先のｃｂｈ１の
プロモーター領域及びｃｂｈ１及びｐｒｅｐｒｏＣのシ
グナル配列融合体を含む。 【００７４】VI．オリゴヌクレオチドを用いることによ
るｐｒｏＣコード領域へのｃｂｈ１コード領域の正確な
融合。 プラスミドｐＡＭＨ１１０６（第１３図）の構成を、本
質的に前のチャプターIVに詳しく記載されたｐＡＭＨ１
１０１の構成と同じようにして行なった。但し、この構
成のために使用された特異的オリゴヌクレオチドはＯＡ
ＭＨ２（第１０及び９図）であった。ｃｂｈ１のプロモ
ーター領域、ｃｂｈ１のシグナル配列及びｐｒｏＣのコ
ード領域に融合された、成熟ＣＢＨＩの初めの１〜２０
のａａのコード領域を含むその得られたプラスミドｐＡ
ＭＨ１１０６からの、ｐｃｂｈ１成熟ｏ−ｐｒｏＣ′を
含むフラグメントを、本質的に前のチャプターIVに記載
しているようにしてｐＡＭＨ１００中にサブクローンし
た（第１２図）。その得られたプラスミドｐＡＭＨ１０
６は、ｃｂｈ１のプロモーター領域、ｃｂｈ１のシグナ
ル配列、ｐｒｏＣのコード領域に融合された成熟ＣＢＨ
Ｉのアミノ酸１〜２０のコード領域を含む。 【００７５】例１０ ｐＡＭＨ１０２及びｐＡＭＨ104 を用いてキモシンの産
生。 Ｔ．リーセイ株ＱＭ９４１４及びＲＵＴ−Ｃ−３０を、
それぞれ５：１のモル比でプラスミドｐＡＭＨ１０２及
びｐ３ＳＲ２により同時形質転換した。プラスミドｐＡ
ＭＨ１０２の構成法は例９のチャプターIIに記載され
た。同時形質転換及び選択を例５におけるようにして行
なった。その形質転換体を、例３に記載されたようにし
て、選択性アセトアミドプレート上で精製した。 【００７６】キモシン産生のために、形質転換体を、１
％Ｓｏｌｋ ｆｌｏｃセルロース及び０．２％プロテオ
ースペプトンを含む最少培地（１０〜５０ml）上で培養
した。その菌糸体を集め、そしてその上清液をＴＣＡ沈
殿法によって濃縮し、そして２ＭのＮａＯＨ、１０mMの
Ｔｒｉｓ（pH８．５）の溶液中に希釈した。その菌糸体
を液体窒素の存在下で破壊し、その破壊された細胞をペ
レット化し、そしてその上清液を、前記培養培地と同じ
方法で処理した。そのサンプルを、ＳＤＳ−ｐａｇｅ
（７．５％〜１５％のポリアクリルアミド グラジェン
ト）上で画分し、そしてニトロセルロースフィルターに
エレクトロブロットした。そのフィルターを、ウサギプ
ロキモシン抗血清及びα−ウサギ−ＩｇＧ−ＡＰ（アル
カリホスファターゼ）接合体と共にインキュベートし、
そしてＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃから購入されたニ
トロプルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリルにより染色した。菌糸体の内部及び外
部のキモシンの量を比較した（第１７図）。菌糸染色体
ＤＮＡ中に組込まれたプラスミドｐＡＭＨ１０２の高い
数のコピィーを含むクローンがまたよりキモシンを産生
したことが、サザンハイブリダイゼーションによって示
された。１つのコピィーの形質転換体を用いる場合、分
泌されたキモシンの量は１ｌの培養培地当り１００μｇ
であった（ウェスターンゲルから近づいた場合）（第１
７図）。分泌されたプロキモシンは、ウェスターンゲル
によって及び凝乳活性（β−カセイン決定基の切断によ
るキモシン凝乳）によって活性キモシンにプロセスされ
ることが示された（参照６３）。菌糸体の内部の種々の
形のキモシン（ｐｒｅｐｒｏＣ，ｐｒｏＣ，Ｃ及び細胞
の内部の分解生成物に由来したキモシン）の量は、菌糸
体の合計タンパク質の０．０４％であることが測定され
（第１７図）、そして分泌されたキモシンの量は、産生
された合計キモシンの６０％であった。これは、菌糸体
の外部でさえ異質遺伝子生成物を分泌するＴ．リーセイ
の能力を示す。 【００７７】プラスミドｐＡＭＨ１０４（第１１図）の
いくつかのコピィーを有する形質転換体（多量のプロキ
モシンを分泌できる）を、増殖培地の凝乳活性を決定す
ることによって、スクリーンした。研究された４０のう
ち最良の形質転換体は、ウェスターンゲル上で及び凝乳
活性によって測定される場合、培養培地１ｌ当り５００
μｇを分泌することが見出された。 【００７８】培養物が小規模な培養（１０〜５０ml）と
比べて、５１ラボラトリィファーメンター中において増
殖される場合、分泌される、活性キモシンの量は、２０
０倍増大されるので、この型の菌株によって産生された
キモシンの量は、約１００mg／ｌである。 【００７９】例１１ Ｔ．リーセイにおける同質及び異質のタンパク質の産生
のための一般的発現ベクターの構成。 Ｔ．リーセイにおいて種々のタンパク質の産生のための
ベクターを構成するために、ｃｂｈ１遺伝子のプロモー
ター及びターミネーター領域を含む一般的発現ベクター
を構成した。ｃｂｈ１ターミネーターを、３個の読み枠
が整合してＳＴＯＰコドンＴＡＡを含むアダプターと共
に、ｐＵＣ１９のｐｓｔＩ部位にサブクローンし、プラ
スミドｐＡＭＨ１１０′（第１５図）を得た。ｐｓｔＩ
ターミネーターフラグメントをｐＡＭＨ１１０′から単
離し、ｃｂｈ１プロモーターを、ｐｒｏＣ遺伝子のアミ
ノ末端を含むＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントとして
ｐＡＭＨ１０２から単離し、そしてこれらのフラグメン
トを、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩにより消化されたｐＵＣ１
９* （これから、このサブクローン段階の前、１つのＮ
ｄｅＩ部位がクレノウによりブラントされた）中にサブ
クローンした。その得られたプラスミドｐＡＭＨ１１０
は、ｃｂｈ１遺伝子のプロモーター及びターミネーター
及びこれらの配列の間に、ＳａｃII及びＮｄｅＩによる
消化によって除去され得るスタファー（ｓｔｕｆｆｅ
ｒ）フラグメントを含む。末端がブラントされた後、遺
伝子のｃＤＮＡ又は染色体コピィーを、プロモーター及
びターミネーターの間に挿入することができる（第１５
図）。 【００８０】例１２ ｃｂｈ１プロモーター下でＴ．リーセイエンドグルカナ
ーゼＩの発現。 産生されるエンドグルカナーゼの量を増大せしめるため
に、ｅｇｌ１遺伝子を、より強力なｃｂｈ１プロモータ
ーに連結した。Ｔ．リーセイエンドグルカナーゼＩのた
めのｃＤＮＡを、スタファーフラグメントを削除するた
めにまずＳａｃII−ＮｄｅＩにより消化された一般的な
発現ベクターｐＡＭＨ１１０（例１１に記載された）中
にＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてサブクロ
ーンした（第１６図）。ｃｂｈ１遺伝子のプロモーター
及びターミネーターの間にｅｇｌ１遺伝子を含む、その
得られたプラスミドｐＡＭＨ１１１を、それぞれ５：１
のモル比でｐ３ＳＲ２と共に、Ｔ．リーセイＱＭ９４１
４（ＡＴＣＣ ２６９２１）に同時形質転換した。形質
転換体を、Ａｍｄｓ+ 表現型について選択し、そしてさ
らに選択培地上で精製した。６個の個々の形質転換体
を、５０mlの液体培養において、セルラーゼ含有培地
（炭素源としてＳｏｌｋａ ｆｌｏｃ，１％）中で４日
間、増殖せしめた。次にその培養上清液を、ヒドロキシ
エチルセルロース（０．１％、参照１２）からの還元性
糖の放出を測定することによってエンドグルカナーゼ活
性について試験した。形質転換体のＥＧＩ活性を対照
（ＱＭ９４１４）と比較し、そして最良の形質転換体
は、対照菌株のエンドグルカナーゼ活性の４倍分泌する
ことが示された。この例は、それぞれのプロモーターを
変えることによって、Ｔ．リーセイにおいて、異なった
セルロース分解酵素の量を調整することが可能であるこ
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Tietotie 2,02150 Espoo, Finland.
【図面の簡単な説明】 【図１】これは、染色体セルラーゼ遺伝子の不活性化の
原理を示す。 【図２】これは、Ｔ．リーセイの染色体ＣＢＨＩ遺伝子
座の挿入突然変異生成のために使用されるプラスミドｐ
ＭＳ４の構成を示す。ＥｃｏＲＩ部位の不活性化によっ
て生成されたフレームシフト突然変異の位置は＊により
マークされている。 【図３】これは、プラスミドｐ２８５′ｐｒｏＣの構成
法を示す。 【図４】これは、プラスミドｐＭＴ６４８及び１５ｐＭ
Ｔ８１３の構成法を示す。 【図５】これは、プラスミドｐＭＴ８３７の構成法を示
す。 【図６】これは、プラスミドｐＲ２７の制限地図を示
す。 【図７】これは、プラスミドｐＡＭＨ１００の制限地図
を示す。 【図８】これは、プラスミドｐＡＭＨ１０５の構成法を
示す。 【図９】これは、合成されたオリゴヌクレオチド、ＯＡ
ＭＨ１，ＯＡＭＨ２及びＯＡＭＨ３を用いてループ−突
然変異生成することによるプラスミドｐＡＭＨ１１０
３，ｐＡＭＨ１１０６及びｐＡＭＨ１１０１の構成法を
示す。 【図１０】これは、リンカーＮＯＲ２０２，ＮＯＲ２０
３，ＯＡＭＨ１，ＯＡＭＨ２及びＯＡＭＨ３を示す。 【図１１】これは、プラスミドｐＡＭＨ１０２及びｐＡ
ＭＨ１０４の制限地図を示す。 【図１２】これは、プラスミドｐＡＭＨ１１０３の制限
地図及びｐＡＭＨ１０３の構成法を示す。 【図１３】これは、プラスミドｐＡＭＨ１１０６の制限
地図及びｐＡＭＨ１０６の構成法を示す。 【図１４】これは、プラスミドｐＡＭＨ１１０１の制限
地図及びｐＡＭＨ１０１の構成法を示す。 【図１５】これは、プラスミドｐＡＭＨ１１０の構成法
を示す。 【図１６】これは、ＣＧＨＩプロモーター機能下でＥＧ
Ｉの発現のために使用されるプラスミドｐＡＭＨ１１１
の構成法を示す。 【図１７】これは、Ｔ．リーセイにおけるキモシンの発
現を示す。ウェスターンブロットレーン１；精製された
プロキモシンの対照、微量のプスウドウキモシン及びキ
モシンを含む、レーン２；ｐＡＭＨ１０２を含む株の増
殖からの培養上清液、レーン３；プラスミドを含まない
株からの培養上清液、レーン４；ｐＡＭＨ１０２を含む
株からの菌糸体。これは、図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:885） (72)発明者 メルヤ ペントティレ フィンランド国，00390 ヘルシンキ, ファンハ ヘムゼンキレンティー，５− ７アー (72)発明者 モゲンズ トリエル ハンセン デンマーク国，デーコー−3650 エール スティゲ，ビンケルベイ 21 (56)参考文献 特開 昭62−175183（ＪＰ，Ａ) ＧＥＮＥ，ＶＯＬ．36，ＮＯ．３, （1985）Ｐ．321−331 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．トリコダーマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）において
    タンパク質生成物を産生するための方法であって、 ａ）目的とするタンパク質生成物をコードする遺伝子、 ｂ）目的とする生成物の発現を制御するために機能可能
    的に前記遺伝子に結合されたプロモーター／エンハンサ
    ーを含んで成るＤＮＡ配列を含む遺伝子発現を促進する
    機能、及び ｃ）安定したトリコダーマ形質転換体を選択できる選択
    マーカーを含んで成る菌株を適切な培養培地中で培養
    し、そして分泌されたタンパク質生成物を前記培養培地
    から回収する方法。 ２．トリコダーマにおいてタンパク質生成物を産生する
    ための方法であって、 ａ）目的とするタンパク質生成物をコードする遺伝子、 ｂ）目的とする生成物の発現を制御するために機能可能
    的に前記遺伝子に結合されたプロモーター／エンハンサ
    ーを含んで成るＤＮＡ配列を含む遺伝子発現を促進する
    機能、及び ｃ）安定性トリコダーマ形質転換体を選択できる選択マ
    ーカーを含んで成る、形質転換された適切な安定性宿主
    微生物を適切な培養培地中で培養し、そして分泌された
    タンパク質生成物を前記培養培地から回収することを含
    んで成る方法。 ３．前記宿主微生物が原栄養性Ｔ．リーセイ菌株である
    特許請求の範囲第１又は２項記載の方法。 ４．前記宿主微生物が栄養要求性Ｔ．リーセイ菌株であ
    る特許請求の範囲第１又は２項記載の方法。 ５．前記宿主菌株が目的としない生成物をコードするい
    づれの遺伝子も欠失している特許請求の範囲第１〜４項
    のいづれか１項記載の方法。 ６．前記宿主株がｃｂｈＩ遺伝子を欠失している特許請
    求の範囲第５項記載の方法。
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