BRPI0719181A2 - Variantes de glucoamilase com propriedades alteradas - Google Patents

Description

glucoamilase Antecedentes

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTES DE GLUCOAMILASE COM PROPRIEDADES ALTERADAS".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à variantes de uma glucoamilase precursora tendo propriedades alteradas (por exemplo, termoestabilidade e/ou atividade específica aperfeiçoada). Em particular, a presente invenção proporciona composições compreendendo as glucoamilases variantes, incluindo composições de hidrólise de amido, composições de ração para animais e compósições de limpeza. A invenção também refere-se a constructos de DNA que codificam as variantes e métodos de produção das variantes de em células hospedeiras. da Invenção j

Ehzimas glucoamilase (1,4-a-glico-hidrolases de glucano, EC 3.2.1.3) são carboidrases de exo-atuação de hidrólise de amido as quais catalisam a remoção de unidades de glicose sucessivas das extremidades de não-redução de amido ou moléculas de oligo ou polissacarídeo.

Glucoamilases são produzidas por numerosas cepas de bactérias, fungos, Ievedo e plantas. De modo particularmente interessante e comercialmente importante, glucoamilases são enzimas fúngicas que são ex:e produzidas, por exemplo, a partir de cepas Aspergillus Dutros (1983) Carlsberg Res. Commun. 48: 529 - 544; Boel e outros, (1984) EMBO J. 3: 1097 - 1102; Hayashida e outros, (1989) Agric. Biol. Chem. 53: 923 - 929; USP 5.024.941; USP 4.794.175 e WO 88/09795); Talaromyces (USP 4.247.637; USP 6.255.084 e USP 6.620.924); Rhizopus (Ashikari e outros, (1986) Agric. Biol. Chem. 50: 957-964; Ashikari e outros, (1989) App. Microbiol. and Biotech. 32: 129 - 133 e USP 4.863.864); Humicola (WO 05/052148 e USP 4.618.579) e Mucor (Houghton-Larsen e outros, (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 210 - 217). Muitos dos genes que codificam essas enzimas foram clonados e expressos em células de levedo, fúngicas e/ou bacterianas.

Comercialmente, glucoamilases são enzimas muito importantes e têm sido usadas em uma ampla variedade de aplicações que requerem a

tracelularmen (Svensson e hidrólise de amido (por exemplo, para a produção de glicose e outros monossacarídeos a partir de amido). Glucoamilases são usadas para produzir adoçantes de milho com alto teor de frutose, os quais compreendem mais de 50% do mercado de adoçantes nos Estados Unidos. Em geral, glucoamila5 ses podem ser e comumente são usadas com amilases alfa em processos de hidrólise djs amido para hidrolisar amido em dextrinas e, então, glicose. A glicose podej então, ser convertida em frutose por outras enzimas (por exemplo, isomerases de glicose); cristalizada; ou usada em fermentações para produzir numerosos produtos finais (por exemplo, etanol, ácido cítrico, 10 ácido láctico, succinato, intermediários de ácido ascórbico, ácido glutâmico, glicerol e 1,3 propanodiol). O etanol produzido usando glucoamilases na fermentação de amido e/ou material contendo celulose pode ser usado como uma fonte de combustível para consumo alcoólico.

Embora glucoamilases tenham sido usadas com sucesso em aplicações comerciais durante muitos anos, ainda existe uma necessidade por novas glucoamilases com propriedades alteradas, tais como atividade específica aperfeiçoada e termoestabilidade aumentada.

Embora diferentes mutações tenham sido feitas em glucoamilases de Aspergillus, as quais intensificam a estabilidade térmica e atividade específica e referência é feita a USP 6.537.792; USP 6.352.851; Chen e outros (1996) Prot. Eng. 9: 499 - 505, Chen e outros (1995) Prot Eng. 8: 575- 582; Fierobe è outros (1996) Biochem. 35: 8698 - 8704; e Li e outros, (1997)

I

Prot. Eng. 10: 1199-1204, há uma necessidade por proporcionar variantes de glucoamilase com propriedades alteradas com relação a seu precursor.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção refere-se à variantes de glucoamilase tendo uma ou mais substituições de aminoácido em posições de resíduo correspondendo às posições 4, 5, 12, 24, 43,44,45,46,47,49,51,

70, 75, 94, 100, 108, 114, 116, 119, 122, 124, 125,137, 141, 143, 146, 148,

i

169, 171, 17Í, 175, 178, 180, 181, 208, 211, 228, 242, 243, 245, 292, 294,

197, 309, 310 368, 369, 375

, 313, 314, 315, 316, 317, 321, 340, 341, 350, 353, 356, 363, , 376, 395, 398, 401, 408, 409, 412, 415, 418, 421, 433, 436 e 451 de SEQ ID NO: 2 ou 3 e/ou uma posição equivalente em uma glucoamilase precursora. A posição equivalente pode ser determinada pela identidade de seqüência, de modo que a glucoamilase precursora tem pelo menos

i

80% de identidade de seqüência e menos de 100% de identidade de se5 quência com SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. A glucoamilase precursora pode ser uma de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. A posição equivalente pode ser determinada pela identidade estrutural à SEQ ID NO: 3. Um outro aspecto da presente invenção é uma variante de glucoamilase tendo uma ou mais substituições de aminoácido correspondendo a uma posição selecionada 10 das posições 4, 5, 24, 29, 43, 49, 70, 75, 76, 100, 108, 119, 124, 137, 146, 148, 169, 171, 172, 175, 178, 181, 208, 211, 243, 292, 294, 297, 314, 316, 317, 340, 341, 350, 356, 363, 368, 369, 376, 395, 401, 412, 433, 436 e 451 e

I

tendo pelo mènos 90% de identidade de seqüência à SEQ ID NO. 2. Em alguns aspectos, a uma ou mais substituições de aminoácido corresponde às 15 seguintes posições: 5, 24, 43, 49, 70, 75, 76, 94, 119, 141, 146, 148, 172, 175, 178, 180, 181, 208, 211, 243, 294, 309, 314, 353, 369, 375, 409. A glucoamilase precursora pode ser qualquer uma de: Trichoderma spp., Aspergillus spp., Hümicola spp., Penicillium spp., Talaromycese spp. ou Sehizosaccharmyces spp. Em alguns aspectos, a variante de glucoamilase é, de 20 preferência, Trichoderma spp. ou Aspergillus spp.

Em outros aspectos da invenção, a variante de glucoamilase inclui uma substituição em uma posição correspondendo a pelo menos uma das seguinteé posições: D4L/E/R/S/C/A/Q/W, F5C/M/N/R/S/T/V/W, I12L/R, D24E/L/Y/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S, D44E/H/K/S/N/Y/F/R, Y47W, 25 Y49N, Q70 R/K/M/P/G/L/F, Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P, P94L, D100W/I/ Q/M/P/A/N, N119P/T/Y/D/E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/M, Q148V/Y/H/A/C/D/ G/M/R/S/T, Y169D/F, Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V, E180A/C/G/H/I/L/ N/P/Q/R/S/T/V/Y, V181 E/C/D/G/H/l/P/T/Y/S/K/F/A, Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211 C/R/E/A/Y/W/M/H/L/l/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L, R245A/E/M/I/P/V, 30 1292D/H/P/R/T/N/V/F/L, G294D/E/T/Q/I/A, K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/ S/R/W, R309A/C/G/H/I/N/P/Q/S/T/W/Y/L, Y310E/G/L/P/S/W/R/Q, D313Q, V314A/R/N/D/C/E/Q/G/H/I/K/L/M/F/P/S/T/W/Y, Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, K341F/D/P/V/G/S, T350S/E/A/N, Q356H/D/E, Τ363L/R/C/H/W, S368W/D/F/l| S369F, N376Q/T/H/S/V, Y395Q/R/S, A398S/I/T, S401C/V, R408S, N409W/T/K, T412A/h/K/G, R433H/Q, I436A/T e~S451 M/T/H. Algumas variantes preferidas têm substituições na posição 172. Outras variantes preferidas têrfi substituições na posição 208 ou 211. Outras variantes preferidas têm substituições correspondendo a Q172F, Q208N ou S221R. Outras variantes preferidas têm pelo menos uma substituição na posição 314. Em alguns aspectos, as variantes têm pelo menos uma substituição na posição 24, 181, 208, 243, 292, 294, 353, 375 ou 409. Algumas substituições preferidas estão nas posições D24E/L/Y, V181K/L, Q208C, E243Y I292V, G294A/Q, T353R, N375N/Q e/ou N409K/W. Em um aspecto, a glucoamilase variante exibe termoestabilidade aumentada quando comparado com a glucoamilase precursora. Alternativamente ou além disso, a variante exibe atividade específica aumentada comparado com uma glucoamilase precursora. Um outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo que codifica

a variante descrita aqui. Um outro aspecto é uma célula hospedeira contendo o polinucleotídeo. Um outro aspecto da invenção é uma composição enzimática incluindo a variante de glucoamilase descrita aqui. Em um aspecto, a composição enzimática é usada em um processo de conversão de amido 20 ou uma formiilação de ração para animal. Em outros aspectos, a composição enzimáticL é usada em um processo de fermentação de álcool.

Um outro aspecto da invenção é um método de produção de uma glucoamilase variante em uma célula hospedeira através de transformação de umá célula hospedeira com um constructo de DNA compreendendo o polinucleotídeo que codifica a glucoamilase variante; cultura da célula

hospedeira sc variante de g

b condições adequadas para a expressão e produção de uma ucoamilase e produção da variante. O método também pode incluir a etapa de recuperação da variante de glucoamilase da cultura.

Breve Descrição dos Desenhos

A

reesei (TrGA)

figura 1A ilustra a glucoamilase precursora de Trichoderma tendo 632 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). O peptídeo sinaliza

dor está sublinhado, a região catalítica (SEQ ID NO: 3) começando com os 10

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resíduos de aminoácido SVDDFI (SEQ ID NO: 160) e tendo 453 resíduos de

I

aminoácido está em negrito; a região Iigante está em itálico e o domínio de ligação está em itálico e sublinhado. A proteína madura, a qual inclui o domínio catalítiço (SEQ ID NO: 3), região Iigante e domínio de ligação a amido

é representac A GA.

A

a por SEQ ID NO: 2.

figura 1B ilustra o cDNA (SEQ ID NO: 4) o qual codifica a Tr

figura 2 ilustra o plasmídeo pDONR-TrGA, o qual inclui o cDNA (SEQ ID NO: 4) da TrGA precursora.

A| figura 3 ilustra os plasmídeos pREP3Y-DEST (A) e pREP3YTrGA (C). !

AS FIGS. 4A - 4B ilustram uma comparação por alinhamento dos domínios catalíticos de glucoamilases precursoras, incluindo a glucoamilase derivada de Aspergillus awamorii (AaGA) (SEQ ID NO: 5); Aspergillus niger ID NO: 6); Aspergillus orzyae (AoGA) (SEQ ID NO: 7); Tricho(TrGA) (SEQ ID NO: 3); Humicola grisea (HgGA) (SEQ ID NO: 8); e Hypocréa vinosa (HvGA) (SEQ ID NO: 9). Aminoácidos idênticos são indicados por um asterisco (*).

A figura 5 ilustra (A) o plasmídeo pTrex 3g-DEST e (B) o plasmíj

deo pTrex3g-TrGA, os quais foram usados como um vetor de expressão para expressão e produção de glucoamilases variantes em um hospedeiro Trichoderma reesei. .' ■ ' ■ *.

(AnGA) (SEQ derma reesei

entre a TrGA

figura 6 ilustra a comparação de Vmax (μΜ de glicose/seg) precursora (tipo silvestre) e variantes, V314, S211R, Q172F e Q208N a 60°C e 32°C, conforme ainda discutido no Exemplo 8.

A figura 7 ilustra a atividade de mutantes combinatoriais sobre o amido. '

A figura 8 ilustra a atividade de mutantes em um único sítio sobre amido de milho.

A figura 9 ilustra a atividade de GA de TrGA e da variante LR8 de TrGA sobre uma amostra de liqüefeito de massa de milho (NE) do Exemplo 10. ·! A figura 10 ilustra o perfil de atividade de TrGA e da variante LR8 de TrGA sobre o liqüefeito de massa de milho (BSE) do Exemplo 10.

A figura 11 ilustra a variante LR8 de TrGA sobre um substrato de amido de milho solúvel.

A figurai 12 é uma comparação das estruturas tridimensionais de

glucoamilase de Trichoderma (preto) (SEQ ID NO: 2) e glucoamilase de Aspergillus awamorii (cinza) visualizadas pelo lado.

A figura 13 é uma comparação das estruturas tridimensionais de glucoamilase de Trichoderma (preto) e glucoamilase de Aspergillus awamorii (cinza) vista de cima.

Descrição Detalhada da Invenção

I. Definições

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente en15 tendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Singleton e outros, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a ED., John Wiley and Sons, New York (1994) e Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) fornecem àqueles versados na técnica o significado ge20 ral de muitos dos termos usados aqui. Ainda, determinados termos são definidos abaixo para fins de clareza e facilidade de referência.

Conforme usado aqui, o termo " glucoamilase (EC 3.2.1.3)" refere-se a uma enzima que catalisa a liberação de D-glicose das extremidades de não-redução do amido e oligo- e polissacarídeos relacionados.

O termo "precursor” ou "seqüência precursora" refere-se a uma

seqüência que é nativa ou ocorre naturalmente em uma célula hospedeira.

O termo "TrGA" refere-se a uma seqüência de glucoamilase precursora de Trichoderma reesei tendo a seqüência da proteína madura ilustrada em SEQ ID NO: 2, a qual inclui o domínio catalítico tendo a seqüência 30 ilustrada em SEQ ID NO: 3. O isolamento, clonagem e expressão da TrGA são descritos no WO 2006/060062 e Pub. de Pat. U.S. No. 2006/0094080, publicada em 4 de Maio de 2006, os quais são incorporados aqui por refe10

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rência. Em ajgumas modalidades, A seqüência precursora refere-se a uma TrGA que é o ponto de partida para manipulação de proteína. A numeração dos aminoácídos de glucoamilase aqui é baseada na seqüência da TrGA (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3).

A frase "forma madura de uma proteína ou polipeptídeo" referese à forma füncional final da proteína ou polipeptídeo. Para exemplificar, uma forma madura da TrGA inclui o domínio catalítico, região Iigante e domínio de ligação a amido tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

O

termo "homólogos de glucoamilase de Trichoderma" refere-se

j

à glucoamilases precursoras tendo pelo menos 80% de identidade de se

j

quência de aminoácido a uma seqüência de TrGA (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3) e glucoamilases as quais retêm as características funcionais de juma glucoamilase.

Conforme usado aqui, uma "seqüência homóloga" significa uma seqüência de ácido nucleico ou polipeptídeo tendo pelo menos 100%, pelo menos 99%, pelo menos 98%, pelo menos 97%, pelo menos 96%, pelo menos 95%, pelo menos 94%, pelo menos 93%, pelo menos 92%, pelo menos 91%, pelo menos 90%, pelo menos 88%, pelo menos 85%, pelo menos j

80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, pelo menos 50%, ou pelo menos 45% de identidade de seqüência a uma seqüência de ácido nucleico ou seqüência de polipeptídeo quando otimamente alinhada para comparação, em que a função da

seqüência de sencialmente

ácido nucleico ou seqüência de polipeptídeo candidata é esa mesma que a seqüência de ácido nucleico ou seqüência de polipeptídeo com a qual a referida seqüência homóloga candidata está sendo comparada. Em algumas modalidades, seqüências homólogas têm entre 85% e 100% Ide identidade de seqüência enquanto que, em outras modalidades, há entre 90% e 100% de identidade de seqüência e, em outras modalidades, há entre 95% e 100% de identidade de seqüência. Em algumas modalidades, a seqüência homóloga candidata é comparada com a seqüência de ácido nucleico de TrGA ou a seqüência da proteína madura. 10

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Conforme usado aqui, os termos "variante de glucoamilase", "variante" e "variante de TrGA" são usados em referência à glucoamilases que são similares a uma seqüência de glucoamilase precursora (por exemplo, a TrGA ou homólogos de glucoamilase de Trichoderma), mas têm pelo menos uma substituição, deleção ou inserção em sua seqüência de aminoácido que as torna diferentes, quanto à seqüência, de uma glucoamilase precursora.

Conforme usado aqui, o termo "domínio catalítico" refere-se a uma região estrutural de um polipeptídeo a qual contém o sítio ativo para hidrólise de substrato.

Oj termo "ligante" refere-se a uma seqüência de aminoácido curta tendo, em ^eral, entre 3 e 40 resíduos de aminoácido que se ligam cova

Ientemente a ligação a am domínio catal O

uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de lido com uma seqüência de aminoácido compreendendo um ítico.

termo "domínio de ligação a amido" refere-se a uma seqüência de aminoácido que se liga, de preferência, a um substrato de amido.

Cjonforme usado aqui, os termos "seqüência mutante" e "gene mutante" são usados permutavelmente e se referem a uma seqüência de polinucleotídeo que tem uma alteração em pelo menos um códon que ocorre em uma seqüência precursora de uma célula hospedeira. O produto da expressão da seqüência mutante é uma proteína variante com uma seqüência i

de aminoácido alterada com relação à precursora. O produto da expressão

pode ter uma tica alterada).

O

capacidade funcional alterada (por exemplo, atividade enzimá

termo "propriedade" ou equivalentes gramaticais do mesmo,

no contexto de um polipeptídeo, conforme usado aqui, refere-se a qualquer característica ou atributo de um polipeptídeo que pode ser selecionado ou deletado. Essas propriedades incluem, mas não estão limitadas a, estabilidade oxidativá, especificidade por substrato, atividade catalítica, estabilidade térmica, perfil de atividade de pH, resistência à degradação proteolítica, KM, Kcat. proporção Km/KCat, duplicação de proteína, capacidade de ligação a um substrato e capacidade de ser secretado. termo "propriedades" ou equivalentes gramaticais do mesmo, no contexto de um ácido nucleico, conforme usado aqui, refere-se a qualquer característica ou atributo de um ácido nucleico que pode ser selecionado ou deletado. Essas propriedades incluem, mas não estão limitadas a, uma propriedade que afeta a transcrição de gene (por exemplo, resistência

I

do promotor ou reconhecimento de promotor), uma propriedade que afeta o

processamen do RNA), um

to de RNA (por exemplo, combinação de RNA e estabilidade ia propriedade que afeta a tradução (por exemplo, regulação, ligação de mRNA à proteínas ribossômicas).

0|S termos "termicamente estável" e "termoestável" se referem à

variantes de glucoamilase da presente invenção que retêm uma quantidade especificada de atividade enzimática após exposição à temperaturas identificadas durante um determinado período de tempo sob condições que prevalecem durante a hidrólise de substratos de amido, por exemplo, enquanto

expostas à temperaturas alteradas.

0 termo "estabilidade intensificada", no contexto de uma propriedade, tal corno termoestabilidade, refere-se a uma maior atividade hidrolítica de amido retida durante o tempo quando comparado com outras glucoamilases, variajntes e/ou glucoamilases do tipo silvestre.

O: termo "estabilidade diminuída", no contexto de uma proprie

I

dade, tal como termoestabilidade, refere-se a uma menor atividade hidrolítica de amido retida durante o tempo quando comparado com outras glucoamilases, variantes e/ou glucoamilases do tipo silvestre.

01 termos "ativo" e "biologicamente ativo" se referem a uma ati

vidade biológijca associada a uma proteína em particular. Segue que a atividade biológica de uma determinada proteína refere-se a qualquer atividade biológica tipicamente atribuída a essa proteína por aqueles versados na técnica. Por exemplo, uma atividade enzimática associada a uma glucoamilase é hidrolítica e, assim, uma glucoamilase ativa tem atividade hidrolítica.

Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico", usados permuta

velmente aqui, se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos ou deóxiribonucleotídeos. Esses 10

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termos incluem, mas não estão limitados a, DNA fita simples, dupla ou tripla, DNA genômico, cDNA, RNA, híbrido de DNA-RNA ou um polímero compreendendo bases purina ou pirimidina ou outras bases de nucleotídeo naturais, química, bioquimicamente modificadas, não-naturais ou derivatizadas.

Conforme usado aqui, os termos "constructo de DNA", "DNA de transformação" e "vetor de expressão" são usados permutavelmente para se referir ao DNA usado para introduzir seqüências em uma célula ou organis

mo hospedeir outro método

o. O DNA pode ser gerado in vitro através de PCR ou qualquer adequado conhecido por aqueles versados na técnica. O constructo de DNA, DNA de transformação ou cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossoma, DNA mitocondrial,

DNA de plast ção do casse de DNA ou D

deo, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, a por:e de expressão recombinante de um vetor de DNA, constructo 'NA de transformação inclui, dentre outras seqüências, uma seqüência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em modalidades preferidas, vetores de expressão têm a capacidade de incorporar e expressar fragmentos de DNA heterólogos na célula hospedeira.

Conforme usado aqui, o termo "vetor" refere-se a um constructo de polinucleotídeo criado para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de célula. Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de deLvio, plasmídeos, cassetes e semelhantes.

Conforme usado aqui, no contexto de introdução de uma seqüência de ácido nucleico em uma célula, o termo "introduzida" refere-se a qualquer método adequado para transferência da seqüência de ácido nucleico para a célula. Tais métodos para introdução incluem, mas não estão limitados a, fusao de protoplasta, transfecção, transformação, conjugação e transdução.

Conforme usado aqui, os termos "transformada" e "estavelmente transformada" se referem a uma célula que tem uma seqüência de polinucleotídeo não-nativa (heteróloga) integrada em seu genoma ou como um ' ssomal que é mantido durante pelo menos duas gerações.

plasmídeo ep

Conforme usado aqui, os termos "marcador selecionável" e "marcador seletivo" se referem a um ácido nucleico (por exemplo, um gene) capaz de expressão em células hospedeiras, o qual permite facilidade de classificação Laqueles hospedeiros contendo o vetor. Tipicamente, marcadores selecionájveis são genes que conferem resistência antimicrobiana ou 5 uma vantagem metabólica à célula hospedeira para permitir que células contendo o DNA exógeno sejam distinguidas de células que não receberam qualquer seqüência exógena durante a transformação.

Conforme usado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma seqüência de ácido nucleico que funciona para dirigir a transcrição de um gene 10 a jusante. O promotor, junto com outras seqüências de ácido nucleico regulatórias de transcrição e tradução (também denominadas "seqüências de controle") é necessário para expressar um determinado gene. Em geral, as seqüências regulatórias de transcrição e tradução incluem, mas não estão limitadas a, seqüências promotoras, sítios de ligação ribossômica, sequên15 cias de início e término de transcrição, seqüências de início e término de tradução e seqüências intensificadoras ou ativadoras.

Um ácido nucleico é "operavelmente ligado" quando ele é colocado em umaj relação funcional com outra seqüência de ácido nucleico. Por exemplo, DN^ que codifica um líder secretório (isto é, um peptídeo sinaliza20 dor) é operavelmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo. Geralmente, "operavelmente ligado" significa que as seqüências de DNA que estão sendo ligadas são contínuas e, no caso de um líder secretório, contínuas e em fase de leitura.

Conforme usado aqui, o termo "gene" refere-se a um polinucleo

tídeo (por exemplo, um segmento de DNA) que codifica um polipeptídeo e inclui regiões que precedem e seguem as regiões de codificação, bem como seqüências intervenientes (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (éxons).

Conforme usado aqui, "genes homólogos" refere-se a um par de

genes de espécies diferentes, mas usualmente relacionadas, os quais correspondem um ao outro e os quais são idênticos ou muito similares um ao outro. O termo abrange genes que foram separados através de especialização (isto é, o desenvolvimento de novas espécies) (por exemplo, genes ortólogos), bem como genes que foram separados através de duplicação genética (por exemplo, genes parálogos).

5 Conforme usado aqui, "ortólogo" e "genes ortólogos" se referem

a genes em diferentes espécies que evoluíram a partir de um gene ancestral

I

em comum (isto é, um gene homólogo) através de especialização. Tipicamente, ortólogos retêm a mesma função durante o curso de evolução. A identificação de ortólogos encontra uso na previsão confiável de função de gene em genómas recentemente sequenciados.

Conforme usado aqui, "parálogo" e "genes parálogos" se referem a genes que são relacionados através de duplicação dentro de um genoma. Enquanto ortólogos retêm a mesma função através do curso de evolução, parálogos desenvolvem novas funções, mesmo embora algumas fun15 ções sejam frequentemente relacionadas àquela original. Exemplos de genes parálogos incluem, mas não estão limitados a, genes que codificam tripsina, quimiotripsina, elastase e trombina, os quais são todas proteinases de serina e ocorrem juntos dentro da mesma espécie.

Conforme usado aqui, "homologia" refere-se à similaridade ou 20 identidade de seqüência, com identidade sendo preferida. Essa homologia é determinada usando métodos padrões conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 [1981]; Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 [1970]; Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444 [1988]; programas tais como INTERVALO, BESTFIT, 25 FASTA e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, Wl); e Devereux e outros, Nucl. Acid Res., 12: 387-395 [1984]).

A "identidade de seqüência de ácido nucleico percentual (%)" ou "identidade de seqüência de aminoácido percentual (%)" é definida como o percentual dJ resíduos de nucleotídeo ou resíduos de aminoácido em uma seqüência candidata que são idênticos aos resíduos de nucleotídeo ou resíduos de aminoácido da seqüência inicial (isto é, TrGA). Seqüências homólogas são determinadas através de métodos conhecidos de alinhamento de seqüência. Um método de alinhamento comumente usado é o BLAST, descrito por Altschul e outros, (Altschul e outros, J. Mol. Biol., 215: 403-410, [1990]; e Karlin e outros, Proc. Natl. Acad.

5 Sei. USA 90: 5873-5787 [1993]) Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 (vide Altschul e outros, Meth. Enzymol., 266: 460- 480 [1996]). O WU-BLAST-2 usa vários parâmetros de busca, a maioria dos quais são ajustados para os valores de padão. Os parâmetros ajustáveis são ajustados com os seguintes valores: amplitude de sobreposição = 1, fração 10 de sobreposição = 0,125, limiar de palavra (T) = 11. Os parâmetros HSP e HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo programa em si, dependendo da composição da seqüência em particular e da composição do banco de dados em particular contra o qual a seqüência de interesse está sendo comparada. Contudo, os valores podem ser ajustados para aumentar 15 a sensibilidade. Um valor % de identidade de seqüência de aminoácido é determinado pelo número de resíduos idênticos equivalentes dividido pelo número total !de resíduos da seqüência "mais longa" na região alinhada. A seqüência "mais longa" é uma tendo os resíduos mais reais na região alinhada (intervalos introduzidos pelo WU-Blast-2 para maximizar o escore de 20 alinhamento são ignoradas).

Outros métodos encontram uso no alinhamento de seqüências. Um exemplo de um algoritmo útil é o PILEUP. O PILEUP cria um alinhamento múltiplo de! seqüência a partir de um grupo de seqüências relacionadas usando alinhamento aos pares progressivo. Ele também pode plotar uma 25 árvore mostrando as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. O PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle (Feng e Doolittle, J. Mol. Evol., 35: 351-360 [1987]). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp (Higgins e Sharp, CABIOS 5: 151-153 [1989]). Parâmetros úteis no PILEUP incluem um 30 peso por intervalo de padão de 3,00, um peso por comprimento de intervalo

,10 e intervalos de extremidades ponderadas, termo "alinhamento ótimo" refere-se ao alinhamento que pro

de padão de C O porciona o maior escore de identidade percentual.

Conforme usado aqui, o termo "hibridização" refere-se ao processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se une a uma fita complementar através de emparelhamento de base, conforme conhecido na técnica.

5 Uma seqüência de ácido nucleico é considerada como sendo

"seletivamente hibridizável" a uma seqüência de ácido nucleico de referência se as duas seqüências se hibridizam especificamente uma à outra sob condições de hibridização e lavagem de estringência moderada a alta. Condições de hibridização são baseadas na temperatura de fusão (Tm) do com10 plexo ou sonda de ligação a ácido nucleico. Por exemplo, "estringência máxima" ocorre, tipicamente, em torno da Tm-5 0C (5 0C abaixo da Tm da sonda); "alta estringência" em torno de 5-10 0C abaixo da Tm; "estringência intermediária" em torno de 10-20 0C abaixo da Tm da sonda; e "baixa estringência" em torno de 20-25 °C abaixo da Tm. Funcionalmente, condições de 15 estringência máxima podem ser usadas para identificar seqüências tendo identidade próxima ou quase próxima à sonda de hibridização; enquanto que uma hibridização em estringência baixa ou intermediária pode ser usada para identificar ou detectar homólogos de seqüência de polinucleotídeo.

Condições de hibridização em estringência moderada e alta são bem-conhecidas na técnica. Um exemplo de condições de alta estringência inclui hibridização em torno de 42 0C em formamida a 50%, 5X SSC1 5X solução de Denhardt, SDS a 0,5% e 100 ng/ml de DNA veículo desnaturado, seguido por lavagem duas vezes em 2X SSC e SDS a 0,5% em temperatura ambiente e mais duas vezes em 0,1X SSC e SDS a 0,5% a 42 °C. Um exemplo de condições de estringência moderada incluem uma incubação durante a noite a 37 0C em uma solução compreendendo formamida a 20%, 5X SSC (NaCI a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5X solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1X SSC em torno de 37-50 0C. Aqueles versados na técnica saberão como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc. conforme necessário para acomodar fatores tais como comprimento da sonda e semelhantes.

Conforme usado aqui, "recombinante" inclui referência a uma célula ou vetor que tenha sido modificado através da introdução de uma seqüência de ácido nucleico heteróloga ou homóloga ou onde a célula é deri5 vada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma idêntica dentro da forma nativa (não-recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são, de outro modo, anormalmente expressos, subexpressos ou não expressos em geral como um resultado de intervenção humana deliberada. 10 Em uma modalidade da invenção, seqüências de DNA com mu

tação são geradas com mutagênese por saturação de sítio em pelo menos um códon. Em outra modalidade preferida, mutagênese por saturação de sítio é realizada para dois ou mais códons. Em uma outra modalidade, seqüências de DNA mutantes têm mais de 50%, mais de 55%, mais de 60%, 15 mais de 65%, mais de 70%, mais de 75%, mais de 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95%, ou mais de 98% de homologia com a seqüência precursora. Em modalidades alternativas, o DNA mutante é gerado in vivo usando qualquer procedimento mutagênico conhecido tal como, por exemplo, radiação, nitrosoguanidina e semelhantes. A seqüência de DNA desejada é, 20 então, isolada e usada nos métodos fornecidos aqui.

Conforme usado aqui, "proteína heteróloga" refere-se a uma proteína ou polipeptídeo que não ocorre naturalmente na célula hospedeira.

Conforme usado aqui, "proteína homóloga" refere-se a uma proteína ou polipeptídeo nativo ou que ocorre naturalmente em uma célula e inclui proteínas nativas que são super-expressas na célula, quer através da tecnologia de DNA recombinante ou naturalmente.

Uma enzima é "superexpressa" em uma célula hospedeira se a enzima é expressa na célula em um nível maior do que o nível no qual ela é expressa em uma célula do tipo silvestre correspondente.

Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados permutavel

mente aqui. Na presente descrição e nas reivindicações, os códigos com uma letra e três letras convencionais para resíduos de aminoácido são usados. O código com 3 letras para aminoácidos é conforme definido em conformidade com a IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Também deve ser entendido que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de uma seqüência de nucleotídeo em virtude da degenera5 ção do código genético.

Variantes da invenção são descritas pela seguinte nomenclatura: [resíduo de aminoácido original/posição/resíduo de aminoácido substituído]. Por exemplo, a substituição de Ieucina por arginina na posição 76 é representada como R76L. Quando mais de um aminoácido é substituído em uma 10 determinada posição, a substituição é representada como 1) Q172C, Q172D ou Q172R; 2) Q172C, D ou R ou 3) Q172C/D/R. Quando uma posição adequada para s|ubstituição é identificada aqui sem um aminoácido específico sugerido, dev^ ser entendido que qualquer resíduo de aminoácido pode ser substituído pelo resíduo de aminoácido presente na posição. Onde uma glu15 coamilase variante contém uma deleção em comparação com outras glucoamilas>es, a deleção é indicada com Por exemplo, uma deleção na posição R76 é representada como R76*. Uma deleção de dois ou mais aminoácidos consecutivos é indicada, por exemplo, como (76 -78)*.

Ima "pró-sequência" é uma seqüência de aminoácido entre a ializadora e a proteína madura que é necessária para a secreção da proteína. Clivagem da pró-sequência resultará em uma proteína ativa madura.

O termo "seqüência sinalizadora" ou "peptídeo sinalizador" refere-se a qualquer seqüência de nucleotídeos e/ou aminoácidos a qual pode 25 participar na secreção das formas maduras ou precursoras da proteína. Essa definição de seqüência sinalizadora é aquela funcional, que se destina a incluir todas aquelas seqüências de aminoácido codificadas pela porção Nterminal do gene da proteína, as quais participam na realização da secreção da proteína. Elas são, frequentemente, mas não universalmente, ligadas à 30 porção N-terminal de uma proteína ou à porção N-terminal de uma proteína precursora. A seqüência sinalizadora pode ser endógena ou exógena. A seqüência sinalizadora pode ser aquela normalmente associada à proteína

U

seqüência sin 10

15

20

30

(por exemplo, glucoamilase) ou pode ser de um gene que codifica outra proteína secretada.

O termo forma "precursora" de uma proteína ou peptídeo referese a uma forma madura da proteína tendo uma pró-sequência operavelmente ligada ao amino ou carbóxi término da proteína. O precursor pode também ter uma seqüência "sinalizadora" operavelmente ligada ao amino término da pró-sequência. O precursor pode também ter polinucleotídeos adicionais que estão envolvidos em atividade pós-traducional (por exemplo, polinucleotídeos divados dos mesmos levam à forma madura de uma proteína ou peptídeo).

"Cepa hospedeira" ou "célula hospedeira" refere-se a um hospedeiro adequado para um vetor de expressão compreendendo DNA de acordo com a presente invenção.

Os termos "derivado de" e "obtido de" se referem não apenas a uma glucoamilase produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também a uma glucoamilase codificada por uma seqüência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro contendo tal seqüência de DNA. Adicionalmente, os termos se referem a uma glucoamilase a qua é codificada por uma seqüência de DNA de origem sintética a qual tem as características de identificação da glucoamilase

e/ou cDNA e em questão.

U

retém a ativid vestre, nativa

m "derivado", dentro do escopo dessa definição, geralmente ade de hidrólise característica observada na forma do tipo silou precursora até o ponto em que o derivado é útil para fins

funcionais de que ocorrem

similares conforme a forma do tipo silvestre, nativa ou precursora. Derivados

glucoamilase abrangem peptídeos ou fragmentos de peptídeo naturalmente, sintética ou recombinantemente produzidos os

quais têm as características gerais das glucoamilases da presente invenção.

O termo "isolado" ou "purificado" refere-se a um material que é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele ocorre naturalmente).

cLnforme usado aqui, o termo "mutagênese combinatorial" refere-se a métodos nos quais bibliotecas de variantes de uma seqüência inicial são geradas. Nessas bibliotecas, as variantes contêm uma ou várias mutações escolhidas de um conjunto pré-definido de mutações. Além disso, os métodos proporcionam meios para introduzir mutações aleatórias as quais 5 não são membros do conjunto pré-definido de mutações. Em algumas modalidades, os métodos incluem aqueles apresentados na USP 6.582.914, aqui incorporada por referência. Em modalidades alternativas, métodos de mutagênese combinatorial abrangem kits comercialmente disponíveis (por exemplo, QuikChange® Multisite, Stratagene, San Diego, CA).

Conforme usado aqui, o termo "biblioteca de mutantes" refere-se

a uma população de células as quais são idênticas na maior parte de seu genoma, mas incluem diferentes homólogos de um ou mais genes. Tais bibliotecas podem ser usadas, por exemplo, para identificar genes ou óperons com traços aperfeiçoados.

Conforme usado aqui, o termo "teor de sólidos secos (DS ou

ds)" refere-se aos sólidos totais em uma pasta em % em uma base em peso seco.

Conforme usado aqui, o termo "hit inicial" refere-se a uma variante que foi identificada através de classificação de uma biblioteca de mutagênese de consenso combinatorial. Em modalidades preferidas, os hits iniciais têm características de desempenho aperfeiçoadas quando comparado com o gene inicial.

Conforme usado aqui, o termo "hit aperfeiçoado" refere-se a uma variante que foi identificada através de classificação de uma biblioteca de mutagênese de consenso combinatorial intensificada.

Conforme usado aqui, o termo "propriedade-alvo" refere-se à propriedade do gene inicial que tem de ser alterado. Não se pretende que a presente invenção esteja limitada a qualquer propriedade-alvo em particular. Contudo, em algumas modalidades preferidas, a propriedade-alvo é a esta30 bilidade de um produto gênico (por exemplo, resistência à desnaturação, proteólise ou outros fatores degradativos) enquanto que, em outras modalidades, o nível de produção em um hospedeiro de produção é alterado. Na verdade, considera-se que qualquer propriedade de um gene inicial encontrará uso na presente invenção.

Outras definições de termos podem aparecer por toda a especificação.

5 Antes que modalidades exemplificativas sejam descritas em

maiores detalhes, deve ser entendido que a presente invenção não está limitada às modalidades descritas embalagem, uma vez que as mesmas podem, naturalmente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é para fins de descrição de modalidades particulares apenas e 10 não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da presente invenção estará limitado apenas pelas reivindicações em anexo.

Onde uma faixa de valores é fornecida, deve ser entendido que cada valor interveniente, até o décimo da unidade do limite mínimo, a menos que o contexto indique claramente de outro modo, entre os limites máximo e 15 mínimo dessa faixa, também é especificamente descrito. Cada faixa menor entre cada valor estabelecido ou valor interveniente em uma faixa estabelecida e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente nessa faixa estabelecida é abrangido dentro da invenção. Os limites máximo e mínimo dessas faixas menores podem ser independentemente incluídos ou excluídos da 20 faixa e cada faixa onde ambos, nenhum ou qualquer um dos limites são incluídos nas faixas menores é também abrangida dentro da invenção, sujeito a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos os limites, faixas excluindo um ou ambos esses limites incluídos também são incluídas na invenção.

Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalen

tes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais exemplificativos e preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais com relação aos quais as publicações são citadas.

Deve ser notado que, conforme usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências no plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "um gene" inclui uma pluralidade de tais agentes candidatos e referência a "uma célula" inclui referência a uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidos por aqueles versados 5 na técnica e assim por diante.

As publicações discutidas aqui são fornecidas unicamente por sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser construído como uma admissão de que a presente invenção não se destina a antecipar tal publicação em virtude de invenção anterior.

ModaIidadesPreferidas

Um objetivo da presente invenção foi alterar propriedades, tal como melhorar a estabilidade térmica e/ou atividade específica, de glucoamilases precursoras e, em particular, glucoamilase de Trichoderma reesei (TrGA), em que uma variante de glucoamilase tendo propriedades alteradas, tal 15 como aperfeiçoada, seria útil, por exemplo, em processos de conversão de amido ou fermentação de álcool.

Glucoamilases precursoras:

Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma variante de glucoamilase. A variante de glucoamilase é uma variante de uma 20 glucoamilase precursora, a referida glucoamilase precursora compreendendo uma seqüência de aminoácido conforme ilustrado em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 ou 9 ou a referida glucoamilase precursora compreendendo um domínio catalítico tendo uma seqüência de aminoácido mostrando pelo menos 80% de identidade de seqüência com uma ou mais das seqüências de 25 aminoácido ilustradas em SEQ ID NO: I, 2, 3, 5, 6, 7, ou 8 e/ou codificada por uma seqüência de DNA a qual se hibridiza, sob condições média, alta ou estringentes, com um DNA que codifica uma glucoamilase tendo uma das seqüências de aminoácido de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.

A estrutura prevista e seqüências conhecidas de glucoamilases são conservadas dentre as espécies fúngicas (Coutinho e outros, 1994 Protein Eng., 7: 393 - 400 e Coutinho e outros, 1994, Protein Eng., 7: 749-760). Em algumas modalidades, a glucoamilase precursora é uma glucoamilase fúngica filamentosa. Em algumas modalidades, a glucoamilase precursora é obtida de uma cepa de Trichoderma (por exemplo, T. reesei, T. Iongibrachiatum, T. strictipilis, T. asperellum, T. konilangbra e T. hazianum), uma cepa de Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. nidulans, A. kawachi, A. awamorii e A.

5 orzyae), uma cepa de Talaromyces (por exemplo, T. emersonii, T. thermophilus e T. duponti), uma cepa de Hypoerea (por exemplo, H. gelatinosa, H. oríentalis, H. vinosa e H. citrina), uma cepa de Fusarium (por exemplo, F. oxysporum, F. roseum e F. venenatum), uma cepa de Neurospora (por exemplo, N. crassa) e uma cepa de Humicola (por exemplo, H. grisea, H. in10 solens e H. lanuginose), uma cepa de Penicillium (por exemplo, P. notatum ou P. chrysogenum) ou uma cepa de Saccharomycopsis (por exemplo, S. fibuligera).

Em algumas modalidades, a glucoamilase precursora pode ser uma glucoamilase bacteriana. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser obtido 15 de uma cepa bacteriana gram positiva, tal como Bacillus (por exemplo, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis, B. stearothermophilus, B. subtilis e B. thuringiensis) ou uma cepa de Streptomyees (por exemplo, S. lividans).

Em algumas modalidades, a glucoamilase precursora terá pelo 20 menos 80% de identidade de seqüência, pelo menos 85% de identidade de seqüência, pelo menos 88% de identidade de seqüência, pelo menos 90% de identidade de seqüência, pelo menos 93% de identidade de seqüência, pelo menos 95% de identidade de seqüência, pelo menos 96% de identidade de seqüência, pelo menos 97% de identidade de seqüência, pelo menos 25 98% de identidade de seqüência e também pelo menos 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido de TrGA de SEQ ID NO: 2.

Em outras modalidades, a glucoamilase precursora terá pelo menos 80% de identidade de seqüência, pelo menos 85% de identidade de seqüência, pelo menos 90% de identidade de seqüência, pelo menos 95% 30 de identidade de seqüência, pelo menos 97% de identidade de seqüência e também pelo menos 98% de identidade de seqüência com o domínio catalítico da seqüência de aminoácido de TrGA de SEQ ID NO: 3. 10

15

20

25

30

Em ainda outras modalidades, a glucoamilase precursora compreenderá uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 93% de identidade de seqüência, pelo menos 95% de identidade de sequência, pelo menos 96% de identidade de sequência, pelo menos 97% de identidade de sequência, pelo menos 98% de identidade dê sequência e também pelo menos 99% de identidade de sequência com jo domínio catalítico da glucoamilase precursora de Aspergillus de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

Em outras modalidades, a glucoamilase precursora compreenderá uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, pelo menos 97% de identidadd de sequência e também pelo menos 99% de identidade de sequência com o domínio catalítico da glucoamilase precursora de Humicola grisea (HgGA) de SEQ ID NO: 8.

Em outras modalidades, um homólogo de glucoamilase de Trichoderma será obtido de uma cepa de Trichoderma ou Hypocrea. Alguns homólogos de glucoamilase de Trichoderma são descritos na Pub. de Pat. U.S. No. 2006/0094080 e referência é feita especificamente às seqüências de aminoácidi) apresentadas em SEQ ID NOs: 17-22 e 43-47 desta referência.

Em algumas modalidades, a glucoamilase precursora é TrGA compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou um homólogo de glucoamilase de Triehoderma tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo meios 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência à sequência da TrGA.

Homologia Estrutural de Glucoamilase:

O

DNA que cod

dogma central de biologia molecular é que a sequência de fica um gene para uma enzima em particular determina a sequência de aminoácido da proteína, essa sequência, por sua vez, determina a duplicação tridimensional da enzima. Essa duplicação leva a resíduos muito diferentes que criam um centro catalítico e superfície de ligação a substrato e isso resulta na alta especificidade e atividade das enzimas em questão.

Glucoamilases consistem de tanto quanto em três domínios estruturais distintos, um domínio catalítico de aproximadamente 450 resíduos,

o qual é estruturalmente conservado em todas as glucoamilases, geralmente 5 seguido por uma região Iigante consistindo em entre 30 e 80 resíduos os quais são conectados a um domínio de ligação a amido de aproximadamente 100 resíduos. A estrutura da glucoamilase de Trichoderma reesei com todas as três regiões intactas foi determinada em uma resolução de 1,8 Angstrom aqui (vide tabela 15 e Exemplo 11). Usando as coordenadas (vide 10 tabela 15), a estrutura foi alinhada com as coordenadas do domínio catalítico da cepa X100 de Aspergillus awamorii que foi determinada previamente (Aleshin, A.E., Hoffman, C., Firsov, L.M. e Honzatko, R.B. 1994 Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori var. X100. J Mol Biol 238: 575-591). A estrutura de cristal de Aspergillus awamorii incluía apenas 15 o domínio catalítico. Conforme observado nas Figuras 12 e 13, a estrutura dos domínios catalíticos se sobrepõe muito intimamente e é possível identificar resíduos equivalentes baseado nessa superposição estrutural. Os inventores acreditam que todas as glucoamilases compartilham a estrutura básica representada nas figuras 12 e 13.

A figura 12 é uma comparação das estruturas das estruturas tri

dimensionais da glucoamilase de Trichoderma (preto) de SEQ ID NO: 1 (vide figura 1 para sequência de aminoácido) e de Aspergillus awamorii (cinza) vistas de lado. Nessa vista, a relação entre o domínio catalítico e a região Iigante e o domínio de ligação a amido podem ser observados.

A figura 13 é uma comparação das estruturas tridimensionais da

glucoamilase de Triehoderma (preto) e de Aspergillus awamorii (cinza) vistas de cima. As glucoamilases mostradas aqui e, na verdade, todas as glucoamilases conhecidas até o momento, compartilham essa homologia estrutural. A conservação de estrutura se correlaciona com a conservação de atividade 30 e um mecanismo conservado de ação para todas as glucoamilases. Dada sua alta homologia, alterações resultantes de variantes sítio-específicas da glucoamilase de Triehoderma que resultam em função alterada também têm 10

conseqüências estruturais e, portanto, funcionais similares em outras glucoamilases. Portanto, os ensinamentos de quais variantes resultam em benefícios desejáveis podem ser aplicados a outras glucoamilases.

Assim, os números de posição de aminoácido discutidos aqui se referem àqueles atribuídos à sequência de glucoamilase de Trichoderma reesei madura apresentada na figura 1. A presente invenção, contudo, não está limitada às variantes de glucoamilase de Trichoderma, mas se estende à glucoamilases contendo resíduos de aminoácido nas posições as quais são "equivalejntes" aos resíduos identificados em particular em glucoamilase de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 2). Em uma modalidade preferida da presente invemção, a glucoamilase precursora é GA de Taleromyces e as substituições são feitas nas posições de resíduo de aminoácido equivalentes em glucoamijase de Taleromyces conforme aquelas divulgadas aqui. Em outras modalidades, a glucoamilase precursora é uma daquelas listadas na

tabela 1. Em

outras modalidades, a glucoamilase precursora é uma glucoa

milase de Penieillium, tal como Penieillium ehrysogenum.

I

A identidade estrutural determina se os resíduos de aminoácido são equivalentes. A identidade estrutural é um equivalente topológico um-aum quando as duas estruturas (estruturas tridimensionais e de aminoácido) 20 são alinhada^. Uma posição de resíduo (aminoácido) de uma glucoamilase é equivalente a um resíduo de glucoamilase de T. reesei se ela é homóloga (isto é, correslpondendo, quanto à posição, à estrutura primária ou terciária) ou análoga a um resíduo ou porção específica desse resíduo na glucoamilase de T. reesei (tendo a mesma ou uma capacidade funcional similar para 25 combinar, reagir ou interagir quimicamente).

De forma a estabelecer a identidade à estrutura primária, a sequência de aminoácido de uma glucoamilase pode ser diretamente comparada com a sequência primária da glucoamilase de Trichoderma reesei e, particularmente, com um conjunto de resíduos conhecidos por serem invari30 áveis em glucioamilases para as quais a sequência é conhecida. Por exemplo, as Figurab 4A e B aqui mostram os resíduos conservados entre glucoamilases. Após alinhamento dos resíduos conservados, que permitem inserções e deleções necessárias de forma a manter o alinhamento (isto é, evi

10

20

25

tando a elimi arbitrária), os cia primária c

inação de resíduos conservados através de deleção e inserção resíduos equivalentes a aminoácidos em particular na sequênie glucoamilase de Trichoderma reesei são definidos. O alinhamento de resíduos conservados conservará, de preferência, 100% de tais resíduos. Contudo, o alinhamento de mais de 75% ou tão pouco quanto 50% dos resíduos conservados é também adequado para definir resíduos equivalentes.

Ppr exemplo, na figura 4, glucoamilases de seis organismos são alinhadas para proporcionar a quantidade máxima de homologia entre seqüências de aminoácido. Uma comparação dessas seqüências mostra que há uma sériej de resíduos conservados contidos em cada sequência, conforme designado por um asterisco. Esses resíduos conservados, assim, podem ser usados para definir os resíduos de aminoácido equivalentes corres

pondentes de

glucoamilase de Trichoderma reesei em outras glucoamilases,

tal como glucoamilase de Aspergillus niger.

A identidade estrutural envolve a identificação de resíduos equivalentes entre as duas estruturas. "Resíduos equivalentes" podem ser definidos determinando a homologia ao nível da estrutura terciária (identidade estrutural) para uma enzima cuja estrutura terciária tenha sido determinada através de cristalografia de raios x. Resíduos equivalentes são definidos conforme aqueles para os quais as coordenadas atômicas de dois ou mais dos átomos da cadeia principal de um resíduo de aminoácido em particular da glucoamilase de Trichoderma reesei (N sobre N, CA sobre CA, C sobre C

e O sobre O) nhamento. O e posicionado

estão dentro de 0,13 nm e, de preferência, 0,1 nm após o alialinhamento é obtido após o melhor modelo ter sido orientado para proporcionar o menor fator R para dados de difração ex

I

perimental na maior resolução disponível.

Zk\Fo(h^\ Fc(h)\·

U

30

FatorR

Resíduos equivalentes os quais são funcionalmente análogos a um resíduo específico de glucoamilase de Trichoderma reesei são definidos como aqueles aminoácidos da enzima os quais podem adotar uma conformação de módo que eles alteram, modificam ou contribuem para a estrutura

da proteína, buída a um r

igação a substrato ou catálise de uma maneira definida e atri3Síduo específico da glucoamilase de Trichoderma reesei. Ainda, eles são aqueles resíduos da enzima (para os quais uma estrutura terciária foi obtida através de cristalografia por raios x) os quais ocupam uma

I

posição análoga até o ponto em que, embora os átomos da cadeia principal do determinajdo resíduo possam não satisfazer os critérios de equivalência com base em ocupação de uma posição homóloga, as coordenadas atômi10 cas de pelo riienos dois dos átomos na cadeia lateral do resíduo repousam entre 0,13 nrrl dos átomos da cadeia lateral correspondente de glucoamilase de Trichoderma reesei. As coordenadas da estrutura tridimensional de glucoamilase de Trichoderma reesei são apresentadas na tabela 15 e podem ser usadas cónforme esboçado acima para determinar resíduos equivalentes 15 ao nível da estrutura terciária.

A

conservados,

Jguns dos resíduos identificados para substituição são resíduos enquanto que outros não são. No caso de resíduos os quais não são conservados, a substituição de um ou mais aminoácidos está limitada à substituições as quais produzem uma variante que tem uma sequência 20 de aminoácido que não corresponde a uma encontrada na natureza. No caso de resíduos conservados, tais substituições não resultarão em uma sequência que ocorre naturalmente.

Variantes

As variantes de acordo com a invenção incluem pelo menos uma

substituição, deleção ou inserção na sequência de aminoácido de uma glu

i

coamilase precursora que torna a variante diferente, quanto à sequência, de uma glucoamilase precursora. Em algumas modalidades, as variantes da invenção têm pelo menos 20%, pelo menos 40%, pelo menos 60%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e também pelo menos 100% da atividade de glucoamilase da atividade de TrGA de

SEQ ID NO: 2.

!

Em algumas modalidades, as variantes de acordo com a inven97% e pelo m E

ção compreenderão uma substituição, deleção ou inserção em pelo menos uma posição pe aminoácido da TrGA precursora (SEQ ID NO: 2) ou em uma

posição equivalente na sequência de outra glucoamilase precursora tendo

i

pelo menos 93% de identidade de sequência, pelo menos 95%, pelo menos ienos 99%.

im outras modalidades, a variante de acordo com a invenção compreenderá uma substituição, deleção ou inserção em pelo menos uma posição de aminoácido de um fragmento da TrGA precursora, em que o fragmento compreende o domínio catalítico da sequência da TrGA (SEQ ID

NO: 3) ou em uma posição equivalente em um fragmento compreendendo o

I

domínio catalítico de uma glucoamilase precursora tendo pelo menos 80%

I

de identidade de sequência ao fragmento da sequência da TrGA, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% e pelo menos 99%. Em algumas modalidades, o fragmento compreenderá pelo menos 400, 425, 450, 15 e/ou 500 resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades, quando a glucoamilase precursora inclui não apenas um domínio catalítico, região Iigante e domínio de ligação a amido, o fragmento pode incluir parte da região Iigante. Em uma modalidade particularmente preferida, a variante compreenderá uma substituição, deleção ou inserção na sequência de aminoácido de um 20 fragmento da sequência da TrGA (SEQ ED NO: 2 ou SEQ ID NO: 3).

Identidade estrutural, com referência a uma substituição de aminoácido, significa que a substituição ocorre na posição de aminoácido equivalente na glucoamilase homóloga ou glucoamilase precursora. O termo posição equivalente significa uma posição que é comum a duas seqüências 25 precursoras a qual é baseada em um alinhamento da sequência de aminoácido de uma glucoamilase precursora em questão, bem como alinhamento

I

da estrutura tridimensional da glucoamilase precursora em questão com a sequência de aminoácido da glucoamilase de TrGA de referência e a sequência tridimensional. Por exemplo, com referência à figura 4, a posição 24 30 na TrGA (SEQ ID NO: 3) é D24 e a posição equivalente para Aspergillus niger (SEQ ID NO: 6) é a posição D25 e a posição equivalente para AspergilIus oryzea (SEQ ID NO: 7) é a posição D26. Vide Figuras 13 e 13 para um 10

15

20

25

30

alinhamento exemplificativo da sequência tridimensional.

Em algumas modalidades, a variante de glucoamilase incluirá pelo menos uma substituição na sequência de aminoácido de um precursor. Em outras modalidades, a variante pode ter mais de uma substituição (por exemplo, duas, três ou quatro substituições).

Em algumas modalidades, uma variante de glucoamilase compreende uma substituição, deleção ou inserção e, de preferência, uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido em uma posição corres

pondendo às na figura 4 (p posições as c E

regiões de aminoácidos não-conservados, conforme ilustrado or exemplo, posições de aminoácido correspondendo àquelas uais não são designadas por na figura 4). mbora as variantes possam estar em qualquer posição na sequência da proteína madura (SEQ ID NOs: 2 ou 3), em uma modalidade, uma variante;de glucoamilase compreende uma ou mais substituições nas seguintes posições na sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 3: 4, 5, 12, 24, 29, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 70, 75, 76, 94, 100, 108, 114, 116, 119, 122, 124, 125, 137, 143, 146, 148, 169, 171, 172, 175, 178, 180, 181, 208, 211, 228, 242, 243, 245, 292, 294, 297, 309, 310, 313, 314, 315, 316, 317, 321, 340, 341, 350, 353, 356, 363, 368, 369, 375, 376,

395, 398, 401 posição equiv

, 408, 409, 412, 415, 418, 421, 433, 436 e 451; e/ou em uma alente em uma glucoamilase precursora. Em algumas modalidades, a glucoamilase precursora terá pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% pelo menos 98% e pelo menos 99% de sequência com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. Em outras a glucoamilase precursora será um homólogo de glucoamilase de Trichoderma.

Ein algumas modalidades, a variante de glucoamilase compreende uma ou mais substituições nas seguintes posições na sequência de )resentada em SEQ ID NO: 2 ou 3:

identidade de modalidades,

aminoácido a

D4, F5, 112, D24, F29, I43, D44, P45, D46, Y47, Y49, W51, Y70,

Q75, R76, PS N146, Q148

4, D100, K108, K114, F116, N119, R122, Q124, R125, G137, Y169, N171, Q172, F175, W178, E180, V181, Q208, S211, 10

15

20

25

30

W228, Ν242, Ε243, R245, Ι292, G294, Κ297, R309, Υ310, D313, V314, Υ315, Υ316, Ν317, W321, Κ340, Κ341, Τ350, Q356, Τ363, S368, S369, Ν376, Υ395, Α398, S401, R408, Ν409, Τ412, Η418, W421, R433, 1436 e/ou S451 e/ou uri posição equivalente na glucoamilase precursora (por exemplo, um homólogo de glucoamilase de Trichoderma).

Em outras modalidades, a variante de uma glucoamilase precursora compreende uma ou mais substituições nas seguintes posições na sej

quência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 3: 4, 5, 24, 29, 43, 44, 49, 70, 75, 76, 100, 108, 119, 124, 137, 146, 148, 169, 171, 172, 175, 178, 181, 208, 211, 243, 292, 294, 297, 314, 316, 317, 340, 341, 350, 356,

363, 368, 36sj, 376, 395, 401, 409, 412, 433, 436 e/ou 451 e/ou uma posição

I

equivalente em uma glucoamilase precursora (por exemplo, homólogo de

glucoamilase de Trichoderma).

\

Enn outras modalidades, a variante de uma glucoamilase precursora compreende pelo menos uma das seguintes substituições nas seguintes posições em uma sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 3: D4L/E/R/S/C/A/Q/W, F5C/M/N/R/S/T/V/W, I12L/R, D24E/L/Y/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S, D44E/H/K/S/N/Y/F/R, Y47W, Y49N, Q70R/K/M/P/G/L/F, Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P, P94L, D100W/I/Q/M/P/A/N, E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M, Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T, Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V, F175H/A/G/R/S/T/C/WY,

N119P/T/Y/D/ Y169D/F,

W178A/C/D/E/F/G/H/K/N/R/S/T/V/Y,

V181 E/C/D/G

E180A/C/G/H/I/L7N/P/Q/R/S/T/V/Y,

i/H/l/P/T /Y/S/L/K/F/A, Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211 C/R/E/A/Y/ W/M/H/L/l/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L, R245A/E/M/I/P/V, 1292D/H/P/R/T/ N/V/F/L, G294D/E/T/Q/I/A, K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/S/R/W, R309A/C/ G/H/l/N/P/Q/S/TΛ/V/Y/L, Y310E/G/L/P/S/W/R/Q, D313Q, V314A/R/N/D/C/E/ /l/F/P/S/T/W/Y, Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, IGIS, T350S/E/A/N, Q356H/D/E, T363L/R/C/H/W, S368W/ , N376Q/T/H/S/V, Y395Q/R/S, A398S/IfT, S401C/V, R408S, ‘412A/H/K/G, R433H/Q, I436A/T, S451 M/T/H e/ou uma substituição em uma posição equivalente em um homólogo de glucoamilase precursora.

Q/G/HI/I/L/K/IV K341F/D/P/V/ D/F/L, S369F N409W/T/K, Em algumas modalidades preferidas, a variante de glucoamilase compreende pelo menos uma substituição em uma posição correspondendo à posição de resíduo de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2 de 5, 24, 43, 49, 70, 75, 76, 94, 119, 146, 148, 172, 175, 178, 180, 181, 208, 211, 5 245, 294, 353, 315, 375, 409, 309, 314, 369, 412 e/ou uma posição equivalente em uma glucoamilase precursora homóloga.

Em algumas modalidades particularmente preferidas, a variante de glucoamilase compreende pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F5W, D24E, I43R, I43Y, I43S, I43F, Y47W, Y49N, 10 Q70K, Q75R, R76L, P94L, N119P/T/Y/D, N146S/D/T/E/W/L, Q148V, N171D, Q172C/D/R/E/F/V/L/T, F175R/W/Y, W178K/N/Y, E180H/N/V/R, V181E/F/ G/l/H, Q208A/T/N, S211 H/M/L/R, R245E, R245M, R309W, V314F/G/ H/K/P/R/Y, Y315F, S369F, T412K correspondendo à posição apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 3 e/ou uma posição equivalente em uma glucoamilase 15 precursora homóloga.

Em outras modalidades particulares, a variante de glucoamilase compreende pelo menos uma substituição de um resíduo de aminoácido selecionado das posições correspondendo à posição 5, 43, 75, 76, 94, 108, 119, 124, 146, 148, 171, 172, 175, 178, 180, 181, 208, 211, 297, 314, 316 ou 20 412 de SEQ ID NO: 2 ou 3 e/ou uma posição equivalente em um homólogo de glucoamilase de Trichoderma. Em algumas modalidades preferidas, a substituição é na posição correspondendo à posição número 148, 172, 175, 178, 180, 208, 211, 314, 412 ou 297 de SEQ ID NO: 2 ou 3 e/ou uma posição equivalente em um homólogo de glucoamilase de Trichoderma. Em al25 gumas modalidades particularmente preferidas, a substituição é em uma posição correspondendo à posição número 148, 172, 175, 178, 180, 208, 211, 314, 412 ou 297 de SEQ ID NO: 2 ou 3 e/ou uma glucoamilase precursora homóloga (por exemplo, homólogo de glucoamilase de Trichoderma).

Em algumas modalidades, a variante de glucoamilase compreende múltiplas substituições. Algumas das múltiplas substituições incluirão uma substituição em uma ou mais posições equivalentes a e incluindo as posições 24, 43, 44, 108, 124, 171, 175, 181, 208, 243, 292, 294, 297, 310, 10

15

20

25

30

314 e 363 de incluirão uma

sições 108, 124, 171, 208, 211 e 314 de SEQ ID NO: 2 ou 3. Em algumas

modalidades

D24/I43/D44/

SEQ ID NO: 2 ou 3. Algumas múltiplas substituições preferidas ou mais das posição equivalentes a e compreendendo as po

as variantes de glucoamilase compreendem múltiplas substitu

ições, tais como Y47W e Y315F ou Y47F e Y315W.

guns exemplos de substituições incluem nas posições Ί-175/V181Λ/314/T363; D24/Q208/I292/G294/K297/Y310 V181/E243/l2j92/k297/N317/Y395; D24/V181/Q208/G294/T363/N376/N409 D24/V181/I292/G294/E243/N409; e I43R/E243/I292/G294/K297 de SEQ ID

I ’

!

NO: 2 ou 3 ej posições equivalentes em glucoamilases precursoras e, particularmente, homólogos de glucoamilase de Trichoderma.

I

Algumas múltiplas substituições preferidas incluem as substituições: D24E,| L/I43F, R/D44H, N/F175H/V181K, L/V314D,H,K/T363R; D24L,W,Y/Q2Í08F/I292F, N, V/G294A, I, Q/K297A/Y310F, Q, R; V181F, K,

L/E243A,N,M D24E, L, YV D24E.L, Y/V 1

R,Y/I292F,L,N,V/K297A, D, Η, Μ, N, Q/N317H/Y395Q, R 81F, K, L/Q208C, F/G294A, I, Q/T363R/N376Q/N409K, W; 81 F, K, L/I292F,L,N,V/G294A, I, Q/E243 A, Μ, N, R, Y/N409K,

W; e I43R/E243A, Μ, N, R, Y/I292F,L,N,V/G294A/K297A,D,H,M, N,Q,S,R,W,Y de SEQ ID NO: 2 ou 3 e posições equivalentes em glucoamilases precursoras e, particularmente, um homólogo de glucoamilase de Trichoderma.

Uma série de glucoamilases precursoras foi alinhada com a sequência de aminoácido de TrGA. A figura 4 inclui o domínio catalítico das seguintes glucoamilases precursoras: Aspergillus awamori (AaGA) (SEQ ID NO: 5); Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO: 6); Aspergillus orzyae (AoGA) (SEQ ID NO: 7), Humicola grisea (HgGA) (SEQ ID NO: 8) e Hypocrea vinosa (HvGA) (SEQ;ID NO: 9). A identidade % dos domínios catalíticos é representada na tabela 1 abaixo. Em algumas modalidades, por exemplo, a glucoamilase variante será derivada de uma glucoamilase precursora a qual é uma

glucoamilase ção em uma NO: 2 ou 3 e

de Aspergillus e a variante incluirá pelo menos uma substituiposição equivalente a uma posição apresentada em SEQ ID , particularmente, em uma posição correspondendo a D4, F5, 112, D24, F29, Ι43, D44, Ρ45, D46, Υ47, Υ49, W51, Υ70, Q75, R76, Ρ94, D100, Κ108, Κ114, F116, N119, R122, Q124, R125, G137, Ν146, Q148, Υ169, Ν171, Q172, F175, W178, Ε180, V181, Q208, S211, W228, Ν242, Ε243, R245, 1292, G294, Κ297, R309, Υ310, D313, V314, Υ315, Υ316, 5 Ν317, W321, Κ340, Κ341, Τ350, Q356, Τ363, S368, S369, Ν376, Υ395, Α398, S401, R408, Ν409, Τ412, Η418, W421, R433, Ι436 e/ou S451.

A remoção de endo-H de açúcares N-Iigados na glucoamilase de Trichoderma reesei teve um efeito de estabilização (quando se olha a Tm). Assim, variantes tendo uma substituição N171D podem ter termoestabilidade 10 aumentada quando comparado com o tipo silvestre. Em algumas modalidades, variantes tendo uma ou mais substituições em sítios tendo açúcares NIigados são proporcionadas, incluindo N171D em Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 2).

tabela 1

AaGA AnGA AoGA HgGA HvGA TrGA AaGA 100 95 58 53 57 56 AnGA 100 59 53 57 56 AoGA 100 55 56 56 HgGA 100 61 63 HvGA 100 91 TrGA 100 A presente invenção também proporciona variantes de glucoami

lase tendo pelo menos uma propriedade alterada (por exemplo, propriedade aperfeiçoada) quando comparado a uma glucoamilase precursora e, particularmente, à TrGA. Em algumas modalidades preferidas, pelo menos uma propriedade alterada (por exemplo, propriedade aperfeiçoada) é selecionada 20 do grupo consistindo em estabilidade ao ácido, estabilidade térmica e atividade específica. De preferência, a propriedade alterada é estabilidade aumentada ao ácido, estabilidade térmica aumentada e/ou atividade específica aumentada. De preferência, a estabilidade térmica aumentada é em maiores temperaturas. Em uma modalidade, a estabilidade aumentada ao pH é em 25; pH elevado. Em uma outra modalidade, a estabilidade aumentada ao pH é em baixo pH.

As variantes de glucoamilase da invenção também podem proporcionar maiores taxas de hidrólise de amido em baixas concentrações de substrato quando comparado à glucoamilase precursora. A variante pode ter 5 uma maior Vmax ou menor Km do que uma glucoamilase precursora quando testada sob as mesmas condições. Por exemplo, a glucoamilase variante pode ter uma maior Vmax em uma faixa de temperatura de 25°C a 70°C (por exemplo, a 25°C a 35°C; 30°C a 35°C; 40°C a 50°C; a 50°C a 55°C e a 55°C a 62°C). Os valores da constante de Michaelis-Menten, Km e Vmax podem 10 ser facilmente determinados usando procedimentos conhecidos padrões. Estabilidade Térmica (variantes termoestáveis):

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma glucoamilase variante tendo estabilidade térmica alterada em temperaturas alteradas quando comparado a um precursor ou tipo silvestre. Temperaturas alteradas incluem temperaturas aumentadas ou diminuídas. Em algumas modalidades, a variante de glucoamilase terá termoestabilidade aperfeiçoada, tal como retendo pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da atividade enzimática após exposição à temperaturas alteradas durante um determinado período de tempo, por exemplo, pelo menos 60 minutos, 120 minutos, 180 minutos, 240 minutos, 300 minutos, etc. Em algumas modalidades, a variante tem estabilidade térmica aumentada comparado à glucoamilase precursora em temperaturas selecionadas na faixa de 40 a 80 0C, também na faixa de 50 a 75 0C e na faixa de 60 a 70 0C e, de preferência, em uma faixa de pH de 4,0 a 6,0. Em algumas modalidades, a termoestabilidade é determinada conforme descrito nos Exemplos.

Em algumas modalidades, variantes particularmente interessantes com relação a um aperfeiçoamento na termoestabilidade incluem uma ou mais deleções, substituições ou inserções e, particularmente, substituições nas seguintes posições na sequência de aminoácido apresentada em SEQ 30 ID NO: 2 ou 3: D4, F5, 112, D24, F29, I43, D44, P45, D46, Y47, Y49, W51, Y70, Q75, R76, P94, D100, K108, KI14, FI16, N119, R122, Q124, R125, G137, N146, Q148, Y169, N171, Q172, F175, W178, E180, V181, Q208, S211, W228, Ν242, Ε243, R245, 1292, G294, Κ297, R309, Υ310, D313, V314, Υ315, Υ316, Ν317, W321, Κ340, Κ341, Τ350, Q356, Τ363, S368, S369, Ν376, Υ395, Α398, S401, R408, Ν409, 1412, Η418, W421, R433, 1436 e/ou S451 e/ou uma posição equivalente em uma glucoamilase precursora.

5 Em algumas modalidades, a glucoamilase precursora será um homólogo de glucoamilase de Trichoderma e, em outras modalidades preferidas, a glucoamilase precursora terá pelo menos 90%, pelo menos 95% e pelo menos 98% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 2 ou 3.

Glucoamilases Quiméricas:

Variantes de glucoamilase da invenção podem também incluir

glucoamilases quiméricas ou híbridas, por exemplo, com um domínio de ligação a amido (SBD) de uma glucoamilase e um domínio catalítico e Iigante de outra. Por exemplo, uma glucoamilase híbrida pode ser feita trocando o SBD de AnGA pelo SBD de TrGA, fazendo um híbrido com o SBD de AnGA 15 e o domínio catalítico e Iigante de TrGA. Alternativamente, o SBD e Iigante de AnGA podem ser trocados pelo SBD e o Iigante de TrGA.

Atividade Específica:

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma glucoamilase variante tendo atividade específica alterada quando comparado a uma glucoamilase precursora ou do tipo silvestre.

Em algumas modalidades, variantes particularmente interessantes com relação a um aperfeiçoamento na atividade específica incluem uma ou mais deleções, substituições ou inserções e, particularmente, substituições nas seguintes posições na sequência de aminoácido apresentada em 25 SEQ ID NO: 2 ou 3: D4, F5, 112, D24, F29, I43, D44, P45, D46, Y47, Y49, W51, Y70, Q75, R76, P94, D100, K108, K114, F116, N119, R122, Q124, R125, G137, N146, Q148, Y169, N171, Q172, F175, W178, E180, V181, Q208, S211, W228, N242, E243, R245, I292, G294, K297, R309, Y310, D313, V314, Y315, Y316, N317, W321, K340, K341, T350, Q356, T363, 30 S368, S369, N376, Y395, A398, S401, R408, N409, T412, H418, W421, R433, I436 e/ou S451 e/ou uma posição equivalente em uma glucoamilase precursora. Em algumas modalidades, variantes da invenção tendo atividade específica aperfeiçoada incluem uma substituição nas seguintes posições^na sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 3: D4, D24, 143, D44, Y70, Q75, R76, D100, K108, N119, Q124, N146, Q148, N171, Q172, F175, V181, Q208, S211, E243, R245, 1292, G294, K297, V314, 5 Y316, N317, K340, K341, T350, Q356, T363, S368, N376, Y395, A398, S401, N409, T412, 1436 e/ou S451 e/ou uma posição equivalente em uma glucoamilase precursora. Em algumas modalidades preferidas, a glucoamilase precursora compreenderá uma sequência tendo pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência à sequência de SEQ ID NO: 2 ou 3.

Polinucleotídeos:

A presente invenção também refere-se a polinucleotídeos isolados que codificam uma glucoamilase variante da invenção. Os polinucleotídeos que codificam uma glucoamilase variante podem ser preparados através de métodos estabelecidos na técnica. Os polinucleotídeos podem ser 15 preparados sinteticamente, tal como através de um sintetizador de DNA automático. A sequência de DNA pode ser de origem genômica (ou cDNA) e sintética misturada preparada através de ligação de fragmentos juntos. Os polinucleotídeos também podem ser preparados através de reação em cadeia de polimerase (PCR) usando iniciadores específicos. Em geral, referên20 cia é feita a Minshull J. e outros, (2004), Engineered protein function by seIective amino acid diversification, Methods 32(4): 416 - 427). Também, uma série de companhias agora sintetizam DNA, tal como Geneart AG, Regensburg, Alemanha.

A presente invenção também proporciona polinucleotídeos iso25 lados compreendendo uma sequência de nucleotídeo (i) tendo pelo menos 70% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 4 ou (ii) sendo capazes de hibridização a uma sonda derivada da sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 4, sob condições de estringência intermediária a alta ou (iii) sendo complementares a uma sequência de nucleotídeo tendo pelo me30 nos 90% de identidade de sequência à sequência apresentada em SEQ ID NO: 4. Sondas úteis de acordo com a invenção podem incluir pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300 ou mais nucleotídeos contínuos de SEQ ID NO: 4.

A presente invenção ainda proporciona polinucleotídeos isolados que codificam glucoamilases variantes as quais compreendem uma sequência de aminoácido compreendendo pelo menos 80% de identidade de se5 quência de aminoácido à SEQ ID NO: 2 ou 3. Em algumas modalidades, as glucoamilases variantes têm pelo menos 80% de identidade à SEQ ID NO: 2 ou 3. Em algumas modalidades, as glucoamilases variantes têm pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, as glucoamilases variantes têm pelo menos 93% de iden10 tidade de sequência de aminoácido à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, as glucoamilases variantes têm pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácido à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, as glucoamilases variantes têm pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácido à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, as glucoamilases 15 variantes têm pelo menos 98% de identidade de sequência de aminoácido à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, as glucoamilases variantes têm pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácido à SEQ ID NO:

2. A presente invenção também proporciona vetores de expressão compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos fornecidos acima.

A presente invenção também proporciona fragmentos (isto é,

porções) do DNA que codifica as glucoamilases variantes fornecidas aqui. Esses fragmentos encontram uso na obtenção de fragmentos de DNA de comprimento parcial capazes de serem usados para isolar ou identificar polinucleotídeos que codificam enzimas glucoamilase maduras descritas aqui a 25 partir de células fúngicas filamentosas (por exemplo, Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Schizosaccharomyces e Humicola) ou um segmento da mesma tendo atividade de glucoamilase. Em algumas modalidades, fragmentos do DNA podem compreender pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300 ou mais nucleotídeos contínuos. Em algumas modalidades, por30 ções do DNA fornecido em SEQ ID NO: 4 encontram uso na obtenção de glucoamilase precursora e, particularmente, homólogos de glucoamilase de Trichoderma de outras espécies, tais como fungos filamentosos, as quais codificam uma glucoamilase. Constructos de DNA e Vetores:

ma da célula gem, vetores

De acordo com uma modalidade da invenção, um constructo de DNA compreendendo um polinucleotídeo conforme descrito acima que codifica uma glucoamilase variante abrangida pela invenção e operavelmente ligado a uma sequência promotora é montado para transferência a uma célula hospedeiraj.

0[ constructo de DNA pode ser introduzido em uma célula hospedeira usando um vetor. O vetor pode ser qualquer vetor o qual, quando introduzido em uma célula hospedeira é, de preferência, integrado no genohospedeira e é replicado. Vetores incluem vetores de clonade expressão, vetores-ponte, plasmídeos, partículas de fago, cassetes e similares. Em algumas modalidades preferidas, o vetor é um vetor de expressão que compreende seqüências regulatórias operavelmente ligadas à sequência que codifica a glucoamilase.

Exemplos de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook e outros (1989) supra e Ausubel (1987) supra e van den Hondel e outros (1991) em Bennett e Lasure (Eds.) More Gene Manipulations IN Fungi, Academic Press páginas 396-428 e Patente U.S. 20 No. 5.874.276. Referência também é feita ao Fungai Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, < www.fqsc.net>) para uma lista de vetores. Vetores particularmente úteis incluem vetores obtidos, por exemplo, da Invitrogen e Promega.

Vetores específicos adequados para uso em células hospedeiras fúngicas incluem vetores tais como pFB6, pBR322, pUC18, pUCIOO,

pDONR®221, pENTR®, pGEM®3Z e pGEM®4Z. Um vetor de ra fins gerais útil em Aspergillus inclui pRAX com um promotor glaA e, em Hypocrea/Trichoderma, inclui pTrex3g com um promotor cbhl.

Plasmídeos adequados para uso em células bacterianas incluem pBR322 e pUC19 que permitem replicação em E. coli e pE194 que permite replicação em Bacillus.

Em algumas modalidades preferidas, o promotor mostra ativida

pDONR®201, expressão pa de transcricional em uma célula hospedeira bacteriana ou fúngica e pode ser derivado de genes que codificam proteínas, quer homólogas ou heterólogas à célula hospedeira. O promotor pode ser um promotor mutante, truncado e/ou híbrido. Os promotores mencionados acima são conhecidos na técnica.

Exemplos de promotores adequados úteis em células fúngicas e,

particularmente, células fúngicas filamentosas, tais como células de Trichoderma ou Aspergillus, incluem promotores exemplificativos tais como os promotores cbhl, cbhl, eg!1, egl1, eg5, xln1 e xln1 de T. reesei. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores de genes de glucoamilase 10 (glaA) de A. awamori e A. niger (vide Nunberg e outros (1984) Mol. Cell Biol. 4: 2306-2315 e Boel e outros (1984) EMBO J. 3: 1581-1585), o promotor de amilase TAKA de A. oryzae, o promotor TPI (isomerase de triose de fosfato) de S. cerevisiae, o promotor dos genes de acetamidase de Aspergillus niduIans e dos genes de Iipase de Rhizomucor miehei.

Exemplos de promotores adequados úteis em células bacteria

nas incluem aqueles obtidos do óperon Iac de E colr, gene de alfa amilase de Bacillus IiCheniformis (amyL), gene de amilase de B. stearothermophilus (amyM); genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, o gene de beta-lactamase e o promotor tac.

Ein uma modalidade, o promotor é um que é nativo à célula

hospedeira. Fjor exemplo, quando T. reesei é o hospedeiro, o promotor é um promotor nativo de T. reesei. Em outra modalidade, o promotor é um que é heterólogo à célula hospedeira fúngica. Em algumas modalidades, o promotor será um promotor de glucoamilase precursora, tal como o promotor de TrGA.

Em algumas modalidades, o constructo de DNA inclui ácidos nucleicos que codificam uma sequência sinalizadora que é uma sequência de aminoácido ligada ao amino término do polipeptídeo o qual dirige o polipeptídeo codificado à via secretória da célula. A extremidade 5' da sequência de codificação da sequência de ácido nucleico pode incluir naturalmente

uma região c ligada em red

e codificação de peptídeo sinalizador a qual é naturalmente e de leitura de tradução com o segmento da sequência de co10

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30

dificação de glucoamilase o qual codifica a glucoamilase secretada ou a ex

tremidade 5' pode incluir u

da sequência de codificação da sequência de ácido nucleico m peptídeo sinalizador qual é estranho à sequência de codificação. Em algumas modalidades, o constructo de DNA inclui uma sequência sinalizadora que está naturalmente associada a um gene de glucoamilase qual uma glucoamilase variante foi obtida. Em algumas modauência sinalizadora será a sequência representada em SEQ ID

precursora dc lidades, a seq

NO: 1 ou uma sequência tendo pelo menos 90%, pelo menos 94% e pelo menos 98% de identidade de sequência à mesma. Seqüências sinalizadoras eficazes podem incluir as seqüências sinalizadoras obtidas de glucoamilases de outras enzimas fúngicas filamentosas, tal como de Trichoderma (glucoamilase de T. reesei), Humicola (celulase de H. insolens ou glucoamilase de H. grisea), Aspergillus (glucoamilase de A. niger e amilase TAKA de A. oryzae) e Rhizopus.

Em modalidades adicionais, um constructo de DNA ou vetor compreendendo uma sequência sinalizadora e uma sequência promotora a ser introduzido em uma célula hospedeira é derivado da mesma fonte. Em algumas modalidades, a sequência sinalizadora da glucoamilase nativa de um homólogo de glucoamilase de Trichoderma, tal como uma sequência

sinalizadora c E

uma sequência de término. Qualquer sequência terminadora funcional na

célula hospec

mesma fonte célula hosped nadoras obtic niger ou A. a

e uma cepa de Hypocrea, pode ser usada.

τι algumas modalidades, o vetor de expressão também inclui

eira pode ser usada na presente invenção. Em uma modalida

de, a sequência de término e a sequência promotora são derivadas da

Em outra modalidade, a sequência de término é homóloga à eira. Seqüências terminadoras úteis incluem seqüências termias dos genes cbhl de Trichoderma reesei;glucoamilase de A. vamori (Nunberg e outros (1984) supra e Boel e outros (1984) supra), sintase de antranilato de Aspergillus nidulans, amilase TAKA de Aspergillus oryzae ou trpC de A. nidulans (Punt e outros (1987) Gene 56: 117- 124).

Ern algumas modalidades, um vetor de expressão inclui um 10

15

20

25

30

marca dor selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles os quais conferem resistência antimicrobiana (por exemplo, higromicina e fleomicina). Marcadores seletivos nutricionais também encontram uso na presente invenção, incluindo aqueles marcadores conhecidos na técnica como amdS (acetamidase), argB (carbamoil transferase de ornitina) e pyrG (decarboxilase de orotidina-5'-fosfato). Marcadores úteis em sistemas de vetor para trJnsformação de Trichoderma são conhecidos na técnica (vide, por exemplo] Finkelstein, capítulo 6 em Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelçtein e outros Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992); Kinghorn e cjutros (1992) Applied Molecular Genetics OF Filamentous Fungi, Blackik Academic and Professional, Chapman and Hall, Londres; Berges e Barleau (1991) Curr. Genet. 19: 359 - 365; e van Hartingsveldt e outros (1987) Mol. Gen. Genet. 206: 71 - 75). Em uma modalidade preferida, o marcador seletivo é o gene amdS, o qual codifica a enzima acetamidase, que permite que as células transformadas cresçam sobre acetamida como uma fonte de nitrogênio. O uso do gene amdS de A. nidulans como um marcador seletivo é descrito em Kelley e outros (1985) EMBO J. 4: 475 - 479 e Penttilla e outros (1987) Gene 61: 155-164.

étodos usados para ligar o constructo de DNA compreendendo ia de ácido nucleico que codifica uma glucoamilase variante, um terminador e outras seqüências e inserir o mesmo em um

M

uma sequenc um promotor,

vetor adequado são bem-conhecidos na técnica. A ligação é, em geral, realizada através de ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, ί Iigantes de oligonucleotídeo sintético são usados de acordo com a prática convencional (vide Sambrook (1989) supra e Bennett e Lasure, More Geme Manipulations IN Fungi, Academic Press, San Diego (1991) páginas 70 - 76). Adicionalmente, vetores podem ser construídos usando técnicas de recombinação conhecidas (por exemplo, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).

Células Hospedeiras:

presente invenção também refere-se à células hospedeiras compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma glucoamilase variante da invenção, as quais são usadas para produzir as glucoamilases da invenção. Em algumas modalidades preferidas, as células hospedeiras são selecionadas de células bacterianas, fúngicas, de planta e levedo. O termo célula hospedeira inclui as células, prole das células e protoplastos criados a 5 partir das células as quais são usadas para produzir uma glucoamilase variante de acordo com a invenção.

Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células fúngicas e, de preferência, células hospedeiras fúngicas filamentosas. O termo "fungo filamentoso" refere-se a todas as formas filamentosas da sub10 divisão Eumycotina (vide Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York). Esses fungos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede celular composta de quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos da presente invenção são morfológica, fisiológica e geneticamente distinto de levedos. Crescimen15 to vegetativo pelo fungo filamentoso é através de alongamento hifal e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Na presente invenção, a célula precursora fúngica filamentosa pode ser uma célula de uma espécie de, mas não limitado a, Trichoderma (por exemplo, Trichoderma reesei, o morfo assexual de Hypocrea jecorina, previamente classificado como T. Ion20 gibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs e outros (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46 - 53; ATCC No. 56765 e ATCC No. 26921); Penicillium sp., Humicola sp. (por exemplo, H. insolens, H. Ianuginosa e H. grisea);Chrysosporium sp. (por exemplo, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por exemplo, A. 25 oryzae, A. niger, A. sojae, A. japonicus, A. nidulans e A. awamori) (Ward e outros (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 738 - 743 e Goedegebuur e outros (2002) Genet 41: 89 -98), Fusarium sp. (por exemplo, F. roseum, F. graminum F. cerealis, F. oxysporuim e F. venenatum), Neurospora sp. (N. crassa), Hypocrea sp., Mucorsp., (M. miehei),, Rhizopus sp. e Emericella sp. 30 (Vide também Innis e outros (1985) Sei. 228: 21 -26). O termo ''Trichoderma" ou "Trichoderma sp." ou "Trichoderma spp." refere-se a qualquer gênero fúngico prévia ou atualmente classificado como Trichoderma. Em algumas modalidades, as células hospedeiras serão células bacterianas gram-positivas. Exemplos não Iimitativos incluem cepas de Streptomyces, j(por exemplo, S. lividans, S. coelicolor e S. griseus) e Bacillus. Conforme usado aqui, o "gênero Bacillus" inclui todas as espécies dentro do 5 gênero "Bacillus", conforme conhecido por aqueles versados na técnica incluindo, mas não limitado a, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. Iautus e B. thuringiensis. É reconhecido que o gênero Bacillus continua a sofrer reorganiza10 ção taxonômiça. Assim, se pretende que o gênero inclua espécies que foram reclassificadas incluindo, mas não limitado a, organismos tal como B. stearothermophilus, o qual é agora denominado "Geobacillus stearothermophilus".

Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma cepa bacteriana gram-negativa, tal como E. coli ou Pseudomonas sp. Em outras modalidades, as! células hospedeiras podem ser células de levedo, tais como

Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Piehia sp. ou Candida sp.

i

Em outras modalidades, a célula hospedeira será uma célula hospedeira geneticamente manipulada em que os genes nativos foram inativados, por exLmplo, através de deleção em células bacterianas ou fúngicas. 20 Em que é desejado obter uma célula hospedeira fúngica tendo um ou mais genes inativados, métodos conhecidos podem ser obtidos (por exemplo, métodos divulgajios na Patente U.S. No. 5.246.853, Patente U.S. No. 5.475.101 e WO 92/06209). Inativação gênica pode ser realizada através de deleção completa ou parcial, através de inativação insercional ou através de qualquer 25 outro meio o qual torna um gene não funcional para sua finalidade pretendida (de modo que o gene seja impedido de expressão de uma proteína funcional). Em algumas modalidades preferidas, quando a célula hospedeira é uma célula de Trichoderma e particularmente uma célula hospedeira de T. reesei, os genes cbhl, cbh2, egl1 e egl2 serão inativados e, de preferência, 30 deletados. Células hospedeiras de Trichoderma reesei particularmente preferidas tendo proteínas quad-deletadas são apresentadas e descritas na USP 5.847.276 e WO 05/001036. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma cepa sémprotease ou protease-deficiente. Transformação de células hospedeiras:·

A introdução de um constructo de DNA ou vetor em uma célula hospedeira inclui técnicas tais como transformação; eletroporação; microin5 jeção nuclear; transdução; transfecção (por exemplo, lipofecção mediada e transfecção mediada por DEAE-Dextrina); incubação com fosfato de cálcio, precipitação cie DNA; bombardeamento em alta velocidade com microprojéteis revestidos de DNA; e fusão de protoplasta. Métodos de transformação geral são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ausubel e outros 10 (1987), supra, capítulo 9; e Sambrook (1989) supra e Campbell e outros (1989) Curr. Genet. 16: 53-56). *

Métodos de transformação para Bacillus são divulgados em numerosas referências, incluindo AnagnostoDoulos Ce J. Spizizen (1961) J. Bacteriol. 81: 741 - 746 e WO 02/14490.

Métodos de transformação para Aspergillus são descritos em

Yelton e outros (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470 - 1474; Berka e outros (1991) em Applications of· Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly é Baldwin, Plenum Press (NY); Cao e outros (2000) Sei. 9: 991 - 1001; Campbell e outros (1989) Curr. Genet. 16: 53-56 e EP 238 023. A expressão de uma 20 proteína heteróloga em Trichoderma é descrita na USP 6.022.725; USP 6.268.328; Harkki e outros (1991); Enzyme Microb. Technol., 13: 227-233; Harkki e outrds (1989) Bio Technoi 7) 596-603; EP 244.234; EP 215.594; e Nevalainen e outros, "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", em 25 Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 - 148). Reférência também é feita ao W096/00787 e Bajar e outroL (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 8202 - 28212 para transformação dè cepas de Fusarium. '

Em uma modalidade específica, 0 preparo de Trichoderma sp. para transformação envolve o preparo de protoplastas a partir de micélio fúngico (vide Campbell e outros (1989) Curr. Genet. 16: 53-56; Pentilla e outros (1987) Gene 61: 155 -164). Transformação Agrobacterium tumefaciensmediada de fungos filamentosos é conhecida (vide de Groot e outros (1998) Nat. Biotechnol. 16: 839 - 842). Referência também é feita à USP 6.022.725 e USP 6.268.328 para procedimentos de transformação usados com hospedeiros fúngicos filamentosos.

5 De preferência, transformantes geneticamente estáveis são

construídos com sistemas de vetor pelos quais o ácido nucleico que codifica a glucoamilase variante é estavelmente integrada no cromossoma de uma cepa hospedeira. Transformantes são, então, purificados através de técnicas conhecidas.

Em algumas outras modalidades, as células hospedeiras são

células de planta, tais como células de uma planta monocot (por exemplo, milho, trigo e sorgo) ou células de uma planta dicot (por exemplo, soja). Métodos para fazer constructos de DNA úteis em transformação de plantas e métodos para a transformação de plantas são conhecidos. Alguns desses 15 métodos incluem transferência de gene Agrobacterium tumefaciensmediada; bombardeamento de microprojétil, transformação PEG-mediada de protoplastas, eletroporação e similares. Referência é feita à USP 6.803.499, USP 6.777.589; Fromm e outros (1990) Biotechnol. 8: 833-839; Potrykus e outros (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 169-177.

Produção de proteínas:

A presente invenção ainda refere-se a métodos de produção das glucoamilases variantes compreendendo transformação de uma célula hospedeira com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma glucoamilase variante de acordo com a invenção, opcionalmen25 te cultura da célula hospedeira sob condições adequadas para a produção da glucoamilase variante e opcionalmente recuperação da glucoamilase.

Nos métodos de expressão e produção da presente invenção, as células hospedeiras são cultivadas sob condições adequadas em cultura em frasco de agitação, fermentações em pequena escala ou larga escala (inclu30 indo fermentações contínua, em batelada e alimentada em batelada) em fermentadores de laboratório ou industriais, com meio adequado contendo sais fisiológicos e nutrientes (vide, por exemplo, Pourquie, J. e outros, BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. e outros, Academic Press, páginas 71-86, 1988 e llmen, M. e outros (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306). Meios comuns comercialmente preparados (por exemplo, caldo de Extrato de Malte de Levedo 5 (YM), caldo de Luria Bertani (LB) e caldo de Dextrose de Sabouraud (SD)) encontram uso na presente invenção. Condições de cultura preferidas para células fúngicas bacterianas e filamentosas são conhecidas na técnica e podem ser encontradas na literatura científica e/ou da fonte dos fungos, tal como a American Type Culture Collection e Fungai Genetics Stock Center. Em 10 casos onde uma sequência de codificação de glucoamilase está sob o controle de um promotor induzível, o agente de indução (por exemplo, um açúcar, sal de metal ou antimicrobiano) é adicionado ao meio em uma concentração eficaz para induzir à expressão da glucoamilase.

Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a mé15 todos de produção da glucoamilase variante compreendendo cultura de uma planta ou célula de planta compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma glucoamilase variante de acordo com a invenção sob condições adequadas para a produção da variante e, opcionalmente, recuperação da glucoamilase.

Em algumas modalidades, de forma a avaliar a expressão de

uma glucoamilase variante por uma linhagem de célula que foi transformada com um polinucleotídeo que codifica a glucoamilase variante abrangida pela invenção, ensaios são realizados a nível de proteína, a nível de RNA e/ou através do uso de bioensaios funcionais particulares à atividade e/ou produ25 ção de glucoamilase. Alguns desses ensaios incluem Northern blotting, dot blotting (análise de DNA ou RNA), RT-PCR (reação em cadeia de polimerase com transcriptase reversa) ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente rotulada (baseado na sequência de codificação de ácido nucleico) e Southern blotting e auto-radiografia convencionais.

Além disso, a produção e/ou expressão de uma glucoamilase

variante pode ser medida em uma amostra diretamente, por exemplo, através de ensaios que medem diretamente açúcares de redução, tal como gli10

15

20

25

30

exemplo, atra usados para glucoamilase

cose, no meio de cultura e através de ensaios para medição da atividade, expressão e/ou produção de glucoamilase. Em particular, a atividade de glucoamilase pede ser ensaiada através do método com ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (vide Goto e outros (1994) Biosci. Biotechnol. Biochem. 58: 49 - 54). Em modalidades adicionais, a expressão da proteína é avaliada através de métodos imunológicos, tal como coloração imunohistoquímica de células, seções teciduais ou imunoensaio do meio de cultura tecidual (por avés de Western blot ou ELISA). Tais imunoensaios podem ser avaliar, qualitativa e quantitativamente, a expressão de uma . Os detalhes de tais métodos são conhecidos por aqueles versados na técnica e muitos reagentes para a prática de tais métodos estão comercialmente disponíveis.

As glucoamilases da presente invenção podem ser recuperadas ou purificadas do meio de cultura através de uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo centrifugação, filtração, extração, precipitação e similares.

Composições:

As glucoamilase variantes podem ser usadas em composições enzimáticas incluindo, mas não limitado a, composições para hidrólise e sacarificação de amido, composições de limpeza e detergentes (por exemplo, detergentes para a lavagem de roupas, detergentes para a lavagem de louça e composições de limpeza para superfícies rígidas), composições para fermentação de j álcool e em composições de ração para animais. Ainda, as glucoamilaseç variantes podem ser usadas em aplicações de cozinha, tal como produção de pão e bolo, fermentação, cuidados com a saúde, têxtil,

processos de conversão de resíduos ambientais, processamento de biopolpa e aplicações de conversão de biomassa.

Em algumas modalidades, uma composição enzimática incluindo uma glucoamilase variante abrangida pela invenção obtida no meio de cultura ou recuperada e purificada do meio de cultura será opcionalmente usada em combinação com qualquer uma ou uma combinação das seguintes enzimas - alfa Jmilases, proteases, pululanases, isoamilases, celulases, hemicelulases, xilanases, glicotransferases de ciclodextrina, lipases, fitases, Iacases, oxidases, esterases, cutinases, xilanases, enzimas de hidrólise de amido granulares e outras glucoamilases. Em uma modalidade, as proteases são proteases fúngicas ácidas (AFP). Em uma outra modalidade, as protea5 ses fúngicas ácidas são de (por exemplo, NSP-24, vide também US 2006/015342, publicada em 13/7/2006, SEQ ID NO: 10, incorporada por referência). Em uma outra modalidade, a fitase é de Buttiaiuiella spp. (por exemplo, BP-17, vide também variantes divulgadas na publicação de patente PCT WO 2006/043178).

Em algumas composições particularmente preferidas, as gluco

amilases variantes da invenção serão combinadas com uma alfa amilase, tal como alfa amilases fúngicas (por exemplo, Aspergillus sp.) ou alfa amilases bacterianas (por exemplo, Bacillus sp., tal como B. stearothermophilus, B. amyloliquefaciens e B. licheniformis) e variantes e híbridos das mesmas. Em 15 uma modalidade, a alfa amilase é uma alfa amilase estável ao ácido. Em uma modalidade, a alfa amilase é uma enzima de hidrólise de amido granuIar (GSHE). Em uma modalidade, a alfa amilase é alfa amilase de Aspergillus kawachi (AKAA), vide US 7.037.704. Alfa amilases comercialmente disponíveis consideradas para uso nas composições da invenção são conheci20 das e incluem GZYME G997, SPEZYME FRED, SPEZYME XTRA1 STARGEN (Danisco US1 Inc., Genencor Division), TERMAMYL 120-L e SUPRA (Novozymes, Biotech.) e VIRIDIUM (Diversa).

Em outras modalidades preferidas, as glucoamilases variantes da invenção podem ser combinadas com outras glucoamilases. Em algumas 25 modalidades, as glucoamilases da invenção serão combinadas com uma ou mais glucoamilases derivadas de cepas de Aspergillus ou variantes das mesmas, tais como A. oryzae, A. niger, A. kawachi e A. awamori; glucoamilases derivadas de cepas de Humicola ou variantes das mesmas, particularmente H. grisea, tal como a glucoamilase tendo pelo menos 90%, 93%, 30 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 3 divulgada no WO 05/052148; glucoamilases derivadas de cepas de Talaromyces ou variantes das mesmas, particularmente T. emersonii; glucoamiIases derivadas de cepas de Athelia e, particularmente, A. rolfsii; glucoamilases derivadas de cepas de Penicillium, particularmente P. chrysogenum. Usos:

Eh particular, as glucoamilases variantes podem ser usadas para processos de conversão de amido e, particularmente, na produção de

10

25

30

dextrose para cool e outros aminoácidos)

xaropes de frutose, açúcares especiais e na produção de álprodutos finais (por exemplo, ácido orgânico, ácido ascórbico e a partir da fermentação de substratos contendo amido (G.M.A van Beynum e outros, Eds. (1985) Starch Conversion Technology, Marcel Dekker Inc. NY). Dextrinas produzidas usando composições de glucoamilase variante da invenção podem resultar em rendimentos de glicose de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% e pelo menos 95%. A produção de álcool a partir da fermentação de substratos de amido usando glucoamilases abrangidas pela invenção pode incluir a produção de álcool combustível ou álcool portátil. Em algumas modalidades, a produção de álcool será maior quandò a glucoamilase variante é usada sob as mesmas condições que a glucoarnilase precursora. Em algumas modalidades, a produção de álcool estará entre cerca de 0,5% e 2,5% no máximo incluindo, mas não limitado a, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3% e 2,4% mais álcool do que a glucoamilase precursora.

Em uma modalidade preferida, as glucoamilases variantes da invenção encontrarão uso na hidrólise de amido de vários substratos baseados em planta, os quais são usados para a produção de álcool. Em algumas

modalidades trigo, cevada

preferidas, os substratos baseados em planta incluirão milho, centeio, mucilagem, arroz, cana-de-açúcar, batata e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o substrato baseado em planta será material vegetal fracionado, por exemplo, um grão de cereal, tal como milho, o qual é fracionado em componentes tais como fibra, germe, proteína e amido! (endosperma) (USP 6.254.914 e USP 6.899.910). Métodos de i

fermentação de álcool são descritos em The Alcohol Textbook, A Reference ForThe Beverage, FuelAND Industrial Alcohol Industries, 3a Ed., 20

25

30

Eds Κ.A. Jacques e outros, 1999, Nottingham University Press, Reino Unido. Em determinadas modalidades preferidas, o álcool será etanol. Em particular, processos de produção por fermentação de álcool são caracterizados como processos de trituração a úmido ou trituração a seco. Em algumas 5 modalidades, a glucoamilase variante será usada em um processo de fermentação por trituração a úmido e, em outras modalidades, a glucoamilase í

variante encontrará uso em um processo de trituração a seco.

A trituração a seco do grão envolve uma série de etapas básicas, as quais geralmente incluem: trituração, cozimento, liquefação, sacarifi10 cação, fermentação e separação de líquidos e sólidos para produzir álcool e outros coprodutos. Material vegetal e, particularmente, grãos de cereal integrais, tais como milho, trigo ou centeio, são triturados. Em alguns casos, o grão pode serí primeiro fracionado em partes componentes. O material vegetal triturado póde ser moído para obter uma partícula espessa ou fina. O ma15 terial vegetal triturado é misturado com líquido (por exemplo, água e/ou vinhaça fina) em um tanque de transformação em pasta. A pasta é submetida

à altas tempe

raturas (por exemplo, 90 0C a 150 0C ou maior) em um forno a

jato junto com enzimas de liquefação (por exemplo, alfa amilases) para solubilizar e hidro isar o amido no grão em dextrinas. A mistura é esfriada e ainda tratada com enzimas de sacarificação, tais como glucoamilases abrangidas pela presjente invenção, para produzir glicose. A massa contendo glicose pode, então, ser fermentada durante aproximadamente 24 a 120 horas na presença de micro-organismos de fermentação, tais como micro-organismos que produzem etanol e, particularmente, Ievedo (Saccharomyces spp). Os sólidos na massa são separados da fase líquida e álcool, tal como etanol e outros coprodutos úteis, tais como grãos de destilaria, são obtidos.

eL

Em algumas modalidades, a etapa de sacarificação e a etapa de fermentação são combinadas e o processo é referido como sacarificação e fermentação simultânea ou sacarificação, propagação de Ievedo e fermentação simultâneas.

Em outras modalidades, a glucoamilase variante é usada em um processo para hidrólise de amido, em que a temperatura do processo está 15

20

25

30

entre 30 0C e 75 0C e também em uma temperatura de entre 40 0C e 65 0C

em uma faixa de pH de entre um pH de 3,0 e um pH de 6,5. Os processos

í

de fermentação, em algumas modalidades, incluem trituração de um grão de cereal ou grãb fracionado e combinação do grão de cereal triturado com Ii5 quido para fojrnar uma pasta a qual é, então, misturada em um único vaso com uma gluçoamilase variante de acordo com a invenção e, opcionalmente, outras enzimas tais como, mas não limitado a, alfa amilases, outras glucoamilases, fitases, proteases, pululanases, isoamilases ou outras enzimas tendo atividade de hidrólise de amido granular e Ievedo para produzir etanol e 10 outros coprodutos (USP 4.514.496, WO 04/081193 e WO 04/080923).

Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um método de sacarificação de uma solução de amido líquida, o qual compreende uma etapa de sacarificação enzimática usando uma gluçoamilase variante da invenção.

A presente invenção também proporciona uma ração para animal compreendendo pelo menos uma gluçoamilase variante abrangida pela invenção. Métodos de uso de uma enzima gluçoamilase na produção de rações compreendendo amido são fornecidos no WO 03/049550, depositado em 13 de Dezembro de 2002 (aqui incorporado por referência em sua totalidade). Resumidamente, a variante de gluçoamilase é misturada com uma ração compreendendo amido. A gluçoamilase é capaz de degradar o amido resistente para uso pelo animal.

Optros objetivos e vantagens da presente invenção são evidentes a partir da presente Especificação.

EXPERIMENTAL

Na descrição e seção experimental a qual segue, as seguintes abreviações ge aplicam: GA (gluçoamilase); GAU (unidade de gluçoamilase); % em peso (percentual em peso); 0C (graus Centígrados); rpm (revoluções por minuto); H2O (água); dH20 (água desionizada); dlH20 (água desionizada, filtração Milli-Q); aa ou AA (aminoácido); bp (par de base); kb (par de quilobase); kD (quilodaltons); g ou gm (gramas); μg (microgramas); mg (miligramas); μι. (tnicrolitros); ml e mL (mililitros); mm (milímetro); μίτι (micrôme10

15

20

25

sa/volume); e rídeos); DP2

tro); M (molar); mM (milimolar); μΜ (micromolar); U (unidades); V (volts); MW (peso molecu ar); seg(s) ou s(s) (segundo/segundos); min(s) ou m(s) (minuto/minutos); hr(s) ou h(s) (hora/horas); DO (oxigênio dissolvido); ABS (Absorbância); EtOH (etanol); PSS (solução salina fisiológica); m/v (masMTP (lâmina de microtitulação); N (Normal); DP1 (monossaca(dissacarídeos); DP>3 (oligossacarídeos, açúcares tendo um grau de polimsrização maior do que 3); ppm (partes por milhão).

Op métodos usados para proporcionar as variantes são descritos abaixo. Contudo, deve ser notado que diferentes métodos podem ser usados para proporcionar as variantes de uma molécula precursora e a invenção

não está limitada aos métodos usados nos exemplos. Pretende-se que qual

i

quer meio adequado para fazer variantes e classificação de variantes possa ser usado.

Ensaio de atividade de gluçoamilase pNPG para lâminas de microtitulacão com 96 Javidades:

As soluções de reagente foram: tampão de NaAc: tampão de acetato de sódio a 200 mM, pH de 4,5; substrato: p-nitrofenil-a-D

glicopiranosíd e solução de de sobrenada 96 cavidades

eo (Sigma N-1377) a 50 mM em tampão de NaAc (0,3 g/20 ml) término: tampão de glicina-NaOH a 800 mM, pH de 10. 30 μΙ nte filtrado foram colocados em uma MTP de fundo plano com nova. A cada cavidade, 50 μΙ de tampão de NaAc e 120 μΙ de substrato foram adicionados e incubados durante 30 minutos a 50°C (Thermolab Systerrjis iEMS Incubator/shaker HT). A reação foi terminada através da adição de 100 μΙ de solução de término. A absorbância foi medida a 405 nm em um leitor para MTP (Molecular Devices Spectramax 384 plus) e a atividade foi calculada usando um coeficiente de extinção molar de 0,011

I

μΜ/cm.

Ensaio de estabilidade térmica:

Sobrenadante bruto (100 ul) foi adicionado a 100 μΙ de tampão de NaAc a 50 mM, pH de 4,5. A amostra foi igualmente dividida sobre 2 MTP. Uma MTP (lâmina inicial) foi incubada durante 1 hora a 4 0C e a outra MTP (lâmina residual) foi incubada a 60 0C (Thermolab Systems iEMS Incu10

bator/Shaker HT) durante 1 hora. A lâmina residual foi rapidamente esfriada durante 15 min sobre gelo. A atividade é medida usando o ensaio de aplicação de etanol descrito abaixo, com a seguinte modificação: a quantidade de amostra tomJda para o ensaio de termoestabilidade é de 25 μΙ e a quantidade de tampão de NaAc a 30 mM, pH de 4,0, é de 35 μΙ.

A termoestabilidade é calculada como atividade residual % como

segue:

ABS (340) residual - placebo x 100 ABS (340) inicial - placebo

O material sobrenadante bruto é testado com relação à glicose restante no meio de cultura após o período de crescimento. Se glicose restante é encontrada, o valor de absorbância é subtraído dos valores de absorbância meclidos da atividade inicial, bem como a atividade residual.

Ensaio de Bradford para quantificação de proteína em lâminas de mi

20

25

30

crotitulacão com 96 cavidades:

A solução reagente era solução de trabalho Bradford Quickstart (BioRad cat#500-0205). 100 μΙ de sobrenadante filtrado a 10 kD foram colocados em urJa lâmina de fundo plano com 96 cavidades. A cada cavidade, 200 μΙ de reagente foram adicionados e incubados durante 5 minutos em temperatura ambiente. A absorbância foi medida a 595 nm em um leitor para

MTP (Molecular Devices Spectramax 384 plus). As concentrações de proteí

í

na foram calculadas de acordo com uma curva padrão de Albumina de Soro Bovino (BSA) (0-50 μg/ml).

Ensaio de atividade de hexoquínase:

Cpquetel de hexoquínase: 10 a 15 minutos antes de uso, 90 ml de água foram adicionados a um recipiente BoatIL de glicose HK R1 (kit de teste de glicoke IL (HK), Instrument Laboratory n° 182507-40) e gentilmente misturados. 8β μΙ de coquetel de hexoquínase foram adicionados a 100 μΙ de

I

dH20. 15 μΙ de amostra foram adicionados às misturas e incubados durante mins no esciuro em temperatura ambiente. A absorbância foi lida a 340 nm

em um leitor

para MTP. As concentrações de glicose foram calculadas de

acordo com uma curva padrão de glicose (0 a 1 mg/ml). 10

15

20

25

30

Condições do ensaio de aplicação de etanol:

Solução de estoque a 8%: 8 g de amido de milho solúvel (Sigma #S4180) foraijn suspensos em 40 ml de dH20 em temperatura ambiente. 50 ml de dH20 epn ebulição foram adicionados à pasta em um frasco de 250 ml e cozidos durante 5 min. A solução de amido foi esfriada para 25°C e o volume ajustado para 100 ml com dH20.

Splução de término: tampão de glicina-NaOH a 800 mM, pH de

10,0. I

Solução de trabalho de amido solúvel a 4% (p/v): solução de estoque foi diluída (1:1) com tampão de acetato de sódio a 100 mM, pH de 4,0.

50 μΙ de tampão de NaAc a 30 mM, pH de 4,0, foram colocados

em uma lâmina de fundo plano com 96 cavidades. A cada cavidade, 120 μΙ

!

de amido de rhnilho solúvel a 4% e 10 μΙ de sobrenadante filtrado a 10 kD foram adicionados e incubados durante 2 horas a 32°C, 900 rpm (ThermoIabsystems iEMS Incubator/Shaker HT). A reação foi cessada através da adição de 90 μΙ de solução de término gelada a 4 °C. A amostra foi colocada

sobre gelo. O 6K15) e 15 μ

amido foi centrifugado a 716 xg a 15°C durante 5 min (SIGMA de sobrenadante foram usados no ensaio de atividade de hexoquínase descrito acima para determinar o teor de glicose.

Condições de ensaio de aplicação de adoçante:

Solução de estoque a 8%: 8 g de amido solúvel (Sigma #S4180) foram suspensos em 40 ml de água em temperatura ambiente. 50 ml de dH20 em ebulição foram adicionados à pasta em um frasco de 250 ml e comins. A solução de amido foi esfriada para 25°C e o volume 100 ml com dH20.

zidos durante ajustado para

Solução de término: tampao de glicina-NaOH a 800 mM, pH de

10,0.

Solução de trabalho de amido solúvel a 4% (p/v): solução de estoque foi diluída (1:1) com tampão de acetato de sódio a 100 mM, pH de 4,5.

50 μΙ de tampão de NaAc a 80 mM, pH de 4,5, foram colocados em uma lâmina de fundo plano com 96 cavidades. A cada cavidade, 120 μΙ de amido de milho solúvel a 4% e 5 μΙ de sobrenadante filtrado a 10 kD foram adicionados e incubados durante 1 hora a 60 °C. A reação foi cessada através da aclição de 90 μΙ de solução de término gelada a 4 °C. A amostra foi colocada slobre gelo durante 30 mins. O amido foi centrifugado a 716 rpm

a 15°C durante 5 mins (SIGMA 6K15, centrífuga) e 15 μΙ de sobrenadante

i

foram usados no ensaio de atividade de hexoquínase descrito aqui para determinar o teo|r de glicose.

EXEMPLOS

O^ exemplos a seguir são fornecidos de forma a demonstrar e ilustrar adiciojialmente determinadas modalidades e aspectos preferidos da invenção e não devem ser construídos como limitando o escopo da mesma. Exemplo 1: Construção do vetor pREP3Y-TrGA

O cassete de expressão de TrGA composto da seqüência de DNA (SEQ ID NO: 4) que codifica o peptídeo sinalizador de TrGA1 a prósequência e a proteína madura, incluindo o domínio catalítico, região Iigante 15 e domínio de ligação a amido, foi clonado no pDONR®201, um vetor de Entrada Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O cassete de expressão de TrGA foi clonado no vetor de destino compatível Gateway pREP3Y-DEST (Fig 3) através da reação de recombinação Gateway® LR.

O vetor de expressão pRep3Y-TrGA (figura 3B) permitiu a expressão da proteína de TrGA (SEQ ID NO: 2) em Schizosaccharomyces pombe.

Sèssenta e cinco bibliotecas de mutagênese sítio-saturada de

I

TrGA (SSM) foram construídas usando o vetor de entrada pDONR-TrGA (Fig 2) como uma [padrão e os iniciadores listados na tabela 2. Os iniciadores de mutagênese úsados nos experimentos contêm o código de seqüência de DNA triplo NfjlS (N = A, C, T, G e S = C ou G) na posição que corresponde ao códon da éequência de TrGA a sofrer mutação (SEQ ID NO: 2) e iniciou a

incorporaçao biblioteca de ciador de mu

aleatória de nucleotídeos nessa posição. Construção de cada SSM começou com duas amplificações por PCR usando o iniagênese (pDONR201 - FW) dianteiro específico para Gateway (tabela 3) e J iniciador reverso para Gateway (pDONR201 - RV) iniciador e um iniciador de mutagênese dianteiro específico (tabela 2) (posições iguais para os iniciadores de mutagênese). DNA polimerase Phusion High Fidelity (Finnzymes ÒY, Espoo, Finlândia) foi usada para amplificação por PCR (iniciadores a 0J2 μΜ, 25 ciclos) de acordo com o protocolo fornecido pela

I

Finnzymes. Resumidamente, 1 μΙ de fragmento de DNA (SEQ ID NO: 1) de ambas as misturas de PCR específicas, objetivados ao mesmo códon, foi adicionado a 48 μΙ de solução de reação de PCR fresca junto com os iniciadores Gateway FW e Gateway RV (Invitrogen) e misturados. Essa amplificação por PCR de fusão (22 ciclos) resultou em um fragmento de DNA de cassete linear com um códon de TrGA com mutação aleatória e sítios de recombinação Gateway únicos sobre ambas as extremidades. Purificação desse fragmento de DNA (ChargeSwitch® PCR Clean-up, Invitrogen, Carlsbad EUA) e uma reação de recombinação BP (Invitrogen, Carlsbad, EUA) com pDONR201 (Invitrogen) gerou DNA multimérico circular (vetor de entrada) que foi subsequentemente transformado em E. coli Max Efficiency DH5a (Invitrogen) e colocado sobre 2x meio TY [16 g/L de Triptona Bacto (Difco), g/L de Extrato de Levedo Bacto (Difco), 5 g/L de NaCI] suplementado com 50 μg/mL de canamicina.

tabela 2 - Iniciadores dianteiros usados para gerar bibliotecas SSM de

TrGA

Iniciador Seq

D4F

F5F

I12F

D24F

F29F

I43F

D44F

P45F

D46F

Y47F

uência de DNA 5' para 3'

pDONR TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC 201-FW

TCTGTTGACNNSTTCATCAGCACCGAGACGC T CT GTT GACGAC N NSAT CAGCACCGAGACGCCTA ATCAGCACCGAGACGCCTNNSGCACTGAACAATCTTCTTT CTTTGCAATGTTGGTCCTNNSGGATGCCGTGCATTCGGCA

:íc

CCTGATGGATGCCGTGCANNSGGCACAT

CAGCTGGTGCGG

ATTGCAT CT CCCAGCACAN NSG ACCCGGACTACT ATTACA GCATCTCCCAGCACAATTNNSCCGGACTACTATTACATGT

TC

CC

CCC AGCACAATT GAC N NSGACTACTATTACAT GT GGA :AGCACAATTGACCCGNNSTACTATTACATGTGGACGC

AGCACAATT G ACCCGGACN NSTATTACAT GTGGACGCG AG

SEQ ID NO:

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20 Iniciador

Y49F

W51F

Y70F

Q75F

R76F

P 94IF

D100F

K114F

F116F

N119F

R122F

R125F

N146F

Q148F

Y169F

Q172F

F175F

W178F

E180F

V181F

Q208F

S211F

W228F

N242F

E243F

R245F

Seqüência de DNA 5’ para 3’ SEQ ID

NO:

ATTGACCCGGACTACTATNNSATGTGGACGCGAGATAGCG 21

CCGGACTACTATTACAT G NNSACGCGAGATAGCGCT CTT G 22

GACCGCTT CACCGAAACG NNSGATGCGGGCCT G- 23

CAGCGCC

I

ACGTACGATGCGGGCCTGNNSCGCCGCATCGAGCAGTA- 24 CA

TACGATGCGGGCCTGCAGNNSCGCATCGAGCAGTACAT- 25 TA

CTCCAGGGCCTCTCTAACNNSTCGGGCTCCCTCGCG- 26

GACG

CCCTCGGGCTCCCTCGCGNNSGGCTCTGGTCTCGGC- 27

GAGC

I

AAGTTT GAGTT GACCCT G NNSCCTTT CACCGGCAACTGGG 28

GAGTTGACCCTGAAGCCTNNSACCGGCAACTGGGGTC- 29 GAC

CT GAAGCCTTT CACCGGCN NST GGGGTCGACCG- 30

CAGCGGG

ttcÍaccggcaactggggtnnsccgcagcgggatggcc- 31

CAG

I

AACTGGGGTCGACCGCAGNNSGATGGCCCAGCTCTGC- 32 GAG

AACjTGGCT CAT CAACAAC N NSTAT CAGT CG ACTGT GTCCA 33 CT CAT CAACAACAACTATN NST CGACT GT GT CC AACGT CA 34

CTCAACTATGTTGCCCAGNNSTGGAACCAAACCGGCTTTG 35

i

GTf GCCCAGTACTGGAACNNSACCGGCTTT GACCT CT GGG 36

T ACT GGAACCAAACCGGCN NSGACCT CT GGGAAGAAGT - 37 CA

CAÁACCGGCTTTGACCTCNNSGAAGAAGTCAATGGGAGCT 38

GGCTTTGACCTCTGGGAANNSGTCAATGGGAGCTCATTCT 39

TTTGACCTCTGGGAAGAANNSAATGGGAGCTCATTCTTTA 40

CTT GCTGCCACT CTT GGCN NST CGGGAAGCGCTTATT CAT 41

ACt CTT GGCCAGTCGGGAN NSGCTTATT CAT CT GTTGCT C 42

TGÒTTTCTCCAACGATTCNNSGTGTCGTCTGGTGGATACG 43

GACTCCAACATCAACACCNNSGAGGGCAGGACTGGCAAGG 44

T CCAACAT CAACACCAACNNSGGCAGGACTGGCAAG- 45

GATG

ATCAACACCAACGAGGGCNNSACTGGCAAGGATGTCAACT 46 Iniciador

I292F

G294F

K297F

R309F

Y31QF

D313F

V314F

Y315F

Y316F

N317F

W321F

K340F

K341F

T350F

Q356F

T363F

S368F

S369F

N376F

Y395F

A398F

S401F

R408F

N409F

T412F

H418F

Secjuência de DNA 5' para 3' SEQ ID

NO:

GT CGACT CCTT CCGCT CCNNSTACGGCGT GAACAAGGG- 47 CA

TCCTTCCGCTCCATCTACNNSGTGAACAAGGGCATTCCTG 48 TCCATCTACGGCGTGAACNNSGG- 49

CA'

TCCTGCCGGTGCTG

GCTGCCGTCGCCATTGGCNNSTATGCAGAGGATGTGTACT 50

GCCGTCGCCATTGGCCGGNNSGCAGAGGATGTGTACTA- 51 CA

ATTGGCCGGTATGCAGAGNNSGTGTACTACAACGGCAACC 52

GGCCGGTATGCAGAGGATNNSTACTACAACGGCAACCCTT 53

CGGTATGCAGAGGAT GT G N NSTACAACGGCAACCCTTGGT 54

TATGCAGAGGAT GT GTACNNSAACGGCAACCCTT GGTAT C 55

GCAG AGGAT GT GTACTAC NNSGG CAACCCTT G GTAT CTT G 56

TACTACAACGGCAACCCTN NSTAT CTTGCTACATTTGCTG 57

GA'

GCCAT CTACGTCTGGNN S AAG ACGGG CT CCAT - 58

CACGG

GCCATCTACGTCTGGAAGNNSACGGGCTCCATCACGGT- 59 GA

TCCAT CACGGT GACCGCCN NSTCCCT GGCCTT CTT CCAG 60

ACCTCCCTGGCCTTCTTCNNSGAGCTTGTTCCTGGCGTGA 61

GAGCTTGTTCCTGGCGTGNNSGCCGGGACCTACTCCAGCA 62

GT GACGGCCGGGACCT ACN NSAGCAGCT CTTCGACCTTTA 63

ACGGCCGGGACCTACT CCN NSAGCT CTT CGACCTTTACCA 64

AGCT CTT CG ACCTTT ACCN NSAT CAT CAACGCCGT CT CGA 65

CTCAGCGAGGCTGCCAAGNNSGTCCCCGCC- 66 GAÒGGTTCGC

GC

GCCAAGTACGTCCCCNNSGACGGTTCGCTGGCC- 67

GAGC

TACGTCCCCGCCGACGGTN NSCT GGCCGAGCAGTTT - 68

GACC

CTGGCCGAGCAGTTTGACNNSAACAGCGG- 69

CAÒTCCGCTGT

GC

ΤΤΊ CACC

AC

3GAGCAGTTTGACCGCNNSAGCGG- 70

CACTCCGCT GT CT G

GACCGCAACAGCGGCN NSCCGCT GT CT GCGCTT - 71

:C

CCGCTGTCTGCGCTTNNSCTGACGTGGTCGTACGCCT 72 Iniciador

W421F

R433F

I436F

S451F

tabela 3 ■

Iniciador

PDON201-

RV

D4R

F5R

I12R

D24R

F29R

I43R

D44R

P45R

D46R

Y47R

Y49R

W51R

Y70R

Q75R

Seqüência de DNA 5' para 3' SEQ ID

NO:

T Cl 'GCGCTT CACCT GACGN NST CGTACGCCTCGTT CTT GA 73 TTGACAGCCACGGCCCGTNNSGCTGG- 74

CA'

CGT GCCCCCCT

ACGGCCCGTCGGGCTGGCNNSGTGCCCCCCTCGTGGGC 75 CA

AGCGCTAGCACGATCCCCNN- 76

SACGTGCTCCGGCGCGTCCG

Iniciadores usados para gerar bibliotecas SSM de TrGA

Seqüência de DNA 5' para 3' SEQ

ID

NO:

GTAACAT C AG AGATTTT G AG ACAC 77

GCGT CT CGGT GCT GAT GAASN NGT CAACAGA 78

TAGGCGTCTCGGTGCTGATSNNGTCGTCAACAGA 79

AAAGAAGATTGTTCAGTGCSNAGGCGTCTCGGTGCTGAT 80

T (jCCGAATGCACGGCAT CCSN N AGGACCAACATT GCA- 81 AAG

cdGCACCAGCTGATGTGCCSNNTGCACGGCATCCAT- 82

cWgg

TGjTAATAGTAGTCCGGGTCSNNTGTGCTGGGAGATG- 83 CAAT

AdATGTAATAGTAGTCCGGSNNAATTGTGCTGGGA- 84

GATGC

TcJcACATGTAATAGTAGTCSNNGTCAATTGTGCTGGGA- 85 GA

GCGTCCACATGTAATAGTASNNCGGGTCA- 86

AT

TGTGCTGGG

AT

CTCGCGTCCACATGTAATASNNGTCCGGGTCA- 87

TGTGCT

CGCTATCTCGCGTCCACATSNNATAGTAGTCCGGGTCA- 88 AT

CAAGAGCGCTATCTCGCGTSNNCATGTAATAG- 89

TAGTCCGG

GGCGCTGCAGGCCCGCATCSNNCGTTTCGGTGA- 90

AÒCGGTC

TGTACTGCTCGATGCGGCGSNNCAGGCCCGCATCG- 91 TAlCGT Iniciador

R76R

P94R

D100R

K114R

F116R

N119R

R122R

R125R

N146R

Q148R

Y169R

Q172R

F175R

W178R

E180R

V181R

Q208R

S211R

W228R

Seqüência de DNA 5' para 3'

TAATGTACTGCTCGATGCGSNNCTGCAGGCCCG

CATCGTA

GGTCCGCGAGGGAGCCCGASNNGTTAGA

GAGGCCCTGGAG

GCÍTCGCCGAGACCAGAGCCSNNCGCGAGGGAGCCC

GAGGG

cdcAGTTGCCGGTGAAAGGSNNCAGGGTCAACTCAA

ACjTT

GliCGACCCCAGTTGCCGGTSNNAGGCTTCAGGGTCA

ACTC

CCCGCTGCGGTCGACCCCASNNGCCGGTGAAAGGCTT

CAG

CT

GGGCCATCCCGCTGCGGSNNACCC

CAGTT GCCGGT GAA

CT CGCAGAGCT GGGCCATCSN NCT GCGGT CGACCCCAGTT

T GGACACAGT CGACT GATASN NGTT GTT GAT GAGCCACTT

TdACGTTGGACACAGTCGASNNATAGTTGTTGTTGAT

GAG

CaAAGCCGGTTT GGTT CCASNNCT GGGCAACATAGTT GAG

CCCAGAGGTCAAAGCCGGTSNNGTTCCAGTACTGGG

CAAC

TGACTTCTTCCCAGAGGTCSNNGCCGGTTTGGTTCCAG

TA

AGCT CCCATT GACTT CTT CS N NGAGGT CAAAGCCGGTTTG

AQAAT GAGCT CCCATT GACSN NTT CCCAGAGGT CAAAGCC

TAAAGAAT GAGCTCCCATTSNNTT CTT CCCAGAGGT CAAA

ATGAATAAGCGCTTCCCGASNNGCCAAGAGTGGCAG

CAAG

GAGCAACAGAT GAAT AAGCS N NT CCCGACT GGCCAAGAGT

CGTATCCACCAGACGACACSNNGAATCGTTGGAGAA

AGCA

SEQ

ID

NO:

92

93

94

95

96

97

98

99

100 101 102

103

104

105

106

107

108

109

110 Iniciador

N242R

E243R

R245R

I292R

G294R

K297R

R309R

Y310R

D313R

V314R

Y315R

Y316R

N317R

W321R

K340R

K341R

T350R

Q356R

T363R

Seqüência de DNA 5' para 3'

CÒTTGCCAGTCCTGCCCTCSNNGGTGTTGATGTTG

GAGTC

CATCCTTGCCAGTCCTGCCSNNGTTGGTGTTGATGTTG

GA

AGTTGACATCCTTGCCAGTSNNGCCCTCGTTGGTGTT

GAT

TGCCCTTGTTCACGCCGTASNNGGAGCGGAAGGAGTC

GAC

CAGGAATGCCCTTGTTCACSNNGTAGATGGAGCGGA

AGGA

CAGCACCGGCAGGAATGCCSNNGTTCACGCCGTA

GATGGA

AGTACACATCCTCTGCATASNNGCCAATGGCGACGG

cWgc

T<jTAGTACACATCCTCTGCSNNCCGGCCAATGGCGACGGC -■·

GGTT GCCGTT GTAGTACACSN NCT CT GCATACCGGCCAAT

AAGGGTTGCCGTTGTAGTASNNATCCTCTGCA

TACCGGCC

ACCAAGGGTTGCCGTTGTASNNCACATCCTCTGCA- : TACCG

GATAC CAAGGGTT GCCGTTSNNGTACACAT C CTCTG CATA

CAAGATACCAAGGGTT GCCS N NGTAGTACACATCCTCTGC

CAGCAAATGTAGCAAGATASNNAGGGTTGCCGTTGTAG

TA

CCGTGATGGAGCCCGTCTTSNNCCAGACGTAGATGG

CATC

T CACCGT GAT GGAGCCCGTSN NCTTCCAGACGTAGATGGC

CC^TGG AAG AAGGCCAGGGASN N GGCGGT CACCGT GATGGA

TCGAGACGGCGTTGATGATSNNGGTAAAGGTCGAA

GAGCT

T GCT GGAGTAGGT CCCGGCSN NCACGCCAGGAACAAGCTC

SEQ

ID

NO:

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120 121 122

123

124

125

126

127

128 129 Iniciador Seqüência de DNA 5' para 3' SEQ

ID

NO:

S368R TAAAGGTCGAAGAGCTGCTSNNGTAGGTCCCGGCCGT- 130 CAC S369R TGGTAAAGGTCGAAGAGCTSNNGGAG- 131 TAGGT CCCGGCCGT N376R TCGAGACGGCGTTGATGATSNNGGTAAAGGTCGAA- 132 GAGCT Y395R GCGAACCGTCGGCGGGGACSNNCTTGG- 133 CAGCCTCGCTGAG A398R GCTCGGCCAGCGAACCGTCSNNGGGGACGTACTTGG- 134 CAGC S401R GGTCAAACTGCTCGGCCAGSNNACCGTCGGCGGG- 135 GACGTA R408R ACAGCGGAGTGCCGCTGTTSNNGTCAAACTGCTCGGC- 136 CAG N409R CAGACAGCGGAGTGCCGCTSNNGCGGTCAA- 137 ACTGCTCGGC T412R GGTGAAGCGCAGACAGCGGSNNGCCGCTGTTGCGGT- 138 CAAA H418R AGGCGTACGACCACGTCAGSNNAAGCGCAGACAGCG- 139 GAGT W421R TCAAGAACGAGGCGTACGASNNCGTCAGGTGAAGCG- 140 CAGA R433R AGGGGGGCACGATGCCAGCSN- 141 NACGGGCCGTGGCTGTCAA I436R TGGCCCACGAGGGGGGCACSNNGCCAGCCC- 142 GACGGGCCGT S451R CGGACGCGCCGGAGCACGTSNNGGGGATCGTGC- 143 TAGCGCT Para cada biblioteca, após incubação durante a noite a 37°C, colônias foram empoçadas através de resuspensão dos clones em PSS. Dos transformantes de E. coli empoçados, plasmídeo total foi isolado (Qiagen)

usando técnicas padrões. Resumidamente, 1 μΙ da solução de plasmídeo foi adicionado a 1 ml de solução de vetor de destino pRep3Y (figuralA) e adicionado à mistura de enzima LR clonase® Il de acordo com o protocolo fornecido pela Invitrogen. Um DNA multimérico circular foi gerado e transformado em E. coli Max Efficiency DH5a, conforme descrito pelo fornecedor. 10

15

20

25

Após incubação durante a noite a 37°C, 96 colônias simples de cada biblioteca foram selecionadas a partir de lâminas de ágar 2xTY com 100 μg/ml de ampícilina e crescidas durante 24 horas a 37°C em MTP contendo 200 μΙ_^β 2x meio TY com 100 μg/ml de ampicilina. As culturas foram usadas para ánálises de seqüência (BaseCIear B.V., Leiden, Países Baixos).

Os números das bibliotecas oscilavam de 1 a 65, com uma adi

ção referente

ao códon da seqüência da TrGA que sofre mutação aleatória.

meio seletivo badas a 28°C

Após classificação, cada biblioteca incluía um máximo de 19 variantes de TrGA. Essas variantes foram individualmente transferidas para Schizosaccharomyces pombe de acordo com a instrução dos fabricantes (Zymo Research, Orange CA. EUA).

Transformações de S. pombe foram feitas em lâminas sobre (Ágar EMM, Qbiogene, Irvine, EUA Cat. No. 4110-232) e incudurante 4 dias. Os transformantes foram purificados da lâmina de transformação dispersando as colônias sobre Ágar EMM.

Exemplo 2: descrição das condições de crescimento e pré-tratamento de amostra

Transformantes de S. pombe foram inoculados em lâminas de microtitulação com 96 cavidades (MTP) contendo meio seletivo (2x EMM-C) [64,4 g/L de Caldo EMM (Qbiogene Cat. No: 4110-032), 0,62 g/L de Mistura de Suplemento Completa (CSM-HIS-LEU-TRP, Qbiogene, Cat. No. 4530- 122)] e incubados durante a noite a 28°C. Da lâmina de microtitulação incubada durante a noite, 200 μΙ de cultura de S. pombe em crescimento foram inoculados em 20 ml de 2x meio líquido EMM-C em um frasco de agitação de 100 ml e incubados durante 4 dias a 26°C a 280 rpm em uma incubadora de agitação Multitron (Infors AG, Bottmingen, Suíça). A cultura em crescimento, 2 ml de cultura de S. pombe foram coletados e centrifugados durante min a 14.000 rpm (Sigma). O sobrenadante foi transferido para um conjun

to de filtro Vi\

^aspin 500 HT de 10 kD (VivaScience AG, Hannover, Alema

mente para o com Tween 8

nha) e centrifugado durante 25 min a 1000 g. O retentado foi diluído nova

volume inicila com NaAc a 50 mM, pH de 4,5, suplementado 3 a 0,015%. Essa solução foi usada nos diferentes ensaios. Ekemplo 3: construção de uma biblioteca combinatorial de 4

variantes de

TrGA

(A) Experimentos foram conduzidos para a construção de variantes de TrGA trazendo combinações das seguintes mutações em um único sítio: Q172F; p208N; S211R e V314H. Uma revisão das variantes é mostrada abaixo:

aj Q172F; Q208N

bj Q172F; S211R

c) Q172F; V314H d) Q208N; S211R

e) Q208N; V314H

f) S211R; V314H

g) Q172F; Q208N; S211R

h) Q172F; Q208N; V314H i) Q172F; S211R; V314H

j) Q208N; S211R; V314H

k) Q172F; Q208N; S211R; V314H

O kit de mutagênese multi sítio-dirigida Quikchange® (QCMS) (Stratagene) foi usado para construir a biblioteca. Os iniciadores 5' fosforila20 dos usados para criar a biblioteca são mostrados na tabela 4. Resultados ótimos em termos de incorporação de iniciadores de comprimento total, bem como redução significativa nos erros iniciador-derivados foram obtidos através do uso de HPLC, PAGE ou qualquer outro tipo de iniciadores purificados (Invitrogen).

tabela 4

Iniciador Seqüência SEQ ID NO: 143R GCATCTCCCAGCACACGAGACCCGGACTACTAT 144 143Y GCATCTCCCAGCACATACGACCCGGACTACTAT 145 R76L GATGCGGGCCTGCAGCTGCGCATCGAGCAGTAC 146 N119T CTGAAGCCTTTCACCGGCACCTGGGGTCGACCG- 147 CAGCGGG Iniciador Seqüência SEQ ID NO: N119Y TGAAGCCTTTCACCGGCTACTGGGGTCGACCG- 148 CAGCGGG N119D CTGAAGCCTTTCACCGGCGACTGGGGTCGACCG- 149 CAGCGGG N146 AGTGGCT CAT CAACAACGASTAT CAGT CGACT GT GT 150 N146T /jGTGGCTCATCAACAACACCTATCAGTCGACTGTGT 151 N146W GT GGCT CAT CAACAATGGTAT CAGT CGACT GT GT 152 N146L /^GT GGCT CAT CAACAACCT GT AT CAGT CGACT GT GT 153 N146S /^GTGGCT CAT CAACAACT CCTAT CAGT CGACT GT GT 154 Q172D/E TT GCCCAGTACT GGAACGASACCGGCTTT - 155 GACCTCTGG I Q172V/L TT GCCCAGTACT GGAACST GACCGGCTTT - 156 GACCTCTGG I Q172T TTGCCCAGTACTGGAACACCACCGGCTTT- 157 GACCTCTGG Q172R TT GCCCAGTACT GGAACCGAACCGGCTTT - 158 GACCTCTGG Q172C TT GCCCAGTACT GGAACT GCACCGGCTTT - 159 GACCTCTGG O plasmídeo padrão pDONR-TrGA (figura 2) foi usado para construir a biblioteca combinatorial usando o kit QCMS da Stratagene. A biblioteca foi construída conforme descrito pelo fornecedor, com concentrações de iniciJdor modificadas usadas nas reações. Especificamente, 4 μΙ de 5 pDONR-TrG/l (25-50 ng) foram misturados com 11 μΙ de água destilada estéril; 1,5 μΙ de dNTP; 2,5 μΙ de 10x tampão QCMS; 1 μΙ de mistura de enzima e 1 μΙ de cada mistura de iniciador mutante, proporcionando um total de 100 ng de iniciadores em cada reação. As condições de PCR foram 95°C durante 1 min, seguido por 30 ciclos de 95 0C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 10 65°C durante 6 min, em um termociclizador MJ Research usando tubos de PCR de 0,2 ml com parede fina. O produto da reação foi digerido com 1 μΙ de Dpn 1 do kit QCMS através de incubação a 37°C durante a noite. Um kit de purificaçãd por PCR (Qiagen) foi usado para purificação da amostra e um segundo ciclci de digestão foi realizado com Dpnl (Stratagene) durante 1 10

hora a 37°C.

A, mistura de reação foi transformada em E. coli Max Efficiency DH5a (Invitrogen) e colocada sobre Ágar seletivo (2xTY suplementado com

50 μg de canamicina/ml). Após incubação durante a noite a 37°C, 96 colô

i

nias simples fjoram selecionadas para análise de seqüência (BaseCIear B.V., Leiden, Países Baixos). As variantes combinatoriais foram clonadas e expressas em lima cepa hospedeira de T. reesei, conforme descrito abaixo e no WO 06/060062.

(B) Mais seis bibliotecas combinatoriais (tabela 5) foram feitas sinteticamente pela Geneart (Regensburg, Alemanha) e foram testadas com relação à estabilidade térmica e em ensaios de aplicação de adoçante e etanol, conformej descrito aqui.

tabela 5. bibliotecas combinatoriais

I

1 Dj24E,L/l43F,R/D44H,N/F175H/V181K,L/V314D,H,K/T363R 2 D24L,W,Y/Q208F/I292F,L,N,V/G294A,I,Q/K297A/Y310F, Q1R 3 V181F.I (,L/E243A,N,M,R,Y/I292F,L,N,V/K297A,D,H,M,N,Q/N317H/Y395 Q1R 4 D24Eí,L,Y/V181F,K,L/Q208C/F/G294A,l,Q/T363R/N376Q/N409K,W D24E,L,Y/V181F,K,L/I292F,L,N,V/G294A,I,Q/E243A,M,N,R,Y/N409K,W 6 I43R/E243A,M,N,R,Y/I292F,L,N,V/G294/K297A,D,H,M,N,Q,S,R,W,Y Exemplo 4: v ariantes com estabilidade térmica aperfeiçoada A molécula de TrGA precursora, sob as condições descritas, ti15

20

nha uma atividade residual entre 15 e 44% (variação dia a dia). O índice de desempenho foi calculado baseado na termoestabilidade da TrGA do mesmo lote. Os índices de desempenho são os quocientes Pl = (atividade residual da variante)/(atividade residual da TrGA). Um índice de desempenho >

1 indica uma estabilidade aperfeiçoada. Variantes as quais têm um índice de desempenho de estabilidade térmica de mais de 1,0 são mostradas na tabela 6 a seguir.

Variantí Estabilidade térmica, 60 °C, pH de 4,5 D4P 1,05 112Ε 1,09 Ι12Υ 1,40 D24L 1,09 D24W 1,13 D24Y 1,03 I43R 1,28 D44N 1,06 D44Q 1,10 Q75N 1,09 R76K 1,03 N146D 1,20 Ν146Ε 1,24 N146L 1,10, N146V 1,28 N146W 1,17 Q148D 1,02 F175I 1,02 F175Y 1,06 Ε180Α 1,41 E180D 1,02 E180G 1,13 Ε180Ι 1,41 E180L 1,38 Ε180Μ 1,10 Ε180Ν 1.27 E180Q 1,72 E180R 1,59 E180V 1,08, E180W 1,30 Ε180Υ 1,31 V181I 1,20 V181K 1,12 V181L 1,06 V181Q 1,09 V181R 1,07 Q208F 1,06 Q208T 1,17 Q208V 1,15 S211D 1,10 S211E 1,02 S211I 1,31 S211M 1,90 Ε243Α 1,19 Ε243Η 1,04 Ε243Μ 1,53 Ε243Ν 1,35 Ε243Ρ 1,06 E243R 1,21 is E243S 1,09 E243T 1,48 E243Y 1,43 I292F 1,17 I292L 1,10 I292N 1,31 I292V 1,02 G294A 1,30 G294C 1,41 G294D 1,31 G294E 1,34 G294H 1,17 G294I 2,15 G294L 2,01 G294R 1,13 G294Q 1,91 G294R 1,34 G294V 1,10 Κ297Α 1,47 K297C 1,10 K297D ' 1,50 K297F i 1,24 K297G 1,25, [ Κ297Η 1,63 K297L 1,62 Κ297Μ 1,62 Κ297Ν 1,87 K297Q 1,82 K297R 1,29 K297S 1,22 Κ297Τ 1,33 K297V 1,10 K297W 1,85 Κ297Υ 1,71 R309S 1,08 Y310C 1,06 Y310F 1,35 Y310L 1,11 Y310Q 1,40 Y310R 1,61. Υ315Ε 1,24 Υ315Η 1,48 Y315L 1,35 Υ315Ν 1,17 Υ315Ρ 1,19 Y315Q 1,43 Υ315Τ 1,34 Y316D 1,06 Ν317Η 1,26 N317Q 1,09 Κ340Η 1,02 K340R ; 1,09 Κ341Ι 1,10 K341V 1,07 T350G 1,08 Τ350Ρ 1,08 T350S 1,33 Q356L 1,20 Τ363Ν 1,30 S368C 1,12 S368E 1,07 S368F 1,16 S368H 1,26 S368I 1,15 S368L 1,33 S368N 1,21 S368P 1,05 S368Q 1,10 S368R 1,14 S368T 1,15 S368W 1,16 S369A 1,22 S369D 1,05 S369F 1,20 S369G 1,05 S369K 1,12 S369L 1,49 S369M 1,36 S369N 1,25 S369P 1,16 S369R 1,12 S369T 1,25 N376F 1,12 N376G 1,26 Ν376Η 1,21 Ν376Κ 1,40 N376L 1,34 Ν376Ρ 1,05 Γ N376Q 1,11 N376S 1,09 N376V 1,19 Ν376ΧΛ 1 1,12 Ν376Υ 1,05, Υ395Α 1,05 Y395C 1,02 Y395F 1,03 Y395G 1,13 Υ395Η 1,10 Y395L 1,50 Υ395Ν 1,20 Y395Q 1,18 Y395R 1,14 Y395S 1,13, Υ395Τ 1,04 A398C 1,10 A398D 1,39 A398F 1,05 A398G 1,17 Α398Η 1,33 Α398Ι 1,41 Α398Κ 1,47 A398L 1,44 Α398Ν 1,23 Α398Ρ 1,38 A398Q 1,43 A398R 1,59 A398S 1,14 Α398Τ 1,25 A398V 1,29 Α398\Α 1,45 Α398Υ 1,38 S401A 1,12 S401E 1,08 S401I 1,05 S401N 1,12 S401P 1,15 S401R 1,25 S401T 1,26 S401V 1,18 R408A 1,14 R408E 1,41 R408G 1,15 R408H 1,12 R408I 1,19 R408K 1,80 R408L 1,55 R408N 1,09 R408Q 1,23 R408S 1,17 Ν409Α 1,25 N409C 1,18 N409D 1,21 Ν409Ε 1,27 N409F 1,32 N409G 1,14 Ν409Η 1,29 Ν409Ι 1,56 Ν409Κ 1,44 N409L 1,57 Ν409Μ 1,17 N409Q. 1,03 N409R 1,29 N409V 1,11 N409W 1,58 T412L 1,10, S451R 1,01 Exemplo 5: Variantes de alto desempenho a partir de um ensaio de classificação com etanol

Variantes foram testadas em um ensaio de classificação com etanol conforme descrito acima. A tabela 7 mostra os resultados do ensaio 5 de classificação para variantes com um índice de desempenho (PI) > 1,0, comparado com o Pl da TrGA. O Pl é uma medida de atividade específica (atividade/mg de enzima). O Pl da atividade específica é o quociente "variante - atividade específica/ WT - atividade específica". O Pl da atividade específica é de 1,0 e uma variante com um Pl > 1,0 tinha uma atividade específi10 ca que é maior do que a TrGA precursora. A atividade específica é a atividade medida através do ensaio de classificação com etanol dividido pelos resultados obtidos no ensaio de Bradford descrito acima.

tabela 7 - Classificação de etanol

variante P.l. 32 0C, pH de 4 D4A 1,07 D4C 1,08. D4E 1,23 D4L 1,34 D4R 1,18 D4S 1,17 F5C 1,35 I12L 1,19 I12R 1,13 D24E 1,60 D24L 1,19 ' D24W 1,03 D24Y 1,14 F29A 1,05 F29C 1,12 F29D 1,20 F29E 1,05 F29I 1,26 F29L 1,42 F29Q 1,01 F29S 1,07 F29V 1,06 I43D 1,14 I43F 1,33 I43R 1,21 Ι43Υ 1,05 D44E 1,37 D44F 1,07 D44G 1,03 D44H 1,11 D44K 1,09 D44N 1,07 D44S 1,08 D44Y 1,07 Υ70Ε 1,02 Y70G 1,06 Υ70Κ 1,01 Υ70Μ 1,36 Υ70Ρ 1,15 Y70R 1,40 Y70S 1,04 Q75A 1,10 Q75K 1,77 R76K 1,06 R76L 1,11 R76M 1,13 R76N 1,02 R76T; 1,04 R76V 1,05 R76W 1,02 R76Y 1,05 D100A 1,08 DIOOj 1,14 DIOOL 1,03, DIOOM 1,12 DIOON 1,06, DIOOP 1,09 DIOOQ 1,14 DIOOT 1,06 DIOOW 1,19 DIOOY 1,05 N119E 1,02 N119F 1,03 N119Y 1,28 N146C 1,11 N146E 1,02 N146G 1,11 N146H 1,07 N146K 1,06 Q148H 1,10 Q148N 1,05 Q148V 1,18 Q148W 1,05 Q148Y 1,16, Y169D. 1,18 Y169F 1,10 Y169H 1,05 Y169R 1,02 Q172E 1,08 Q172G 1,05 Q172R 1,22 Q172S 1,03 F175C 1,18' F175H 1,26 F175T 1,28 F175W 1,16 F175Y 1,05 V181F 1,28 V181K 1,35 V181L 1,37 V181R 1,01 Q208A 1,22 Q208C 1,17 Q208F 1,12 Q208H 1,02 Q208I, 1,02 Q208L 1,32 S211A 1,30 S211E 1,30 S211G 1,05 S211L 1,04. S211M 1,05 S211R 1,34 S211W 1,07 S211Y 1,08 Ε243Α 1,23 E243L 1,20 Ε243Μ 1,26 Ε243Ν 1,28 E243R 1,31 Ε243Υ 1,25. I292F 1,23 Ι292Η 1,04 I292L 1,21 1292N 1,27 I292R 1,02 I292V 1,24 G294A 1,91 G294I 1,92 G294Q 1,99 Κ297Α 1,82 K2.97D 1,87 Κ297Η 1,79 Κ297Μ 1,91 Κ297Ν 1,87 K297Q 1,85 K297R 1,71 K297S 1,72 K297W 1,70 Κ297Υ 1,80 R309L 1,43 Y310F 1,05 Y310Q 1,16 Y310R 1,24 V314D I 1,10 V314F : 1,04 V314H 1,31 V314K 1,08 V314L 1,02 V314N 1,05 V314R 1,06 Y316R 1,42 Y316W 1,05 Ν317Η 1,14 Ν317Κ 1,02 N317S 1,03 Ν317Τ 1,23 K340D 1,33 Κ340Τ 1,16 K341D 1,04 K341F 1,64 K341G 1,64 K341L 1,04 Κ341Ν 1,05 K341S 1,06 Τ350Α 1,56 T350D 1,04 Τ350Ε 1,59 Τ350Η 1,03 Τ350Ν 1,06 T350Q 1,05 T350R 1,02 Q356D 1,69 Q356E 1,07 Q356H 1,03 Q356K 1,03 Τ363Α 1,04 T363C 1,54 T363G 1,02 T363hl 1,09 T363N 1,02 T363R 1,61 T363V 1,05 T363W 1,08 S368D 1,11 S368F 1,08 S368H 1,04 S368L 1,07 S368M 1,03 S368N 1,02 S368W 1,24. S369F 1,68 S369M 1,04 S369T 1,05 N376G 1,05 Ν376Η 1,10 N376Q. 1,16 N376S 1,06 Ν376Τ 1,12 N376V 1,64. Υ395Α 1,02 Y395C 1,05 Y395G 1,02 Y395Q 1,63 Y395R 1,20 Y395S 1,09 A398D 1,05 Α398Ρ 1,03 S401A 1,04 S401D 1,01 S401G 1,04. S401N 1,02 S401V 1,06 Ν409Κ 1,30 N409L 1,04 N409W 1,31 Τ412Α 1,04 T412G 1,06 Τ412Κ 1,05 R433Q 1,16 I436A 1,32 I436H 1,02 I436T 1,03 S451A 1,03 S451M 1,28 S451T 1,09 S451Y 1,03 10

Exemplo 6: Variantes de alto desempenho a partir de um ensaio de classificação de adoçante

Variantes foram testadas em.um ensaio de classificação de adoçante. conforrrjie descrito aqui acima. A tabela 8 mostra os resultados do ensaio de classificação, em que variantes com um índice de desempenho (PI) > 1,00, comparado com o Pl da TrGA, são mostradas. O Pl é uma medida de atividade específica (atividade/mg de enzima). O Pl da atividade específica é o quociente "variante - atividade específica/WT - atividade específica". O Pl da atividade específica é de 1,0 e uma variante com um Pl >1,0 tinha uma atividade específica que é maior do que a TrGA precursora, tabela 8 - Classificação de adoçante

Variante P.l. 60 °C, pH de 4,5 D4E 1,09, D4L 1,03 D4S 1l07 - ~ D24E 1,45 D24L. 1,31 - ‘ ' D24Y 1 or I43D 1,05 I43F 1,31 I43R 1,28 D44E 1,09 ,D44H 1,12 D44N 1,31 ......... ,Y70F 1,26 Y70L 1,22 Q75K 1,12 R76K 1,11 R76M 1,03 R76P 1,13 R76T 1,11 R76W 1,07 D100Y 1,04 Ν119Ε 1,12 Ν119Υ 1,01 N146D 1,05 Ν146Ε 1,11 Q148D 1,02 Q148W 1,05 Q172H 1,05 0172 Y 1,03 F175H 1,42 F175Y 1,11 V181A 1,10 V181F 1,01 V181K 1,43 V181L 1,42 Q208C 1,08 Q208F 1,20 Q208H 1,11 Q208L 1,03 Q208N 1,03 Q208S 1,06 Q208T 1,12 S211H 1,16 S211M 1,16 S211R 1,34 S211W 1,09 Ε243Α 1,06 E243F 1,01 Ε243Ν 1,05 E243R 1,14 E243S 1,09 Ε243Υ 1,07 R245A 1,01 Ι292Ν 1,04 I292V 1,12 G294A 1,06 G294Q 1,02 Κ297Α 1,04 K297D 1,10 K297Q 1,07 V314D 1,22 V314H 1,85 V314K 1,34 V314L 1,13 V314N 1,08 V314R 1,20 V314Y 1,05 Y316R 1,20 Ν317Η 1,25 Ν317Κ 1,03 K340D 1,21 Κ340Ε 1,05 K341D 1,08 K341G 1,22 K341L 1,08 Κ341Ν 1,08 K341S 1,12 Τ350Η 1,03 T350L 1,04 Q356D 1,31 Q356E 1,04 Q356K 1,05 T363C 1,08 T363G 1,04 T363N 1,02 T363R 1,50 S368G 1,04 S368M 1,03 N376G 1,02 N376Q 1,07 Y395Q 1,01 A398H 1,03 A398S 1,03 S401A 1,01 N409K 1,19 N409T 1,02 N409W 1,01 T412G 1,06 T412S 1,03 I436D 1,02 1436Q 1,06 I436T 1,16 S451D 1,01 S451E 1,09 S451F 1,02 S451H 1,11 S451T 1,11 ________---_ Exemplo 7: construção de vetores e transformação em células hospedeiras de Trichoderma reesei

A. Construção de vetores de expressão compreendendo um polinucleotídeo que coçiifica uma GA variante

0 cassete de expressão compreendendo a seqüência de DNA SEQ 20

25

ID NO: 4 foi cjlonado no pDONR® 201, um vetor de Entrada Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, CA). O cassete de expressão de TrGA foi clonado no vetor de destino Gateway compatível pTrex3g-DEST (figura 5), o qual também é descrito no WO 06/060062, através de reação de recombinação Gateway® 5 LR. O vetor de expressão pTrex3g-TrGA (figura 5) permitiu a expressão da proteína de TrGA (SEQ ID NO: 2) em um hospedeiro Trichoderma reesei. Vetores foram construídos, os quais incluíam cDNA de TrGA modificado que codifica pelo menos as seguintes variantes (1) V314H; (2) S211R; (3) Q208N e (4) Q172F.

B. Transformação

Um yetor de expressão contendo uma GA variante foi transformado em uma cepa hospedeira de T. reesei derivada de RL-P37 (IA52) e tendo várias deleções de gene (Δ cbhl, Δ cbh2, Δ egl1, A egl2) usando bombardeamento de pLrtículas através do Sistema PDS-1000/Helium (BioRad Cat.

No. 165-02257). O protocolo é esboçado abaixo e referência é feita também aos Exemplos; 6 e 11 do WO 05/001036.

Uma suspenJão de esporos (aproximadamente 5 x 108 esporos/ml) da cepa de T. reesei foi preparada. 100-200 μΙ de suspensão de esporos foram dis

persos sobre mida. O meio

o centro de lâminas com meio Médio Mínimo (MM) de acetade acetamida MM tinha a seguinte composição: 0,6 g/L de a

cetamida; 1,68 g/L de CsCI; 20 g/L de glicose; 20 g/L de KH2PO4; 0,6 g/L de CaCI2.2H20; 1 ml/L de 1000X solução de elementos vestigiais; 20 g/L de ágar; e pH de 5,5. 1 ml/L de 400X solução salina de elementos vestigiais: ácido cítrico a 175 g/L, FeS04.7H20 a 200 g/L, ZnS04.7H20 a 16 g/L, CuS04.5H20 a 3,2 g/L, MnSO4-H2O a 1,4 g/L, H3BO3 a 0,8 g/L. A suspensão de esporos foi deixada secar sobre a superfície do meio MM de acetamida.

ansformação seguiu a instrução dos fabricantes. Resumidade partículas de tungstênio M10 foram colocados em um tubo ntrífuga. 1 mL de etanol foi adicionado e deixado descansar

mente, 60 mç para microce

durante 15 minutos. As partículas foram centrifugadas a 15.000 rpm durante

segundos.

O etanol foi removido e as partículas foram lavadas três vezes

com dH20 estéril antes de 1 mL glicerol estéril a 50% (v/v) ser adicionado. 25 μΙ de suspensão de partículas de tungstênio foram colocados em um tubo para microcentrífuga. Enquanto se submetia a turbilhonamento continuamente, o seguinte foi adicionado: 0,5 -5 μΙ (100-200 ng/μΙ) de DNA de plasmídeo, 25 μΙ Cle CaCI2 a 2,5M e 10 μΙ de espermidina a 0,1M. As partículas 5 foram centrifugadas durante 3 segundos. O sobrenadante foi removido e as partículas foram lavadas com 200 μΙ de etanol a 70% (v/v) e centrifugadas durante 3 segundos. O sobrenadante foi removido e 24 μΙ de etanol a 100% foram adicionLdos, misturados através de pipeteamento e o tubo foi colocado em um banho ultrassônico. Alíquotas de 8 μΙ das partículas foram remo10 vidas e colocádas sobre o centro dos discos macroveículo que foram manti

I

dos em um secador. Uma vez que a suspensão de tungstênio/DNA tinha

I

secado, o diáco microveículo foi colocado na câmara de bombardeamento junto com a lâmina de acetamida MM com esporos e o processo de bombardeamento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Após 15 bombardeamento dos esporos na lâmina com partículas de tungstênio/DNA, as lâminas foram incubadas a 28 °C. As colônias transformadas foram separadas das lâminas frescas de acetamida MM após 4 dias (Pentilla e outros (1987) Gene 61: 155-164).

C. Demonstração de atividade de GA a partir da TrGA variante expressa ansformadas

dós 5 dias de crescimento sobre acetamida MM, os transforâminas mostrando morfologia estável foram inoculados em itação de 250 ml contendo 30 ml de meio Proflo (o meio Proflo continha: 30 g/L de a-lactose; 6,5 g/L de (NH4)2SO4; 2 g/L de KH2PO4; 0,3 g/L de MgSOit.7H20; 0,2 g/L de CaCI2.2H20; 1 ml/L de 400X solução salina de elementos vestigiais: ácido cítrico a 175 g/L, FeS04.7H20 a 200 g/L, ZnS04.7H20 a Ϊ6 g/L, CuS04.5H20 a 3,2 g/L, MnSO4-H2O a 1,4 g/L, H3BO3 a 0,8 g/L; 2 ml/L de Tween 80 a 10%; 22,5 g/L de farinha de semente de algodão ProFIo (Traders Protein, Memphis, TN); 0,72 g/L de CaCO3. Após dois dias de crescimento a 28°C e 140 rpm, 10% da cultura Proflo foram transferidos para urr frasco de agitação de 250 ml contendo 30 ml de Meio de Lactose Definido. A composição do Meio de Lactose Definido era como segue: 5

em células tr

A

mantes nas frascos de ag g/L de (NH4)^SO4; 33 g/L de tampão de ácido 1,4-Piperazina bis(propanosulfônico); 9 ij/L de casaminoácidos; 4,5 g/L de KH2PO4; 1,0 g/L de MgSO4JH2O; 5 ml/L de anti-espumante Mazu DF60-P (Mazur Chemicals, IL); 1000X solução de elementos vestigiais; pH de 5,5; 40 ml/L de solução de 5 Iactose a 40% (peso/v) foram adicionads ao meio após esterilização. Os frascos de agitação com Meio de Lactose Definido foram incubados a 28 0C, 140 rpm durante 4-5 dias.

Amostras do sobrenadante de cultura foram misturadas com um volume aproximado de 2X tampão de carregamento de amostra com agente de redução. Micélio foi removido através de centrifugação e o sobrenadante foi analisado com relação à proteína total (BCA Protein Assay Kit, Pierce Cat. No. 23225).

A atividade de GA foi medida usando o ensaio com p-nitrofenilalfa-D-glicopiranosídeo (pNPG), com pNPG como um substrato (Sigma N15 1377). Nesse ensaio, a capacidade da gluçoamilase de catalisar a hidrólise de p-nitrofenil-alfa-D-glicopiranosídeo (pNPG) em glicose e p-nitrofenol é medida. Em lim pH alcalino, o nitrofenol forma uma cor amarela que é proporcional à atividade de gluçoamilase e é monitorada a 405 nm e comparada contra um pailrão enzimático medido como GAU (Elder, Μ. T. e Montgomery 20 R. S., Glucoamylase activity in industrial enzyme preparations using colorimetric enzymatic method, Journal of AOAC International, vol. 78(2), 1995). Um GAU é definido como a quantidade de enzima que produzirá 1 gm de açúcar de redução calculado como glicose por hora a partir de um substrato de amido solúvel (ds de 4%) em um pH de 4,2 e 60°C.

Oi perfil de proteína foi determinado através de eletroforese PA

GE sobre um gel de Bis-Tris a 10% NuPAGE® Novex com Tampão de Ope

I

ração de SDSi de MES (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).

Exemplo 8: testagem de aplicações em pequena escala de variantes selecionadas sobre amido solúvel

Cepas hospedeiras de Trichoderma reesei expressando as vari

antes únicas à) V314H, b) S211R, c) Q172F e d) Q208N foram crescidas em fermentadores de 14 L alimentados em batelada a 34 0C, pH de 3,5 em meio nutriente incjuindo glicose (Cerelose DE99), KH2PO4, MgS04-7H20, (NH4)2SO4, GaCI2-2H20, elementos vestigiais e anti-espumante Mazu (DF6000K). Quando de depleção de glicose, a temperatura de crescimento e o pH foram desviados para 28 0C e 4,0, respectivamente. O material celular 5 foi removido através de filtração e os sobrenadantes de cultura foram coletados e concentrados para obter mais de 90% de gluçoamilase como proteína total.

Várias propriedades cinéticas foram determinadas para a produ

I ·

ção de glicosé sobre amido de batata solúvel em um pH de 4,3 a 32 0C e 60

0C e comparadas com a TrGA do tipo silvestre. Cada uma das quatro varian

! '

tes demonstrou valores de Vmax aumentados (μΜ de glicose/seg) quando comparado com o tipo silvestre (TrGA), indicando taxas catalíticas elevadas (kcat (seg'1)). A figura 6 ilustra a Vmax de duas réplicas para cada temperatura testada. 15 Exemplo 9: método para determinar o desempenho sobre a produção de EtOH das variantes

Validação da classificação foi realizada sobre as variantes que foram identificadas como tendo um maior índice de desempenho quando comparado com a TrGA precursora (vide tabelas 7/8) usando um novo teste 20 de aplicação cie etanol em pequena escala. 24 variantes derivadas de avaliação de sítio e bibliotecas combinatoriais (tabela 9) foram selecionadas e transformadas diretamente em T.reesei para expressão e testagem em escala maior. As variantes foram testadas com relação desenvolvimento térmi

I

co térmico usando Calorimetria por Exploração Diferencial (análise de DSC 25 descrita aqui abaixo) e o desempenho usando um novo ensaio de aplicação de etanol em pequena escala secundário. O método consistia em duas etapas: 1) injeção de variantes sobre uma coluna de troca de ânions para determinar precisamente a concentração de proteína; e 2) titulação de variantes com três !diferentes concentrações de TrGA (0,3-0,15-0,075 g/ 28 g de 30 ds) de forma a calcular seu desempenho sobre a produção de etanol com relação à molécula do tipo silvestre, tabela 9. Lista de variantes combinatoriais Variante Mutaçao LR8 Q172F/Q208N LR6 Q172F/Q208NA//314H LR 12 Q172F/S211R SW3-1 D24 E/I43R/D44 N/F 175 H/V181LA/314H/T353R SW3-2 D24L/I43F/D44N/F175H/V181L/V/314H/T353R ET4-1 D24L/Q208Q/I292V/G294A/K297A/Y31OR ET4-2 D24W/Q208F/I292V/G294Q/K297A/Y310R ET5-1 V181L/E243A/I292N/K297N/N317N/Y395Q ET5-2 V181L/E243R/I292F/K297A/N317N/Y395Q ET7-1 D24YA/181L/Q208C/G294A/T353R/N375N/N409W ET7-2 D24LA/181L/Q208C/G294A/T353R/N375Q/N409W ET8-1 D24E/V181K/E243Y/I292V/G294Q/N409K ET8-2 D24.E/V181F/E243R/I292N/G294I/N409W ET9-1 I043R/E243R/I292F/G294A/K297A ET9-2 I043R/E243R/I292F/G294A/K297M Purificação e determinação de proteína

Um preparado de enzima bruta foi purificado usando um sistema

AKTA Explorer 100 FPLC Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). βCiclodextrina (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Baixos; 85: 608-8) foi acopiada a glóbulos de Sepharose epóxi-ativados (GE Healthcare, Diegem, Bélgica; 17-0480-01). A coluna foi usada para capturar glucoamilases do preparado enzimático. A enzima foi eluída dos glóbulos usando tampão de Tris a mM, pH de 7,5 ou tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH de 4,3 contendo α-ciclodextrina a 10 mM (Sigma, 28705). As amostras purificadas foram analisadas através de SDS-PAGE. Para determinar precisamente a concentração de proteína das variantes, um método de determinação de proteína baseado em FPLC foi desenvolvido. A concentração de proteína da molécula de TrGA marcadora purificada foi primeiro determinada usando um protocolo padrão de Bradford (Bio-Rad cat#500-0205). Subsequentemente, as amostras purificadas foram injetadas sobre uma coluna ResourceQ_1 ml (GE Healthcare) e a enzima foi eluída com tampão de Tris a 25 mM, contendo NaCI a 500 mM. A área de pico foi determinada e a concentração de proteína foi calculada com relação à área de pico do padrão de TrGA com uma concentração conhecida.

Aplicação de EtOH em pequena escala

A tabela 10 resume a produção de etanol e açúcares (DPI, DP2, DP>3) por diferentes variantes combinatoriais. Uma amostra de liqüefeito de massa de milho foi obtida e diluída para DS de 26% usando vinhaça fina. O pH da pasta foi ajustado para um pH de 4,3 usando ácido sulfúrico a 4N. Uma alíquota de 100 g de massa foi colocada em um banho de água a 32 0C e deixada equilibrar. Após a adição de 100 μ de ureia a 400 ppm, 1 ml de amostra de enzima de TrGA variante purificada (150 μg/ml) ou TrGA purificada (300, 150, 75 μg/ml) foi adicionado a cada amostra de massa de milho. Finalmente, 333 μΙ de solução a 15 g de Ievedo Red Star Red hidratado 30 minutos em 45 ml de água Dl (Lesaffre yeast Corp. Milwaukee, Wl) foram adicionados a cada amostra. As amostras foram tomadas a 5, 21, 28, 48 e 52 horas e analisadas através de HPLC usando uma coluna Aminex HPX87H 9 (Bio-Rad).

Determinações de etanol e carboidrato

Um tubo de Eppendorf para centrífuga de 2 ml foi enchido com cerveja de fermentador e esfriado sobre gelo durante 10 minutos. A amostra foi centrifugada durante 3 minutos a 14.000 x g e 500 μΙ do sobrenadante foram transferidos para um tubo de ensaio contendo 50 μΙ de solução de morte (ácido sulfúrico a 1,1N) e deixada descansar durante 5 minutos. 5,0 ml de água foram adicionados ao tubo de ensaio e, então, filtrados em uma lâmina com filtro de 0,22 μηη (Multiscreen, Millipore, Amsterdam, Países Baixos) e levada para HPLC. Temperatura da coluna: 60 °C; fase móvel: ácido sulfúrico a 0,01 N; taxa de fluxo: 0,6 ml/min; detector: RI; volume de injeção: μΙ. A coluna separa as moléculas baseado na carga e peso molecular; DP1 (monossacarídeos); DP2 (dissacarídeos); DP3 (trissacarídeos); DP>3 (açúcares de oligossacarídeo tendo um grau de polimerização maior do que 3); ácido succínico; ácido láctico; glicerol; metanol; etanol.

Análise por DSC

A temperatura de fusão das amostras de enzima purificadas (0,2-0,4 mg/ml) foi determinada usando Calorimetria por Exploração Diferencial (DSC).

tabela 10. produção de etanol e sacarídeos_

horas DP>3 DP2 DP1 Etanol (m/v)% (m/v)% (m/v)% (m/v)% TrGA(0 CO 5,5 3,46 2,70 0,91 1,02 3 (Q 21,5 3,40 0,50 0,06 6,80 28,5 1,68 1,46 0,07 8,13 46 0,04 0,71 0,06 10,21 52,5 0,04 0,45 0,03 10,96 TrGA (0,150 mg) 5,5 3,40 2,43 0,15 1,00 I 21,5 3,78 0,21 0,03 4,23 28,5 3,86 0,20 0,03 5,07 46 2,73 0,52 0,06 7,86 52,5 1,70 0,87 0,04 7,92 TrGA (0,075 mg) 5,5 3,43 2,16 -0,01 0,94 ' 21,5 3,54 0,20 0,03 3,10 28,5 3,43 0,18 0,03 3,14 46 3,93 0,18 0,05 4,65 52,5 4,01 0,18 0,03 4,79 ET7-1 5,5 3,45 2,53 0,21 1,00 21,5 3,94 0,22 0,04 4,77 28,5 3,89 0,23 0,04 5,58 46 1,58 1,22 0,06 8,64 I 52,5 0,62 1,50 0,04 9,14 LR8 5,5 3,43 2,50 0,17 1,00 21,5 3,96 0,22 0,04 4,79 28,5 3,86 0,21 0,04 6,21 46 1,27 1,11 0,07 9,17 52,5 0,45 1,24 0,04 8,73 LRfI 2 5,5 3,47 2,51 0,16 1,05 21,5 3,86 0,22 0,04 4,44 28,5 3,94 0,22 ' 0,04 5,30 46 2,09 1,08 0,07 8,56 52,5 0,99 1,52 0,04 9,16 LR6 5,5 3,37 2,44 0,18 0,96 21,5 3,88 0,21 0,04 4,44 28,5 3,90 0,20 0,04 5,10 46 2,44 0,64 0,08 8,59 52,5 1,27 1,01 0,04 8,97 ET8-1 5,5 3,46 2,53 0,22 0,99 21,5 3,99 0,21 0,04 4,86 28,5 3,90 0,21 0,04 5,76 46 1,29 1,11 0,08 8,94 52,5 0,47 1,25 0,04 9,56 ET7-2 5,5 3,57 2,46 0,17 1,02 21,5 4,26 0,21 0,03 4,21 28,5 4,37 0,20 0,04 5,14 46 3,87 0,27 0,05 7,21 52,5 3,27 0,33 0,03 8,07 A tabela 11 representa os rendimentos finais de etanol e o de

sempenho das variantes em uma dosagem de 0,15 mg. O desempenho foi calculado através de interpolação dos valores de 0,3 mg e 0,15 mg da TrGA com os valores das variantes.

tabela 11: Rendimentos de etanol

variante EtOH %(v/v) desempenho com relação à TrGA TrGA 0,3 mg 10,21 TrGA0,15 mg 7,86 1,00 TrGA 0,075 mg 4,65 ET7-1 8,64 1,33 LR8 9,17 1,56 LR12 8,56 1,30 LR6 8,59 1,31 ET8-1 8,94 1,46 ET7-2 7,21 0,72 Todas as variantes combinatoriais, exceto ET7-2, tiveram um desempenho melhor do que a TrGA do tipo silvestre. LR8 teve um desempenho melhor A

em um único de etanol em

com um desempenho aperfeiçoado de 1,56. tabela 12 proporciona uma visão geral de todos os mutantes sítio e combinatoriais testados usando o ensaio de aplicação aequena escala. Variantes que estão sombreadas na tabela 12 tiveram um désempenho melhor do que a TrGA e também tiveram uma maior temperatura de desenvolvimento térmico térmico (dTm). tabela 12. Desempenho e desenvolvimento térmico térmico de variantes com relação à TrGA

variante XTrGA dTm LR8 1,56 0,30 ET8-1 1,46 1,60 EÍT7-1 1,33 0,90 LB6 1,31 0,73 LR12 1,30 -0,13 ET5-2 1,29 -0,31 ET4-2 1,27 0,71 V218 1,27 0,06 ET4-1 \ 1,21 -2,64 SW 1,21 0,29 Q172F 1,18 -0,01 V314H 1,17 -0,44 G294I 1,16 -0,22 S211R 1,12 -0,44 Q208N 1,08 -0,22 ET9-1 1,04 -1,33 K297A 1,03 -1,11 SW3-2 1,00 0,88 TrGA 1,00 0,00 G294Q 0,99 -0,86 ET8/2 0,93 -0,01 P94N 0,76 -5,17 ET5-1 0,76 -3,28 ET7-2 0,72 -3,59 S214L/C222F 0,70 -3,98 Op resultados mostraram que cromatografia (FPLC) era uma ferramenta útil para determinar precisamente a concentração de proteína. Os resultados também mostraram que titulação das variantes com três concentrações de TrGA era um método valioso para determinar o desempenho sm pequena escala. Sete variantes tiveram um desempenho e a TrGA do tipo silvestre (vide tabela 12) e também tiveram :ura de desenvolvimento térmico térmico maior e as variantes m desempenho tão bom quanto a TrGA tinha em uma menor

de variantes melhor do qu uma tempera não tiveram u

Tm.

Exemplo 10: determinação de atividade específica de um conjunto selecionado de variantes em um único sítio e combinatoriais e especificidade de substrato de LR8

riais e varios

atividade específica de um conjunto das variantes combinatomutantes em um único sítio que foram usados para construir variantes combinatoriais foi analisada (tabela 13). LR8 (PI 1,56 determinado com ensaio de aplicação em pequena escala) foi ainda estudada com relação à especificidade de substrato. Isso foi feito através de ajuste de um ensaio em MTP para determinar as taxas de produção de glicose de variantes i

de GA e determinar a especificidade de substrato da variante LR8. Desco20 briu-se que o ensaio em MTP discrimina entre variantes e todas as variantes, exceto ET7-1, mostraram maiores taxas do que a gluçoamilase de Trichoderma reesei do tipo silvestre (wt). Ainda, diversas variantes (LR8/ET8/Q172F) tiveram um desempenho 20-30% melhor do que a TrGA. LR8 teve um desempenho melhor sobre amido solúvel e duas amostras dife25 rentes de liqüefeito de massa de milho comparado com o tipo silvestre.

Substratos usados nos experimentos a seguir eram solução de estoque de amido de milho solúvel preparada como segue: 8 g de amido de milho solúvel (Sigma # S4180) foram dissolvidos em 100 ml de água milliQ e aquecidos em um microondas durante 1 minuto. A dispersão foi levada à 30 ebulição durante 5 minutos e, após esfriar, o volume foi ajustado para 100 ml. Amido de milho solúvel a 4% foi preparado através de diluição da solução de estoque a 1:1 com tampão de NaAc a 100 mM, pH de 4. Em um ex10

perimènto, um substrato de liqüefeito de milho (NE) foi preparado usando um

analisador de 7,5 x com Na

umidade para medir a% em ds, então, o substrato foi diluído Ac a 50 mM para, finalmente, obter ds de 4%. '0 substrato foi

centrifugado durante 5' a 2000xg e o sobrenadante foi filtrado com um filtro

1 ■ · * * ’ 5 !

de 0,22 μm. Em outro experimento, um substrato de liqüefeito de^ milho

è fe * * ·■ ' ' t * · ■ : (BSE) foi preparado da mesma forma, exceto que o substrato foi diluído 10x

antes de centrifugação. , .

enzima foi diluída usando a solução de Estoque de 150 μg de ug/180 μΙ de mistura de reação). As soluções foram ainda diluídas com Na^ca 50 mM, pH de 4,0 como segue: 300 ng (10x), 200 ng, 150 ng, 100 ng, 75 ng, 50 ng, 25 ng, 10 ng/180 μ de mistura de reação.

A

enzima/ml (3

O

de 4,0, 120 μ

ensaio foi realizado como segue: 40 μΙ de NaAc a 50 mM, pH de amido de milho solúvel a 4% e 20 μΙ de enzima foram adi

cionados a cada cavidade. As amostras foram incubadas durante 2 horas a

32 °C, 900 rpm e terminada sobre gelo após a adição de 90 μΙ de tampão de glicina-NaOH a 800 mM, pH de 10 durante 5 min. A lâmina foi centrifugada durante 5 min a 2000 rpm a 15 0C. À lâmina fresca, 85 μΙ de água milliQ e 100 μΙ de coquetel de hexoquínase (kit de teste de glicose Il (HK), Instrumental Laboratory # 182507-40) e 20 μΙ de sobrenadante foram adicionados.

Para uma linha de calibração de glicose (0-1 mg/ml),,20 μΙ de estoque de adicionados ao invés disso. As lâminas foram incubadas duem temperatura ambiente no escuro, seguido por medição da absorção a 340 nm usando o Spectramax. tabela 13

desempenho Jcom relação ao tipo silvestre

glicose foram

,i ■ ■

rante 10 min

gráfico 1 300 200 150 100 75

50

ng de GA

TrGa 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

ET7-1 0,94 0,98 0,91 .0,92 0,63 0,39 3,50

0,93 1,00 1,22 0,91 0,64 0,06 -0,89

LR12 0,94 0,99. "1,17 0,83’ 0,66 -0,15 -0,99

LR8 0,94 1,01 1,16 0,99 0,55 0,17 :1,67

ET8 0,87 0,95 1,29 1,02 0,62 -0,05 -1,64

1,00 0,53 -3,99 0,62 -4,36 * -3,42 ET7 0,94 1,00 1,21 0,93 0,50 0,22 -0,62 -1,40 gráfico 2 V314H 0,95 0,97 1,24 0,91 0,78 0,54 0,74 1,89 G294Q 0,98 0,99 1,03 1,21 1,00 0,19 -0,34 -1,12 S21 0,97 0,99 1,29 1,05 0,94 0,27 -1,32 0,53 Q208N 0,97 1,01 1,13 0,95 0,90 -0,05 -1,01 -2,81 017 0,99 1,04 1,31 1,23 1,32 0,38 -1,59 -2,20 G294I 0,91 0,96 1,37 1,25 0,80 0,09 -1,20 -3,66 P94 0,98 1,00 1,24 1,09 1,05 0,29 6,29 -3,80 TrGA 1,00 1,00 1,06 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Os resultados do ensaio para determinar as taxas de produção de glicose pelas variantes de GA são mostrados nas Figuras 7 e 8. Nessas figuras, o desempenho relativo da TrGA foi calculado por quantidade de enzima adicionada. Conclusões foram extraídas da região linear do gráfico a 5 150 ng de enzima. Os resultados nas Figuras 7, 8 e tabela 13 mostraram que LR8, ET8, ET7-2, S211R, Q172F e P94N tiveram um desempenho melhor do que o tipo silvestre sobre a faixa linear.

Especificidade de substrato de LR8 - O desempenho de LR8 e do tipo silvestre de TrGA foi testado sobre substratos (amido de milho solú10 vel e dois substratos de massa de milho produzidos no Exemplo 10) usados em classificação e aplicação. Quando analisados através de HPLC, os substratos mostraram uma diferença no grau de padrão de polimerização (DP) (vide Figuras 9-11). Em NE e BSE -> = DP4 está presente, enquanto que o amido de milho solúvel consiste em pelo menos quatro ou mais moléculas 15 de glicose. Sobre todos os substratos, LR8 teve um desempenho melhor do que o tipo silvestre (vide Figuras 9, 10 e 11).

Exemplo 11: estrutura de Cristal da TrGA

A estrutura tridimensional completa da gluçoamilase de Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) (TrGA) foi determinada em uma resolução 20 de 1,9 A. A tabela 15 mostra as coordenadas para a estrutura de cristal de gluçoamilase de Trichoderma. A TrGA foi cristalizada em uma forma intacta contendo 599 resíduos e todas as modificações pós-traducionais que normalmente ocorreriam no hospedeiro natural. A estrutura de cristal foi produzida e analisada como segue.

Expressão e purificação de proteína

O gene que codifica a GA de H. jecorina foi clonado e expresso de acordo com os protocolos descritos no pedido de patente US com publi5 cação No.: US 2006/0094080 A1, por Dunn-Coleman e outros e data de publicação de 4 de Maio de 2006.

O material de proteína de TrGA usado para todos os experimentos de cristalização foi inicialmente purificado em uma etapa através de cromatografia de troca de ânions como segue: sobrenadantes de cultura con10 centrados de TrGA expressa, consistindo em 180 mg/ml de proteína total, foram preparados através de diluição de uma amostra a 1:10 em um tampão de Tris-HCI a 25 mM, pH de 8,0. Uma coluna HiPrep 16/10 Q Sepharose FF (GE Helthcare) foi empregada para a purificação por troca de ânions. A coluna HiPrep foi equilibrada com 4 volumes de coluna (CV) de tampão de ini15 ciação (Tris-HCI a 25 mM, pH de 8,0), seguido por aplicação de 10 ml da amostra de proteína diluída. Um gradiente linear de 8 CV de NaCI a 0 a 140 mM em tampão de operação (Tris-HCI a 25 mM, pH de 8,0) foi aplicado para eluir a proteína ligada. A TrGA ligada eluiu da coluna HiPrep Q sepharose em uma concentração de sal de NaCI a aproximadamente 80 mM. Frações 20 contendo a proteína de TrGA pura foram empoçadas e concentradas para 50 mg/ml usando um tubo de concentração para centrífuga Vivaspin de 25 ml (Viva Science) com um corte de peso molecular (MWCO) de 10 kD. O material de TrGA purificado e concentrado teve o tampão trocado usando uma coluna de desalinização DG-10 (Bio-Rad) e equilibrado com tampão de 25 acetato de sódio a 50 mM, pH de 4,3. As concentrações de proteína foram determinadas através de medição da absorbância a 280 nm. O estoque de proteína de TrGA inicialmente purificado e concentrado foi, após o que, armazenado a -20 °C.

Duas etapas de purificação adicionais, purificação de troca de ânions adicional e uma purificação por exclusão de tamanho, foram introduzidas para intensificar a cristalinidade do material de proteína de TrGA. Essas duas etapas de purificação adicionais foram realizadas como segue: em uma primeira etapa de purificação por troca de ânions, uma coluna MonoQ (GE Helthcare) de 10 ml foi empregada. Uma amostra de 1 ml do material de TrGA inicialmente purificado e congelado (50 mg de proteína) foi descongelada e o tampão foi trocado para Tris-HCI a 20 mM, pH de 8,0, através de 5 diluição repetida da amostra para 6 ml no novo tampão, seguido por uma concentração da amostra novamente para 0,5 ml usando um tubo de concentração com MWCO de 5 kD de 6 ml. A amostra de TrGA foi diluída após a última etapa de concentração em água destilada, até ser atingida uma condutividade da amostra de proteína a qual correspondia à condutividade 10 do tampão de iniciação da purificação de ânions, isto é, Tris-HCI a 25 mM, pH de 8,0. A coluna MonoQ foi primeiro equilibrada com 4 volumes de coluna (CV) de tampão de iniciação, seguido por aplicação da amostra de proteína diluída à coluna. A proteína ligada foi eluída da coluna MonoQ através de dois gradientes diferentes. No primeiro, um gradiente em pH linear de 4 CB 15 foi aplicado, onde o pH do tampão de iniciação foi diminuído de 8,0 para 6,0. No segundo, um gradiente de 8 CV com alta concentração de sal foi aplicado, no qual a concentração de sal foi aumentada de NaCI a 0 para 350 mM no tampão de operação (Tris-HCI a 25 mM, pH de 6,0). Descobriu-se que a TrGA ligada elui da coluna durante o segundo gradiente de sal em uma con20 centração de NaCI de aproximadamente 150 mM. Frações contendo TrGA foram empoçadas e concentradas para 2 ml usando um tubo de concentração Vivaspin com MWCO de 5 kD de 6 ml. A amostra de TrGA concentrada foi, após o que, aplicada a uma coluna de exclusão de tamanho Superdex 200 16/60 (GE Helthcare) equilibrada com 4 CV de Tris-Cl a 20 mM, pH de 25 8,0 e NaCI a 50 mM, o qual também foi usado como tampão de operação. Frações do pico de eluição principal após a purificação por exclusão de tamanho foram empoçadas e concentradas até uma concentração aproximada de proteína de 7,5 mg/ml usando um tubo de concentração Vivaspin com MWCO de 5 kD de 6 ml.

Cristalização de proteína

A amostra de proteína que foi usada para encontrar as condições iniciais de cristalização de TrGA era uma amostra do material de TrGA que foi purificado uma vez através de purificação de troca de ânions e, após o que, armazenado a -20 °C. A amostra de proteína de TrGA foi descongelada e diluída com tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH de 4,3, para aproximadamente 12 mg/ml antes dos experimentos de cristalização iniciais.

5 O conjunto de dados de raios X ortorômbico foi usado para solucionar a estrutura da TrGA através de substituição molecular (MR) e o conjunto de dados ortorômbico de alta resolução usado para o modelo da estrutura de TrGA com grupo espacial ortorômbico. Descobriu-se que os cristais de TrGA ortorômbicos prescem em solução consistindo em PEG 3350 a 25%, acetato de amônio a Ó,20M, Bis-Tris a 0,1 OM1 pH de 5,5 (solução reservatório) usando o método de difusão de vapor com gotejamento (McPherson 1982), a 20 °C. As gotas cie cristalização foram preparadas através de mistura de quantidades iguais de solução de proteína (12 mg/ml) e solução reservatório para um volume final de 10 ml. Descobriu-se que os cristais de TrGA3 pertencem ao grupo espacial ortorômbico P212121, com dimensões celulares aproximadas: a = 52,2 A, b = 99,2 A, c = 121,2 A e têm uma Vm calculada de 2,3 (Matthews 1968) com moléculas na unidade assimétrica. cLleta de dados de raios X

ol dois conjuntos de dados de TrGA ortorômbicos foram coletados de cristais únicos montados em tubos capilares vedados, em temperatura ambiente, p conjunto de dados de raios X ortorômbico de alta resolução inicial usado para solucionar a estrutura através de métodos de substituição molecular (MR) foi coletado em uma fonte de raios X no laboratório, um detector de placa de imagem MSC/Rigaku (Molecular Structures Corp., The Woodlands, Texas) Raxis IV++ com espelhos de focalização usando radiação CuKa a Dartir de um gerador de anodo giratório Rigaku RU200. Esse conjunto de dados foi processado, escalonado e a média calculada usando o software d*trek fornecido pela MSC/Rigaku. O conjunto de dados monoclínico centralizado C foi coletado a partir de um único cristal de TrGA congelado a 100K, equil brado em um agente crio-protetor compreendido de PEG 3350 a 25%, glicerol a 15%, CaCfe a 50 mM e Bis-Tris a 0,1 M, pH de 5,5 como crio-protetor, [montado em laços de fita de rayon e congelados mergulhando em nitrogênio] líquido antes de transporte para o Synchrotron. O conjunto de dados ortorônjibico de alta resolução (1,9 Á) e o conjunto de dados monoclínico centralizado C (1,8 A) foram ambos coletados em uma fonte de Synchrotron, linha de feixe 911:5 no MAX LAB em Lund, Suécia. Ambos os con5 juntos de dados que foram coletados em uma fonte de Synchrotron foram processados òom o MOSFLM e escalonados com o programa SCALA incluído no pacote de programa CCP4 (Collaborative Computational Project Number 4, 1994). Todo o processamento de dados subsequente foi realizado usando o pacote de programa CCP4 (Collaborative Computational Project 10 Number 4, 19^94), a menos que de outro modo estabelecido. Um conjunto de 5% das reflexões de cada conjunto de dados foi posto de lado e usado para monitoramento de R-Iivre (Brünger 1992).

Solução de estrutura

A estrutura da TrGA foi inicialmente solucionada através de MR com o programa de substituição automática MOLREP (Collaborative Computational Project Number 4, 1994), incluído no pacote de programa CCP4, usando o conjunto de dados ortorômbico de alta resolução inicial e usando as coordenadas da variante de GA X100 de Aspergillus. awamori (AaGA) (pdb, entradJ 1GLM (Aleshin e outros, 1992)) como modelo de busca. O modelo de biisca por GA de A. awamori foi editado para remover todas as porções de glicosilação presas à molécula de proteína como N- e Oglicosilações e todas as moléculas de solvente antes de realização dos experimentos de MR. Todas as reflexões entre uma resolução de 36,8 e 2,8 A, a partir do conjunto de dados de TrGA de alta resolução inicial, foram usadas para a solução através de MR. O programa de MR encontrou uma única solução em função da rotação, com um máximo de 11,1 σ acima da base, o próximo máximo mais alto foi 3,8 σ acima da base. A solução em função da translação proporcionou um R-fator de 48,7% e tinha um fator de contraste de 17,4. A solução por MR foi refinada para 10 ciclos de refino por mínimos quadrados restrito usando o programa Refmac 5.0 (Murshudov e outros, 1997). Isso ciminuiu o R-fator cristalográfico para 31,1%, enquanto que o valor de R-Iivre caiu de 42,2% para 41,1%. 10

20

25

30

Refino e adaptação de modelo

O

modelo de solução por MR refinado foi usado para calcular um mapa de densidade inicial a partir do conjunto de dados de TrGA ortorômbica de alta resolução. A densidade eletrônica para uma ponte de dissulfeto entre os resíduos 19 e 26 da TrGA1 uma ponte de dissulfeto não presente no modelo da estrutura da variante X100 de A. awamori, pôde ser prontamente identificada nesse mapa de densidade eletrônica. Isso foi tomado como uma indicação de que o mapa de densidade eletrônica era de qualidade suficiente para ser usado para construir um modelo estrutural da TrGA a partir de

sua sequênciá de aminoácido. O modelo da estrutura de TrGA inicial, base

í

ado no conjunto de dados de alta resolução, foi refinado com ciclos alternados de construção de modelo usando Coot (Emsley e Cowtan 2004) e o refiidade máxima usando o Refmac 5.0.

resolução do modelo de estrutura de TrGA inicial foi estendida

no de probabi A

para a resolução do conjunto de dados ortorômbico de alta resolução (1,9 Â) através de re"ino do modelo estrutural de TrGA inicial contra o conjunto de dados de altá resolução durante 10 ciclos de refino restrito usando o programa Refmac 5.0. A maioria das moléculas de água nos modelos estruturais foi localizada automaticamente usando os protocolos de captura de água em programas de refino e, então, manualmente selecionadas ou descar

tadas através

figuras foram A

de inspeção visual. Todas as comparações estruturais foram

feitas com o Coot (Emsley e Cowtan, 2004) ou O (Jones e outros, 1991) e as

preparadas com PyMOL (DeLano, 2002). partir desses resultados, pode ser observado que o segmento

'

de núcleo catalítico da TrGA seguia a mesma topologia em barril (α/α)β descrita por Aleshin e outros, 1992 para a AaGA, consistindo em um barril duplo de alfa hélices com o C-término da hélice externa levando ao N-término de uma hélice interna. Foi possível identificar diferenças chave na densidade eletrônica, tal como a ponte de dissulfeto entre os resíduos 19 e 26 e uma inserção (resíduos 257-260) com relação à AaGA. O segmento compreendendo 80-100 também sofreu reconstrução extensiva de modelo. Um principal sítio de glicosilação foi identificado em Asn 171, o qual tinha até quatro porções de glicosídeo presas. Um sítio de glicosilação similar foi identificado em AaGA. Adicionalmente, o núcleo catalítico contendo três cis-peptídeos entre os resíduos 22-23, 44-45 e 122-123 era conservado entre a TrGA e a AaGA. Em gejral, havia uma variação rms de 0,535 A entre 409 de 453 áto5 mos de Ca quando de comparação das coordenadas dos núcleos catalíticos da TrGA e AapA.

Exemplo 12: homologia entre TrGA e GA de Aspergillus awamori

Alestrutura de cristal da TrGA identificada no Exemplo 11 foi superposta sobrp a estrutura de cristal previamente identificada da GA de As

j

pergillus awamori (AaGA). A estrutura de cristal da AaGA foi obtida do banco de dados de proteína (PDB) e a forma da AaGA que cristalizou foi a forma contendo apenas um domínio catalítico. A estrutura da glucoamilase de Trichoderma reesei, com todas as três regiões intactas, foi determinada em uma resolução de 1,8 Angstroms aqui (vide tabela 15 e Exemplo 11). Usan15 do as coordenadas (vide tabela 15), a estrutura foi alinhada com as coordej

nadas do domínio catalítico da cepa X100 de Aspergillus awamorii, que foi determinada previamente (Aleshin, A.E., Hoffman, C., Firsov, L.M. e Honzatko, R.B. 1994 Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori var. X100. J Mol Biol 238: 575-591 e o PDB). Conforme observado 20 nas Figuras 12 e 13, a estrutura do domínio catalítico se sobrepôs muito intimamente e permitiu a identificação de resíduos equivalentes baseado nessa superposição estrutural.

Baseado nesse análise, foram identificados sítios que poderiam sofrer mutaçãb na TrGA e resultar em estabilidade e/ou atividade específica 25 aumentada. Esses sítios incluem 108, 124, 175 e 316 no sítio ativo. Também foram identificadas variantes aos pares específicas Y47W/Y315F e Y47F/Y315W; Em virtude da alta homologia estrutural, espera-se que variantes benéficas! encontradas nos sítios na GA de Trichoderma reesei tenham conseqüências similares em Aspergillus awamori e outras glucoamilases 30 homólogas.

Varias modificações e variações dos métodos e sistema descrito da invenção sjerão evidentes para aqueles versados na técnica sem se desviar I e € moc

rme

ífice

da

m a 52.

1

2

3

4

5

6

7

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11

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13

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19

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21

22

23

24

25

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27

28

29

30

31

32 I

33

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38

39

40

101

spírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita com alidades preferidas específicas, deve ser entendido que a invenreivindicado, não estará indevidamente limitada a tais modalida>. Na verdade, diversas modificações dos modos descritos para nvenção os quais são óbvios para aqueles versados na técnica jstar dentro do escopo das reivindicações em anexo.

85 99 . 000000 .000000 .000000 .019163 .000000 .000000

232 121. 0.000000 1.000000 0.000000 -0.000001 0.010077 0.000000

240 0 0 1

90.00 000000 000000 OOOOÜO -0.000001 0.000000 0,008248

90.00

N SER A 1 -30.485 CA SER A 1 -30.568 CB SER A 1 -31.953 OG SER A 1 -32.137 C SER A 1 -29.519 O SER A 1 -29.043 N VAL A 2 -29.170 CA VAL A 2 -28.302 CB VAL A 2 -28.142 CGl VAL A 2 -27.349 CG2 VAL A 2 -27.468 C VAL A 2 -28.846 O VAL A 2 -28.086 N ASP A 3 -30.160 CA. ASP A 3 -30.791 CB A SP A 3 -32.283 CG ASP A 3 -32.522 ODl ASP A 3 -32.413 OD 2 ASP A 3 -32.786 C ASP A 3 -30.556 O ASP A 3 -30.282 N ASP A 4 -30.644 CA ASP A 4 -30.369 CB ASP A 4 -30.601 CG ASP A 4 . -32.088 ODl ASP A 4 -32.991 OD2 ASP A 4 -32.340 C ASP A 4 -28.925 O ASP A 4 -28 . 697 N PHE A 5 -27.961 CA PHE A 5 -26.553 CB PHE A 5 -25.666 CG PHE A 5 -24.244 CDl PHE A 5 -23.395 CEl PHE A 5 -22.063 CZ PHE A 5 -21.593 CE2 PHE A 5 -22.425 CD2 PHE A 5 -23.749 C PHE A 5 -26.352 O PHE A 5 -25.659 30

29

28

28

28

28

27 26

25

24

26

25 25

25 24. 24.

23. 22.

24.

25.

24.

26 .

27.

28. 29 .

28 . 30. 27 .

26. 27. 26. 27 . 26. 27 . 26.

25. 25. 25. 25. 25 .

.567

.350

.707

.089

.345

.415

.425

.293

.339

.103

.057

.506

.109

.286

.530,

.323

.492

.251

.092

.153

.446

.477

.244

.731

.121

.260

332

049

881

096

860

110

646

259

823

783

181

617

438

244

90.00 0.00000 00000 00000 00000 óoooo 0.00000 21.185 20.326 20.424 21.695 20.772 21.911 19.867 20.179 18.955 19.316 17 .827 21.363 22 .245 21.381

22 .457 22,190 20.943 21,028 19.870

23 .818 24.778

23 .875 25.083

24 .822 24 .785 24.925 24.608 25.579 26.770 24.660 24.994 23 .764 23 .931 24.854 25.009 24.228 23 .286 23 .144 25.539 26 . 544

1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 í.oo 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

00

00

00

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00

00

00

1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

37.11 37.00

37.27

40.11 35.91 35 .46

34.51

33.56 33 .84

34.20

34.79 32 .48 31.10 31.43 31.38 32.17

35.28

36.80 40.63

30.59 30.19 29.89 29.99

31.12 34.16 36.06 39.96 28.65

28.51 ■26.74

25.21

25.59 26.03 27 .29 27.33' 26.77

28.42

28.42 24.23

23.56 ATOM 212 CD2 PHE A 29 -10 .611 17.408 -46 .973 1 .00 22 .71 ATOM 213 C PHE A 29 -6 .853 16.783 -45 .296 1 .00 19.10 ATOM 214 0 PHE A 29 -5 . 862 17.501 -45 .224 1, .00 19.40 ATOM 215 N GLY A 30 -6 .830 15.558 -45 .816 1, .00 18,73 ATOM 216 CA GLY A 30 -5 .603 15.008 -46. ,398 1, .00 19.00 ATOM 217 C GLY A 30 -4 .717 14.307 -45, .399 1, ,00 19.69 ATOM 218 0 GLY A 30 -3 .657 13.809 -45, .768 1, .00 19.61 ATOM 219 N THR A 31 -5 <133 14.255 -44, .123 1, ,00 18.86 ATOM 220 CA THR A 31 -4 J 450 13.384 -43, .165 1, .00 19.14 ATOM 221' CB THR A 31 -4 .846 13.689 -41 .689 1 .00 18.79 ATOM 222 OGl THR A 31 -6 .265 13.579 -41, . 559 1, .00 18.61 ATOM 223 CG 2 THR A 31 -4 .410 15.106 -41, ,262 1, .00 16.47 ATOM 224 C THR A 31 -4 .812 11.925 -43, .498 1, ,00 19.11 ATOM 225 0 THR A 31 -5 .713 11.661 -44, ,313 1, ,00 19.69 ATOM 226 N SER A 32 -4 . 107 10.982 -42, .881 1, .00 19 .74 ATOM 227 CA SER A 32 -4 .367 9.554 -43, .094 1, .00 20.00 ATOM 228 CB SER A 32 -3 .411 8.722 -42, .248 1, ,00 20.73 ATOM 229 OG SER A 32 -2 .064 8.973 -42, ,612 1, .00 21.56 ATOM 230 C SER A 32 -5 .!806 9.217 -42, ,704 1, ,00 20.57 ATOM 231 0 SER A 32 -6.334 9.778 -41, ,732 1, .00 20.70 ATOM 232 N ALA A 33 -6 .443 8.319 -43 ,452 1, .00 19.94 ATOM 233 CA ALA A 33 -7 .768 7.823 -43, ,068 1. .00 19.61 ATOM 234 CB ALA A 33 -8 .232 6.729 -44, , 035 1. ,00 19 .31 ATOM 235 C ALA A 33 -7 .764 7.285 -41 , 637 1, .00 19.10 ATOM 236 0 ALA A 33 -6 .906 6.482 -41, ,264 1. ,00 19.49 ATOM 237 N GLY A 34 -8 .742 7.719 -40, ,856 1, .00 17.74 ATOM 238 CA GLY A 34 -8 . 878 7 .282 -39, ,473 1, .00 18.31 ATOM 239 C GLY A 34 -7 .988 8.020 -38, ,473 1, .00 18 .48 ATOM 240 0 GLY A 34 -8 .050 7.739 -37, ,271 1, .00 19.07 ATOM 241 N ALA A 35 -7 .173 8.959 -38, .937 1, ,00 17.05 ATOM 242 CA ALA A 35 -6 .329 9 .723 -38, , 000 1, ,.00 17 .17 ATOM 243 CB ALA A 35 -5 .167 10.376 -38, ,730 1, ,00 17.10 ATOM 244 C ALA A 35 -7 .173 10.784 -37, ,271 1. .00 16.55 ATOM 245 0 ALA A 35 -8 .174 11.271 -37, .808 1, .00 17.35 ATOM 246 N VAL A 36 -6 .793 11.130 -36, .051 1, .00 15 .39 ATOM 247 CA VAL A 36 -7 .490 12.198 -35, ,328 1. ,00 14.41 ATOM 248 CB VAL A 36 -8 .142 11.687 -34, ,031 1, .00 15.02 ATOM 249 CGl VAL A 36 -8 .903 12.828 -33, ,349 1, .00 16.72 ATOM 250 CG 2 VAL A 36 -9 . 081 10.520 -34. ,336 1.00 16.45 ATOM 251 C VAL A 36 -6 .407 13.201 -34, ,944 1, ,00 14.36 ATOM 252 0 VAL A 36 -5 4 2 I 12.816 -34, ,311 1, .00 14.44 ATOM 253 N ILE A 37 -6 j 566 14.454 -35, ,331 1, ,00 13 .68 ATOM 254 CA ILE A 37 -5 .614 15.470 -34, .893 1, ,00 13 .67 ATOM 255 CB ILE A 37 -5 .528 16.687 -35, .849 ■1, .00 13 .66 ATOM 256 CGl ILE A 37 -6 .847 17.486 -35. .901 1, ,00 14.31 ATOM ■ 257 CDl ILE A 37 -6 .773 18.712 -36, .864 1, .00 14.21 ATOM 258 CG2 ILE A 37 -5 .158 16.214 -37. ,260 1. ,00 14.62 ATOM 259 C ILE A 37 -6 .041 15.908 -33 . ,505 1, ,00 13 .27 ATOM 260 0 ILE A 37 -7 .235 16.011 -33. .224 1, ,00 12.99 ATOM 261 N ALA A 38 -5 .081 16.159 -32, ,630 1, ,00 13.03 ATOM 262 CA ALA A 38 -5 .445 16.697 -31. .333 1, ,00 12 . 81 ATOM 263 CB ALA A 38 -4 .2 35 16.680 -30, .377 1, ,00 12 .73 ATOM 264 C ALA A 38 -6 J 046 18.122 -31, .497 1, ,00 12 .45 ATOM 265 0 ALA A 38 -6 .939 18.503 -30, .775 1, ,00 12.23 ATOM 266 N SER A 39 -5 .555 18.870 -32, .482 1 .00 12.90 ATOM 267 CA SER A 39 -5 .973 20.246 -32. ,769 1. ,00 12.85 ATOM 268 CB SER A 39 -5 . 512 21.211 -31, , 657 1. ,00 12 .63 aí^HOoocNVovovovooinHvovDrgovD^r-ifinHHO^HoSHmoomOkDvxjH^ojojQOOt^fOin^ío^^Droojr-r-^Hiíic^ocvj mmoo^oor-^VDrMcor-CN^oovoooco^-sítrirHinHfhin^vDoj^hoo^oiníNiyjinHnco^Hco^o^ncoHocoMVDncofyjo

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19.41 ATOM 456 CG ASN A 61 -18, ,465 11.375 -27, ,643 1 .00 22.93 ATOM 457 ODl ASN A 61 -19, ,585 11.057 -27, ,231 1 .00 30.05 ATOM 458 ND2 ASN A 61 -18, ,206' 12.568 -28, ,130 1 .00 29.54 ATOM 459 C ASN A 61 -18, ,480 8.659 -28, .907 1 .00 17.28 ATOM 460 O ASN A 61 -19, , 697 8.475 -28, .852 1 .00 18.11 ATOM 461 N LEU A 62 -17. 799 8.647 -30 , ,056 1 .00 16.54 ATOM 462 CA LEU A 62 -18, ,460 8.379 -31, .334 1 .00 16.19 ATOM 463 CB LEU A 62 -17. ,479 8.572 -32, .499 1 .00 16.85 ATOM 464 CG LEU A 62 -17, , 047 10.027 -32, ,697 1 .00 18.47 ATOM 465 CDl LEU A 62 -16. , 118 10.153 -33 , .916 1 .00 20.38 ATOM 466 CD2 LEU A 52 -18, ,2 63 10.925 -32 .837. 1.00 19.93 ATOM 467 C LEU A 62 -19, ,089 6.991 -31, .371 1 .00 16.01 ATOM 468 0 LEU A 62 -20, ,225 6.833 --- 31 .842 1 .00 15.98 ATOM 469 N ILE A 63 -18, ,387 5.998 -30, .831 1 .00 15.67 ATOM 470 CA ILE A 63 -18. 910 4.628 -30, .810 1 .00 15.86 ATOM 471 CB ILE A 63 -17, ,803 3 .610 -30, .372 1 .00 15.88 ATOM 472 CGl ILE A 63 -16, ,756 3.466 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ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo ATOM 611 OEl GLU A 79 -16.345 0 328 -42 670 1.00 26.99 ATOM 612 0E2 GLU A 79 -17.579 -1 012 -41 .425 1.00 25.69 ATOM 613 C GLU A 79 -12.418 1 918 -39 704 1.00 18.80 ATOM 6l4 0 GLU A 79 -11.450 1 191 -39 507 1.00 19 .44 ATOM 615 N GLN A 80 -12.301 3 147 -40 .211 1.00 18.84 ATOM 6lè CA GLN A 80 -10.998 3 661 -40 636 1. 00 17 .90 ATOM 61Í CB GLN A 80 -11.149 4 921 ,-41 .482 1.00 18.92 ATOM 618 CG GLN A 80 -11.794 4 593 -42 844 1.00 21.99 ATOM 619 CD GLN A 80 -12.040 5 799 -43 707 1.00 27 .48 ATOM 620 OEl GLN A 80 -12.265 6 898 -43 223 1.00 30.45 ATOM 521 NE2 GLN A 80 -12.037 5 585 -45 013 1.00 32 .63 ATOM 622 C GLN A 80 -10.059 3 892 -39 456 1.00 17 .64 ATOM 52Í 0 GLN A 80 -8.862 3 612 -39 535 1.00 17.21 ATOM 624 N TYR A 81 -10.607 4 408 -38 365 1.00 17.29 ATOM 625 CA TYR A 81 -9.839 4 552 -37 122 1.00 17.64 ATOM 626 CB TYR A 81 -10.750 5 139 -36 023 1.00 17 .24 ATOM 627 CG TYR A 81 -10.188 4 973 -34 621 1.00 17 .79 ATOM 6 2 é CDl TYR A 81 -9.085 5 728 -34 184 1.00 16.36 ATOM 62S) CEl TYR A 81 -8.561 5 568 -32 882 1.00 17.45 ATOM 630 CZ TYR A 81 -9.146 4 646 -32 009 1.00 16.35 ATOM 63ll OH TYR A 81 -8.654 4 457 -30 724 1.00 17.06 ATOM 632 CE2 TYR A 81 -10.238 3 890 -32 423 1.00 17.51 ATOM 633 CD2 TYR A 81 -10.754 4 055 -33 729 1.00 17.00 ATOM 634 C TYR A 81 -9.271 3 197 -36 686 1.00 18 .04 ATOM 635 0 TYR A 81 -8.098 3 083 -36 321 1.00 17 .85 ATOM 636 N ILE A 82 -10.096 2 159 -36 746 1.00 17 .99 ATOM 637 CA ILE A 82 -9.661 0 839 -36 295 1.00 19.35 ATOM 638 CB ILE A 82 -10.844 -0 166 -36 187, 1.00 18.93 ATOM 639 CGl ILE A 82 -11.753 0 233 -35 017 1.00 19.40 ATOM 64C CDl ILE A 82 -13.093 -0 565 -34 896 1.00 20.46 ATOM 641 CG2 ILE A 82 -10.301 -1 587 -35 984 1..00 20.61 ATOK 642 C ILE A 82 -8.547 0 292 -37 194 1. QO 19 .92 ATOM 643 0 ILE A 82 -7.543 -0 239 -36 708 1.00 20.26 ATOM 644 N THR A 83 -8.713 0 432 -38 503 1.00 20.05 ATOM 645 CA THR A 83 -7.709 -0 100 -39 406 1.00 21.11 ATOM 646 CB THR A 83 -8.241 -0 297 -40 845 1.00 21.63 ATOM 647 OGl THR A 83 -8.830 0 902 -41 306 1.00 25.88 ATOM 648 CG2 THR A 83 -9.330 -1 347 -40 851 1.00 21.56 ATOM 649 C THR A 83 -6.410 0 690 -39 337 1.00 20.59 ATOM 650 0 THR A 83 -5.338 0 105 -39 511 1.00 20.72 ATOM 651 N ALA A 84 -6.494 1 997 -39 050 1.00 19.51 ATOM 652 CA ALA A 84 -5.292 2 809 -38 777 1.00 19.37 ATOM 653 CB ALA A 84 -5.652 4 290 -38 507 1.00 19.42 ATOM 654 C ALA A 84 -4.436 2 231 -37 643 ■1.00 19 . 32 ATOM 655 0 ALA A 84 -3 .208 2 370 -37 649 1.00 19 .47 ATOM 656 N GLN A 85 -5.063 1 535 -36 695 1.00 19.34 ATOM 657 CA GLN A 85 -4.325 0 998 -35 544 1.00 18.78 ATOM 658 CB GLN A 85 -5.266 0 609 -34 396 1.00 19 .29 ATOM 659 CG GLN A 85 -6.260 1 735 -34 007 1.00 17 .98 ATOM 660 CD GLN A 85 -5.593 3 098 -33 830 1.00 17.20 ATOM 661 OEl GLN A 85 -6.021 4 095 -34 418 1.00 20.82 ATOM 662 NE2 GLN A 85 -4.540 3 143 -33 034 1.00 13.47 ATOM 663 C GLN A 85 -3.447 -0 178 -35 932 1. 00 19.08 ATOM 664 0 GLN A 85 -2.478 -0 473 -35 251 1.00 17.94 ATOM 665 N VAL A 86 -3.808 -0 838 -37 032 1.00 19 .32 ATOM 666 CA VAL A 86 -2.999 -1 928 -37 588 1.00 20.79 ATOM 667 CB VAL A 86 -3.670 -2 581 -38 823 1.00 21.18 726

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CG PRO A 94 10 .988 7 .653 -30 .753 1 .00 19 .96 CD PRO A 94 9 .952 6 .717 -31 .325 1 .00 19 .99 C PRO A 94 10 .870 4 .898 -28 .263 1 .00 20 .64 O PRO A 94 11 .756 4 .727 -27 .430 1 .00 20 . 54 N SER A 95 9 .610 4 .485 -28 , 073 1 .00 20 .36 CA SER A 95 9 .264 3 .674 -26 .902 1 .00 21 .00 CB SER A 95 7 , ,770 3, ,736 VO ,587 1, ,00 20 .05 CN I OG SER A 95 7, .413 5 .036 -26, .147 1 .00 19 .97 C SER A 95 9 .679 2 .204 -27 .066 1 .00 21 .73 O SER A 95 9 .8 09 1 .499 -26, . 072 1 .00 22 .10 N GLY A 96 9, .853 1, .748 -28, ,306 ' 1, .00 21 .90 CA GLY A 96 10, .229 0 .350 ί ,562 1 .00 23 .56 to OO C GLY A 96 9, , 506 -0, .196 -29 , ,774 1 .00 24 .14 O GLY A 96 9 .121 0 .557 -30 .664 1 .00 24 .24 N SER A '91 9, ,315 -1, , 510 -29, ,828 1, .00 25 .24 CA SER A 97 8, ,703 -2 , ,116 -31, ,000 1, .00 25 .77 CB SER A 97 9, ,751 -2 , ,874 -31, .834 1, ,00 27 .15 OG SER A 97 10 ,120 -4 .086 -31, .189 1 .00 30 .57 C SER A 97 7 , .590 -3, ,042 -30, ,571 1, ;οο 25 .27 O SER A 97 7 , ,346 -3, .199 -29. ,376 1 .00 24 .85 N LEU A 98 6, .930 -3, .655 -31, ,543 1 .00 24 .82 CA LEU A 98 5 , ,826 -4, .559 -31, ,252 1, ,00 25 .88 CB LEU A 98 4, ,982 -4, .813 -32 , ,504 1 .00 25 .31 CG LEU A 98 3, ,714 -5. ,673 -32 . ,420 1, .00 25 .89 CDl LEU A 98 2, ,745 -5, ,169 -31, ,337 1, .00 25 .58 CD2 LEU A 98 3 , ,006 -5, ,724 -33. ,778 1, .00 26 .27 C LEU A ,98 6 .310 -5 .866 -30, .604 1 .00 26 .75 O LEU A 98 5 . , 607 -6, , 43δ -29. , 762 1. ,00 27 .41 N ALA A 99 7 , ,528 -6, ,290 -30, ,950 1, ,00 27 .23 CA ALA A 99 8, .074 -7 , ,590 -30, ,533 1, ; οο 27 .89 CB ALA A 99 9, ,566 -7, ,700 -30, ,935 1, ,00 27 .68 C ALA A 99 7. ,893 -7. ,911 -29. ,053 1, ,00 27 .86 O ALA A 99 7 , ,450 -9, ,007 -28, ,711 1, ,00 28 .77 N ASP A 100 8. ,241 -6, .966 -28. ,181 1, ,00 27 .75 CA ASP A 100 8, : 030 -7 , .137 -26. ,741 1 .00 27 .20 CB ASP A 100 9. .328 -6, .937 -25, ,966 1 .00 27 .10 CG ASP A 100 9. ,845 -5. ,525 -26. 038 1. ,00 30 .19 ODl ASP A 100 10, ,891 -5, ,281 -25. ,419 1, .00 32 .28 OD2 ASP A 100 9, ,225 -4 , ,654 -26, ,694 1, .00 30 .36 C ASP A 100 6, ,905 -6. ,256 -26, ,173 1, .00 25 .74 O ASP A 100 6. ,761 -6, , 108 -24. 956 1, ,00 26 .33 N GLY A 101 6, ,118 -5, ,683 -27. ,075 1, .00 24 .93 CA GLY A 101 4 , .982 -4 , ,853 -26. ,707 1, .00 23 .22 C GLY A 101 5 , ,326 -3 , ,418 -26. ,342 1, ,00 22 .68 O GLY A 101 4. ,419 -2 , ,580 -26. ,287 1 , ,00 21 .48 N SER A 102 6, ,609 -3 , ,117 -26. ,126 1, .00 ,21 .53 CA SER A 102 6, ,996 -1, ,815 -25. ,563 1, ,00 21 .49 CB SER A 102 8, .483 -1 .739 -25, .199 1 .00 22 .07 OG SER A 102 9, .283 -1, .958 -26, .345 1 .00 21 .77 C SER A 102 • 6, ,604 -0, ,643 -26, ,449 1, ,00 20 .66 O SER A 102 6, ,279 0. ,403 -25. ,925 1, ,00 20 .67 N GLY A 103 6. , 636 -0, ,819 -27. .771 1, ,00 19 .97 CA GLY A 103 6, ,257 0, ,255 -28. ,707 1, ,00 19 .46 C GLY A 103 4. ,824 0. 777 -28. 539 1. ,00 18 .94 O GLY A 103 4. ,525 1. ,903 -28. ,945 1, ,00 18 .13 N LEU A 104 3 . 939 -0. 043 -27. 956 1. ,00 18. .13 CA LEU A 104 2, ,517 0. ,326 -27, ,818 1, ,00 16 .92 > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > 7* > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > h3 ►9 ►9 ►9 ►9 β *-3 ►9 ►3 ^9 »9 ►9 ►9 >9 »9 »9 ►9 >9 β »9 β β β >9 ►9 β »9 ♦9 β β β β *9 β ►9 β *-3 *9 ►9 ►9 ►9 ►9 *-9 »-9 *-3 β •-3 ►9 ►9 *-3 ►9 O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O ο O O O O O O O ο O O O O O O O O O O O O O O O O S O O O S S 3 S S S S S s: X S S £ S £ S S S S S S 3! S S S S S S S S S S S 3 S S S S S s: S S 00 00 00 00 00 OO GD OD OO OO OO OO OO OO CO 00 CO 00 CO 00 OO OO 00 α> 00 OO 00 00 CD 00 oci 00 00 00 OO 00 00 00 00 00 00 00 QO 00 00 00 00 00 Qo OO OO 00 00 00 00 OD CD VO VD VO VO VO VO OO OO OO OQ CO OO OO OO CO 00 -J -j ο -J -j -j -J -J -J α\ σ\ σ> σ\ σ» σ> (Ti σ\ σ\ σι cn VJl cn cn cn cn cn (Tl Cn cn ■£» £*- l> OJ Ul Φ» OJ CO I-* O VO CD -J σ\ VJl u> to l·* O VO 00 O σ> UI LO to »-* ο VO CO -J σ> υ> CO Ν> H ο VO QO -J σ\ cn £* OJ to >-* o VO 00 -J CD cn OJ N) j-» O VO O O O O O O O O O O O O O O O O O ϊϊ O O O O O O O O 2! η O η η η O O O O η O n !3 O O O O n O O O O O O O > Ci O to > ü W N PJ σ O ro > ϋ O CXJ > N η O O Cd > α O <π DJ > Ω Q tu > σ D O Cd to I-* M to V-* M ÍO Hk ÍO K-* CO f-* O Ω ►9 β ►9 ►9 *-3 ►9 »-3 tO hO tXJ >tí *ü ♦d *α ►ü rO >τ3 *d ►d rO "d iO tr· Ct IT1 tr* t* tr tr IT tr tr tr tr tr tr tr tr *9 *9 *9 ►9 ►9 β v9 tr tr tr tr tr tr tr t- X K a: X x X S X X d: X X Pí tc X X Pd Pd Pd Pd ?ΰ να ?ο ►< K < η: ►< «ί Η? *< Dd M M M M W W M X 33 X X rc K W M W W W M *< ►< VO PtJ * VO VO Pd η m m W W W W W W W W O O O O O ο O W ίη ιη W CO W W OT C G C C C a C C PO VO VO VO PO c: G G G G G > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > > CD CD -J -j -0 -J -J ---J -J Oi OY cr> cr» Ol oi σι cr> σ> cn o> cn cn cn Ul CH cn & »&> OJ OJ OJ OJ OJ OJ OJ OJ to to IO to to to to I-* M H» h-1 I-1 \ \ \ ttlltl

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O LYS A 140 -22.053 ATOM 1070 N TRP A 141 -21.062 ATOM 1071! CA TRP A 141 -22.054 ATOM 1072 CB TRP A 141 -21.847 ATOM 1073 CG TRP A 141 -22.973 ATOM 1074 CDl TRP A 141 -24.113 ATOM 1075 NEl TRP A 141 -24.921 ATOM 1076; CE2 TRP A 141 -24.302 ATOM 1077 CD2 TRP A 141 -23.078 ATOM 1078 CE3 TRP A 141 -22.248 ATOM 1079 CZ3 TRP A 141 -22.669 ATOM 1080 CH2 TRP A 141 -23.891 ATOM 1081 CZ2 TRP A 141 -24.721 ATOM 1082 C TRP A 141 -22.078 ATOM 1083 O TRP A 141 -23.155 ATOM 1084 N LEU A 142 -20.904 ATOM 1085 CA LEU A 142 -20.806 ATOM 1086 CB LEU A 142 -19.361 ATOM 1087, CG LEU A 142 -18.754 ATOM 1088 CDl LEU A 142 -17.274 ATOM 1089 CD2 LEU A 142 -19.424 ATOM 1090 C LEU A 142 -21.406 ATOM 1091 O LEU A 142 -22.195 ATOM 1092 N ILE A 143 -21.045 ATOM 1093 CA ILE A 143 -21.596 ATOM 1094 CB ILE A 143 -20.959 ATOM 1095 CGl ILE A 143 -19.474 ATOM 1096 CDl ILE A 143 -18.707 ATOM 1097 CG2 ILE A 143 -21.720 ATOM 1098 C ILE A 143 -23.124 ATOM 1099 O ILE A 143 -23.813 ATOM 1100 N ASN A 144 -23.655 ATOM 1101 CA ASN A 144 -25.109 ATOM 1102 CB ASN A 144 -25.479 ATOM 1103 CG ASN A 144 -26.960 ATOM 1104 ODl ASN A 144 -27.444 ATOM 1105 ND2 ASN A 144 -27.685 ATOM 1106 C ASN A 144 -25.820 ATOM 1107 O ASN A 144 -27.012 ATOM 1108 N ASN A 145 -25.094 ATOM 1109 CA ASN A 145 -25.705 ATOM 1110 CB ASN A 145 -25.526 ATOM 1111 CG ASN A 145 -26.397 ATOM 1112 ODl ASN A 145 -27.576 ATOM 1113 ND2 ASN A 145 -25.834 ATOM 1114 C ASN A 145 -25.285 ATOM 1115 O ASN A 145 -25.412 ATOM 1116 N ASN A 146 -24.789 ATOM 1117 CA ASN A 146 -24.475 ATOM 1118 I CB ASN A 146 -25.710 ATOM 1119 CG ASN A 146 -26.994 ATOM 1120 ODl ASN A 146 -27.033 ATOM 1121 ND2 ASN A 146 -28.047 ATOM 1122 C ASN A 146 -23.266 ATOM 1123 O ASN A 146 -23.216 -2 .725 -22 .954 -5 .001 -29 .584 -5 .823 -29 .670 -3 .898 -30 .321 -3 .613 -31 .338 -2 .226 -31 .953 -I .833 -32 . 874 -I .170 -32 .531 -I .016 -33 .638 -I .575 -34 .722 -2 .115 -34 .276 -2 .766 -35 ,203 -2, .858 -36, ,532 -2 .304 -36, ,940 -I. ,666 -36, , 051 -4 .666 -32, ,448 -5 , .152 -32, ,831 -4 .991 -32, ,985 -6 .024 -34, ,010 -6 .199 -34, .473 -5, .023 -35, ,252 -5, .304 -35, .441 -4, .793 -36, ,624 -7 .364 -33, .556 -7, .966 -34, .283 -7 .814 -32, .359 -9 .040 -31, .792 -9 .362 -30, .425 -9 .722 -30, .609 -9 .814 -29, .301 -10, ,494 -29, ,717 -8. ,992 -31, , 682 -9 .928 -32, ,118 -7 , ,916 -31, ,111 -7 ,768 -30, ,988 -6, , 522 -30, , 186 -6, .489 -29, ,792 -7 , .350 -29, ,041 -5, .488 -30, ,291 -7 , ,760 -32. 341 -8, ,029 -32 , ,411 -7 , ,460 -33, ,411 -7 , ,403 -34, ,726 -6, ,014 -35, ,331 -4, .986 -34, .639 -4, , 841 -34, ,969 -4, , 289 -33, , 647 -8, .533 -35. , 671 -8, ,415 -36. 902 -9, ,618 -35, , 065 -10, ,885 -35. ,736 -11, ,459 -36. ,461 -11, ,280 -35. ,657 -11 . 543 -34, .450 -10, . 814 -36, ,321 -10, ,795 -36, ,652 -11, ,419 -37. ,724 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

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00

00

00

00

00

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24.17

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40.10

32 .17

32.73

32.19

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34.31

33.13

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34.14 34.85

37.41

41.43 41.54 33 .92 33 .76 ATOM 1181 ND2 ASN A ATOM 1182 C ASN A ATOM 1183 0 ASN A ATOM 1184 N VAL A ATOM 1185 CA VAL A ATOM 1186 CB VAL A ATOM 1187 CGl VAL A ATOM 118é CG2 VAL A ATOM 11 SSf C VAL A ATOM 1190 0 VAL A ATOM 1191 N ILE A ATOM 1192 CA ILE A ATOM 1193: CB ILE A ATOM 1194 CGl ILE A ATOM 1195 CDl ILE A ATOM 1196 CG2 ILE A ATOM 1197 C ILE A ATOM 1198 0 ILE A ATOM 1199 N TRP A ATOM 1200 CA TRP A ATOM 1201) CB TRP A ATOM 1202 CG TRP A ATOM 1203 ' CDl TRP A ATOM 1204 NEl TRP A ATOM 1205 CE2 TRP A ATOM 1206 CD2 TRP A ATOM 1207 CE3 TRP A ATOM 1208 CZ3 TRP A ATOM 1209 CH2 TRP A ATOM 1210 CZ2 TRP A ATOM 1211 C TRP A ATOM 1212 0 TRP A ATOM 1213 N PRO A ATOM 1214 CA PRO A ATOM 1215 CB PRO A ATOM 1216 CG PRO A ATOM 1217 CD PRO A ATOM .1218 C PRO A ATOM 1219 0 PRO A ATOM 1220 N ILE A ATOM 1221 CA ILE A ATOM 1222 CB ILE A ATOM 1223 CGl ILE A ATOM 1224 CDl ILE A ATOM 1225 CG2 ILE A ATOM 1226 C ILE A ATOM 1227 0 ILE A ATOM 1228 N VAL A ATOM 1229 CA VAL A ATOM 1230 CB VAL A ATOM 1231 CGl VAL A ATOM 1232 CG 2 VAL A ATOM 1233 C VAL A ATOM 1234 0 VAL A ATOM ■ 1235 N ARG A ATOM 1236 CA ARG A ATOM 1237 CB ARG A 153 -10 .917 -14 .444 153 O .060 -10 .272 I 153 -8 .850 I .213 O 154 -10 .810 -9 .193 154 -10 .251 -7 . 854 154 -11, .217 -6 .925 154 -10, .565 -5 .577 154 -11 .654 -7 .585 154 -9 .824 -7 .211 154 -8, .722 -6, , 678 155 -10, .685 -7 , ,288 155 -10. .525 -6, ,459 155 -11, ,900 -5, ,972 155 -12, .596 -5 .128 155 -14, .006 -4, .680 155 -11, ,731 -5, ,144 155 -9, ,710 -7, .136 155 -8. ,789 -6, .537 156 . -10, ,006 -8, ,409 156 -9 .392 -9 .099 156 -9, ,958 -10, ,520 156 -9 , ,298 -11, ,245 156 -8, ,420 -12, ,298 156 -8 .011 -12, .680 156 -8, ,600 -11, ,863 156 -9 , ,416 -10, ,941 156 -10, ,139 -9, ,983 156 -10, ,024 -9. ,982 156 -9, ,206 -10, ,910 156 -8 .495 -11, .861 156 -7 , ,845 -9, ,109 156 -7 , ,235 -8, ,945 157 -7 , ,209 -9. ,303 157 -5, ,726 -9 , ,258 157 -5, ,378 -9. ,459 157 -6, ,583 -10, ,172 157 . -7. 762 -9. 596 157 -5, ,162 -7 , .898 157 -4, , 092 -7 , ,837 158 -5, ,881 -6, ,821 158 -5. ,457 -5. .467 158 -6 ,273 -4, .348 158 -6, ,261 -4. ,527 158 -7 , ,229 -3 . ,640 158 -5, .686 -2 , ,971 158 -5, ,632 -5, ,366 158 -4, .701 -5, ,023 159 -6, .840 -5 , ,704 159 -7. ,201 -5. ,624 159 -8, .687 -6, ,026 159 -9, .046 -6, ,028 159 -9. ,604 -5, ,090 159 -6. 280 -6, 501 159 -5. .794 -6, ,089 160 -6. ,022 -7, 721 160 -5, ,171 -8, ,633 160 -5, , 078 -10, ,005 -38.383 1 .00 37.61 -37.787 1 .00 32.10 -38.020 1 .00 32.79 -37.577 1 .00 30.55 -37.750 1 .00 28.93 -38.537 1 .00 29.03 -38.827 1 .00 29.23 -39.860 1 .00 29 .87 -36.414 1 .00 27.28 -36.306 1 . 00 26.96 -35.403 1 .00 25.13 -34.197' 1 .00 23.05 -33 . 670 .1 .00 23 .10 -34.741 1 .00 22.49 -34.375 1 .00 22.72 -32.399 1 .00 23.05 -33.092 1 .00 22.44 -32.533 1 .00 21.14 -32.822 1 .00 21.48 -31.696 1 .00 21.75 -31.511 1 .00 22.50 -30.371 1.00 23.43 -30.461 1 .00 24.92 -29.198 1 .00 24.85 -28.269 1 .00 26.38 -28.970 1 .00 25.03 -28.236 1 .00 25.01 -26.844 1 .00 24.30 -26.185 1 .00 23 . 97 -26.875 1 .00 24 .60 -31.699 1 .00 21.52 -30.648 1 .00 21.78 -32.870 1 .00 21.66 -32.878 1 .00 21.40 -34.360 1 .00 21.26 -34.955 1 .00 22.82 -34.207 1 ,00 21.45 -32.410 1. .00 21.30 -31.795 1 .00 21.11 -32.724 1 .00 20.52 -32.318 1 .00 19.93 -33.034 1 .00 19.73 -34.559 1 ,00 21,25 -35.351 1 .00 20 .03 -32.670 1 .00 20.16 -30.816 1 .00 19.58 -30.081 1 .00 19.04 -30.359 1 . 00 19.39 -23.953 1 .00 19.15 -28.744 1 . 00 19 . 06 -27.253 1 .00 20.39 -29.511 1 .00 20.08 -28.105 1 ,00 19.39 -27.036 1 .00 18.63 -28.585 1, .00 18.93 -27.833 1. .00 19.64 -28.513 1 .00 19.17 1296

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N ARG A 194 •10.185 CA ARG A 194 ■11.349 CB ARG A 194 ■11.922 CG ARG A 194 ■13.029 CD ARG A 194 ■13.614 NE ARG A 194 14.589 CZ ARG A 194 15.624 NHl ARG A 194 15.815 NH 2 ARG A 194 16.451 C ARG A 194 ■11.047 O ARG A 194 11.842 N ALA A 195 -9.918 CA ALA A 195 -9.562 CB ALA A 195 -8.254 C ALA A 195 -9.436 O ALA A 195 -9.959 N LEU A 196 -8.763 CA LEU A 196 -8.552 CB LEU A 196 . -7.625 CG LEU A 196 -6.167 CDl LEU A 196 -5.375 CD2 LEU A 196 -5.590 C LEU A 196 -9.877 O LEU A 196 - 10.102 N VAL A 197 - 10.779 CA VAL A 197 - 12.112 CB VAL A 197 - 12.875 CGl VAL A 197 - 14.340 CG2 VAL A 197 12.149 C VAL A 197 - 12.924 O VAL A 197 - 13.456 N GLU A 198 - 13.010 CA GLU A 198 - 13.747 CB GLU A 198 - 13.849 CG GLU A 198 - 14.609 CD GLU A 198 - 15.334 OEl GLU A 198 - 16.313 ΟΕ2 GLU A 198 - 14.924 C GLU A 198 - 13.094 O GLU A 198 - 13 .780 N GLY A 199 - 11.770 CA GLY A 199 - 10.998 C GLY A 199 - 11.288 O GLY A 199 - 11.546 N ALA A 200 - 11.256 CA ALA A 200 - 11.605 CB ALA A 200 - 11.463 C ALA A 200 - 13.016 O ALA A 200 - 13.237 N THR A 201 - 13.965 CA THR A 201 - 15.345 CB THR A 201 - 16.302 OGl THR A 201 - 16.219 CG2 THR A 201 - 17.756 C THR A 201 - 15.435 O THR A 201 - 16.099 N LEU A 202 - 14.760 -I .285 -15 .995 1 .00 15 .27 -I .437 -16 .852 1 .00 15 .29 -0 .073 -17 .234 1 .00 14 .30 -0 .212 -18 .239 1 .00 14 .46 I .102 -18 .723 1 .00 15 .43 0 .780 -19 , .767 1 .00 15 .58 I .539 -20, .125 1 .00 17 .92 2 ,744 -19, ,576 1 .00 14 .60 I, ,095 -21. ,060 1 .00 16 .15 -2 .258 -18, . 111 1 .00 15 .74 -3 .120 -18, .504 1 .00 15 .56 -I .967 -18, .758 1 .00 15 .60 -2 , ,638 -20. .004 .1 .00 15, .90 -2 .042 -20, .591 1 .00 15 .40 -4 , ,150 -19, . 798 1 .00 15, .65 -4 ,929 -20, .610 1 .00 16 .79 -4 , , 550 -18 , .721 1 .00 16; .36 -5, ,976 -18, ,423 1 .00 17 .02 -6, .126 -17, ,235 1 .00 16 .96 -5, ,744 -17, ,532 1 .00 16 ,96 -5, ,857 -16, ,252 1 .00 18, .93 -6. ,636 -18, 630 1 .00 20. ,38 -6. ,685 -18. ,167 1 .00 17, .92 -7. ,795 -18. ,643 1 .00 18, ,98 -5, ,014 -17, ,454 1 .00 18, .51 -6, ,560 -17 , ,181 1 .00 18, ,81 -5. ,702 -16, ,130 1 .00 18 .26 -6. ,173 -15. ,994 1 .00 21, .18 -5. .784 -14. ,778 1 .00 19 .79 -6. , 779 -18. ,462 1 .00 19, .05 -7 , .884 -18, ,693 1 .00 18, ,62 -5. .752 -19 . ,308 1 .00 18, .43 -5. ,873 -20. ,556 1 .00 19, ,38 -4 . ,517 -21. ,241 1 .00 19, ,38 -3 , ,530 -20. ,417 1 .00 20, .22 -2 , ,537 -21, ,298 1 .00 22, ,66 -2 , ,940 -21. ,940 1 .00 22 . ,16 -1, ,369 -21, .342 1 .00 22 , .92 -6, ,861 -21. ,509 1 .00 19, .78 -7 , ,506 -22 . ,303 1 .00 20, ,29 -6 , ,944 -21. ,435 1 .00 19 , ,78 -7 , ,823 -22 , .314 1 .00 20, .88 -9 . ,285 -21. 986 1 .00 21, ,53 -10. ,083 -22 . 879 1 .00 22, ,36 -9, ,615 -20, ,702 1 .00 21, .79 -10, ,956 -20. 234 1 .00 22, ,44 -11. ,038 -18. 728 1 .00 22, ,21 -11. ,329 -20. 696 1 .00 22. ,54 -12. ,419 -21. 214 1 .00 22. ,25 -10. ,403 -20. 573 1 .00 22. ,56 -10, ,671 -20. ,989 1 .00 22. ,77 -9. 527 -20. 551 1 .00 22 . 83 -9. ,387 -19. 134 1 .00 24. ,92 -9, ,819 -20. ,929 1 .00 23 . ,76 -10. ,905 -22. 485 1 .00 22. ,78 -11. ,851 -22. 925 1 .00 22. ,95 -10, ,069 -23. 275 1 .00 21, ,78 ATOM 1637 CB SER A ATOM 1638 OG SER A ATOM 1639 C SER A ATOM 1640 0 SER A ATOM 164Í N ALA A ATOM 1642 CA ALA A ATOM 164} CB ALA A ATOM 1644 C ALA A ATOM 1645 0 ALA A ATOM 1646 N TYR A ATOM 164Τ| CA TYR A ATOM 164Í3 CB TYR A ATOM 1649 CG TYR A ATOM 1650 CDl TYR A ATOM 1651 CEl TYR A ATOM 1652 CZ TYR A ATOM 16 53 OH TYR A ATOM 1654 CE2 TYR A ATOM 1655] CD2 TYR A ATOM 1656 C TYR A ATOM 1657' O TYR A ATOM . 1658 N SER A ATOM 1659 CA SER A ATOM 1660 CB SER A ATOM 1661 OG SER A ATOM 1662 C SER A ATOM 1663 0 SER A ATOM 1664 N SER A ATOM 1665 CA SER A ATOM 1666 CB SER A ATOM 1667 OG SER A ATOM 1668 C SER' A ATOM 1669 0 SER A ATOM 1670 N VAL A ATOM 1671 CA VAL A ATOM 1672 CB VAL A ATOM 1673 CGl VAL A ATOM 1674 CG2 VAL A ATOM 1675 C VAL A ATOM 1676 0 VAL A ATOM 1677 N ALA A ATOM 1678 CA ALA A ATOM 1679 CB ALA A ATOM 1680 C ALA A ATOM 1681 0 ALA A ATOM 1682 N PRO A ATOM 1683 CA PRO A ATOM 1684 CB PRO A ATOM 1685 CG PRO A ATOM 1686 CD PRO A ATOM 1687 C PRO A ATOM 1688 0 PRO A ATOM 1689 N GLN A ATOM 1690 CA GLN A ATOM 1691 ; CB GLN A ATOM 1692 i CG GLN A ATOM 1693 CD GLN A 117

211 -7, .401 -17 .353 211 -6, .315 -17 .789 211 -6, .509 -15 .026 211 -6, .542 -14 .676 212 -5, .505 -14 .712 212 -4. .423 -13 ,816 212 ' -3, .417 -13 .622 212 -4, ,999 -12 ,450 212 -4, ,566 -11 ,848 213 -5, ,970 -11 .979 213 -6, . 594 -10 .676 213 -7, .453 -10, ,241 213 -6. .761 -10 .345 213 -7 , ,461 -10, .761 213 -6, ,854 -10, .854 213 -5, ,503 -10, ,545 213 -4, .930 -10 .6.68 213 -4. .758 -10, ,149 213 -5. ,400 -10. ,038 213 -7 , ,423 -10, ,710 213 -7. ,320 -9, ,804 214 -8, ,226 -11, ,767 214 -9, ,064 -11, .832 214 -10, ,244 -12, .798 214 -9, ,776 -14, .085 214 -8, ,259 -12 , .122 214 -8, ,676 -11, .762 215 -7, ,095 -12, .743 215 -6, ,295 -12, .970 215 -5. ,390 -14, .205 215 -4. ,267 -13, ,914 215 -5. ,491 -11, ,739 215 -5, .217 -11 .561 216 -5. ,115 -10, ,894 216 -4, ,347 -9 , ,679 216 -3 , ,442 -9, .296 216 -2 . ,855 -7 , .888 216 -2, ,296 -10, ,317 216 -5, ,256 -8, ,520 216 -4 . 869 -7 . ,745 217 -6. ,475 -8. ,440 217 -7 , 374 -7 , ,303 217 -8. 721 -7 . ,479 217 -7 , 571 -6, ,968 217 -7, 447 -5, ,804 218 -7, 842 -7, ,988 218 -8. 030 -7 , ,700 218 -8, ,283 -9, ,104 218 -8. 789 -9, ,905 218 -7, , 966 -9 , .435 218 -6. 798 -7 , ,065 218 -6. 928 -6 , ,299 219 -5. 608 -7 , ,386 219 -4. ,378 -6, ,786 219 -3. 149 -7 , ,569 219 -3 , 113 -8, ,985 219 -3 . 323 -8 , .982 -17 .783 1 .00 25 .87 -18 .573 1, .00 26 .62 -17 .498 1, .00 24 .55 -16 .311 1, .00 24 .46 -18 .323 1 .00 23 .56 -17, .906 1, ,00 23, .42 -19 .031 1 .00 23 .66 -17, .496 1, ,00 23, .54 -16, .513 1, ,00 24, ,00 -18, .271 1, ,00 22. .79 -18 .017 1, .00 22 .18 -19, .193 1, ,00 21, .74 -20 . 515 .1 ,00 20, ,05 -21, . 637 1 ,00 20, .58 -22 .868 1 ,00 21, .95 -22 , .988 1 ,00 20, .62 -24, .220 1 ,00 21, .72 -21, ,888 1, ,00 19, ,76 -20, ,647 1, ,00 20, .61 -16, ,758 1, ,00 23, ,06 -15. ,939 1, ,00 22. ,56 -16. , 578 1. ,00 23, ,15 -15, .392 1 .00 23, .90 -15, .580 1, .00 24, .54 -15, ,939 1 .00 27, .95 -14 , , 122 1 .00 23, .64 -13, .026 1 .00 23 .43 -14. .248 1, .00 23, .82 -13. ,050 1, .00 24. .66 -13, ,200 1 .00 25. .70 -14, ,004 1, .00 29, .15 -12, ,610 1, .00 23, ,98 -11, .421 1, .00 24, .09 -13 . .566 1, .00 22. .89 -13, ,272 1. .00 22, ,50 -14, ,493 1, .00 22, .52 -14, ,369 1, ,00 24. ,11 -14, ,652 1, .00 22, ,49 -12 , , 801 1, ,00 21. ,88 -11, 936 1, ,00 21. ,84 -13 . 332 1, ,00 21. ,86 -13 , , 050 1, ,00 21. .59 -13. 760 1. ,00 21. .26 -11. ,558 1, ,00 21, ,55 -11. ,165 1, ,00 21, ,20 -10. ,701 1, ,00 21. ,95 -9. ,282 1, ,00 21. ,59 -8. ,670 1, ,00 22. .29 -9. ,789 1, ,00 22. ,61 -10, ,963 1, ,00 22 , .11 -8. ,634 1, ,00 21. ,27 -7. , 680 1, ,00 20. ,92 -9. ,141 1. ,00 21. ,17 -8. , 609 . 1, ,00 21. .51 -9. 084 1. ,00 22. ,72 -8. 516 1, .00 24. ,90 -7. ,015 1, ,00 29. ,57 ATOM 1751 CD ARG atom: 1752 NE ARG ATOM 1753 CZ ARG ATOM 1754 NHl ARG ATOM 1755 NH 2 ARG ATOM 1756 C ARG ATOM 17 57; O ARG ATOM 17 58' N PHE ATOM 1759! CA PHE ATOM 1760 CB PHE ATOM 1761! CG PHE ATOM 17 62 CDl PHE ATOM 1763 CEl PHE ATOM 1764 CZ PHE ATOM 1765 CE2 PHE ATOM 1766 CD2 PHE ATOM 17 67 C PHE ATOM 1768 O PHE ATOM 1769 N TRP ATOM 1770 CA TRP ATOM 1771 CB TRP ATOM . 1772 CG TRP ATOM 1773 ' CDl TRP ATOM 1774 NEl TRP ATOM 1775 CE2 TRP ATOM 1776 CD2 TRP ATOM 1777 CE3 TRP ATOM 1778 CZ3 TRP ATOM 1779 CH2 TRP ATOM 1780 CZ2 TRP ATOM 1781 C TRP ATOM 1782 O TRP ATOM 1783 N VAL ATOM 1784 CA VAL ATOM 1785 CB VAL ATOM 1786 CGl VAL ATOM 1787 CG2 VAL ATOM .1788 C VAL ATOM 1789 O VAL ATOM 1790 N SER ATOM 1791 CA SER ATOM 1792 CB SER ATOM 1793 I OG SER ATOM 1794 i C SER ATOM 1795 O SER ATOM 1796 N SER ATOM 1797 CA SER ATOM . 1798 CB SER ATOM 1799 OG SER ATOM 1800 C SER ATOM 1801 O SER ATOM 1802 I N GLY ATOM 1803 CA GLY ATOM 1804 C GLY ATOM 1805 O GLY ATOM 1806 ! N GLY ATOM 1807 CA GLY 118

A 226 -1.806 0.741 A 226 -3.035 0.843 A 226 -3.997 -0.079 A 226 -5.093 0.120 A 226 -3.874 -1.196 A 226 -3.499 4.645 A 226 -2.723 5.358 A 227 -4.298 5.123 A 227 -4.280 6.545 A 227 -4.777 6.704 A 227 -3.814 6.195 A 227 -3.733 4.831 A 227 -2.855 4.355 A 227 -2.034 5.264 A 227 -2.113 6.641 A 227 -3.005 7 .091 A 227 -5.126 7 .435 A 227 -4.967 8.659 A 228 -6.032 6.820 A 228 -6.924 7 .545 A 228 -8.036 6.596 A 228 -9.030 7.228 A 228 -9.243 6.915 A 228 -10.255 7.722 A 228 -10.712 8.553 A 228 -9.958 8.280 A 228 -10.225 9.014 A 228 -11.209 9.986 A 228 -11.937 10 . 242 A 228 -11.710 9.537 A 228 -6.193 8.120 A 228 -5.479 7.394 A 229 -6.379 9.416 A 229 -5.844 10.065 A 229 -5.205 11.436 A 229 -4.490 12.026 A 229 -4.226 11.292 A 229 -6.984 10.206 A 229 -7.803 11.119 A 230 -7.044 9.298 A 230 -8.193 9 .290 A 230 -8.254 8.000 A 230 -7 . 029 7.805 A 230 -8.241 10.513 A 230 -9.321 10.983 A 231 -7.088 11.059 A 231 -7.059 12 .237 A 231 -5.671 12.461 A 231 -4.703 12.713 A 231 -7.566 13.491 A 231 -8.154 14.364 A 232 -7.373 13.579 A 232 -7.867 14.728 A 232 -9.181 14.518 A 232 -9.810 15.487 A 233 -9.589 13.265 A 233 -10.809 12.937 -1,204 1.00 32.16

-0.432 1.00 37.77

-0.413 1.00 41.09

0.322. 1.00 42.17

-1.127 1.00 42.78

-2.915 1.00 21.23

-2.288 1.00 20.95

-3.869 1.00 20.28

-4.250 1.00 19.67

-5.693 1.00 19.40

-6.744 1.00 18.28

-7.040 1.00 18.14

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-8.748 1.00 16.75

-8.456 1.00 18.79

-7.452 1.00 17.51

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-3.334 1.00 20.38

-2.583 1.00 20.72

-1.671 1.00 20.71

-1.211 1.00 20.41

-0.283 1.00 20.59

1.040 1.00 21.81

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0.565 1.00 20.71

-0.607 1.00 18.88

-1.772 1.00 18.79

-1.734 1.00 20.13'

-0.552 1.00 21.18

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-0.493 1.00 23.28

2.000 1.00 24.08

1.899 1.00 23.70

2.974 1.00 25.37

3.905 1.00 27.59

4.728 1.00 27.67

5.402 1.00 31.30

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5.174 1.00 28.91

5.165 1.00 28.76

6.030 1.00 29.72

6.639 1.00 30.39

5.635 1.00 34.43

5.323 1.00 29.39

5.966 1.00 30.97

4.005 1.00 27.59

3.247 1.00 25.22

2.493 1.00 23.25

2.077 1.00 23.19

2.320 1.00 20.97

1.578 1.00 19.35 atom: 1865Í C ASN A 240 ATOM 1866 O ASN A 240 ATOM 1867; N THR A 241 ATOM 1868! CA THR A 241 ATOM 1869; CB THR A 241 ATOM 1870! OGl THR A 241 ATOM 1871 CG2 THR A 241 ATOM 1872 C THR A 241 ATOM 1873 O THR A 241 ATOM 18741 N ASN A 242 ATOM 1875 CA ASN A 242 ATOM 1876 CB ASN A 242 ATOM 1877 CG ASN A 242 ATOM 1878 ODl ASN A 242 ATOM 1879 ND 2 ASN A 242 ATOM 1880 C ASN A 242 ATOM 1881 O ASN A 242 ATOM 1882 N GLU A 243 ATOM 1883 CA GLU A 243 ATOM 1884 CB GLU A 243 ATOM 1885 CG GLU A 243 ATOM 1886 CD GLU A 243 ATOM 1887 OEl GLU A 243 ATOM 1888 ΟΕ2 GLU A 243 ATOM 1889 C GLU A 243 ATOM 1890 O GLU A 243 ATOM 1891 N GLY A 244 ATOM 1892 CA GLY A 244 ATOM 1893 C GLY A 244 ATOM 1894 O GLY A 244 ATOM 1895 N ARG A 245 ATOM 1896 CA ARG A 245 ATOM 1897 CB ARG A 245 ATOM 1898 CG ARG A 245 ATOM 1899 CD ARG A 245 ATOM 1900 NE ARG A 245 ATOM 1901 CZ ARG A 245 ATOM 1902 NHl ARG A 245 ATOM 1903 NH 2 ARG A 245 ATOM 1904 C ARG A 245 ATOM 1905 O ARG A 245 ATOM 1906 N THR A 246 ATOM 1907 CA THR A 246 ATOM 1908 CB THR A 246 ATOM 1909 OGl THR A 246 ATOM 1910 CG2 THR A 246 ATOM 1911 1 C THR A 246 ATOM 1912 O THR A 246 ATOM 1913 N GLY A 247 ATOM 1914 : CA GLY A 247 ATOM 1915 C GLY A 247 ATOM 1916 O GLY A 247 ATOM 1917 N LYS A 248 ATOM 1918 CA LYS A CO CSJ ATOM 1919 CB LYS A 248 ATOM 1920 CG LYS A 248 ATOM 1921 CD LYS A 248 6 .334 7 .677 -7 .571 1.00 23 .27 7 .000 7 .381 -8 562 1.00 23 15 6 261 8 . 919 -7 096 1. 00 25 02 6 .939 10 .038 -7 .729 1.00 28 .12 6 044 10 .720 -8 817 1. 00 28 09 6 741 11 .836 -9 369 1.00 28 75 4 727 11 .208 -8 231 1.00 28 30 7 302 11 .065 -6 674 1.00 29 96 6 749 11 .037 -5 589 1.00 30 58 8 209 11 .984 -6 991 1.00 33 17 8 585 13 .019 -6 024 1.00 36 07 059 12 .880 -5 616 1.00 37 13 324 11 .631 -4 771 1.00 40 96 9 509 11 .235 -3 921 1.00 45 33 11 477 11 .007 -4 998 1.00 44 43 8 321 14 .427 -6 528 1.00 37 00 9 091 15 .346 -6 245 1.00 37 94 7 210 14 .602 -7 233 1.00 37 54 6 895 15 .869 -7 907 1.00 38. 05 775 15 .638 -8 .925 1.00 38 77 650 16 732 -9 977 1.00 42 65 .6 959 16 .985 -10 709 1.00 47 49 7 424 16 084 -11 453 1.00 49 14 7 520 18 .090 -10 532 1.00 50 15 6 559 17 088 -7 015 1.00 37 15 6 645 18 .240 -7 469 1.00 38 39 6 174 16 .873 -5 766 1.00 35 69 858 18 .019 -4 911 1.00 33 51 4 609 18 .775 -5 369 1.00 31 80 4 634 19 .999 -5 535 1.00 33 32 3 529 18 .036 -5 612 1.00 27 92 2 200 18 .618 -5 781 1.00 24 21 I 638 18 .224 -7 130 1.00 24 30 2 410 18 842 -8 275 1.00 24 62 I 625 18 .681 -9 532 1.00 22 11 2 462 18 .829 -10 713 1.00 21 '13 2 114 18 302 -11 878 1.00 21 50 0 982 17 621 -11 945 1.00 18 57 2 883 18 443 -12 951 1.00 20 83 I 295 18 040 -4 718 1.00 21 84 I 624 17 .021 -4 128 1.00 20 65 0 140 18 .652 -4 483 1.00 19 15 -0 824 18 .058 -3 540 1.00 17 46 -I 989 18 997 -3 238 1.00 17 87 -2 752 19 .155 -4 440 1.00 15 85 -I 495 20 .370 -2 730 1.00 17 50 -I 426 16 .769 -4 103 1.00 17 25 -I 884 15 914 -3 351 1.00 17 57 -I 482 16 646 -5 430 1.00 15 60 -2 148 15 492 -6 054 1.00 15 02 -3 609 15 761 -6 396 1.00 14 69 -4 260 14 939 -7 059 1.00 14 45 -4 137 16 890 -5 928 1.00 13 43 -5 508 17 286 -6 259 1.00 13 00 -5 969 18 453 -5 396 1.00 12 32 -5 965 18 179 -3 881 1.00 13 12 -6 133 19 493 -3 102 1.00 14 08 1980

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122

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16.00

16.20

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14.58

14.15

13.73

14.61

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14.09 13.52

11.38

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11.77 11.08

14.73 14.71

15.09

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18.04

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22.18

28.35

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19.16

17.65 18 .-07 17,67 17.27 18 .29 17.20

16.35 15.85 15.83 .43'

15.10

14.38

14.38 14.90 .55 15.47 ATOM 2321 C GLY A 302 ATOM 2322 O GLY A 302 ATOM 2323 N ALA A 303 ATOM 2324 CA ALA A 303 ATOM 2325 CB ALA A 303 ATOM 2326 C ALA A 303 ATOM 2327 O ALA A 303 ATOM 2328 N ALA A 304 ATOM 2329 CA ALA A 304 ATOM 2330 CB ALA A 304 ATOM 2331 C ALA A 304 ATOM 2332 O ALA A 304 ATOM 2333 N VAL A 305 ATOM 2334 CA VAL A 305 ATOM 2335 CB VAL A 305 ATOM 2336 CGl VAL A 305 ATOM 2337 CG2 VAL A 305 ATOM 2338 C VAL A 305 ATOM 2339 O VAL A 305 ATOM 2340 N ALA A 306 ATOM 2341 CA ALA A 306 ATOM 2342 CB ALA A 306 ATOM 2343 C ALA A 306 ATOM 2344 O ALA A 306 ATOM 2345 N ILE A 307 ATOM 2346 CA ILE A 307 ATOM 2347 CB ILE A 307 ATOM 2348 CGl ILE A 307 ATOM 2349 CDl ILE A 307 ATOM 2350 CG2 ILE A 307 ATOM 2351 C ILE A 307 ATOM 2352 O ILE A 307 ATOM 2353 N GLY A 308 ATOM 2354 CA GLY A 308 ATOM 2355 C GLY A 308 ATOM 2356 O GLY A 308 ATOM 2357 N ARG A 309 ATOM 2358 CA ARG A 309 ATOM 2359 CB ARG A 309 ATOM 2360 CG ARG A 309 ATOM 2361 CD . ARG A 309 ATOM 2362 NE ARG A 309 ATOM 2363 CZ ARG A 309 ATOM 2364 NHl ARG A 309 ATOM 2365 NH2 ARG A 309 ATOM 2366 C ARG A 309 ATOM 2367 O ARG A 309 ATOM . 2368 N TYR A 310 ATOM 2369 CA TYR A 310 ATOM 2370 CB TYR A 310 ATOM 2371 CG TYR A 310 ATOM 2372 CDl TYR A 310 ATOM 2373 CEl TYR A 310 ATOM 2374 CZ TYR A 310 ATOM 2375 OH TYR A 310 ATOM 2376 CE2 TYR A 310 ATOM 2377 CD2 TYR A 310 26.637 -4.537 1 .00 19.78 26.283 -4.991 1 .00 19.32 27.355 -5.235 1 .00 17.97 27 .708 -6.635 1 .00 17.13 29 .212 -6.812 1 .00 16.73 27.245 -7.481 1 .00 16.19 27 .171 -7.004 1 .00 16.23 26.956 -8.746 1 .00 15.66 26.378 -9.640 1 .00 15.10 25.795 ■10.860 1 .00 15.80 27.394 10 . 044 1 .00 14.74 28.587 10.121 1 .00 14.27 26.914 10.300 1. .00 14.18 27.783 10.698 1, .00 13.54 27 .971 -9.543 1, .00 13.42 28.881 -8.418 1, .00 14.25 26.597 -8.966 1, ,00 14.99 27.141 ■11.873 1, .00 13.34 25.944 12.126 1.00 12.46 27.921 12.562 1, .00 13.38 27.376 13 .573 1, ,00 14.37 28.504 14.470 1, .00 15.32 26 .626 12 .938 1, .00 14.68 27 .116 ■11.974 1 .00 15.21 25.452 13.484 1, .00 13.50 24.668 12 .975 1 .00 13 .67 23.438 ■12.163 1, .00 14.45 22.386 - 13 .072 1, .00 15.37 21.033 - 12.368 1, .00 19.15 23.848 - 11.005 1, .00 15.52 24.290 - 14.059 1, ,00 12 .52 24.232 - 15.264 1, ,00 12 .22 24.095 - 13.604 1, .00 11,71 23.737 - 14.452 1, ,00 11.64 22 .306 14.199 1, ,00 11.62 21.444 13.806 1. ,00 12.05 22 .026 14.454 1, ,00 11.39 20.661 - 14.337 1; ,00 11.23 20.467 15.275 1, ,00 11.37 20.697 16.791 1. ,00 11.29 20.130 17.625 1, ,00 12.62 20.919 - 17.425 1, ,OO 12.15 20.665 - 18.047 1. ,00 15.00 19.633 - 18.910 1, .00 12 .05 21.395 - 17.778 1. ,OO 13 .85 20.425 - 12.888 1, ,00 11.83 19 .481 - 12.221 1, ,00 11.38 21.322 - 12.399 1. ,00 11.88 21.215 - 11.022 1. ,00 11.17 20.082 - 10.878 1, ,00 12 .49 20.201 - 11.844 1. ,00 13 .10 19.622 - 13.138 1. ,00 12 . 57 19.772 - 14.039 1, ,00 15.63 20.475 - 13.649 1, , 00 14.31 20.611 - 14.529 1, ,00 14.42 21.030 - 12.379 1, ,00 12 . 68 20.906 - 11.485 1. OO 14 . 04 -22.565

-23.661

-21.,686

-21.1948

-22.168

-20.784

-19 .j647

-21.067

-20.069

-20,750

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-19.27-0

-17.703

-16 J 6 8 0

-15.656

-16.224

-15:218

-15:952

-16.121

-15.130

-14 j 233

-13;709

-13.082

-12 ί 457

-12!781

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-12;134

-12 i 756

-12 I 921

-13.119

-101-646

-10 L 974

-9'.405

-8,276

-71.853

-8.667

-6.583

- 60 91

-41896

-5.220

-4,066

- 21. 8 4 5

-1.701

-1.630

-Oj. 624

-5.654

-6.093

-4;. 806

-4Í.293

-3.225

-2.065

-2;.128

-1.069

0.065

1.119

0Í. 159

-0!. 909 ATOM 2435 CB ASN A 317 ATOM 2436 CG ASN A 317 ATOM 2437 ODl ASN A 317 ATOM 243 8 ND 2 ASN A 317 ATOM 243 9 C ASN A 317 ATOM 244 0 O ASN A 317 ATOM 2441 N GLY A 318 ATOM 244!2 CA GLY A 318 ATOM 244 3 C GLY A 318 ATOM 244 4 O GLY A 318 ATOM 244 5 N ASN A 319 ATOM 244 6 CA ASN A 319 ATOM 244 7 CB ASN A 319 ATOM 244 8 CG ASN A 319 ATOM 244 9 ODl ASN A 319 ATOM 245 0 ND2 ASN A 319 ATOM 245 I C ASN A 319 ATOM 245 2 O ASN A 319 ATOM 245 3 N PRO A 320 ATOM 245 4 CA PRO A 320 ATOM 245 5 CB PRO A 320 ATOM 245 6 CG PRO A 320 ATOM 245 7 CD PRO A 320 ATOM 245 8 C PRO A 320 ATOM 245 9 O PRO A 320 ATOM 246 0 N TRP A 321 ATOM 246 I CA TRP A 321 ATOM 246 2 CB TRP A 321 ATOM 246 3 CG TRP A 321 ATOM 246 4 CDl TRP A 321 ATOM 2465 NEl TRP A 321 ATOM 246,6 CE2 TRP A 321 ATOM 246:7 CD2 TRP A 321 ATOM 2468 CE3 TRP A 321 ATOM 2469 CZ3 TRP A 321 ATOM 247 P CH2 TRP A 321 ATOM 24711 CZ2 TRP A 321 ATOM 247b C TRP A 321 ATOM 2473 O TRP A 321 ATOM 247*1 N TYR A 322 ATOM 2475 CA TYR A 322 ATOM 2476 CB TYR A 322 ATOM 247 Í7 CG TYR A 322 ATOM 2478 CDl TYR A 322 ATOM 2479 CEl TYR A 322 ATOM 2480 CZ TYR A 322 ATOM 248 OH TYR A 322 ATOM 2482 CE2 TYR A 322 ATOM 2483 CD2 TYR A 322 ATOM 2484 C TYR A 322 ATOM 2485 O TYR A 322 ATOM 2486 N LEU A 323 ATOM 2487 CA LEU A 323 ATOM 2488 CB LEU A 323 ATOM 2489 CG LEU A 323 ATOM 249 Ò CDl LEU A 323 ATOM 249Í CD2 LEU A 323 0 .106 31 .699 -16 .921 1 .00 1 .171 32 .489 -17 .624 1 .00 2 .363 32 .384 -17 .305 1 .00 0 .756 33 .269 -18 .603- 1 .00 -0 .506 29 .551 -15, ,842 1 .00 -0, .706 30 .001 -14, .719 1, ,00 -1 .114 28 .459 -16 .300 1 .00 -2 .086 27 .721 -15 .475 1. .00 -3 .458 28 .356 -15 .550 1 .00 -3 .700 29 .390 -14 .932 1 .00 -4 .369 27 .733 -16. .306 1 .00 -5 ,672 28 .305 .-16, .557 1 .00 -5, , 693 28, .883 -17. ,980 .1, .00 -4 .676 29 .979 -18, ,187 1, .00 -4, ,832 31, .117 -17, , 699 1, ,00 -3, .640 29 .665 -18, .942 1, .00 -6. .799 27 .271 -16 , .442 1, .00 -6, .545 26 .071 -16, ,456 1, .00 -8, .054 27 .732 -16, ,334 1, ,00 -9 .113 26 .759 -16, ,472 1 .00 -10, .395 27 ,579 -16, ,324 1, ,00 -10, ,007 29, ,011 -16, .183 1, ,00 -8, ,537 29, .090 -15, ,991 1, ,00 -9, ,101 26, ,090 -17, ,851 1. ,00 -8, ,643 26, .698 OO ,820 1. ,00 <---I I -9 , .589 24 . 852 -17 , ,912 1, ,00 -9. ,739 24. ,116 -19, ,154 1, ,00 -8, .988 22 .775 -19, ,063 1, ,00 -7 , .469 22, .900 -19. ,200 1, .00 -6, .558 23, .837 -18. .627 1, .00 -5, ,347 23, .636 -19. 016 1, ,00 -5, ,290 22, ,538 -19 , ,831 1, .00 -6, .617 22, .054 -19, ,978 1, .00 -6, .846 20, .938 -20, ,787 1, .00 -5, .741 20, ,323 -21, ,428 1, .00 -4, .436 20, .819 -21, ,250 1, ,00 -4, .193 21, .948 -20, ,479 1, ,00 -11 , ,202 23, .797 -19 , ,342 1, .00 -11, , 875 23, .448 -18 , ,388 1, .00 -11. 696 23. ,896 -20. 579 1. ,00 -13 , ,088 23 , .511 -20. ,841 1, .00 -13, ,433 23, .691 -22 , ,322 1. .00 -13 . .352 25, .130 -22 . ,793 1. .00 -12, ,260 25, ,574 -23. 509 1, ,00 -12, .173 26 .914 -23 , ,965 1, ,00 -13, ,216 27, ,802 -23 . 697 1, ,00 -13. ,127 29. ,104 -24. 146 1. ,00 -14, ,324 27. ,373 -22. 982 1, 00 -14. 378 26. ,031 -22. 522 1, 00 -13 . 367 22. ,082 -20. 433 1. 00 -14, ,380 21, ,795 -19. ,771 1, ,00 -12 . 480 21, ,169 -20. 814 1, 00 -12 , ,770 19, ,750 -20. ,561 1, ,00 -11. ,787 18, .844 -21. ,315 1, ,00 -10. ,314 18, ,876 -20. ,903 1, ,00 -10. 074 17 , 902 -19. 745 1, 00 -9 . ,474 18 , ,437 -22. 112 1, 00 20.01 24 . 51

29.46 29 .08 18.2.8 19.05 17 .74

15.34

15.47 15.75 13.16 12.74

12.31 13.01

14.18 11.49 12 .27 12.28

12 .96

12.58

13.28

14.34 12 .66

12.18

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11.15

12.16

13.28

13 .24 13 .51 12 .68 14.41 13 .49

13.43 14.69

11.99 11. 51

11.47

11.31 12 .14 12.81

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11.58

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16.47 16.75 17.21 17 .24 17 .07

18.15

19.86 20.59

22.85 22.71

19.18

18.87 19.67

20.19

20.38 21.17 21.92 21.67. 22.35

23.66

23.66

23.70 24.56

25.67 27.09

25.47

25.15 25.01

24.20 24.30 23.51

22.68 21.99 20.27

22.67 21.24

20.71 20.37

25.39

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27.68 26.96 28.98 2892

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CA ILE A 377 -30.586 16 .983 -2.916 I .00 18.66 CB ILE A 377 -30.081 15 .651 -2.319 I .00 18.56 CGl ILE A 377 -29.834 15 .813 -0.800 I .00 18.42 CDl ILE A 377 -29.634 14 .481 -0.028 I .00 19.35 CG2 ILE A 377 -28.787 15 .233 -3.025 I .00 18.07 C ILE A 377 -30.546 16 .964 -4.451 I .00 18.87 O ILE A 377 -29.655 17 .575 -5.058 I .00 18.47 N ILE A 378 -31.513 16 .293 -5.068 I .00 18.45 CA ILE A 378 -31.556 16 .216 -6 . 539 I . 00 19.78 CB ILE A 378 -32.738 15 .359 -7.085 I .00 20.45 CGl ILE A 378 -32,593 13 .891 -6.650 I .00 22.32 CDl ILE A 378 -31.414 13 .145 -7.270 I. .00 24.68 CG2 ILE A 378 -32.829 15 .472 -8.646 I, .00 21.27 C ILE A 378 -31.561 17 .588 -7.177 I, .00 19.82 O ILE A 378 -30.760 17 .849 -8.101 I, .00 19.62 N ASN A 379 -32.441 18 .470 -6.689 I, .00 18.68 CA ASN A 379 -32.531 19 .820 -7.224 I .00 19.13 CB ASN A 379 -33.738 20 .578 -6.658 1, ,00 20.08 CG ASN A 379 --- 35.0 66 19 .956 -7,087 I, .00 25.11 ODl ASN A 379 -35.121 19 .173 -8.044 1, .00 29.37 ND2 ASN A 379 -36.144 20 .289 -6.369 1, .00 29.08 C ASN A 379 -31.241 20 .604 -7.040 1, .00 17.96 O ASN A 379 -30.774 21 .273 -7.981 1 .00 17.85 N ALA A 380 -30.662 20 .497 -5.841 1, ,00 15.93 CA ALA A 380 -29.458 21 .241 -5.509 1. ,00 16.08 CB ALA A 380 -29.120 21 .061 -4.033 1, .00 16.14 C ALA A 380 -28.299 20 . 783 -6.389 1, .00 15.64 O ALA A 380 -27.566 21 .607 -6.938 1, ,00 16.56 N VAL A 381 -28.153 19 .471 -6.519 1, ,00 15.22 CA VAL A 381 -27.039 18 .912 -7.302 1, ,00 15.77 CB VAL A 381 -26.823 17 .403 -6.999 1. ,00 15.61 CGl VAL A 381 -25.747 16 .777 -7 .940 1. ,00 14.83 CG2 VAL A 381 -26.386 17 .234 -5.551 1, .00 14.84 C VAL A 381 -27 .243 19 .211 -8.794 1. ,00 16.08 O VAL A 381 -26.281 19 .508 -9 .505 1, ,00 16.62 N SER A 382 -28.482 19 .112 -9.278 1, ,00 16.66 CA SER A 382 -28.772 19 .453 -10.690 1, ,00 18.67 CB SER A 382 -30.246 19 .212 -11.043 1, ,00 18,26 OG SER A 382 -30,538 17 .855 -10.893. 1, ,00 24,56 C SER A 382 -28.434 20 .894 -11.005 1. ,00 18.10 O SER A 382 -27 . 815 21 .183 -12 . 027 1, ,00 18.05 N THR A 383 -28.853 21 .810 -10.132 1. , 00 17.66 CA THR A 383 -28.521 23 .216 -10.298 1. 00 17.72 CB THR A 383 -29.199 24 .063 -9.180 1. ,00 18.48 OGl THR A 383 -30.606 23 .985 -9.373 1. ,00 19.72 CG2 THR A 383 -28.771 25 .550 -9.227 1. ,00 19.59 C THR A 383 -27.017 23 .470 -10.314 1. ,00 17.09 O THR A 383 -26.524 24 .286 -11.109 1. ,00 17.00 N TYR A 384 -26.299 22 .774 -9.435 1. ,00 15.62 CA TYR A 384 -24.858 22 .925 -9.312 1. ,00 15.37 CB TYR A 384 -24.397 22 .164 -8.068 1, ,00 15.00 CG TYR A 384 -22 . 958 22 .345 -7.630 1 . .00 15.08 CDl TYR A 384 -22.361 23 .601 -7.578 1, ,00 15.83 CEl TYR A 384 -21. 049 23 .752 -7 .131 1, ,00 16.33 CZ TYR A 384 -20.321 22 .623 -6.737 1, ,00 16.13 OH TYR A 384 -19.018 22 .738 -6.302 1. 00 16 .22 CE2 TYR A 384 -20.890 21 .386 -6.778 1. ,00 13 .72 ATOM 3005 C ALA A 392 -18 478 28 .098 -20 .363 I 00 19.59 ATOM 3006 O ALA A 392 -17 764 28 .724 -21 157 I 00 18 . 65 ATOM 3007 N ALA A 393 -19 808 28 .117 -20 425 I 00 20.40 ATOM 3008 CA ALA A 393 -20 526 28 .820 -21 507. I .00 21.27 ATOM 3009 CB ALA A 393 -22 035 28 .524 -21 421 I 00 21.83 ATOM 3010. C ALA A 393 -20 266 30 .334 -21 574 I 00 21. 79 ATOM 3011 O ALA A 393 -20 283 30 .920 -22 664 I 00 21.96 ATOM 3012 N LYS A 394 -19 976 30 .971 -20 435 I 00 21.37 ATOM 3013 CA LYS A 394 -19 626 32 .383 -20 447 I 00 22.02 ATOM 3014 CB LYS A 394 -19 289 32 .916 -19 043 I 00 23.11 ATOM 3015 CG LYS A 394 -20 411 32 .980 -18 044 I 00 25.98 ATOM 3016 CD LYS A 394 -19 782 33 .341 -16 700 I 00 28.89 ATOM 3017 CE LYS A 394 -20 793 33 .314 -15 576 I OO 34.05 ATOM 3018 NZ LYS A 394 -20 097 33 .674 -14 290 I 00 33.96 ATOM 3019 C LYS A 394 -18 403 32 .626 -21 310 I 00 21.55 ATOM 3020 O LYS A 394 -18 188 33 .742 -21 771 I 00 22.41 ATOM 3021 N , TYR A 395 -17 570 31 .604 -21 488 I 00 19.98 ATOM 3022 CA TYR A 395 -16 287 31 .824 -22 132 I 00 19.46 ATOM 3023 CB TYR A 395 -15 137 31 .464 -21 185 I 00 20.82 ATOM 3024 CG TYR A 395 -15 291 32 .165 -19 872 I 00 22.04 ATOM 3025 CDl TYR A 395 -15 644 31 .450 -18 716 I 00 23.21 ATOM 3026 CEl TYR A 395 -15 806 32 .097 -17 508 I 00 23.70 ATOM 3027 CZ TYR A 395 -15 661 33 .473 -17 460 I 00 23.93 ATOM 3028 OH TYR A 395 -15 828 34 .143 -16 272 I 00 26.14 ATOM 3029 CE2 TYR A 395 -15 327 34 .202 -18 593 I 00 24.38 ATOM 3030 CD2 TYR A 395 -15 157 33 .548 -19 791 I 00 22.37 ATOM 3031 C TYR A 395 -16 157 31 .119 -23 451 I 00 19.22 ATOM 3032 O TYR A 395 -15 045 30 .940 -23 941 I 00 18.70 ATOM 3033 N VAL A 396 -17 299 30 .718 -24 018 I 00 18.16 ATOM 3034 CA VAL A 396 -17 331 30 .135 -25 352 I 00 19.03 ATOM 3035 CB VAL A 396 -18 396 29 025 -25 458 I 00 18.18 ATOM 3036 CGl VAL A 396 -18 469 28 .465 -26 898 I 00 18.63 ATOM 3037 CG2 VAL A 396 -18 094 27 .915 -24 452 I 00 18.97 ATOM 3038 C VAL A 396 -17 654 31 .288 -26 308 I 00 19.65 ATOM 3039 O VAL A 396 -18 644 31 .986 -26 098 I 00 19.66 ATOM 3040 N PRO A 397 -16 810 31 .507 -27 328 I 00 20.41 ATOM 3041 CA PRO A 397 . -17 016 32 .626 -28 256 I 00 20.82 ATOM .3042 CB PRO A 397 -15 794 32 .561 -29 175 I 00 21.47 ATOM 3043 CG PRO A 397 -14 819 31 .725 -28 475 I 00 21.69 ATOM 3044 CD PRO A 397 -15 598 30 .741 -27 661 I 00 19 .70 ATOM 3045 C PRO A 397 -18 280 32 .434 -29 073 I 00 21.11 ATOM 3046 O PRO A 397 -18 844 31 .339 -29 088 I 00 19.88 ATOM 3047 N ALA A 398 -18 713 33 492 -29 765 I 00 21.26 ATOM 3048 CA ALA A 398 -19 951 33 .424 -30 559 I 00 21.44 ATOM 3049 CB ALA A 398 -20 227 34 .766 -31 230 I 00 22.38 ATOM 3050 C ALA A 398 -19 971 32 .297 -31 587 I 00 21.30 ATOM 3051 O ALA A 398 -21 038 31 .769 -31 901 I 00 22.15 ATOM 3052 N ASP A 399 -18 804 31 .896 -32 102 I 00 20.30 ATOM 3053 CA ASP A 399 -18 780 30 .858 -33 133 I 00 19 .40 ATOM 3054 CB ASP A 399 -17 587 31 .032 -34 071 I 00 19 .42 ATOM 3055 CG ASP A 399 -16 233 30 .835 -33 381 I 00 21.84 ATOM 3056 ODl ASP A 399 -16 146 30 569 -32 159 I 00 20.91 ATOM 3057 OD2 ASP A 399 -15 229 30 .950 -34 104 I 00 24.62 ATOM 3058 C ASP A 399 -18 834 29 .435 -32 579 I 00 18.14 ATOM 3059 O ASP A 399 -18 802 28 .465 -33 350 I 00 16.78 ATOM 3060 N GLY A 400 -18 891 29 322 -31 245 I 00 16.82 ATOM 3061 CA GLY A 400 -18 996 28 015 -30 607 I 00 15.41 3119, 3120:

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0 ASP A 407 -9.257 33 .185 -17.800 1 .00 15.12 N ARG A 408 -7.248 32 . 548 -17.018 1 .00 14.63 CA ARG A 408 -7.644 32 .530 -15.609 1 .00 15.33 CB ARG A 408 -6.453 32 .095 -14.753 1 .00 15.32 CG ARG A 408 -5.236 33 .062 -14.828 1 .00 14.48 CD ARG A 408 -4.009 32 .47 9 -14.122 1 .00 16.22 NE ARG A 408 -4.237 32 .248 -12.695 1 .00 15.55 CZ ARG A 408 -3.613 31. .323 -11.961 1, .00 18 .66 NHl ARG A 408 -3.878 31 .231 -10.658 1 .00 17.51 ΝΗ2 ARG A 408 -2.717 30. .499 -12.511 1, .00 17.12 C ARG A 408 -8.167 33 .886 -15.108 1 .00 16.66 O ARG A 408 -8.898 33 .943 -14.110 1 .00 16.82 N ASN A 409 -7.781 34 .964 -15.790 .1 .00 18.00 CA ASN A 409 -8.252 36 .316 -15.421 1 .00 20.06 CB ASN A 409 -7.069 37. .275 -15.355 1, .00 20.32 CG ASN A 409 -6.119 36 .937 -14.224 1. .00 21.65 ODl ASN A 409 -6.549 36 .678 -13.111 1, .00 24142 ND2 ASN A 409 -4.830 36 ,914 -14.516 1, .00 23.96 C ASN A 409 . -9.320 36 ,903 -16.336 1, .00 21.43 O ASN A 409 -10.272 37 .524 -15.857 1 .00 22.03 N SER A 410 -9.152 36 ,724 -17.646 1, .00 22.25 CA SER A 410 -10.007 37,410 -18.624 1 .00 22.76 CB SER A 410 -9.146 38 , 159 -19.636 1 .00 23.45 OG SER A 410 -8.470 37. ,260 -20.495 1, .00 23.38 C SER A 410 -10.971 36 .472 -19.343 1, .00 22.82 O SER A 410 -11.898 36 .925 -20.010 1, .00 23 .59 N GLY A 411 -10.758 35 .161 -19.238 1 .00 21.64 CA GLY A 411 -11.668 34 .221 -19.877 1, .00 20.39 C GLY A 411 -11.476 34 .087 -21.379 1, .00 19 .99 O GLY A 411 -12.223 33, .368 -22.029 1, .00 20.85 N THR A 412 -10.478 34, .750 -21.941 1, .00 19 .04 CA THR A 412 -10.268 34 .658 -23.383 1, ,00 20.25 CB THR A 412 -9.447 35, .853 -23 .922 1, ,00 21.81 OGl THR A 412 -8.187 35 .900 -23.257 1, ,00 26.24 CG2 THR A 412 -10.160 37 .163 -23 .631 1, .00 23 .82 C THR A 412 -9.615 33 .294 -23.732 1 .00 19.17 O THR A 412 -8.786 32 .796 -22.970 1, ,00 17 .70 N PRO A 413 -9.996 32 .688 -24.874 1 .00 18.84 CA PRO A 413 -9.466 31 .348 -25.234 1, .00 18.32 CB PRO A 413 -10.220 31, .002 -26.525 1, ,00 18.75 CG PRO A 413 -11.513 31 .928 -26.451 1, .00 19 .42 CD PRO A 413 -10.943 33, .195 -25.891 1, .00 19.40 C PRO A 413 -7.959 31 .399 -25.464 1, .00 18.87 O PRO A 413 -7.436 32, .406 -25.955 1, ,00 18.20 N LEU A 414 -7.253 30 .353 -25 .051 1 .00 18.44 CA , LEU A 414 -5.822 30 .275 -25.305 1, .00 18.90 CB LEU A 414 -4.992 30 .974 -24.208 1, .00 21.66 CG LEU A 414 -5.019 30 .574 -22.754 1 .00 24.35 CDl LEU A 414 -4.134 31 .484 -21.892 1, ,00 27.42 CD2 LEU A .414 -6.406 30 .669 -22 .224 1 .00 30.77 C LEU A 414 -5.362 28 .854 -25.518 1, .00 17.24 O LEU A 414 -6.138 27 .913 -25.406 1, ,00 15.97 N SER A 415 -4.091 28, .733 -25.865 1, ,00 15.34 CA SER A 415 -3.473 27 .481 -26.257 1, ,00 15.28 CB SER A 415 -3.434 26, ,468 -25.101 1, ,00 14.94 OG SER A 415 -2.632 25, ,355 -25.445 1, ,00 14.00 C SER A 415 -4.141 26 .932 -27.528 1, ,00 15.13 3234

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C SER A 422 -14.229 O SER A 422 -15.204 N TYR A 423 -14.320 CA TYR A 423 -15.617 CB TYR A 423 -15.502 CG . TYR A 423 -15.132 CDÍ TYR A 423 -16.002 CEl TYR A 423 -15.668 CZ TYR A 423 -14.468 OH TYR A 423 -14.157 CE2 TYR A 423 -13.588 CD2 TYR A 423 -13.942 C TYR A 423 -16.217 O TYR A 423 -17.430 N ALA A 424 -15.385 CA ALA A 424 -15.853 CB ALA A 424 -14.717 C ALA A 424 -16.411 O ALA A 424 . -17.465 N SER A 425 -15.696 CA SER A 425 -16.077 CB SER A 425 -14.948 OG SER A 425 -14.817 C SER A 425 -17.402 O SER A 425 -18.132 N PHE A 426 -17.683 CA PHE A 426 -18.983 CB PHE A 426 -19.018 CG PHE A 426 -20.410 CDl PHE A 426 -20.951 CEl PHE A 426 -22.279 CZ PHE A 426 -23.064 CE2 PHE A 426 -22.561 CD2 PHE A 426 -21.225 C PHE A 426 -20.079 O PHE A 426 -21.120 N LEU A 427 -19.834 CA LEU A 427 -20.811 CB LEU A 427 -20.339 CG LEU A 427 -20.363 CDl LEU A 427 -19.661 CD2 LEU A 427 -21.773 C LEU A 427 -21.137 O LEU A 427 -22.307 N THR A 428 -20.130 CA THR A 428 -20.397 CB THR A 428 -19.134 OGl THR A 428 -18.127 CG2 THR A 428 -18.533 C THR A 428 -21.146 O THR A 428 -22.102 N ALA A 429 -20 . 738 CA ALA A 429 -21.367 CB ALA A 429 -20.704 C ALA A 429 -22.852 O ALA A 429 -23.704 N THR A 430 -23.151 19.496 -26.257 I .00 11 19.468 -25.530 I .00 12 19.281 -27.563 I .00 11 18.990 -28.170· I .00 11 19.020 -29 .717 I .00 11 20.389 -30.274 I .00 12 21.485 -30.145 I .00 10 22.741 -30.643 I .00 11 22.912 -31.316 I .00 12 24.145 -31.783 I .00 13 21.845 -31.496 I .00 13 20.572 -30.991 I .00 12 17.673 -27.658 I .00 12 17.622 -27.323 I .00 12 16.623 -27.539 I .00 10 15.337 -26.986 I .00 11 14.294 -26.952 I .00 11 15.535 -25.588 I .00 10 14.974 -25.246 1.00 11 16.308 -24.770 I .00 9 16.519 -23.379 I .00 10 17.228 -22.602 1.00 11 18.604 -22.957 I .00 13 17.291 -23.219 I .00 11 17.043 -22.276 I .00 11 18.220 -24.133 I .00 12 18.891 -24.154 I .00 12 20.053 -25.173 I .00 13 20.575 -25.391 I .00 15 21.522 -24.516 I .00 17 21.980 -24.688 I .00 17 21.455 -25.716 1.00 17 20.496 -26.558 I .00 17 20.045 -26.396 I .00 17 17 , 878 -24.502 I .00 13 17.827 -23.850 I .00 13 17.077 -25.539 I .00 13 16.090 -25.996 I .00 14 15.410 -27.291 I .00 14 16.336 -28.506 I .00 15 15.639 -29 . 689 I .00 18 16.800 -28.876 I .00 16 15.045 -24.959 I .00 14 14.667 -24.833 I .00 16 14.551 -24.235 I .00 13 13.544 -23.196 I .00 13 12.732 -22.745 I .00 12 13.597 -22.185 I .00 12 11.902 -23.923 I .00 13 14.133 -21.980 I .00 13 13.517 -21.478 I .00 15 15.312 -21.524 I .00 13 15.942 -20.355 I .00 14 17.295 -20.036 I .00 14 16.158 -20.643 I .00 15 15.908 -19.783 I .00 15 16.622 -21.854 I .00 15 .40

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97 48. ATOM 3347 N PRO A 438 -23.497 5.208 -21 255 1.00 22 ATOM 3348 CA PRO A 438 -22.837 4.291 -22 181 I. 00 22 ATOM 3349 CB PRO A 438 -21.365 4.642 -22 009 1.00 22 atom: 3350 CG PRO A 438 -21.248 5.054 -20 578 1.00 23 ATOM 3351 CD PRO A 438 -22.575 5.707 -20 214 1.00 22 ATOM 3352 . C PRO A 438 -23.093 2.840 -21 753 1.00 22 ATOM 3353 O PRO A 438 -23.580 2.604 -20 626 1.00 23 ATOM 3354 N PRO A 439 -22.796 1.878 -22 639 1.00 22 ATOM 3355 CA PRO A 439 -22.911 0.452 -22 283 1.00 22 ATOM 3356 CB PRO A 439 -22.300 -0.2 69 -23 499 1.00 21 ATOM 33 57Í CG PRO A 439 -22.526 0.664 -24 618 1.00 22 ATOM 3358 CD PRO A 439 -22.391 2.062 -24 050 1.00 22 ATOM 3359 C PRO A 439 -22.122 0.129 -21. 037 1.00 21 ATOM 3360 O PRO A 439 -21.075 0.750 -20 776 1.00 20 ATOM 3361 N SER A 440 -22.628 -0.818 -20 253 1.00 22 ATOM 3362 CA SER A 440 -21.932 -1.273 -19 060 1.00 23 ATOM 3363 CB SER A 440 -22.818 -2.195 -18 224 1.00 24 ATOM 3364 OG SER A 440 -23.805 -1.412 -17 566 1.00 26 ATOM 3365 C SER A 440 -20.654 -1.992 -19 430 1.00 23 ATOM 3366 O SER A 440 -20.540 -2.554 -20 522 1.00 23 ATOM 3367 N TRP A 441 -19.681 -1.929 -18 536 1.00 24 ATOM 3368 CA TRP A 441 -18.431 -2.646 -18 718 1.00 24 ATOM 3369 CB TRP A 441 -17.255 -1.679 -18 819 1.00 22 ATOM 3370 CG TRP A 441 -16.963 -0.837 -17. 583 1.00 19 ATOM 3371 CDl TRP A 441 -17.409 0.432 -17. 339 1.00 16 ATOM 3372 NEl TRP A 441 -16.909 0.878 -16 138 1.00 17 ATOM 3373 CE2 TRP A 441 -16.111 -0.098 -15. 595 1.00 17 ATOM 3374 CD2 TRP A 441 -16.130 -1.194' -16 476 1.00 18 ATOM 3375 CE3 TRP A 441 -15.377 -2.338 -16 149 1.00 19 ATOM 3376 CZ3 TRP A 441 -14.658 -2.355 -14 961 1.00 18 ATOM 3377 CH2 TRP A 441 -14.670 -1.246 -14. 094 1.00 20 ATOM 3378 CZ2 TRP A 441 -15.400 -0.114 -14 391 1.00 19 ATOM 3379 C TRP A 441 -18.179 -3.661 -17. 625 1.00 26 ATOM 3380 O TRP A 441 -17.410 -4.592 -17 813 1.00 25 ATOM 3381 N ALA A 442 -18.798 -3 .471 -16 468 1.00 29 ATOM 3382 CA ALA A 442 -18.442 -4.292 -15 330 1.00 33 ATOM 3383 CB ALA A 442 -18.347 -3.447 -14 082 1.00 33 ATOM 3384 C ALA A 442 -19.447 -5.412 -15. 136 1.00 37 ATOM 3385 O ALA A 442 -20.383 -5.561 -15 915 1.00 38 ATOM 3386 N ASN A 443 -19.201 -6.222 -14. 116 1.00 41 ATOM 3387 CA ASN A 443 -20.226 -7.030 -13.467 1.00 45 ATOM 3388 CB ASN A 443 -20.135 -8.490 -13 914 1.00 45 ATOM 3389 CG ASN A 443 -18.815 -9.129 -13 531 1.00 48 ATOM 3390 ODl ASN A 443 -18.620 -9.524 -12 380 1.00 50 ATOM 3391 ND2 ASN A 443 -17.888 -9.212 -14. 492 1.00 50 ATOM 3392 C ASN A 443 -19.946 -6.892 -11. 972 1.00 46 atom: 3393 O ASN A 443 -18.878 -6.396 -11. 580 1.00 47 ATOM 3394 N SER A 444 -20.873 -7 .343 -11 135 1.00 49 ATOM 3395 CA SER A 444 -20.719 -7.201 -9. 684 1.00 51 ATOM 3396 CB SER A 444 -21.713 -8.096 -8. 936 1.00 51 ATOM 3397 OG SER A 444 -21.738 -7.735 -7 563 1.00 52 ATOM 3398 C SER A 444 -19.291 -7.452 -9. 165 1.00 51 ATOM 3399 O SER A 444 -18.743 -6.610 -8. 433 1.00 52 ATOM 3400 N SER A 445 -18.700 -8.588 -9. 558 1.00 52 ATOM 3401 CA SER A 445 -17.400 -9.030 -9. 029 1.00 52 ATOM 3402 CB SER A 445 -17.138 -10.497 -9. 385 1. 00 53 ATOM 3403 OG SER A 445 -16.901 -10.650 -10. 775 1.00 54 .28

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27 .736

28 . 836

29 .712 29 .426 27.976 27.508 ■26.162 25.268 23.941 25.698 27.050 31.152 31.529 31.961 33.388 33.784

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N PRO A 471 -15 .987 CA PRO A 471 -16 .983 CB PRO A 471 -17, .790 CG PRO A 471 -16 . 877 CD PRO A 471 -16 . 093 C PRO A 471 -17 .879 O PRO A 471 -18, . 108 N PRO A 472 -18, .378 CA PRO A 472 -19. ,238 CB PRO A 472 -19, .378 CG PRO A 472 -19, ,171 CD PRO A 472 -18. ,171 C PRO A 472 -20, , 604 O PRO A 472 -21 .017 N SER A 473 -21. ,268 CA SER A 473 -22, ,675 CB SER A 473 -23 , , 571 OG SER A 473 -23, ,468 C SER A 473 -23. . 043 O SER A 473 -24, ,041 N GLN A 474 -22, 257 CA GLN A 474 -22, ,558 CB GLN A 474 -21, .291 CG GLN A 474 -20, ,331 CD GLN A 474 -19. ,295 OEl GLN A 474 -18, ,478 ΝΕ2 GLN A 474 -19, ,304 C GLN A 474 -23 , , 620 O GLN A 474 -23. ,329 N THR A 475 -24, , 859 CA THR A 475 -26, ,012 CB THR A 475 -27, , 051 OGl THR A 475 -27, ,120 CG2 THR A 475 -26. ,642 C THR A 475 -26. ,635 O THR A 475 -26, ,363 N PRO A 476 -27. 453 CA PRO A 476 -27. ,990 CB PRO A 476 -28 , ,567 CG PRO A 476 -28. ,890 CD PRO A 476 -27. 907 C PRO A 476 -29, ,085 O PRO A 476 -29 , 654 N LYS A 477 -29. ,342 CA LYS A 477 -30. 472 CB LYS A 477 -30. ,541 CG LYS A 477 -29. 665 CD LYS A 477 -29, ,939 CE LYS A 477 -29. 996 NZ LYS A 477 -29. ,705 C LYS A 477 -31. ,766 O LYS A 477 -31. ,818 N PRO A 478 -32. ,831 CA PRO A 478 -34. , 150 CB PRO A 478 -35. 106 CG PRO A 478 -34. ,255 CD PRO A 478 -32 . , 885 -5 .931 -43 .959 1 .00 37 .46 -6 .243 -44 .985 1 .00 38 .04 -7 .383 -44, .361 1 .00 37, .60 -7 .986 -43, . 337 1 .00 38 .09 -6 .828 -42, .795 1 .00 37 .31 -5 .033 -45, .231 1 .00 38 .96 -4 .245 ,-44, ,306 1 .00 38 .78 -4 .869 -46, .471 1 .00 39 .78 -3 .723 -46, ,771 1 .00 39 ,87 -3 .780 -48 .293 1 .00 40 .09 -5, .225 -48, ,635 1 .00 40 ,28 -5 .740 -47 , ,649 1 .00 40 .02 -3 .864 -46 , . 114 1, .00 39 ,75 -4 .980 -45 ,798 ■ 1 .00 40 .10 -2, ,734 -45 , , 881 1, ,00 39, , 71 -2, .696 -45, ,467 1, .00 39 ,61 -3 , ,070 -46 , , 651 1, .00 40 .16 -2, .074 -47, .658 1, .00 42 .'55 -3 , .509 -44. .221 1, ,00 38, .94 -4, .258 -44. .210 1, .00 39 .07 -3 , ,340 -43. ,159 1, ,00 37, .75 -3 .993 -41, ,888 1, .00 36 .60 -4 .205 -41, ,057 1 .00 36 .41 -5 , ,169 -41. ,732 1, ,00 36, ,24 -5, .757 -40. ,795 1, ,00 36, ,45 -5 .040 -40, ,211 1 .00 35 .30 -7, ,077 -40, ,671 1, ,00 36, ,85 -3 , ,191 -41, , 149 1 , .00 36 ,40 -2 , .444 -40, ,208 1, ,00 35 .99 -3 , .350 -41. , 616 1 , ,00 35, ,59 -2 , .595 -41, , 148 1, „00 35, ,20 -2, .478 -42. ,287 1, ,00 35, ,73 -3, .737 -42, ,959 1, .00 36, ,85 -1, ,418 -43. ,310 1, .00 34, ,51 -3, ,256 -39. ,910 1, .00 35. ,16 -4 .420 -39, ,622 1 .00 34, ,47 -2. ,510 -39. 148 1, .00 35, ,36 -3, .111 -37, ,923 1, .00 36, ,40 -1, ,910 -37, ,167 1 , ,00 36, ,04 -0, ,912 -38. ,230 1, ,00 35, ,98 -1, ,119 -39. ,339 1, ,00 35 , ,70 -4, .171 -38. ,158 1, ,00 37 ,45 -4. .244 -39. ,254 1 . .00 36 , .95 -4, .984 -37. ,133 1, ,00 39 .01 -5. .911 -37. ,111 1. ,00 41. .20 -6, ,641 -35. ,774 1, ,00 41, .46 -7 , ,850 -35. ,604 1, ,00 41, ,87 -8 .517 -34. ,237 1, .00 42, ,36 -7. ,497 -33. 076 1, ,00 44. ,55 -8, ,110 -31. ,718 1, ,00 44. ,56 -5, , 118 -37. ,230 1, ,00 42. ,27 -3 , ,960 -36, ,798 1, .00 42. ,18 -5, ,743 -37, ,780 1, ,00 43. .46 -5 , , 106 -37, , 669 1. , 00 44, .02 -6, ,144 -38, 267 1. 00 43. ,89 -7, ,033 -39. ,105 1, .00 44, .08 -7 , .034 -38, ,493 1 , , 00 43, .41 3690

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CA THR A 487 -23.676 CB THR A 487 -24.879 OGl THR A 487 -25.321 CG2 THR A 487 -24.489 C THR A 487 -23.110 O THR A 487 -23.761 N PRO A 488 -21.901 CA PRO A 488 -21.309 CB PRO A 488 -19.988 CG PRO A 488 -19.684 CD PRO A 488 -21.010 C PRO A 498 -22.175 O PRO A 488 -23.003 N ' LEU A 489 -21.971 CA LEU A 489 -22.606 CB LEU A 489 -22.269 CG LEU A 489 -22.805 CDl LEU A 489 -22.233 CD2 LEU A 489 -24.332 C LEU A 489 -22 .137 O LEU A 489 -20.983 N PRO A 490 -23.030 CA PRO A 490 -22.636 CB PRO A 490 -23.983 CG PRO A 490 -24.900 CD PRO A 490 -24.425 C PRO A 490 -21.737 O PRO A 490 -21.826 N CYS A 491 -20.858 CA CYS A 491 -20.079 CS CYS A 491 -18.630 SG CYS A 491 -18.450 C CYS A 491 -20.032 O CYS A 491 -20.369 N ALA A 492 -19.577 CA ALA A 492 -19.205 CB ALA A 492 -18.837 C ALA A 492 -18.023 O ALA A 492 -17.310 N THR A 493 -17 . 828 CA THR A 493 -16.612 CB THR A 493 -16.845 OGl THR A 493 -17.944 CG2 THR A 493 -15.590 C THR A 493 -15.596 O THR A 493 -15.916 N PRO A 494 -14.390 CA PRO A 494 -13.464 CB PRO A 494 -12.414 CG PRO A .494 -12.416 CD PRO A 494 -13.815 C PRO A 494 -12.809 O PRO A 494 -12.801 N THR A 495 -12.260 CA THR A 495 -11.551 CB THR A 495 -11.885 OGl THR A 495 -11.449 336 -42. .986 I .00 31.43 785 -43 . .869 I .00 31.94 665 -44. ,644 I .00 35.19 904 -44. 810 I .00 32.95 561 -42. ,261 I .00 29.79 078 -41. 363 1.00 29.20 027 -42. ,644 I .00 29.20 228 -42. ,005 I .00 28.77 435 -42. ,763 I .00 28.75 126 -43 . ,408 I .00 29.52 448 -43 . , 667 I .00 29.41 463 -42. 194 I .00 28.44 499 -43 . 116 I .00 28.51 469 -41. 345 I .00 27.28 77.5 -41. 522 I .00 26.52 708 -40. 365 I .00 27.19 303 -38. 987 I .00 27.53 242 -37.929 I .00 26.81 323 -38. 970 I .00 28.98 402 -42. 833 I .00 26.65 210 -43. 245 I .00 25.40 153' -43 . 503 I .00 26.84 745 -44. 786 I .00 26.44 107 -45. 432 I .00 27.00 341 -44. 289 I .00 27.68 475 -43 . 137 1.00 26.91 982 -44. 668 I .00 26.22 729 -43 . 698 I .00 25.74 182 -45. 650 I .00 26.06 412 -45. 754 I .00 26.88 194 -45. 302 I .00 27 .00 196 -43. 819 I .00 27.23 822 -47 . 217 I .00 27.27 026 -48. 083 I .00 27.34 045 -47. 484 I .00 28.05 449 -48. 845 I .00 29.40 928 -43. 866 I .00 29.49 599 -49. 320 I .00 30.37 998 -48. 497 I .00 30.36 508 -50. 633 I .00 31.27 883 -51. 163 I .00 32.43 234 -52. 533 I .00 33 .22 324 -52. 431 I .00 38.55 464 -52 . 996 I .00 33 .71 006 -51. 254 I .00 31.35 068 -51. 795 I .00 31.58 815 -50. 682 I .00 30.44 947 -50 . 696 I .00 30.01 555 -49. 645 I .00 30.26 077 -49. 658 1.00 30.56 635 -49. 997 1.00 30.85 089 -52. 060 I .00 28.81 137 -52. 834 I .00 28.82 258 -52. 352 I .00 28 .43 419 -53. 623 I .00 28.44 748 -54. 319 I .00 28.68 839 -53 . 500 I .00 30.39 15

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32 ATOM 3803 CA GLU A 503 ATOM 3804 CB GLU A 503 ATOM 3805 CG GLU A 503 ATOM 3806 CD GLU A 503 ATOM 3807 OEl GLU A 503 ATOM 3808 OE 2 GLU A 503 ATOM 3809 C GLU A 503 ATOM 3810 O GLU A 503 ATOM 3811 N LEU A 504 ATOM 3812 CA LEU A 504 ATOM 3813 CB LEU A 504 ATOM 3814 CG LEU A 504 ATOM 3815 CDl LEU A 504 ATOM 3816 CD2 LEU A 504 ATOM 3817 C LEU A 504 ATOM 3818 O LEU A 504 ATOM 3819 N VAL A 505 ATOM .3820 CA VAL A 505 ATOM 3821 CB VAL A 505 ATOM 3822 CGl VAL A 505 ATOM 3823 CG2 VAL A 505 ATOM 3824 C VAL A 505 ATOM 3825 O VAL A 505 ATOM 3826 N SER A 506 ATOM 3827 CA SER A 506 ATOM 3828 CB SER A 506 ATOM 3829 OG SER A 506 ATOM 3830 C SER A 506 ATOM 3831 O SER A 506 ATOM 3832 N THR A 507 ATOM 3833 CA THR A 507 ATOM 3834 CB THR A 507 ATOM 3635 OGl THR A 507 ATOM 3836 CG2 THR A 507 ATOM 3837 C THR A 507 ATOM 3838 O THR A 507 ATOM 3839 N GLN A 508 ATOM ,3840 CA GLN A 508 ATOM 3841 CB GLN A 508 ATOM 3842 CG GLN A 508 ATOM 3843 CD GLN A 508 ATOM 3844 OEl GLN A 508 ATOM 3845 ΝΕ2 GLN A 508 ATOM 3846 C GLN A 508 ATOM 3847 O GLN A 508 ATOM 3848 N PHE A 509 ATOM 3849 CA PHE A 509 ATOM 3850 CB PHE A 509 ATOM 3851 CG PHE A 509 ATOM 3852 CDl PHE A 509 ATOM 3853 CEl PHE A 509 ATOM 3854 CZ PHE A 509 ATOM 3855 CE2 PHE A 509 ATOM 3856 CD2 PHE A 509 ATOM 3857 C ■ PHE A 509 ATOM 3858 O PHE A 509 ATOM 3859 N GLY A 510 1Í36

8 678 19 821 -43 968 1.00 14 46 .9 434 20 .712 -44 .996 1.00 14 .22 IO 782 20 121 -45 524 1.00 16 31 110 620 18 973 -46 539. 1.00 21 32 11 523 18 819 -47 393 1.00 21 21 9 609 18 230 -46 510 1.00 20 10 '9 657 19 322 -42 917 1.0 0 14 22 I1O 175 20 121 -42 131 1.00 15 31 9 960 18 027 -42 927 1.00 14 92 11 026 17 518 -42 052 1.00 15 49 1P 658 16 147 -41 489 1.00 16 33 9 479 16 178 -40 498 1.00 17 19 8 922 14 753 -40 320 1.00 19 08 9 953 16 723 -39 198 1.00 17 28 12 318 17 428 -42 846 1.00 16 59 12 403 16 656 -43 785 1,00 16 72 13 317 18 201 -42 444 1.00 17 20 14 592 18 235 -43 154 1.00 19 16 14 548 19 141 -44 418 1.00 18 88 14 028 20 539 -44 090 1.00 19 28 15 948 19 219 -45 095 1.00 21 65 15 674 18 705. -42 188 1.00 20 00 15 595 19 785 -41 595 1.00 19 92 16 685 17 868 -42 011 1.00 21 73 17 761 18 216 -41 104 1.00 23 33 18 570 16 974 -40 771 1.00 23 74 19 583 17 320 -39 847 1.00 28 30 18 646 19 284 -41 759 1.00 23 03 I 070 19 139 -42 908 1.00 23 20 19, 18 888 20 371 -41 049 1.00 24 01 19 685 21 464 -41 600 1.00 25 15 18I 845 22 725 -41 833 1.00 25 01 18: 104 23 015 -40 650 1.00 24 43 17; 891 22 536 -43 000 1.00 24 71 2 Ο· 795 21 812 -40 623 1.00 27 09 2 0) 729 21 448 -39 451 1.00 26 15 211 798 22 536 -41 113 1.00 29 34 22 912 22 986 -40 272 1.00 32 54 24 239 22 542 -40 897 1.00 32 54 24' 369 21 010 -40 972 1.00 34 32 25 400 20 515 -41 991 1.00 36 23 26 283 19 700 -41 660 1.00 41 79 25; 279 20 977 -43 242 1.00 40 42 22 827 24 502 -40 100 1.00 33 06 22 136 25 178 -40 873 1.00 32 49 23 494 25 037 -39 075 1.00 33 80 23 432 26 476 -38 782 1.00 35 03 24 413 26 837 -37 651 1.00 36 75 24 481 28 315 -37 340 1.00 39 07 23 592 28 893 -36 428 1.00 41 58 23 642 30 265 -36 140 1.00 42 61 24 603 31 073 -36 766 1.00 41 78 25 507 30 503 -37 678 1.00 42 48 25 441 29 127 -37 955 . 1.00 41 46 23 712 27 311 -40 040 1.00 34 58 24 614 26 990 -40 815 1.00 34 58 22 912 28 355 -40 256 1.00 33 85 I

ATOM 3917 C ASN A 518 4ι. 199 27 .937 -60.232 1 .00 27.20 ATOM 3918 O ASN A 518 41 154 28 .822 -61.079 1 .00 28.68 ATOM 3919 N ALA A 519 3.399 27 .907 -59.163 1 .00 27.04 ATOM 3920 CA ALA A 519 2.424 28 .978 -58.898· 1. .00 26.47 ATOM 3921 CB ALA A 519 11.473 28 .598 -57.747 1, .00 27.02 ATOM 3922 C ALA A 519 3 l 090 30 .322 -58.629 1, .00 26.35 ATOM 3923 O ALA A 519 4.226 30 .394 -58.135 1, .00 25.27 ATOM 3924 N ALA A 520 2 .369 31 .394 -58.954 1. . 00 26.25 ATOM 3925 CA ALA A 520 21887 32.741 -58.784 1 .00 26.77 ATOM 3926 CB ALA A 520 1 í 872 33 .775 -59.298 1. .00 27.50 ATOM 3927 C ALA A 520 3.250 33 .004 -57.317 1 .00 26.68 ATOM 3928 O ALA A 520 4.301 33 .560 -57.030 1 .00 26.01 ATOM 3929 N ALA A 521 2 i 3 95 32 .548 -56.399 1, .00 26.75 ATOM 3930 CA ALA A 521 2.628 32 .712 -54.963 1. ,00 26.82 ATOM 3931 CB ALA A 521 1.395 32 .251 -54.167 1, .00 26.85 ATOM 3932 C ALA A 521 3.876 31 .950 -54.504 1, ,00 26.51 ATOM 3933 O ALA A 521 4.485 32 .305 -53.494 1 .00 26.63 ATOM 3934 N LEU A 522 4.‘ 261 30 .919 -55.259 1, .00 26.79 ATOM 3935 CA LEU A 522 5.452 30 .113 -54.932 1.00 26.50 ATOM 3936 CB LEU A 522 5,185 28 .626 -55.155 1 .00 26.64 ATOM 3937 CG LEU A 522 4.224 27 .946 -54.169 1 .00 26.58 ATOM 3938 CDl LEU A 522 4.049 26 .489 -54..533 1, .00 27.59 ATOM 3939 CD2 LEU A 522 4.718 28 .092 -52.730 1 .00 28.08 ATOM 3940 C LEU A 522 6.696 30 .559 -55.709 1. .00 26.54 ATOM 3941 ο LEU A 522 7 .1779 29 .987 -55.547 1, .00 25.56 ATOM 3942 N GLY A 523 6 J518 31 .575 -56.552 1, .00 26.25 ATOM 3943 CA GLY A 523 7 .637 32 .267 -57.199 1, .00 26.16 ATOM 3944 C GLY A 523 7.996 31 .809 -58.607 1, .00 26.84 ATOM 3945 O GLY A 523 9 .029 32 .227 -59.152 1, .00 25.81 ATOM 3946 N ASN A 524 7.1162 30 .946 -59.193 1, .00 27.13 ATOM 3947 CA ASN A 524 7.413 30 .419 -60.539 1, .00 27.74 ATOM 3948 CB ASN A 524 7 . 046 31 .484 -61.591 1, ,00 28.43 ATOM 3949 CG ASN A 524 7 .123 30 .960 -63.015 1, ,00 30.79 ATOM 3950 ODl ASN A 524 6.856 29 .780 -63.285 1. ,00 30.80 ATOM 3951 ND 2 ASN A 524 7 .515 31 .838 -63.936 1 , ,00 33.61 ATOM 3952 C ASN A 524 8.845 29 .857 -60.710 1, ,00 28.44 ATOM 3953 O ASN A 524 . 9.531 30 .104 -61.720 1, .00 27.82 ATOM 3954 N TRP A 525 9.280 29 .111 -59.693 1, .00 27.99 ATOM 3955 CA TRP A 525 10.573 28 .398 -59.659 1. .00 28.92 ATOM 3956 CB TRP A 525 10.787 27 .507 -60.896 1. .00 28.31 ATOM 3957 CG TRP A 525 9.803 26 .394 -61.060 1, ,00 27.68 ATOM 3958 CDl TRP A 525 8.^02 26 .247 -62.078 1, ,00 27.96 ATOM 3959 NEl TRP A 525 8.166 25 .106 -61.907 1, ,00 27,55 ATOM 3960 CE2 TRP A 525 8.589 24 .471 -60.762 1, .00 30,58 ATOM 3961 CD2 TRP A 525 9.609 25 .277 -60.184 1, ,00 27.84 ATOM 3962 CE3 TRP A 525 10.ho 24 .842 -59.001 1, .00 26.50 ATOM 3963 CZ3 TRP A 525 9.787 23 .655 -58.411 1, .00 27.55 ATOM 3964 CH2 TRP A 525 8.752 22 .889 -58.998 1, .00 27 .90 ATOM 3965 CZ2 TRP A 525 8.144 23 .279 -60.168 1. ,00 26.22 ATOM 3966 C TRP A 525 11.790 29 .301 -59.452 1 , .00 29 .66 ATOM 3967 O TRP A 525 12.921 28 .804 -59.346 1, .00 30.61 ATOM 3968 N SER A 526 11.570 30 .613 -59.380 1, .00 30.33 ATOM 3969 CA SER A 526 12.645 31 .536 -59.004 1, .00 31.13 ATOM 3970 CB SER A 526 12.213 32 .993 -59.187 1, .00 31.02 ATOM 3971 OG SER A 526 13.166 33 .838 -58.562 1, ,00 33.69 ATOM 3972 C SER A 526 13.086 31 .312 -57.560 1. ,00 31.29 ATOM 3973 O SER A 526 12.271 31 .381 -56.627 1. ,00 31.21, 4032

4033

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CA VAL A 536 CB VAL A 536 CGl VAL A 536 CG2 VAL A 536 C VAL A 536 O VAL A 536 N ASN A 537 CA ASN A 537 CB ASN A 537 CG ASN A 537 ODl ASN A 537 ND 2 ASN A 537 C ASN A 537 O ASN A 537 N TYR A 538 CA TYR A 538 CB TYR A 538 CG TYR A 538 CDl TYR A 538 CEl TYR A 538 CZ TYR A 538 OH TYR A 538 CE2 TYR A 538 CD2 TYR A 538 C TYR A 538 O TYR A 538 N ALA A 539 CA ALA A 539 CB ALA A 539 C ALA A 539 O ALA A 539 N ASP A 540 CA ASP A 540 CB ASP A 540 CG ASP A 540 ODl ASP A 540 OD2 ASP A 540 C ASP A 540 O ASP A 540 N ASN A 541 CA ASN A 541 CB ASN A 541 CG ASN A 541 ODl ASN A 541 ND2 ASN A 541 C ASN A 541 O ASN A 541 N HIS A 542 CA HIS A 542 CB HIS A 542 CG HIS A 542 NDl HIS A 542 CEl HIS A 542 ΝΕ2 HIS A 542 CD2 HIS A 542 C HIS A 542 O HIS A 542 10.138 8 . 824 7,805 8.208 9.938 10.124 9.570 9.344 8.074 6. 800 6.742 5.762 10.518 10.394 11.653 12.767 13.816 14.916 14.822 15.853 16.961 17.946 17.066

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1.00 18.66

1.00 19.98

1.00 20.19

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1.00 20.37

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17 ATOM 4373 CA THR A 579 2 426 17 .448 -57 254 1.00 25.34 ATOM 4374 CB THR A 579 2 092 16 . 568 -58 477 1.00 26.08 ATOM 4375 OGl THR A 579 3 162 16 .672 -59 429 1.00 29.14 ATOM 4376 CG2 THR A 579 0 749 16 .979 -59 126 1.00 26.14 ATOM 4377 C THR A 579 ■ I 259 17 .480 -56 291 1.00 25.05 ATOM 4378 O THR A 579 0 977 16 .487 -55 629 1.00 25.73 ATOM 43 79 N TVR A 580 0 591 18 .619 ,-56 213 1.00 25.23 ATOM 4380 CA TYR A 580 -0 450 18 .802 -55 211 1.00 25 .68 ATOM 4381 CB TYR A 580 0 098 19 .556 -53 976 1.00 25.88 ATOM 4382 CG TYR A 580 -0 931 19 .763 -52 866 1.00 26.21 ATOM 4383 CDl TYR A 580 -I 284 21 .048 -52 429 1.00 26.22 ATOM 4384 CEl TYR A 580 -2 256 . 21 .233 -51 399 1.00 27.53 ATOM 4385 CZ TYR A 580 -2 860 20 .111 -50 841 1.00 27 . 08 ATOM 4386 OH TYR A 580 -3 806 20.207 -49 844' 1.00 27.88 ATOM 4387 CE2 TYR A 580 -2 510 18 .841 -51 264 1.00 26 .97 ATOM 4388 CD2 TYR A 580 -I 562 18 671 -52 276 1.00 26.29 ATOM 4389 C TYR A 580 -I 634 19 .523 -55 .828 1.00 25.65 ATOM 4390 O TYR A 580 -I 490 20 596 -56 403 1.00 25.29 ATOM 4391 N THR A 581 -2 813 18 .915 -55 732 1.00 25.95 ATOM 4392 CA THR A 581 . -4 015 19 .629 -56 117 1.00 25.78 ATOM 4393 CB THR A 581 -5 016 18 .700 -56 806 1.00 26.75 ATOM 4394 OGl THR A 581 -4 332 18 .000 -57 855 1.00 26.57 ATOM 4395 CG2 THR A 581 -6 189 19 .498 -57 397 1.00 27.62 ATOM 4396 C THR A 581 -4 627 20 .285 -54 874 1.00 25.36 ATOM 4397 O THR A 581 -5 024 19 .595 -53 935 1.00 25.22 ATOM 4398 N VAL A 582 -4 685 21 .615 -54 880 1.00 24.54 ATOM 4399 CA VAL A 582 -5 255 22 .382 -53 777 1.00 24.15 ATOM 4400 CB VAL A 582 -5 006 23 .915 -53 953 1.00 24.21 ATOM 4401 CGl VAL A 582 -5 472 24 .700 -52 744 1. 00 23.87 ATOM 4402 CG2 VAL A 582 -3 514 24 .218 -54 219 1.00 25.33 ATOM 4403 C VAL A 582 -6 759 22 .063 -53 706 1, 00 24.32 ATOM 4404 O VAL A 582 -7 478 22 .204 -54 700 1.00 23.26 ATOM 4405 N PRO A 583 -7 236 21 .587 -52 546 1.00 24.10 ATOM 4406 CA PRO A 583 -8 665 21 .230 -52 476 1.00 24.34 ATOM 4407 CB PRO A 583 -8 865 20 .763 -51 022 1.00 24.33 ATOM 4408 CG PRO A 583 -7 516 20 .538 -50 468 1.00 25.16 ATOM 4409 CD PRO A 583 -6 508 21 .310 -51 294 1.00 24.72 ATOM 4410 C PRO A 583 -9 597 22 .404 -52 768 1.00 24.50 ATOM 4411 O PRO A 583 -9 262 23 558 -52 487 1.00 23 .93 ATOM ' 4412 N ALA A 584 -10 756 22 .104 -53 350 1.00 24.61 ATOM 4413 CA ALA A 584 -11 817 23 084 -53 477 1.00 24.77 ATOM 4414 CB ALA A 584 -12 065 23 .439 -54 943 1.00 25.29 ATOM 4415 C ALA A 584 -13 036 22 434 -52 847 1.00 24.94 ATOM 4416 O ALA A 584 -13 922 21 .932 -53 537 1.00 25.03 ATOM 4417 N VAL A 585 -13 052 22 .406 -51 517 1.00 24.24 ATOM 4418 CA VAL A 585 -14 .075 21 .673 -50 776 1.00 23.75 ATOM 4419 CB VAL A 585 -13 465 20 .452 -50 029 1.00 24.50 ATOM 4420 CGl VAL A 535 -14 515 19 .770 -49 151 1.00 24.48 ATOM 4421 CG2 VAL A 585 -12 863 19 .447 -51 026 1.00 25.32 ATOM 4422 C VAL A 585 -14 707 22 .639 -49 781 1.00 23.20 ATOM 4423 O VAL A 585 -13 999 23 347 -49 065 1.00 22.13 ATOM 4424 N ALA A 586 -16 044 22 .679 -49 739 1.00 22.43 ATOM 4425 CA ALA A 586 -16 749 23 .546 -48 804 1.00 21.79 ATOM 4426 CB ALA A 586 -18 240 23 .212 -48 820 1.00 22 .19 ATOM 4427 C ALA A 586 -16 160 23 .324 -47 389 1.00 21.57 ATOM 4428 O ALA A 586 -15 954 22 .180 -46 990 1.00 20.89 ATOM 4429 N CYS A 587 -15 872 24 .414 -46 679 I . 00 21.59 ATOM 4487 ΟΕ2 GLU A 594 ATOM 4488 C GLU A 594 ATOM 4489 O GLU A 594 ATOM 4490 N ASP A 595 ATOM 4491 CA ASP A 595 ATOM 4492 CB ASP A 595 ATOM 4493 CG ASP A 595 ATOM 4494 ODl ASP A 595 ATOM 4495 OD2 ASP A 595 ATOM 4496 C ASP A 595 ATOM 4497 O ASP A 595 ATOM 4498 N THR A 596 ATOM 44 99 CA THR A 596 ATOM 4500 CB THR A 596 ATOM 4501 OGl THR A 596 ATOM 4502 CG2 THR A 596 ATOM 4503 C THR A 596 ATOM 4504 O THR A 596 ATOM 4505 N TRP A 597 ATOM 4506 CA TRP A 597 ATOM 4507 CB TRP A 597 ATOM 4508 CG TRP A 597 ATOM 4509 CDl TRP A 597 ATOM '4510 NEl TRP A 597 ATOM 4511 CE2 TRP A 597 ATOM 4512 CD2 TRP A 597 ATOM 4513 CE3 TRP A 597 ATOM 4514 CZ3 TRP A 597 ATOM 4515 CH2 TRP A 597 ATOM 4516 CZ2 TRP A 597 ATOM 4517 C TRP A 597 ATOM 4518 O TRP A 597 ATOM 4519 N GLN A 598 ATOM 4520 CA GLN A 598 ATOM 4521 CB GLN A 598 ATOM 4522 CG GLN A 598 ATOM 4523 CD GLN A 598 ATOM 4524 OEl GLN A 598 ATOM 4525 ΝΕ2 GLN A 598 ATOM 4526 C GLN A 598 ATOM 4527 O GLN A 598 ATOM 4528 N SER A 599 ATOM 4529 CA SER A 599 ATOM 4530 CB SER A 599 ATOM 4531 OG SER A 599 ATOM 4532 C SER A 599 ATOM 4533 O SER A 599 ATOM 4534 OXT SER A 599 ATOM 4535 Cl MAN A 601 ATOM 4536 C2 MAN A 601 ATOM 4537 02 MAN A 601 ATOM 4538 C3 MAN A 601 ATOM 4539 03 MAN A 601 ATOM 4540 ; C4 MAN A 501 ATOM 4541 ! 04 MAN A 601 ATOM 4542 iC5 MAN A 601 ATOM 4543 ! C6 MAN A 601 2 .107 16 .507 -39 .940 1 .00 16 .43 4 .286 16 .245 -45 .323 1 .00 17 .34 3 .973 15 .177 -45, .852 1 .00 17 .78 .463 16 .833 -45 .487 1 .00 17 .05 6, ,481 16, .326 -46, .405 1, .00 17, .21 6, .823 17 ,379 -47, .475 1 .00 16 . 63 5, .678 17, .619 , -48, ,455 1 .00 17 .91 5, .023 16 .631 -48, .857 1 .00 20, .73 5, .434 18, .795 -48, .844 1, .00 18, .08 7 .734 15 .955 -45, .631 1 .00 17 .47 7 .915 16 .375 -44, .492 1 .00 16 .44 8 .598 15 .162 -46, .277 1 .00 18 .11 9, ,917 14, .835 -45, , 747 1 .00 18, .85 9, ,991 13 .390 -45, ,188 1 .00 19 .58 9, ,057 13 , .248 -44. ,116 1 .00 20, ,97 11, ,385 13 , .124 -44, , 598 1 .00 20, .94 10, ,895 14, ,978 -46, .914 1 .00 19, .34 10, , 588 14, .531 -48, .024 1, .00 19, .05 12, ,050 15, .581 -46. .631 1, .00 20, .24 13, .074 15 .921 -47, .633 1 .00 21 .94 14, .325 16 .453 -46. ,940 1, .00 22, .34 15, .445 16, ,854 -47, ,882 1, .00 23, .75 16, ,509 16 .079 -48, .275 1 .00 25, .08 17, .327 16, ,801 -49. ,138 1, .00 24, .85 16, .802 18, .059 -49, .300 1 .00 25, .25 15, .611 18, ,128 -48, .527 1, .00 24, .09 14, .875 19, .325 -48, . 519 1 .00 24, .91 15, .334 20, .401 -49, ,262 1, .00 23 , .38 16, ,520 20 .299 -50, ,028 1 .00 25, .14 17, .265 19. ,137 -50. ,053 1, ,00 22. .49 13, ,424 14, ,708 -48. ,473 1 .00 23. .42 13. ,675 13 , ,635 -47. ,939 1, ,00 22 , ,37 13, .409 14, ,904 -49, ,788 1 .00 25, .26 13, ,698 13 , ,850 -50. ,755 1, ,00 27 . ,05 12. .936 14, ,124 -52, ,052 1 .00 26, ,51 11, .418 13 , .948 -51, ,895 1 .00 26. ,10 10, ,642 14, .209 -53. .156 1 .00 26 , ,76 11, , 194 14, .620 -54, ,175 1 .00 27, .68 9, , 340 13 , .990 -53, 095 1 .00 25, ,96 15. 204 13 , ,787 -50. 977 1, ,00 29. 21 15, ,794 14 , ,694 -51, , 574 1 .00 28 . ,61 15. , 818 12. ,722 -50, ,453 1 .00 32 , ,41 17. ,273 12 , ,530 -50, ,498 1 .00 35, ,70 17, ,747 11. ,698 -49, ,302 1, .00 35. ,61 17 , ,374 12 , .296 -48 , , 072 1 .00 39 , .62 17, 703 11. ,831 -51, 785 1, .00 36, ,66 16, ,916 11, .145 -52, ,433 1, .00 37, ,44 18, ,863 11, ,922 -52 . ,194 1, .00 38. ,18 -3. ,602 -3, ,018 -46. 412 1, .00102. ,64 -4, , 584 -2 , ,109 -47 , ,156 1, .00102. ,73 -3, .951 -1, ,548 -48 , 288 1 .00102. ,91 -5, .867 -2 , .845 -47 , , 570 1 .00102. .38 -6, ,544 -2 , ,112 -48, 566 1, .00102, ,32 -5, , 640 -4, ,269 -48, ,082 1 .00102, ,18 -6, ,860 -4, ,967 -47, ,984 1 .00101, ,76 -4. ,561 -5. ,018 -47, 298 1, .00102. ,40 -4. , 172 -6. ,307 -48. 010 1, ,00102. ,48 ATOM 4601 Cl MAN A 608 3. 870 15 416 -59 489 1 .00 37,21 ATOM 460Í C2 MAN A 608 5.134 15 938 -60 168 1 .00 40.45 ATOM 4603 02 MAN A 608 6.091 14 903 -60 120 1 .00 38.47 ATOM 46 04 C3 MAN A 608 4.872 16 381 -61 608 1 .00 42.66 ATOM 4605 03 MAN A 608 6.071 16 726 -62 263 1 .00 44.20 ATOM 4 6 0 è C4 MAN A 608 4.122 15 321 -62 401 1 .00 44.80 ATOM 460 j 04 MAN A 608 3 . 708 15 907 -63 612 1 .00 47.73 ATOM 4608 C5 MAN A 608 2.893 14 887 -61 597 1 .00 44.80 ATOM 4609 C6 MAN A 608 2 . 042 13 861 -62 342 1 .00 47.55 ATOM 4610 06 MAN A 608 1.085 14 582 -63 104 1 .00 49.87 ATOM 4611 05 MAN A 608 3.262 14 423 -60 302 1 .00 42 .18 ATOM 4612 Cl NAG A 611 3.450 -2 354 -8 282 1 .00 23 .44 ATOM 4613 C2 NAG A 611 3.474 -0 875 -7 878 1 .00 24.51 ATOM 4614 N2 NAG A 611 4.425 -0 077 -8 630 1 .00 21.95 ATOM 4615 C7 NAG A 611 4.123 0 454 -9 818 1 .00 22 , 94 ATOM 4616 07 NAG A 611 3.030 0 322 -10 367 1 .00 20 .93 ATOM 46l] C8 NAG A 611 5.216 1 232 -10 481 1 .00 21.54 ATOM 4618 C3 NAG A 611 3.741 -0 713 -6 380 1 .00 25.60 ATOM 461íj 03 NAG A 611 3.676 0 655 -6 047 1 .00 24.91 ATOM 4620 C4 NAG A 611 2 . 741 -1 528 -5 554 1 .00 25.70 ATOM 462l| 04 NAG A 611 3.196 -1 598 -4 227 1 .00 28.27 ATOM 4622 C5 NAG A 611 2.648 -2 952 -6 086 1 .00 26.18 ATOM 4623 C6 NAG A 611 1.524 -3 738 -5 397 1 .00 26.64 ATOM 4624 06 NAG A 611 0.278 -3 081 -5 497 1 .00 25.38 ATOM 4625 05 NAG A 611 2.437 -2 975 -7 488 1 .00 24.34 ATOM 4626 Cl NAG A 612 2.499 -0 713 -3 326 1 .00 32.04 ATOM ' 462*7 C2 NAG A 612 2 .710 -1 192 -1 879 1 .00 35.81 ATOM 4628 N2 NAG A 612 2.254 -2 556 -1 666 1 .00 37 .89 ATOM 462^ C7 NAG A 612 3.072 -3 605 -1 753 1 .00 39.19 ATOM 4630 07 NAG A 612 4.277 -3 517 -2 031 1 .00 40.58 ATOM 4631 C8 NAG A 612 2 .439 -4 947 -1 507 1 .00 38.98 ATOM 4632 C3 NAG A 612 2.012 -0 256 -0 899 1 .00 37 .96 ATOM 4633 03 NAG A 612 2.352 -D 666 0 403 1 .00 41.23 ATOM 4634 C4 NAG A 612 2.491 1 176 -1 129 1.00 37.63 ATOM 4635 04 NAG A 612 1.789 2 053 -0 278 1 .00 40.85 ATOM 4636 C5 NAG A 612 2.294 1 565 -2 604 1 .00 35.10 ATOM 4637 C6 NAG A 612 2 .785 2 982 -2 903 1 .00 31.93 ATOM 4638 06 NAG A 612 4.188 2 994 -3 008 0 .58 32.70 ATOM 4635 05 NAG A 612 2.974 0 625 -3 425 1 .00 31.95 ATOM 464C 08 BTB A 620 -1.213 18 638 -21 639 1 .00 23 .78 ATOM 4641 C8 BTB A 620 -1.255 19 440 -22 838 1 .00 17.50 ATOM 4642 C7 BTB A 620 -2.257 18 851 -23 831 1 .00 15.39 ATOM 4643 N BTB A 620 -1.808 17 505 -24 294 1 .00 13.88 ATOM 4644 C5 BTB A 620 -1.274 17 600 -25 684 • 1 .00 12.99 ATOM 4645 C6 BTB A 620 0.017 18 399 -25 786 1 .00 14.67 ATOM 4646 06 BTB A 620 0.949 18 004 -24 768 1 .00 16.93 ATOM 4647 C2 BTB A 620 -2.926 16 495 -24 191 1 .00 13.33 ATOM 4648 C4 BTB A 620 -4.238 16 972 -24 835 1 .00 13.45 ATOM 4649 04 BTB A 620 -4.167 17 018 -26 265 1 .00 14.77 ATOM 4650 C3 BTB A 620 -3.213 16 295 -22 703 1 .00 13.18 ATOM 4651 03 BTB A 620 -1.984 15 920 -22 059 1 .00 12.74 ATOM 4652 Cl BTB A 620 -2.501 15 161 -24 845 1 .00 13.57 ATOM 4653 Ol BTB A 620 -3.463 14 138 -24 525 1 .00 13.07 ATOM 4654 O WAT W 1 -7.741 16 530 -28 587 1 .00 12.90 ATOM 4655 O WAT W 2 -1.955 18 721 -7 814 1 .00 11.77 ATOM 4656 O WAT W 3 -17.101 16 033 -19 836 1 .00 15.26 ATOM 4657 O WAT W 4 -1.389 7 464 -24 070 1 .00 15.86 cn 00 Γ- VD ΓΟ ί---I rH γο CO CM Γ- CO I-H Γ- Γ¬ CD ιη ιη ιη σ\ ιη O Vf 00 IO VO Vf ΟΟ σ> ΓΟ rH ιη VO CN σ\ 00 σ\ Γ- τ"Η ΓΟ O ΓΟ Γ- ιη 00 «Η ΓΟ Vf τ-Η CO Γ- σ» O Γ- Γ¬ CO σι VO ιη ΓΟ O O ΓΟ ιη cn Γ¬ Cft 0\ ΓΟ VO Γ- Ο σ\ σ\ σ> Vf VO 1---I Γ- VO ιη ΓΟ Vf CM VD O VO ιη rH Vf γΗ CN ΓΟ Γ- rH VO ιη VO CM Γ¬ VD 00 VO rH O *-Η cn 00 ΓΟ VO ΟΟ O H VO H «---I O CM sf ΓΜ ο ΟΟ Cft O ΓΜ O VO ιη ιη Γ-* 00 ο Vf Nf ΓΟ 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146

O WAT W 298 -26 O WAT W 300 -10 O WAT W 302 -I O WAT W 303 -15 O WAT W 304 12 O WAT W 305 2 O WAT W 306 3 O WAT W 307 22 O WAT W 309 -17 O WAT W 311 12 O WAT W 312 23 O WAT W 314 -18 O WAT W 315 -11 O WAT W 316 -25 O WAT W 317 -36 O WAT W 318 -17 O WAT W 319 -16 O WAT W 320 -14 O WAT W 321 -15 O WAT W 322 -32 O WAT W 323 -32 O WAT W 325 15 O WAT W 326 -12 O WAT W 327 4 O WAT W 328 13 O WAT W 329 -21 O WAT W 330 19 O WAT W 331 -19 O WAT W 332 -25 O WAT W 333 -16 O WAT W 334 -17 O WAT W 335 -19 O WAT W 337 10 O WAT W 338 4 O WAT W 339 13 O WAT W 341 5 O WAT W 342 -19 O WAT W 343 7 O WAT W 345 6 O WAT W 347 3 O WAT W 348 -17 O WAT W 351 -22 O WAT W 352 25 O WAT W 353 7 O WAT W 354 -27 O WAT W 356 8 O WAT W 357 4 O WAT W 358 -0 O WAT W 360 -3 O WAT W 361 20 O WAT W 363 -26 O WAT W 365 -25 O WAT W 367 19 O WAT W 369 12 O WAT W 370 9 O WAT W 372 -10 O WAT W 373 -24 -3 .087 -31 .243 1 .00 39 O OO 35 .024 -53 .050 1 .00 55 .39 7 .169 ' -31 .692 1 .00 39 .12 -19 . 000 -23 .770 1 .00 34 .62 10 .568 -25 ,112 1 .00 39 .04 2 .766 1 ,880 1 .00 53 .88 21, ,122 , -19 ,818 1 .00 46 .35 24 .721 -48 .099 1 .00 40 .35 -6, . 726 -19 ,202 1 .00 41 .54 I .109 -31 .461 1 .00 47 .85 25 .060 -50 .638 1 .00 49 .64 4, .422 -19 .151 1 .00 39 .17 -7, ,807 -8, ,676 1 .00 37 .74 I. ,885 -4, ,649 1 .00 44. .72 13, ,592 5, ,315 1 .00 44, .38 20, .023 -46 ,231 1 .00 48 .30 29, , 024 -54, .668 1 .00 39, .40 32 , , 143 -5 .494 1 .00 42 .73 28, ,830 -38, .916 1 .00 46, .47 22 , ,221 -3 , ,433 1 .00 41 . 52 16, ,905 -12 , ,401 1 .00 46 ,29 22, ,212 -60, ,490 1 .00 34, ,67 8. ,518 -41. ,723 1 .00 36, .26 20, .490 -10, .568 1 .00 38, .04 10. , 625 -29, ,312 1 .00 38, ,32 9, ,615 -24, .896 1 .00 40, .43 25, ,925 -40, ,19? 1 .00 51, ,36 8. ,073 -45, ,255 1 .00 46, ,06 -2, ,892 -29, ,306 1, .00 41, ,74 -7 . ,067 -23. .297 1, .00 38. .54 24. ,078 2 , .157 1 .00 45. .82 31. ,941 0. , 010 1, .00 38. .91. 21. ,901 -62. ,740 1, .00 44. .31 15, ,230 -51, ,810 1 .00 42 , ,12 14. 161 -43 . 380 1, .00 46. ,42 -11. ,625 -28, ,739 1 .00 43. ,09 13, ,347 10. ,394 1, .00 42 , ,44 23. ,050 -30. ,796 1 .00 34. ,94 24. ,087 -63. ,943 1 .00 45, ,16 22. ,842 -12. ,031 1, .00 43, ,85 7. ,564 5. , 723 1, .00 43, .77 31. ,372 -24, ,708 1, .00 42. .69 25. 103 -46. 967 1, ,00 40. ,51 32. ,464 -67 . ,637 . 1, .00 57, .78 5. 101 5 . 861 1, ,00 48. ,31 11. 087 -40. ,867 1, .00 47 , ,51 29. 116 -17. 433 1, .00 43 . 72 9. 488 -45. 288 1, ,00 45. ,63 36. 536 -12 . 138 1, ,00 46. ,29 19. 772 -36. 896 1, .00 38. 73 15. 345 -28, 735 1, ,00 49. 07 0. 100 -48. ,602 1, .00 60, ,01 29. 586 -58. 438 1, ,00 48. 19 11. ,144 -54 , ,427 1 .00 48. .48 2. ,674 -16. ,115 1, .00 44. ,59 38. 564 -13 . 215 1, .00 48 . 60 16. ,211 10. ,617 1, ,00 42 . 16 753

820

992

282

106

585

680

759

062

594

347

291

815

147

473

587

081

210

274

792

475

341

668

709

937

964

325

010

024

593

517

123

677

510

979

979

453

085

471

734

739

014

016

969

444

012

974

457

090

072

217

308

369

808

410

249

151 ATOM 5000 O WAT W 375 -6.459 31.697 -48.106 1.00 46.03 ATOM 5001 O WAT W 376 -11.605 27.116 -I.562 1.00 44.58 ATOM 5002 O WAT W 377 -4.703 24.150 -62.673 1.00 48.70 ATOM 5003 O WAT W 379 6 .889 0.036 -7.530 1.00 45.35 ATOM 5004 O WAT W 381 -13.601 32.742 -32.002 1.00 51.37 ATOM 5005 O WAT W 383 -28.077 5.243 -4.688 1.00 37.46 END

Claims (26)

1. Variante de glucoamilase compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido em posições de resíduo correspondendo às posições 4, 5, 12, 24, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 70, 75, 6, 94, 100, 108, 114, 116, 119, 122, 124, 125, 137, 141, 143, 146, 148, 169, 171, 172, 175, 178, 180, 181, 208, 211, 228, 242, 243, 245, 292, 294, 197, 309, 310, 313, 314, 315, 316, 31Í, 321, 340, 341, 350, 353, 356, 363, 368, 369, 375, 376, 395, 398, 401, 408, 409, 412, 415, 418, 421, 433, 436 e 451 de SEQ ID NO: 2 ou 3 e/ou uma posição equivalente em uma glucoamilase precursora.

2 Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que a posição equivalente é determinada pela identidade de seqüência e a dita glucoafnilase precursora tem pelo menos 80% de identidade de seqüência e menos de 100% de identidade de seqüência com SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9.

3. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 2, em que a glucoamilase precursora é SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.

4. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que a posição equivalente é determinada pela identidade estrutural à SEQ ID NO: 3.

5. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que uma Lu mais substituições de aminoácido correspondem a uma posição selecionada das posições 4, 5, 24, 29, 43, 49, 70, 75, 76, 100, 108, 119, 124, 137, 146, 148, 169, 171, 172, 175, 178, 181, 208, 211, 243, 292, 294, 297, 314, 316, 317, 340, 341, 350, 356, 363, 368, 369, 376, 395, 401, 412, 433, 436 e 451 e a referida glucoamilase precursora tem pelo menos 90% de identidade de seqüência à SEQ ID NO. 2.

6. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que uma ou mais substituições de aminoácido correspondem a uma posição selecionada das posições 5, 24, 43, 49, 70, 75, 76, 94, 119, 141, 146, 148, 172, 175, 178, 180, 181, 208, 211, 243, 294, 309, 314, 353, 369, 375, 409.

7. Glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que a glucoamilase precursora é selecionada de uma glucoamilase obtida de Triehoderma spp., Aspergillus spp., Humicola spp., Penicillium spp., Talaromyeese spp. ou Schizosaceharmyees spp.

8. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 7, em que a glucoamilase precursora é obtida de Triehoderma spp. ou AspergilIus spp.

9. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que a va pondendo às iriante compreende uma substituição em uma posição corresposições: D4L/E/R/S/C/A/Q/W, F5C/M/N/R/S/T/V/W, I12L/R, D24E/UY/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S, D44E/H/K/S/N/Y/F/R, Y47W, Y49N, Q70R/K/M/P/G/1VF, Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P, P94L, D100W/I/Q/ M/P/A/N, NlÍ9PA/Y/D/E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/M, Q148V/Y/H/A/C/D/G/ M/R/S/T, Ylè9D/F, Q172C/A/D/R/E/F/HA//L/M/N/S/T/V, E180A/C/G/H/I/L/ N/P/Q/R/S/TÁ//Y, V181 E/C/D/G/H/l/P/T/Y/S/K/F/A, Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211C/R/E/a|y/W/M/H/L/I/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L, R245A/E/M/I/PA/, I292D/H/P/R/T /N/V/F/L, G294D/E/T/Q/I/A, K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/R/H/ S/R/W, R309A/C/G/H/I/N/P/Q/S/T/W/A/L, Y310E/G/L/P/S/W/R/Q, D313Q, V314A/R/N/D jC/E/Q/G/H/l/K/L/M/F/P/S/T/W/Y, Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, K341F/D/P/V/G/S, T350S/E/A/N, Q356H/D/E, T363L/R/C/H/W, S368W/D/F/L S369F, N376Q/T/H/S/V, Y395Q/R/S, A398S/IÍT, S401C/V, R408S, N409j/VA7K, T412A/h/K/G, R433H/Q, I436A/T e S451M/T/H.

10. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que a substituição é na posição correspondendo à posição 172.

11. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 10, ainda compreendendo uma substituição na posição correspondendo à posição 208 ou 211.

12. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 11, em que a substituição é Q172F, Q208N ou S221R.

13 . Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 11, ainda compreendendo uma substituição em uma posição correspondendo à i posição 314.

14. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que a uma ou mais substituições de aminoácido correspondem às posições 24, 181, 208, 243, 292, 294, 353, 375 e 409.

15. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 14, em que a substituição é na posição D24E/1VY, V181K/L, Q208C, E243Y I292V, G294j/Q, T353R, N375N/Q e N409K/W.

16. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que a refirida variante exibe termoestabilidade aumentada quando comparada à glucoamilase precursora.

17. Variante de glucoamilase de acordo com a reivindicação 1, em que a referida variante exibe atividade específica aumentada comparada à glucoamilase precursora.

18. Polinucleotídeo que codifica a variante como definida na reivindicação 1.

19. Célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo de acordo como definido na reivindicação 18.

20. Composição enzimática compreendendo a variante de glucoamilase cojno definida na reivindicação 1.

21. Composição enzimática de acordo com a reivindicação 20, em que a referida composição é usada em um processo de conversão de amido.

22. Composição enzimática de acordo com a reivindicação 20, em que a refjsrida composição é usada em uma formulação de ração para animal.

23. Composição enzimática de acordo com a reivindicação 20, em que a referida composição é usada em um processo de fermentação de álcool.

24. Método de produção de uma glucoamilase variante em uma célula hospedeira compreendendo transformação de uma célula hospedeira com um conitructo de DNA compreendendo um polinucleotídeo como definido na reivindicação 18; cultura da célula hospedeira sob condições adequadas para a expressão e produção da referida variante de glucoamilase e produção da referida variante.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, ainda compreendendo recuperação da variante de glucoamilase da referida cultura.

26. Variante de glucoamilase compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos uma deíeção ou inserção em uma seqüência correspondendo a uma glucoamilase precursora tendo 90% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 2 ou 3.