ES2795989T3

ES2795989T3 - Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas

Info

Publication number: ES2795989T3
Application number: ES17205190T
Authority: ES
Inventors: Wolfgang Aehle; Richard Bott; Martijin Scheffers; Solingen Piet Van; Casper Vroemen
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2007-11-20
Filing date: 2008-11-20
Publication date: 2020-11-25
Anticipated expiration: 2028-11-20
Also published as: US20090275080A1; BRPI0820483A2; EP2816109A1; DK2222842T3; US8058033B2; CN101868537B; DK3323889T3; CA2705941A1; US20120149087A1; CN101868537A; HUE050328T2; EP2222842A2; WO2009067218A3; EP2816109B1; US8679792B2; EP2222842B1; EP3323889B1; MX2010005461A; JP2011502543A; EP3323889A1

Abstract

Una variante de glucoamilasa que comprende al menos: (i) una sustitución de aminoácidos correspondiente a la posición 431 en SEQ ID NO: 2 o una posición equivalente basada en la alineación de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID NO: 2; y (ii) una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a las posiciones 61, 73, 417, 430, 503, 511, 535, 539 o 563 de SEQ ID NO: 2 o posiciones equivalentes basadas en la alineación de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID NO: 2; en la que la variante de glucoamilasa presenta al menos un 93 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y en la que la variante de glucoamilasa muestra termoestabilidad aumentada y/o actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] Las variantes de glucoamilasas presentan de forma beneficiosa propiedades modificadas (p. ej., termoestabilidad y/o actividad específica mejoradas). Se presentan composiciones que comprenden las glucoamilasas variantes, construcciones de ADN que codifican las variantes y métodos para producir las variantes de glucoamilasa en células huésped.

ANTECEDENTES

[0002] Las enzimas de glucoamilasa (glucano 1,4-a-glucohidrolasas, EC 3.2.1.3) son carbohidrasas hidrolizantes de almidón que actúan en exo, que catalizan la eliminación de unidades de glucosa sucesivas de los extremos no reductores de moléculas relacionadas con oligosacáridos y polisacáridos o almidón. Las glucoamilasas pueden hidrolizar tanto los enlaces glucosídicos lineales como ramificados de almidón (p.ej., amilosa y amilopectina).

[0003] Las glucoamilasas se producen mediante numerosas cepas de bacterias, hongos, levaduras y plantas. Especialmente interesantes, y comercialmente importantes, las glucoamilasas son enzimas fúngicas que se producen de forma extracelular, por ejemplo, a partir de cepas de Aspergillus (Svensson et al. (1983) Carlsberg Res. Commun. 48:529-544; Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; Hayashida et al., (1989) Agric. Biol. Chem.

53:923-929; patente estadounidense n.°. 5024941; patente estadounidense n.° 4794175 y WO 88/09795); Talaromyces (patente estadounidense n.° 4247637; patente estadounidense n.° 6255084 y patente estadounidense n.° 6620924); Rhizopus (Ashikari et al., (1986) Agric. Biol. Chem. 50:957-964; Ashikari et al., (1989) App. Microbiol. Biotech. 32:129-133 y patente estadounidense n.° 4863864); Humicola (WO 05/052148 y patente estadounidense n.° 4618579) y Mucor (Houghton-Larsen et al., (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:210-217). Muchos de los genes que codifican estas enzimas han sido clonados y expresados en células bacterianas, fúngicas y/o levadura.

[0004] Comercialmente, las glucoamilasas son enzimas muy importantes y se han utilizado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón (p. ej., para la producción de glucosa y otros monosacáridos a partir de almidón). Las glucoamilasas se utilizan para producir edulcorantes de maíz con alto contenido de fructosa, que comprenden más del 50 % del mercado de edulcorantes en Estados Unidos. En general, las glucoamilasas pueden utilizarse, y normalmente se utilizan, con alfa-amilasas en procesos hidrolizantes de almidón para hidrolizar almidón en dextrinas y posteriormente glucosa. La glucosa puede entonces convertirse en fructosa por parte de otras enzimas (p. ej., isomerasas de glucosa); cristalizarse; o utilizarse en fermentaciones con el fin de producir numerosos productos finales (p. ej., etanol, ácido cítrico, ácido láctico, succinato, intermediarios de ácido ascórbico, ácido glutámico, glicerol y 1,3-propanodiol). El etanol producido mediante el uso de glucoamilasas en la fermentación de material que contiene celulosa y/o almidón puede utilizarse como una fuente de combustible o para consumo alcohólico.

WO 2006/060062 expone la glucoamilasa Trichoderma reesei y homólogos de esta.

[0005] US 2003/0032163 describe una variante de una glucoamilasa fúngica precursora, cuya variante muestra una estabilidad térmica mejorada y/o una actividad específica aumentada mediante sustratos sacáridos.

[0006] WO 01/04273 describe una variante de una glucoamilasa fúngica, cuya variante muestra propiedades modificadas, en concreto una estabilidad térmica mejorada y/o una actividad específica aumentada.

[0007] Aunque las glucoamilasas se han utilizado con éxito en aplicaciones comerciales durante muchos años, todavía existe la necesidad de nuevas glucoamilasas con propiedades modificadas, tal como actividad específica mejorada o termoestabilidad aumentada.

[0008] Se han realizado diferentes mutaciones en glucoamilasas de Aspergillus que potencian la estabilidad térmica y la actividad específica. Se hace referencia a la patente estadounidense n.° 6537792; la patente estadounidense n.° 6352851; Chen et al. (1996) Prot. Eng. 9:499-505, Chen et al., (1995) Prot Eng. 8:575-582; Fierobe et al. (1996) Biochem. 35:8698-8704; y Li et al., (1997) Prot. Eng. 10:1199-1204. Todavía existe la necesidad de proporcionar variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas en relación con su precursora.

SUMARIO

[0009] La presente exposición se refiere a variantes de glucoamilasa de una glucoamilasa precursora. En un primer aspecto, la presente invención proporciona una variante de glucoamilasa que comprende al menos:

(i) una sustitución de aminoácidos en la posición 431 en SEQ ID NO: 2 o una posición equivalente basada en la alineación de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID NO: 2; y

(ii) una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a las posiciones 61, 73, 417, 430, 503, 511, 535, 539 o 563 de SEQ ID NO: 2 o posiciones equivalentes basadas en la alineación de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID NO: 2;

en la que la variante de glucoamilasa presenta al menos un 93% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y en la que la variante de glucoamilasa muestra termoestabilidad aumentada y/o actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 2.

[0010] En alguna forma de realización, la sustitución en la posición 431 en SEQ ID NO: 2 se elige de: A431L/Q.

[0011] En algunas partes de la exposición, la variante es una variante de una glucoamilasa precursora que presenta un dominio catalítico con al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o 2, o que presenta un dominio de unión a almidón con al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o 2.

[0012] En algunas partes de la exposición, la variante de glucoamilasa presenta al menos un 95 % o al menos un 99,5 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, o la variante es una variante de una glucoamilasa precursora que es SEQ ID NO: 1 o 2.

[0013] En algunas formas de realización, la variante comprende sustituciones de aminoácidos correspondientes a A431L/Q y uno o más de N61I, G73F, L417R/V, T430A/M, E503A/V, Q511H, A535R, A539R o N563I/K en SEQ ID NO: 2.

[0014] En algunas partes de la exposición, la variante comprende además una o más de las siguientes sustituciones: D4L/E/R/S/C/A/Q/W, F5C/M/N/R/S/T/V/W, Il2L/R, D24E/L/Y/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S/Q, D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C, Y47W,Y49N, Q70R/K/M/P/G/L/F, Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P, P94L, D100W/I/Q/M/P/A/N, N119P/T/Y/D/E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M, Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T, Y169D/F, Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V, F175H/A/G/R/S/T/C/W/Y, W178A/C/D/E/F/G/H/K/N/R/S/T/V/Y, E180A/C/G/H/I/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y, VI81E/C/D/G/H/I/P/T/Y/S/L/K/F/A, Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211C/R/E/A/Y/W/M/H/L/I/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L, R245A/E/M/I/P/V, I292D/H/P/R/T/N/V/F/L, G294C/D/E/T/Q/I/A, K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/S/R/W, R309A/C/G/H/I/N/P/Q/S/T/W/Y/L, Y310E/G/L/P/S/W/R/Q, D313Q, V314A/R/N/D/C/E/Q/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y, Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, K341F/D/P/V/G/S, T350S/E/A/N, Q356H/D/E, T363L/R/C/H/W, S368W/D/F/L, S369F, N376Q/T/H/S/V, Y395Q/R/S, A398S/I/T, S401C/V, R408S, N409W/T/K, T412A/H/K/G, R433H/Q, 1436A/T, o S451 M/T/H en SEQ ID NO: 2.

[0015] En algunas partes de la exposición, la variante de glucoamilasa comprende múltiples sustituciones en las posiciones:

I43/N61/T430/A431/Q511/A539;

I43/L417/T430/A431/Q511/A539;

I43/T430/A431/E503/Q511;

I43/T430/A431/Q511;

I43/T430/A431/Q511/A539;

I43/A431/Q511;

G294/L417/A431;

G294/L417/A431/Q511;

L417/T430/A431/Q511/A535/A539/N563; y

L417/A431/Q511.

[0016] En algunas formas de realización, la variante de glucoamilasa comprende uno de los conjuntos de sustitución:

I43Q/N61I/T430A/A431L/Q511H/A539R;

I43Q/L417V/T430A/A431L/Q511H/A539R;

I43Q/T430A/A431L/E503A/Q511H;

I43Q/T430A/A431L/Q511H;

I43Q/T430A/A431L/Q511H/A539R;

I43Q/A431L/Q511H;

G294C/L417R/A431L;

G294C/L417R/A431L,Q/Q511H;

G294C/L417V/A431Q;

L417R,V/A431L,Q/Q511H; y

L417V/T430A/A431L,Q/Q511H/A535R/A539R/N563I, de SEQ ID NO: 2.

[0017] En algunas formas de realización, la glucoamilasa precursora se elige de una glucoamilasa obtenida de una Trichoderma spp., una Aspergillus spp., una Humicola spp., una Penicillium spp., una Talaromyces spp., o una Schizosaccharomyces spp.

[0018] En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica la variante de glucoamilasa del primer aspecto de la invención.

[0019] En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido del segundo aspecto de la invención.

[0020] En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende el vector del tercer aspecto de la invención.

[0021] En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una composición de enzima que comprende la variante de glucoamilasa de cualquiera del primer aspecto de la invención.

[0022] En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una variante de glucoamilasa en una célula huésped que comprende el cultivo de la célula huésped del cuarto aspecto de la invención con las condiciones adecuadas para la expresión y producción de la variante de glucoamilasa y la producción de la variante de glucoamilasa.

[0023] En algunas formas de realización, el método comprende además la recuperación de la variante de glucoamilasa del cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0024]

La FIG. 1A representa la glucoamilasa precursora Trichoderma reesei (TrGA) con 632 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). El péptido señal se subraya, la región catalítica (SEQ ID NO: 3) que comienza con los residuos de aminoácidos SVDDFI (SEQ ID NO: 160) y que presenta 453 residuos de aminoácidos está en negrita; la región de enlace está en cursiva y el dominio de unión a almidón (SEQ ID NO: 161) está tanto en cursiva como subrayado. La proteína madura, que incluye el dominio catalítico (SEQ ID NO: 3), la región de enlace y el dominio de unión a almidón (SEQ ID NO: 161) se representa mediante SEQ ID NO: 2. La FIG. 1B representa el ADNc (SEQ ID NO: 4) que codifica la TrGA.

La FIG. 2 representa el plásmido pDONR-TrGA que incluye el ADNc (SEQ ID NO: 4) de la TrGA precursora.

La FIG. 3 representa los plásmidos pREP3Y-DEST (A) y pREP3Y-TrGA (B).

Las FIGS. 4A-4B representan una comparación de la alineación de los dominios catalíticos de glucoamilasas precursoras que incluye glucoamilasa derivada de Aspergillus awamori (AaGA) (SEQ ID NO: 5); Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO: 6); Aspergillus orzyae (AoGA) (SEQ ID NO: 7); Trichoderma reesei (TrGA) (SEQ ID NO: 3); Humicola grisea (HgGA) (SEQ ID NO: 8); e Hypocrea vinosa (HvGa ) (SEQ ID NO: 9). Los aminoácidos idénticos se indican con un asterisco (*),

Las FIGS. 4C-4D representan una alineación que compara el dominio de unión a almidón (SBD) de glucoamilasas precursoras entre las que se incluyen Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 161), Humicola grísea (HgGA) (SEQ ID NO: 162), Thielavia terrestris (TtGA) (SEQ ID NO: 163), Thermomyces lanuginosus (ThGA) (SEQ ID NO: 164), Talaromyces emersonii (TeGA) (SEQ ID NO: 165), Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO: 166), y Aspergillus awamori (AaGA) (SEQ ID NO: 167). Los aminoácidos idénticos se indican con un punto (.).

La FIG. 5A representa el plásmido pTrex3g-DEST. La FIG. 5B representa el plásmido pTrex3g-TrGA. Los plásmidos se utilizaron como vectores de expresión para la expresión y producción de glucoamilasas variantes en un huésped Trichoderma reesei.

La FIG. 6 representa la comparación Vmax (pM glucosa/s) entre la TrGA precursora (de tipo silvestre) y las variantes, V314, S211R, Q172F y Q208N a 6o °C y 32 °C, como se detalla en el Ejemplo 8.

La FIG. 7 representa la actividad de variantes combinatorias en un sustrato de almidón. Entre las variantes combinatorias descritas en el presente documento se incluyen ET7-1 (D24Y/V181L/Q208C/G294A/T353R/N375N/N409W), LR8 (Q172F/Q208N), LR12 (Q172F/S211R), LR6 (Q172F/Q208N/V314H), ET8-1 (D24E/V181K/E243Y/I292V/G294Q/N409K) y ET7-2 (Q24L/V181L/Q208C/G294A/T353R/N375Q/N409W). La actividad se representa en unidades de absorción a 340 nm como función de ng de las variantes de glucoamilasa indicadas.

La FIG. 8 representa la actividad de variantes de sitio único en un sustrato de maicena. Entre las variantes de sitio único descritas en el presente documento se incluyen V314H, G294Q, S211R, Q208N, Q172F, G294I y P94N. La actividad se representa en unidades de absorción a 340 nm como función de ng de las variantes de glucoamilasa indicadas.

La FIG. 9 representa la actividad de glucoamilasa de TrGA y la variante de TrGA LR8 (Q172F/Q208N) sobre una muestra de sustrato licuado de pulpa de maíz (NE).

La FIG. 10 representa el perfil de actividad de TrGA y la variante de TrGA LR8 (Q172F/Q208N) sobre una muestra de sustrato licuado de pulpa de maíz (BSE).

La FIG. 11 representa el perfil de actividad de TrGA y la variante de TrGA LR8 (Q172F/Q208N) sobre una muestra de sustrato de maicena soluble.

La FIG. 12 representa una comparación de las estructuras tridimensionales de la glucoamilasa Trichoderma reesei ( negra) (SEQ ID NO: 2) y la glucoamilasa Aspergillus awamorii (gris), vistas de lado.

La FIG. 13 representa una comparación de las estructuras tridimensionales de la glucoamilasa Trichoderma reesei (negra) y la glucoamilasa Aspergillus awamorii (gris) vistas desde la parte superior.

La FIG. 14A representa el plásmido pTTT-Dest. La FIG. 14B representa el plásmido pTTT-TrGA(B).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0025] Las glucoamilasas son enzimas comercialmente importantes en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón. Las variantes de glucoamilasa descritas en el presente documento contienen sustituciones de aminoácidos dentro del dominio catalítico o del dominio de unión a almidón. Las variantes pueden mostrar propiedades modificadas, tal como termoestabilidad y/o actividad específica mejoradas. Las variantes con termoestabilidad y/o actividad específica mejoradas pueden mejorar de forma significativa la eficacia de la producción de etanol carburante y glucosa a partir de maicena, por ejemplo.

1. Definiciones

[0026] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado según lo entiende comúnmente alguien especializado en la técnica a la que esta invención pertenece. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan al experto el significado general de muchos de los términos empleados en el presente documento. Determinados términos se definen a continuación para una mayor claridad y facilidad de referencia.

[0027] El término "glucoamilasa (EC 3.2.1.3)" se refiere en el presente documento a una enzima que cataliza la

liberación de D-glucosa desde los extremos no reductores de almidón y polisacáridos y oligosacáridos

relacionados.

[0028] El término "precursor" o "secuencia precursora" hace referencia a una secuencia que es natural o que se

da de forma natural en una célula huésped. Entre las secuencias precursoras se incluyen, aunque sin carácter

limitativo, las secuencias de glucoamilasa establecidas en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 9.

[0029] El término "posición equivalente" se refiere en el presente documento a una posición que es común a las

dos secuencias precursoras que se basa en una alineación de la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa

precursora en cuestión así como una alineación de la estructura tridimensional de la glucoamilasa precursora en

cuestión con la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de referencia TrGA (SEQ ID NO: 2) y la secuencia

tridimensional.

[0030] El término "TrGA" se refiere a una secuencia de glucoamilasa Trichoderma reesei precursora que presenta

la secuencia de proteína madura ilustrada en SEQ ID NO: 2 que incluye el dominio catalítico que presenta la

secuencia ilustrada en SEQ ID NO: 3. El aislamiento, clonación y expresión de la TrGA se describen en la patente

estadounidense n.° 7413887. En algunas formas de realización, la secuencia precursora hace referencia a una

glucoamilasa que es el punto inicial para la ingeniería de proteínas. La numeración de los aminoácidos de la

glucoamilasa en el presente documento se basa en la alineación de secuencia de una glucoamilasa con TrGA

(SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3).

[0031] La frase "forma madura de una proteína o polipéptido" hace referencia a la forma funcional final de la

proteína o polipéptido. Con el fin de ejemplificarlo, una forma madura de la TrGA incluye el dominio catalítico, la

región de enlace y el dominio de unión a almidón que presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0032] Los términos "variante de glucoamilasa" y "variante" se emplean en el presente documento en referencia a

glucoamilasas que presentan un grado de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de

glucoamilasa precursora y que pueden conservar características funcionales de una glucoamilasa. Una variante

es similar a una secuencia precursora pero presenta al menos una sustitución, deleción o inserción en su secuencia

de aminoácidos que hace que sea diferente de una glucoamilasa precursora por la secuencia. En algunos casos,

las variantes han sido manipuladas y/o diseñadas para que incluyan al menos una sustitución, deleción o inserción

en su secuencia de aminoácidos que las diferencie de una precursora por la secuencia.

[0033] Las "variantes" pueden presentar al menos un 99,5 %, al menos un 99 %, al menos un 98 %, al menos un

97 %, al menos un 96 %, al menos un 95 %, al menos un 94 %, al menos un 93 %, al menos un 92 %, al menos

un 91%, al menos un 90 %, al menos un 88 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos

un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 60 %, al menos un 55 %, al menos un 50 % o al menos un 45 % de

identidad de secuencia con una secuencia de polipéptidos cuando se alinea de forma óptima para su comparación.

En algunas partes de la exposición, la variante de glucoamilasa puede presentar al menos un 99,5 %, al menos un

99 %, al menos un 98 %, al menos un 97 %, al menos un 96 %, al menos un 95 %, al menos un 94 %, al menos

un 93 %, al menos un 92 %, al menos un 91 %, al menos un 90 %, al menos un 88 %, al menos un 85 %, al meno un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 60 %, al menos un 55 %, al meno un 50 % o al menos un 45 % de identidad secuencia con el dominio catalítico de una glucoamilasa precursora. En

algunas partes de la exposición, la variante de glucoamilasa puede presentar al menos un 99,5 %, al menos un

un 93 %, al menos un 92 %, al menos un 91 %, al menos un 90 %, al menos un 88 %, al menos un 85 %, al meno un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 60 %, al menos un 55 %, al meno un 50 % o al menos un 45 % de identidad de secuencia con el dominio de unión a almidón de una glucoamilasa

precursora. La identidad de secuencia puede medirse sobre toda la longitud de la secuencia precursora o variante.

[0034] La identidad de secuencia se determina utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica (véase,

p. ej., Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970);

Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85: 2444 (1988); programas como GAP, BESTHT, FASTA, y

TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI); y Devereux et al.,

Nucleic Acid Res., 12: 387-395 (1984)).

[0035] El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" o "porcentaje (%) de identidad de secuencia

de aminoácidos" se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos o residuos de aminoácidos en una

secuencia candidata que son idénticos a los residuos de nucleótidos o residuos de aminoácidos de la secuencia

inicial (p. ej., TrGA). La identidad de secuencia puede medirse sobre toda la longitud de la secuencia inicial (p. ej.,

SEQ ID NO: 2).

[0036] La identidad de secuencia se determina mediante métodos conocidos de alineación de secuencias. Un método de alineación comúnmente conocido es BLAST descrito por Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); y Karlin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 90: 5873-5787 (1993)). Un programa BLAST especialmente útil es el programa WU-BLAST-2 (véase Altschul et al, Meth. Enzymol. 266: 460-480 (1996)). WU-BLAST-2 utiliza diferentes parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales están establecidos a los valores por defecto. Los parámetros regulables están configurados con los siguientes valores: periodo de solapamiento = 1, fracción de solapamiento = 0,125, umbral de palabras (T) = 11. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y los establece el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia específica y la composición de la base de datos específica contra la que se busca la secuencia de interés. Sin embargo, los valores pueden regularse con el fin de aumentar la sensibilidad. Un valor de % de identidad de secuencia de aminoácidos se determina por el número de residuos idénticos que coinciden dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es la que presenta los residuos más reales en la región alineada (se ignoran los huecos introducidos por WU-Blast-2 con el fin de maximizar la puntuación de alineación).

[0037] Otros métodos pueden ser útiles para alinear secuencias. Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencias múltiple de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones por pares progresivas. También puede trazar un árbol que muestre las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987)). El método es similar al descrito por Higgins y Sharp (Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989)). Parámetros útiles de PILEUP incluyen un peso del hueco por defecto de 3,00, un peso de la longitud del hueco por defecto de 0,10 y huecos de extremo ponderados.

[0038] El término "alineación óptima" hace referencia a la alineación que proporciona la mayor puntuación de porcentaje de identidad.

[0039] El término "dominio catalítico" hace referencia en el presente documento a una región estructural de un polipéptido que contiene el centro activo para la hidrólisis del sustrato.

[0040] El término "enlazador" se refiere a una secuencia de aminoácidos corta que presenta generalmente entre 3 y 40 residuos de aminoácidos que une de forma covalente una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de unión a almidón con una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio catalítico.

[0041] El término "dominio de unión a almidón" se refiere a una secuencia de aminoácidos que se une preferentemente a un sustrato de almidón.

[0042] Los términos "secuencia mutante" y "gen mutante" se utilizan en el presente documento indistintamente y hacen referencia a una secuencia de polinucleótidos que presenta una alteración en al menos un codón que se da en la secuencia original de una célula huésped. El producto de expresión de la secuencia mutante es una proteína variante con una secuencia de aminoácidos modificada en relación con la precursora. El producto de expresión puede presentar una capacidad funcional modificada (p. ej., actividad enzimática mejorada).

[0043] El término "propiedad" o equivalentes gramaticales del mismo en el contexto de un polipéptido se refiere en el presente documento a cualquier característica o atributo de un polipéptido que puede elegirse o detectarse. Entre estas propiedades se incluyen, sin carácter limitativo, estabilidad oxidativa, especificidad de sustrato, actividad catalítica, estabilidad térmica, perfil de actividad de pH, resistencia a degradación proteolítica, K^m, K^cat, relación K^m, K^cat, plegamiento de proteínas, capacidad de unirse a un sustrato y capacidad de ser secretado.

[0044] El término "propiedad" o equivalentes gramaticales del mismo en el contexto de un ácido nucleico se refiere en el presente documento a cualquier característica o atributo de un ácido nucleico que pueda elegirse o detectarse. Entre estas propiedades se incluyen, sin carácter limitativo, una propiedad que afecta a la transcripción de genes (p. ej., fuerza del promotor o reconocimiento del promotor), una propiedad que afecta al procesamiento de ARN (p. ej., corte y empalme de ARN y estabilidad de ARN), una propiedad que afecta a la traducción (p. ej., regulación, unión de ARNm a proteínas ribosómicas).

[0045] Los términos "estable térmicamente" y "termoestable" hacen referencia a variantes de glucoamilasa de la presente invención que retienen una cantidad específica de actividad enzimática tras la exposición a temperaturas sobre un periodo de tiempo determinado en condiciones que se mantienen durante la hidrólisis de sustratos de almidón, por ejemplo, mientras se exponen a temperaturas modificadas.

[0046] El término "estabilidad mejorada" en el contexto de una propiedad tal como termoestabilidad se refiere a una mayor actividad hidrolítica de almidón retenido con el tiempo en comparación con otra glucoamilasas de referencia (es decir, precursoras).

[0047] El término "estabilidad disminuida" en el contexto de una propiedad tal como termoestabilidad se refiere a una menor actividad hidrolítica de almidón retenido con el tiempo en comparación con otra glucoamilasa de referencia.

[0048] El término "actividad específica" se define como la actividad por mg de proteína de glucoamilasa. En algunas formas de realización, la actividad de glucoamilasa se determina mediante el análisis de etanol descrito en el presente documento y se expresa como la cantidad de glucosa que se produce del sustrato de almidón. En algunas partes de la exposición, la concentración de proteína puede determinarse mediante el análisis Caliper descrito en el presente documento.

[0049] Los términos "activa" y "biológicamente activa" se refieren a una actividad biológica asociada con una proteína específica. Por consiguiente, la actividad biológica de una proteína determinada se refiere a cualquier actividad biológica típicamente atribuida a aquella proteína por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una actividad enzimática asociada a una glucoamilasa es hidrolítica y, por tanto, una glucoamilasa activa presenta actividad hidrolítica.

[0050] Los términos "polinucléotidos" y "ácido nucleico", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Entre estos términos se incluyen, aunque sin carácter limitativo, ADN de cadena simple, doble o triple, ADN genómico, ADNc, ARN, híbrido a DN-ARN o un polímero que comprenda bases de pirimidina y purina u otras bases de nucleótidos naturales, modificadas de forma química, bioquímica, no naturales o derivatizadas.

[0051] Los términos "construcción de ADN, "ADN transformante" y "vector de expresión" se usan indistintamente para referirse al ADN utilizado para introducir secuencias en una célula huésped u organismo. El ADN puede generarse in vitro mediante PCR o cualquier otra técnica adecuada conocida por los expertos en la técnica. La construcción de ADN, el ADN transformante o el casete de expresión recombinante pueden incorporarse en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plastidial, virus o fragmento de ácido nucleico. Normalmente, la parte del casete de expresión recombinante de un vector de expresión, construcción de ADN o ADN transformante incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que ha de transcribirse y un promotor. En algunas partes de la exposición, los vectores de expresión tienen la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula huésped.

[0052] El término "vector" se refiere en el presente documento a una construcción de polinucleótidos diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Entre los vectores se incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores transportadores, plásmidos, casetes y similares.

[0053] Tal y como se emplea en el presente documento en el contexto de introducción de una secuencia de ácido nucleico en una célula, el término "introducido" hace referencia a cualquier método adecuado para transferir la secuencia de ácido nucleico en la célula. Tales métodos para la introducción incluyen sin carácter limitativo fusión de protoplasto, transfección, transformación, conjugación y transducción.

[0054] Los términos "transformada" y "transformada de forma estable" hacen referencia en el presente documento a una célula que tiene una secuencia de polinucleótidos no natural (heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido episomal que se mantiene durante al menos dos generaciones.

[0055] Los términos "marcador seleccionable" y "marcador selectivo" hacen referencia en el presente documento a un ácido nucleico (p. ej., un gen) capaz de expresarse en células huésped que permite la facilidad de selección de aquellos huéspedes que contienen el vector. Normalmente, los marcadores seleccionables son genes que conceden resistencia antimicrobiana o una ventaja metabólica en la célula huésped con el fin de permitir que las células que contienen el ADN exógeno se distingan de las células que no han recibido ninguna secuencia exógena durante la transformación.

[0056] El término "promotor/a" hace referencia en el presente documento a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de un gen aguas abajo. El promotor, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de traducción y transcripción (también denominadas "secuencias de control"), es necesario para expresar un gen determinado. En general, entre las secuencias reguladoras de traducción y transcripción se incluyen, sin carácter limitativo, secuencias promotoras, sitios de unión ribosómicos, secuencias de transcripción de inicio y parada, secuencias de traducción de inicio y de parada y secuencias potenciadoras o activadoras.

[0057] Un ácido nucleico está "unido de forma operativa" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN que codifica un líder secretor (es decir, un péptido señal), está unido de forma operativa a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido. Generalmente, "unido de forma operativa" indica que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura.

[0058] El término "gen" se refiere en el presente documento a un polinucleótido (p. ej., un segmento de ADN) que codifica un polipéptido e incluye regiones que preceden y siguen a las regiones codificantes así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

[0059] Los términos "ortólogo" y "genes ortólogos" se refieren en el presente documento a genes en diferentes especies que han evolucionado de un gen ancestral común (es decir, un gen homólogo) mediante especiación. Normalmente, los ortólogos conservan la misma función durante el transcurso de la evolución. La identificación de ortólogos es útil a la hora de predecir de forma fiable la función del gen en genomas secuenciados recientemente.

[0060] Los términos "parálogo" y "genes parálogos" se refieren en el presente documento a genes que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Mientras que los ortólogos conservan la misma función durante el transcurso de la evolución, los parálogos desarrollan nuevas funciones, aunque algunas funciones están relacionadas normalmente con la original. Entre los ejemplos de genes parálogos se incluyen, sin carácter limitativo, genes que codifican tripsina, quimotripsina, elastasa y trombina, que son todos serina proteasas y se dan de forma conjunta en las mismas especies.

[0061] El término "hibridación" se refiere en el presente documento al proceso por el que una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria a través del apareamiento de bases, como se conoce en la técnica.

[0062] Se considera que una secuencia de ácido nucleico es "hibridable de forma selectiva" en referencia a una secuencia de ácido nucleico si las dos secuencias se hibridan una a la otra de forma específica bajo condiciones de lavado e hibridación con una astringencia de moderada a alta. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (T^m) de la sonda o complejo que une ácido nucleico. Por ejemplo, la "astringencia máxima" normalmente se da a aproximadamente T^m-5 °C (5° por debajo de la T^mde la sonda); "astringencia alta" a aproximadamente 5-10 °C por debajo de la T^m; "astringencia intermedia" a aproximadamente 10-20 °C por debajo de la T^mde la sonda y "baja astringencia" a aproximadamente 20-25°C por debajo de la T^m. De forma funcional, pueden utilizarse las condiciones de astringencia máxima para identificar secuencias que tengan identidad precisa o casi precisa con la sonda de hibridación; mientras que se puede utilizar una hibridación de astringencia intermedia o baja para identificar o detectar homólogos de secuencia de polinucleótidos.

[0063] Las condiciones de hibridación de astringencia moderada y alta son ya conocidas en la técnica. Un ejemplo de condiciones de astringencia alta incluye la hibridación a aproximadamente 42 °C en formamida 50 %, 5X s Sc , 5X solución Denhardt, SDS 0,5 % y 100 pg/ml de ADN portador desnaturalizado seguido de dos lavados en 2X SSC y SDS 0,5 % a temperatura ambiente y dos veces adicionales en 0,1X SSC y SDS 0,5 % a 42 °C. Un ejemplo de condiciones astringentes moderadas incluye una incubación durante la noche a 37 °C en una solución que comprende formamida 20 %, 5 X SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato trisódico), 50 mM fosfato de sodio (pH 7,6), 5 X solución Denhardt, sulfato de dextrano 10 % y 20 mg/ml ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado seguido del lavado de los filtros en 1 X SSC a aproximadamente 37 - 50 °C. Aquellos expertos en la técnica saben cómo regular la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptarse a factores tales como la longitud de sonda y similares.

[0064] El término "recombinante" en el presente documento incluye referencia a una célula o vector que ha sido modificado mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico homóloga o heteróloga o que la célula se ha derivado de una célula modificada de ese modo. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se hallan en forma idéntica dentro de la forma natural (no recombinante) de la célula o expresan genes naturales que se han expresado de otro modo de forma anormal, subexpresado o no expresado en general como resultado de una intervención humana deliberada.

[0065] En una forma de realización de la presente exposición, las secuencias de ADN mutado se generan con mutagénesis por saturación del sitio en al menos un codón. En otra parte de la exposición, la mutagénesis por saturación del sitio se lleva a cabo en dos o más codones. En una parte adicional de la exposición, las secuencias de ADN presentan más del 50 %, más del 55 %, más del 60 %, más del 65 %, más del 70 %, más del 75 %, más del 80 %, más del 85 %, más del 90 %, más del 95 % o más del 98 % de homología con la secuencia precursora. En partes alternativas de la exposición, el ADN mutante se genera in vivo utilizando cualquier procedimiento mutagénico conocido tal como, por ejemplo, radiación, nitrosoguanidina y similares. A continuación, la secuencia de ADN deseada se aísla y se utiliza en los métodos proporcionados en el presente documento.

[0066] El término "proteína heteróloga" se refiere en el presente documento a una proteína o polipéptido que no se da de forma natural en la célula huésped.

[0067] Una enzima está "sobreexpresada" en una célula huésped si la enzima se expresa en la célula con un nivel mayor que el nivel al que se expresa en una célula de tipo silvestre correspondiente.

[0068] Los términos "proteína" y "polipéptido" se utilizan indistintamente en el presente documento. En la presente exposición y reivindicaciones, se utilizan los códigos de una letra y tres letras convencionales para residuos de aminoácidos. Los códigos de 3 letras para aminoácidos se definen según la Comisión sobre nomenclatura bioquímica IUPAC-IUB (JCBN). También se entiende que un polipéptido puede codificarse mediante más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.

[0069] Se describen variantes de la presente exposición mediante la siguiente nomenclatura: [residuo aminoácido original/posición/residuo aminoácido sustituido]. Por ejemplo, la sustitución de leucina por arginina en la posición 76 se representa como R76L. Cuando se sustituye más de un aminoácido en una determinada posición, la sustitución se representa como 1) Q172C, Q172D o Q172R; 2) Q172C, D, o R o 3) Q172C/D/R. Cuando se identifica en la misma una posición adecuada para la sustitución sin un aminoácido específico sugerido, se ha de entender que cualquier residuo de aminoácido puede sustituirse por el residuo de aminoácido presente en la posición. Cuando una glucoamilasa variante contiene una deleción en comparación con otras glucoamilasas la deleción se indica con "*". Por ejemplo, una deleción en la posición R76 se representa como R76*. Una deleción de dos o más aminoácidos consecutivos se indica por ejemplo como (76-78)*.

[0070] Una "prosecuencia" es una secuencia de aminoácidos entre la secuencia señal y la proteína madura que es necesaria para la secreción de la proteína. La escisión de la prosecuencia tendrá como resultado una proteína activa madura.

[0071] El término "secuencia señal" o "péptido señal" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que puedan participar en la secreción de las formas precursoras o maduras de la proteína. Esta definición de secuencia señal es una funcional, que pretende incluir todas las secuencias de aminoácidos codificadas por la parte N-terminal del gen de la proteína, que participan en la realización de la secreción de proteína. Normalmente, aunque no de forma universal, están ligados a la parte N-terminal de una proteína o a la parte N-terminal de una proteína precursora. La secuencia señal puede ser endógena o exógena. La secuencia señal puede estar asociada normalmente a la proteína (p. ej., glucoamilasa) o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada.

[0072] El término forma "precursora" de una proteína o péptido se refiere a la forma madura de la proteína que tiene una prosecuencia unida de forma operativa al carbonilo o amino-terminal de la proteína. El precursor puede también presentar una secuencia "señal" unida de forma operativa al amino-terminal de la prosecuencia. El precursor puede también presentar polipéptidos adicionales que estén involucrados en la actividad traduccional posterior (p. ej., polinucleótidos escindidos de este para dejar la forma madura de una proteína o péptido).

[0073] Los términos "cepa huésped" o "célula huésped" se refieren a un huésped adecuado para un vector de expresión que comprende ADN según la presente exposición.

[0074] Los términos "derivado/a de" y "obtenido/a de" se refieren no solo a una glucoamilasa producida o que se puede producir mediante una cepa del organismo en cuestión, sino también a una glucoamilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de tal cepa y producida en un organismo huésped que contiene dicha secuencia de ADN. Además, el término se refiere a una glucoamilasa que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o ADNc y que presenta las características de identificación de la glucoamilasa en cuestión.

[0075] Un "derivado" dentro del alcance de esta definición generalmente conserva la característica actividad hidrolizante observada en la forma de tipo silvestre, natural o precursora hasta el punto de que el derivado es útil para fines similares como la forma precursora, natural o de tipo silvestre. Los derivados funcionales de glucoamilasas abarcan péptidos o fragmentos de péptidos producidos de forma natural, sintética o recombinante que presentan las características generales de las glucoamilasas de la presente exposición.

[0076] El término "aislado" se refiere a un material que se ha extraído de su medio natural si se da de forma natural.

[0077] Una proteína "purificada" hace referencia a una proteína que está al menos parcialmente purificada para su homogeneidad. En algunas partes de la exposición, una proteína purificada presenta más de un 10 % de pureza, preferiblemente más de un 20 % de pureza e incluso más preferiblemente más de un 30 % de pureza, según se determina mediante SDS-PAGE. Aspectos adicionales de la presente exposición incluyen la proteína en una forma altamente purificada (es decir, más de un 40 % de pureza, más de un 60 % de pureza, más de un 80 % de pureza, más de un 90 % de pureza, más de un 95 % de pureza, más de un 97 % de pureza e incluso más de un 99 % de pureza) según se determina mediante SDS-PAGE.

[0078] El término "mutagénesis combinatoria" hace referencia en el presente documento a métodos en los que se generan las bibliotecas de variantes de una secuencia inicial. En estas bibliotecas, las variantes contienen una o más mutaciones elegidas de un conjunto predefinido de mutaciones. Además, los métodos proporcionan medios para introducir mutaciones aleatorias que no eran elementos del conjunto predefinido de mutaciones. En algunas partes de la exposición, los métodos incluyen aquellos descritos en la patente estadounidense n.° 6582914. En partes alternativas de la exposición, los métodos de mutagénesis combinatoria incluyen kits disponibles comercialmente (p. ej., Quik- Change® Multisite, Stratagene, San Diego, CA).

[0079] El término "biblioteca de mutantes" hace referencia en el presente documento a una población de células que son idénticas en la mayor parte de su genoma pero incluyen diferentes homólogos de uno o más genes. Tales bibliotecas pueden utilizarse, por ejemplo, para identificar genes u operones con rasgos mejorados.

[0080] El término "contenido de sólidos secos (DS o ds por sus siglas en inglés)" hace referencia en el presente documento a los sólidos totales de una suspensión en % sobre una base de peso en seco.

[0081] El término “resultado inicial” hace referencia en el presente documento a una variante que se identificó mediante la detección de una biblioteca de mutagénesis combinatoria por consenso. En algunas partes de la exposición, los resultados iniciales presentan características de actuación mejoradas, comparadas con el gen inicial.

[0082] El término “resultado mejorado” hace referencia en el presente documento a una variante que se identificó mediante la detección de una biblioteca de mutagénesis combinatoria por consenso mejorada.

[0083] El término "propiedad diana" hace referencia en el presente documento a la propiedad del gen inicial que ha de modificarse. No se pretende que la presente exposición esté limitada por ninguna propiedad diana específica. Sin embargo, en algunas partes de la exposición, la propiedad diana es la estabilidad de un producto génico (p. ej., resistencia a la desnaturalización, proteólisis u otros factores de degradación), mientras que en otras partes de la exposición, el nivel de producción en un huésped de producción se modifica. De hecho, se contempla que cualquier propiedad de un gen inicial será útil en la presente exposición. Pueden aparecer otras definiciones de los términos en toda la memoria.

[0084] En los casos en los que se presente una gama de valores, ha de entenderse que también se indica de forma específica cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de cada gama. Cada gama menor entre cualquier valor indicado o valor intermedio en una gama indicada y cualquier otro valor indicado o intermedio en esa gama indicada se incluye dentro de la exposición. Los límites superior e inferior de estas gamas menores pueden incluirse o excluirse de forma independiente en la gama, y cada gama en la que cualquier límite, ambos o ninguno se incluyan en las gamas menores también se incluye dentro de la exposición, sujeta a cualquier límite excluido de forma específica en la gama indicada. En los casos en los que la gama indicada incluya uno o ambos límites, las gamas que excluyan alguno de esos límites incluidos o ambos también se incluyen en la invención.

[0085] Antes de describir las formas de realización de ejemplo con más detalle, ha de entenderse que la presente exposición no está limitada a las formas de realización específicas descritas, ya que tales pueden, obviamente, variar. Pese a que en la práctica o el estudio de la presente exposición pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación.

[0086] Tal y como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/a" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un gen" incluye una pluralidad de tales agentes candidatos y la referencia a "la célula" incluye referencia a una o más células y equivalentes de estas conocidos por los expertos en la técnica, etc.

[0087] Las publicaciones detalladas en el presente documento se presentan únicamente para su exposición anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo que aparece en el presente documento ha de entenderse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder a tal publicación en virtud de la invención anterior.

2. Glucoamilasas precursoras:

[0088] En algunas formas de realización, la presente exposición proporciona una variante de glucoamilasa. La variante de glucoamilasa es una variante de una glucoamilasa precursora, que puede comprender tanto un dominio catalítico como un dominio de unión a almidón. En algunas partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprende un dominio catalítico que presenta una secuencia de aminoácidos como se ilustra en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 o 9 o que presenta una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 80 % de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de aminoácidos ilustradas en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 o 9. En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprende un dominio catalítico codificado por una secuencia de ADN que hibrida bajo condiciones astringentes, medias o altas con un ADN que codifica el dominio catalítico de una glucoamilasa que presenta una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 o 3.

[0089] En algunas partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprende un dominio de unión a almidón que presenta una secuencia de aminoácidos según se ilustra en SEQ ID NO:1, 2, 161, 162, 163, 164, 165, 166 o 167 o que presenta una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 80 % de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de aminoácidos ilustradas en SEQ ID NO: 1, 2, 161, 162, 163, 164, 165, 166, o 167. En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprende un dominio de unión a almidón codificado mediante una secuencia de ADN que hibrida bajo condiciones astringentes, altas o medias con un ADN que codifica el dominio de unión a almidón de una glucoamilasa que presenta una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2.

[0090] La estructura predicha y las secuencias conocidas de glucoamilasas se conservan entre especies fúngicas (Coutinho et al., 1994, Protein Eng., 7:393-400 y Coutinho et al., 1994, Protein Eng., 7: 749-760). En algunas partes de la exposición, la glucoamilasa precursora es una glucoamilasa fúngica filamentosa. En algunas formas de realización, la glucoamilasa precursora se obtiene de una cepa de Trichoderma (p. ej., T. reesei, T. longibrachiatum, T. strictipilis, T. asperellum, T. konilangbra y T. hazianum), una cepa de Aspergillus (p. ej., A. niger, A. nidulans, A. kawachi, A. awamori y A. orzyae), una cepa de Talaromyces (p. ej., T. emersonii, T. thermophilus y T. duponti), una cepa de Hypocrea (p. ej., H. gelatinosa, H. orientalis, H. vinosa y H. citrina), una cepa de Fusarium (p. ej., F. oxysporum, F. roseurn, y F. venenatum), una cepa de Neurospora (p. ej., N. crassa) y una cepa de Humicola (p. ej., H. grisea, H. insolens y H. lanuginosa), una cepa de Penicillium (p. ej., P. notatum o P. chrysogenum) o una cepa de Saccharomycopsis (p. ej., S. fibuligera).

[0091] En algunas partes de la exposición, la glucoamilasa precursora puede ser una glucoamilasa bacteriana. Por ejemplo, el polipéptido puede obtenerse de una cepa bacteriana gram positiva tal como Bacillus (p. ej., B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis, B. stearothermophilus, B. subtilis y B. thuringiensis) o una cepa de Streptomyces (p. ej., S. lividans).

[0092] En algunas partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprenderá un dominio catalítico que presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia, al menos un 85 % de identidad de secuencia, al menos un 90 % de identidad de secuencia, al menos un 95 % de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia y también al menos un 98 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la secuencia de aminoácidos de TrGA de SEQ ID NO: 3.

[0093] En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprenderá un dominio catalítico que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia, al menos un 93 % de identidad de secuencia, al menos un 95 % de identidad de secuencia, al menos un 96 % de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia, al menos un 98 % de identidad de secuencia y también al menos un 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa precursora Aspergillus de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

[0094] En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprenderá un dominio catalítico que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia, al menos un 95 % de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia y también al menos un 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa precursora Humicola grisea (HgGA) de SEQ ID NO: 8.

[0095] En algunas formas de realización, la glucoamilasa precursora comprenderá un dominio de unión a almidón con al menos un 80 % de identidad de secuencia, al menos un 85 % de identidad de secuencia, al menos un 90 % de identidad de secuencia, al menos un 95 % de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia y también al menos un 98 % de identidad de secuencia con el dominio de unión a almidón de la secuencia de aminoácidos de TrGA de SEQ ID NO: 1, o 2.

[0096] En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprenderá un dominio de unión a almidón con al menos un 90% de identidad de secuencia, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia y también al menos un 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa Humicola grísea (HgGA) de SEQ ID NO: 162.

[0097] En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprenderá un dominio de unión a almidón que presenta al menos un 90% de identidad de secuencia, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia y también al menos un 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa Thielavia terrestris (TtGA) de SEQ ID NO: 163.

[0098] En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprenderá un dominio de unión a almidón que presenta al menos un 90% de identidad de secuencia, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia y también al menos un 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa Thermomyces lanuginosus (ThGA) de SEQ ID NO: 164.

[0099] En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprenderá un dominio de unión a almidón que presenta al menos un 90% de identidad de secuencia, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia y también al menos un 99 % de identidad de secuencia con el dominio catalítico de la glucoamilasa Talaromyces emersoniit (TeGA) de SEQ ID NO: 165.

[0100] En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora comprenderá un dominio de unión a almidón que presenta al menos un 90% de identidad de secuencia, al menos un 93 % de identidad de secuencia, al menos un 95 % de identidad de secuencia, al menos un 96 % de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia, al menos un 98 % de identidad de secuencia y también al menos un 99 % de identidad de secuencia con el dominio de unión a almidón de la glucoamilasa precursora Aspergillus de SEQ ID NO: 166 o 167.

[0101] En algunas formas de realización, la glucoamilasa precursora presentará al menos un 80 % de identidad de secuencia, al menos un 85 % de identidad de secuencia, al menos un 88 % de identidad de secuencia, al menos un 90 % de identidad de secuencia, al menos un 93 % de identidad de secuencia, al menos un 95 % de identidad de secuencia, al menos un 96 % de identidad de secuencia, al menos un 97 % de identidad de secuencia, al menos un 98 % de identidad de secuencia y también al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos TrGA de SEQ ID NO: 2.

[0102] En partes adicionales de la exposición, se obtendrá un homólogo de glucoamilasa Trichoderma a partir de una cepa de Trichoderma o Hypocrea. Algunos homólogos típicos de glucoamilasa Trichoderma se describen en la patente estadounidense n.° 7413887 y se hace referencia de forma específica a las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 17-22 y 43-47 de dicha referencia.

[0103] En algunas formas de realización, la glucoamilasa precursora es TrGA que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o un homólogo de la glucoamilasa Trichoderma con al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 88 %, al menos un 90 %, al menos un 93 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de TrGA (SEQ ID NO: 2).

[0104] Una glucoamilasa precursora puede aislarse y/o identificarse mediante técnicas de ADN recombinante convencionales. Se puede utilizar cualquier técnica convencional conocida por los expertos. Por ejemplo, se pueden utilizar sondas y/o cebadores específicos para áreas conservadas de la glucoamilasa con el fin de identificar homólogos en células bacterianas o fúngicas (el dominio catalítico, el centro activo, etc.). De forma alternativa, se puede utilizar una PCR con cebadores degenerados para identificar homólogos en células bacterianas o fúngicas. En algunos casos, se pueden analizar secuencias conocidas, tales como en una base de datos, para determinar la identidad estructural y/o de secuencia con una de las glucoamilasas conocidas, entre las que se incluyen SEQ ID NO: 2 o dominios de unión a almidón conocidos, entre los que se incluyen SEQ ID NO: 161. También se pueden utilizar análisis funcionales para identificar la actividad de glucoamilasa en una célula bacteriana o fúngica. Las proteínas con actividad de glucoamilasa se pueden aislar y cambiar el orden con el fin de aislar la secuencia de ADN correspondiente. El experto en la técnica conoce tales métodos.

3. Homología estructural de la glucoamilasa:

[0105] El dogma central de la biología molecular es que la secuencia de ADN que codifica un gen para una enzima específica determina la secuencia de aminoácidos de la proteína, secuencia que a su vez determina el plegamiento tridimensional de la enzima. plegamiento reúne los residuos dispares que crean un centro catalítico y una superficie de unión al sustrato y tiene como resultado una alta especificidad y actividad de las enzimas en cuestión.

[0106] Las glucoamilasas consisten en hasta tres dominios estructurales distintos, un dominio catalítico de aproximadamente 450 residuos que está conservado de forma estructural en todas las glucoamilasas, generalmente seguido de una región de enlace consistente en entre 30 y 80 residuos que están conectados a un dominio de unión a almidón de aproximadamente 100 residuos. La estructura de la glucoamilasa Trichoderma reesei con las tres regiones intactas se determinó con la resolución Angstrom 1.8 en el presente documento (véase el ejemplo 13). Al utilizar las coordenadas la estructura se alineó con las coordenadas del dominio catalítico de la cepa Aspergillus awamori X100 que se determinó previamente (Aleshin, A.E., Hoffman, C., Firsov, L.M., and Honzatko, R.B. 1994 Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori var. X100. J Mol Biol 238: 575-591.). La estructura de cristal Aspergillus awamori incluía únicamente el dominio catalítico. Como puede observarse en las figuras 12 y 13, la estructura de los dominios catalíticos se superpone muy estrechamente y permite la identificación de los residuos equivalentes según esta superposición estructural. Se cree que todas las glucoamilasas comparten la estructura básica representada en las figuras 12 y 13.

[0107] La figura 12 es una comparación de las estructuras tridimensionales de la glucoamilasa Trichoderma (negra) de SEQ ID NO: 1 (véase la figura 1 para la secuencia de aminoácidos) y de Aspergillus awamorii (gris) vistas de lado. En esta vista, puede verse la relación entre el dominio catalítico y la región de enlace y el dominio de unión a almidón.

[0108] La figura 13 es una comparación de las estructuras tridimensionales de la glucoamilasa Trichoderma (negra) y de Aspergillus awamorii (gris) vistas desde la parte superior. Las glucoamilasas mostradas en el presente documento y de hecho glucoamilasas conocidas a día de hoy comparten esta homología estructural. La conservación de la estructura se corresponde con la conservación de la actividad y un mecanismo conservado de acción para todas las glucoamilasas. Teniendo en cuenta esta alta homología, los cambios que resultan de las variantes específicas del lugar de la glucoamilasa Trichoderma que tienen como resultado una función modificada tendrían consecuencias estructurales y, por tanto, funcionales similares en otras glucoamilasas. Por lo tanto, la información dada a conocer sobre qué variantes presentan beneficios aconsejables puede aplicarse a otras glucoamilasas.

[0109] Se produjo una estructura de cristal adicional utilizando las coordenadas para el dominio de unión a almidón (SBD). El SBD para TrGA se alineó con el SBD para A. niger. Como se muestra en la figura 13, la estructura de los SBD de A. niger y TrGA se superpone muy estrechamente. Se cree que, aunque todos los dominios de unión a almidón comparten al menos parte de la estructura básica representada en la figura 13, algunos SBD se parecen más estructuralmente que otros. Por ejemplo, el SBD de TrGA puede clasificarse como dentro de la familia del módulo de unión de carbohidrato 20 dentro de la base de datos CAZY (cazy.org). La base de datos CAZY describe las familias de módulos de unión de carbohidrato catalíticos y estructuralmente relacionados (o dominios funcionales) de enzimas que degradan, modifican o crean enlaces glicosídicos. Dada una homología estructural alta, las variantes específicas del sitio del SBD de TrGA que tienen como resultado una función modificada también tendrían consecuencias estructurales y, por tanto, funcionales similares en otras glucoamilasas que tengan SBD con estructura similar a la del SBD de TrGA, especialmente aquellos clasificados dentro de la familia de módulo 20 de unión de carbohidratos. Por lo tanto, la información dada a conocer sobre qué variantes presentan beneficios aconsejables puede aplicarse a otros SBD que presentan similaridad estructural.

[0110] Por lo tanto, los números de posición de aminoácidos detallados en el presente documento hacen referencia a aquellos asignados a la secuencia de glucoamilasa Trichoderma reesei madura presentada en la figura 1. Sin embargo, la presente exposición no está limitada a las variantes de la glucoamilasa Trichoderma, sino que se extiende a glucoamilasas que contienen residuos de aminoácidos en posiciones que son “equivalentes” a los residuos identificados específicos en la glucoamilasa Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 2). En una forma de realización de la presente exposición, la glucoamilasa precursora es la glucoamilasa Taleromyces y las sustituciones se realizan en las posiciones de residuo de aminoácidos equivalentes en la glucoamilasa Taleromyces como las descritas en el presente documento. En otras partes de la exposición, la glucoamilasa precursora es una de las enumeradas en la tabla 1. En partes adicionales de la exposición, la glucoamilasa precursora es una glucoamilasa Penicillium, tal como Penicillium chrysogenum.

[0111] La identidad estructural determina si los residuos de aminoácidos son equivalentes. La identidad estructural es un equivalente topológico directo cuando las dos estructuras (estructuras de aminoácidos y tridimensionales) se alinean. Una posición de residuos (aminoácidos) de una glucoamilasa es equivalente a un residuo de glucoamilasa T. reesei si es tanto homóloga (es decir, se corresponde en posición ya sea en estructura primaria o terciaria) como análoga con un residuo específico o parte de ese residuo en la glucoamilasa T. reesei (que tenga la misma capacidad funcional o similar para combinar, reaccionar o interactuar de forma química).

[0112] Con el fin de establecer la identidad con la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una glucoamilasa puede compararse directamente con la secuencia primaria de la glucoamilasa Trichoderma reesei y específicamente con un conjunto de residuos que se sabe son invariables en glucoamilasas por cuya secuencia son conocidos. Por ejemplo, las figuras 4A y 4B en el presente documento muestran los residuos conservados entre glucoamilasas. Las figuras 4C y 4D muestran una alineación de dominios de unión a almidón a partir de diferentes glucoamilasas. Una vez se han alineado los residuos conservados, y permitiendo las inserciones y deleciones necesarias con el fin de mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de residuos conservados a través de la deleción e inserción arbitrarias), se definen los residuos equivalentes a aminoácidos específicos en la secuencia primaria de glucoamilasa Trichoderma reesei. La alineación de residuos conservados normalmente debería conservar el 100 % de tales residuos. Sin embargo, la alineación de más del 75 % o tan solo un 50 % de residuos conservados también es adecuada para definir residuos equivalentes. Además, la identidad estructural puede utilizarse junto con la identidad de secuencia para identificar residuos equivalentes.

[0113] Por ejemplo, en las figuras 4A y 4B, se alinean los dominios catalíticos de glucoamilasas de seis organismos para proporcionar la máxima cantidad de homología entre secuencias de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que existe un número de residuos conservados contenidos en cada secuencia como se indica mediante un asterisco. Por consiguiente, estos residuos conservados pueden usarse para definir los correspondientes residuos de aminoácidos equivalentes de la glucoamilasa Trichoderma reesei en otras glucoamilasas como la glucoamilasa de Aspergillus niger. De forma similar, las figuras 4C y 4D muestran los dominios de unión a almidón de glucoamilasas de siete organismos alineados para identificar residuos equivalentes.

[0114] La identidad estructural supone la identificación de residuos equivalentes entre las dos estructuras. Los "residuos equivalentes" pueden definirse mediante la determinación de homología en el nivel de la estructura terciaria (identidad estructural) para una enzima cuya estructura terciaria ha sido determinada mediante técnicas de cristalografía de rayos X. Los residuos equivalentes se definen como aquellos para cuyas coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de aminoácido específico de la glucoamilasa Trichoderma reesei (N en N, CA en CA, C en C y O en O) están dentro de 0,13 nm y opcionalmente 0,1 nm tras la alineación. La alineación se consigue después de que el mejor modelo se haya orientado y colocado para proporcionar la máxima superposición de coordenadas atómicas de átomos de proteína no hidrógenos de la glucoamilasa en cuestión con la glucoamilasa Trichoderma reesei. El mejor modelo es el modelo cristalográfico que proporciona el factor R más bajo para los datos de difracción experimental con la resolución más alta disponible.

[0115] Los residuos equivalentes que son análogos funcionalmente a un residuo específico de la glucoamilasa Trichoderma reesei se definen como aquellos aminoácidos de la enzima que pueden adoptar una conformación de tal forma que bien cambian, modifican o contribuyen a la estructura proteica, unión de sustrato o catálisis de forma definida y atribuida a un residuo específico de la glucoamilasa Trichoderma reesei. Además, se trata de aquellos residuos de la enzima (para los que se ha obtenido una estructura terciaria mediante cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga hasta el punto de que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo determinado puedan no cumplir los criterios de equivalencia sobre la base de ocupar una posición homóloga, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo quedan con 0,13 nm de los correspondientes átomos de la cadena lateral de la glucoamilasa Trichoderma reesei. Las coordenadas de la estructura tridimensional de la glucoamilasa Trichoderma reesei están establecidas en la tabla 15 y pueden utilizarse como se detalla anteriormente con el fin de determinar residuos equivalentes en el nivel de estructura terciaria.

[0116] Algunos de los residuos identificados para la sustitución son residuos conservados mientras que otros no lo son. En el caso de residuos que no se conservan, la sustitución de uno o más aminoácidos está limitada a las sustituciones que producen una variante que presenta una secuencia de aminoácidos que no se corresponde con una hallada en la naturaleza. En el caso de residuos conservados, tales sustituciones no deberían tener como resultado una secuencia que se da de forma natural.

4. Variantes

[0117] Las variantes según la presente exposición incluyen al menos una sustitución, deleción o inserción en la secuencia de aminoácidos de una glucoamilasa precursora que hace que la variante sea diferente de la glucoamilasa precursora por la secuencia. En algunas partes de la exposición, las variantes de la exposición presentarán al menos un 20 %, al menos un 40 %, al menos un 60 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 % de la actividad de glucoamilasa de la actividad de TrGA de SEQ ID NO: 2.

[0118] En algunas partes de la exposición, las variantes de acuerdo con la exposición comprenderán una sustitución, deleción o inserción en al menos una posición de aminoácidos de la TrGA precursora (SEQ ID NO: 2), o en una posición equivalente en la secuencia de otra glucoamilasa precursora con al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de TrGA, incluyendo sin carácter limitativo al menos un 90 %, al menos un 93 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % y al menos un 99 % de identidad de secuencia.

[0119] En otras partes de la exposición, la variante de acuerdo con la exposición comprenderá una sustitución, deleción o inserción en al menos una posición de aminoácidos de un fragmento de la TrGA precursora, donde el fragmento comprende el dominio catalítico de la secuencia de TrGA (SEQ ID NO: 3), o en una posición equivalente en un fragmento que comprende el dominio catalítico de una glucoamilasa precursora con al menos un 80 % de identidad de secuencia con el fragmento de la secuencia de TrGA, incluyendo sin carácter limitativo al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % y al menos un 99 %. En algunas partes de la exposición, el fragmento comprenderá al menos 400, 425, 450 y/o 500 residuos de aminoácidos.

[0120] En otras partes de la exposición, la variante de acuerdo con la exposición comprenderá una sustitución, deleción o inserción en al menos una posición de aminoácidos de un fragmento de la TrGA precursora, donde el fragmento comprende el dominio de unión a almidón de la secuencia de TrGA (SEQ ID NO: 161), o en una posición equivalente en un fragmento que comprende el dominio de unión a almidón de una glucoamilasa precursora con al menos un 80 % de identidad de secuencia con el fragmento de la secuencia de TrGA, incluyendo sin carácter limitativo al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % y al menos un 99 %. En algunas formas de realización, el fragmento comprenderá al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y/o 109 residuos de aminoácidos del dominio de unión a almidón de TrGA (SEQ ID NO: 161).

[0121] En algunas partes de la exposición, cuando la glucoamilasa precursora incluye un dominio catalítico, una región de enlace y un dominio de unión a almidón, la variante comprenderá una sustitución, deleción o inserción en al menos una posición de aminoácido de un fragmento que comprende parte de la región de enlace. En algunas partes de la exposición, la variante comprenderá una sustitución, deleción o inserción en la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la secuencia de TrGA (SEQ ID NO: 2).

[0122] La identidad estructural con respecto a una sustitución de aminoácidos indica que la sustitución tiene lugar en la posición de aminoácidos equivalente en la glucoamilasa homóloga o glucoamilasa precursora. El término posición equivalente se refiere a una posición que es común a dos secuencias precursoras que se basa en una alineación de la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa precursora en cuestión así como una alineación de la estructura tridimensional de la glucoamilasa precursora en cuestión con la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de referencia TrGA y la secuencia tridimensional. Por ejemplo, en referencia a la figura 5, la posición 24 en TrGA (SEQ ID NO: 2 o 3) es D24 y la posición equivalente para Aspergillus niger (SEQ ID NO: 6) es la posición D25 y la posición equivalente para Aspergillus oryzea (SEQ ID NO: 7) es la posición D26. Véanse las figuras 12 y 13 para una alineación de ejemplo de la secuencia tridimensional.

[0123] En algunas partes de la exposición, la glucoamilasa incluirá al menos una sustitución en la secuencia de aminoácidos de una precursora. En partes adicionales de la exposición, la variante puede presentar más de una sustitución (p. ej., dos, tres o cuatro sustituciones).

[0124] En algunas partes de la exposición, una variante de glucoamilasa comprende una sustitución, deleción o inserción y normalmente un sustitución en al menos una posición de aminoácidos en una posición correspondiente a las regiones de aminoácidos no conservados como se ilustra en la figura 5 (p. ej., posiciones de aminoácidos correspondientes a aquellas posiciones que no están indicadas con "*" en la figura 5).

[0125] Aunque las variantes pueden estar en cualquier posición en la secuencia de proteína madura (SEQ ID NO: 2), en una parte de la exposición, una variante de glucoamilasa comprende una o más sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2: 4, 5, 12, 24, 29, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 61, 70, 73, 75, 76, 94, 100, 108, 114, 116, 119, 122, 124, 125, 137, 143, 146, 148, 169, 171, 172, 175, 178, 180, 181,208, 211, 228, 242, 243, 245, 292, 294, 297, 309, 310, 313, 314, 315, 316, 317, 321, 340, 341, 350, 353, 356, 363, 368, 369, 375, 376, 395, 398, 401,408, 409, 412, 415, 417, 418, 421,430, 431,433, 436, 451, 503, 511, 535, 539 o 563 o en una posición equivalente en una glucoamilasa precursora. En algunas partes de la exposición, la glucoamilasa precursora presentará al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % y al menos un 99 % de identidad con SEQ ID NO: 2. En otras formas de realización, la glucoamilasa precursora será un homólogo de glucoamilasa Trichoderma.

[0126] En algunas partes de la exposición, la variante de glucoamilasa comprende una o más sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2:

D4, F5, I12, D24, F29, I43, D44, P45, D46, Y47, Y49, W51, N61, Y70, G73, Q75, R76, P94, D100, K108, K114, F116, N119, R122, Q124, R125, G137, N146, Q148, Y169, N171, Q172, F175, W178, E180, V181, Q208, S211, W228, N242, E243, R245, 1292, G294, K297, R309, Y310, D313, V314, Y315, Y316, N317, W321, K340, K341, T350, Q356, T363, S368, S369, N376, Y395, A398, S401, R408, N409, T412, L417, H418, W421, T430, A431, R433, 1436, S451, E503, Q511, A535, A539, o N563; o una posición equivalente en una glucoamilasa precursora (p. ej., un homólogo de glucoamilasa Trichoderma).

[0127] En otras partes de la exposición, la variante de una precursora de glucoamilasa comprende una o más sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:2: 4, 5, 24, 29, 43, 44, 49, 61, 70, 73, 75, 76, 100, 108, 119, 124, 137, 146, 148, 169, 171, 172, 175, 178, 181, 208, 211, 243, 292, 294, 297, 314, 316, 317, 340, 341, 350, 356, 363, 368, 369, 376, 395, 401, 409, 412, 417, 430, 431,433, 436, 451, 503, 511, 535, 539 o 563 o una posición equivalente en una glucoamilasa precursora (p. ej., un homólogo de glucoamilasa Trichoderma).

[0128] En partes adicionales de la exposición, la variante de una precursora de glucoamilasa comprende al menos una de las siguientes sustituciones en las siguientes posiciones en una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2: D4L/E/R/S/C/A/Q/W, F5C/M/N/R/S/TN/W, I12L/R, D24E/L/Y/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S/Q, D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C, Y47W,Y49N, N61D/I/L/Q/V/W, Q70R/K/M/P/G/L/F, G73F/C/L/W, Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P, P94L, D100W/I/Q/M/P/A/N, N119P/T/Y/D/E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M, Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T, Y169D/F, Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V, F175H/A/G/R/S/T/C/W/Y, W178A/C/D/E/F/G/H/K/N/R/S/T/V/Y, E180A/C/G/H/I/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y/, V181E/C/D/G/H/I/P/T/Y/S/L/K/F/A, Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211C/R/E/A/Y/W/M/H/L/I/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L, R245A/E/M/I/P/V, I292D/H/P/R/T/N/V/F/L, G294C/D/E/T/Q/I/A, K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/S/R/W, R309A/C/G/H/I/N/P/Q/S/T/W/Y/L, Y310E/G/L/P/S/W/R/Q, D313Q, V314A/R/N/D/C/E/Q/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y, Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, K341F/D/P/V/G/S, T350S/E/A/N, Q356H/D/E, T363L/R/C/H/W, S368W/D/F/L, S369F, N376Q/T/H/S/V, Y395Q/R/S, A398S/I/T, S401C/V, R408S, N409W/T/K, T412A/H/K/G, L417A/D/E/F/G/I/K/Q/R/S/T/V/W/Y, T430A/E/F/G/H/I/K/M/N/Q/R/V, A431C/E/H/I/L/M/Q/R/S/W/Y, R433H/Q, I436A/T, S451M/T/H, E503A/C/D/H/S/V/W, Q511C/G/H/I/K/T/V, A535E/F/G/K/LN/P/R/S/TN/W/Y, A539E/H/M/R/S/W, o N563/A/C/E/I/K/L/Q/T/V; o una sustitución en una posición equivalente en un homólogo de glucoamilasa precursora.

[0129] En algunas partes de la exposición, la variante de glucoamilasa comprende al menos una sustitución en una posición correspondiente a la posición de residuo de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 2: 5, 24, 43, 44, 49, 61, 70, 73, 75, 76, 94, 119, 146, 148, 172, 175, 178, 180, 181, 208, 211, 245, 294, 353, 315, 375, 409, 309, 314, 369, 412, 417, 430, 431, 503, 511, 535, 539 o 563; o una posición equivalente en una glucoamilasa precursora homóloga.

[0130] En algunas partes representativas de la exposición, la variante de glucoamilasa comprende al menos una sustitución elegida del grupo consistente en F5W, D24E, I43R, I43Y, I43Q, I43S, I43F, D44C, D44R, Y47W, Y49N, N61I, Q70K, G73F, Q75R, R76L, P94L, N119P/T/Y/D, N146S/D/T/E/W/L, Q148V N171D, Q172C/D/R/E/F/V/L/T, F175R/W/Y, W178K/N/Y, E180H/N/V/R, V181E/F/G/I/H, Q208A/T/N, S211H/M/L/R, R245E, R245M, G294C, R309W, V314F/G/H/K/P/R/Y, Y315F, S369F, T412K, L417R, L417V, T430A, T430M, A431L, A431Q, E503A, E503V, Q511H, A535R, A539R, N563I y N563K correspondientes a la posición establecida en SEQ ID NO: 2 o una posición equivalente en una glucoamilasa precursora homóloga.

[0131] En partes concretas adicionales de la exposición, la variante de glucoamilasa comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido elegido de entre las posiciones correspondientes a la posición 5, 43, 44, 61, 73, 75, 76, 94, 108, 119, 124, 146, 148, 171, 172, 175, 178, 180, 181, 208, 211,294, 297, 314, 316, 412, 417, 430, 431, 503, 511, 535, 539 o 563 de SEQ ID NO: 2 o una posición equivalente en un homólogo de glucoamilasa Trichoderma. En algunas partes de la exposición, la sustitución se encuentra en una posición correspondiente a la posición número 43, 44, 61, 73, 148, 172, 175, 178, 180, 208, 211, 294, 297, 314, 412, 417, 430, 431, 503, 511, 535, 539 o 563 de SEQ ID NO: 2 o una posición equivalente en un homólogo de glucoamilasa Trichoderma.

[0132] En algunas partes representativas de la exposición, la sustitución está en una posición correspondiente a la posición número 43, 44, 61, 73, 108, 124, 171, 172, 208, 211,294, 314, 316, 417, 430, 431, 503, 511, 535, 539, o 563 de SEQ ID NO: 2, o una glucoamilasa precursora homóloga (p. ej., homólogo de glucoamilasa Trichoderma).

[0133] En algunas partes de la exposición, las variantes de glucoamilasa comprenden múltiples sustituciones.

Algunas de las sustituciones múltiples incluirán una sustitución en una o más de las posiciones equivalentes y que incluyan las posiciones 24, 43, 44, 108, 124, 171, 175, 181,208, 243, 292, 294, 297, 310, 314, 363, 417, 430, 431, 503, 511, 535, 539, o 563 de SEQ ID NO: 2. Entre algunas de las típicas sustituciones múltiples se incluirán una o más de las posiciones equivalentes y correspondientes a las posiciones 43, 44, 61, 73, 08, 124, 171, 208, 211, 294, 314417, 430, 431, 503, 511, 535, 539, o 563 de SEQ ID NO: 2.

[0134] Algunos ejemplos de variantes con sustituciones múltiples incluyen sustituciones en las posiciones: D24/I43/D44/F175/V181/V314/T363;

D24/Q208/I292/G294/K297/Y310;

V181/E243/I292/k297/N317/Y395;

D24/V181/Q208/G294/T363/N376/N409;

D24/V181/I292/G294/E243/N409;

I43R/E243/I292/G294/K297;

I43/D44/N61/L417/E503/Q511/A539;

I43/D44/L417/E503/Q511/A539;

I43/N61/L417/T430/Q511/A539;

I43/N61/L417/E503/Q511/A539;

I43/N61/T430/A431/Q511/A539;

I43/N61/T430/Q511;

I43/N61/T430/Q511/A539;

I43/N61/Q511;

I43/N61/Q511/A539;

I43/G73/T430;

I43/L417/E503/Q511/A539;

I43/L417/Q511;

I43/L417/T430/A431/Q511/A539;

I43/L417/T430/Q511;

I43/L417/T430/Q511/A539;

I43/L417/E503/A539;

I43/L417/E503/Q511/A539;

I43/T430;

I43/T430/A431/E503/Q511;

I43/T430/A431/Q511;

I43/T430/A431/Q511/A539;

I43/T430/E503/Q511;

I43/T430/Q511;

I43Q/T430/Q511/A539;

I43/A431/Q511;

I43/T430/E503/Q511/N563;

I43/T430/E503/A535/N563;

I43/E503/Q511/A539;

I43/Q511/A539;

D44/G73/L417/N563;

D44/G73/E503/Q511;

D44/G73/N563;

D44/L417/N563;

D44/T430/Q511/A535;

D44/E503/Q511/N563;

G73/T430/E503/Q511;

G73/T430/Q511;

G294/L417/A431;

G294/L417/A431/Q511;

L417/T430/A431/Q511/A535/A539/N563;

L417/A431/Q511;

L417/T430/Q511/A535/N563;

L417/T430/Q511/A539/N563 y

E503/N563;

de SEQ ID NO: 2 o posiciones equivalentes en glucoamilasas precursoras y especialmente homólogos de glucoamilasa Trichoderma.

[0135] Algunas variantes con múltiples sustituciones pueden incluir las sustituciones en las posiciones:

Y47F/W,Y315F/W;

D24E,L/I43F,R/D44H,N/F175H/V181K,L/V314D,H,K/T363R;

D24L,W,Y/Q208F/I292F,N,V/G294A,I,Q/K297A/Y310F,Q,R;

V181F,K,L/E243A,N,M,R,Y/I292F,L,N,V/K297A,D,H,M,N,Q/N317H/Y395 Q,R;

D24E,L,Y/V181F,K,L/Q208C,F/G294A,I,Q/T363R/N376Q/N409K,W;

D24E,L,YN181F,K,L/I292F,L,N,V/G294A,I,Q/E243A,M,N,R,Y/N409K, W;

I43R/E243A,M,N,R,Y/I292F,L,N,V/G294A/K297A,D,H,M,N,Q,S,R,W,Y;

I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R;

I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R;

I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R;

I43Q/N61I/L417V/T430M/Q511H/A539R;

I43R/N61I/L417R,V/E503A/Q511H/A539R;

I43Q/N61I/T430A/A431L/Q511H/A539R;

I43Q/N61I/T430A/Q511H;

I43Q/N61I/T430A/Q511H/A539R;

I43Q/N61I/T430M/Q511H/A539RI43Q/N61I/Q511H;

I43Q/N61I/Q511H/A539R;

I43R/G73F/T430A;

I43Q/L417V/T430A/A431L/Q511H/A539R;

I43Q/L417V/T430A/Q511H;

I43Q/L417V/T430A/Q511H/A539R;

I43R/L417R/E503A/A539R;

I43R,Q/L417V/E503A/Q511H/A539R;

I43Q/L417V/Q511H;

I43R,Q/T430A;

I43Q/T430A/A431L/E503A/Q511H;

I43Q/T430A/A431L/Q511H;

I43Q/T430A/A431L/Q511H/A539R;

I43Q/T430A/E503A/Q511H;

I43Q/T430A/Q511H;

I43Q/T430A,M/Q511H/A539R;

I43R/T430A/E503A,V/Q511H/N563K;

I43Q/A431L/Q511H;

I43Q/E503A/Q511H/A539R;

I43Q/Q511H/A539R;

D44C/G73F/E503V/Q511H;

D44C/G73F/L417R/N 563K;

D44C/G73F/N563K;

D44C/L417R/N563K;

D44R/E503A/Q511H/N563I;

D44R/T430A/Q511H/A535R;

G73F/T430A/E503V/Q511H;

G73F/T430A/Q511H;

G294C/L417R/A431L;

G294C/L417R/A431L,Q/Q511H;

G294C/L417V/A431Q;

L417R,V/A431L,Q/Q511H;

L417V/T430A/A431L,Q/Q511H/A535R/A539R/N563I;

L417V/T430A/Q511H/A535R/N563I;

L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I y

E503A/N563I

[0136] Se ha alineado un número de glucoamilasas precursoras con la secuencia de aminoácidos de TrGa. Las figuras 4A y 4B incluyen el dominio catalítico de las siguientes glucoamilasas precursoras: Aspergillus awamori (AaGA) (s Eq ID NO: 5); Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO: 6); Aspergillus orzyae (AoGA) (SEQ ID NO: 7), Humicola grisea (HgGA) (s Eq ID NO: 8); e Hypocrea vinosa (HvGA) (SEQ ID NO: 9). El porcentaje de identidad de los dominios catalíticos se representa en la tabla 1 a continuación. Las figuras 4C y 4D incluyen el dominio de unión a almidón de las siguientes glucoamilasas precursoras: Trichoderma reesei (TrGA) (SEQ ID NO: 161), Humicola grisea (HgGA) (SEQ ID NO: 162), Thielavia terrestris (TtGA) (SEQ ID NO: 163), Thermomyces lanuginosus (ThGA) (SEQ ID NO: 164), Talaromyces emersonii (TeGA) (SEQ ID NO: 165), Aspergillus niger (AnGA) (SEQ ID NO: 166), y Aspergillus awamori (AaGA) (SEQ ID NO: 167). Por ejemplo, la glucoamilasa variante se derivará de una glucoamilasa precursora que es una glucoamilasa Aspergillus y la variante incluirá al menos una sustitución en una posición equivalente a una posición establecida en SEQ ID NO: 2, y en concreto en una posición correspondiente a D4, F5, I12, D24, F29, I43, D44, P45, D46, Y47, Y49, W51, N61, Y70, G73, Q75, R76, P94, D100, K108, K114, F116, N119, R122, Q124, R125, G137, N146, Q148, Y169, N171, Q172, F175, W178, E180, V181, Q208, S211, W228, N242, E243, R245, 1292, G294, K297, R309, Y310, D313, V314, Y315, Y316, N317, W321, K340, K341, T350, Q356, T363, S368, S369, N376, Y395, A398, S401, R408, N409, T412, L417, H418, W421, T430, A431, R433, 1436, S451, E503, Q511, A535, A539, o N563.

[0137] La eliminación con Endo-H de azúcares enlazados a N en la glucoamilasa Trichoderma reesei presentaban un efecto estabilizador (cuando se observaba la T^m). Por lo tanto, las variantes con una sustitución N171D pueden presentar termoestabilidad aumentada en comparación con la precursora de tipo silvestre. En algunas partes de la exposición, se presentan variantes con una o más sustituciones en sitios con azúcares enlazados a N, entre las que se incluye N171D en Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 2).

Tabla 1

[0138] La presente exposición también proporciona variantes de glucoamilasa con al menos una propiedad modificada (p. ej., propiedad mejorada) en comparación con una glucoamilasa precursora y en concreto con la TrGA. En algunas partes de la exposición, al menos una propiedad modificada (p. ej., propiedad mejorada) se elige del grupo consistente en estabilidad del ácido, estabilidad térmica y actividad específica. Normalmente, la propiedad modificada es estabilidad del ácido aumentada, estabilidad térmica aumentada y/o actividad específica aumentada. La estabilidad térmica aumentada se da normalmente a temperaturas superiores. En una forma de realización, la estabilidad del pH aumentada se da con un pH alto. En una forma de realización adicional, la estabilidad del pH aumentada se da con un pH bajo.

[0139] Las variantes de glucoamilasa de la exposición pueden también proporcionar índices superiores de hidrólisis de almidón con concentraciones de sustrato bajas en comparación con la glucoamilasa precursora. La variante puede tener una Vmax superior o Km inferior a una glucoamilasa precursora cuando se realiza el análisis con las mismas condiciones. Por ejemplo, la glucoamilasa variante puede tener una Vmax superior con un intervalo de temperaturas de 25 °C a 70 °C (p. ej., de 25 °C a 35 °C; de 30 °C a 35 °C; de 40 °C a 50 °C; de 50 °C a 55 °C y de 55 °C a 62 °C). Los valores Km, Vmax y la constante Michaelis-Menten pueden determinarse fácilmente utilizando procedimientos conocidos convencionales.

5. Estabilidad térm ica (variantes termoestables)

[0140] En un aspecto, la exposición hace referencia a una glucoamilasa variante con estabilidad térmica modificada con temperaturas modificadas en comparación con una precursora o de tipo silvestre. Las temperaturas modificadas incluyen temperaturas aumentadas o disminuidas. En algunas partes de la exposición, la variante de glucoamilasa presentará termoestabilidad mejorada tal como la retención de al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de actividad enzimática tras la exposición a temperaturas modificadas durante un periodo de tiempo determinado, por ejemplo, al menos 60 minutos, 120 minutos, 180 minutos, 240 minutos, 300 minutos, etc. En algunas partes de la exposición, la variante presenta estabilidad térmica aumentada en comparación con la glucoamilasa precursora con temperaturas elegidas dentro del intervalo de 40 a 80 °C, también dentro del intervalo de 50 a 75 °C y dentro del intervalo de 60 a 70 °C, y normalmente con un intervalo de pH de 4,0 a 6,0. En algunas partes de la exposición, la termoestabilidad se determina tal y como se describe en los ejemplos.

[0141] En algunas partes de la exposición, variantes especialmente interesantes en relación con una mejora en la termoestabilidad incluyen una o más deleciones, sustituciones o inserciones y concretamente sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2: D4, F5, I12, D24, F29, 143, D44, P45, D46, Y47, Y49, W51, N61, Y70, G73, Q75, R76, P94, D100, K108, K114, F116, N119, R122, Q124, R125, G137, N146, Q148, Y169, N171, Q172, F175, W178, E180, V181, Q208, S211, W228, N242, E243, R245, 1292, G294, K297, R309, Y310, D313, V314, Y315, Y316, N317, W321, K340, K341, T350, Q356, T363, S368, S369, N376, Y395, A398, S401, R408, N409, T412, L417, H418, W421, T430, A431, R433, 1436, S451, E503, Q511, A535, A539, o N563; o una posición equivalente en una glucoamilasa precursora. En algunas formas de realización, la glucoamilasa precursora será un homólogo de glucoamilasa Trichoderma y en formas de realización típicas, la glucoamilasa precursora presentará al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

6. Glucoamilasas quiméricas

[0142] Las variantes de glucoamilasa de la presente exposición pueden también incluir glucoamilasas híbridas o quiméricas con, por ejemplo, un dominio de unión a almidón (SBD) de una glucoamilasa y un dominio catalítico y enlazador de otra. Por ejemplo, una glucoamilasa híbrida puede formarse mediante el intercambio del SBD de AnGA con el SBD de TrGA, realizando un híbrido con el SBD de AnGA y el dominio catalítico y enlazador de TrGA. De forma alternativa, el SBD y el enlazador de AnGA pueden intercambiarse por el SBD y el enlazador de TrGA.

7. Actividad específica

[0143] En otro aspecto, la presente exposición hace referencia a una glucoamilasa variante con actividad específica modificada en comparación con una glucoamilasa de tipo silvestre o precursora.

[0144] En algunas partes de la exposición, variantes especialmente interesantes en relación con una mejora en la actividad específica incluyen una o más deleciones, sustituciones o inserciones y concretamente sustituciones en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2: D4, F5, I12, D24, F29, 143, D44, P45, D46, Y47, Y49, W51, N61, Y70, G73, Q75, R76, P94, D100, K108, K114, F116, N119, R122, Q124, R125, G137, N146, Q148, Y169, N171, Q172, F175, W178, E180, V181, Q208, S211, W228, N242, E243, R245, 1292, G294, K297, R309, Y310, D313, V314, Y315, Y316, N317, W321, K340, K341, T350, Q356, T363, S368, S369, N376, Y395, A398, S401, R408, N409, T412, L417, T430, A431, H418, W421, R433, 1436, S451, E503, Q511, A535, A539, o N563; o una posición equivalente en una glucoamilasa precursora. En algunas partes de la exposición, las variantes de la presente exposición con actividad específica mejorada incluyen una sustitución en las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2: D4, D24, I43, D44, N61, Y70, G73, Q75, R76, D100, K108, N119, Q124, N146, Q148, N171, Q172, F175, V181, Q208, S211, E243, R245, 1292, G294, K297, V314, Y316, N317, K340, K341, T350, Q356, T363, S368, N376, Y395, A398, S401, N409, T412, L417, T430, A431, I436, S451, E503, Q511, A535, A539, o N563; o una posición equivalente en una glucoamilasa precursora. En algunas formas de realización, la glucoamilasa precursora comprenderá una secuencia con al menos un 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 2.

8. Polinucleótidos

[0145] La presente exposición también hace referencia a polinucléotidos aislados que codifican una glucoamilasa variante de la presente exposición. Los polinucleótidos que codifican una glucoamilasa variante pueden prepararse mediante técnicas consolidadas conocidas en la técnica. Los polinucleótidos pueden prepararse de forma sintética, tal como mediante un sintetizador de ADN automático. La secuencia de ADN puede ser de origen sintético y genómico combinados (o ADNc) preparada mediante la ligación conjunta de fragmentos. Los polinucleótidos pueden también prepararse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) utilizando cebadores específicos. En general, se hace referencia a Minshull J., et al., (2004), Engineered protein function by selective amino acid diversification, Methods 32(4):416-427. Asimismo, una serie de empresas ahora sintetizan ADN, como por ejemplo Geneart AG, Regensburg, Alemania.

[0146] La presente exposición también proporciona polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos (i) con al menos un 70 % de identidad con SEQ ID NO: 4, o (ii) capaz de hibridar con una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 4, con condiciones de astringencia intermedia a alta, o (iii) complementaria a una secuencia de nucleótidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia establecida en SEQ ID NO: 4. Sondas útiles según la presente exposición pueden incluir al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 4.

[0147] La presente exposición proporciona además polinucleótidos aislados que codifican glucoamilasas variantes que comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 80 % de identidad secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2. En algunas formas de realización, las glucoamilasas variantes presentan al menos un 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2. En algunas formas de realización, las glucoamilasas variantes presentan al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2. En algunas formas de realización, las glucoamilasas variantes presentan al menos un 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2. En algunas formas de realización, las glucoamilasas variantes presentan al menos un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2. En algunas formas de realización, las glucoamilasas variantes presentan al menos un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2. La presente exposición también proporciona vectores de expresión que comprenden cualquiera de los polinucleótidos proporcionados anteriormente.

[0148] La presente exposición también proporciona fragmentos (es decir, partes) del ADN que codifica las glucoamilasas variantes proporcionadas en el presente documento. Estos fragmentos son útiles a la hora de obtener fragmentos de ADN de longitud parcial capaces de ser usados para aislar o identificar polinucleótidos que codifican enzimas de glucoamilasa maduras descritas en el presente documento a partir de células fúngicas filamentosas (p. ej., Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Schizosaccharomyces y Humicola), o un segmento de estas con actividad de glucoamilasa. En algunas partes de la exposición, los fragmentos del ADN pueden comprender al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300 o más nucleótidos contiguos. En algunas partes de la exposición, partes del ADN proporcionadas en SEQ ID NO: 4 pueden utilizarse a la hora de obtener homólogos de glucoamilasa precursora y concretamente homólogos de glucoamilasa Trichoderma de otras especies, tal como hongos filamentosos que codifican una glucoamilasa.

9. Construcciones de ADN y vectores

[0149] Según una forma de realización de la presente exposición, una construcción de ADN que comprende un polinucleótido según se describe anteriormente y que codifica una glucoamilasa variante incluida en la presente exposición y unida de forma operativa a una secuencia promotora se junta para transferirse a una célula huésped.

[0150] La construcción de ADN puede introducirse en una célula huésped utilizando un vector. El vector puede ser cualquier vector que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra normalmente en el genoma de la célula huésped y se duplica. Entre los vectores se incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores transportadores, plásmidos, partículas fágicas, casetes y similares. En algunas partes de la exposición, el vector es un vector de expresión que comprende secuencias reguladoras unidas de forma operativa a la secuencia que codifica la glucoamilasa.

[0151] Ejemplos de vectores de expresión y/o integración adecuados se presentan en Sambrook et al., (1989) supra, y Ausubel (1987) supra, y van den Hondel et al.. (1991) en Bennett y Lasure (Eds.) MORE GENE m A n Ip UlATIONS IN FUNGI, Academic Press pp. 396-428 y la patente estadounidense n.° 5874276. El catálogo de cepas del Centro de Almacenamiento genético fúngico (FGSC, < www.fgsc.net>) también expone vectores útiles. Entre los vectores especialmente útiles se incluyen vectores obtenidos de, por ejemplo, Invitrogen y Promega.

[0152] Vectores específicos adecuados para utilizarse en células huésped fúngicas incluyen vectores tales como pFB6, pBR322, pUC18, pUC100, pDONR™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z y pGEM®4Z. Un vector de expresión con fin general útil en Aspergillus incluye pRAX con un promotor glaA, y en Hypocrea/Trichoderma incluye pTrex3g con un promotor cbh1.

[0153] Plásmidos adecuados para utilizarse en células bacterianas incluyen pBR322 y pUC19 que permiten la replicación en E.coli y pE194 por ejemplo que permite la replicación en Bacillus.

[0154] En algunas partes de la exposición, el promotor muestra actividad transcripcional en una célula huésped fúngica o bacteriana y puede derivarse de genes que codifican proteínas ya sean homólogas o heterólogas a la célula huésped. El promotor puede ser un promotor híbrido, truncado y/o mutante. Los promotores mencionados anteriormente son conocidos en la técnica.

[0155] Ejemplos de promotores adecuados útiles en células fúngicas y especialmente en células fúngicas filamentosas tal como células Trichoderma o Aspergillus incluyen tales promotores de ejemplo como los promotores cbh1, cbh2, egl1, egl2, eg5, xln1 y xln2 de T. reesei. Otros ejemplos de promotores útiles incluyen promotores de genes de glucoamilasa A. awamori y A. niger (glaA) (véase, Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol.

4:2306-2315 y Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1581-1585), promotor de TAKA amilasa A oryzae, el promotor TPI (triosa fosfato isomerasa) de S. cerevisiae, el promotor de genes acetamidasa Aspergillus nidulans y genes lipasa Rhiaomucor miehei.

[0156] Ejemplos de promotores adecuados útiles en células bacterianas incluyen aquellos obtenidos del operón lac E. coli; gen alfa-amilasa Bacillus licheniformis (amyL), gen amilasa B. stearothermophilus (amyM); genes xylA y xylB Bacillus subtilis, el gen beta-lactamasa y el promotor tac.

[0157] En una parte de la exposición, el promotor es uno que es natural a la célula huésped. Por ejemplo, cuando el huésped es T. reesei, el promotor es un promotor natural de T. reesei. En otras formas de realización, el promotor es uno que es heterólogo a la célula huésped fúngica. En algunas formas de realización, el promotor será el promotor de la glucoamilasa precursora tal como el promotor de TrGA.

[0158] En algunas partes de la exposición, la construcción de ADN incluye ácidos nucleicos que codifican una secuencia señal que es una secuencia de aminoácidos enlazada al amino terminal del polipéptido que dirige al polipéptido codificado a la trayectoria secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico puede incluir de forma natural una región codificante de péptido señal que está enlazada de forma natural en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante de glucoamilasa que codifica la glucoamilasa secretada o el extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico puede incluir un péptido señal que es ajeno a la secuencia codificante. En algunas partes de la exposición, la construcción de ADN incluye una secuencia señal que está asociada de forma natural a un gen de glucoamilasa precursora a partir del cual se obtiene la glucoamilasa variante. En algunas partes de la exposición, la secuencia señal será la secuencia representada en SEQ ID NO: 1 o una secuencia con al menos un 90 %, al menos un 94 % y al menos un 98 % de identidad de secuencia con la misma. Secuencias señales eficaces pueden incluir las secuencias señales obtenidas de glucoamilasas de otras enzimas fúngicas filamentosas, tal como de Trichoderma (glucoamilasa T. reesei), Humicola (celulasa H. insolens o glucoamilasa H. grisea), Aspergillus (glucoamilasa A. niger y TAKA amilasa A. oryzae) y Rhizopus.

[0159] En partes adicionales de la exposición, una construcción de ADN o vector que comprende una secuencia señal y una secuencia promotora que han de introducirse en una célula huésped se derivan de la misma fuente. En algunas formas de realización, se puede utilizar la secuencia señal de glucoamilasa natural de un homólogo de glucoamilasa Trichoderma, tal como una secuencia señal de una cepa de Hypocrea.

[0160] En algunas partes de la exposición, el vector de expresión también incluye una secuencia de terminación. En la presente exposición, puede utilizarse cualquier secuencia de terminación funcional en la célula huésped. En una forma de realización, la secuencia de terminación y la secuencia promotora se derivan de la misma fuente. En otra forma de realización, la secuencia de terminación es homóloga a la célula huésped. Entre las secuencias de terminación útiles se incluyen secuencias de terminación obtenidas a partir de los genes de cbh1 Trichoderma reesei; glucoamilasa A. niger o A. awamori (Nunberg et al. (1984) supra, y Boel et al., (1984) supra), antranilato sintasa Aspergillus nidulans, Taka amilasa Aspergillus oryzae o A. nidulans trpC (Punt et al., (1987) Gene 56:117-124).

[0161] En algunas partes de la exposición, un vector de expresión incluye un marcador seleccionable. Entre los ejemplos de típicos marcadores seleccionables se incluyen unos que confieren resistencia antimicrobiana (p. ej., higromicina y fleomicina). Los marcadores selectivos nutricionales también son útiles en la presente exposición incluyendo aquellos marcadores conocidos en la técnica como amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa) y pyrG (orotidina-5' fosfato descarboxilasa). Los marcadores útiles en sistemas de vectores para la transformación de Trichoderma son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Finkelstein, capítulo 6 en BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992); Kinghom et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, Londres; Berges and Barreau (1991) Curr. Genet. 19:359-365; y van Hartingsveldt et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 206:71-75). En una parte típica de la exposición, el marcador selectivo es el gen amdS, que codifica la enzima acetamidasa, lo que permite que las células transformadas crezcan en acetamida como una fuente de nitrógeno. El uso del gen amdS A. nidulans como marcador selectivo se describe en Kelley et al., (1985) EMBO J. 4:475-479 y Penttila et al., (1987) Gene 61:155-164.

[0162] Los métodos utilizados para ligar la construcción de ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucoamilasa variante, un promotor, un terminador y otras secuencias y para insertarlos en un vector adecuado son conocidos en la técnica. El enlace se consigue generalmente mediante la ligación en los sitios de restricción convenientes. Si no existen estos sitios, los enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica convencional. (Véase, Sambrook (1989) supra, y Bennett and Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego (1991) pp 70-76.) De forma adicional, los vectores pueden construirse utilizando técnicas de recombinación conocidas (p. ej., Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).

10. Células huésped

[0163] La presente invención también hace referencia a células huésped que comprenden un polinucleótido que codifica una glucoamilasa variante de la exposición, que se utilizan para producir las glucoamilasas de la exposición. En algunas partes de la exposición, las células huésped se eligen de células bacterianas, fúngicas, vegetales y de levadura. El término célula huésped incluye tanto las células como la progenie de las células y protoplastos creados a partir de las células que se utilizan para producir una glucoamilasa variante según la presente exposición.

[0164] En algunas formas de realización, las células huésped son células huésped fúngicas y normalmente células huésped fúngicas filamentosas. El término "hongos filamentosos" hace referencia a las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina (Véase Alexopoulos, C. J. (1962), INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, Nueva York). Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos de la exposición. Los hongos filamentosos de la presente exposición son distintos morfológica, fisiológica y genéticamente de las levaduras. El crecimiento vegetativo por hongos filamentosos se realiza mediante elongación de las hifas y el catabolismo de carbono es aerobio obligado. En la presente exposición, la célula precursora fúngica filamentosa puede ser una célula de una especie de entre, sin carácter limitativo, Trichoderma, (p. ej., Trichoderma reesei, la mutación asexual de Hypocreajecorina, clasificada anteriormente como T. longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol 20:46-53; ATCC n.° 56765 y ATCC n.° 26921); Penicillium sp., Humicola sp. (p. ej., H. insolens, H. lanuginosay H. grisea); Chrysosporium sp. (p. ej., C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (p. ej., A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans, y A. awamori) (Ward et al., (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743 y Goedegebuur et al., (2002) Genet 41:89-98), Fusarium sp., (p.ej., F. roseum, F. graminum F. cerealis, F. oxysporuim y F. venenatum), Neurospora sp., (N. crassa), Hypocrea sp., Mucor sp., (M. miehei),, Rhizopus sp. y Emericella sp. (véase también, Innis et al., (1985) Sci. 228:21-26). Los términos "Trichoderma" o "Trichoderma sp." o "Trichoderma spp." hacen referencia a cualquier género fúngico clasificado previamente o actualmente como Trichoderma.

[0165] En algunas formas de realización, las células huésped serán células bacterianas gram positivas. Entre los ejemplos sin carácter limitativo se incluyen cepas de Streptomyces, (p. ej., S. liv idans, S. coelicolor y S. griseus) y Bacillus. Tal y como se utiliza en el presente documento, "el género Bacillus" incluye todas las especies dentro del género "Bacillus", según lo conocen los expertos en la técnica, entre las que se incluyen sin carácter limitativo B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, y B. thuringiensis. Se ha reconocido que el género Bacillus sigue experimentando reorganización taxonómica. Por lo tanto, se pretende que el género incluya especies que han sido reclasificadas, incluyendo sin carácter limitativo tales organismos como B. stearothermophilus, que ahora se denomina "Geobacillus stearothermophilus".

[0166] En algunas partes de la exposición, la célula huésped es una cepa bacteriana gram negativa, tal como E. coli o Pseudomonas sp. En otras partes de las exposición, las células huésped pueden ser células de levadura tal como Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp. o Candida sp.

[0167] En otras partes de la exposición, la célula huésped será una célula huésped diseñada genéticamente en la que los genes naturales se han desactivado, por ejemplo, mediante deleción en células bacterianas o fúngicas. Cuando se desee obtener una célula huésped fúngica con uno o más genes desactivados, se pueden utilizar métodos conocidos (p. ej., los métodos expuestos en la patente estadounidense n.° 5246853, la patente estadounidense n.° 5475l0 l, y WO 92/06209). La desactivación génica puede conseguirse mediante una deleción completa o parcial, mediante desactivación por inserción o mediante cualquier otro medio que proporcione un gen no funcional para el fin destinado (de forma que se impida la expresión del gen de una proteína funcional). En algunas formas de realización, cuando la célula huésped es una célula Trichoderma y especialmente una célula huésped T. reesei, los genes cbhl, cbh2, egll y egl2 se desactivarán y/o delecionarán normalmente. Normalmente, células huésped Trichoderma reesei con proteínas con deleción cuádruple se establecen y describen en la patente estadounidense n.° 5847276 y WO 05/001036. En otras partes de la exposición, la célula huésped es una cepa carente de proteasa o proteasa negativa.

11. Transformación de células huésped

[0168] La introducción de una construcción de ADN o vector en una célula huésped incluye técnicas tales como transformación, electroporación, microinyección nuclear, transducción, transfección (p. ej., transfección mediada por lipofección y mediada por DEAE-Dextrina); incubación con precipitado de ADN fosfato calcio; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles revestidos de ADN y fusión de protoplastos. Las técnicas de transformación generales se conocen en la técnica (véase, p. ej., Ausubel et al., (1987), supra, capítulo 9; y Sambrook (1989) supra, y Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16:53-56).

[0169] Los métodos de transformación para Bacillus se exponen en numerosas referencias entre las que se incluyen Anagnostopoulos C y J. Spizizen (1961) J. Bacteriol. 81:741-746 y WO 02/14490.

[0170] Los métodos de transformación para Aspergillus se describen en Yelton et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE UU 81:1470-1474; Berka et al., (1991) en Applications of Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly and Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., (2000) Science 9:991-1001; Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16:53-56 y EP 238 023. La expresión de proteína heteróloga en Trichoderma se describe en la patente estadounidense n.° 6022725; la patente estadounidense n.° 6268328; Harkki et al. (1991); Enzyme Microb. Technol. 13:227-233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7:596-603; EP 244,234; EP 215,594; y Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", en MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong y Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pp. 129-148). También se hace referencia a WO96/00787 y Bajar et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE UU 88:8202-8212 para la transformación de cepas Fusarium.

[0171] En una parte específica de la exposición, la preparación de Trichoderma sp. para la transformación implica la preparación de protoplastos a partir de micelios fúngicos (Véase, Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16:53-56; Pentilla et al., (1987) Gene 61:155-164). La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de hongos filamentosos es conocida (véase de Groot et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:839-842). También se hace referencia a la patente estadounidense n.° 6022725 y la patente estadounidense n.° 6268328 para los procedimientos de transformación utilizados con huéspedes fúngicos filamentosos.

[0172] Normalmente, los transformantes estables genéticamente se construyen con sistemas de vectores por los que el ácido nucleico que codifica la glucoamilasa variante se integra de forma estable en un cromosoma de la cepa huésped. A continuación, se purifican los transformantes con técnicas conocidas.

[0173] En algunas formas de realización adicionales, las células huésped son células vegetales, tal como células de una planta monocotiledónea (p. ej., maíz, trigo y sorgo) o células de una planta dicotiledónea (p. ej., soja). Los métodos para realizar construcciones de ADN útiles para la transformación de plantas y métodos para la transformación vegetal son conocidos. Algunos de estos métodos incluyen transferencia génica mediada por Agrobacterium tumefaciens; bombardeo de microproyectiles, transformación de protoplastos mediada por p Eg , electroporación y similares. Se hace referencia a (la patente estadounidense n.° 6803499, la patente estadounidense n.° 6777589; Fromm et al (1990) Biotechnol. 8:833-839; Potrykus et al (1985) Mol. Gen. Genet.

199:169-177.

12. Producción de proteínas

[0174] La presente invención hace referencia además a métodos para producir las glucoamilasas variantes que comprenden la transformación de una célula huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una glucoamilasa variante de acuerdo con la presente exposición, el cultivo opcional de la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de la glucoamilasa variante y la recuperación opcional de la glucoamilasa.

[0175] En los métodos de producción y expresión de la presente exposición, las células huésped se cultivan bajo condiciones adecuadas en cultivo con agitación del matraz, fermentaciones a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes y discontinuas) en fermentadores industriales o de laboratorio, con el medio adecuado que contenga sales fisiológicas y nutrientes (véase, p. ej., Pourquie, J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 y Ilmen, M. et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306). Los medios comunes preparados comercialmente (p. ej., caldo de extracto de malta levadura, caldo Luria Bertani y el caldo Sabouraud Dextrosa) son útiles en la presente exposición. Las condiciones de cultivo para células fúngicas filamentosas y bacterianas son conocidas en la técnica y pueden hallarse en la literatura científica y/o desde la fuente de los hongos tal como American Type Culture Collection y Fungal Genetics Stock Center. En los casos en los que una secuencia codificante de glucoamilasa esté bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor (p. ej., un azúcar, una sal metálica o antimicrobiano) se añade al medio con una concentración eficaz para inducir la expresión de glucoamilasa.

[0176] En algunas partes de la exposición, la presente exposición hace referencia a métodos para producir la glucoamilasa variante que comprenden el cultivo de una planta o célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica una glucoamilasa variante de acuerdo con la exposición bajo condiciones adecuadas para la producción de la variante y la recuperación opcional de la glucoamilasa.

[0177] En algunas partes de la exposición, con el fin de evaluar la expresión de una glucoamilasa variante mediante una línea celular que ha sido transformada con un polinucleótido que codifica una glucoamilasa variante incluida en la exposición se llevan a cabo ensayos en el nivel de proteína, el nivel de ARN y/o mediante el uso de bioanálisis funcionales específicos de la actividad y/o producción de glucoamilasa. Algunos de estos ensayos incluyen la prueba de Northern blot, dot blot (análisis de ADN o ARN), RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) o hibridación in situ utilizando una sonda marcada de forma adecuada (según la secuencia codificante de ácido nucleico) y la prueba de Southern blot convencional y autorradiografía.

[0178] Además, la producción y/o expresión de una glucoamilasa variante puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante ensayos que miden directamente los azúcares reductores tal como glucosa en el medio de cultivo y mediante ensayos que miden la actividad, expresión y/o producción de glucoamilasa. En concreto, la actividad de glucoamilasa puede analizarse mediante el método del ácido 3,5-dinitrosalicídico (DNS) (Véase, Goto et al., (1994) Biosci. Biotechnol. Biochem. 58:49-54). En formas de realización adicionales, la expresión de proteína se evalúa mediante métodos inmunológicos, tal como la coloración inmunohistoquímica de células, secciones de tejido o inmunoanálisis de un medio de cultivo de tejido (p. ej., mediante Western blot o ELISA). Tales inmunoanálisis pueden utilizarse para evaluar de forma cualitativa y cuantitativa la expresión de una glucoamilasa. Los expertos en la técnica conocen los detalles de tales métodos y muchos reactivos para practicar tales métodos están disponibles comercialmente.

[0179] Las glucoamilasas de la presente exposición pueden recuperarse o purificarse del medio de cultivo mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica entre los que se incluyen la centrifugación, la filtración, la extracción, la precipitación y similares.

13. Composiciones

[0180] Las glucoamilasas variantes pueden utilizarse en composiciones de enzima entre las que se incluyen sin carácter limitativo composiciones para la hidrólisis y sacarificación de almidón, composiciones de limpieza y detergente (p. ej., detergentes para la colada, detergentes para lavar los platos y composiciones de limpieza de superficies duras), composiciones para la fermentación del alcohol y en composiciones para pienso animal. Además, las glucoamilasas variantes pueden utilizarse en aplicaciones de cocción, tal como la producción de pan y pasteles, destilación, atención sanitaria, textil, procesos de conversión de residuos medioambientales, procesamiento de biopulpeo y aplicaciones de conversión de biomasa.

[0181] En algunas partes de la exposición, se utilizará de forma opcional una composición de enzima que incluye una glucoamilasa variante incluida en la exposición obtenida en un medio de cultivo o recuperada y purificada del medio de cultivo junto con cualquiera de las siguientes enzimas o una combinación de estas - alfa-amilasas, proteasas, pululanasas, isoamilasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, ciclodextrina glicotransferasas, lipasas, fitasas, laccasas, oxidasas, esterasas, cutinasas, xilanasas, enzimas hidrolizantes de almidón granular y otras glucoamilasas. En una parte de la exposición, las proteasas son proteasas fúngicas ácidas (AFP por sus siglas en inglés). En partes adicionales de la exposición, las proteasas fúngicas ácidas son de Trichoderma (p. ej., NSP-24, véase también US 2006/0154353, publicada el 13 de julio de 2006). En una parte adicional de la exposición, la fitasa es de Buttiauxiella spp. (p. ej., BP-17, véanse también las variantes expuestas en la publicación de patente PCT WO 2006/043178).

[0182] En algunas composiciones representativas, las glucoamilasas variantes de la exposición se combinarán con un alfa-amilasa, tal como alfa-amilasas fúngicas (p. ej., Aspergillus sp.) o alfa-amilasas bacterianas (p. ej., Bacillus sp. tal como B. stearothermophilus, B. amyloliquefaciens y B. licheniformis) y variantes e híbridos de estas. En algunas partes de la exposición, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa estable ácida. En una parte de la exposición, la alfa-amilasa es una enzima hidrolizante de almidón granular (GSHE). En una parte de la exposición, la alfaamilasa es alfa-amilasa Aspergillus kawachi (AKAA), véase US 7037704. Las alfa-amilasas disponibles comercialmente contempladas para utilizarse en las composiciones de la presente exposición son conocidas e incluyen GZYME G997, SPEZYME FRED, SPEZYME XTRA, STARGEN (Danisco US, Inc, Genencor Division), TERMAMYL 120-L y SUPRA (Novozymes, Biotech.) y VIRIDIUM (Diversa).

[0183] En otras partes de la exposición, las glucoamilasas variantes de la presente exposición pueden combinarse con otras glucoamilasas. En algunas partes de la exposición, las glucoamilasas de la presente exposición se combinarán con una o más glucoamilasas derivadas de cepas de Aspergillus o variantes de esta, tal como A. oryzae, A. niger, A. kawachi, y A. awamori; glucoamilasas derivadas de cepas de Humicola o variantes de esta, especialmente H. grisea, tal como la glucoamilasa con al menos un 90 %, 93 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 expuesta en WO 05/052148; glucoamilasas derivadas de cepas de Talaromyces o variantes de esta, especialmente T. emersonii; glucoamilasas derivadas de cepas de Athelia y especialmente A. rolfsii; glucoamilasas derivadas de cepas de Penicillium, especialmente P. chrysogenum.

14. Usos

[0184] En concreto, las glucoamilasas variantes pueden utilizarse para los procesos de conversión de almidón, y especialmente en la producción de dextrosa para jarabes de fructosa, azúcares especializados y en la producción de alcohol y otros productos finales (p. ej., ácido orgánico, ácido ascórbico y aminoácidos) a partir de la fermentación de sustratos que contienen almidón (G.M.A van Beynum et al., Eds. (1985) STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Marcel Dekker Inc. NY). Las dextrinas producidas utilizando composiciones de glucoamilasa variante de la presente exposición pueden tener como resultado una producción de glucosa de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % y al menos un 95 %. La producción de alcohol a partir de la fermentación de sustratos de almidón con glucoamilasas de la presente exposición puede incluir la producción de carburante alcohólico y alcohol de boca. En algunas partes de la exposición, la producción de alcohol será mayor cuando la glucoamilasa variante se utilice con las mismas condiciones que la glucoamilasa precursora. En algunas partes de la exposición, la producción de alcohol será entre aproximadamente un 0,5 % y 2,5 % mayor, incluyendo sin carácter limitativo 0,6 %; 0,7 %; 0,8 %; 0,9 %; 1,0 %; 1,1 %; 1,2 %; 1,3 %; 1,4 %; 1,5 %; 1,6 %; 1,7 %; 1,8 %; 1,9 %; 2,0 %; 2,1 %; 2,2 %; 2,3 % y 2,4 % más de alcohol que la glucoamilasa precursora.

[0185] En una parte representativa de la exposición, las glucoamilasas variantes de la exposición serán útiles en la hidrólisis de almidón de diferentes sustratos con base vegetal, que se utilizan para la producción de alcohol. En algunas partes de la exposición, los sustratos con base vegetal incluirán maíz, trigo, cebada, centeno, sorgo, arroz, caña de azúcar, patatas y combinaciones de estos. En algunas partes de la exposición, el sustrato con base vegetal se fraccionará en material vegetal, por ejemplo, un grano de cereal, tal como maíz, que se fracciona en componentes tal como fibra, germen, proteína y almidón (endospermo) (patente estadounidense n.° 6254914 y patente estadounidense n.° 6899910). Los métodos para las fermentaciones de alcohol se describen en THE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCE FOR THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES, 3a Ed., Eds K.A. Jacques et al., 1999, Nottingham University Press, Reino Unido. En determinadas partes de la exposición, el alcohol será etanol. En concreto, los procesos de producción de fermentación de alcohol se caracterizan como procesos de molienda húmeda o seca. En algunas partes de la exposición, la glucoamilasa variante se utilizará en un proceso de fermentación de molienda húmeda y en otras partes de la exposición la glucoamilasa variante será útil en un proceso de molienda seca.

[0186] La molienda de grano seco implica un número de etapas básicas, que incluyen generalmente: triturado, cocción, licuefacción, sacarificación, fermentación y separación de líquidos y sólidos con el fin de producir alcohol y otros subproductos. Se tritura material vegetal y especialmente granos de cereales integrales, tal como maíz, trigo o centeno. En algunos casos, el grano se puede fraccionar primero en partes componentes. El material vegetal triturado puede molerse para obtener una partícula fina o gruesa. El material vegetal triturado se mezcla con líquido (p. ej., agua y/o finos residuos de la destilería) en un tanque de suspensión. La suspensión está sujeta a altas temperaturas (p. ej., de 90 °C a 105 °C o superiores) en una caldera de inyección a vapor junto con enzimas de licuefacción (p. ej., alfa-amilasas) para solubilizar e hidrolizar el almidón en el grano a dextrinas. La pulpa se enfría y se trata además con enzimas de sacarificación, tal como glucoamilasas incluidas en la presente exposición, para producir glucosa. A continuación, la pulpa que contiene glucosa puede fermentarse durante aproximadamente un intervalo de 24 a 120 horas en presencia de microorganismos de fermentación, tal como microorganismos que producen etanol y especialmente levadura (Saccharomyces spp). Los sólidos en la mezcla se separan de la fase líquida y se obtiene alcohol tal como etanol y subproductos útiles tal como granos de destilación.

[0187] En algunas partes de la exposición, la etapa de sacarificación y la etapa de fermentación se combinan y se hace referencia al proceso como sacarificación y fermentación simultáneas o sacarificación, propagación de levadura y fermentación simultáneas.

[0188] En otras partes de la exposición, la glucoamilasa variante se utiliza en un proceso para la hidrólisis de almidón en el que la temperatura del proceso se lleva a cabo con una temperatura de entre 30 °C y 75 °C y también con una temperatura de entre 40 °C y 65 °C con un intervalo de pH de entre pH 3,0 y pH 6,5. Los procesos de fermentación en algunas partes de la exposición incluyen la molienda de un grano de cereal o grano fraccionado y la combinación del grano de cereal molido con líquido con el fin de formar una suspensión que a continuación se mezcla en un único recipiente con una glucoamilasa variante según la presente exposición y de forma opcional otras enzimas tal como, sin carácter limitativo, alfa-amilasas, otras glucoamilasas, fitasas, proteasas, pululanasas, isoamilasas u otras enzimas con actividad hidrolizante de almidón granular y levadura para producir etanol y otros subproductos (patente estadounidense n.° 4514496, WO 04/081193 y WO 04/080923).

[0189] En algunas partes de la exposición, la presente exposición pertenece a un método para sacarificar una solución de almidón líquida, que comprende una etapa de sacarificación enzimática con una glucoamilasa variante de la presente exposición.

[0190] La presente exposición también presenta pienso animal que comprende al menos una glucoamilasa variante incluida en la presente exposición. Los métodos para usar una enzima de glucoamilasa en la producción de piensos que comprenden almidón se presentan en WO 03/049550, presentada el 13 de diciembre de 2002. En resumen, la variante de glucoamilasa se mezcla con un pienso que comprende almidón. La glucoamilasa es capaz de degradar almidón resistente para ser usado por el animal.

[0191] Otros objetos y ventajas de la presente exposición resultan evidentes a partir de la presente memoria.

EJEMPLOS

[0192] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de demostrar e ilustrar además determinadas partes representativas de la exposición y aspectos de la presente exposición y no han de considerarse como limitadores del alcance de la misma.

[0193] En la exposición y la sección experimental que se presenta a continuación, se aplican las siguientes abreviaturas: GA (glucoamilasa); GAU (unidad glucoamilasa); % p (porcentaje en peso); °C (grados centígrados); rpm (revoluciones por minuto); H²O (agua); dH²O (agua desmineralizada),dIH²O (agua desmineralizada, filtración Milli-Q) aa o AA (aminoácido); pb (pares de bases); kb (pares de kilobases); kD (kilodaltons); g o gm (gramos); |jg (microgramos); mg (miligramos); jL (microlitros); ml y mL (mililitros); mm (milímetros), jm (micrómetro); M (molar); mM (milimolar); jM (micromolar); U (unidades); V (voltios); PM (peso molecular); s (segundo/segundos); min(s) o m(s) (minuto/minutos); hr(s) o h(s) (hora/horas); OD (oxígeno disuelto); ABS (absorbancia); EtOH (etanol); SF (suero fisiológico); m/v (masa/volumen) y PMT (placa de microtitulación); N (Normal); DP1 (monosacáridos); DP2 (disacáridos); DP>3 (oligosacáridos, azúcares con un grado de polimerización superior a 3); ppm (partes por millón).

[0194] A continuación, se describen los métodos utilizados para proporcionar variantes. Sin embargo, cabe destacar que pueden utilizarse diferentes métodos para proporcionar variantes de una molécula precursora y la invención no está limitada a los métodos utilizados en los ejemplos. Se pretende que se pueda utilizar cualquier medio adecuado para realizar variantes y para la selección de variantes.

Análisis de la actividad glucoamilasa pNPG para placas de m icrotitulación de 96 pocilios:

[0195] Las soluciones de reactivos fueron: tampón NaAc: tampón acetato de sodio 200 mM pH 4,5; Sustrato: pnitrofenil-a-D-glucopiranósido 50 mM (Sigma N-1377) en tampón NaAc (0,3 g/20ml) y solución de cese de reacción: tampón glicina-NaOH 800 mM pH 10. Se colocaron 30 j l de sobrenadante filtrado en una nueva PMT de 96 pocillos de base plana. A cada pocillo se añadió 50 j l de tampón NaAc y 120 j l de sustrato y se incubó durante 30 minutos a 50 °C (incubadora/agitador HT iEMS de Thermolab systems). Se finalizó la reacción añadiendo 100 j l de solución de cese de reacción. Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de PMT (Spectramax 384 plus de Molecular Devices) y la actividad se calculó utilizando un coeficiente de extinción molar de 0,011 jM/cm.

Análisis de estabilidad térmica:

[0196] Se añadió sobrenadante crudo (100 j l) a 100 j l tampón NaAc 50 mM pH 4,5. La muestra se dividió equitativamente sobre 2 PMT. Una PMT (placa inicial) se incubó durante 1 hr a 4 °C y la otra PMT (placa residual) se incubó a 60 °C (incubadora/agitador HT iEMS de Thermolab systems) durante 1 hr. La placa residual se enfrió durante 15 min en hielo. Se midió la actividad de ambas placas utilizando el análisis de la aplicación de etanol descrito a continuación, con la siguiente modificación: la cantidad de muestra tomada para el análisis de termoestabilidad es 25 j l y la cantidad de tampón NaAc 30 mMpH 4,0 es 35 jl.

[0197] Se calculó la termoestabilidad como % de actividad residual como se muestra a continuación:

A BS( H O W ^ji dual - vacío

------ 1 ;---------------------- xl 0ü%

ABS(340).inicial - vacío

[0198] Se analizó el material sobrenadante crudo para detectar la glucosa restante en el medio de cultivo tras el periodo de crecimiento. Si se hallaba glucosa restante, el valor de absorbancia se restaba de los valores de absorbancia medidos tanto de la actividad inicial como de la actividad residual.

Análisis Bradford para la cuantificación de proteína en placas de m icrotitulación de 96 pocillos:

[0199] La solución de reactivo era la solución de trabajo Bradford Quickstart (BioRad cat n.° 500-0205). Se colocaron 100 j l de sobrenadante filtrado 10 kD en una placa nueva con base plana de 96 pocillos. Se añadieron a cada pocillo 200 j l de reactivo y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia a 595 nm en un lector de PMT (Spectramax 384 plus de Molecular Devices). Las concentraciones de proteína se calcularon según una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA) (0-50 jl/ml).

Análisis de actividad de hexoquinasa:

[0200] Cóctel de hexoquinasa: 10-15 minutos antes de su uso, se añadieron 90 ml de agua a un recipiente BoatIL de glucosa HK R1 (kit de análisis de glucosa IL (HK), Instrumental Laboratory n.° 182507-40) y se mezcló gradualmente. Se añadieron 85 j l de cóctel de hexoquinasa a 100 j l de dH2O. Se añadieron 15 j l de muestra a las mezclas y se incubaron durante 5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Se leyó la absorbancia a 340 nm en un lector de PMT. Las concentraciones de glucosa se calcularon según una curva estándar de glucosa (0-1 mg/ml).

Condiciones de análisis de la aplicación de etanol:

[0201] Para preparar el 8 % de solución madre: se suspendieron 8 g de almidón de maíz soluble (Sigma n° S4180) en 40 ml dH2O a temperatura ambiente. Se añadieron cincuenta mililitros de dH2O hirviendo a la suspensión en un matraz de 250 ml y se coció durante 5 minutos. La solución de almidón se enfrió a 25 °C y se reguló el volumen a 100 ml con dH2O. La solución de trabajo de almidón soluble 4 % (m/v) se preparó mediante la dilución (1:1) de la solución madre con tampón acetato de sodio 100 mM, pH 3,7.

[0202] Para el análisis de detección, se diluyeron 5 j l de sobrenadante crudo con 175 j l de tampón NaAc 50 mM pH 4,5 en una PMT de 96 pocillos de base plana. Se añadieron sesenta microlitros de esta dilución a 120 j l almidón de maíz soluble 4 % y se incubaron a 900 rpm durante 2 horas a 32 °C (incubadora/agitador HT iEMS de Thermolabsystems). Se finalizó la reacción añadiendo 90 j l de solución de cese de reacción enfriada a 4 °C (tampón glicina-NaOH 800 mM, pH 10). La muestra se colocó en hielo. El almidón se centrifugó a 1118 * g a 15 °C durante 5 minutos (SIGMA 6K15) y se utilizaron 15 j l de sobrenadante en el análisis de actividad de Hexoquinasa descrito anteriormente con el fin de determinar el contenido de glucosa.

[0203] Se analizó el material sobrenadante crudo para detectar la glucosa restante en el medio de cultivo tras el periodo de crecimiento. Si se hallaba glucosa restante, la cantidad de glucosa producida por la glucoamilasa no se calculaba.

Condiciones de análisis de la aplicación del edulcorante:

[0204] Para preparar la solución madre 8 %: se suspendieron 8 g de almidón soluble (Sigma n° S4180) en 40 ml de agua a temperatura ambiente. Se añadieron 50 ml de dH2O hirviendo a la suspensión en un matraz de 250ml y se coció durante 5 minutos. La solución de almidón se enfrió a 25 °C y se reguló el volumen a 100 ml con dH2O. La solución de trabajo de almidón soluble 4 % (m/v) se preparó mediante la dilución de la solución madre 1:1 con tampón acetato de sodio 100 mM, pH 4,5.

[0205] Se colocaron cincuenta microlitros de tampón NaAc 80 mM pH 4,5 en una placa de 96 pocillos de base plana. Se añadieron a cada pocillo 120 pl almidón de maíz soluble 4 % y 5 pl de sobrenadante filtrado 10 kD y se incubaron durante 1 hora a 60 °C. Se finalizó la reacción añadiendo 90 pl de solución de cese de reacción enfriada a 4°C (tampón glicina-NaOH 800 mM, pH 10,0). La muestra se colocó en hielo durante 30 minutos. El almidón se centrifugó a 716 rpm a 15 °C durante 5 minutos (Sigma 6K15, centifrugadora) y se utilizaron 15 pl del sobrenadante del análisis de actividad de Hexoquinasa descrito anteriormente con el fin de determinar el contenido de glucosa.

Ejemplo 1

Construcción del vector pREP3Y-TrGA

[0206] El casete de expresión TrGA compuesto de la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 4) que codifica el péptido señal TrGA, la prosecuencia y la proteína madura, que incluye el dominio catalítico, la región de enlace y el dominio de unión a almidón, se clonó en pDONR™201, un vector de entrada Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, Ca , EE UU). El casete de expresión TrGA se clonó en el vector de destino compatible Gateway pREP3Y-DEST (fig. 3) mediante la reacción de recombinación Gateway®.

[0207] El vector de expresión pRep3Y-TrGA (figura 3B) permitió la expresión de la proteína TrGA (SEQ ID NO: 2) en Schizosaccharomyces pombe.

[0208] Se crearon sesenta y cinco bibliotecas de mutagénesis por saturación del sitio (SSM por sus siglas en inglés) de TrGA utilizando el vector de entrada pDONR-TrGA (fig. 2) como plantilla y los cebadores enumerados en la tabla 2. Todos los cebadores de mutagénesis utilizados en los experimentos contienen el código de secuencia de ADN triple NNS (N= A,C,T,G y S=C o G) en la posición que se corresponde con el codón de la secuencia de TrGA que ha de mutarse (SEQ ID NO: 2 e iniciaron una incorporación aleatoria de nucleótidos en esa posición. La construcción de cada biblioteca SSM se inició con dos amplificaciones por PCR utilizando el Gateway forward (pDONR201-FW) y un cebador de mutagénesis inverso específico (tabla 3) y el cebador Gateway reversed (pDONR201-RV) y un cebador de mutagénesis directo específico (tabla 2) (mismas posiciones para los cebadores de mutagénesis). La polimerasa de ADN Phusion de alta fidelidad (Finnzymes OY, Espoo, Finlandia) se utilizó en una amplificación por PCR (0,2 pM cebadores, 25 ciclos) según el protocolo proporcionado por Finnzymes. En resumen, se añadió 1 pl (SEQ ID NO: 1), fragmento de ADN de ambas mezclas de PCR, ambas dirigidas al mismo codón a 48 pl de solución de reacción por PCR nueva junto con los cebadores Gateway FW y Gateway RV (Invitrogen) y se mezcló. Esta amplificación por PCR de fusión (22 ciclos) tuvo como resultado un fragmento de ADN de casete de expresión lineal con un codón de TrGA específico mutado de forma aleatoria y sitios de recombinación Gateway únicos en ambos extremos. La purificación de este fragmento de ADN (Limpieza PCR ChargeSwitch®, Invitrogen, Carlsbad EEUU) y una reacción de recombinación BP (Invitrogen, Carlsbad, USA) con pDONR201 (Invitrogen) generaron un ADN multimérico circular (vector de entrada) que se transformó posteriormente en E. coli Max efficiency DH5a (Invitrogen) y se recubrió en un medio 2xTY [Bacto Tryptone (Difco) 16 g/L, Bacto Yeast Extract (Difco) 10 g/L, NaCL 5 g/L] complementado con 50 pg/mL kanamicina.

Tabla 2. Cebadores directos utilizados para generar bibliotecas SSM de TrGA

Tabla 3. Cebadores utilizados para generar bibliotecas SSM de TrGA

[0209] Para cada biblioteca, tras la incubación durante la noche a 37 °C, se agruparon colonias mediante resuspensión de los clones en SF. A partir de los transformantes E. coli agrupados, se aisló el plásmido total (Qiaqen) utilizando técnicas convencionales. En resumen, se añadió 1 j l de la solución de plásmido a 1 j l de la solución de vector de destino pRep3Y (figura 1 A) y se añadió a la mezcla de enzima LR CLON- ASET™ II según el protocolo proporcionado por Invitrogen. Se generó un ADN multimérico circular y se transformó en E. coli Max EfficiencyDH5a como describe el proveedor.

[0210] Tras la incubación durante la noche a 37 °C, se recogieron 96 colonias únicas de cada biblioteca de las placas de agar 2xTY con 100jg/ml ampicilina y se cultivaron durante 24 hrs a 37 °C en una PMT con 200 j l de medio 2xYT con 100 jg/m l ampicilina. Los cultivos se utilizaron para los análisis de secuencia (BaseClear B.V., Leiden, Holanda).

[0211] Los números de biblioteca variaban desde 1 a 65 con una adición que hacía referencia al codón de la secuencia TrGA que se mutó de forma aleatoria. Tras la selección, cada biblioteca incluía un máximo de 19 variantes TrGA. Estas variantes se transfirieron de forma individual a Schizosaccharomyces pombe según las instrucciones del fabricante. (Zymo Research, Orange CA. EE UU).

[0212] Las transformaciones de S. pombe se cubrieron en un medio selectivo (Agar EMM, Qbiogene, Irvine, EE UU n.° Cat. 4110-232) y se incubaron a 28 °C durante 4 días. Los transformantes se purificaron a partir de la placa de transformación mediante el rayado de las colonias en agar EMM.

Ejemplo 2

Descripción de las condiciones de crecim iento y el pretratamiento de la muestra

[0213] Los transformantes S.pombe se inocularon en placas de microtitulación de 96 pocillos (PMT) con medio selectivo (2xEMM- C) [64,4 g/L Caldo EMM (Qbiogene n.° Cat. 4110-032), 0,62 g/L Complete Supplement Mixture (CSM-HlS-LEU-TRP, Qbiogene, n.° Cat. 4530-122)] y se incubaron durante la noche a 28 °C. A partir de la placa de microtitulación incubada durante la noche, se inocularon 200 j l del cultivo S. pombe en 20 ml de medio líquido 2xEMM-C en un matraz de agitación de 100 ml y se incubaron durante 4 días a 26 °C con 280 rpm en un incubadora de agitación Multitron (Infors AG, Bottmingen, Suiza). A partir del cultivo, se tomaron 2 ml de muestras del cultivo S. pombe y se centrifugaron durante 5 min a 14.000 rpm (Sigma). El sobrenadante se transfirió a una configuración de filtro 500 HT 10 kD Vivaspin (VivaScience AG, Hannover, Alemania) y se centrifugó durante 25 min a 1000 g. El material retenido se diluyó de nuevo a volumen inicial original con NaAc 50 mM pH 4,5 complementado con 0,015% Tween-80. Esta solución se utilizó en diferentes ensayos.

Ejemplo 3

Construcción de una biblioteca combinatoria de 4 variantes de TrGA

[0214] (A) Se llevaron a cabo experimentos para la construcción de variantes TrGA portando combinaciones de las siguientes mutaciones de sitios únicos: Q172F; Q208N; S211R y V314H. A continuación se muestra un análisis de las variantes:

a) Q172F; Q208N

b) Q172F; S211R

c) Q172F; V314H

d) Q208N; S211R

e) Q208N V314H

f) S211R; V314H

g) Q172F; Q208N; S211R

h) Q172F; Q208N; V314H

i) Q172F; S211R; V314H

j) Q208N; S211R; V314H

k) Q172F; Q208N; S211R; V314H

[0215] Se utilizó el kit de mutagénesis dirigida en múltiples sitios Quikchange® (QCMS) (Stratagene) para construir la biblioteca. Los cebadores fosforilados 5' utilizados para crear la biblioteca se muestran en la tabla 4. Los resultados óptimos en cuanto a incorporación de los cebadores de longitud completa así como reducción significativa en errores derivados de cebadores se obtuvieron mediante el uso de HPLC PAGE o cualquier otro tipo de cebadores purificados (Invitrogen).

Tabla 4. Cebadores utilizados para constru ir variantes combinatorias seleccionadas.

[0216] Se utilizó el plásmido plantilla pDONR-TrGA (Figura 2) para crear la biblioteca combinatoria utilizando el kit QCMS de Stratagene. La biblioteca se creó según lo descrito por el proveedor con concentraciones de cebadores modificados utilizadas en las reacciones. De forma específica, se mezclaron 4 pl pDONR-TrGA (25-50 ng) con 11 |jl de agua destilada estéril; 1,5 pl de dNTP; 2,5 pl de 10xtampón QCMS; 1 pl de mezcla de enzima y 1 pl de cada mezcla de cebador mutante proporcionando un total de 100 ng de cebadores en cada reacción. Las condiciones de PCR fueron 95 °C durante 1 min, seguido de 30 ciclos de 95 °C durante 1 min, 55 °C durante 1 min y 65 °C durante 6 min en un termociclador MJ Research utilizando tubos de PCR de 0,2 ml de pared fina. El producto de reacción se digirió con 1 pl de Dpnl del kit QCMS mediante incubación a 37 °C durante la noche. Se utilizó un kit de purificación PCR (Qiagen) para la purificación de la muestra y se llevó a cabo una segunda ronda de digestión con Dpn1 (Stratagene) durante 1 hora a 37 °C.

[0217] La mezcla de reacción se transformó en E. coli Max efficiency DH5a (Invitrogen) y se cubrió en agar selectivo (2xTY complementado con 50 pl kanamicina/ml). Tras la incubación durante la noche a 37 °C, se recogieron 96 colonias únicas para un análisis de secuencias ((BaseClear B.V., Leiden, Holanda). Las variantes combinatorias se clonaron y expresaron en una cepa huésped T. reesei según se describe a continuación y en WO 06/060062.

[0218] (B) Se realizaron de forma sintética seis bibliotecas combinatorias adicionales (tabla 5) mediante Geneart (Regensburg, Alemania) y se analizaron para determinar la estabilidad térmica y en ensayos de aplicación de edulcorante y etanol según se describe en el presente documento.

Tabla 5. Bibliotecas combinatorias

Ejemplo 4

Variantes con estabilidad térm ica mejorada

[0219] La molécula TrGA precursora bajo las condiciones descritas presentaba una actividad residual entre un 15 y un 44 % (variación diaria). El índice de rendimiento se calculó según la termoestabilidad de TrGA del mismo lote. Los índices de rendimiento son los cocientes PI = (actividad residual variante)/(actividad residual TrGA). Un índice de rendimiento >1 indica una estabilidad mejorada. Las variantes que presentaban un índice de rendimiento de estabilidad térmica de más del 1,0 se muestran en la siguiente tabla 6.

Tabla 6. Detección termoestabilidad

Ejemplo 5

Variantes de alto rendimiento a partir de un análisis de detección de etanol

[0220] Se analizaron las variantes en un análisis de detección de etanol utilizando los análisis descritos anteriormente. La tabla 7 muestra los resultados del análisis de detección para las variantes con un índice de rendimiento (PI) > 1,0 en comparación con el PI de la TrGA precursora. El PI es una medida de actividad específica (actividad/mg enzima). El PI de la actividad específica es el cociente "actividad específica variante/actividad específica WT". El PI de la actividad específica es 1,0 y una variante con un PI > 1,0 presenta una actividad específica que es mayor que la TrGA precursora. La actividad específica es la actividad medida mediante el análisis de detección de etanol dividida por los resultados obtenidos en el análisis Bradford descrito anteriormente.

Tabla 7. Detección etanol

Ejemplo 6

Variantes de alto rendimiento a partir de un análisis de detección de edulcorante

[0221] Se analizaron las variantes en un análisis de detección de edulcorante según se describe anteriormente en el presente documento. La tabla 8 muestra los resultados del análisis de detección en el que se muestran las variantes con un índice de rendimiento (PI) > 1,00 en comparación con el PI de la TrGA precursora. El PI es una medida de actividad específica (actividad/mg enzima). El PI de la actividad específica es el cociente "actividad específica variante/actividad específica WT". El PI de la actividad específica es 1,0 y una variante con un PI > 1,0 presenta una actividad específica que es mayor que la TrGA precursora.

Tabla 8. Detección edulcorante

Ejemplo 7

Construcción de vectores y transform ación en células huésped Trichoderm a reesei.

A. Construcción de vectores de expresión que comprenden un polinucleótido que codifica una GA variante.

[0222] El casete de expresión TrGA que comprende la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 4 se clonó en pDONR™201, un vector de entrada Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El casete de expresión TrGA se clonó en el vector de destino compatible Gateway pTrex3g-DEST (figura 5), que también se describe en WO 06/060062 mediante la reacción de recombinación Gateway® LR. El vector de expresión pTrex3g-TrGA (figura 5) permitió la expresión de la proteína TrGA (SEQ ID NO: 2) en un huésped Trichoderma reesei. Se construyeron los vectores, que incluían ADNc de TrGA modificado que codificaba al menos las siguientes variantes (1) V314H; (2) S211R; (3) Q208N y (4) Q172F.

B. Transformación

[0223] Un vector de expresión que contiene una GA variante se transformó en una cepa huésped T. reesei derivada de RL- P37 (IA52) y con diferentes deleciones de genes (A cbhl, Acbh2, Aeg/1, Aegl2) utilizando un bombardeo de partículas mediante PDS-1000/Helium System (BioRad n.° Cat. 165-02257). El protocolo se resume a continuación y también se hace referencia a los ejemplos 6 y 11 de WO 05/001036.

[0224] Se preparó una suspensión de esporas (aproximadamente 5x108 esporas/ml) a partir de la cepa de T. reesei. Se extendieron de cien a doscientos microlitros de suspensión de esporas en el centro de las placas de medio de acetamida de medio mínimo (MM). El medio de acetamida MM presentaba la siguiente composición: 0,6 g/L acetamida; 1,68 g/L CsCl; 20 g/L glucosa; 20 g/L KH2PO4; 0,6 g/L CaC^2H2O; 1 ml/L 1000X solución de oligoelementos: 20 g/L agar; y pH 5,5; 1 ml/L 400X solución salina de oligoelementos; ácido cítrico 175 g/L, FeSO4.7H2O 200g/L, ZnSO4^7H2O 16 g/L, CuSO4^5H2O 3,2 g/L, M nS O 4^O 1,4 g/L, H3BO30,8 g/L. Se dejó que la suspensión de esporas se secara en la superficie del medio de acetamida MM.

[0225] La transformación siguió las instrucciones de los fabricantes. En resumen, se colocaron 60 mg de partículas de tungsteno M10 en un tubo de microcentrifugación. Se añadió 1 mL de etanol y se dejó reposar durante 15 minutos. Las partículas se centrifugaron a 15000 rpm durante 15 segundos. Se extrajo el etanol y las partículas se lavaron tres veces con dH2O estéril antes de añadir 1 mL de glicerol estéril 50 % (v/v). Se colocaron 25 pl de suspensión de partículas de tungsteno en un tubo de microcentrifugación. Mientras se mezclaba de forma continua con agitador vortex, se añadió lo siguiente: 0,5-5 pl (100-200 ng/pl) de ADN plasmídico, 25 pl de 2,5 M CaCl2 y 10 pl de 0,1 M espermidina. Las partículas se centrifugaron durante 3 segundos. Se extrajo el sobrenadante y se lavaron las partículas con 200 pl de etanol 70 % (v/v) y se centrifugaron durante 3 segundos. Se extrajo el sobrenadante y se añadieron 24 pl de etanol 100 %, se mezcló mediante pipeteo y el tubo se colocó en un baño ultrasónico, se extrajeron 8 pl partes alícuotas de partículas y se colocaron en el centro de los discos microportadores que se fijaron en un desecador. Una vez se secó la suspensión de tungsteno/ADN, el disco microportador se colocó en la cámara de bombardeo junto con la placa de acetamida MM con esporas y el proceso de bombardeo se llevó a cabo según las instrucciones de los fabricantes. Tras el bombardeo de las esporas cubiertas con las partículas de tungsteno/ADN, las placas se incubaron a 28 °C. Las colonias transformadas se recogieron en placas limpias de acetamida MM tras 4 días (Pentilla et a/. (1987) Gene 61: 155-164). C. Demostración de la actividad GA a partir de la TrGA variante expresada en células transformadas.

[0226] Tras 5 días de cultivo en placas de acetamida MM, los transformantes que mostraban morfología estable se inocularon en matraces de agitación de 250 ml con 30 ml de medio Proflo. El medio Proflo contenía: 30 g/L a lactosa; 6,5 g/L (NH4)2SO4; 2 g/L KH2PO4; 0,3 g/L M g S O 4 ^ O ; 0,2 g/L C a C h ^ O ; 1 ml/L 400X solución salina de oligoelementos: ácido cítrico 175 g/L, FeSO4^7H2O 200g/L, ZnSO4^7H2O 16 g/L, CuSO4^5H2O 3,2 g/L, M nS O 4^O 1,4 g/L, H3BO30,8 g/L; 2 ml/L 10 % Tween 80; 22,5 g/L harina de semilla de algodón ProFlo (Traders protein, Memphis, TN); 0,72 g/L CaCO3. Tras dos días de cultivo a 28 °C y 140 rpm, 10 % del cultivo Proflo se transfirió a un matraz de agitación de 250 ml con 30 ml de Medio definido de lactosa. 5 g/L (NH4)2SO4; 33 g/L tampón 1,4-Piperazinebis (ácido propanosulfónico); 9 g/L casamino ácidos, 4,5 g/L KH2PO4, 1,0 g/LMgSO4^7H2O, 5 ml/L antiespumante Mazu DF60-P (Mazur Chemicals, IL), 1 ml/L de 1000X solución de oligoelementos; pH 5,5; 40 ml/L de solución lactosa 40 % (p/v) se añadió al medio tras la esterilización. Los matraces de agitación con el medio definido de lactosa se incubaron a 28 °C, 140 rpm durante 4-5 días.

[0227] Las muestras del sobrenadante de cultivo se mezclaron con un volumen adecuado de 2X tampón de carga de muestra con agente reductor. Se extrajo el micelio mediante centrifugación y se analizó el sobrenadante para detectar el contenido de proteína total (BCA Protein Assay Kit, Pierce Cat. n.° 23225).

[0228] La actividad GA se midió utilizando el análisis p-nitrofenil-a-D-glucopiranósido (pNPG) con pNPG como un sustrato (Sigma N-1377). En este análisis se mide la capacidad de la glucoamilasa de catalizar la hidrólisis de pnitrofenil-a-D-glucopiranósido (pNPG) a glucosa y p-nitrofenol. Con un pH alcalino, el nitrofenol forma un color amarillo que es proporcional a la actividad de glucoamilasa y se controla a 405 nm y se compara frente a la norma de enzima medida como una GAU (Elder, M. T. y Montgomery R. S., Glucoamylase activity in industrial enzyme preparations using colorimetric enzymatic method, Journal of AOAC International, vol. 78(2), 1995). Una GAU se define como la cantidad de enzima que producirá 1 gm de azúcar reductora calculada como glucosa por hora a partir de un sustrato de almidón soluble (4 % ds) con pH 4,2 y 60 °C.

[0229] El perfil proteínico se determinó mediante electroforesis PAGE sobre NuPAGE® Novex 10% Bis-Tris Gel con tampón de migración MES SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE UU).

Ejemplo 8

Ensayo de aplicaciones a pequeña escala de variantes elegidas sobre almidón soluble

[0230] Las cepas huésped Trichoderma reesei que expresan las variantes únicas a) V314H, b) S211R, c) Q172F y d) Q208N se cultivaron en fermentadores de 14 L de alimentación discontinua a 34 °C, pH 3,5 en medios de nutrientes que incluían glucosa (Cerelose DE99), KH2PO4, MgSOWH2O, (NH^SO4, CaCh^H2O, oligoelementos y antiespumante Mazu (DF6000K). Tras la disminución de glucosa, la temperatura del cultivo y el pH se cambiaron a 28 °C y 4,0 respectivamente. Se extrajo el material celular mediante filtración y se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se concentraron para contener más del 90 % de glucoamilasa como proteína total.

[0231] Se determinaron diferentes propiedades cinéticas para la producción de glucosa sobre almidón de patata soluble con pH 4,3 a 32 °C y a 60 °C y se compararon con la TrGA de tipo silvestre. Cada una de las cuatro variantes mostraron valores de Vmax aumentada (j M glucosa/s) en comparación con el tipo silvestre (TrGA) lo que indica índices catalíticos elevados (kcat (sec-1)). La figura 6 ilustra la Vmax de dos réplicas para cada temperatura analizada.

Ejemplo 9

Método para determinar el rendimiento sobre la producción de EtOH de variantes

[0232] La validación de la detección se llevó a cabo sobre las variantes que se identificaron con un índice de rendimiento superior en comparación con la TrGA precursora (véase tabla 7/8) utilizando un ensayo de aplicación de etanol de pequeña escala novedoso. Se derivaron veinticuatro variantes de la evaluación del sitio y se eligieron bibliotecas combinatorias (tabla 9) y se transformaron directamente en T. reesei para su expresión y análisis a mayor escala. Se analizaron las variantes para detectar el despliegue térmico utilizando la calorimetría diferencial de barrido (análisis DSC descrito a continuación en el presente documento) y el rendimiento utilizando un análisis de aplicación de etanol a pequeña escala secundario y novedoso. El método consistía en dos etapas: 1) inyección de variantes sobre una columna de intercambio aniónico para determinar de forma precisa la concentración proteica; y 2) titulación de variantes con tres concentraciones de TrGA diferentes (0,3-0,15-0,075g/ 28 g ds) con el fin de calcular su rendimiento sobre la producción de etanol en relación con la molécula de tipo silvestre.

Tabla 9. Lista de variantes combinatorias

variante mutación

LR8 Q172F/Q208N

LR6 Q172F/Q208N/V314H

LR12 Q172F/S211R

SW3-1 D24E/I43R/D44N/F175H/V181L/V314H/T353R

SW3-2 D24L/I43F/D44N/F175H/V181L/V314H/T353R

ET4-1 D24L/Q208Q/I292V/G294A/K297A/Y310R

ET4-2 D24W/Q208F/I292V/G294Q/K297A/Y310R

ET5-1 V181L/E243A/I292N/K297N/N317N/Y395Q

ET5-2 V181L/E243R/I292F/K297A/N317N/Y395Q

ET7-1 D24Y/V181L/Q208C/G294A/T353R/N375N/N409W

ET7-2 D24L/V181L/Q208C/G294A/T353R/N375Q/N409W

ET8-1 D24E/V181K/E243Y/I292V/G294Q/N409K

ET8-2 D24E/V181F/E243R/I292N/G294I/N409W

ET9-1 I043R/E243R/I292F/G294A/K297A

ET9-2 I043R/E243R/I292L/G294A/K297M

Determinación y purificación proteica

[0233] Se purificó una preparación de enzima cruda utilizando un sistema AKTA explorer 100 FPLC (Amersham Biosciences, Piscataway, Nj). p-Ciclodextrina (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Holanda; 85,608-8) se unió a esferas de Sepharose activadas con epoxy (GE Healthcare, Diegem, Bélgica; 17-0480-01). La columna se utilizó para capturar glucoamilasas a partir de la preparación de enzimas. La enzima se eluyó de las esferas utilizando tampón Tris 25 mM pH 7,5 o tampón acetato de sodio 50 mM pH 4,3 con a-ciclodextrina 10 mM (Sigma, 28705). Las muestras purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE. Con el fin de determinar de forma precisa la concentración de proteína de las variantes se desarrolló un método de determinación de proteína basado en FPLC.

La concentración proteica de la molécula TrGA del marcador purificado se determinó en primer lugar utilizando un protocolo Bradford convencional (Bio-Rad cat n.° 500-0205). Posteriormente, las muestras purificadas se inyectaron en una columna de 1 ml ResourceQ (GE Healthcare) y la enzima se eluyó con tampón Tris 25 mM pH con NaCl 500 mM. Se determinó el área pico y se calculó la concentración proteica en relación al área pico de la TrGA convencional con concentración conocida.

Aplicación de EtOH a pequeña escala

[0234] La tabla 10 resume la producción de etanol y azúcares (DP1, DP2, DP>3) mediante diferentes variantes combinatorias. Se obtuvo una muestra de sustrato licuado de pulpa de maíz y se diluyó a 26 % DS utilizando finos residuos de la destilería. El pH de la suspensión se reguló a pH 4,3 utilizando 4N ácido sulfúrico. Una parte alícuota de 100 g de pulpa se colocó en un baño de agua a 32 °C y se dejó que se equilibrara. Tras una adición de 100 pl 400 ppm urea, se añadió 1 ml de muestra de enzima TrGA variante purificada (150 pg/ml) o TrGA purificada (300, 150, 75 pg/ml) a cada muestra de pulpa de maíz. Finalmente, se añadieron a cada muestra 333 pl de levadura Red Star Red hidratada 30 minutos 15 g en 45 ml de solución de agua DI (Lesaffre yeast Corp. Milwaukee, WI). Las muestras se tomaron tras 5, 21, 28, 48 y 52 horas y se analizaron mediante HPLc utilizando una columna 9 Aminex HPX-87H (Bio-Rad).

Determinaciones de etanol y carbohidratos

[0235] Se llenó un tubo de centrifugación eppendorf de 2 ml con cerveza del fermentador y se enfrió en hielo durante 10 minutos. La muestra se centrifugó durante 3 minutos a 14,000 x g y 500 pl del sobrenadante se transfirieron a un tubo de ensayo con 50 pl de solución de desactivación (1,1 N ácido sulfúrico) y se dejó reposar durante 5 minutos. Se añadieron 5,0 ml de agua al tubo de ensayo y, a continuación, se filtró en una placa de filtro de 0,22 pm (multipantalla, Millipore, Amsterdam, Holanda) y se analizó en HPLC. Temperatura de la columna: 60 °C: fase móvil: 0,01 N ácido sulfúrico; índice de flujo 0,6 ml/min; detector: RI; volumen de inyección: 20 pl. La columna separa las moléculas según la carga y el peso molecular; DP1 (monosacáridos); DP2 (disacáridos); DP3 (trisacáridos); DP>3 (azúcares oligosacáridas con un grado de polimerización superior a 3); ácido succínico; ácido láctico; glicerol; metanol; etanol.

Análisis DSC

[0236] La temperatura de fusión de las muestras de enzima purificadas (0,2-0,4 mg/ml) se determinó utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Tabla 10. Producción de etanol y sacáridos

horas DP>3 (m/v)% DP2 (m/v)% DP1 (m/v)% Etanol (v/v)% TrGA (0,3 mg) 5,5 3,46 2,70 0,91 1,02

21,5 3,40 0,50 0,06 6,80

28,5 1,68 1,46 0,07 8,13

46 0,04 0,71 0,06 10,21

52,5 0,04 0,45 0,03 10,96

TrGA (0,150 mg) 5,5 3,40 2,43 0,15 1,00

21,5 3,78 0,21 0,03 4,23

28,5 3,86 0,20 0,03 5,07

46 2,73 0,52 0,06 7,86

52,5 1,70 0,87 0,04 7,92

TrGA (0,075 mg) 5,5 3,43 2,16 -0,01 0,94

21,5 3,54 0,20 0,03 3,10

28,5 3,43 0,18 0,03 3,14

46 3,93 0,18 0,05 4,65

52,5 4,01 0,18 0,03 4,79

ET7-1 5,5 3,45 2,53 0,21 1,00

21,5 3,94 0,22 0,04 4,77

28,5 3,89 0,23 0,04 5,58

horas DP>3 (m/v)% DP2 (m/v)% DP1 (m/v)% Etanol (v/v)%

46 1,58 1,22 0,06 8,64

52,5 0,62 1,50 0,04 9,14

LR8 5,5 3,43 2,50 0,17 1,00

21,5 3,96 0,22 0,04 4,79

28,5 3,86 0,21 0,04 6,21

46 1,27 1,11 0,07 9,17

52,5 0,45 1,24 0,04 8,73

LR12 5,5 3,47 2,51 0,16 1,05

21,5 3,86 0,22 0,04 4,44

28,5 3,94 0,22 0,04 5,30

46 2,09 1,08 0,07 8,56

52,5 0,99 1,52 0,04 9,16

LR6 5,5 3,37 2,44 0,18 0,96

21,5 3,88 0,21 0,04 4,44

28,5 3,90 0,20 0,04 5,10

46 2,44 0,64 0,08 8,59

52,5 1,27 1,01 0,04 8,97

ET8-1 5,5 3,46 2,53 0,22 0,99

21,5 3,99 0,21 0,04 4,86

28,5 3,90 0,21 0,04 5,76

46 1,29 1,11 0,08 8,94

52,5 0,47 1,25 0,04 9,56

ET7-2 5,5 3,57 2,46 0,17 1,02

21,5 4,26 0,21 0,03 4,21

28,5 4,37 0,20 0,04 5,14

46 3,87 0,27 0,05 7,21

52,5 3,27 0,33 0,03 8,07

[0237] La tabla 11 representa la producción de etanol final y el rendimiento de las variantes con 0,15 mg de dosis. El rendimiento se calculó mediante interpolación de los valores 0,3 mg y 0,15 mg de la TrGA por los valores de las variantes.

Tabla 11: Producción etanol

variante EtOH % (v/v) Rendimiento en relación con TrGA TrGA 0,3 mg 10,21

TrGA 0,15 mg 7,86 1,00

TrGA 0,075 mg 4,65

ET7-1 8,64 1,33

LR8 9,17 1,56

LR12 8,56 1,30

LR6 8,59 1,31

ET8-1 8,94 1,46

ET7-2 7,21 0,72

[0238] Todas las variantes combinatorias excepto ET7-2 funcionaron mejor que el tipo silvestre de TrGA. LR8 tuvo el mejor resultado con un rendimiento mejorado de 1,56.

[0239] La tabla 12 muestra un resumen de todas las variantes combinatorias y de sitio único sometidas a prueba por medio del análisis de aplicación de etanol a pequeña escala. Las variantes que están sombreadas en la tabla 12 funcionaron mejor que la TrGA y también presentaron una temperatura de despliegue térmico superior (dTm).

Tabla 12. Rendimiento y despliegue térmico

de variantes en relación con TrGA

Q172F 1.18 - 0.01

V314H 1.17 -0.44

G294I 1.16 - 0.22

S211R 1.12 -0.44

Q208N 1.08 - 0.22

ET9-1 1.04 -1.33

K297A 1.03 - 1.11

SW3-2 1.00 0.88

TrGA 1.00 0.00

G294Q 0.99 - 0.86

ET8/2 0.93 - 0.01

P94N 0.76 -5.17

ET5-1 0.76 -3.28

ET7-2 0.72 -3.59

S214L/C222F 0.70 -3.98

[0240] Los resultados mostraron que la cromatografía (FPLC) era una herramienta útil para determinar de forma precisa la concentración de proteína. Los resultados también mostraron que la titulación de las variantes con tres concentraciones TrGA era un método valioso para determinar el rendimiento de variantes a pequeña escala. Diferentes variantes funcionaron mejor que la TrGA de tipo silvestre (véase la tabla 12) y también presentaban una temperatura de despliegue térmico superior y las variantes que no funcionaron tan bien como la TrGA también presentaban una Tm inferior.

Ejemplo 10: Determinación de actividad específica de un conjunto seleccionado de variantes combinatorias y de sitio único y especificidad de sustrato de LR8

[0241] Se analizó la actividad específica de un conjunto de variantes combinatorias y diferentes variantes de sitio único que se utilizaron para construir variantes combinatorias (tabla 13). LR8 (PI 1,56 determinado con análisis de aplicación a pequeña escala) se estudió además con respecto a la especificidad de sustrato. Esto se realizó mediante la configuración de un análisis PMT con el fin de determinar los índices de producción de glucosa de variantes GA y para determinar la especificidad de sustrato de la variante LR8. Se halló que el análisis de PMT discriminaba entre variantes y todas las variantes excepto ET7-1 mostraron índices superiores a la glucoamilasa Trichoderma reesei de tipo salvaje (wt). Además, diferentes variantes (LR8/ET8/Q172F) funcionaron un 20-30 % mejor que TrGA. LR8 funcionó mejor sobre almidón de maíz soluble y dos muestras diferentes de sustrato licuado de pulpa de maíz en comparación con la de tipo salvaje.

[0242] Los sustratos utilizados en los siguientes experimentos fueron la solución madre de almidón de maíz soluble preparada como se muestra a continuación: 8 g de almidón de maíz soluble (Sigma n.° S4180) se disolvieron en 100 ml de agua milliQ y se calentaron en un microondas durante 1 minuto. La dispersión se hirvió durante 5 minutos y tras el enfriado se reguló el volumen a 100 ml. Se preparó almidón de maíz soluble 4 % mediante la dilución de la solución madre 1:1 con tampón NaAC 100 mM, pH 4. En un experimento, se preparó un sustrato licuado de maíz (NE) utilizando un analizador de humedad para medir el % ds, a continuación el sustrato se diluyó 7,5 x con NaAC 50 mM para conseguir finalmente 4 % ds. El sustrato se centrifugó durante 5' a 2000 x g y el sobrenadante se filtró con un filtro 0,22 pm. En otro experimento, se preparó un sustrato licuado de maíz (BSE) del mismo modo, excepto que el sustrato se diluyó 10x antes de la centrifugación.

[0243] La enzima se diluyó utilizando la solución madre de 150 pg enzima/ml (3 pg/180 pl mezcla de reacción). Las soluciones se diluyeron además con NaAc 50 mM ph 4,0 como se muestra a continuación: 300 ng (10 x), 200 ng, 150 ng, 100 ng, 75 ng, 50 ng, 25 ng, 10 ng/180 pl mezcla de reacción.

[0244] El análisis de llevó a cabo como se muestra a continuación: 40 pl NaAc 50 mM pH 4,0, 120 pl almidón de maíz soluble 4 % y 20 pl de enzima se añadieron a cada pocillo. Las muestras se incubaron durante 2 h a 32 °C 900 rpm y se terminaron en hielo tras la adición de 90 pl tampón glicina-NaOH 800 mM ph 10 durante 5 min. La placa se centrifugó durante 5 min a 2000 rpm a 15°C. Se añadieron 85 pl agua milliQ y 100 pl cóctel hexoquinasa (kit análisis de glucosa II HK), Instrumental Laboratory n° 182507-40) y 20 pl de sobrenadante a una placa nueva. Para una línea de calibración de glucosa (0-1 mg/ml) se añadió en su lugar un almacenamiento de glucosa 20 pl. Las placas se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad seguido de la medición de absorción a 340 nm utilizando el Spectramax.

Tabla 13

Rendimiento relativo a peso

. . . . . . .

iP&N 3E'] 0.98 1.00 ílfir'4] 1.09 1.05 0.29 6.29 -3.80

TrGA 1.00 1.00 * wífl 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

[0245] Los resultados del análisis para determinar los índices de producción de glucosa de las variantes GA se muestran en la figura 7 y 8. En estas figuras, el rendimiento relativo a TrGA se calculó por cantidad de enzima añadida. Se extrajeron conclusiones de la región lineal del gráfico a 150 ng de enzima. Los resultados en las figuras 7, 8 y la tabla 13 mostraron que LR8, ET8, ET7-2, S211R, Q172F y P94N funcionaron mejor que el tipo silvestre sobre una gama lineal.

[0246] Con el fin de determinar la especificidad de sustrato de LR8, se analizó el rendimiento de LR8 y TrGA de tipo silvestre sobre sustratos (almidón de maíz soluble y los dos sustratos de pulpa de maíz producidos en el Ejemplo 10) utilizados en la detección y aplicación. Cuando se analizaron mediante Hp LC, los sustratos mostraron una diferencia en el grado del patrón de polimerización (DP) (véanse las figuras 9-11). En NE y BSE DP1->=DP4 está presente mientras que el almidón de maíz soluble consiste en al menos cuatro o más moléculas de glucosa. En todos los sustratos l R8 funcionó mejor que el tipo silvestre (véanse las figuras 9, 10 y 11).

Ejemplo 11: Detección y caracterización de variantes expresadas en Trichoderm a reesei utilizando bibliotecas de evaluación del s itio (SEL) en el vector pTTT

[0247] Se crearon variantes de TrGA adicionales, especialmente variantes con sustituciones en el SBD y se detectaron directamente en Trichoderma reesei. De forma similar al Ejemplo 1, se crearon otras diez bibliotecas de mutagénesis por saturación del sitio (SSM) de TrGA utilizando el vector de entrada pDONR-TrGA como plantilla y los cebadores enumerados en la tabla 14. Los sitios incluyen: N61, G73, L417, T430, A431, E503, Q511, A535, A539 y N563. Entre estos sitios, E503, Q511, A535, A539, y N563 se encuentran dentro del dominio de unión a almidón de la TrGA. Por consiguiente, la recombinación se llevó a cabo con el vector pTTT-Dest (figura 14) utilizando la mezcla de enzima LR CLONASE™ II según el protocolo proporcionado por Invitrogen. Los productos de recombinación se transformaron en E. coli Max efficiency DH5a (Invitrogen) y se cubrieron sobre medio 2xTY [Bacto Tryptone (Difco) 16 g/L, Bacto Yeast Extract (Difco) 10 g/L, NaCL 5 g/L] complementado con 100 pg/ml ampicilina. Tras la incubación durante la noche a 37 °C, se recogieron 96 colonias únicas de cada biblioteca de las placas de agar 2xTY con 100 pg/ml ampicilina y se cultivaron durante 24 hrs a 37 °C en una PMT con 200 pl de medio 2xYT con 100 |jg/ml ampicilina. Los cultivos se utilizaron para los análisis de secuencia (analizador de secuencia ABI3100, Applied Biosystems). Cada biblioteca contenía de 15 a 19 variantes de TrGA diferentes en el vector de expresión final. Estas variantes se transformaron de forma individual en T. reesei.

Tabla 14 Cebadores utilizados para generar bibliotecas SSM TrGA adicionales

[0248] Los SEL se transformaron en T. reesei utilizando el método PEG-protoplasto (véase p. ej., Pentilla et al. (1987) Gene 61: 155-164). El huésped T. reesei es una cepa derivada de RL-P37 (IA52) con cuatro deleciones génicas ((A cbh1, Acbh2, Aegl1, Aeg/2; es decir, "con deleción cuádruple"; véase la patente estadounidense n.° 5847276, WO 92/06184 y WO 05/001036). Las mezclas de transformación con un contenido de hasta 600 ng de ADN y 1-5*105 protoplastos en un volumen total de 25 j l se trataron con 200 ml de 25 % solución PEG, diluida con 2 volúmenes de 1,2 M solución sorbitol, mezclado con MM agarosa superior selectiva 3 % con acetamida y se vertió en agarosa selectiva 2 % con acetamida bien en placas de microtitulación de 24 pocillos. Las placas se incubaron a 28 °C durante un periodo de 5 a 8 días. Las esporas de la población total de transformantes regeneradas en cada pocillo individual se recogieron de las placas utilizando una solución de 0,85 % NaCl, 0,015% Tween 80. Las suspensiones de esporas se utilizaron para inocular fermentaciones en PMT de 96 pocillos. En el caso de PMT de 24 pocillos, se introdujo una etapa adicional de recubrimiento sobre una PMT de 24 pocillos nueva con MM acetamida selectiva con el fin de enriquecer el número de esporas.

[0249] Los transformantes se fermentaron en PMT y se utilizaron para los análisis los sobrenadantes de cultivo con variantes de proteína expresadas. En resumen, las PMT con 200 j l de medio LD-GSM se inocularon por cuadruplicado con suspensiones de esporas de transformantes de T. reesei que expresan variantes de TrGA (más de 104 esporas por pocillo). Las placas se incubaron a 28 °C con agitación a 230 rpm y 80 % de humedad durante 6 días. Los sobrenadantes de cultivo se recolectaron mediante filtración al vacío. Los sobrenadantes se utilizaron en diferentes análisis para la detección de variantes con propiedades mejoradas.

[0250] Las variantes que muestran un índice de rendimiento superior a 1,0 para la estabilidad térmica, actividad específica y tanto estabilidad térmica como actividad específica se muestran en las tablas 15-17.

Tabla 15. Detección de estabilidad térm ica de variantes de TrGA adicionales

Tabla 16. Detección de actividad específica de variantes de TrGA adicionales

Tabla 17. Variantes de TrGA adicionales que muestran tanto estabilidad térmica como actividad específica aumentadas

Ejemplo 12: Caracterización de un conjunto seleccionado de variantes combinatorias y de sitio único

[0251] Según los resultados de los Ejemplos 4-6 y 11, se caracterizó además un conjunto de variantes combinatorias y variantes de sitio único para determinar propiedades modificadas. El conjunto seleccionado incluye variantes combinatorias y de sitio único con sustituciones en: 143, D44, N61, G73, G294, L417, T430, A431, E503, Q511, A535, A539 y/o N563. Las variantes se purificaron a partir de fermentación a gran escala y se determinaron los PI de estabilidad térmica y actividad específica. De forma específica, las actividades específicas se determinaron utilizando diferentes sustratos, entre los que se incluyen DP7, almidón de maíz y sustrato licuado. Los resultados se muestran en la tabla 18 y 19.

Tabla 18. PI de un conjunto seleccionado de variantes de sitio único, cada una de las cuales viene de una fermentación de 500 ml

Tabla 19. PI de un conjunto seleccionado de variantes combinatorias

Ejemplo 11: Estructura de cristal de TrGA

[0252] La estructura tridimensional completa de la glucoamilasa Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) (TrGA) se determinó con la resolución 1,9 A. TrGA se cristalizó de forma intacta con 599 residuos y con todas las modificaciones traduccionales posteriores que normalmente tendrían lugar en el huésped natural. La estructura de cristal se produjo y se analizó de la siguiente manera:

[0253] Para la expresión proteica y purificación, el gen codificante de GA H. jecorina se clonó y se expresó según los protocolos descritos en la patente estadounidense n.° 7413887.

[0254] El material de proteína TrGA usado para todos los experimentos de cristalización se purificó inicialmente en una etapa mediante cromatografía de intercambio de aniones como se muestra a continuación: se prepararon sobrenadantes de cultivo concentrados de TrGA expresada, consistentes en 180 mg/ml de proteína total, mediante la dilución de la muestra 1:10 en un tampón de Tris-HCl 25 mM, pH 8,0. Se empleó una columna FF Sepharose Q HiPrep 16/10 (GE Helthcare) para la purificación de intercambio aniónico. La columna HiPrep se equilibró con 4 volúmenes de columna (VC) de tampón de inicio (Tris-Hcl 25 mM, pH 8,0) seguido de una aplicación de 10 ml de la muestra proteica diluida. Se aplicó un gradiente lineal 8 VC de 0 a 140 mM NaCl en el tampón de migración (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0) con el fin de eluir la proteína unida. Se eluyó la TrGA unida de la columna sepharose Q HiPrep con una concentración de sal de aproximadamente NaCl 80 mM. Las fracciones con proteína TrGA pura se acumularon y concentraron a 50 mg/ml utilizando un tubo de concentración centrífuga Vivaspin de 25 ml (Viva Science) con un límite de peso molecular (LPM) de 10 kD. Se cambió el tampón del material de TrGA purificado y concentrado utilizando una columna desaladora DG-10 (Bio-Rad) equilibrada con tampón acetato de sodio 50 mM, pH 4,3. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante la medición de la absorbancia a 280 nm. El contenido proteico de TrGA concentrado y purificado inicialmente se almacenó a -20 °C.

[0255] Se introdujeron dos etapas de purificación adicionales, una purificación mediante intercambio de aniones adicional y una purificación por exclusión de tamaño, con el fin de mejorar la capacidad de formar cristales del material proteico TrGA. Estas dos etapas de purificación adicionales se llevaron a cabo de la siguiente forma. En la primera etapa de purificación por intercambio de aniones se utilizó una columna MonoQ 10 ml (GE Helthcare). Una muestra de 1 ml del material TrGA congelado y purificado inicialmente (50 mg proteína) se descongeló y el tampón se cambió a Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, mediante dilución repetida de la muestra a 6 ml en el nuevo tampón, seguido de una concentración de la muestra de nuevo a 0,5 ml utilizando un tubo de concentración de 6 ml LPM 5 kD. La muestra TrGA se diluyó tras la última etapa de concentración en agua destilada hasta que se alcanzó una conductividad de la muestra proteica que correspondía a la conductividad del tampón inicial de la purificación de aniones, es decir, Tris-HCl 25 mM, pH 8,0. La columna MonoQ se equilibró primero con tampón de inicio 4 volúmenes de columna (VC), seguido de la aplicación de la muestra proteica diluida a la columna. Se eluyó la proteína unida de la columna MonoQ mediante dos gradientes diferentes. En el primero, se aplicó un gradiente pH lineal 4 VC donde el pH del tampón de inicio se disminuyó de 8,0 a 6,0. En el segundo gradiente, se aplicó un gradiente de sal largo 8 VC en el que la concentración de sal aumentó de 0 a 350 mM NaCl en el tampón de migración (Tris-HCl 25 mM, pH 6,0). Se halló que la TrGA unida se eluía de la columna durante el segundo gradiente de sal con una concentración de NaCl aproximada de 150 mM. Las fracciones con TrGA se acumularon y concentraron a 2 ml utilizando un tubo de concentración Vivaspin 6 ml LPM 5 kD. A continuación, la muestra TrGA concentrada se aplicó a una columna de exclusión de tamaño Superdex 200 16/60 (GE Healthcare) equilibrada con 4 VC de Tris-Cl 20 mM, pH 8,0 y NaCl 50 mM, que también se utilizó como tampón de migración. Las fracciones del principal pico de elución tras la purificación por exclusión de tamaño se acumularon y concentraron a una concentración de proteína aproximada de 7,5 mg/ml utilizando un tubo de concentración Vivaspin de 6 ml LPM 5kD.

[0256] Para la cristalización de proteína, la muestra proteica que se utilizó para hallar las condiciones de cristalización de TrGA iniciales fue una muestra del material TrGA que se purificó una vez mediante purificación por intercambio de aniones y a partir de ahí se almacenó a -20 °C. La muestra proteica TrGA se descongeló y se diluyó con tampón acetato de sodio 50 mM, pH 4,3 a aproximadamente 12 mg/ml antes de los experimentos de cristalización iniciales. El conjunto de datos de rayos X ortorrómbicos se utilizó para solucionar la estructura TrGA mediante reemplazo molecular (RM) y el conjunto de datos ortorrómbicos de alta resolución se utilizó para el modelo de estructura TrGA del grupo espacial ortorrómbico final. Se halló que los cristales TrGA ortorrómbicos se cultivaban en solución consistente en 25 % PEG 3350, 0,20M acetato de amonio, 0,10M Bis-Tris pH 5,5 (solución de reserva), utilizando el método de difusión por vapor con gotas colgantes (McPherson 1982), a 20 °C. Las gotas de cristalización se prepararon mediante la mezcla de iguales cantidades de solución proteica (12 mg/ml) y solución de reserva para un volumen final de 10 pl. Se halló que los cristales TrGA pertenecen al grupo espacial ortorrómbico P212121 con las dimensiones celulares aproximadas: a = 52.2 A, b = 99.2 A, c = 121.2 A, y presentan una Vm calculada de 2,3 (Matthews 1968) con una molécula en la unidad asimétrica.

[0257] Para la recogida de datos de rayos X, los dos conjuntos de datos TrGA ortorrómbicos se recogieron de cristales únicos fijados en tubos capilares sellados, a temperatura ambiente. El conjunto de datos de rayos X TrGA ortorrómbicos de baja resolución iniciales, utilizado para solucionar la estructura mediante métodos de reemplazo molecular (RM), se recogió en una fuente de rayos X doméstica, un detector de placa de imagen Raxis IV++ MSC/Rigaku (Molecular Structures Corp., The Woodlands, Texas) con espejos de enfoque con una radiación Cu Ka de un generador de ánodos giratorio Rigaku RU200. Este conjunto de datos se procesó, se organizó y se realizó la media utilizando el software d*trek suministrado por MSC/Rigaku. El conjunto de datos monoclínicos centrados C se recogió de un único cristal TrGA congelado a 100 K equilibrado en un agente crioprotector compuesto de 25 % PEG 3350, 15% Glicerol 50 mM CaCh y 0,1 M Bis-Tris pH 5,5 como crioprotector, fijado en bucles de fibra rayón y sumergido congelado en nitrógeno líquido antes de su transporte al sincrotrón. Tanto el conjunto de datos ortorrómbicos de alta resolución (1.9 A) como el conjunto de datos monoclínicos centrados C (1.8 A) se recogieron en una fuente de sincrotrón, línea de haz 911:5 en MAX LAB en Lund, Suecia. Ambos conjuntos de datos recogidos en una fuente de sincrotrón se procesaron con MOSFLM y se organizaron con el programa SCALA incluido en el paquete de programas CCP4 (Collaborative Computational Project Number 4 1994). El procesamiento de datos posterior se llevó a cabo utilizando el paquete de programas CCP4 (Collaborative Computational Project Number 4 1994), a menos que se indique lo contrario. Un conjunto del 5 % de las reflexiones de cada conjunto de datos se deja apartado y se utiliza para controlar el libre R (Brünger, A (1992) Nature, 355:472-475).

[0258] La estructura TrGA se solucionó inicialmente mediante RM con el programa de reemplazo automático MOLREP (Collaborative Computational Project Number 4 1994), incluido en el paquete de programas CCP4, utilizando el conjunto de datos ortorrómbicos de resolución baja inicial y utilizando las coordenadas de la variante Aspergillus awamori GA (AaGA) X100 (pdb entrada 1GLM (Aleshin et al. (1994) J. Mol. Boil. 238: 575-591) como modelo de investigación. Se editó el modelo de investigación A. awamori GA para eliminar todas las fracciones de glicosilación fijadas a la molécula de proteína como glicosilaciones N- y O- y todas las moléculas de solventes antes de llevar a cabo los experimentos de RM. Todas las reflexiones entre 36,8 y 2,8 A de resolución, del conjunto de datos de TrGA de baja resolución inicial, se utilizaron para la solución RM. El programa de RM halló una única solución de función de rotación, con un máximo de 11,1 a por encima de lo ya registrado, el siguiente valor más alto fue 3,8 a por encima de lo ya registrado. La solución de función de traducción proporcionó un factor R de 48,7 % y presentó un factor de contraste de 17,4. La solución MR se refinó durante 10 ciclos de refinamiento de cuadrados mínimos limitado utilizando el programa Refmac 5.0(Murshudov et al (1997) Acta Crystallogr. D53: 240 255). Esto redujo el factor R cristalográfico a 31,1% mientras que el valor libre R cayó desde 42,2 % a 41,1 %.

[0259] El modelo de solución RM refinado se utilizó para calcular un mapa de densidad inicial a partir del conjunto de datos TrGA ortorrómbicos de baja resolución. La densidad de electrones para un puente disulfuro entre los

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una variante de glucoamilasa que comprende al menos:

(i) una sustitución de aminoácidos correspondiente a la posición 431 en SEQ ID NO: 2 o una posición equivalente basada en la alineación de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID NO: 2; y

en la que la variante de glucoamilasa presenta al menos un 93 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2,

y en la que la variante de glucoamilasa muestra termoestabilidad aumentada y/o actividad específica aumentada en comparación con la glucoamilasa de SEQ ID NO: 2.

2. Variante de glucoamilasa según la reivindicación 1, en la que la sustitución en la posición 431 en SEQ ID NO:

2 se elige de: A431L/Q.

3. Variante de glucoamilasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la variante es una variante de una glucoamilasa precursora que presenta un dominio catalítico con al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o 2, o que presenta un dominio de unión a almidón con al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o 2.

4. Variante de glucoamilasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la variante de glucoamilasa presenta al menos un 95 % o al menos un 99,5 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, o en la que la variante es una variante de una glucoamilasa precursora que es SEQ ID NO: 1 o 2

5. Variante de glucoamilasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la variante comprende sustituciones de aminoácidos correspondientes a A431L y uno o más de N61I, G73F, L417R/V, T430A/M, E503A/V, Q511H, A535R, A539R, o N563I/K en SEQ ID NO: 2.

6. Variante de glucoamilasa según la reivindicación 5, en la que la variante comprende además una o más de las siguientes sustituciones: D4L/E/R/S/C/A/Q/W, F5C/M/N/R/S/T/V/W,Il2L/R, D24E/L/Y/T, F29L/I/D/C/S/V/W, I43F/R/D/Y/S/Q, D44E/H/K/S/N/Y/F/R/C,Y47W,Y49N, Q70R/K/M/P/G/L/F,Q75R/K/A, R76L/M/K/T/P,P94L,D100W/I/Q/M/P/A/N, N119P/T/Y/D/E, N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/F/M,Q148V/Y/H/A/C/D/G/M/R/S/T, Y169D/F, Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V,F175H/A/G/R/S/T/C/W/Y, W178A/C/D/E/F/G/H/K/N/R/S/T/V/Y,E180A/C/G/H/I/L/N/P/Q/R/S/T/V/Y, VI81E/C/D/G/H/I/P/T/Y/S/L/K/F/A,Q208L/A/C/E/N/F/H/T, S211C/R/E/A/Y/W/M/H/L/I/R/Q/T, E243S/R/N/M/Y/A/L,R245A/E/M/I/P/V, I292D/H/P/R/T/N/V/F/L, G294C/D/E/T/Q/I/A,K297F/L/P/T/M/D/N/Q/A/Y/H/S/R/W, R309A/C/G/H/I/N/P/Q/S/T/W/Y/L,Y310E/G/L/P/S/W/R/Q, D313Q, V314A/R/N/D/C/E/Q/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y,Y315F, Y316Q/R, N317T/H, K340D/T, K341F/D/P/V/G/S, T350S/E/A/N,Q356H/D/E, T363L/R/C/H/W, S368W/D/F/L, S369F, N376Q/T/H/S/V, Y395Q/R/S,A398S/I/T, S401C/V, R408S, N409W/T/K, T412A/H/K/G, R433H/Q, 1436A/T, o S451 M/T/H en SEQ ID NO: 2.

7. Variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende sustituciones múltiples en las posiciones:

I43/N61/T430/A431/Q511/A539;

I43/L417/T430/A431/Q511/A539;

I43/T430/A431/E503/Q511;

I43/T430/A431/Q511;

I43/T430/A431/Q511/A539;

I43/A431/Q511;

G294/L417/A431;

G294/L417/A431/Q511;

L417/T430/A431/Q511/A535/A539/N563; y

L417/A431/Q511.

8. Variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende uno de los conjuntos de sustitución:

I43Q/N61I/T430A/A431L/Q511H/A539R;

143Q/L417V/T430A/A431L/Q511H/A539R;

I43Q/T430A/A431L/E503A/Q511H;

I43Q/T430A/A431L/Q511H;

I43Q/T430A/A431L/Q511H/A539R;

I43Q/A431L/Q511H;

G294C/L417R/A431L;

G294C/L417R/A431L,Q/Q511H;

G294C/L417V/A431Q;

L417R,V/A431L,Q/Q511H; y

L417V/T430A/A431L,Q/Q511H/A535R/A539R/N563I,

de SEQ ID NO: 2.

9. Variante de glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la glucoamilasa precursora se elige de una glucoamilasa obtenida a partir de una Trichoderma spp., una Aspergillus spp., una Humicola spp., una Penicillium spp., una Talaromyces spp., o una Schizosaccharomyces spp.

10. Un polinucleótido que codifica la variante de glucoamilasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 10.

12. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 11.

13. Una composición de enzima que comprende la variante de glucoamilasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

14. Un método para producir una variante de glucoamilasa en una célula huésped que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 12 con las condiciones adecuadas para la expresión y producción de la variante de glucoamilasa y la producción de la variante de glucoamilasa.

15. Método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende además la recuperación de la variante de glucoamilasa del cultivo.