CN117925790A - 一种用于恒温指数扩增的模板 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于恒温指数扩增的模板，模板由X’Y’模板和Y’Y’模板组成，X’Y’模板为靶序列识别模板，Y’Y’模板为信号指数放大扩增模板；X’Y’模板的3’端标记有封闭基团；或X’Y’模板的3’端没有标记封闭基团；Y’Y’模板含有切刻内切酶和/或限制性内切酶识别位点；Y’Y’模板标记有荧光基团和淬灭基团，且Y’Y’模板的3’端标记有封闭基团；或Y’Y’模板标记有荧光基团和淬灭基团。本发明解决了现有的用于恒温指数扩增的模板非特异性扩增较高，导致检测结果准确性不佳的技术问题，实现了提高检测结果的准确性，以及检测特异度和灵敏度，并且降低检测成本的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于恒温指数扩增的模板。
背景技术
核酸扩增技术是一种用于检测和定量特定DNA或RNA序列的分子生物学方法，这种技术的出现和发展，使得我们能够在病原体检测、基因研究等领域进行更为精确和高效的工作。
核酸扩增技术中最常用的是聚合酶链反应(PCR)，其扩增速率高，可以在很短的时间内得到大量的扩增产物；灵敏度高，可以检测到非常低浓度的目标序列；可重复性好，可以在不同实验室和不同设备上得到一致的结果，同时适用于多种不同的样本类型和目标序列。但PCR扩增技术操作较为复杂，需要精确的温度控制和设备；扩增时间相对较长且成本较高。
恒温扩增技术是一种无需温度变化即可进行核酸扩增的技术，主要包括：重组酶聚合酶扩增技术，环介导等温扩增技术，链替代扩增技术，滚环扩增技术等。恒温扩增技术具有以下优势：操作简单，不需要复杂的温度控制和设备；扩增时间相对较短，可在5min内扩增到106-109倍；灵敏度高，可以检测到低浓度的目标序列。但是非特异性扩增较高，检测结果的准确性会受到影响。而用于恒温扩增技术的模板序列在整个扩增过程中起着关键的作用，模板的设计需要确保特异性和合适的杂交温度。同时为了减少非特异性扩增，需要对模板序列的3’端进行修饰，以减少模板自身回折，触发整个恒温扩增过程。
发明内容
本发明解决了现有的用于恒温指数扩增的模板非特异性扩增较高，导致检测结果准确性不佳的技术问题，实现了提高检测结果的准确性，以及检测特异度和灵敏度，并且降低检测成本的技术效果。
为解决上述问题，本发明提供一种用于恒温指数扩增的模板，模板由X’Y’模板和Y’Y’模板组成，X’Y’模板为靶序列识别模板，Y’Y’模板为信号指数放大扩增模板；X’Y’模板的3’端标记有封闭基团；或X’Y’模板的3’端没有标记封闭基团；Y’Y’模板含有切刻内切酶和/或限制性内切酶识别位点；Y’Y’模板标记有荧光基团和淬灭基团，且Y’Y’模板的3’端标记有封闭基团；或Y’Y’模板标记有荧光基团和淬灭基团。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明通过添加或不添加限制性内切酶识别位点，限制性内切酶识别位点处于切刻内切酶识别序列之前，当靶序列存在时，触发整个恒温指数扩增，限制性内切酶和切刻内切酶可同时工作并且不会互相影响。荧光基团和淬灭基团处于限制性内切酶识别序列的3’端和5’端，经限制性内切酶酶切后，可产生靶分子特异性的可检测信号，同时酶切掉的序列可继续进行扩增，触发更大范围的酶切反应。在未添加限制性内切酶位点的荧光模板上，因单链模板的柔性特性，使得荧光基团和淬灭基团之间的距离较近而无或少量荧光发出；当有特异性扩增时，荧光模板因双链形成而变得刚性，荧光基团和淬灭基团之间的距离增大，淬灭基团因无法淬灭荧光基团发出的荧光，使荧光信号增强数倍。上述模板设计方法可使检测操作简便，大大减少非特异性扩增的信号干扰，降低检测成本，所需样本少，灵敏度高，特异性强，而且为恒温指数扩增信号放大反应，能够缩短检测时长。
在本发明的一个实例中，封闭基团为氨基、ddC、磷酸化修饰中的任一种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：对3’端进行封闭可以有效降低非特异性扩增，减少模板自身回折，避免触发整个恒温扩增过程，进而提高检测的准确性。
在本发明的一个实例中，Y’Y’模板的3’末端修饰氨基，可与流式编码微球或基因芯片表面的羧基基团进行连接。
在本发明的一个实例中，荧光基团为异硫氰酸荧光素、羧基荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、CY3、CY5、ROX、TAMRA、Texas Red中的任一种。
在本发明的一个实例中，淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和Dabcyl中的任一种。
在本发明的一个实例中，X’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，X’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：第一区，第一区的核苷酸序列与靶分子特异性核苷酸序列部分或完全互补，第一区的3’末端碱基标记有封闭基团；或第一区的3’末端碱基没有标记封闭基团；第二区，与Y’Y’模板的第一区的核苷酸序列完全相同，第二区的核苷酸序列与靶分子特异性核苷酸序列无同源性；X’Y’模板的第一区与第二区之间为切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：靶序列存在时，可触发X’Y’模板对特异性Y序列的扩增反应，以此将靶序列的信号进行放大，进而提高检测的灵敏度。
在本发明的一个实例中，Y’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，Y’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：第一区，第一区的核苷酸序列与X’Y’模板的第二区的核苷酸序列完全相同，第一区的3’末端碱基标记有封闭基团；或第一区的3’末端碱基没有标记封闭基团；第二区，Y’Y’模板的第二区的核苷酸序列与其第一区的核苷酸序列完全相同，且Y’Y’模板的第二区的5’末端碱基标记有淬灭基团；Y’Y’模板的第一区与第二区之间为切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列，切刻内切酶识别序列的3’端碱基标记有荧光基团。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：Y’Y’模板序列在单链状态下，荧光基团与淬灭基团靠近，荧光信号被淬灭，Y片段存在时，会触发Y’Y’模板的扩增反应，单链完全展开形成双链，荧光基团远离淬灭基团，荧光信号产生，进而能够通过检测荧光信号来检测靶序列，灵敏度高，特异性强。
在本发明的一个实例中，Y’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，Y’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：第一区，第一区的核苷酸序列与X’Y’模板的第二区的核苷酸序列完全相同，且第一区的3’末端碱基标记有荧光基团；第二区，Y’Y’模板的第二区的核苷酸序列与其第一区的核苷酸序列完全相同，且Y’Y’模板的第二区的5’末端碱基或中间碱基标记有淬灭基团；Y’Y’模板的第一区与第二区之间为切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：Y’Y’模板序列在单链状态下，荧光基团与淬灭基团靠近，荧光信号被淬灭，Y片段存在时，会触发Y’Y’模板的扩增反应，单链完全展开形成双链，荧光基团远离淬灭基团，荧光信号产生，进而能够通过检测荧光信号来检测靶序列，灵敏度高，特异性强。
在本发明的一个实例中，Y’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，Y’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：第一区，第一区的核苷酸序列与X’Y’模板的第二区的核苷酸序列完全相同，且第一区的3’末端碱基标记有封闭基团；第二区，Y’Y’模板的第二区的核苷酸序列与其第一区的核苷酸序列完全相同；第一区的5’端碱基与切刻内切酶识别序列3’端碱基之间为限制性内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列；限制性内切酶识别序列的5’端和3’端碱基附近分别标记有淬灭基团和荧光基团；或限制性内切酶识别序列的3’端碱基标记有荧光基团，Y’Y’模板的第二区的5’末端标记有淬灭基团；Y’Y’模板的第二区的3’端碱基与切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列相连。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：Y’Y’模板序列在单链状态下，荧光基团与淬灭基团靠近，荧光信号被淬灭，Y片段存在时，会触发Y’Y’模板的扩增反应，限制性内切酶识别酶切位点并切割双链，释放淬灭基团，产生荧光，进而能够通过检测荧光信号来检测靶序列。同时切掉的双链会继续进行扩增反应，触发更大范围的酶切反应。
在本发明的一个实例中，切刻内切酶为Nt.BstNBI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nt.BsmAI切刻内切酶、Nt.BspQI切刻内切酶中的任一种。
在本发明的一个实例中，限制性内切酶为AciI、BsaHI、PstI、BsiHKAI、BsmAI、BsrBI、TaqI、MboI、HinP1I、HinfI、HhaI、DpnII、DdeI中的任一种。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例提供的3’端标记荧光基团的Y’Y’模板的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图。
图2为本发明实施例提供的中间标记荧光基团的Y’Y’模板的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图。
图3为本发明实施例提供的带有限制性内切酶识别序列的Y’Y’模板的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图。
图4为本发明实施例提供的3’端标记荧光基团的Y’Y’模板实时恒温指数扩增曲线。
图5为本发明实施例提供的带有限制性内切酶识别序列的Y’Y’模板实时恒温指数扩增曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
本发明提供一种用于恒温指数扩增的模板，模板由X’Y’模板和Y’Y’模板组成，X’Y’模板为靶序列识别模板，Y’Y’模板为信号指数放大扩增模板；X’Y’模板的3’端标记有封闭基团；或X’Y’模板的3’端没有标记封闭基团；Y’Y’模板含有切刻内切酶和/或限制性内切酶识别位点；Y’Y’模板标记有荧光基团和淬灭基团，且Y’Y’模板的3’端标记有封闭基团；或Y’Y’模板标记有荧光基团和淬灭基团，Y’Y’模板的3’端没有标记封闭基团。
进一步地，封闭基团为氨基、ddC、磷酸化修饰中的任一种。
具体的，ddc为双脱氧胞苷。
进一步地，Y’Y’模板的3’末端修饰氨基，可与流式编码微球或基因芯片表面的羧基基团进行连接。
进一步地，荧光基团为异硫氰酸荧光素、羧基荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、CY3、CY5、ROX、TAMRA、Texas Red中的任一种。
进一步地，淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和Dabcyl中的任一种。
举例来说，X’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，X’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：第一区，第一区的核苷酸序列与靶分子特异性核苷酸序列部分或完全互补，第一区的3’末端碱基标记有封闭基团；或第一区的3’末端碱基没有标记封闭基团；第二区，与Y’Y’模板的第一区的核苷酸序列完全相同，第二区的核苷酸序列与靶分子特异性核苷酸序列无同源性；X’Y’模板的第一区与第二区之间为切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列。
举例来说，Y’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，Y’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：第一区，第一区的核苷酸序列与X’Y’模板的第二区的核苷酸序列完全相同，第一区的3’末端碱基标记有封闭基团；或第一区的3’末端碱基没有标记封闭基团；第二区，Y’Y’模板的第二区的核苷酸序列与其第一区的核苷酸序列完全相同，且Y’Y’模板的第二区的5’末端碱基标记有淬灭基团；Y’Y’模板的第一区与第二区之间为切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列，切刻内切酶识别序列的3’端碱基标记有荧光基团。
参见图1，其为3’端标记荧光基团的Y’Y’模板的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图。Y’Y’模板序列在单链状态下，荧光基团与淬灭基团靠近，荧光信号被淬灭，Y片段存在时，会触发Y’Y’模板的扩增反应，单链完全展开形成双链，荧光基团远离淬灭基团，荧光信号产生，进而能够通过检测荧光信号来检测靶序列，灵敏度高，特异性强。
举例来说，Y’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，Y’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：第一区，第一区的核苷酸序列与X’Y’模板的第二区的核苷酸序列完全相同，且第一区的3’末端碱基标记有荧光基团；第二区，Y’Y’模板的第二区的核苷酸序列与其第一区的核苷酸序列完全相同，且Y’Y’模板的第二区的5’末端碱基或中间碱基标记有淬灭基团；Y’Y’模板的第一区与第二区之间为切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列。
参见图2，其为中间标记荧光基团的Y’Y’模板的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图。Y’Y’模板序列在单链状态下，荧光基团与淬灭基团靠近，荧光信号被淬灭，Y片段存在时，会触发Y’Y’模板的扩增反应，单链完全展开形成双链，荧光基团远离淬灭基团，荧光信号产生，进而能够通过检测荧光信号来检测靶序列，灵敏度高，特异性强。
举例来说，Y’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，Y’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：第一区，第一区的核苷酸序列与X’Y’模板的第二区的核苷酸序列完全相同，且第一区的3’末端碱基标记有封闭基团；第二区，Y’Y’模板的第二区的核苷酸序列与其第一区的核苷酸序列完全相同；第一区的5’端碱基与切刻内切酶识别序列3’端碱基之间为限制性内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列；限制性内切酶识别序列的5’端和3’端碱基附近分别标记有淬灭基团和荧光基团；或限制性内切酶识别序列的3’端碱基标记有荧光基团，Y’Y’模板的第二区的5’末端标记有淬灭基团；Y’Y’模板的第二区的3’端碱基与切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列相连。
参见图3，其为带有限制性内切酶识别序列的Y’Y’模板的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图。Y’Y’模板序列在单链状态下，荧光基团与淬灭基团靠近，荧光信号被淬灭，Y片段存在时，会触发Y’Y’模板的扩增反应，限制性内切酶识别酶切位点并切割双链，释放淬灭基团，产生荧光，进而能够通过检测荧光信号来检测靶序列，灵敏度高，特异性强。同时切掉的双链会继续进行扩增反应，触发更大范围的酶切反应。
进一步地，切刻内切酶为Nt.BstNBI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nt.BsmAI切刻内切酶、Nt.BspQI切刻内切酶中的任一种。
进一步地，限制性内切酶为AciI、BsaHI、PstI、BsiHKAI、BsmAI、BsrBI、TaqI、MboI、HinP1I、HinfI、HhaI、DpnII、DdeI中的任一种。
实施例一：
本发明实施例提供一种用于恒温指数扩增的模板的设计方法，包括以下步骤：
1.根据靶序列的序列信息，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸X’序列和信号扩增模板，信号扩增模板由X’Y’模板和Y’Y’模板组成。
Seq1为靶序列模拟分子，具有可触发其自身延伸的3’-OH；
Seq2为X’Y’模板，其3’端至5’端的核苷酸序列组成特征依次为：①与Seq1核苷酸序列互补的第一区核苷酸序列，并且3’端修饰ddC；②相较于X’序列无同源性的特异性第二区Y’核苷酸序列；③第一区与第二区之间为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列反义链，即5’-AACAGACTC-3’；
Seq3为Y’Y’模板，其3’端至5’端的核苷酸序列组成特征依次为：①与Seq2第二区核苷酸序列完全相同的第一区核苷酸序列，并且3’端修饰ddC；②与Seq3第1区完全相同的第二区核苷酸序列，并且其5’端标记BHQ1淬灭基团；③第一区与第二区之间为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列反义链及酶切间距序列，即5’-AACAGACTC-3’，并且其3’端标记FAM荧光基团。Seq1、Seq2、Seq3为DNA序列，DNA序列参见表1。
表1DNA序列
2.实时荧光恒温指数扩增
将系列终浓度(2*106、2*103、2、0个拷贝)Seq1与10pM Seq2进行高温变性退火，得到变性退火产物，将变性退火产物加到合适的PCR反应体系中进行恒温指数扩增，体系总体积为20μL。体系中包含的组分为：10nM Y’Y’模板，5μM dNTPs mix，1хNEBuffer，40mMTMAC，0.005U/μL WS Bst2.0，0.015U/μL Nt.BstNBI，无核酸酶水。反应条件为：55℃，60min，荧光采集为每30s采集一次，所用设备为SLAN-96P实时荧光定量PCR仪。
3.结果分析
2*106、2*103、2、0个拷贝Seq1的扩增曲线参见图4，结果表明，所有检测浓度的Seq1均在10～40的时间内达到扩增平台期，检测灵敏度至少可达到2个拷贝。
实施例二：
本发明实施例提供一种用于恒温指数扩增的模板的设计方法，包括以下步骤：
1.根据靶序列的序列信息，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸X’序列和信号扩增模板，信号扩增模板由X’Y’模板和Y’Y’模板组成。
Seq1为靶序列模拟分子，具有可触发其自身延伸的3’-OH；
Seq2为X’Y’模板，其3’端至5’端的核苷酸序列组成特征依次为：①与Seq1核苷酸序列互补的第一区核苷酸序列，并且3’端修饰ddC；②相较于X’序列无同源性的特异性第二区Y’核苷酸序列③第一区与第二区之间为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列反义链，即5’-AACAGACTC-3’；
Seq3为Y’Y’模板，其3’端至5’端的核苷酸序列组成特征依次为：①与Seq2第二区核苷酸序列完全相同的第一区核苷酸序列，并且3’端修饰ddC；②与Seq3第1区完全相同的第二区核苷酸序列；③第一区5’端碱基与切刻内切酶识别序列3’端碱基之间为PstI限制性内切酶识别序列反义链序列，即5’-CTGCAG-3’，并且其5’端和3’端碱基分别标记BHQ1淬灭基团和FAM荧光基团；④与第二区3’端碱基相连的为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列，即5’-AACAGACTC-3’。Seq1、Seq2、Seq3为DNA序列，DNA序列参见表2。
表2DNA序列
将系列终浓度(2*106、2*103、2、0个拷贝)Seq1与10pM Seq2进行高温变性退火，得到变性退火产物。将变性退火产物加到合适的PCR反应体系中进行恒温指数扩增，体系总体积为20μL。体系中包含的组分为：10nM Y’Y’模板，5μM dNTPs mix，1хNEBuffer，40mMTMAC，0.005U/μL WS Bst2.0，0.015U/μL Nt.BstNBI，0.02U/μL PstI，无核酸酶水。反应条件为：55℃，60min，荧光采集为每30s采集一次，所用设备为SLAN-96P实时荧光定量PCR仪。
3.结果分析
2*106、2*103、2、0个拷贝Seq1的扩增曲线参见图5，结果表明，所有检测浓度的Seq1均在10～40的时间内达到扩增平台期，检测灵敏度至少可达到2个拷贝。
综上所述，上述用于恒温指数扩增的模板可使检测操作简便，大大减少非特异性扩增的信号干扰，降低检测成本，所需样本少，灵敏度高，特异性强，而且为恒温指数扩增信号放大反应，能够缩短检测时长。
实施例三：
本发明实施例提供一种用于恒温指数扩增的模板的设计方法，包括以下步骤：
1.根据靶序列的序列信息，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸X’序列和信号扩增模板，信号扩增模板由X’Y’模板和Y’Y’模板组成。
Seq1为靶序列模拟分子，具有可触发其自身延伸的3’-OH；
Seq2为X’Y’模板，其3’端至5’端的核苷酸序列组成特征依次为：①与Seq1核苷酸序列互补的第一区核苷酸序列，并且3’端修饰ddC；②相较于X’序列无同源性的特异性第二区Y’核苷酸序列；③第一区与第二区之间为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列反义链，即5’-AACAGACTC-3’；
Seq3为Y’Y’模板，其3’端至5’端的核苷酸序列组成特征依次为：①与Seq2第二区核苷酸序列完全相同的第一区核苷酸序列，并且3’末端修饰氨基；②与Seq3第1区完全相同的第二区核苷酸序列，并且其5’端标记BHQ1淬灭基团；③第一区与第二区之间为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列反义链及酶切间距序列，即5’-AACAGACTC-3’，并且其3’端标记FAM荧光基团。Seq1、Seq2、Seq3为DNA序列，DNA序列参见表3。
表3DNA序列
2.实时荧光恒温指数扩增
使用引物偶联试剂盒将流式编码微球与Y’Y’模板偶联，由于Y’Y’模板的3’末端修饰氨基，因此可与流式编码微球表面的羧基基团进行连接。
将系列终浓度(2*106、2*103、2、0个拷贝)Seq1与10pM Seq2进行高温变性退火，得到变性退火产物。55℃恒温指数扩增目的序列。反应体系为50μl。将变性退火产物和包被有Y’Y’模板序列的流式编码微球加到合适的恒温指数扩增体系中，对目的序列进行特异性扩增，得到扩增产物，得到的扩增产物放于4℃中保存。按照试剂盒说明书要求进行试验，此步骤可替换成其他同类型试剂盒。
使用流式细胞仪对流式编码微球逐颗进行分析，检测流式编码微球荧光，本发明采用恒温指数扩增，不需要复杂的仪器设备，可在短时间内表现出很高的放大效率，大大缩短检测时间。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (11)
1.一种用于恒温指数扩增的模板，其特征在于，所述模板由X’Y’模板和Y’Y’模板组成，所述X’Y’模板为靶序列识别模板，所述Y’Y’模板为信号指数放大扩增模板；
所述X’Y’模板的3’端标记有封闭基团；或
所述X’Y’模板的3’端没有标记所述封闭基团；
所述Y’Y’模板含有切刻内切酶和/或限制性内切酶识别位点；
所述Y’Y’模板标记有荧光基团和淬灭基团，且所述Y’Y’模板的3’端标记有所述封闭基团；或
所述Y’Y’模板标记有所述荧光基团和所述淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的模板，其特征在于，所述封闭基团为氨基、ddC、磷酸化修饰中的任一种。
3.根据权利要求1所述的模板，其特征在于，所述Y’Y’模板的3’末端修饰氨基，可与流式编码微球或基因芯片表面的羧基基团进行连接。
4.根据权利要求1所述的模板，其特征在于，所述荧光基团为异硫氰酸荧光素、羧基荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、CY3、CY5、ROX、TAMRA、Texas Red中的任一种。
5.根据权利要求1所述的模板，其特征在于，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB和Dabcyl中的任一种。
6.根据权利要求1所述的模板，其特征在于，所述X’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，所述X’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：
第一区，所述第一区的核苷酸序列与靶分子特异性核苷酸序列部分或完全互补，所述第一区的3’末端碱基标记有所述封闭基团；或所述第一区的3’末端碱基没有标记所述封闭基团；
第二区，与所述Y’Y’模板的第一区的核苷酸序列完全相同，所述第二区的核苷酸序列与所述靶分子特异性核苷酸序列无同源性；
所述X’Y’模板的第一区与第二区之间为切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列。
7.根据权利要求1所述的模板，其特征在于，所述Y’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，所述Y’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：
第一区，所述第一区的核苷酸序列与所述X’Y’模板的第二区的核苷酸序列完全相同，所述第一区的3’末端碱基标记有所述封闭基团；或所述第一区的3’末端碱基没有标记所述封闭基团；
第二区，所述Y’Y’模板的第二区的核苷酸序列与其第一区的核苷酸序列完全相同，且所述Y’Y’模板的第二区的5’末端碱基标记有所述淬灭基团；
所述Y’Y’模板的第一区与第二区之间为切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列，所述切刻内切酶识别序列的3’端碱基标记有所述荧光基团。
8.根据权利要求1所述的模板，其特征在于，所述Y’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，所述Y’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：
第一区，所述第一区的核苷酸序列与所述X’Y’模板的第二区的核苷酸序列完全相同，且所述第一区的3’末端碱基标记有所述荧光基团；
第二区，所述Y’Y’模板的第二区的核苷酸序列与其第一区的核苷酸序列完全相同，且所述Y’Y’模板的第二区的5’末端碱基或中间碱基标记有所述淬灭基团；
所述Y’Y’模板的第一区与第二区之间为切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列。
9.根据权利要求1所述的模板，其特征在于，所述Y’Y’模板为具有线性结构的寡核苷酸，所述Y’Y’模板的3’-5’端的核苷酸序列组成特征依次为：
第一区，所述第一区的核苷酸序列与所述X’Y’模板的第二区的核苷酸序列完全相同，且所述第一区的3’末端碱基标记有所述封闭基团；
第二区，所述Y’Y’模板的第二区的核苷酸序列与其第一区的核苷酸序列完全相同；
所述第一区的5’端碱基与切刻内切酶识别序列3’端碱基之间为限制性内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列；
所述限制性内切酶识别序列的5’端和3’端碱基附近分别标记有所述淬灭基团和所述荧光基团；或
所述限制性内切酶识别序列的3’端碱基标记有所述荧光基团，所述Y’Y’模板的第二区的5’末端标记有所述淬灭基团；
所述Y’Y’模板的第二区的3’端碱基与所述切刻内切酶识别序列反义链序列及酶切间距序列相连。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的模板，其特征在于，所述切刻内切酶为Nt.BstNBI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nt.BsmAI切刻内切酶、Nt.BspQI切刻内切酶中的任一种。
11.根据权利要求9所述的模板，其特征在于，所述限制性内切酶为AciI、BsaHI、PstI、BsiHKAI、BsmAI、BsrBI、TaqI、MboI、HinP1I、HinfI、HhaI、DpnII、DdeI中的任一种。
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