CN117947144A - 核酸序列特异性的靶标切割再连接滚环扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于待测核酸环化或扩增或检测的试剂盒和应用。该试剂盒包括前端向导DNA、后端向导DNA、模板连接引物、Tth argonaute核酸内切酶和DNA连接酶。该试剂盒可用于ssDNA、dsDNA类型的样本核酸切割与检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及用于待测核酸环化或扩增或检测的试剂盒和应用。
背景技术
滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)与超分支滚环扩增技术(Hyperbranchedrollingcycleamplification,HRCA)是一种有效的酶促等温反应，它以闭环的环状核苷酸为模板，在短DNA或RNA引物的结合作用下，产生长串联的单链DNA或RNA产物。作为合成环状核酸分子(如质粒)副本的自然滚环复制的简化衍生物，RCA无需热循环即可快速扩增环状模板，并在分子生物学中找到了各种应用。与其他扩增策略相比，RCA有以下几个优点：首先，由于连接挂锁探针需要严格的互补性，因此它赋予了RCA反应高度的特异性，甚至可以用来区分单个碱基的错配。其次，通过引入多种引物，指数放大很容易实现，因此也有具备良好的灵敏度。第三，可以通过操作圆形模板来定制RCA产品，以生成功能性核酸，例如适体，DNA酶和限制酶位点。此外，RCA具有良好的生物相容性，尤其适用于原位检测。因此，RCA作为一种高效且潜在的工具，可以高度敏感地检测生物标志物，引起了广泛的关注。并且，更加适合检测具有未知结构变异的序列。
虽然滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)与超分支滚环扩增技术(Hyperbranchedrollingcycleamplification，HRCA)在原位检测以及测序上有着很好的应用场景。但其最大的问题就在于必须以环状DNA/RNA作为开端进行扩增检测。通常根据实验需求，可以合成环形探针作为RCA扩增的起始模板。但更多情况下，需要研究的是样本自身的遗传信息，此类遗传物质通常都是以dsDNA、ssDNA或RNA形式出现，并非环状核苷酸。而对于核苷酸的环化方法通常是使用模板连接探针对靶序列进行捕获对折，再通过连接酶进连接环化处理，但此类方法非常受限于靶核苷酸的长度，及结构。因反应温度都接近于体温(37℃)，对于结构复杂的核苷酸序列的单链化以及捕获再连接，更是非常困难的。尤其在面对dsDNA样本的时候，首先要将双链解链让闭锁探针寻找靶标，再通过连接酶进行靶标的环化。这个过程既费时费力，操作繁琐，环化成功率也比较低，无法更好地将滚环复制这个方法利用到分子生物学领域的应用。
发明内容
本发明核心聚焦在如何借鉴超分支滚环扩增技术与滚环扩增技术的工作原理，创新性地提出一种可以提升效率或能解决上述问题的新一代滚环扩增办法。
本发明提供了用于待测核酸环化或扩增或检测的试剂盒，包括前端向导DNA、后端向导DNA、模板连接引物、Tth argonaute核酸内切酶和DNA连接酶，
所述前端向导DNA和所述后端向导DNA为单链DNA且5’端磷酸化，所述前端向导DNA特异性结合所述待测核酸5’端相邻片段和所述待测核酸5’端片段，所述后端向导DNA特异性结合所述待测核酸3’端相邻片段和所述待测核酸3’端片段，所述前端向导DNA和后端向导DNA用于指导Tth argonaute核酸内切酶将包含待测核酸的核酸分子切割为含有待测核酸的单链核酸；
所述模板连接引物为单链DNA，其从5’端-3’端依次包括：与含有待测核酸的单链核酸的3’端至少6nt区域反向互补的区域和与含有待测核酸的单链核酸的5’端至少6nt区域互补的区域；
所述DNA连接酶用于将开口环状DNA连接形成闭口环状DNA。
该试剂盒的技术核心将一种名为“Tth argonaute”的特殊核酸内切酶，配合滚环扩增技术、超分支滚环扩增技术的工作原理，从而实现核酸序列特异性的靶标切割再连接滚环扩增方法。首先，“Tth argonaute”是一种可编辑的核酸内切酶，其通过在5‘端的磷酸化单链DNA(16–18nt)指导下，可发挥DNA介导的核酸内切酶作用，并在与DNA向导链(即前端向导DNA和/或后端向导DNA)第10和11个碱基互补的碱基处切割底物核酸(即包含待测核酸的核酸分子)。通过使用多个上述核酸内切酶，能实现对底物核酸的特异性切割，并得到具有明确目的性的特异ssDNA片段。其次，在模拟滚环扩增技术、超分支滚环扩增技术的工作原理，通过人工设计高度特异性的，并且与“Tth argonaute”内切酶切割得到的特异ssDNA片段5’/3’两端互补的模板连接引物，在连接酶的作用下，将内切酶切割得到的特异ssDNA片段补齐成环。在聚合酶的作用下，模板连接引物在补齐成环的ssDNA片段上开始从3’端聚合延伸，从而实现特异性的滚环线性扩增。更可以通过设计一条或多条与扩增产物互补的反向引物，实现特异性的滚环指数级扩增。
图1为Tth argonaute核酸内切酶对底物核酸的切割与开口环状DNA的制备。Tthargonaute核酸内切酶与前端/后端向导DNA孵育后产生的复合物(TtAgo angonaute&5’pssDNA Complex)，在特异的10～11nt处酶切底物核酸(ds DNA Nucleic acid substrate或ssDNA Nucleic acid substrate)，切割后的产物(Cut product，即Target Nucleic acidsubstrate)被模板结合引物(template ligation Primer)捕获并折叠，形成开口状环状DNA。
图2为开口环状DNA的环化与滚环扩增。开口环状DNA在Taq DNA连接酶的作用下进行连接，形成闭口环状DNA。滚环扩增以闭口环状DNA为扩增模板，在Bst聚合酶、dNTPs等离子的作用下，采用正向扩增引物完成滚环的线性扩增(Linear amplification)，或者采用正向扩增引物和反向扩增，完成滚环的指数扩增(Exponential amplification)。
包含待测核酸的核酸分子可为dsDNA，也可以是ssDNA。“Tth argonaute”核酸内切酶切割核酸分子时，可以使用复数个5’磷酸化修饰的单链DNA作为向导，具体的“Tthargonaute”核酸内切酶切割核酸分子时，优先选择2个5’磷酸化修饰的单链DNA作为向导切割核酸分子。
可选地，根据上述的试剂盒，所述模板连接引物的长度≥12nt。例如，模板连接引物的长度可以为12nt～50nt，例如可为12nt～20nt、21nt～30nt、31nt～40nt或41nt～50nt。
在一个实施例中，人工设计的模板连接引物应与“Tth argonaute”内切酶切割得到的特异ssDNA片段发生结合，且结合位置为ssDNA的3’端与模板连接引物的5’端结合，ssDNA的5’端与模板连接引物的3’端结合，形成开口环状DNA。开口环状DNA可以通过各种DNA连接酶进行连接，形成闭环环状DNA。
可选地，根据上述的试剂盒，还包括正向扩增引物，所述正向扩增引物与部分所述待测核酸反向互补，用于扩增所述待测核酸。
在一个实施例中，人工设计的模板连接引物既让“Tth argonaute”内切酶切割得到的特异ssDNA片段折叠环化，也可以在聚合酶的作用下作为正向扩增引物从3’端开始延伸，完成线性的滚环扩增。
可选地，根据上述的试剂盒，还包括反向扩增引物，所述反向扩增引物与部分所述待测核酸相同，用于扩增所述待测核酸，实现滚环的指数级扩增。
可选地，根据上述的试剂盒，还包括聚合酶，例如Bst聚合酶，以实现滚环扩增。
可选地，根据上述的试剂盒，还包括检测分子信标，所述检测分子信标为与目标核酸特异性结合的单链DNA，所述检测分子信标两端分别连接荧光基团和淬灭基团。该检测分子信标实现对产物的实时、特异性的检测。
上述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用可为在如下任一种的应用：
(1)待测核酸成环；
(2)待测核酸扩增；
(3)待测核酸滚环扩增；
(4)待测核酸检测；
(5)待测核酸测序；
(6)制备用于待测核酸成环的产品；
(7)制备用于待测核酸扩增的产品；
(8)制备用于待测核酸滚环扩增的产品；
(9)制备用于待测核酸检测的产品；
(10)制备用于待测核酸测序的产品。
本发明还提供了待测核酸的环化方法，包括
(1)将上述前端向导DNA和上述后端向导DNA混合获得预混物，再将所述预混物和Tth argonaute核酸内切酶混合获得前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物；
(2)将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、含有待测核酸的底物核酸、上述模板连接引物和上述DNA连接酶混合获得闭口环状DNA，即成环后的待测核酸。
本发明还提供了待测核酸的扩增方法，为M1或M2。
M1包括如下步骤：
(1)将上述前端向导DNA和上述后端向导DNA混合获得预混物，再将所述预混物和Tth argonaute核酸内切酶混合获得前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物；
(2)将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、含有待测核酸的底物核酸、上述模板连接引物和上述DNA连接酶混合获得闭口环状DNA；
(3)将步骤(2)获得的闭口环状DNA、DNA聚合酶和扩增引物混合进行PCR反应获得扩增的待测核酸。
M2包括如下步骤：
(1)将上述前端向导DNA和上述后端向导DNA混合获得预混物，再将所述预混物和Tth argonaute核酸内切酶混合获得前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物；
(2)将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、含有待测核酸的底物核酸、上述模板连接引物、上述DNA连接酶、DNA聚合酶和扩增引物混合进行成环和PCR反应获得扩增的待测核酸。
可选地，根据上述的扩增方法，所述扩增引物为上述正向扩增引物。
可选地，根据上述的扩增方法，所述扩增引物为上述正向扩增引物和上述反向扩增引物。
本发明还提供了一种待测核酸的检测方法，包括
(1)将上述前端向导DNA和上述后端向导DNA混合获得预混物，再将所述预混物和Tth argonaute核酸内切酶混合获得前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物；
(2)将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、含有待测核酸的底物核酸、上述模板连接引物、上述DNA连接酶、DNA聚合酶、上述分子信标和扩增引物混合进行成环和PCR反应获得荧光信号；
(3)根据步骤(2)获得的荧光信号确定待测核酸中是否存在目标核酸。
可选地，根据上述的检测方法，所述扩增引物用于扩增所述目标核酸。
可选地，根据上述的检测方法，步骤(3)为若所述荧光信号出现明显的S型曲线，且S型曲线出峰时间＜反应总时长×10％，则所述待测核酸中存在目标核酸；反之，则所述待测核酸中不存在目标核酸。
采用本发明提供的试剂盒或者扩增方法扩增出现的产物具有高度的特异性及可识别性。产物可用作物种的鉴定、测序分析、SNP位点或基因插入/缺失相关的检测。
本发明提供的试剂盒可用于ssDNA、dsDNA类型的样本核酸切割与检测。
本发明提供的试剂盒可用于微阵列芯片法、一代测序法、二代测序法(单细胞测序)、实时荧光染料法、实时荧光探针法和电泳法等的检测。
附图说明
图1为Tth argonauteTth argonauteTth argonaute核酸内切酶酶切及切割后产物的捕获折叠。
图2为切割后产物的连接环化与滚环扩增过程。
图3为实施例2叶酸代谢677号SNP点扩增后测序数据。
图4为实施例2采用本发明实施例所提供的方法对叶酸代谢677号SNP位点野生型的扩增结果。
图5为实施例3叶酸代谢677号SNP点扩增后测序数据。
图6为实施例3采用本发明实施例所提供的方法对叶酸代谢677号SNP位点突变型的扩增结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
核酸DNA提取试剂盒(天根RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(DP451))
Tth argonaute核酸内切酶(NEB公司，Tth argonaute核酸内切酶catalog:M0665S)
高温DNA连接酶(NEB公司，Taq DNA连接酶M0208L)
Bst聚合酶(NEB公司，Bst 2.0DNA聚合酶M0538L)
10×Taq DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司，Taq DNA Ligase ReactionBuffer B0208S)
10X Isothermal Amplification Buffer(NEB公司，Isothermal AmplificationBuffer B0537S)
实施例1、用于待测核酸环化或扩增的试剂盒的制备
一、用于待测核酸环化或扩增或检测试剂盒
用于待测核酸环化或扩增或检测试剂盒包括如下：
前端向导DNA，为单链DNA且5’端磷酸化，特异性结合待测核酸5’端相邻片段和待测核酸5’端片段；
后端向导DNA，为单链DNA且5’端磷酸化，特异性结合待测核酸3’端相邻片段和待测核酸3’端片段；
前端向导DNA和后端向导DNA用于指导Tth argonauteTth argonaute核酸内切酶将包含待测核酸的核酸分子切割为含有待测核酸的单链核酸；
模板连接引物，为单链DNA，其从5’端-3’端依次包括：与含有待测核酸的单链核酸的3’端至少6nt区域反向互补的区域和与含有待测核酸的单链核酸的5’端至少6nt区域互补的区域；
Tth argonauteTth argonaute核酸内切酶；
DNA连接酶用于将开口环状DNA连接形成闭口环状DNA，例如为Taq DNA连接酶。
在一种实施方式中，该试剂盒还包括扩增引物。扩增引物可包括正向扩增引物和/或反向扩增引物。正向扩增引物与部分待测核酸反向互补，用于扩增待测核酸。反向扩增引物与部分待测核酸相同，用于扩增待测核酸。
在一种实施方式中，该试剂盒还包括检测分子信标。检测分子信标可为与目标核酸特异性结合的单链DNA，检测分子信标两端分别连接荧光基团和淬灭基团。
在一种实施方式中，该试剂盒还包括DNA聚合酶，例如Bst聚合酶。
二、工作原理
上述试剂盒的主要工作原理如图1和图2所示。
1、向导DNA的设计
一组向导DNA由两条5’端磷酸化，长度为16～18nt的ssDNA片段组成，分别命名为前端向导DNA与后端向导DNA。所述前端向导DNA与后端向导DNA与底物核酸特异性互补。所述前端向导DNA与底物核酸的互补位点在后端向导DNA与底物核酸的互补点之前，即前端向导DNA更靠近底物核酸的5’端。
2、5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物的制备
将前端向导DNA、后端向导DNA与Tth argonaute核酸内切酶，按照摩尔浓度5:5:2的比例混匀，并加入终浓度0.5mM的ATP，在70℃环境下孵育15～30min，完成5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物的制备。具体制备方式见下表1。
表1.5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物的制备
注：此处标注的20μL反应体积指的是总反应体积，表1中的组分按照该比例混合后，70℃环境下孵育15～30min，即得到5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物，该复合物用于后续的单链底物制备。
3、10×Tth argonaute BufferII的配制
具体的Tth argonaute Buffer由20mM Tris-Acetate、10mM NH4CH3CO2、50mM KCl、2mM Mg(C2H3O2)2和0.1％ Tween-20组成。
具体的Tth argonaute BufferII的pH≈8.4～8.8之间。
具体的Tth argonaute BufferII作为Tth argonaute核酸内切酶的稀释液、缓冲液和反应液。
具体的配制方法见下表2。
表2.10×Tth argonaute BufferII的配制方法
4、滚环扩增起始模板片段的制备原理及配制方法
将5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物和10×Tth argonaute BufferII按照下表3中的比例进行配置。在65℃～85摄氏度间激活内切反应。所述内切反应如图1所示，发生在前端向导DNA-Tth argonaute复合物的前端向导DNA，后端向导DNA-Tthargonaute复合物的后端向导DNA与底物核酸(dsDNA Nucleic acid substrate或者ssDNANucleic acid substrate)互补后，在前端/后端向导DNA的10～11nt位置发生内切。经过前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物切割后的产物包括待测核酸，即为滚环扩增的起始模板片段(Target Nucleic acid substrate)。所述起始模板片段长度可以为20nt～80nt。
表3.滚环扩增起始模板片段反应液的配制方法
4、模板连接引物的设计
模板连接引物(template ligation Primer)为单链DNA，作用于前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物切割后产生的，用于滚环复制的起始模板片段上。所述模板连接引物的长度由起始模板片段的长度决定，但长度最低不能小于12nt。所述模板连接引物的5’端至少有6nt序列与起始模板片段3’端反向互补，所述模板连接引物的3’端至少有6nt序列与起始模板片段5’端互补。
如图1所示，所述模板连接引物用于与所述起始模板片段结合形成开口环状DNA。
5、DNA环化和滚环扩增
DNA环化和滚环扩增如图2所示。
所述DNA环化，需要利用DNA连接酶(例如Taq DNA连接酶)将所述开口环状DNA连接形成闭口环状DNA。所述DNA的环化，必须保证起始模板片段和模板连接引物是完全互补的，且在开口环状DNA中起始模板片段的5’端与3’端相邻，中间不能有任何碱基的插入与缺失。具体配制方法见下表4所示。
环化所使用的连接酶可为低温连接酶，环化温度可为37℃～65℃；也可为耐高温连接酶。
表4.滚环扩增起始模板片段的环化反应液配制
滚环扩增以闭口环状DNA为扩增模板，在Bst聚合酶、dNTPs、Mgcl等离子的作用下，采用正向扩增引物(Amplification forward primer)完成滚环的线性扩增，或者采用正向扩增引物和反向扩增引物(Amplification reverse primer)，完成滚环的指数扩增。正向扩增引物与部分所述闭口环状DNA的待测核酸反向互补，用于扩增所述待测核酸；反向扩增引物与部分所述闭口环状DNA的待测核酸相同，用于扩增所述待测核酸。
具体配制方法见下表5所示。
表5.滚环扩增反应液配制
所述环化与滚环扩增可分别进行；也可同时进行，即边环化边滚环扩增，温度为65℃，时间为60min。
三、使用方法
1、待测核酸成环方法
采用上述试剂盒进行待测核酸成环方法如表6所示，具体包括如下步骤：
(1)将0.5μL浓度为10μM的前端向导DNA和0.5μL浓度为10μM的后端向导DNA混合获得预混物，再将预混物、2μL浓度为1μM Tth argonaute内切酶和1μL浓度为10mM的ATP混合，70℃孵育15～30min获得5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物。
(2)将步骤(1)获得的5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、5～10μL底物核酸、1μL浓度为10μM的模板连接引物、1μL浓度为40U/μL的Taq DNA Ligase、2μL的10×TaqDNA Ligase Reaction Buffer、2μL的10×Tth argonaute BufferII，无酶无核酸水补充至20μL，混合，65℃反应60min获得闭口环状DNA，即成环后的待测核酸。
表6待测核酸成环方法
2、待测核酸扩增方法
采用上述试剂盒进行待测核酸扩增方法如表7所示，具体包括如下步骤：
(1)将0.5μL浓度为10μM的前端向导DNA和0.5μL浓度为10μM的后端向导DNA混合获得预混物，再将预混物、2μL浓度为1μM Tth argonaute内切酶和1μL浓度为10mM的ATP混合，70℃孵育15～30min获得5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物。
(2)将步骤(1)获得的5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、10μL底物核酸、1μL浓度为10μM的模板连接引物、1μL浓度为40U/μL的Taq DNA Ligase、1μL的10×TaqDNA Ligase Reaction Buffer、1μL的10×Tth argonaute BufferII和2μL无酶无核酸水混合，65℃反应60min获得闭口环状DNA，即成环后的待测核酸。
(3)如表7所示，将步骤(2)获得的闭口环状DNA、5μL 10X IsothermalAmplification Buffer、0.3μL浓度为1M MgCl2、7μL浓度为10mM dNTP Mix、1.25μL浓度为10μM的正向扩增引物、1.25浓度为10μM的反向扩增引物、2μL浓度为8U/μl的Bst 2.0DNAPolymerase，无酶无核酸水补齐至50μl，混合，65℃反应60min获得扩增的待测核酸。
或者步骤(3)也可为将步骤(2)获得的闭口环状DNA、5μL 10X IsothermalAmplification Buffer、0.3μL浓度为1M MgCl2、7μL浓度为10mM dNTP Mix、1.25μL浓度为10μM的正向扩增引物、2μL浓度为8U/μl的Bst 2.0DNA Polymerase，无酶无核酸水补齐至50μl，混合，65℃反应60min获得扩增的待测核酸。
在另一实施方式中，采用上述试剂盒进行待测核酸扩增方法具体包括如下步骤：
(1)将0.5μL浓度为10μM的前端向导DNA和0.5μL浓度为10μM的后端向导DNA混合获得预混物，再将预混物、2μL浓度为1μM Tth argonaute内切酶和1μL浓度为10mM的ATP混合，70℃孵育15～30min获得5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物。
(2)将步骤(1)获得的5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、10μL底物核酸、1μL浓度为10μM的模板连接引物、1μL浓度为40U/μL的Taq DNA Ligase、1μL的10×TaqDNA Ligase Reaction Buffer、1μL的10×Tth argonaute BufferII、5μL 10XIsothermalAmplification Buffer、0.3μL浓度为1M MgCl2、7μL浓度为10mM dNTP Mix、1.25μL浓度为10μM的正向扩增引物、1.25μL浓度为10μM的反向扩增引物、2μL浓度为8U/μl的Bst 2.0DNAPolymerase,无酶无核酸水补齐至50μl，混合，65℃反应60min获得扩增的待测核酸。
或步骤(2)也可为将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、10μL底物核酸、1μL浓度为10μM的模板连接引物、1μL浓度为40U/μL的Taq DNA Ligase、1μL的10×Taq DNA Ligase Reaction Buffer、1μL的10×Tth argonaute BufferII、5μL 10XIsothermal Amplification Buffer、0.3μL浓度为1M MgCl2、7μL浓度为10mM dNTP Mix、1.25μL浓度为10μM的正向扩增引物、2μL浓度为8U/μl的Bst 2.0DNA Polymerase,无酶无核酸水补齐至50μl，混合，65℃反应60min获得扩增的待测核酸。
表7待测核酸扩增方法步骤(3)
3、待测核酸检测方法
采用上述试剂盒进行待测核酸检测方法具体包括如下步骤：
(1)将前端向导DNA和后端向导DNA混合获得预混物，再将预混物和Tth argonaute核酸内切酶混合获得前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物；
(2)将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、含有待测核酸的底物核酸、模板连接引物、DNA连接酶、DNA聚合酶、分子信标和扩增引物混合进行成环和PCR反应获得荧光信号；
(3)根据步骤(2)获得的荧光信号确定待测核酸是否为目标核酸。
实施例2、叶酸代谢SNP位点的靶标特异性识别切割与滚环扩增检测方法的建立
1、核酸样本准备：样本为人全血样本，采用核酸DNA提取试剂盒获得核酸样本。对该人全血样本核酸DNA进行实时荧光PCR扩增以及一代测序分析，确定了该样本中叶酸677号代谢SNP位点为野生型，具体如图3所示。
2、DNA向导链、模板连接引物与扩增引物的设计：针对目前已知的叶酸代谢677SNP位点，设计对应的两条gDNA序列作为“Tth argonaute”核酸内切酶的向导链，对靶标区域进行特异性识别与特异性切割。模板连接引物根据切割后产物的5’/3’端序列进行设计，保证模板连接引物的5’端与切割后产物的3’端完全匹配；模板连接引物的3’端与切割后产物的5’端完全匹配。
序列具体如下：
677位点前端DNA向导链(野生型)：5’磷酸化-CTGCGGGAGCCGATTT-3’(SEQ IDNo.1)；
677位点后端DNA向导链：5’磷酸化-AGCTTTGAGGCTGACCT-3’(SEQ ID No.2)；
模板连接引物(野生型)：5’-CTGACCTGAACGAGGGCGTC-3’(SEQ ID No.3)；
正向扩增引物：5’-CACCTTCTCCTTCAAGTGC-3’(SEQ ID No.4)；
检测分子信标：5’FAM-CCCGTGACGCCCTCGGACTGGACTTACGGG-3’BHQ1(SEQ IDNo.5)。
3、配制反应体系及反应
(1)按照表1配制5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物，配制好的复合物放置在70℃，孵育15min完成5×前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物。
(2)按照表8配制反应体系放入实时荧光PCR仪器中，设置荧光采集通道为FAM，设置反应温度为65℃，设置采集频率为60s/次，设置循环数为50cycles。并实时观察结果。
表8反应体系
检测结果如图4所示，荧光信号出现明显的S型曲线，且S型曲线出峰时间＜反应总时长×10％，说明采用本实施例方法检测的叶酸677号代谢SNP位点为野生型，与测序结果一致。
实施例3、本发明对叶酸677号代谢SNP位点检测的特异性考察
采集3份不同人源的全血样本，使用核酸基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取。并用实时荧光PCR仪对样本进行PCR扩增与一代测序分析，对三个样本的叶酸代谢677号SNP位点进行鉴定，具体见图5所示，从左到右分别为677位点突变；677位点杂合；677位点杂合。
使用实施例2相同的方法对一代测序结果为突变型的样本进行检测。
检测结果如图6所示，荧光信号没有出现S型曲线，说明采用本实施例方法检测的叶酸677号代谢SNP位点为突变型，与测序结果一致。
本发明所提供的方法对样本的检测具备极高的准确度，其最显著优点，在于优秀的特异性。例如本发明实施例对叶酸代谢677号SNP位点的检测，共设计了三重识别序列，第一重识别序列为前端向导DNA，本发明实施例前端向导DNA的第10号碱基用以结合677号SNP位点，若该位点不匹配，则无法激活内切活性，即无法开展后续的环化。第二重识别序列为模板连接引物，因使用的Taq DNA连接酶的特性，若模板连接引物无法完全与切割后的靶标互补，则无法激活Taq DNA连接酶的活性，从而无法完成环化。第三重识别序列为分子信标，分子信标在本发明实施例中作为特异性判断是否有扩增产物的检测手段，其设计位点位于叶酸代谢677号SNP位点上，又因为该位点被设计在成环序列的5’端第一个碱基，所以当核酸底物无法成环时，分子信标将无法结合产生荧光。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (9)
1.用于待测核酸环化或扩增或检测的试剂盒，其特征在于：包括前端向导DNA、后端向导DNA、模板连接引物、Tth argonaute核酸内切酶和DNA连接酶，
所述前端向导DNA和所述后端向导DNA为单链DNA且5’端磷酸化，所述前端向导DNA特异性结合所述待测核酸5’端相邻片段和所述待测核酸5’端片段，所述后端向导DNA特异性结合所述待测核酸3’端相邻片段和所述待测核酸3’端片段，所述前端向导DNA和后端向导DNA用于指导Tth argonaute核酸内切酶将包含待测核酸的核酸分子切割为含有待测核酸的单链核酸；
所述模板连接引物为单链DNA，其从5’端-3’端依次包括：与含有待测核酸的单链核酸的3’端至少6nt区域反向互补的区域和与含有待测核酸的单链核酸的5’端至少6nt区域互补的区域；
所述DNA连接酶用于将开口环状DNA连接形成闭口环状DNA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述模板连接引物的长度≥12nt。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：包括正向扩增引物，所述正向扩增引物与部分所述待测核酸反向互补，用于扩增所述待测核酸。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：包括反向扩增引物，所述反向扩增引物与部分所述待测核酸相同，用于扩增所述待测核酸。
5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：包括检测分子信标，所述检测分子信标为与目标核酸特异性结合的单链DNA，所述检测分子信标两端分别连接荧光基团和淬灭基团。
6.权利要求1-5任一所述试剂盒在如下任一种的应用：
(1)待测核酸成环；
(2)待测核酸扩增；
(3)待测核酸滚环扩增；
(4)待测核酸检测；
(5)待测核酸测序；
(6)制备用于待测核酸成环的产品；
(7)制备用于待测核酸扩增的产品；
(8)制备用于待测核酸滚环扩增的产品；
(9)制备用于待测核酸检测的产品；
(10)制备用于待测核酸测序的产品。
7.待测核酸的环化方法，其特征在于：包括
(1)将权利要求1中所述前端向导DNA和所述后端向导DNA混合获得预混物，再将所述预混物和Tth argonaute核酸内切酶混合获得前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物；
(2)将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、含有待测核酸的底物核酸、权利要求1中所述模板连接引物和权利要求1中所述DNA连接酶混合获得闭口环状DNA，即成环后的待测核酸。
8.待测核酸的扩增方法，其特征在于：为M1或M2，
M1包括如下步骤：
(1)将权利要求1中所述前端向导DNA和所述后端向导DNA混合获得预混物，再将所述预混物和Tth argonaute核酸内切酶混合获得前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物；
(2)将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、含有待测核酸的底物核酸、权利要求1中所述模板连接引物和权利要求1中所述DNA连接酶混合获得闭口环状DNA；
(3)将步骤(2)获得的闭口环状DNA、DNA聚合酶和扩增引物混合进行PCR反应获得扩增的待测核酸；
M2包括如下步骤：
(1)将权利要求1中所述前端向导DNA和所述后端向导DNA混合获得预混物，再将所述预混物和Tth argonaute核酸内切酶混合获得前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物；
(2)将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、含有待测核酸的底物核酸、权利要求1中所述模板连接引物、权利要求1中所述DNA连接酶、DNA聚合酶和扩增引物混合进行成环和PCR反应获得扩增的待测核酸。
9.待测核酸的检测方法，其特征在于：包括
(1)将权利要求1中所述前端向导DNA和所述后端向导DNA混合获得预混物，再将所述预混物和Tth argonaute核酸内切酶混合获得前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物；
(2)将步骤(1)获得的前端/后端向导DNA-Tth argonaute复合物、含有待测核酸的底物核酸、权利要求1中所述模板连接引物、权利要求1中所述DNA连接酶、DNA聚合酶、权利要求5中所述分子信标和扩增引物混合进行成环和PCR反应获得荧光信号；
(3)根据步骤(2)获得的荧光信号确定待测核酸中是否存在目标核酸。
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