CN118147354A - 一种引物与探针组合及其方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种引物与探针组合及其方法和应用。本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种RAA‑LFD检测转基因玉米事件DBN9936的引物与探针组合及其方法和应用。本发明根据外源插入DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RAA引物，从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米中DBN9936成分的引物及探针组合。以转基因玉米DBN9936基因组DNA为模板，利用该对引物和探针进行RAA扩增及免疫层析检测，具有操作简便、速度快、特异性好、灵敏度高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种RAA-LFD检测转基因玉米事件DBN9936的引物与探针组合及其方法和应用。
背景技术
核酸等温扩增(isothermal amplification)技术自上世纪90年代出现以来，基于其核酸体外扩增的迅速和高效，操作简便，可结合多种终点检测形式，且不需要复杂精密仪器等优点，受到研究人员的广泛喜爱，实地应用前景广阔。其中，重组酶介导等温核酸扩增技术(RecombinaseAidedAmplification,RAA)作为一种新型的核酸扩增技术，在重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等协同作用下实现模板DNA的扩增，整个反应在37℃～42℃的恒温度条件下，20min左右即可获得检测结果。RAA扩增依据是否引物探针或探针修饰的不同，其结果可利用凝胶电泳、荧光素修饰或侧向流免疫层析法检测，其中，侧向流试纸条法(LFD)不需要特定仪器，利用抗原、抗体等特异性交联结合，依靠胶体金纳米颗粒等聚集显色的形式进行检测，具有特异性强、高效便捷、直观等优点。目前尚无利用RAA-LFD技术对转基因玉米DBN9936进行品系特异性的鉴定方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种RAA-LFD检测转基因玉米事件DBN9936的引物与探针组合，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步，所述探针序列的修饰如下：探针的5’端标记荧光素FAM基团，探针的第31位鸟嘌呤(G)替换为dSpacer，探针的3’端添加C3-Spacer。
本发明还提供了一种检测转基因玉米DBN9936事件的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针组合。
本发明还提供了一种RAA-LFD检测转基因玉米事件DBN9936的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测样品的基因组DNA为模板，利用本发明的引物和探针组合进行RAA扩增，采用侧流层析试纸对RAA扩增产物进行检测。
进一步，所述RAA扩增体系为50μL，其中，再水化缓冲液29.5μL，280μM醋酸镁溶液2.5μl，正向引物和反向引物均不低于5pmol，探针不低于2pmol，DNA模板2μL，余量为ddH2O。
进一步，正向引物和反向引物的终浓度为0.1～0.5μM，探针的终浓度为0.04～0.2μM。
优选地，正向引物和反向引物的终浓度均为0.3μM，探针的终浓度为0.08μM。
进一步，所述RAA扩增程序为水浴37～42℃反应5～30min。
优选地，所述RAA扩增程序为水浴38℃反应15min。
本发明还提供了所述引物与探针组合在检测转基因玉米事件DBN9936中的应用。
本发明还提供了所述检测试剂盒在检测转基因玉米事件DBN9936中的应用。
本发明相对于现有技术的有益效果在于：
本发明根据转化载体T-DNA与玉米基因组的连接区域序列设计并筛选出一套利用RAA-LFD可快速有效检测出转基因玉米DBN9936成分的引物和探针组合，首次提供了转基因玉米DBN9936品系特异性的RAA-LFD检测方法。以转基因玉米DBN9936基因组DNA为模板，利用本方法中的引物和探针进行RAA-LFD试纸条检测，可以获得明显的检测条带。将阳性基因质粒标准品稀释至5.8×106～5.8×101Copies/μL，均有阳性指示带。本发明的RAA检测引物与探针组合特异性强，试剂盒以侧流层析试纸卡为终点检测，无需昂贵仪器，经济适用，具有操作简便、适应环境广、速度快、特异性高、灵敏度好等特点。
附图说明
图1为DBN9936引物和探针筛选侧向流试纸条检测结果，模板均为ddH2O，其中，图A中1-5分别为，1：DBN36-F1/R1，2：DBN36-F1/R2，3：DBN36-F1/R3，4：DBN36-F1/R4，DBN36-F1/R5；图B中1-5分别为，1：DBN36-F2/R1，2：DBN36-F2/R2，3：DBN36-F2/R3，4：DBN36-F2/R4，5：DBN36-F2/R5；图C中1-5分别为，1：DBN36-F3/R1，2：DBN36-F3/R2，3：DBN36-F3/R3，4：DBN36-F3/R4，5：DBN36-F3/R5；图D中1-5分别为，1：DBN36-F4/R1，2：DBN36-F4/R2，3：DBN36-F4/R3，4：DBN36-F4/R4，5：DBN36-F4/R5；图E中1-5分别为，1：DBN36-F5/R1，2：DBN36-F5/R2，3：DBN36-F5/R3，4：DBN36-F5/R4，5：DBN36-F5/R5。
图2为DBN9936引物和探针设计筛选结果，模板均为转基因玉米DBN9936基因组DNA，其中，图A为侧向流试纸条检测结果，图A中1-6分别为，1：DBN36-F1/R1，2：DBN36-F3/R2，3：DBN36-F4/R1，4：DBN36-F4/R2，5：DBN36-F5/R1，6：DBN36-F5/R2；图B为RAA产物纯化后琼脂糖凝胶电泳图，图B中M为700bp DNA Marker；图B中1-6分别为，1：DBN36-F1/R1，2：DBN36-F3/R2，3：DBN36-F4/R1，4：DBN36-F4/R2，5：DBN36-F5/R1，6：DBN36-F5/R2。
图3为引物DBN36-F4/R2的RAA最佳反应浓度实验结果，其中，1-5中DBN36-F4/R2的反应浓度分别为：0.1μM，0.2μM，0.3μM，0.4μM，0.5μM。
图4为探针DBN36-P的RAA最佳反应浓度实验结果，其中，1-5中DBN36-P的反应浓度分别为：0.04μM，0.08μM，0.12μM，0.16μM，0.20μM。
图5为转基因玉米DBN9936 RAA检测最佳反应温度实验结果，其中，1-6中转基因玉米DBN9936 RAA检测反应温度分别为：1：37℃，2：38℃，3：39℃，4：40℃，5：41℃，6：42℃。
图6为转基因玉米DBN9936 RAA检测最佳反应时间实验结果，其中，1-6中转基因玉米DBN9936 RAA检测反应时间分别为：1：5min，2：10min，3：15min，4：20min，5：25min，6：30min。
图7为转基因玉米DBN9936 RAA检测特异性分析结果，其中1-10分别为，1：转基因玉米DBN9936，2：转基因玉米DBN9858，3：转基因玉米DBN9501，4：GA21，5：MON810，6：CC-2，7：ND207，8：瑞丰125，9：瑞丰8，10：空白对照。
图8为转基因玉米DBN9936 RAA检测特异性分析结果，其中，1：转基因玉米DBN9936，2：转基因大豆，3：转基因棉花，4：转基因油菜，5：空白对照。
图9为转基因玉米DBN9936 RAA检测灵敏度分析结果，模板均为pUC57-DBN36合成质粒，其中，图A为侧向流试纸条敏感性检测结果；图A中样品1-8的模板拷贝数依次为5.8x106，5.8x105，5.8x 104，5.8x 103，5.8x 102，5.8x 101，5.8x 100，0；图B为RAA产物纯化后琼脂糖凝胶电泳敏感性检测结果，其中，图B中M为700bp DNAMarker；样品1-7的模板拷贝数分别为5.8x106，5.8x105，5.8x104，5.8x103，5.8x102，5.8x101，5.8x100。
具体实施方式
下面将结合具体实施例及说明书附图，对本发明做进一步详细阐述。所述实施例仅起说明目的，并不对本发明的范围进行限制。
以下实施例中实验方法未具体注明的，一般按照常规实验条件或试剂厂商建议的条件进行。除特殊说明外，所有试剂、材料均为商业途径获得。
实施例1
1、基因组DNA模板的制备及RAA扩增引物、探针组合的设计与筛选
1.1样品模板的制备：取供试植物干重组织约30mg，参照植物基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNAKit，#DP305-03，TIANGEN)的操作步骤提取总DNA，并于-20℃保存，备用。
1.2转基因玉米DBN9936对照基因重组质粒的合成：根据外源插入DNA序列与玉米基因组的连接区域，确定模板DNA序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆至pUC57载体，命名为pUC57-DBN36，将pUC57-DBN36质粒转化至感受态DH5a，过夜培养后提取质粒并测定浓度。
根据下列公式：拷贝数(copies/μL)＝6.02x1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(660x质粒碱基数)
1.3引物、探针组合的设计与筛选：根据转基因玉米DBN9936转化体序列与玉米基因组的连接区域序列，利用Oligo7设计引物及探针。设计过程中应避免引物之间、引物与探针之间形成二级结构等问题，上游引物的5’端标记生物素Biotin基团；在探针设计中5’端标记荧光素FAM基团，第31位的鸟嘌呤(G)替换为dSpacer，3’端添加C3Spacer。引物和探针均由上海生工合成。本实验设计了RAA探针(DBN36-P)并在探针上游设计了5条正向引物(DBN36-F1至DBN36-F5)，探针下游设计了5条反向引物(DBN36-R1至DBN36-R5)，序列见表1。筛选过程中，首先使用RAA-nfo试剂盒进行空白对照检测，筛选出无非特异反应的引物对，具体检测结果如图1所示，其中有6个引物对特异性较好。进一步，利用筛选出的引物对以转基因玉米DBN9936基因组DNA为模板进行RAA扩增，结果分别通过侧流层析试纸和琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图2-A、B所示，其中引物对DBN36-F4/R2检测条带明亮，扩增效果较好。
本申请筛选得到一对RAA引物DBN36-F4/R2用于转基因玉米DBN9936的品系特异性检测，引物和探针序列见表1。
表1
注：Biotin：生物素；FAM：发光基团；THF：脱碱基位点；C3 Spacer：封闭基团。
实施例2
1、RAA扩增反应体系和程序优化及检测特异性、敏感性分析
1.1RAA扩增反应体系和程序优化：以转基因玉米DBN9936总DNA为模板，利用本发明设计的转基因玉米DBN9936品系特异引物DBN36-F4/DBN36-R2进行RAA扩增。RAA扩增体系为50μL，其中，再水化缓冲液29.5μL，280μM醋酸镁溶液2.5μl，终浓度为0.1～0.5μM的DBN36-F4/DBN36-R2，终浓度为0.04～0.2μM的DBN36-P，样品基因组DNA 2μL，余量ddH2O，充分混匀后将反应管放在恒温水浴锅中进行扩增。反应温度为37℃～42℃，扩增时间为5min～30min。反应结束后，将RAA产物用稀释液进行20倍稀释，吸取50μL稀释后样本滴加至试纸条加样孔，待质控条带正常显色后，5min内观察指示条带显色情况。
1.2RAA特异性检测：分别以转基因玉米DBN9936、DBN9858、DBN9501、瑞丰125、瑞丰8、ND207、GA21、CC-2、MON810等基因组DNA为模板，转基因大豆、转基因棉花、转基因油菜等基因组DNA为模板，以ddH2O为空白对照，进行RAA-LFD检测，完成特异性测定实验。
1.3RAA敏感性检测：将重组质粒pUC57-DBN36进行10倍倍比稀释，稀释后的质粒浓度在5.8×106～5.8×100Copies/μL之间，并将其作为模板DNA进行RAA扩增，以确定本方法的最低检测浓度，即转基因玉米DBN9936RAA-LFD方法的敏感度。
2、实验结果与分析
2.1RAA扩增反应体系和程序优化：
2.1.1RAA扩增反应体系优化结果：以转基因玉米DBN9936基因组DNA为模板，利用本发明设计的引物DBN36-F4/DBN36-R2和探针DBN36-P进行RAA扩增。根据侧流层析试纸条结果可见(图3、图4)：总50μLRPA扩增体系中，引物DBN36-F4/DBN36-R2使用终浓度分别为0.1～0.5μM，引物浓度为0.1μM时指示条带即可显色，引物浓度为0.3μM时指示条带显著增亮，且随浓度增加亮度无明显变化，综合试纸条检测结果，确定0.3μM为最佳引物工作浓度；反应中探针DBN36-P工作浓度分别为0.04～0.2μM，探针浓度为0.08μM时指示条带显著增亮，且随浓度增加亮度无明显变化，综合试纸条检测结果，确定0.08μM为最佳探针工作浓度。
2.1.2RAA扩增反应程序优化结果：利用2.1.1中优选的扩增体系，进行最佳反应温度、时间优化，根据侧向流试纸检测结果可见(图5、图6)：反应时间20min，分别在37℃～42℃水浴，温度为37℃时指示条带即可显色，温度为38℃时指示条带显著增亮，且随温度增加亮度无明显变化，综合试纸条结果，确定38℃为最佳反应温度；优选上述反应温度，分别水浴5min～30min，水浴5min时指示条带即可显色，而15min时指示条带最亮，且随时间延长亮度无明显变化，综合检测结果，确定15min为最佳反应时间。
2.2RAA-LFD特异性检测结果：特异性检测结果如图7-8所示，以转基因玉米DBN9936基因组DNA为模板扩增，侧向流试纸条指示条带显色明显；以其他转基因玉米：如DBN9858、瑞丰125、瑞丰8、ND207、GA21、CC-2等，转基因大豆、转基因棉花、转基因油菜等基因组DNA为模板扩增，侧向流试纸条指示带均未显色，说明该方法特异性良好。
2.3RAA-LFD敏感性检测结果：敏感性检测结果如图9A-B所示，使用5.8x106～5.8x100Copies/μL系列浓度的pUC57-DBN36重组质粒进行RAA敏感性实验。图9A实验结果显示RAA-LFD检测方法敏感性良好，检测限为5.8x101Copies/μL，比琼脂糖凝胶电泳分析敏感性高约100左右倍(图9B)。
综上所述，基于转基因玉米DBN9936转化体序列与玉米基因组的连接区域序列设计合成的特异性引物、探针：DBN36-F4/DBN36-R2和DBN36-P，可用于转基因玉米DBN9936的快速检测。
Claims (10)
1.一种RAA-LFD检测转基因玉米事件DBN9936的引物与探针组合，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的引物与探针组合，其特征在于，所述探针序列的修饰如下：探针的5’端标记荧光素FAM基团，探针的第31位鸟嘌呤(G)替换为dSpacer，探针的3’端添加C3-Spacer。
3.一种检测转基因玉米DBN9936事件的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针组合。
4.一种RAA-LFD检测转基因玉米事件DBN9936的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1的引物和探针组合进行RAA扩增，采用侧流层析试纸对RAA扩增产物进行检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RAA扩增体系为50μL，其中，再水化缓冲液29.5μL，280μM醋酸镁溶液2.5μl，正向引物和反向引物均不低于5pmol，探针不低于2pmol，DNA模板2μL，余量为ddH2O。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，正向引物和反向引物的终浓度为0.1～0.5μM，探针的终浓度为0.04～0.2μM。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，正向引物和反向引物的终浓度均为0.3μM，探针的终浓度为0.08μM。
8.根据权利要求4～7任一项所述的方法，其特征在于，所述RAA扩增程序为水浴37～42℃反应5～30min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述RAA扩增程序为水浴38℃反应15min。
10.权利要求1或2所述的引物与探针组合，或者权利要求3所述的检测试剂盒在检测转基因玉米事件DBN9936中的应用。
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