CN117007796A - 红细胞脱核的分子标记物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及红细胞脱核的分子标记物及其用途。具体而言，本申请提供了一种鉴定或分选正在脱核的红细胞的方法，通过对CD44、CD235a或Ter119、CD45等标记物的检测，而特异性地识别正在脱核的红细胞。

Description

红细胞脱核的分子标记物及其用途
技术领域
本申请涉及医学、生物学、临床诊断领域。具体而言，涉及红细胞脱核的分子标记物及其用途。
背景技术
红细胞是体内运输氧的主要载体，对于维持生命至关重要。在失血性贫血、地中海贫血及造血功能障碍等疾病的治疗中，输注红细胞是挽救患者生命的主要手段，但目前存在供不应求、无法完全清除血源性病毒等问题。因此，开发新的血源是贫血临床治疗的迫切需求。
通过体外培养体系诱导红系分化并脱核产生成熟红细胞，可以提供持续且安全的血源。在体外造血体系中，常利用来自脐带血、成体骨髓及外周血的造血干/祖细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、永生化的成人红系祖细胞进行体外诱导红系分化。但是，造血干祖细胞来源受限，而在胚胎干细胞、诱导多能干细胞、永生化的成人红系祖细胞体外培养体系中，红细胞脱核效率低下是阻碍体外高效造血的主要原因之一。
造血始于造血干细胞，其中红系造血发育在完成定向和祖细胞阶段的大量扩增之后增殖速率显著下降，进入终末分化阶段，大量积累红系特异表达产物，为产生形态和功能上成熟的红细胞做最后的准备。红系终末分化过程伴随3-5次细胞分裂，经历：原红细胞(Proerythroblast，以下简称ProE)、早幼红细胞(Basophilic erythroblast，BasoE)、中幼红细胞(Polychromatic erythroblast，PolyE)、晚幼红细胞(Orthochromaticerythroblast，OrthoE)四个有核细胞阶段(Doty RT et al.Single-cell analysesdemonstrate that a heme-GATA1 feedback loop regulates red celldifferentiation.Blood.2019,133(5):457-469)。在这个过程中，细胞逐渐变小、血红蛋白积累、细胞核发生固缩，最终脱核形成网织红细胞和仅由薄层胞质包被的细胞核(pyrenocyte)(McGrath,Kathleen E et al.Enucleation of primitive erythroidcells generates a transient population of"pyrenocytes"in the mammalianfetus.Blood.2008,111(4):2409-17；Sankaran,Vijay G et al.Cyclin D3 coordinatesthe cell cycle during differentiation to regulate erythrocyte size andnumber.Genes&development.2012,26(18)：2075-87)。脱出的红细胞核(pyrenocyte)以膜磷脂酰丝氨酸依赖性方式被血岛中央巨噬细胞或骨髓中的其他巨噬细胞吞噬(Chasis,Joel Anne,and Narla Mohandas.Erythroblastic islands:niches forerythropoiesis.Blood.2008.112(3)：470-8)。而网织红细胞进一步降解残余的RNA和细胞器，生成成熟的红细胞并释放到血液循环行使运输氧的功能(Pasini,Erica M et al.In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red bloodcells.Blood.2006，108(3)：791-801)。成熟的红细胞在人体内可以生存120天，而在小鼠体内生存55天。
红细胞脱核是体外红系分化产生成熟红细胞的关键环节，涉及复杂的动态细胞形变。利用细胞免疫荧光及流式成像技术有助于揭示脱核过程中的细胞形变及分子机制。已有研究发现脱核前的成红细胞需经历染色质浓缩和核固缩，细胞周期退出，进而发生核极化，随后将核从细胞浆中排出，与新生网织红分离后的核则被巨噬细胞吞噬。如此剧烈的细胞变化涉及多种生物学过程的参与，如膜蛋白分选、细胞骨架重塑、囊泡运输、液泡融合、细胞器清除等。多种细胞骨架蛋白在这个过程起到重要作用，如微管帮助建立细胞极性；肌动蛋白actin和肌球蛋白myosin相互作用，在细胞核与新生网织红细胞之间形成CAR收缩环。影响骨架蛋白重塑将显著阻碍脱核进程，并使生成的网织红发生形态及功能异常。脂筏聚集辅助分离细胞核，并形成新的细胞膜(Konstantinidis,Diamantis G et al.“Signalingand cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation.”Blood vol.119,25(2012):6118-27)。
此外，红细胞脱核过程伴随膜蛋白的分选，对人成红细胞进行体外培养的研究提示，对红细胞形状和可变形性很重要的细胞骨架蛋白、血影蛋白和血型糖蛋白被分选到网织红细胞膜，而与细胞粘附相关的蛋白质(如Emp1和β1整合素)被分选到脱出的细胞核(pyrenocyte)(Bell,Amanda J et al.“Protein distribution during humanerythroblast enucleation in vitro.”PloS one vol.8,4(2013):e60300)。在小鼠骨髓体外红系分化的研究中，75％的EMP和70％的α4β1和α5β1整合素的β1亚基分配到细胞核周围的质膜。这个过程将导致巨噬细胞在该位点的有效结合，从而促进吞噬作用(Lee,James C-M et al.“Mechanism of protein sorting during erythroblast enucleation:role ofcytoskeletal connectivity”Blood vol.103,5(2004):1912-9)。
上述红细胞脱核调控机制的研究往往建立在形态学检测的基础上。鉴于此，本领域仍需要有效的表面标记物识别并富集正在脱核中的红细胞。
发明内容
针对本领域的前述需求，提供了靶向CD45(尤其是人CD45)的试剂在制备检测装置中的用途，其中所述检测装置是试剂盒或芯片的形式，所述检测装置用于确定分离自体内或来自体外培养物的红系细胞的脱核状态，所述脱核状态选自以下的任一项：脱核准备/未脱核、正在脱核、已脱核，靶向CD45的试剂能够确定CD45是否存在或确定CD45水平，并选自以下的任一项：抗CD45抗体或其抗原结合片段、靶向CD45的引物、靶向CD45的探针。在一些实施方案中，正在脱核选自以下的任一项：脱核早期、脱核晚期。
在一些实施方案中，当红系细胞呈现CD45阳性时，判定所述红系细胞处于正在脱核的状态、或判定所述红系细胞处于正在脱核状态的比例统计学上显著提高。
在另一些实施方案中，当红系细胞呈现CD45阴性时，判定所述红系细胞处于脱核准备、或者处于正在脱核状态的比例统计学上显著降低。
在一些实施方案中，所述检测装置还包含靶向CD235a(也作Ter119)的试剂；所述靶向CD235a的试剂是指确定CD235a是否存在或确定CD235a水平的试剂。所述靶向CD235a的试剂选自以下的任一项：抗CD235a抗体或其抗原结合片段、靶向CD235a的引物、靶向CD235a的探针。
在一些实施方案中，当红系细胞呈现CD235a和CD45阳性时，判定所述红系细胞处于正在脱核的状态、或判定所述红系细胞处于正在脱核状态的比例统计学上显著提高。
在一些实施方案中，当CD235a和CD45共定位于红系细胞的表面时，判定所述红系细胞处于正在脱核的状态、或判定所述红系细胞处于正在脱核状态的比例统计学上显著提高。
在一些实施方案中，所述检测装置还包含靶向CD44的试剂；所述靶向CD44的试剂是指确定CD44是否存在或确定CD44水平的试剂；所述靶向CD44的试剂选自以下的任一项：抗CD44抗体或其抗原结合片段、靶向CD44的引物、靶向CD44的探针。
在一些实施方案中，当CD44和CD45共定位于脱出的细胞核表面时，判定所述红系细胞已脱核、或判定所述红系细胞的脱核率统计学上显著提高。
在一些实施方案中，所述检测装置还包含靶向以下任一项的试剂或其组合：血红蛋白、ApoE、Vcam1、C1qa、C1qb、C1qc、Ly6D、Ighm、Igkc、Cd79a、CD79b、Ebf1、Pax5、Lef1、Elane、S100A8/A9、Prtn3、Cebpb、Lyz2、S100a4、Lgals3。
在一些实施方案中，当红系细胞在RNA水平上高表达血红蛋白、ApoE、Vcam1、C1qa、C1qb、C1qc，且红系细胞在蛋白水平上呈现CD44和CD45阳性时，判定所述红系细胞处于脱核晚期的状态、或判定所述红系细胞处于脱核晚期的状态的比例统计学上显著提高。
在一些实施方案中，当红系细胞在RNA水平上高表达Ly6D、Ighm、Igkc、Cd79a、CD79b、Ebf1、Pax5、Lef1、Elane、S100A8/A9、Prtn3、Cebpb、Lyz2、S100a4、Lgals3中的一种或多种，且在蛋白水平上呈现CD44、CD235a阳性和CD45阴性时，判定所述红系细胞脱核潜能显著提高。
在一些实施方案中，确定是在RNA水平或蛋白水平的确定。
在一些实施方案中，抗体源自以下的任一项：鼠、兔、人、骆驼、犬、羊、马、重组表达的抗体。
在一些具体的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在一些具体的实施方案中，所述抗原结合片段选自以下的任一项：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、单链抗体、结构域抗体、多特异性抗体。
本申请还提供了一种在体外富集正在脱核的红系细胞的方法，包括步骤：
1)在体外提供红系细胞，所述红系细胞分离自体内或来自体外培养物；
2)使所述红系细胞接触根据本申请的靶向CD45的试剂，
3)分选CD45阳性的红系细胞，优选通过流式细胞术分选。
在一些实施方案中，所述CD45是指人CD45。
在一些实施方案中，所述方法不用于疾病的诊断或治疗。
本申请还提供了一种在体外富集正在脱核的红系细胞的方法，包括步骤：
1)在体外提供红系细胞，
2.1)使所述红系细胞接触根据本申请的靶向CD45的试剂，
2.2)任选地，使所述红系细胞接触根据本申请的靶向CD44的试剂，
2.3)任选地，使所述红系细胞接触根据本申请的靶向CD235a的试剂，
3)分选CD45阳性(任选CD44阳性、任选CD235a阳性)的红系细胞；
步骤2.1)、2.2)、2.3)可以按照任意顺序先后或同时进行。
本申请还提供了一种用于确定红系细胞的脱核状态的装置(试剂盒或芯片)，所述脱核状态选自以下的任一项：脱核准备/未脱核、正在脱核、已脱核。
在一些实施方案中，所述装置包含选自以下的任一项(在蛋白或RNA水平)：根据本申请的靶向CD45的试剂、根据本申请的靶向CD44的试剂、根据本申请的靶向CD235a的试剂。
在一些实施方案中，所述装置还包含靶向以下任一项的试剂或其组合(在蛋白或RNA水平)：血红蛋白、ApoE、Vcam1、C1qa、C1qb、C1qc、免疫特征RNA标记物(如Ly6D、Ighm、Igkc、Cd79a、CD79b、Ebf1、Pax5、Lef1、Elane、S100A8/A9、Prtn3、Cebpb、Lyz2、S100a4、Lgals3)。
附图说明
图1A：通过流式成像圈出正在脱核的红细胞，并展示其富集CD44高表达细胞和相应的细胞荧光照片。
图1B：正在脱核的红细胞高表达CD44的统计图。
图1C：通过流式分析CD44hiTer119+细胞群(定义为Nonpro)正在脱核的比例并统计。
图1D：流式分选Nonpro细胞群，涂片进行吉姆萨、联苯胺染色。
图1E：Nonpro富集晚期脱核红细胞。
图1F：代表性细胞照片显示CD44蛋白在红细胞脱核过程中的分布情况。
图1G：流式成像显示肌动蛋白与CD44在红细胞脱核过程中的位置关系。
图1H：免疫荧光3D成像展示CD44和Ter119在脱核过程中的动态分布。
图2A：UMAP分析CD45-Nonpro异质性。
图2B：Dotplot图展示红系细胞、细胞骨架、转录因子及免疫反应相关特征基因表达情况。
图3A韦恩图展示免疫细胞与免疫红细胞功能富集GO条目。
图3B：聚类热图展示免疫红细胞特异性富集的生物学功能。
图4A：流式成像分析小鼠骨髓有核红细胞和正在脱核红细胞中CD44与CD45蛋白水平上的共表达情况，并统计CD45+％。
图4B：流式成像分析CD45+有核红细胞与CD45-有核红细胞中的正在脱核比例。
图4C：细胞荧光照片显示正在脱核红细胞中的信号的分布情况。
图4D至图4E：统计CD45+和CD45-正在脱核红细胞中的脱核早晚期的占比，核染色强弱亚群的占比。
图4F：部分无核红细胞中也存在CD45弱阳性细胞。
图4G至图4H：CD45+Ter119+％与正在脱核红细胞比例呈正相关，与红细胞脱核率呈负相关。
图4I：免疫荧光3D重建显示CD45+正在脱核红细胞。
图5A：流式分选小鼠全骨髓中的Nonpro和晚幼红OrthoE进行单细胞测序。
图5B：UMAP展示小鼠全骨髓Nonpro、CD45-Nonpro和Ortho的混合样本的细胞异质性(EB：Erythroblast)。右上角展示单个样本的UMAP，右下角UMAP展示合并样本的RNA含量。
图5C：UMAP展示红系特征基因、免疫细胞特征基因和Ery/ApoE+亚群的特征基因表达情况。
图5D：Ery/ApoE+特异在全骨髓Nonpro中富集。
图6A：流式成像分析并展示CD45-Nonpro中的正在脱核细胞。
图6B至图6D：免疫荧光照片统计体外过夜培养后红细胞脱核率和正在脱核比例。
图6E：CD45-Nonpro过夜培养后的流式成像分析，展示CD45+红细胞中脱核准备(未脱核)、正在脱核及已脱核的细胞形态及CD45蛋白和Ter119蛋白分布。
图6F：CD45-Nonpro和Ortho过夜培养后的红细胞中处于未进入脱核阶段、正在脱核阶段和已完成脱核的细胞亚群分布。
图6G：CD45-Nonpro和Ortho过夜培养后各亚群的CD45+％。
图7A：流式成像分析人骨髓红细胞中的CD45+比例及其中正在脱核比例的圈门策略。
图7B：细胞荧光照片显示CD45+和CD45-正在脱核红细胞的形态。
图7C：统计人骨髓有核红细胞和无核红细胞中CD45+和CD45-有核红细胞中的正在脱核比例。
图7D和图7E：直方图显示CD45+和CD45-正在脱核红细胞中早晚期的比例。
具体实施方式
术语
在本申请上下文中，“红细胞”(也作红系细胞)应作最广泛的解读，包括向成熟红细胞发育过程中各阶段的细胞；例如但不限于红系祖细胞、原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞、和成熟红细胞。
当“红细胞”特指某个阶段的细胞时，技术人员能够通过上下文而显而易见地确定。
在本申请上下文中，“成红细胞”是指有核的红系细胞，包括以下：原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞；成红细胞的群体中包含正在脱核的红系细胞。
在本申请上下文中，“免疫红细胞”是指同时表达免疫标记物(如CD45蛋白或免疫细胞特征RNA)和红系标记物(如鼠Ter119，对应的是人CD235a)的细胞。
免疫红细胞分为：1)免疫细胞特征RNA阳性的红系细胞，2)CD45蛋白阳性的红系细胞两类。作为免疫细胞特征RNA的示例，可以提及Ly6D、Ighm、Igkc、Cd79a、CD79b、Ebf1、Pax5、Lef1、Elane、S100A8/A9、Prtn3、Cebpb、Lyz2、S100a4、Lgals3。脱核过程RNA的表达非常多样且变化迅速。因此在鉴别免疫细胞特征RNA阳性的红系细胞时，未采用单一RNA标记物，而是评价RNA转录组的概貌(profile)，例如采用本领域公知的方法或实施例2中所用方法。
在本申请上下文中，“脱核”是指成红系细胞脱去细胞核而产生成熟红细胞的过程。
在本申请上下文中，“免疫性脱核”是指：成红细胞在脱去细胞核产生成熟红细胞的过程中，表达免疫标记物CD45蛋白、或髓系/淋系特征性RNA。
在本申请上下文中，脱核早期：红系细胞开始脱去细胞核的过程，通常显现出以下特征：流式成像中有Ter119(即CD235a)信号、核信号的中心间距(Delta Centroid)大于1且小于4。
在本申请上下文中，脱核晚期通常显现出以下特征：流式成像中有Ter119(即CD235a)信号、核信号的中心间距大于4小于8。
在本申请上下文中，“正在脱核”是指从晚幼红细胞到网织红细胞的中间过程。通常显现出以下特征：流式成像中有Ter119(即CD235a)信号、核信号的中心间距大于1小于8。
在本申请上下文中，“已完成脱核的”或“已脱核的”可互换使用，是指无核的状态。通常，Ter119+且核信号阴性时，就标志着已完成脱核。
在本申请上下文中，“未脱核”文中也称脱核准备，是指核信号的中心间距小于1的状态。
在本申请上下文中，“脱核潜能”是指红系细胞在转录组水平上具有脱核相关调控通路的激活。
在本申请上下文中，“脱核潜能评分”是指是指对脱核相关调控通路在转录组水平上的评分(例如但不限于：钙离子响应、MAPK活性、结合肌动蛋白、细胞变形、囊泡运输等参数)，利用公知的Seurat系统的AddModuleScore进行打分，分值越高代表该通路被激活的程度越高。
在本申请上下文中，“脱核率”是指无核的红细胞占全体红系细胞的百分比。
在本申请上下文中，“高表达”也表示为上标hi，是指相对于对照的表达水平、信号强度、或量更高。根据上下文并结合所用的检测方式，技术人员将能够理解具体所指的对照。作为一个示例，CD44hi是指CD44的信号强度高于早幼红细胞BasoE的CD44信号强度。
靶向试剂
在本申请中，靶标是指本申请的靶向试剂所针对的客体；其可以是核酸(基因、mRNA等)，也可以是蛋白(前体、同种型)。作为一个示例，靶标是抗原(如CD45蛋白)作为靶标。作为另一个示例，靶标是mRNA作为靶标。
靶向靶标(如CD45)的试剂是指能够确定靶标是否存在(定性)或确定靶标水平(定量)的试剂。所述确定可以是在蛋白水平上，也可以在核酸水平上。
在一些实施方案中，当在蛋白水平确定靶标是否存在或确定靶标水平时，靶向靶标的试剂是抗-靶标的抗体或其抗原结合片段。
“抗原”是指能够由抗原结合蛋白(例如抗体)所特异性识别或结合的分子或分子部分。抗原可具有一个或多个表位。“表位”指能够与抗体或其抗原结合片段特异性结合的抗原上的区域。表位可以由连续氨基酸串(线性表位)形成；或包含非连续氨基酸(构象表位)。
“能够特异性结合”、“特异性结合”或“结合”是指相比其他抗原或表位，抗体能够以更高的亲和力结合至靶标抗原或其表位。通常地，抗体以约1×10-7M或更小(例如约1×10-8M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或其表位。可使用已知的方法来测量KD，例如通过表面等离子体共振测定法所测量的。
“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体；单特异性抗体，多特异性抗体；全长抗体和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性即可。
“抗体片段”或“抗原结合片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原(如CD45、CD44、Ter119)相结合。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’F(ab’)2、单域抗体、单链Fab(scFab)、双抗体、线性抗体、scFv；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
技术人员理解，本申请的技术效果不依赖与特定的抗体株，只要是能够靶向靶标(如抗原)的抗体或其抗原结合片段都能够实施本申请的技术方案，可以是市售抗体或实验室制备的抗体。
CD45应作做广泛的解读，是指CD45基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于CD45基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。作为一个示例，CD45是CD45蛋白。作为一个示例，CD45是人CD45。CD45的核酸和氨基酸序列信息可获自数据库，例如Genbank号5788或Uniprot号P08575。
CD44应作做广泛的解读，是指CD44基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于CD44基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。作为一个示例，CD44是人CD44。CD44的核酸和氨基酸序列信息可获自数据库，例如Genbank号960或Uniprot号P16070。
Ter119应作做广泛的解读，是指Ter119基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于Ter119基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。作为一个示例，Ter119是小鼠Ter119。Ter119的核酸和氨基酸序列信息可获自数据库，例如Genbank号14934或Uniprot号P14220。小鼠Ter119所对应的人类同源物是GYPA(也作CD235a)。GYPA的核酸和氨基酸序列信息可获自数据库，例如Genbank号2993或Uniprot号P02724。
在一些实施方案中，当在核酸(如RNA)水平确定靶标是否存在或确定靶标水平时，靶向靶标的试剂是引物(对)或探针的形式，其识别并结合靶标核酸的一段或全长序列。
引物是指在核苷酸聚合作用起始时，促进合成的一种具有特定核苷酸序列的分子。引物通常是人工合成的两段核苷酸序列，一个引物与靶标区域(或模板、靶标序列)的一端互补，另一个引物与靶标区域的另一端互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，从而核酸聚合酶能够顺着其3’端开始合成新的核苷酸链。
引物可以是DNA引物或RNA引物。在本申请具体的示例中，优选RNA引物。应当理解的是，RNA引物所对应的DNA引物仍落入本申请的范围。由于引物通常以一对的形式出现，因此称为引物对。引物对中的一个引物特异于靶序列的上游，作为正向引物；另一个引物特异于靶序列的下游，作为反向引物。
当给定靶标序列时，技术人员根据教科书和核苷酸序列互补原理(例如《分子克隆实验指南》2017；P450“使用Primer3 Plus设计PCR引物”；第13章“标记的DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针的制备”)，知晓引物扩增靶向序列的原理、知晓探针结合靶向序列的原理，也清楚引物和探针的设计原则。现有技术中有多种引物/探针的设计软件，例如PrimerPremier、Oligo7、BeaconDesigner等。当技术人员知晓靶标序列时，可以涉及并获得特异性的引物或探针的序列信息和结构信息。因此，本申请的技术方案不限于特定的引物对或探针序列。
作为一个示例，引物/探针的长度不超过50个nt，例如但不限于1、2、3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、44、46、48、50个nt。
检测装置
技术人员知晓，检测装置可以体现为任何已知的或未来的形式，例如试剂(或组装成试剂盒)或芯片的形式。
当检测装置是试剂(或试剂盒)的形式时，其包含本申请的靶向试剂，制备成液体或冻干粉的形式。当检测装置芯片的形式时，在固相载体上结合(包被)有本申请的靶向试剂。
根据本申请的一种或多种靶向试剂可以以缀合物或标记的形式存在，以获得可检测/可定量的信号。当与合适的标记或可检测的生物分子(或化学物质)一起使用时，靶向试剂尤其可用于体外和体内的鉴定、识别、区分、分选、定位、诊断等应用。
用于免疫分析的标记是本领域技术人员已知的，并且包括酶、放射性同位素、荧光、发光、颗粒(如胶乳、磁颗粒)、显色物质(例如胶体金)。
作为一个尤其感兴趣的示例，抗体(或其片段)、引物或探针上带有可检测的标记(例如，酶、荧光、放射性标记等)从而实现对红细胞的可视化、量化、分选、和/或富集。
在一些实施方案中，检测装置包含至少一个容器，容器中包含本申请的各靶向试剂或其组合。
富集方法
本申请提供富集目标细胞群的方法，尤其是富集正在脱核的红细胞的方法。
技术人员理解，富集不应限制性地解释为纯化。
在一些实施方案中，“富集”表现为：使得目标细胞群在最终细胞群中的比例显著高于目标细胞群在初始细胞群中的比例。作为一个示例，在初始细胞群中，通过使初始细胞群接触本申请的靶向试剂，识别被靶向试剂所结合的目标细胞群，对所识别的目标细胞群进行分选而收集获得最终细胞群，从而提高了目标细胞群的比例。
分选的方法是本领域公知的。比如，可以用载体进行捕获。再比如，用流式细胞术进行分选正在脱核的红细胞。
在本申请中，“显著”是指存在统计学上的显著差异，尤其是在设定的p值水平处。例如，p值设置为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、甚至更低。例如，当两个群体测量的表述水平所得p值小于特定p值水平时，则认为两个群体存在统计学上的显著差异。
实施例
实施例1.富集正在脱核的红细胞
1.CD44的表达
红细胞脱核时具有典型的形态特征，随着脱核过程的进行，细胞核中心到胞质中心的距离(Δcentroid)逐渐增加，同时细胞的纵横比(Aspect ratio)逐渐减小。借助流式成像技术，圈出小鼠全骨髓成红细胞的正在脱核(Extruding)的细胞(图1A)。有趣的是，随着红系终末分化逐渐下降的细胞表面分子CD44在部分正在脱核细胞上呈现高表达，进一步定量其比例高达60％(图1B)。提示CD44可能是正在脱核红细胞的潜在标记物。
2.CD44hiTer119+(Nonpro)
鉴于CD44在正在脱核细胞上的高表达，发明人进一步分析了CD44hiTer119+的细胞群(命名为Nonpro)。流式成像结果统计，Nonpro的正在脱核比例为40-60％，远高于成红细胞(erythroblast，EB)中的脱核比例(图1C)。
3.形态学验证
通过流式分选细胞术，收集了小鼠骨髓的Nonpro细胞进行涂片染色，吉姆萨染色将胞核染成蓝紫色，联苯胺染色将富含血红蛋白的胞质染色为深黄色。在Nonpro中非常容易看到正在脱核的细胞形态，与流式成像分析的结果高度一致(图1D)。
4.CD44在脱核早期和晚期的分布
进一步探索了Nonpro的脱核细胞的特征。通过流式成像，根据Δcentroid将正在脱核红细胞分为早期和晚期脱核阶段，发现Nonpro富集晚期脱核细胞(图1E)。代表性图像显示，CD44蛋白在脱核早期凝集并极化到细胞的一侧，在晚期与新生网织红分离并最终包围到细胞核周(图1F)。
5.F-肌动蛋白的分布
鉴于细胞骨架蛋白在脱核中的重要作用，在Nonpro中检测了F-肌动蛋白在脱核过程中的分布及与CD44的位置关系。
F-肌动蛋白的分布与已有研究报道一致，在脱核中晚期集中在新生网织红细胞和排出的核之间，后来定位于网织红细胞内而非排出的细胞核内，而CD44蛋白则与F-肌动蛋白分离，环绕细胞核分布(图1G)。
6.CD44与Ter119的动态分布
为了明确CD44在核排出过程中的空间分布，对分选的Nonpro细胞进行了高分辨率共聚焦显微镜及3D成像(图1H)。在脱核早期，Ter119部分聚集鼓出细胞表面。在脱核中期，细胞核被挤压变形成不对称的哑铃状，CD44不连续地分布在变形的核狭窄处及核表面。脱核晚期，CD44和Ter119分别完全分布到排出的核及新生网织红表面。
综上所述，使用CD44hiTer119+定义的Nonpro细胞能够富集小鼠骨髓里正在脱核的红细胞。
实施例2.Nonpro单细胞转录组的测序
为了更好地表征Nonpro的亚群，进行了单细胞RNA测序，以鉴定正在脱核的分子标记。
通过流式细胞分选术，从两只小鼠的骨髓中分离和收集CD44hiTer119+Nonpro细胞。为了排除红细胞吞噬体，去除了CD45标记的所有免疫细胞，得到CD45-Nonpro进行10×单细胞转录组测序。严格质控后，共获取10361单细胞进行后续分析。
UMAP分析确定了7个细胞亚群，包括连续主轴和两个独立亚群(图2A)。基于红系特征基因表达模式，将主轴上连续分布的5个亚群分别定义为E1至E5。
有趣的是，两个独立亚群分别高表达与B淋巴细胞(Ly6D、Ighm、Igkc、Cd79a、CD79b，转录因子包括Ebf1、Pax5和Lef1)、中性粒细胞(Elane、S100A8/A9、Prtn3及转录因子Cebpb)和单核细胞(Lyz2、S100a4、Lgals3)相关的免疫基因，将它们鉴定为免疫红细胞Ery/B和Ery/Mono(图2B)。
此外，GO富集分析提示，免疫红细胞不仅具有先天免疫反应的调节、细胞-细胞粘附的正向调节、白细胞迁移、吞噬作用等与免疫反应有关的功能，同时也保留了红系分化的功能，并获得了肌动蛋白丝聚合和细胞形状调节的能力(数据未显示)。这表明免疫红细胞可能具有与红细胞脱核相关的潜在功能。
综上所述，通过单细胞转录组测序，鉴定了Nonpro细胞由早期成红细胞(51.72％)、晚期成红细胞(15.84％)和免疫红细胞(32.44％)组成。
为了进一步探索免疫红细胞所特有的生物学功能，将Ery/B与Ery/Mono与小鼠骨髓免疫细胞的公共单细胞RNA-seq数据进行比较。虽然Ery/B与Ery/Mono与免疫细胞在转录组水平上具有较高的相似性(数据未显示)，但生物学功能富集分析的结果分析却揭示了它们之间在细胞功能上的差异(图3A)。聚类热图显示了免疫红细胞中的特定生物学功能GO条目。脱核相关途径，包括对钙离子的响应、MAP激酶活性的调节、肌动蛋白结合、囊泡和液泡，在免疫红细胞中被显著特异性激活(数据未显示)。
根据GO条目中的基因表达计算了CD45-Nonpro中每个亚群的脱核潜能评分。免疫红细胞(两个独立亚群Ery/B与Ery/Mono)比主轴上连续分布的5个亚群具有显著增高的脱核潜能评分(图3B)。
总体而言，结果表明CD45-Nonpro中的免疫红细胞具有脱核相关生物学功能，为免疫红细胞脱核在转录水平上做好了准备。
实施例3.利用免疫分子CD45有效捕获体内正在脱核的红细胞
为了明确免疫红细胞与脱核的关系，选择了在免疫红细胞中与CD44共表达的CD45分子作为表面标志物进行流式成像。
考虑到免疫红细胞的特殊性(同时表达免疫标记物和红系标记物)，优化了流式成像的实验方案，舍弃用磁珠分选CD45-细胞的步骤，使用小鼠全骨髓细胞进行流式成像，防止免疫红细胞的丢失。流式成像检测到蛋白水平上CD45与CD44的正相关，且正在脱核红细胞中CD45阳性率达60％-80％(图4A)。进一步统计CD45+成红细胞中正在脱核的比例高达60％-80％(图4B)，略高于Nonpro富集正在脱核红细胞的比例(40％-60％)(图1C)，且CD45可以捕获CD44lowCD45low早期脱核红细胞(图1C至图1D)，弥补了CD44不能捕获该亚群细胞的缺憾。因此，CD45+红细胞可以较Nonpro更有效地富集正在脱核红细胞。
图4C显示了CD45+正在脱核红细胞的代表性照片。随着CD45表达由弱到强，富含CD45蛋白的小泡鼓出胞外(I)，随后核变形进入CD44和CD45阳性小泡中(II)，Ter119与CD44及CD45发生膜分离，分布到新生网织红细胞膜表面，脱出的细胞核表面围绕着CD44和CD45蛋白(III)。有意思的是，脱出的CD44+CD45+核DNA染色强度变弱，提示可能存在DNA降解。
接下来统计了CD45+正在脱核红细胞中处于脱核早晚期的比例及细胞核强度。发现CD45+更加富集脱核晚期和核信号弱的有核红细胞(图4D和图4E)。此外，部分无核红细胞中也存在CD45弱阳性细胞(图4F)。细胞照片显示，CD45蛋白在网织红凹陷的地方仍有残留，可能是免疫信号没有完全消退或者在脱核的连接处断裂。
为了明确CD45是否可以作为正在脱核红细胞的分子标记物，对CD45+Ter119+比例与正在脱核红细胞比例及脱核率分别进行相关性分析(图4G和图4H)。结果表明CD45+Ter119+比例与正在脱核红细胞比例呈正相关，与脱核率成负相关。因此，CD45可以有效标记具有免疫特征的一类正在脱核的红细胞。
免疫荧光染色的3D重建揭示了CD45和Ter119蛋白的空间分布(图4I)。在脱核晚期的红细胞中，CD45主要分布在脱出的细胞核表面，在新生的网织红细胞与脱出的核之间连接的膜上可以看到Ter119和CD45信号在分布上存在交互。此结果进一步表明红细胞脱核时对Ter119和CD45进行蛋白质分选。
实施例4.正在脱核的免疫红细胞一过性表达免疫基因转录产物
为了全面完整地刻画免疫红细胞脱核过程中的转录组动态，分选小鼠的全骨髓Nonpro细胞(实施例2中Nonpro不是来自全骨髓，而是去除了免疫细胞。本实施例中的全骨髓Nonpro没有去除免疫细胞，和实施例1中Nonpro是相同细胞群体)，并以OrthoE细胞作为对照一起进行单细胞转录组测序(图5A)。经过严格的质量控制，分别获得了2004个全骨髓Nonpro细胞和4379个OrthoE细胞。
将全骨髓Nonpro、两个CD45-Nonpro(Nonpro1、Nonpro2；Nonpro1、Nonpro2是实验重复，分别来自两个样本，均涵盖前述7个亚群)和OrthoE进行整合，UMAP分析确定了9个亚群。全骨髓Nonpro的分群模式与CD45-Nonpro相似，包括一个连续的主轴和两个独立的亚群(图5B)。虽然全骨髓Nonpro中大多数特征基因的表达与CD45-Nonpro(图5C，图2C)保持一致，但是全骨髓Nonpro的免疫红细胞的比例降低(图5D)，这提示免疫分子在RNA和蛋白质表达水平并不同步。
与CD45-Nonpro相比，Ery/ApoE+是全骨髓Nonpro特有的。Ery/ApoE+亚群细胞在RNA水平上高度表达血红蛋白、Apoe、Vcam1、补体成分(C1qa、C1qb和C1qc)，在蛋白水平上表现为CD45阳性和CD44强阳性(图5C)。
GO富集分析显示，Ery/ApoE+亚群的细胞在补体激活、对无机物的反应、上皮细胞迁移的调节、对脂蛋白颗粒的反应、炎症反应的调节、肿瘤坏死因子的产生、内吞作用的正向调节以及红细胞稳态，和血红素结合等方面发挥作用(数据未显示)。
这些结果提示Ery/ApoE+亚群红细胞获得了单核细胞样特征。此外，脱核潜能评分显示该亚群的脱核潜能在转录水平上比Ery/B和Ery/Mono明显减弱，但仍有少量细胞获得较高的脱核潜能评分，因此提示其进入脱核晚期，这与其形态学的表现也是一致的。
ApoE作为载脂蛋白主要负责脂蛋白介导的脂质运输，而脂蛋白代谢可以影响红细胞的脱核及成熟。已有研究表明，ApoE失活加重高胆固醇血症小鼠的红细胞脱核及成熟异常(Blood 2002Mar1；99(5):1817-24)。因此本申请发现的Ery/ApoE+亚群可能在红细胞脱核中起到重要作用。
基于上述结果，推测免疫基因的转录在脱核开始前被一过性激活，翻译出免疫蛋白后不再需要维持其转录，因而表现出免疫基因转录产物在脱核中一过性上调。
实施例5.体外培养CD45-Nonpro细胞发生免疫性脱核
下一步需要明确CD45-Nonpro是否会发生免疫性脱核。
首先，通过流式成像检测了小鼠骨髓严格去除免疫细胞后的CD45-Nonpro的形态(图6A)，其中约8％的细胞表现为正在脱核的形态。通过流式细胞术分选小鼠骨髓严格去除免疫细胞后的CD45-Nonpro和晚幼红OrthoE细胞，进行体外过夜培养。经免疫荧光染色统计二者的脱核率分别是50％和10％，处于正在脱核阶段的细胞比例分别是12％和15％(图6B至图6D)。流式成像统计得到一致的结果(图6F)。可见，CD45-Nonpro的脱核率高于OrthoE细胞。推测由于CD45-Nonpro在转录组水平已经为脱核做好了充分的准备，因此相比OrthoE具有更高的脱核潜能。接下来，使用流式成像检测CD45-Nonpro和OrthoE细胞体外培养后是否表达CD45蛋白。不论在未脱核、正在脱核、还是已脱核的红细胞中，CD45-Nonpro细胞经过夜培养后CD45阳性率均显著高于OrthoE(图6E，图6G)。代表性照片显示Nonpro脱核前CD45在细胞膜上和Ter119逐渐分离，随着脱核进展分配到即将脱出的细胞核侧，与Ter119彻底分开，这与体内免疫脱核CD45分布的模式相同。CD45也在部分无核红细胞中表达(图6E)，其比例略高于体内。提示可能因为微环境的差异导致体外免疫脱核后CD45蛋白的消退减慢。
实施例6.富集成人骨髓中正在脱核的细胞
人和小鼠脱核可能存在种属差异性，人红细胞脱核时细胞核不变形，小鼠脱核时细胞变形成哑铃状被排出红细胞。
免疫红细胞的生物学功能富集钙离子应答，MAPK激酶活性，肌动蛋白结合等脱核相关通路，但是未见囊泡运输通路的富集，这提示小鼠和人的免疫性脱核可能存在种属差异性(数据未显示)。
收集健康成人骨髓穿刺的样本，裂红后进行流式成像检测(图7A至图7B)。相比CD45-红细胞，人CD45+红细胞的正在脱核的比例显著增加(图7C)，且相对富集晚期脱核红细胞(图7D和图7E)。这与小鼠骨髓中免疫性脱核的表现高度一致。
综上，RNA和蛋白水平提示成人骨髓的免疫红细胞显著富集正在脱核形态的细胞。

Claims (10)

1.靶向CD45的试剂在制备检测装置中的用途，其中：
所述检测装置是试剂盒或芯片的形式；
所述检测装置用于确定红系细胞的脱核状态，所述脱核状态选自以下的任一项：脱核准备、正在脱核、已脱核；
所述靶向CD45的试剂是指确定CD45是否存在或确定CD45水平的试剂；
所述靶向CD45的试剂选自以下的任一项：抗CD45抗体或其抗原结合片段、靶向CD45的引物、靶向CD45的探针；
所述红系细胞分离自体内、或来自体外培养物；
优选地，所述正在脱核选自以下的任一项：脱核早期、脱核晚期；
所述CD45是指人CD45。
2.根据权利要求1所述的用途，其中：
当红系细胞呈现CD45阳性时，判定所述红系细胞处于正在脱核的状态、或判定所述红系细胞处于正在脱核状态的比例统计学上显著提高；
当红系细胞呈现CD45阴性时，判定所述红系细胞处于脱核准备、或者处于正在脱核状态的比例统计学上显著降低。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中：
所述检测装置还包含靶向CD235a或Ter119的试剂；
所述靶向CD235a或Ter119的试剂是指确定CD235a或Ter119是否存在或确定CD235a或Ter119水平的试剂；
所述靶向CD235a或Ter119的试剂选自以下的任一项：抗CD235a或Ter119抗体或其抗原结合片段、靶向CD235a或Ter119的引物、靶向CD235a或Ter119的探针。
4.根据权利要求3所述的用途，其中：
当红系细胞呈现CD235a阳性或Ter119阳性以及CD45阳性时，判定所述红系细胞处于正在脱核的状态、或判定所述红系细胞处于正在脱核状态的比例统计学上显著提高；或者
当CD235a和CD45共定位、或Ter119和CD45共定位于红系细胞的表面时，判定所述红系细胞处于正在脱核的状态、或判定所述红系细胞处于正在脱核状态的比例统计学上显著提高。
5.根据权利要求1或3所述的用途，其中：
所述检测装置还包含靶向CD44的试剂；
所述靶向CD44的试剂是指确定CD44是否存在或确定CD44水平的试剂；
所述靶向CD44的试剂选自以下的任一项：抗CD44抗体或其抗原结合片段、靶向CD44的引物、靶向CD44的探针。
6.根据权利要求5所述的用途，其中：
当CD44和CD45共定位于脱出的细胞核表面时，判定所述红系细胞已脱核、或判定所述红系细胞的脱核率统计学上显著提高。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中：
所述检测装置还包含靶向以下任一项的试剂或其组合：血红蛋白、ApoE、Vcam1、C1qa、C1qb、C1qc、Ly6D、Ighm、Igkc、Cd79a、CD79b、Ebf1、Pax5、Lef1、Elane、S100A8/A9、Prtn3、Cebpb、Lyz2、S100a4、Lgals3；
优选地，当红系细胞在RNA水平上高表达血红蛋白、ApoE、Vcam1、C1qa、C1qb、C1qc，且在蛋白水平上呈现CD44和CD45阳性时，判定所述红系细胞处于脱核晚期的状态、或判定所述红系细胞处于脱核晚期的状态的比例统计学上显著提高；
优选地，当红系细胞在RNA水平上高表达Ly6D、Ighm、Igkc、Cd79a、CD79b、Ebf1、Pax5、Lef1、Elane、S100A8/A9、Prtn3、Cebpb、Lyz2、S100a4、Lgals3中的一种或多种，且在蛋白水平上呈现CD44阳性、CD235a阳性或Ter119阳性、CD45阴性时，判定所述红系细胞具有显著增高的脱核潜能。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中：
所述确定是在RNA水平或蛋白水平的确定；
所述抗体源自以下的任一项：鼠、兔、人、骆驼、犬、羊、马、重组表达的抗体；
优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体；
优选地，所述抗原结合片段选自以下的任一项：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、单链抗体、结构域抗体、多特异性抗体。
9.一种在体外富集正在脱核的红系细胞的方法，包括步骤：
1)在体外提供红系细胞，
2)使所述红系细胞接触靶向CD45的试剂，
3)分选CD45阳性的红系细胞，优选通过流式细胞术分选；
其中：
所述靶向CD45的试剂是指确定CD45是否存在或确定CD45水平的试剂；
所述靶向CD45的试剂选自以下的任一项：抗CD45抗体或其抗原结合片段、靶向CD45的引物、靶向CD45的探针；
所述红系细胞分离自体内、或来自体外培养物；
所述CD45是指人CD45；
所述方法不用于疾病的诊断或治疗。
10.根据权利要求9所述的方法，其中：
1)在体外提供红系细胞，
2.1)使所述红系细胞接触靶向CD45的试剂，
2.2)任选地，使所述红系细胞接触靶向CD44的试剂，
2.3)任选地，使所述红系细胞接触靶向CD235a或Ter119的试剂，3)分选CD45阳性、任选CD44阳性、任选CD235a或Ter119阳性的红系细胞；
步骤2.1)、2.2)、2.3)可以按照任意顺序先后或同时进行；
所述靶向CD44的试剂是指确定CD44是否存在或确定CD44水平的试剂；
所述靶向CD44的试剂选自以下的任一项：抗CD44抗体或其抗原结合片段、靶向CD44的引物、靶向CD44的探针；
所述靶向CD235a或Ter119的试剂是指确定CD235a或Ter119是否存在或确定CD235a或Ter119水平的试剂；
所述靶向CD235a或Ter119的试剂选自以下的任一项：抗CD235a或Ter119抗体或其抗原结合片段、靶向CD235a或Ter119的引物、靶向CD235a或Ter119的探针；
所述确定是在RNA水平或蛋白水平的确定。
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