CN106632558B

CN106632558B - 一种寡聚核苷酸的纯化方法及应用

Info

Publication number: CN106632558B
Application number: CN201610721169.5A
Authority: CN
Inventors: 陈平; 王翔; 胡华友; 支三军
Original assignee: Huaiyin Normal University
Current assignee: Huaiyin Normal University
Priority date: 2016-08-25
Filing date: 2016-08-25
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2036-08-25
Also published as: CN106632558A

Abstract

本发明提供了一种对经DNA合成仪合成的寡聚核苷酸进行纯化的方法，包括以下步骤：采用C18反相柱或固相萃取纯化柱对粗DNA进行纯化，其中以非极性键合硅胶或弱极性键合硅胶为固定相或使用寡聚核苷酸固相萃取纯化柱填料为载体，以乙腈/水，和/或浓氨水，和/或去离子水，和/或三氟乙酸，为流动相进行洗脱纯化，收集目的寡聚核苷酸溶液，将所收集的DNA溶液进行浓缩。通过本方法纯化得到的寡聚核苷酸纯度高，收率高，并且本方法操作简单，成本低。

Description

一种寡聚核苷酸的纯化方法及应用

技术领域

本发明涉及寡聚核苷酸的纯化领域，特别是带有或未带有二甲氧基三苯甲基（DMT）的寡聚核苷酸的纯化。

背景技术

DNA合成仪已经是获得寡核苷酸的一种非常有价值的工具。寡核苷酸是分步合成的，每隔一定时间向新生成的寡核苷酸链上加上一种单体。在每一反应周期中几乎定量地对寡聚核苷酸链进行增链反应，但仍会有约1-2％左右的单体不能反应完全。因此所得产物一般含有少量的不同长度寡聚核苷酸杂质链的不均匀混合物。

一般而言在固相载体（CPG）上制备寡聚核苷酸需要将最终目标寡聚氧核苷酸链从载体上解脱下来。将该寡聚物从载体上解脱下来一般是用浓氨水处理该固相载体。通常还需要再用例如旋转蒸发器等仪器在减压条件下去除过量的氨水。但是这种去除浓氨水的方法不宜用于大规模分离寡聚核苷酸粗产品。

事实上，就这个问题，本领域中已经展开了一些研究，Metelev等(1992)报导了用离子交换HPLC分析寡核糖核苷酸和嵌合的寡核糖-寡脱氧核糖核苷酸。他们发现所研究的寡核苷酸的保留时间取决于寡核苷酸中核糖核苷酸残基的数目。并发现寡核糖核苷酸的保留时间与其长度有关。Metelev指出可以纯化和分析长度高达25个核苷酸的寡核糖核苷酸。

PCT专利申请WO2011/161007提出的纯化方法首先在反相高效液相色谱法采用酸性RP-HPLC流动相，随后采用高pH值的流动相。然而高pH值条件下多肽不稳定，产生新的杂质，导致批次之间纯度不一致。

此外，有报道称 (Journal of Medicinal Chemistry 43，1664-1669，2000)采用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)，流动相为标准的TFA/乙腈体系，柱温为65度，乙腈的浓度梯度为60分钟内0～100％，分离出目标产物，纯化收率为35％；中国专利200610110898.3和中国专利200510107588采用同样的纯化方法，纯化收率为28％。

目前，绝大多数寡聚核苷酸引物均采用OPC（oligonucletide purificationcartridge，寡聚核苷酸固相萃取纯化柱）柱纯化、HPLC（高效液相色谱）纯化以及PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳）纯化三种纯化方法，但是这三种纯化方法均有其不足之处：HPLC虽然纯度较高，但是它的纯化量较小，速度慢且费用高；OPC柱纯化，虽然速度较HPLC有所提高，但是其专一性吸附能力有限，不免有小片段的带入；PAGE纯化虽然纯化效果较好，而且可以直观的看到DNA合成片段的质控环节，但是PAGE纯化实验步骤多、费人力、电泳及后处理过程样品损失量大以及电泳时间长，纯化时间长达6-8小时，这样对于大量的DNA纯化势必受到一定的影响。

因此，现在需要有适用于制备寡聚核苷酸链分离纯化的改进方法。

发明内容

发明概述

本发明提供了寡聚核苷酸纯化的改进方法。具体地说，本发明提供的方法适合于对DNA合成仪获得的寡聚核苷酸链进行高效纯化。本发明纯化方法不需要使用减压去除浓氨水。

本发明一方面使用非极性键合硅胶或弱极性键合硅胶为固定相，在浓氨水将寡聚核苷酸链从它们的固相载体上解脱下来之前，通过一定pH值和用量的Tris-HCl或NaCl对C18反相柱进行活化，提高该色谱柱的纯化量，然后使用该方法可以对未带DMT的寡聚核苷酸链进行脱除盐类等小分子杂质。本发明的另一方面是用Cartridge柱OPC为载体，使用特定的梯度洗脱的方式进行寡聚核苷酸链的纯化，然后使用该方法可以对带有DMT的寡聚核苷酸链粗产品中分离纯化得到目标寡聚核苷酸链。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。

发明的详细说明

一般使用反相液相色谱将所需的DMT保护的寡聚核苷酸链(即有5′二甲氧基三苯甲基保护基的寡聚核苷酸)与无DMT保护的寡聚杂质链(即没有5′二甲氧基三苯甲基基团的寡核苷酸副产品)进行分离开。更具疏水性的DMT保护的寡聚物比无DMT保护的寡聚物能更紧密地与反相柱结合。如果所需的寡核苷酸要用于治疗目的，与寡核苷酸配位的所有铵根阳离子必须用其它阳离子进行交换(例如使用钠离子)。这通常是通过离子交换色谱后再用交联葡聚糖凝胶脱盐来实现的。

本发明包括一些改进的方法用来分离或纯化DNA合成仪获得的寡聚核苷酸链。这里使用的“分离”和“纯化”两词在一定条件下能互换使用，并且是指这样的过程，即具有某种特定分子结构的寡核苷酸用物理方法从具有不同分子结构的寡核苷酸中分离出来，且将氨水和/或其它盐从寡核苷酸混合物中去除。

具体说，本发明包括使用非极性键合硅胶或弱极性键合硅胶为固定相或使用Cartridge柱OPC载体的两种方式进行分离纯化DNA合成仪获得的寡核苷酸。

在本发明第一种实施方案中，所需的寡核苷酸是从过量浓氨水和/或其它盐中分离出来，并将含有寡核苷酸的盐溶液不经过其他处理，直接使用本发明所述的方法进行DNA分离纯化。将含寡核苷酸的盐溶液通过C18反相柱将盐等小分子杂质进行分离去除。优选的，使用的固相为键合碳链C1、C4、C8、C18、氰基或苯基的硅胶；优选为，十八烷基硅烷键合硅胶、丁基烷基硅烷键合硅胶或氰基烷基硅烷键合硅胶。

使用的方法包括步骤：

a、以非极性键合硅胶或弱极性键合硅胶为固定相，以体积比为100-80∶0-20的乙腈和水为流动相，在不使用真空泵的条件下冲洗柱子，冲洗后将柱子完全抽干以除去柱子中的残留杂质；

b、用Tris-HCl或NaCl活化柱子；

c、上样；

d、使用去离子水冲洗柱子；

e、用1-50∶99-50的水和乙腈为洗脱液对固相进行洗脱；

f、收集目标寡聚核苷酸溶液。

本发明方法可用来纯化的样品为含盐的寡核苷酸粗混合物。这些粗混合物可以是用氨水从固相合成CPG载体上解脱下来的或者是事先经过其它纯化程序但盐等小分子浓度未达到要求纯度的混合物

在本发明的第二个实施方案中，将含寡核苷酸的盐溶液通过OPC为载体的Cartridge柱将带有二甲氧基三苯甲基DMT目标寡聚核苷酸链进行分离纯化后，去除掉大部分为带有DMT保护的杂质链，然后用三氟乙酸溶液去除目标寡聚核苷酸链的DMT保护基，最终得到纯化后的目标寡聚核苷酸链；优选的，使用的方法包括步骤：

a、使用Cartridge柱OPC为载体，以体积比为100-80∶0-20的乙腈和水为流动相，在不使用真空泵的条件下冲洗柱子，冲洗后将柱子完全抽干以除去柱子中的残留杂质；

b、用Tris-HCl或NaCl活化柱子；

c、上样；

d’、以浓氨水溶液为A相、去离子水为B相、三氟乙酸（TFA）水溶液的C相，按照A相-B相-C相- B相的先后顺序进行洗脱纯化，其中，梯度C％：3％-25％，A相的pH应大于8.5，不大于13；

e、用1-50∶99-50的水和乙腈为洗脱液对固相进行洗脱；

f、收集目标寡聚核苷酸溶液。

本发明方法可用来纯化的样品为含盐的寡核苷酸粗混合物。这些粗混合物可以是未用浓氨水将目标核苷酸链5’端DMT保护基团脱离下列或者是事先经过其它纯化程序但没达到要求纯度的混合物。

将寡核苷酸置于柱上在室温或接近室温温度下用梯度或非梯度缓冲液洗脱。优选的，步骤a中作为流动相的乙腈和水的体积比优选为100∶0。其中，更优选使用的5ml乙腈在不使用真空泵的条件下冲洗柱子；和/或所述的B步骤中Tris-HCl或NaCl的浓度为0.5M，和/或pH为6-7，优选为pH7.5。在一个实施例中，步骤d’的梯度C％：3-5％，优选为4%。

本发明方法的一个实施例中e步骤中水和乙腈的比为1:1。

本发明方法的一个实施例中e步骤中对固定相进行梯度洗脱，

用水和乙腈梯度洗脱的比例依次为:

3:1→2:1→1:1，每种比例的水和乙腈1ml，循环进行洗脱。

本发明的另一个实施例中，步骤c之前还包括前处理步骤；优选的，前处理步骤为除去样品中残留的氨水；和/或在步骤f之后还包括步骤g浓缩定量；优选的，步骤g使用离心浓缩仪将步骤f获得的收集液浓缩到适当体积，并进行定量。

根据本发明，用本发明方法使用的制备柱直径至少为1mm，优选的，直径为1mm-100mm；

根据本发明，用本发明方法分离的寡核苷酸碱基数目可以在某个范围内，优选的，所述寡聚核苷酸长度是5至大约50个核苷酸。

本发明分离纯化DNA合成仪获得的寡核苷酸的过程中，优选的要使用缓冲液，如Tris-HCl(优选浓度大约0.1M至大约1M)。盐(如氯化钠)用于平衡和洗脱，优选使用0.5M，更优选的使用0至2M的氯化钠梯度。

本发明还涉及一种端基修饰的DNA用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（denaturingPAGE）割胶分离后，再用本发明实施例中的C18柱子脱盐方法进行DNA的纯化，具体操作步骤为：制胶；预跑；样品浓缩上样；跑胶；割下的目的胶所在区域；捣碎，加水浸泡；离心取上清液；将上清液合并浓缩；重复本发明实施例中所述的C18脱盐过程。

在一些应用中，可以向缓冲液中加入螯合剂如1mM的EDTA。寡核苷酸柱容量稍微低于载体或固定相的容量，装柱范围可高到大约5 OD单位/ml载体或固定相，优选大约2OD单位/ml填料。最佳线性速度范围在大约1 OD/mL

DNA纯化后回收率或纯度检测的方法：

样品经相应纯化方法纯化以后，利用紫外分光光度法测定260 nm处的紫外吸光度，然后计算该产品的产量，计算方法参见实施例1中的相应计算公式。回收率的计算方法为：回收率=纯化后产量/纯化前粗产品量。（我们把纯化前的粗产品的量规定为DNA合成仪的设定合成量）

纯化后样品的纯度可进一步利用高效液相色谱或/和变性PAGE对其进行进一步的检测表征：

高纯度的样品在高效液相色谱中应表现出单一的峰形，主峰保留时间之前出现的吸收峰越少，证明产品越纯，具体纯度可通过峰面积归一法进行计算；变性PAGE对DNA的纯度检查方法为，将PAGE用相应显色剂（如染色剂Stains-All）显色后应表现出均一、单一的斑点，与主斑点的电泳迁移率相比，其它迁移率斑点出现的越少、颜色越浅，证明产品的纯度越高，具体纯度可通过凝胶成像仪对相应斑点的颜色进行归一化法进行计算。

本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1.用C18反相柱进行样品脱盐纯化前后实验比对结果，左侧为C18纯化后、右侧为C18纯化前，A为目的DNA，B为杂DNA；

图2.用C18反相柱进行样品分离纯化前后样品紫外吸收实验比对结果；

图3.用OPC载体进行样品分离纯化前后实验比对结果，左侧为OPC纯化后、右侧为OPC纯化前，C为目的DNA，D为杂DNA；

图4.用变性PAGE法处理后再使用C18柱子进行样品分离纯化前后实验比对结果,1为PAGE纯化后、2-6为PAGE纯化前，E为目的DNA，F为杂DNA。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司购得：

核酸合成仪：ABI 394 型，美国应用生物系统公司。

垂直凝胶电泳仪：JY1600C 型，北京君意东方公司。

紫外-可见光谱仪（UV-Vis）：Varian Cary 100 型，美国Varian 公司。

循环水式真空泵：SHZ-D(III) 型，中国郑州仪器有限公司。

固相萃取仪：Mediwax-12 型，美国Mediwax公司。

真空离心浓缩仪：Concentrator plus 型，德国Eppendorf公司。

C18填料购买自Sigma公司；OPC固相萃取柱与填料购买自Waters公司；聚丙烯凝胶染色剂Stains-All购买自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、尿素、Tris缓冲液购买在北京赛百盛公司；变性聚丙烯凝胶电泳（denature PAGE）：质量体积分数10% , 丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺= 19:1，3M 尿素；浓氨水、乙腈购买自国药试剂公司；离心管购买自Axygen公司。

实施例1用C18反相柱进行样品分离纯化

用装有1ml C18载体的C18反相柱(自Sigma公司购得)纯化具有DNA序列：5'- CCCCTA ACC CCT TCT TAC GGC GAA TGA GTA AAT TAG AA-3'（序列1）的寡聚核苷酸链，固相载体柱的直径为1.5cm。

实验在室温条件下进行，具体操作为：

（1）用5 mL 乙腈CH₃CN冲洗一下柱子（5 mL一次加入，因为乙腈的粘度较小，冲洗时不用开真空泵，使其随重力自然流下即可。冲洗后将柱子完全抽干以除去柱子中的残留杂质）

（2）用Tris-HCl 5 mL 活化一下柱子（5 mL一次加入，注意最后使液面保留到与载体上部平齐，不要使柱子抽干）

（3）将含有序列1的待纯化的含盐的寡核苷酸粗产品上样（使样品缓慢浸润到柱子中后，关闭阀门，不要使样品流出，使其在柱子中充分吸附，大约需2 min）

（4）用去离子水冲洗柱子，每次4 mL，冲洗两次。（冲洗完后将柱子抽干以尽可能地脱盐）

（5）用3 mL CH₃CN/H₂O洗脱柱子（当洗脱液完全浸润到柱子中后，关闭阀门，等待2分钟，使其充分将DNA洗脱下来）

（6）收集（用Axygen 2mL 离心管：1.5 mL/管×2管收集，将溶液完全抽干以得到尽可能多的DNA）

（7）浓缩定量（用离心浓缩仪将3mL 洗脱液浓缩到适当体积，用UV定量，UV定量时应使其260nm处的吸收值调控到0.2—1之间）。

样品在进行纯化前要先除一下氨水（用浓缩仪大约抽30分钟）。C18柱子的流速要始终控制在约1-2滴/s（通过真空泵使其真空度控制在约2kPa左右从而控制流速）。纯化后的样品在浓缩合并时要从较稀的样品管合并到较浓的样品管中，并用适量的水冲洗一下合并后的空样品管，以减少DNA的损失。

结果使用寡聚核苷酸的摩尔数计算方法计算DNA的浓度。

寡聚核苷酸的摩尔数计算方法：

1 OD是指：置于光路长度为1 cm的比色皿中的DNA溶液，如果其在260 nm处的吸光度值为1，则称1 ml该溶液中溶解的DNA的量为1 OD。

1个OD值的寡聚核苷酸的重量约为33 μg，而每个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此，合成DNA的nmol数一般按以下公式粗略地计算。

如果需要计算合成DNA的精确浓度，请按以下公式进行计算：

测紫外时260nm的吸收值即为OD值，若样品较浓时应取少量稀释至适当的倍数再测紫外，使其260nm处的吸收值调控到0.2-1之间（只有在这个范围内时它的紫外吸收值与浓度才程线性关系，所得出的结果才更加准确）。通过以上公式计算出来的是在1mL水中DNA的nmol数，即也对应于一个浓度C= X nmol/mL=X μM,测完后将X值标到离心管上即为最后浓缩后DNA的浓度。

将实施例1所述方法使用前后的样品（该样品非修饰、未带二甲氧基三苯甲基DMT）进行电泳实验，如附图1所示，可见经过纯化后的目的DNA以外的杂质核酸分子有一定的减少；特别是如附图2所示，从纯化前后样品的紫外吸收光谱表征结果可以看出，200nm-230nm波长范围内，小分子盐离子的紫外吸收强度有了明显的降低，说明经过C18纯化后，小分子盐离子浓度有了显著的降低，证明C18纯化柱具有很好的脱盐效果。

为了优化纯化效果，对步骤2活化柱子使用的Tris-HCl的条件进行优化，结果见表1。

表1 Tris-HCl的条件进行优化实验

Tris-HCl溶液	0.2M	0.5M	1M
				pH=5	回收率49.1%	回收率50.5%	回收率49.6%
pH=7.5	回收率51.1%	回收率52.4%	回收率51.6%
				pH=8.5	回收率50.0%	回收率50.3%	回收率49.9%

另外，为了优化纯化效果，对步骤5使用CH₃CN/H₂O洗脱柱子的比例进行优化，结果见表2。

表2 CH₃CN/H₂O洗脱柱子的比例进行优化实验

H<sub>2</sub>O： CH<sub>3</sub>CN（V/V）	纯化后DNA回收率
		1:1	回收率51.6%
2:1	回收率50.9%
		3:1	回收率50.5%
3:1→1:1（各1ml 顺次洗脱柱子）	回收率51.3%
		3:1→2:1→1:1（各1ml顺次洗脱柱子）	回收率52.6%

通过上述实验可见，使用pH7.5 的0.5M Tris-HCl进行柱活化，使用水和乙腈（v/v）梯度洗脱的比例依次为:

3:1→2:1→1:1，每种比例的水和乙腈1ml，循环进行洗脱，最终DNA分离纯化的效果最好。

按照上述优化条件，步骤2中使用pH7.5 的0.5M Tris-HCl进行柱活化，步骤5中使用水和乙腈（v/v）3:1→2:1→1:1梯度洗脱的比例（每种比例的水和乙腈1ml，循环进行洗脱）。将最终获得的纯化样品于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约1-3ml后转移至合适大小西林瓶，进行冷冻干燥，即可得到纯度大于84.9%的纯化后寡聚核苷酸，回收率约为87.7%。

实施例2 用含有OPC载体的Cartridge柱进行样品分离纯化

用装有1ml OPC载体的Cartridge柱(自Waters公司购得)纯化具有DNA序列：5’-CAG ACC AGT GAG CTG GCA TTC GCC ATT CAG GC-3’（序列2）的寡聚核苷酸链（该样品为带有DMT的DNA），固相萃取柱的直径为1.5 cm。

实验在室温条件下进行，具体操作为：

1.用5mL CH₃CN冲洗一下柱子（5mL一次加入，因为乙腈的粘度较小，冲洗时不用开真空泵，使其随重力自然流下即可。冲洗后将柱子完全抽干以除去柱子中的残留杂质）

2.用Tris-HCl 5mL 活化一下柱子（5mL一次加入，注意最后使液面保留到与载体上部平齐，不要使柱子抽干）

3.将含有序列2的待纯化的含盐的寡核苷酸粗混合物上样（使样品缓慢浸润到柱子中后，关闭阀门，不要使样品流出，使其在柱子中充分吸附，大约需2min）

4.用浓氨水4mL左右冲洗柱子（用以除去未带DMT的短链DNA）

5.用去离子水冲洗柱子，每次4mL，冲洗两次。（冲洗完后将柱子抽干以尽可能地出去氨水和短链DNA）

6.用4mL 3-25%三氟乙酸 TFA(水溶液) 洗脱柱子（当洗脱液完全浸润到柱子中后，关闭阀门，等待2分钟，使TFA充分将DMT从DNA上切下来，若剪切成功会看到柱子由无色变为浅红色，2min后将溶液完全抽干以除去剩余的TFA）

7.用4mL去离子水冲洗柱子中的TFA。（冲洗完后将柱子抽干以尽可能地除去剩余的TFA）

8.用3mLCH₃CN/H₂O洗脱柱子（当洗脱液完全浸润到柱子中后，关闭阀门，等待2分钟，使其充分将DNA洗脱下来）

9.收集（用Axygen 2mL 离心管：1.5mL/管×2管收集，将溶液完全抽干以得到尽可能多的DNA）

10.浓缩定量（用离心浓缩仪将3mL 洗脱液浓缩到适当体积，用UV定量，UV定量时应使其260nm处的吸收值调控到0.2-1之间）。

OPC柱子的流速要始终控制在约1-2滴/s（通过真空泵使其真空度控制在约2kPa左右从而控制流速）。纯化后的样品在浓缩合并时要从较稀的样品管合并到较浓的样品管中，并用适量的水冲洗一下合并后的空样品管，以减少DNA的损失。

将实施例2所述方法纯化前后的样品（该样品DNA带有二甲氧基三苯甲基DMT保护基，并且在纯化的过程中最后将DMT保护基脱除后，最终得到目标DNA链）进行电泳实验，如附图3所示，可见经过纯化后的目的DNA以外的杂质核酸分子明显减少，具有较好纯化效果。

为了优化纯化效果，对步骤2活化柱子使用的Tris-HCl的条件进行优化，结果见表3。

表3Tris-HCl的条件进行优化实验

Tris-HCl溶液	0.2M	0.5M	1M
				pH=5	回收率51.3%	回收率52.7%	回收率51.6%
pH=7.5	回收率53.7%	回收率55.0%	回收率53.9%
				pH=8.5	回收率52.0%	回收率52.5%	回收率51.7%

另外，为了优化纯化效果，对步骤8使用CH₃CN/H₂O洗脱柱子的比例进行优化，结果见表4。

表4 CH₃CN/H₂O洗脱柱子的比例进行优化实验

H2O： CH3CN（V/V）	纯化后DNA回收率
		1:1	回收率54.1%
2:1	回收率53.9%
		3:1	回收率53.5%
3:1→1:1（各1ml 顺次洗脱柱子）	回收率54.2%
		3:1→2:1→1:1（各1ml顺次洗脱柱子）	回收率55.3%

此外，本实验还使用不同的碱性溶液进行第4步的优化反应，结果见表5。

表5碱性溶液洗脱优化实验

碱性溶液（pH）	纯化后DNA回收率
		氨水（pH=7.5）	回收率51.1%
浓氨水（pH=8.5）	回收率58.3%
		浓氨水（pH=9.5）	回收率59.5%
浓氨水（pH=10.5）	回收率56.6%
		碳酸氢钠	回收率35.3%

此外，本实验还使用不同的三氟乙酸浓度进行第6步的优化反应，结果见表6。

表6 三氟乙酸洗脱优化实验

三氟乙酸	纯化后DNA回收率
		2%	回收率58.7%
4%	回收率61.5%
		15%	回收率50.4%
25%	回收率43.3%

按照上述优化条件，步骤2中使用pH7.5 的0.5M Tris-HCl进行柱活化，步骤8中使用水和乙腈（v/v）3:1→2:1→1:1梯度洗脱的比例（每种比例的水和乙腈1ml，循环进行洗脱）。步骤4和6中分别使用pH=9.5的浓氨水，4%的三氟乙酸进行洗脱。将最终获得的纯化样品于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约1-3ml后转至合适大小西林瓶，进行冷冻干燥，即可得到纯度大于95.1%的纯化后寡聚核苷酸，回收率约为82.7%。

实施例3用denaturing PAGE割胶分离后，再用C18柱子脱盐进行样品分离纯化

具体操作步骤如下：

1、制胶：40mL 10% denaturing PAGE（Acr：Bis=19：1，7M Urea 1×TBE），130μLAPS，36μL TEMED，用宽梳子制胶（可以上大约600uL的样品）。

注意：制作厚胶板时各种试剂量按此比例增加。

2、约2h胶凝固后，装好胶架，加入上样缓冲液１×ＴＢＥ，用注射器吹一下胶孔（除去胶孔中的多余的Urea）。

3、500V预跑约1h。

4、预跑后再吹一下胶孔（除去胶孔中的Urea）。

5、样品浓缩至400uL左右+100uL（10%蔗糖与饱和Urea）(这是对于按200nmol投量时浓缩至400uL，其他投量浓缩量按此比例计算)，然后用干式恒温器将样品加热至９５℃２分钟，自然冷却至室温。

6、上样：将样品加到宽的上样槽中（注意不含溴酚蓝等指示剂的样品加样时要特别小心，不要加得太满以防止样品从上样槽中溢出）（之所以不加溴酚蓝等指示剂是为了割胶时不会将与他们迁移率相近的DNA同时割下，从而避免纯化后的DNA带有指示剂的颜色），然后在宽上样槽旁边的窄上样槽中加上溴酚蓝等指示剂，用来标记电泳的分离情况。

7、跑胶：500V （约4h30min，即溴酚蓝染料带跑到接近胶的低部，对不同长度的DNA链的电泳时间做适当调整）（１０％denature PAGE 色素迁移速率对应的DNA：溴酚兰=12mer二甲苯腈蓝FF=55mer）。

8、电泳结束后将PAGE胶小心地转移到塑料薄面上，并放到硅胶板上，然后用紫外灯（254nm）照射下割下所需条带（照射时间要短，避免损伤DNA）。

9、将所割下的胶放入10mL离心管里捣碎，加满水浸泡过夜（约12h）。

10、离心取上清液，再加满水浸泡5h,再次离心取上清液。

11、将两次上清液合并浓缩至4mL左右。

12、重复实施例1所述的C18脱盐过程。

样品在进行C18和PAGE纯化前要先除一下氨水（用浓缩仪大约抽30分钟）。C18柱子的流速要始终控制在约1-2滴/s（通过真空泵使其真空度控制在约2kPa左右从而控制流速）。纯化后的样品在浓缩合并时要从较稀的样品管合并到较浓的样品管中，并用适量的水冲洗一下合并后的空样品管，以减少DNA的损失。

将实施例3所述方法使用前后的样品进行电泳实验，如附图4所示，可见经过纯化后的目的DNA以外的杂核酸分子明显减少，具有很好的纯化效果，最终获得的纯化样品于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约1-3ml后转至合适大小西林瓶，进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.1%的纯化后寡聚核苷酸，回收率约为75.1%。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种带有5′-二甲氧基三苯甲基保护基DMT的寡聚核苷酸的纯化方法，包括以下步骤：

b、用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液Tris-HCl活化柱子，所述Tris-HCl的浓度为0.5M，pH为7.5；

c、上样；

d、以浓氨水溶液为A相、去离子水为B相、三氟乙酸TFA水溶液为C相，按照A相-B相-C相-B相的先后顺序进行洗脱纯化，其中，C％为4％，A相的pH为9.5；

e、用水和乙腈为洗脱液对固相进行梯度洗脱；所述梯度洗脱，是用水和乙腈梯度洗脱的比例依次为：3:1→2:1→1:1，每种比例的水和乙腈1ml，循环进行洗脱；

f、收集目标寡聚核苷酸溶液。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述的步骤a中作为流动相的乙腈和水的体积比为100∶0，使用的5ml乙腈在不使用真空泵的条件下冲洗柱子。