JPS604174A - 核酸塩基およびヌクレオシドとヌクレオチドの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、核酸塩基およびヌクレオシドとヌクレオチド
の分離方法に関するものである。

更ニ詳しくは、エポキシ基を含む多孔性ゲルに核酸塩基
を結合せしめた多孔性ゲルを用い、最初に水で処理し、
続いてアンモニア水で処理する事からなる核酸塩ｉお−
よびヌクレオシドとヌクレオチドの分離方法を提供する
ものである。

ヌクレオチドは合成りＮＡ、ＲＮＡの原料となるばかシ
でなく、医薬品の中間体として極めて重要な化合物であ
シ、最近ではそれらの化合物の需要は特に多くなってい
る。

しかし、一方では使用する条件が高度化すればするほど
純度も高品質のものが要求されてくる。

従って、効率よくしかも高品質でヌクレオチド化合物を
それらの前駆体である核酸塩基およびヌクレオシド化合
物から分離できるならばその工業的意義は大きい。

一般に、核酸塩基およびその関連化合物の分離はイオン
交換クロマトグラフィーによシ実施されてきた。この方
法では、溶出液ｐＨ，塩濃度により溶出挙動が非常に影
響を受ける。

これらの手段を分離方法に使用するためには、さらに大
きな問題点がある。

１）イオン交換の場合は分離物中に塩を含有するため、
さらに透析等で塩を除去する必要がある。しかし、これ
らの方法でも完全に塩を除去する事は困難である。

２）この方法は、その手段をイオン交換で行っているた
め、大量に処理し、分離することが不可能である。

そこで、本発明者はこれらの種々の問題点を解決するた
め、鋭意検討を続けてきた結果、エポキシ基を含む多孔
性ゲルに核酸塩基を結合せしめた多孔性ゲルを用いて、
最初に水で処理し、続いてアンモニア水で処理すれば、
極めて効率よくしかも高品質でヌクレオチドを分離する
ことに成功し、本発明を達成した。

即ち、本発明の方法は溶出溶媒に水とアンモニア水のみ
で行う事ができるため、系中に塩等の不純物を全く含有
しない。従って、透析等の操作も不要である。

一方、効率（多量処理）については実施例１で示した様
に水で処理すると核酸塩基とヌクレオシドは溶出してく
るけれども、ヌクレオチドは全く溶出してこない。しか
し、アンモニア水で処理するとゲル中のヌクレオチドが
溶出する。従って、これらの現象を利用すれは核酸塩基
およびヌクレオシドとヌクレオチドを大量に分離精製す
ることが可能である。

本発明の中で使用できる核酸塩基含有の多孔性ゲルとし
ては、エポキシ基を含む有機系、無機系ゲル担体に核酸
塩基を含有したものであればよい。

多孔性ゲルとしては、有機系ゲルとして脂肪族又は芳香
族系ゲルでグリシジルメタクリレート、グリシジルアク
リレート、グリシジルアリルエーテル、１．２−エボキ
シスデレン等のエポキシ基含有モノマーの単独重合体ま
たは共重合体で更にこれらとスチレン、α−メチルスチ
レン等の置換スチレン；アクリル酸あるいはメタアクリ
ル酸およびそれらのエステル類：アクリロニトリルある
いはメタアクリロニトリル等の置換アク１ルロニトリル
等の単量体との共重合体、またはこれらと架橋剤として
通常知られているもの、たとえば、ジピニノバンゼイ、
エチレングリコールジメタまたはアクリレートのように
不飽和基を２個以上含む単量体を少なくとも一種以上含
む共重合体からなる多孔性のゲルをあげることができる
。またデキストランの如き天然物にエポキシ基を含有さ
せたものでもよい。

また、無機系ゲルとしては上記のようなエポキシ基を含
むモノマーをシリカゲル、アルミナ等にグラフトさせた
重合体も使用できる。

使用されるゲルの孔の大きさは１μｍ以下、好ましくは
１０〜２０００　Ａ、更に好ましくは５０〜５００Ａの
もので、架橋密度は５〜３０モルチ、ゲルの大きさは２
〜２００μｍ１好ましくは５〜５０μｍである。

一方、反応に使用される核酸塩基およびその関連化合物
としては、アデニン、グアニン、チミン。

ウラシル、シトシン、テオフィリン、ヒポキサンチン、
６−メルカプトプリン、５−ハロピリミジン等をあげる
ことができる。

きわめて簡単であって、種々の溶媒中で多孔性ゲルと核
酸塩基および／またはその関連化合物を加熱反応すれば
よい。この場合、使用できうる溶媒としては、Ｎ、Ｎ−
ジメチルホルムアミド、Ｎ。

Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルスルホキ
シドなどの極性溶媒の単独および二種以上の混合溶媒が
ある。

このゲルの製法の一例としては、特公昭５５−１５９９
７号の記載の方法で製造すればよい。

即ち、架橋化した多孔性ポリグリシジルメタクリレート
（ポアーサイズ、１００＾）ゲルに溶媒、たとえばＮ、
Ｎ−ジメチルホルムアミド中で核酸塩基を反応させた核
酸塩基含有の多孔性ゲルである。アンモニア水としては
１ＯＮ−［ＬＯＯＩＮの範囲の濃度を使用すればよい。

以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ アデニル酸をアデニンおよびアデノシンの混合物から、
架橋した多孔性ポリグリシジルメタクリレート（ボアー
サイズ、１００Ｎ）にチミンを結合させたゲル（チミン
含有量２０　ｍｏ１９１ｔ　）を用いて次の条件で分離
した。

１）分離条件 ａ）　装　置；　ｒＨＬｃ−８０２ＵＪ　（商品名庫洋
曹達工業株式会社製液体クロマトグラフィ） ｂ）検出器：紫外線吸収検出器（２５４ｎｓ）Ｃ）溶　
媒；水、アンモニア水（０，０１Ｎ）ｄ）圧損：２０Ｉ
ｃ９／ｃ！ ｅ）温度：２５℃ ｆ）流速；　３．５　ｍｌ／ｍｔｎ ｇ）カラムサイズ：長さ２フイート、内径　（Ｌ３１イ
ンチ２）分離方法 最初に水を溶媒に用いると、アデノシン。

アデニンが溶出し、アデニル酸は溶出しなかった。

そこで、１２０分後に［ＬＯＩＮのアンモニア水で処理
すると、２分後にアデニル酸が溶出した。結果は図−１
に示した。

極めて効果的に分離できることがわかる。

実施例２〜５ 次の系を実施例１と同様の方法で分離した。

実施例２　チミジル酸、チミン、チミジン結果は図−２
に示した。

実施例３　グアニル酸、グアニン、グアノシン結果は図
−３に示した。

実施例４　シチジル酸、シトシン、シチジン結果は図−
４に示した。

実施例５　ウリジル酸、ウラフル、ウリジン結果は図−
５に示した。

実施例６ 実施例１の中で使用したゲルを下記のゲルに変えて、実
施例１と同様の条件、方法でチミジル酸をチミン、およ
びチミジンから分離した。

使用ゲル；架橋した多孔性ポリグリシジルメタクリレー
ト（ボアーサイズ、１００χ）にアデニンを結合させた
ゲル（アデ ニン含有量１８　ｍｏ１％　） 結果は図−６に示した。

【図面の簡単な説明】

図−１はアデニル酸の分離のクロマトグラム。 図−２はチミジル酸の分離のクロマ・トゲラム。 図−３はグアニル酸の分離のクロマ・トゲラム。 図−４はシチジル酸の分離のクロマトグラム。 図−５はウリジル酸の分離のクロマトグラム。 図−６はチミジル酸の分離のクロマ・トゲラム。 を示す。 １、　アデノシン　Ｚ　アデニン　五　アデニル酸４、
　チミジン　５　チミン　＆　チミジル酸ｌ　グアノシ
ン　ａ　グアニン　９　グアニル酸１α　シチジン　１
ｔ　シトシン　１ｚ　シチジル酸１五　ウリジン　１４
．ウラシル　１５．ウリジル酸特許出願人　東洋曹達工
業株式会社 ←ＮＨ，ＯＴ　ｌＴ１０ ３　２　１ 溶出時間（分） 図１ ４−ＮＩＴ、、０ＨＩＩ２０ ６　５４ 溶出時間（分） 図２ ←ＮＨ４０１１１ｑ２ｃ＋　＝−う− ９８７ 溶出時間（分） 図３ ←ＮＩ＋、、ＯＨ１１２０−一一一一一一−→１２　＋
１１０ 溶出時間（分） 図４ ←Ｎ　ｎ４０８　ｍｈｏ　−一力 溶出時間（分） 図５ ４−　Ｎｌ＋４０＋（１１２０−一一一一一７６　５　
４

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　エポキシ基を含む多孔性ゲルに核酸塩基を結合
   させた多孔性ゲルを用いて、最初に水で処理したのち、
   続いてアンモニア水で処理することから成る核酸塩基お
   よびヌクレオシドとヌクレオチドの分離方法。
2. （２）アンモニア水として、１ＯＮないし３．００１　
   Ｎの範囲の濃度を使用する特許請求の範囲第１項記載の
   方法。