CN116590278B - 一种基于原位裂解和脉冲凝胶电泳相结合的叶绿体环状基因组的提取方法 - Google Patents
一种基于原位裂解和脉冲凝胶电泳相结合的叶绿体环状基因组的提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于原位裂解和脉冲凝胶电泳相结合的叶绿体环状基因组的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）待提取作物的预处理，得到用于叶绿体细胞器提取的叶片；（2）将叶片快速浸入ET‑M‑D体系中10~20min，用W5‑3溶液清洗三次后，通过等差离心法和密度梯度离心法去除杂物，得到叶绿体粗提溶液；所述ET‑M‑D体系包括以下终浓度的成分：0.6M甘露醇，0.05MMES，0.03MTris和75%的乙醇；（3）使用叶绿体粗提溶液构建叶绿体细胞器包埋胶栓；（4）Et‑S裂解液结合NDS‑1体系裂解胶栓中的叶绿体细胞器；（5）通过脉冲场凝胶电泳分离纯化叶绿体基因组；（6）电洗脱回收叶绿体环状基因组；（7）利用RecBCDase体系清除电洗脱步骤中产生的断裂核酸片段。本发明所述方法可提取高纯度的Cir‑cpDNA。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种基于原位裂解和脉冲凝胶电泳法的叶绿体环状基因组的提取方法。
背景技术
叶绿体是绿色植物细胞中进行光合作用的重要细胞器，自身拥有相对独立的遗传物质，即叶绿体DNA(cpDNA)。目前cpDNA的提取方法主要包括离心法和原位裂解-脉冲凝胶电泳法(In situ lysis-PFGE)。
1957年Meselson提出了一种观察氯化铯(CsCl)密度梯度中噬菌体DNA平衡分布的新方法，该密度梯度是由氯化铯在恒定离心场作用下沉降建立的，即离心法。1963年EdwardH.L.C根据Jgentorf(1957)和Marmur(1961)的实验方法从菠菜和甜菜叶中分离出细胞DNA后，通过CsCl密度梯度超离心分离出cpDNA(minor DNA components)。同年，Ruth S与人合著了一项研究，从绿衣藻(green agla chlamydomonas)中分离出一系列非核染色体突变体材料，这表明存在广泛的非染色体遗传系统，在分离出相对完整的叶绿体后，用CsCl密度梯度超离心力提取cpDNA并对cpDNA的浮力密度和碱基组成进行表征。1966年Tewari.K.K通过非连续蔗糖梯度离心法分离出烟草叶绿体(由山梨醇溶液，一种简单的均质化渗透，分离出包膜完整的叶绿体，最初由Walker在1964年进行了试验，确定其烟草叶绿体中分离到的cpDNA为单一组分且在CsCl密度梯度的浮密度为1.702(1965年由Shipp W.S首次报道了CsCl中cpDNA的浮密度为1.703)。Pertoft H在1977年使用percoll(一种改性的胶体二氧化硅)作为一种新的梯度材料分离细胞和细胞器，而用于分离叶绿体的percoll密度梯度在近4年后(1981年)由Mouiuoux G和Cline K首次测试。1987年，Pay A和A.Smith M尝试用“Self-generated Percoll gradients”分离粗叶绿体并将从中回收的叶绿体用含有2％的sarkosyl和50μg/ml的蛋白酶K(Proteinase K)的NET缓冲液进行裂解，提取其cpDNA。
因此，自20世纪60年代后期的开创性工作以来，通过离心法制备完整叶绿体用于cpDNA提取的方法得到广泛应用，为广泛的叶绿体基因组表征研究和蛋白质研究等铺平了道路。
1984年David C.S和Charles F.C开发了一种琼脂糖凝胶电泳系统：“脉冲场凝胶电泳(PFGE)”和“凝胶插入块(gel Insert)”，是一种将含有裸露DNA(未断裂DNA链)的“凝胶插入块(gel Insert)”包埋入凝胶后分离高分子量和具高分辨率的DNA分子研究技术。它是一种新型的凝胶电泳，可分离高达2000kb的DNA分子，其分辨率超过了传统电泳对分子量(logarithmic molecular weight)的依赖性。同年晚些时候，荷兰癌症研究所分子生物学部门的Lex H.T.V通过脉冲场梯度凝胶电泳(Pulsed field gradient gelelectrophoresis)对427株布鲁氏锥虫的染色体大小的DNA分子进行了分离--由此可见，对于专注于大片段DNA(Mb)研究人员来说，这项技术是非常紧迫和重要的。
PFGE技术在1990-1991年开始应用于观察cpDNA分子结构的研究领域，当时Bendich AJ和Smith S b使用的是“In situ lysis-PFGE”结合引物探针的方法。但据文献资料显示，1989年Xing-wang D的研究首次对cpDNA分子结构进行了“In situ lysis-PFGE”方法的探索。与此之外，1995年由Hong-bing Z提出的“In situ lysis-PFGE”(原位裂解和脉冲凝胶电泳法，insitu lysis-PFGE)从植物细胞中提取高分子量(HMW)的nuDNA，该新方案的目的之一是降低作为污染物的cpDNA含量。Steffen B的结果(1995)支持了当时的一个普遍共识，即质体DNA(ptDNA)作为基因组大小的圆形分子存在于细胞器中，同时“In situlysis-PFGE”作为一种高效的细胞器基因组分子结构领域的研究方法，得到了较为系统的描述和改进。
自20世纪末以来，“密度梯度离心”和“In situ lysis-PFGE”糅合发展成为叶绿体分离和cpDNA分子结构研究的主流途径，已成为此领域的实验生物技术的基础。其提取叶绿体和研究cpDNA分子结构主要演变为三个基本步骤：从叶片组织中分离叶绿体，叶绿体的裂解，cpDNA的纯化。
然而，现有的制备方法中仍存在操作步骤复杂，提取纯度低的缺陷。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种叶绿体环状基因组的提取方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于原位裂解和脉冲凝胶电泳相结合的叶绿体环状基因组的提取方法，包括以下步骤：
(1)待提取作物的预处理，得到用于叶绿体细胞器提取的叶片；
(2)将叶片快速浸入ET-M-D体系中15min，用W5-3溶液清洗三次后，通过等差离心法和密度梯度离心法去除杂物，得到叶绿体粗提溶液；所述ET-M-D体系包括0.6M甘露醇，0.05MMES，0.03MTris和75％ V/V的乙醇；
(3)使用叶绿体粗提溶液构建叶绿体细胞器包埋胶栓；
(4)裂解胶栓中的叶绿体细胞器；
(5)通过脉冲凝胶电泳分离纯化叶绿体基因组；
(6)电洗脱回收叶绿体环状基因组；
(7)利用RecBCDase体系清除电洗脱步骤中产生的断裂核酸片段。
进一步地，步骤(1)中所述作物包括大豆、大麦、小麦、玉米。
进一步地，步骤(1)的预处理具体步骤包括：待作物种子萌发3-3.5天后，将幼苗移至霍格兰营养液内水培，在光照条件下25～30℃/70％湿度培养12～14h，在黑暗条件下23～25℃/70％湿度培养10～14h，光照和黑暗交替循环培养，每隔7天更换霍格兰营养液，直至叶片呈现微黄色的叶绿体饥饿状态。
进一步地，步骤(2)中所述的W5-3溶液包括以下终浓度的成分：0.1MNaCl，0.15MCaCl2，0.005MKCl，0.0015MMES，0.1MTris，0.05MEDTA·Na2。
进一步地，步骤(4)的具体步骤包括：使用Et-S裂解液在35℃条件下孵育叶绿体细胞器包埋胶栓2.5h，期间每隔30min更换一次Et-S裂解液；在冰水浴的条件下，使用pK溶液孵育叶绿体细胞器包埋胶栓3h，期间每隔30min更换一次pK溶液；在冰水浴的条件下，使用NDS-1体系孵育叶绿体细胞器包埋胶栓10h，待NDS-1体系恢复至室温后在50℃水浴锅中继续孵育9min，移除NDS-1体系。
进一步地，所述Et-S裂解液包括以下终浓度的成分：0.25MNaCl，0.05MMES，0.03MTris，0.5％(W/V)SDS，0.4％(V/V)Tween 20，40％(V/V)乙醇。其中，W/V为g/mL比，V/V为体积比。
进一步地，所述用NDS-1体系包括以下终浓度的成分：0.1MTris，0.05MEDTA，0.5％(W/V)SDS，20mM亚精胺，2mg/mL蛋白酶K，1mMCaCl2。
进一步地，步骤(6)中回收载体选用D-tube透析管。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：1、本发明利用原位裂解技术，脉冲凝胶电泳技术，电洗脱技术和酶切技术相结合，构建了一种新的叶绿体环状基因组提取技术流程，能够同时满足叶绿体环状基因组的提取和纯化，在质基因组研究中具有非常重要的意义。2、本发明通过优化作物培养条件来降低叶绿体细胞器中淀粉等碳水化合物的积累，有效的降低了叶绿体细胞器在离心和包埋过程中的破裂，提高了叶绿体细胞器胶栓的包埋质量。3、本发明通过优化取样条件和原位裂解两个核心步骤，原创性的研发了用以失活细胞蛋白为主的ET-M-D体系(防止提取过程中核酸酶对DNA的酶解)和叶绿体细胞器胶栓裂解中的Et-S裂解液两个体系，同时优化了cpDNA释放体系NDS-1，有效的提高了胶栓中叶绿体细胞器的裂解质量和Cir-cpDNA含量。4、选用电洗脱技术回收叶绿体基因组，以D-tube透析管作为核酸回收载体。有效的降低了回收过程中的叶绿体环状基因组的物理断裂，提高了回收质量。5、本发明利用RecBCDase的酶切特性，消除电洗脱回收液中的非环状cpDNA杂链，使提取的叶绿体环状基因组纯度更高。
附图说明
图1为本发明提取方法流程图；
图2为大豆叶片取样示意图；其中，红的箭头表示适宜取样叶片；黑色箭头表示幼龄叶片；蓝色箭头表示老龄叶片；
图3为大豆提取叶绿体时非连续蔗糖密度梯度纯化叶绿体细胞器图示；
图4为大豆提取叶绿体的光学显微镜镜检结果图；黑色箭头表示细胞，红色箭头表示叶绿体；
图5为大豆提取叶绿体包埋胶栓效果图；黑色箭头表示不含叶绿体的琼脂糖凝胶，红色箭头表示含叶绿体的琼脂糖凝胶；
图6为Et-S裂解液裂解大豆叶绿体包埋胶栓效果图；黑色箭头指向裂解后空白胶栓(+CK)，红色箭头指向未裂解的叶绿体包埋胶栓(-CK)，蓝色箭头指向裂解2.5h后的叶绿体包埋胶栓；
图7为PFGE电泳分离纯化大豆叶绿体基因组结果图；泳道A/B为DNAladder，泳道C/G为裂解的空白胶栓(CK-1)，泳道D/E/F为裂解的叶绿体包埋胶栓，泳道H/L/M未裂解的叶绿体包埋胶栓(CK-2)；
图8为提取大豆叶绿体基因组时切取分离纯化后目的条带(Cir-cpDNA)；泳道A/B/C为PFGE电泳后进行侵泡法(EB核酸染料)染色；黑色箭头指向未染色目的条带；
图9为电洗脱示意图；
图10大豆叶绿体参考基因组(A)及提取的Cir-cpDNA的RCR鉴定(B)；其中，泳道1和20分别为DL5000 DNA Marker和DL 2000DNA Marker，泳道2和3分别为细胞基因组和提取的Cir-cpDNA的ACT4引物的PCR扩增，泳道4和5分别为细胞基因组和提取的Cir-cpDNA的Gy-mt-4引物的PCR扩增，泳道6至19分别为提取的Cir-cpDNA的Gy-cp引物系列的PCR扩增；
图11Et-S裂解液裂解时间梯度筛选。泳道A到F分别为：A 0.5h，B 1h，C 1.5h，D2h，E 2.5h，F 3h。泳道G和H为+CK，裂解液裂解DH5α(E.coli)。泳道I为-CK，裂解液裂解空白胶栓；
图12为其它作物及其Cir-cpDNA提取；其中A编号指代大麦及其Cir-cpDNA，B编号指代小麦及其Cir-cpDNA，C编号指代玉米及其Cir-cpDNA，D编号指代大豆的Cir-cpDNA。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1大豆Cir-cpDNA的提取
(1)特定培养环境下样品处理
蛭石培育大豆种子萌发后，待双子叶生长发育呈现绿色(3-3.5天)，剔除蛭石清洗幼苗，移取幼苗至霍格兰营养液中进行水培。将水培幼苗移至植物光照培养箱，设定培养条件为光照(欧司朗L85 W/25通用白色荧光灯)14h/25℃/70％湿度，黑暗10h/21℃/70％湿度，每隔7天更换霍格兰营养液，促使植物叶片处于饥饿状态细胞，使其叶绿体贮藏极少的碳水化合物。适宜取样的叶绿体饥饿状态为叶片呈现微黄色(图2)。
(2)等差离心法提取叶绿体细胞器
(2.1)将采取的新鲜叶片10g快速浸入100mL ET-M-D体系(表1)中15min后，用50mLW5-3溶液清洗三次。
表1ET-M-D体系
注：由于甘露醇难溶与酒精，所以先将甘露醇，MES(吗啉乙磺酸)，Tris溶解到水中，调节pH＝6.5后用分析纯酒精定容至酒精占比为75％，现配现用。
(2.2)将步骤(2.1)处理后的叶片在50mL W5-3溶液(原生质体提取液，表2)中剪碎后，研磨至粘稠，用50mL W5-3溶液调节粘液至浑浊。
表2W5-3溶液
注：以水作为溶剂，调节pH＝7.5，高温灭菌后至室温，冰上预冷。
(2.3)100mm尼龙纱布除杂过滤后，用W5-3溶液定容至300mL，离心(100g/5min)后移取上层液，离心(500g/10min)移取上层液，再次离心(1200g/30min)移除上层液，取沉淀。用50mL W5-3溶液轻柔的溶解沉淀，离心(1200g/30min)，移除上层液取沉淀。用20mL W5-3溶液轻柔的溶解沉淀后置于配置好的非连续蔗糖密度梯度上，离心(10000g/1h/4℃)(图3)，吸取中间层(B中箭头指向部分)叶绿体细胞器后用W5-3溶液定容至30mL，离心(2000g/20min/4℃)移除上层液并用光学显微镜检测叶绿体细胞器完整性，镜检结果表明，叶绿体细胞器呈现完整(图4)。
(2.4)用5mM Tris-HCl溶解沉淀后调节至叶绿体浓度为2.5x107/ml。
注意：步骤2.1中新鲜叶片现取现用，切勿超低温处理或保存(例如液氮速冻、-20℃贮藏等)。步骤2.2中研钵预冷后在冰上进行研磨或用研磨机进行研磨5min(1800R/min/4℃)。步骤2.3中离心机预冷至4℃。步骤2.4中5mM Tris-HCl的pH值为7.5(pH值大于8.0直接降低Cir-cpDNA的裂解质量)，冰上预冷。需用毛刷轻柔促使叶绿体粗沉淀溶解，或将加入5mM Tris-HCl的离心管在冰上上下搓动，促进沉淀溶解，切勿剧烈混匀，如振荡器震荡，剧烈摇晃等。
(3)构建叶绿体细胞器包埋胶栓
(3.1)提前预制2％低熔点琼脂糖凝胶，置于45℃水浴锅中待用。将制胶模具清洗干净，室温待用。
(3.2)将步骤(2.4)中待用的粗叶绿体细胞器溶液迅速插入45℃水浴锅中孵育25～30s。
(3.3)将等体积的2％琼脂糖凝胶迅速且轻柔的加入到预热的叶绿体细胞器溶液中，快速轻柔混匀。
(3.4)移液管轻柔吸取琼脂糖凝胶和粗叶绿体细胞器溶液的混合液，轻柔注入制胶模具中，4℃/30min凝固(图5)。
注意：步骤3.1中2％琼脂糖凝胶由10mM Tris-HCl(pH＝8.0)的溶液作为溶剂。制胶模具选用200μL(7.8mm直径和4.5mm高)，用以更大量包埋叶绿体细胞器。步骤3.2中将冰上待用的粗叶绿体溶液迅速插入45℃水浴锅中预热，目的是使粗叶绿体溶液温度上升到适宜与琼脂糖凝胶混匀。孵育时间过短会导致凝固时未混匀，孵育时间过长会导致叶绿体细胞壁高温破裂，均影响胶栓包埋质量。步骤3.3中凝胶与叶绿体细胞器溶液混匀过程中，凝胶加入时需轻柔且快速，加入后可缓慢上下颠倒3-4次进行混匀，防止产生气泡。步骤3.4中凝胶与叶绿体细胞器溶液混匀后，迅速且轻柔的用移液管移取混合液进行注模，同时防止注模过程中产生气泡。所述步骤3.2、3.3、3.4均影响叶绿体细胞器包埋质量，且所需实验技巧娴熟和操作流畅。
(4)特定裂解液裂解胶栓中叶绿体细胞器
(4.1)在35℃水浴锅中用50mL Et-S裂解液(表3)浸泡孵育叶绿体细胞器包埋胶栓2.5h(图6)，期间每隔30min更换一次等量的Et-S裂解液。
(4.2)在冰水中50mLpK溶液(表4)浸泡孵育叶绿体胶栓3h，期间每隔30min更换一次等量的pK溶液。
(4.3)在冰水中50mL NDS-1体系(表5)浸泡孵育叶绿体胶栓10h，恢复NDS-1体系至室温后在50℃水浴锅中孵育9min，快速移除NDS-1体系，用冰上预冷的50mL 0.5x TBE溶液浸泡胶栓待用。
表3Et-S裂解液
注：由于SDS难溶与酒精，所以先将NaCl，MES，Tris溶解到水中，在加入SDS和Tween20，调节pH＝7.5后用分析纯酒精定容至酒精占比40％，现配现用。
表4pK溶液
注：pH＝7.5，高温灭菌后至室温，冰上预冷。孵育期间可轻柔摇晃。
表5NDS-1体系
注：配置无亚精胺母液，过滤除菌后-20℃保存，在裂解时现溶亚精胺，pH＝7.5。
注意：步骤4.1中Et-S裂解液孵育后，叶绿体胶栓颜色由绿色渐变为浅绿色或淡黄色(图6)。步骤4.2中pK溶液孵育期间可轻柔摇晃，叶绿体胶栓表现为由漂浮渐变为沉底状态即可。
(5)脉冲凝胶电泳分离纯化叶绿体基因组
(5.1)预制1％低熔点琼脂糖凝胶(LMP)进行胶栓中叶绿体基因组的PFGE分离纯化。
(5.2)凝固后切取适宜大小的胶孔，将叶绿体包埋胶栓置于胶孔中，滴加0.5％低熔点琼脂糖凝胶封口。
(5.3)将封口后的凝胶板按照脉冲凝胶电泳仪的操作说明上机，设定电泳参数(Reverse Voltage Gradient:6V/cm,Int.Sw.Tm:60s,Fin.Sw.Tm:90s,Included angle:120°,Run Time:15h,Ramping factor:a＝:ENTER；图7)。
(5.4)电泳完成后，割胶染色进行电泳结果鉴定(图8)。
注意：步骤5.1中1％低熔点琼脂糖凝胶由0.5x TBE作为溶剂，不添加核酸染料。可胶栓裂解完成前30min进行制胶。步骤5.2中注意0.5％低熔点凝胶封口时不要产生气泡。步骤5.3在电泳槽中0.5x TBE预冷至15℃，流速调整至50R。步骤5.4中电泳完成后，切取需要鉴定裂解质量和/或确定叶绿体环状基因组电泳条带的凝胶区域进行染色(图8，左胶块)。其余区域不进行染色处理，防止核酸染料对核酸长链的损伤。
(6)电洗脱回收叶绿体环状基因组
(6.1)依据叶绿体环状基因组电泳条带染色位点，等位切取包含叶绿体环状基因组未染色凝胶块(图8，右胶块)。
(6.2)将未染色凝胶块置于预湿的D-Tube管中采用电泳液进行电洗脱(图9)，所述电泳液为冰上预冷的5mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液，电洗脱条件为90V/45min。
(6.3)快速移除D-Tube中凝胶后反向电泳90v/90s，轻柔移取D-Tube管中液体700μL(电洗脱液)至1.5mL离心管中；
(6.4)用糖原提取电洗脱液中叶绿体基因组(表6)，超纯水溶解糖原沉淀颗粒，调节核酸浓度为20ng/μL，冰上待用。
表6糖原提取Cir-cpDNA
注：依次按照表中顺序添加试剂至电洗脱溶液中。
注意：步骤6.2中保持电洗脱过程中电泳液低温。步骤6.3在电洗脱完成后，反向电泳使附着于D-Tube透析膜内侧的核酸电洗到管中液体。步骤6.4轻柔混匀(切勿吸打等剧烈混匀操作)，-20℃静置3h(或过夜)，在预冷至4℃的超高速离心机上进行16000g/20min离心，移除液体，加入冰上预冷的75％酒精，18000g/20min离心，移除液体(切勿有液体残留)，室温晾干(约10min，不可长时间晾干)后加入超纯水溶析。
(7)RecBCDase体系清除电洗脱步骤中产生的断裂核酸片段
(7.1)构建RecDBDase体系(表7)并孵育处理(37℃/10h，70℃/30min)用以清除电洗脱步骤中产生的非环状核酸片段。
表7RecBCDase体系
注：将60μL体系分成10μL×6后构建孵育条件为：37℃/10h，70℃/30min。所述RecBCDase体系采购自BioLabs，货号为M0345S。
表8大豆叶绿体基因组鉴定引物
注：ACT4和Gy-mt-4分别为大豆核基因组和线粒体基因组特异性引物，Gy-cp-1到Gy-cp-14为大豆叶绿体基因组鉴定引物。
(7.2)参考大豆叶绿体基因组序列(NCBI GEO：NC_007942)，设计叶绿体基因组鉴定引物14对，结合对照引物(核基因组特异性引物ACT4和线粒体基因组特异性引物Gy-mt-4)，共计16对引物(表8)进行常规PCR扩增后电泳鉴定(图10B)，泳道1和20分别为DL5000DNA Marker和DL 2000DNA Marker，泳道2和3分别为细胞基因组和提取的Cir-cpDNA的ACT4引物的PCR扩增，泳道4和5分别为细胞基因组和提取的Cir-cpDNA的Gy-mt-4引物的PCR扩增，泳道6至19分别为提取的Cir-cpDNA的Gy-cp引物系列的PCR扩增，Gy-cp系列引物的扩增目的条带均用箭头进行指向，同时进行测序分析(包含对非目的扩增条带Gy-cp-11(382bp)和Gy-cp-14(1706bp和692bp)的测序分析)，并比对到大豆叶绿体参考基因组中(图10A)，验证结果表明，Cir-cpDNA中不包含核基因组和线粒体基因组杂质。检测后将其余同批次进行-20℃贮藏。
(7.3)电洗脱大豆Cir-cpDNA后进行RecBCDase体系纯化，测定其Cir-cpDNA浓度可达632.8ng/μL。ddH2O稀释核酸浓度至20ng/μL后，-20℃贮藏备用。
依据参考文献(Doi:10.3390/plants8120606)中“Materials and Methods”阐述的cpDNA的提取方法，逐步提取大豆cpDNA(仅步骤(1)与本实施例相同，其余步骤为文献中步骤)并进行核酸浓度检测。作为本发明申请项的对比例，获得cpDNA浓度为43.3ng/μL。
实施例2Et-S裂解液裂解时间梯度筛选
(1)～(3)步骤同实施例1。
(4)步骤(4.1)特定裂解液裂解胶栓中叶绿体细胞器。在35℃水浴锅中用Et-S裂解液孵育叶绿体细胞器包埋胶栓，构建Et-S裂解液的裂解时间梯度(0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h)，期间每隔30min更换一次体系。步骤(4.2)，(4.3)同实施例1。
(5)～(7)步骤同实施例1。根据电泳鉴定裂解效果，如图11所示。泳道A到F分别为：A0.5h，B 1h，C 1.5h，D 2h，E 2.5h，F 3h。泳道G和H为+CK，裂解液裂解DH5α(E.coli)。泳道I为-CK，裂解液裂解空白胶栓。实验结果表明，泳道E结果最为清晰，所以Et-S裂解液适宜裂解时间为2.5h。
实施例3大麦Cir-cpDNA提取
(1)特定培养环境下样品处理
大麦(单子叶)叶绿体基因组单倍型诱导步骤同实施例1步骤(1)，变更培养条件为：光照(欧司朗L85 W/25通用白色荧光灯)14h/28℃/70％湿度，黑暗10h/25℃/70％湿度。适宜取样的叶绿体饥饿状态为图12。
(2)等差离心法提取叶绿体细胞器
大麦叶绿体提取步骤同实施例1步骤(2)，其不同点为：步骤(2.1)中ET-M-D体系处理时长变更为20min；步骤(2.3)中离心条件变更为1500g/30min。
(3)～(6)同实施例1。
(7)步骤(7.1)RecBCDase体系除杂步骤同实施例1。
(7.2)参考大麦叶绿体基因组序列(NCBI GEO：NC_056985)，设计叶绿体基因组鉴定引物(表9)进行常规PCR扩增后电泳鉴定及比对，检测后将其余同批次进行-20℃贮藏。
表9大麦叶绿体基因组鉴定引物
实施例4小麦Cir-cpDNA提取
(1)特定培养环境下样品处理
小麦(单子叶)叶绿体基因组单倍型诱导步骤同实施例1步骤(1)，变更培养条件为：光照(欧司朗L85 W/25通用白色荧光灯)14h/28℃/70％湿度，黑暗10h/25℃/70％湿度。适宜取样的叶绿体饥饿状态为图12。
(2)等差离心法提取叶绿体细胞器
小麦叶绿体提取步骤同实施例1步骤(2)，其不同点为：步骤(2.1)中ET-M-D体系处理时长变更为20min；步骤(2.3)中离心条件变更为1500g/30min。
(3)～(6)同实施例1。
(7)步骤(7.1)RecBCDase体系除杂步骤同实施例1。
(7.2)参考小麦叶绿体基因组序列(NCBI GEO：NC_002762)，设计叶绿体基因组鉴定引物(表10)进行常规PCR扩增后电泳鉴定及比对，检测后将其余同批次进行-20℃贮藏。
表10小麦叶绿体基因组鉴定引物
实施例5玉米Cir-cpDNA提取
(1)特定培养环境下样品处理
玉米(单子叶)叶绿体基因组单倍型诱导步骤同实施例1步骤(1)，变更培养条件为：光照(欧司朗L85 W/25通用白色荧光灯)12h/30℃/70％湿度，黑暗12h/23℃/70％湿度。适宜取样的叶绿体饥饿状态为图12。
(2)等差离心法提取叶绿体细胞器
玉米叶绿体提取步骤同2.2.1步骤(2)，其不同点为：步骤(2.1)中ET-M-D体系处理时长变更为10min；步骤(2.3)中离心条件变更为1500g/30min。
(3)～(6)同实施例1。
(7)步骤(7.1)参考玉米叶绿体基因组序列(NCBI GEO：NC_001666)，设计叶绿体基因组鉴定引物(表11)进行常规PCR扩增后电泳鉴定及比对，检测后将其余同批次进行-20℃贮藏。
表11玉米叶绿体基因组鉴定引物
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Claims (4)
1.一种基于原位裂解和脉冲凝胶电泳相结合的叶绿体环状基因组的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）待提取作物的预处理，得到用于叶绿体细胞器提取的叶片；
（2）将叶片快速浸入ET-M-D 体系中10~20min，用W5-3 溶液清洗三次后，通过等差离心法和密度梯度离心法去除杂物，得到叶绿体粗提溶液；所述ET-M-D 体系包括以下终浓度的成分：0.6M甘露醇、0.05M MES、0.03M Tris和75% V/V乙醇；
所述的W5-3溶液包括以下终浓度的成分：0.1MNaCl，0.15MCaCl2，0.005MKCl，0.0015MMES，0.1MTris，0.05MEDTA·Na2；
（3）使用叶绿体粗提溶液构建叶绿体细胞器包埋胶栓；
（4）裂解胶栓中的叶绿体细胞器；
具体步骤包括：使用Et-S 裂解液在35℃条件下孵育叶绿体细胞器包埋胶栓 2.5h，期间每隔 30min 更换一次Et-S 裂解液；然后在冰水浴的条件下，使用pK 溶液孵育叶绿体细胞器包埋胶栓3h，期间每隔30min 更换一次 pK 溶液；然后在冰水浴的条件下，使用NDS-1体系孵育叶绿体细胞器包埋胶栓10h，待NDS-1体系恢复至室温后在 50℃ 水浴锅中继续孵育 9min，移除 NDS-1 体系；
所述Et-S 裂解液包括以下终浓度的成分：0.25MNaCl，0.05MMES，0.03MTris，0.5% W/VSDS，0.4% V/V Tween20，40% V/V乙醇；
所述用NDS-1 体系包括以下终浓度的成分：0.1MTris，0.05MEDTA，0.5%W/VSDS，20mM亚精胺，2mg/mL蛋白酶K，1mMCaCl2；
（5）通过脉冲凝胶电泳分离纯化叶绿体基因组；
（6）电洗脱回收叶绿体环状基因组；
（7）利用RecBCDase 体系清除电洗脱步骤中产生的断裂核酸片段。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）中所述作物包括大豆、大麦、小麦或玉米中的一种。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）的预处理具体步骤包括：待作物种子萌发3-3.5天后，将幼苗移至霍格兰营养液内水培，在光照条件下25~30℃/70% 湿度培养12~14h，在黑暗条件下23~25℃/70% 湿度培养10~14h，光照和黑暗交替循环培养，每隔7 天更换霍格兰营养液，直至叶片呈现微黄色的叶绿体饥饿状态。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（6）中回收载体选用D-tube 透析管。
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| CN101899432A (zh) * | 2010-05-04 | 2010-12-01 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种提取高纯度芝麻线粒体dna的方法 |
| CN107365765A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-11-21 | 南京农业大学 | 草莓叶绿体基因组dna的高效提取方法 |
| CN109777808A (zh) * | 2018-12-11 | 2019-05-21 | 福建农林大学 | 一种多肽及其在细胞核和叶绿体中定位表达外源蛋白的应用 |
| CN114990103A (zh) * | 2021-03-01 | 2022-09-02 | 中国中医科学院中药研究所 | 改良高盐-低pH法提取灯盏细辛叶绿体基因组DNA的方法 |
-
2023
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