CN115678889A - 一种质粒大量制备的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种质粒大量提取的方法，属于分子生物学领域。本发明在碱裂解法的基础上进行了改进，不需要用到氯仿等有毒试剂，且不需要用到硅胶膜或离子交换柱等吸附载体，能充分去除质粒中的基因组DNA、蛋白质及RNA等杂质，在较短时间内得到大量高纯度的质粒。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种质粒大量制备的方法。
背景技术
质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状，有利于细菌在特定的环境条件下生存。
细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体，是能把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体，然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。
目前质粒获取最常用的方式为碱裂解法，常规的碱裂解法需要用到氯仿等有机溶剂去除蛋白杂质，危害实验人员身体健康。还有一些商品化的试剂盒在用碱裂解得到质粒粗提液后，再利用硅胶膜或阴离子交换柱进一步纯化质粒，使其满足下游分子实验如酶切、PCR等需求。但是硅胶膜和阴离子交换柱载量有限，且成本较高，无法获得大量纯度较高的质粒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种新的质粒大量制备的方法。本发明在碱裂解法的基础上进行了改进，不需要用到氯仿等有毒试剂，且不需要用到硅胶膜或离子交换柱等吸附载体，能充分去除质粒中的基因组DNA、蛋白质及RNA等杂质，在较短时间内得到大量高纯度的质粒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种质粒大量提取的方法，包括以下步骤：
(1)将培养好的含有目的质粒的1L大肠杆菌菌液离心，收集菌体，弃掉上清。所述的离心的条件优选为5000g离心10分钟。
(2)加入100-300mL的预冷的缓冲液P1，使菌体充分重悬。所述的缓冲液P1的成分为：25mM Tris，10mM EDTA，100μg/mL RnaseA，pH8.0。
(3)加入等体积的缓冲液P2，轻轻摇晃2分钟，静置5分钟，使菌体充分裂解。所述的缓冲液P2的成分为：0.2M NaOH，1％SDS。
(4)加入等体积的缓冲液P3，轻柔摇晃1分钟，此时有大量白色絮状物产生。所述的缓冲液P3为5M醋酸钾溶液。
(5)将上述裂解产物15000g离心30min，弃掉白色沉淀，转移上清。
(6)将转移的上清液通过布氏漏斗过滤，去除残留的沉淀物，然后再通过0.22μm滤膜过滤。
(7)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀后，放在-20℃1-2小时，然后再12000g离心20-30分钟，此时在管底可见质粒形成的白色沉淀。去除上清液，将沉淀晾干。
(8)加入50-100mL TE缓冲液将沉淀溶解，然后加入4-12M LiCl 30-50mL，-20℃沉淀30分钟后，4℃12000g离心10分钟，留上清。所述的TE缓冲液的成分为：10mM Tris，1mMEDTA，pH 8.0。
(9)向上清液中加入0.7倍异丙醇，混匀后-20℃沉淀过夜。
(10)4℃12000g离心10-20分钟，加75％乙醇洗涤，然后再12000g离心10分钟，弃上清。
(11)将沉淀晾干后，用1-3mL TE缓冲液溶解，得到质粒，将得到的质粒放在-20℃保存。
一种用于质粒大量制备的缓冲液组合，包含缓冲液P1、P2、P3。缓冲液P1的成分为：25mM Tris，10mM EDTA，100μg/mL RnaseA，pH8.0；缓冲液P2的成分为：0.2M NaOH，1％SDS；缓冲液P3为5M醋酸钾溶液。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：避免使用氯仿等有毒试剂，且不需要用到硅胶膜或离子交换柱等吸附载体，成本较低。能充分去除质粒中的基因组DNA、蛋白质及RNA等杂质，在较短时间内得到大量高纯度的质粒。
附图说明
图1为本发明方法提取的质粒与天根商品化质粒大量提取试剂盒提取的质粒比较结果；L为DNA ladder，a、b为天根商品化质粒大量提取试剂盒提取的质粒，c、d为本发明方法提取的质粒。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1大肠杆菌的培养
将含有目标质粒的大肠杆菌接种到10mL LB培养基中，37℃过夜培养后，将10mL种子液转接到1L的LB培养基中，37℃过夜培养至OD600＝1.2。将培养好的大肠杆菌5000g离心10分钟，收集菌体，弃上清。上述LB培养基的配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠。
实施例2质粒的大量提取纯化
(1)往实施例1收集的菌体中加入120mL的预冷的缓冲液P1，使菌体充分重悬。所述的缓冲液P1的成分为：25mM Tris，10mM EDTA，100μg/mL RnaseA，pH8.0。
(2)加入120mL的缓冲液P2，轻轻摇晃2分钟，静置5分钟，使菌体充分裂解。所述的缓冲液P2的成分为：0.2M NaOH，1％SDS。
(3)加入等体积的缓冲液P3，轻柔摇晃1分钟，此时有大量白色絮状物产生。所述的缓冲液P3为5M醋酸钾溶液。
(4)将上述裂解产物15000g离心30min，弃掉白色沉淀，转移上清。
(5)将转移的上清液通过布氏漏斗过滤，去除残留的沉淀物，然后再通过0.22μm滤膜过滤。
(6)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀后，放在-20℃1-2小时，然后再12000g离心20分钟，此时在管底可见质粒形成的白色沉淀。去除上清液，将沉淀晾干。
(7)加入50-100mL TE缓冲液将沉淀溶解，然后加入4M LiCl 30-50mL，-20℃沉淀30分钟后，4℃12000g离心10分钟，留上清。所述的TE缓冲液的成分为：10mM Tris，1mMEDTA，pH 8.0。
(8)向上清液中加入0.7倍异丙醇，混匀后-20℃沉淀过夜。
(9)4℃12000g离心20分钟，加75％乙醇洗涤，然后再12000g离心10分钟，弃上清。
(10)将沉淀晾干后，用1mL TE缓冲液溶解，将得到的质粒放在-20℃保存。
实施例3质粒浓度及纯度测定
取实施例2提取的质粒2μL，点样到Thermo Fisher超微量分光光度计上，检测质粒的浓度和纯度。
用本发明方法及天根商品化质粒大提试剂盒平行抽提2次后进行比较(表1)，天根商品化质粒大提试剂盒的操作步骤参考其说明书。
表1质粒提取比较
由表1数据可见，本发明方法提取的质粒浓度略高于天根商品化质粒大量提取试剂盒，将提取的质粒在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，然后用核酸染料染色后成像，如图1所示，本方法提取的质粒纯度更高，无明显的RNA污染(质粒下方的小片段)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种质粒大量提取的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将培养好的含有目的质粒的1L大肠杆菌菌液离心，收集菌体，弃掉上清；
(2)加入100-300mL的预冷的缓冲液P1，使菌体充分重悬；所述的缓冲液P1的成分为：25mM Tris，10mM EDTA，100μg/mL RnaseA，pH8.0；
(3)加入等体积的缓冲液P2，轻轻摇晃2分钟，静置5分钟，使菌体充分裂解；所述的缓冲液P2的成分为：0.2M NaOH，1％SDS；
(4)加入等体积的缓冲液P3，轻柔摇晃1分钟；所述的缓冲液P3为5M醋酸钾溶液；
(5)将上述裂解产物15000g离心30min，弃掉白色沉淀，转移上清；
(6)将转移的上清液通过过滤，去除残留的沉淀物，然后再通过0.22μm滤膜过滤；
(7)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀后，放在-20℃1-2小时，然后再12000g离心20-30分钟，去除上清液，将沉淀晾干；
(8)加入50-100mL TE缓冲液将沉淀溶解，然后加入5-12M LiCl 30-50mL，-20℃沉淀30分钟后，4℃12000g离心10分钟，留上清；所述的TE缓冲液的成分为：10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0；
(9)向上清液中加入0.7倍异丙醇，混匀后-20℃沉淀过夜；
(10)4℃12000g离心10-20分钟，加75％乙醇洗涤，然后再12000g离心10分钟，弃上清；
(11)将沉淀晾干后，用1-3mL TE缓冲液溶解，得到质粒。
2.根据权利要求1所述的质粒大量提取的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的离心的条件为5000g离心10分钟。
3.一种用于质粒大量制备的缓冲液组合，其特征在于：包含缓冲液P1、P2、P3；
缓冲液P1的成分为：25mM Tris，10mM EDTA，100μg/mL RnaseA，pH8.0；
缓冲液P2的成分为：0.2M NaOH，1％SDS；
缓冲液P3为5M醋酸钾溶液。
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