CN107475291A

CN107475291A - 一种高效表达人源cyp2j2重组酶的方法和应用

Info

Publication number: CN107475291A
Application number: CN201710531480.8A
Authority: CN
Inventors: 王昕�; 刘导志; 鲁健; 刘明耀
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2017-12-15

Abstract

本发明公开了一种利用果蝇(S2)表达系统同时表达人源CYP2J2/OR/CYB5A重组蛋白的方法，将CYP2J2，OR和CYB5A的cDNA分别连接至表达载体构建重组表达质粒，再将其与筛选质粒共同转染进果蝇细胞，重组表达质粒将随机整合至宿主基因组中，经杀稻瘟菌素筛选得到稳转细胞株，稳转细胞株经CdCl₂和血晶素诱导同时表达CYP2J2，OR和CYB5A三种蛋白。本发明中，通过该方法建立的稳转细胞株具有操作简便、成本低、稳定性高以及所得蛋白表达量高活性高等优点。本发明中描述的方法可广泛应用于体外药物代谢以及药物筛选开发等相关研究中。

Description

一种高效表达人源CYP2J2重组酶的方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高效表达具有代谢活性的人源CYP2J2重组酶的方法和应用。

背景技术

药物在人体内具有较为复杂的代谢途径，其中I相药物代谢酶与II相药物代谢酶在药物代谢过程中扮演着十分重要的角色。药物经药物代谢酶作用可能产生毒性或者失效。此外两种及两种以上药物同时使用时，常常产生药物代谢酶引起的相互作用，从而可能使药物产生毒性或者丧失药效。因此在新药研发中，确定候选化合物的代谢途径，对于药物毒性以及药物-药物间相互作用的评估起着至关重要的作用。由于体内药物代谢酶系较为复杂，因此，在体外研究药物代谢酶对候选化合物的代谢作用成为药物研发初期非常重要的研究手段。目前，利用基因编辑与细胞工程技术表达的人源重组药物代谢酶已经成为一种重要的药物代谢体外研究模型。

作为最重要的一类I相药物代谢酶，细胞色素P450酶系(CYPs)是一类含有亚铁血红素的蛋白超家族。CYPs是参与生物内源性物质以及外源性物质的代谢与转化的重要酶系，参与代谢约75％的临床药物。CYP2J2是一类主要在肝外组织中表达的CYP酶亚型。1991年CYP2J2被发现，最初，人们认为其主要负责内源性物质，如花生四烯酸的代谢；2002年Matsumoto等人发现CYP2J2还参与抗组胺类药物阿司咪唑的代谢；此后，CYP2J2在药物代谢上的作用逐渐引起关注。随着研究的深入，越来越多的经由CYP2J2代谢的药物将会被发现，CYP2J2在药物代谢中的重要作用将会更加凸显。美国FDA药物研发指导原则上也指出应将CYP2J2作为药物代谢需要考虑的CYP酶。此外，据报道，CYP2J2及其内源性代谢产物EETs还与心血管疾病以及肿瘤等疾病的发生发展具有密切关系。因此开展对CYP2J2的研究有非常重要的意义。CYP2J2分子量约为58kDa，是主要存在于内质网膜和线粒体内膜上的膜结合蛋白，其功能的发挥需要辅酶细胞色素P450氧化还原酶(OR)和cytb₅的参与。

近年来，昆虫表达系统越来越多的被用于异源蛋白的表达，如杆状病毒病毒-昆虫表达系统以草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9或Sf21细胞系为宿主，用以表达异源蛋白；果蝇表达系统则以果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞系构建稳转细胞株，实现异源蛋白的表达。相比于哺乳动物表达系统，昆虫表达系统具有细胞培养条件简单、细胞密度大、蛋白表达量高、成本低等优点。同时昆虫表达系统作为一种真核表达系统拥有复杂的翻译后修饰机制，使其表达产物具有与天然产物类似的活性，这是原核表达系统无法做到的。杆状病毒-昆虫表达系统与果蝇表达系统尽管同时具有上述优点而且前者已有关于成功表达CYPs酶的报道，但前者也具有一定缺陷：1、制备重组病毒黏粒过程较为复杂；2、使用重组杆状病毒感染宿主细胞，随着病毒的扩增最终会造成细胞的裂解死亡，因此需要测定病毒滴度并摸索最佳的蛋白表达时间。此外，杆状病毒-昆虫表达系统每次表达异源蛋白均需重新感染细胞，属于瞬时表达类型。而果蝇表达系统在表达异源蛋白时，细胞处于正常健康的状态，可以持续稳定的表达目的蛋白，大大减少了重复转染筛选所需的时间。目前尚无用果蝇系统成功表达CYP2J2重组酶的先例。同时由于昆虫细胞中无OR和cyt b₅蛋白的表达，单独表达的CYPs活性很低，因此提高OR和cyt b₅蛋白的表达从而提高CYP2J2酶活性也是需要解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，建立一套利用果蝇表达系统稳定高效地表达具有较高活性的人源重组CYP2J2酶的方法，从而实现CYP2J2酶的大量表达，以用于药物筛选及新药研发等方面的研究。

本发明方法的具体描述如下：通过PCR方法分别扩增去除起始密码子和终止密码子的CYP2J2、OR和A型cytb₅(CYB5A)cDNA片段；同时在每一条cDNA5’端和3’端引入两个不同的酶切位点，通过酶切、连接等步骤将上述cDNA片段分别连接至表达载体pMT/BiP/V5-HisA，从而得到包含CYP2J2、OR和CYB5A cDNA的重组表达质粒。将上述三个重组表达质粒与筛选质粒(pCoBlast)以2：1：1：0.2的比例同时转染果蝇S2细胞，或将上述质粒分别与pCoBlast以4：0.2的比例转染果蝇S2细胞。待细胞状态良好后用终浓度25μg/ml的杀稻瘟菌素筛选2周获得稳转细胞株。优化蛋白表达条件后，以20μM的CdCl₂和1μg/ml的血晶素诱导稳转细胞株表达后即可同时表达或分别表达CYP2J2、OR和CYB5A蛋白。将经过诱导的细胞离心收集后，超声破碎，再以差速离心的方式制备含有CYP2J2的微粒体用于CYP2J2相关的代谢研究。

本发明提出了一种人源CYP2J2/OR/CYB5A重组表达质粒的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)引物设计及目的基因扩增

设计CYP2J2引物(F：5’-GGAGATCTCTCGCGGCGATGGGCTCTCT-3’，R：5’-GCTCTAGACACCTGAGGAACAGCGCAGA-3’)如SEQ ID NO.4-5所示。在F引物5’端引入Bgl II酶切位点(AGATCT)，在R引物5’端引入Xba I酶切位点(TCTAGA)。

设计OR引物(F：5’-CGGCTCGAGATCAACATGGGAGACTCCCA-3’，R：5’-CCGTCTAGAGCTCCACACGTCCAGGGAGT-3’)如SEQ ID NO.6-7所示。在F引物5’端引入Xho I酶切位点(CTCGAG)，在R引物5’端引入Xba I酶切位点(TCTAGA)。

设计CYB5A引物(F：5’-GGAACTAGTGCAGAGCAGTCGGACGAG-3’，R：5’-CCGTCTAGAGTCCTCTGCCATGTATA-3’)如SEQ ID NO.8-9所示。在F引物5’端引入Spe I酶切位点(ACTAGT)，在R引物5’端引入Xba I酶切位点(TCTAGA)。

以上引物设计时均去除了起始密码子和终止密码子。

分别以GV227-CYP2J2，pMD18-T simple-OR和pENTR223.1-CYB5A质粒为模板经PCR扩增、琼脂糖凝胶回收，分别得到CYP2J2，OR和CYB5A的cDNA。

步骤(1)中，所述GV227-CYP2J2质粒购自吉凯基因公司(产品编号：CYP2J2(GC063E04))，pMD18-T simple-OR质粒购自sino Biological公司(产品编号：HG10365-M)，pENTR223.1-CYB5A质粒购自CUABIO Biotech公司(产品编号：CSB-CL006309HU)。

步骤(1)中，可采用常规PCR扩增体系及条件对目的基因进行扩增。

步骤(1)中，所述CYP2J2的cDNA如SEQ ID NO.1所示。

步骤(1)中，所述OR的cDNA如SEQ ID NO.2所示。

步骤(1)中，所述CYB5A的cDNA如SEQ ID NO.3所示。

(2)重组表达质粒的构建

将得到的CYP2J2，OR和CYB5A的cDNA片段与pMT/BiP/V5-HisA表达载体(质粒图谱如图1所示)分别用相应的内切酶进行双酶切(CYP2J2-Bgl II/Xba I，OR-Xho I/Xba I，CYB5A-Spe I/Xba I)；将处理过的cDNA片段与相应的酶切后的表达载体采用T4连接酶连接，水浴过夜，可得到CYP2J2/OR/CYB5A重组表达质粒，或2J2-pMT、OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒。

步骤(2)中，所述双酶切的条件为：各cDNA片段量为1-2μg(优选为2μg)，表达载体量为1-2μg(优选为2μg)，各对应内切酶使用量为15U-20U(优选为15U)。

步骤(2)中，所述采用T4连接酶连接时的水浴温度为12-18℃；优选地，为16℃。连接体系含cDNA酶切产物1μg，表达载体酶切产物100ng。

本发明中，对构建得到的重组表达质粒进行鉴定，测序结果正确的克隆可进一步扩大培养；所述鉴定的过程包括：将上述构建的2J2-pMT，OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒分别转化大肠杆菌DH5α菌株，用带有氨苄青霉素的固体LB培养基筛选转化菌株。挑取单克隆菌落至3ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃，220rpm摇床过夜。用质粒小提试剂盒抽提重组表达质粒，再用相应内切酶对抽提的质粒进行双酶切，将酶切产物进行凝胶电泳验证。当酶切结果测定CYP2J2大小约为1.5kb，OR大小约为2kb，CYB5A大小约为0.4kb时，为阳性克隆，可进一步扩大培养，用无内毒素大抽试剂盒抽提质粒，抽提的质粒-20℃保存备用。

本发明还提出了一种由上述构建方法构建得到的CYP2J2/OR/CYB5A重组表达质粒，或2J2-pMT，OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒。

本发明还提出了一种重组表达质粒转染果蝇S2细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使用脂质体将构建好的CYP2J2/OR/CYB5A重组表达质粒的与筛选质粒pCoBlast共转染S2细胞，得到CYP2J2/OR/CYB5A共表达细胞株；或将上述2J2-pMT，OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒分别与pCoBlast单独转染S2细胞，得到各单转细胞株。

其中，所述脂质体为lipo 2000。

其中，所述2J2-pMT，OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒与筛选质粒pCoBlast的质量比为0.5-2：0.5-2：0.5-2：0.2，优选地，为2：1：1：0.2。或，所述重组表达质粒与筛选质粒pCoBlast分别单独转染S2细胞，所述2J2-pMT与pCoBlast的质量比为1-4：0.05-0.2(优选为4：0.2)；所述OR-pMT与pCoBlast的质量比为1-4：0.05-0.2(优选为4：0.2)；所述CYB5A-pMT与pCoBlast的质量比为1-4：0.05-0.2(优选为4：0.2)。

其中，所述共转染可采用常规方法进行。

其中，所述共转染后的S2细胞培养时间为3天；优选地，共转染后的S2细胞培养6h，然后更换新鲜的完全培养基培养3天；其中，所述S2细胞生长所需完全培养基为：Schneider’s Insect Medium加10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

其中，对经完全培养基培养的细胞筛选稳转细胞株，包括，向细胞培养物中加入含杀稻瘟菌素(blasticidin，终浓度为25μg/ml)的新鲜完全培养基筛选稳转细胞株，筛选两周，每3天更换一次含杀稻瘟菌素(blasticidin，终浓度为25μg/ml)的新鲜培养基但不更换培养皿。筛选结束后，细胞仍用含杀稻瘟菌素(blasticidin，终浓度为25μg/ml)的培养基培养，每次传代均使用新的培养皿。稳转细胞株能够在含有杀稻瘟菌素的培养基中正常生长且稳定传代，因此筛选两周后，若细胞形态正常且能够传代则表明筛选得到稳转株。

本发明中，获得的稳转细胞株可冻存，复苏后即可扩大培养制备人源CYP2J2重组酶，无需重复转染筛选细胞株等过程，大大缩短制备时间。

本发明中，在共转染前还包括将所述S2细胞培养至细胞状态良好的步骤。所述S2细胞生长所需完全培养基为：Schneider’s Insect Medium加10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。其中，所述S2细胞于25-29℃，无CO₂条件下培养；优选地，所述S2细胞于28℃，无CO₂条件下培养。

本发明中，所述方法还包括将细胞状态良好的S2细胞用血球计数板计数，将细胞以1×10⁶个/ml的密度接种至6孔板，每孔接板体积为2ml细胞稀释液，培养24h后，用于共转染。

本发明还提出了一种蛋白表达的方法。因本发明使用的表达载体启动子为重金属离子诱导型启动子，且CYP2J2和CYB5A为含亚铁血红素蛋白，因此，本发明对蛋白表达诱导剂和血晶素添加量进行了优化。OR单转细胞株诱导蛋白时，不添加血晶素；其他细胞株诱导蛋白表达时添加1μg/ml的血晶素。

所述方法包括：向CYP2J2/OR/CYB5A共表达细胞培养液或CYP2J2、CYB5A单转细胞培养液中加入CdCl₂和血晶素诱导蛋白表达；或向OR单转细胞培养液中加入CdCl₂诱导蛋白表达。

其中，所述CdCl₂的终浓度为5-30μM；优选地，为20μM。

其中，所述血晶素的终浓度为1-4μg/ml；优选地，为1μg/ml。

其中，所述诱导的时间为2-5天；优选地，为3天。

本发明还提出了一种重组酶微粒体的制备方法。所述方法包括以下步骤：离心收集上述诱导蛋白表达后的细胞，用Tris-蔗糖缓冲液重悬细胞沉淀，并置于冰上。用超声破碎法将细胞置于冰上破碎。超声结束后，离心。将上清转移到超速离心管中，离心。沉淀即为人源CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体，或OR，CYP2J2和CYB5A重组酶微粒体。用Tris-蔗糖缓冲液重悬后即得微粒体悬液。

其中，所述Tris-蔗糖缓冲液的组成为50mM Tris，3mM MgCl₂和200mM蔗糖，pH7.4。

在本发明一个具体实施方式中，微粒体的表达方法，包括以下步骤：实施选择CYP2J2/OR/CYB5A共表达细胞株和各单转细胞株进行大规模培养，具体过程如下：(1)将稳转细胞株复苏，用完全培养基在培养皿中培养至100ml。(2)将含细胞的培养液190×g，离心5min，弃去原有培养基，用200ml Express Five培养基重悬后，转移至新的培养皿中，置于28℃，无CO₂培养箱继续培养2-3天。(3)取少量细胞液进行细胞计数，当细胞密度达到1×10⁷个/ml时，加入终浓度20μM的CdCl₂以及1μg/ml的血晶素(OR单转细胞株不加血晶素)诱导蛋白表达，诱导时间为3天。

然后以1690×g转速离心5min收集诱导过的细胞，弃去上清，按25g细胞/100ml缓冲液的比例用Tris-蔗糖缓冲液(含50mM Tris，3mM MgCl₂和200mM蔗糖，pH 7.4)重悬细胞沉淀，并置于冰上。用超声破碎法将细胞置于冰上破碎：6mm探头，功率60％，超声2s，间隔3s，循环30次。超声结束后，4℃，10600×g，离心20min。将上清转移到超速离心管中，4℃，105000×g，离心60min。弃去上清，将沉淀转移，加入适量Tris-蔗糖缓冲液重悬沉淀，即得到人源CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体溶液(OR，CYP2J2和CYB5A重组酶微粒体溶液)，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，保存至-150℃备用。

本发明还提出了一种由上述方法得到的CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体，或OR，CYP2J2和CYB5A重组酶微粒体。

本发明还提出了一种培养细胞的方法，在诱导蛋白表达前，细胞用完全培养基培养，在诱导蛋白表达时，细胞改用Express Five培养基培养。

本发明中，采用上述方法制备得到的CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体对阿司咪唑代谢的酶动力学参数如下：米氏常数K_m＝1.65μM，最大反应速率V_max＝0.6630nmol/min/mg protein，代谢清除率CL_int(V_max/K_m)＝401.8ml/min/g protein。K_m值与文献报道接近，Vmax和CLint显示人源CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体具有较高代谢活性。而将OR微粒体，CYP2J2微粒体和CYB5A微粒体混合后得到的混合微粒体中CYP2J2的代谢活性非常低，表明通过CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体的共表达方法获得的人源CYP2J2重组酶具有更强的代谢能力。

本发明中，以氟桂利嗪作为CYP2J2阳性抑制剂，以阿司咪唑作为CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体代谢底物，其中，阿司咪唑代谢产物O-去甲基阿司咪唑生成量随氟桂利嗪浓度增加呈浓度依赖性降低；在阿司咪唑浓度为0.5μM时，氟桂利嗪对人源CYP2J2共表达重组酶代谢阿司咪唑活性的IC₅₀为5.96μM。

本发明利用果蝇(S2)表达系统同时表达人源CYP2J2/OR/CYB5A重组蛋白的方法，将CYP2J2，OR和CYB5A的cDNA分别连接至表达载体构建重组表达质粒，再将其与筛选质粒共同转染进果蝇细胞，重组表达质粒将随机整合至宿主基因组中，经杀稻瘟菌素筛选得到稳转细胞株，稳转细胞株经CdCl₂和血晶素诱导同时表达CYP2J2，OR和CYB5A三种蛋白。本发明中可广泛应用于体外药物代谢以及药物筛选开发等相关研究。

本发明的有益效果在于：

1.本发明使用pMT/BiP/V5-HisA表达载体构建重组表达质粒，过程简单，易于操作。

2.本发明采用脂质体转染法转染细胞，对细胞毒性小，转染效率高。

3.本发明筛选稳转细胞株仅需两周左右，筛选到的细胞株仅需两周左右即可扩增至200ml体积以上细胞，密度大于1×10⁷个/ml。

4.本发明获得的稳转细胞株可冻存，复苏后即可扩大培养制备人源CYP2J2重组酶，无需重复转染筛选细胞株等过程，大大缩短制备时间。

5.本发明优化了人源CYP2J2重组酶的表达条件，包括诱导剂及其浓度、血晶素添加量等，获得的人源CYP2J2重组酶代谢活性高。

6.本发明构建重组表达质粒以及建立的稳转细胞株的方法操作简便、成本低，建立的稳转细胞株具有稳定性高，表达量高，活性高等优点。

附图说明

图1为pMT/BiP/V5-HisA表达载体质粒图谱。

图2重组表达质粒双酶切验证图。1-3号为OR-pMT重组质粒样品，3号质粒测序结果结果正确，对应的OR酶切条带大小约为2kb；4-6号为2J2-pMT重组质粒样品，6号质粒测序结果正确，对应的CYP2J2条带大小约为1.5kb；7-9为CYB5A-pMT重组质粒，8号质粒测序结果正确，对应的CYB5A条带大小约为0.4kb。

图3诱导剂及血晶素对单转细胞株蛋白表达的影响。(A)CuSO₄和CdCl₂对OR单转细胞株蛋白表达影响，同时检测细胞样品和培养基样品，NC为未加诱导剂组。(B)不同浓度血晶素对各单转细胞株蛋白表达的影响。

图4不同浓度血晶素对2J2/OR/CYB5A(即CYP2J2/OR/CYB5A)共转染细胞株蛋白表达的影响。

图5重组酶微粒体代谢阿司咪唑酶动力学图。2J2/OR/CYB5A(即CYP2J2/OR/CYB5A)为共表达重组酶微粒体，OR+2J2+CYB5A(即OR+CYP2J2+CYB5A)为混合微粒体(OR，CYP2J2及CYB5A微粒体混合所得)。

图6氟桂利嗪对2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体的抑制作用分析。(A)图表示不同浓度氟桂利嗪对2J2/OR/CYB5A共表达微粒体对阿司咪唑代谢能力的影响，阿司咪唑横坐标为氟桂利嗪浓度，纵坐标为阿司咪唑代谢产物O-去甲基阿司咪唑浓度。(B)图为对(A)作非线性回归分析所得，横坐标为氟桂利嗪浓度的对数值，纵坐标为相对酶活，以此计算出氟桂利嗪对2J2/OR/CYB5A共表达微粒体中CYP2J2酶的半抑制浓度(IC₅₀)值。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1CYP2J2、OR和CYB5A重组表达质粒构建

1.1、引物设计及目的基因扩增：

设计CYP2J2引物(F：5’-GGAGATCTCTCGCGGCGATGGGCTCTCT-3’，R：5’-GCTCTAGACACCTGAGGAACAGCGCAGA-3’)。在F引物5’端引入Bgl II酶切位点(AGATCT)，在R引物5’端引入Xba I酶切位点(TCTAGA)。

设计OR引物(F：5’-CGGCTCGAGATCAACATGGGAGACTCCCA-3’，R：5’-CCGTCTAGAGCTCCACACGTCCAGGGAGT-3’)。在F引物5’端引入Xho I酶切位点(CTCGAG)，在R引物5’端引入Xba I酶切位点(TCTAGA)。

设计CYB5A引物(F：5’-GGAACTAGTGCAGAGCAGTCGGACGAG-3’，R：5’-CCGTCTAGAGTCCTCTGCCATGTATA-3’)。在F引物5’端引入Spe I酶切位点(ACTAGT)，在R引物5’端引入Xba I酶切位点(TCTAGA)。

以上引物设计时均去除了起始密码子和终止密码子。

1.2、重组表达质粒构建

将得到的CYP2J2，OR和CYB5A的cDNA片段与pMT/BiP/V5-His A表达载体(质粒图谱如图1所示)分别用相应的内切酶进行双酶切(CYP2J2-Bgl II/Xba I，OR-Xho I/Xba I，CYB5A-Spe I/Xba I)；将处理过的cDNA片段与相应的酶切后的表达载体用T4连接酶连接，16℃水浴过夜，可得到2J2-pMT，OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒。

1.3重组表达质粒鉴定及扩大培养

用1.2中构建的重组表达质粒分别转化大肠杆菌DH5α菌株，用带有氨苄青霉素的固体LB培养基筛选转化菌株。挑取单克隆菌落至3ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃，220rpm摇床过夜。用质粒小提试剂盒抽提重组表达质粒，再用相应内切酶对抽提的质粒进行双酶切，将酶切产物进行凝胶电泳验证。酶切结果如图2所示，OR大小约为2kb，CYP2J2大小约为1.5kb，CYB5A大小约为0.4kb。将双酶切验证阳性的质粒测序，将测序结果正确的克隆扩大培养，用无内毒素大抽试剂盒抽提质粒，抽提的质粒-20℃保存备用。

实施例2重组表达质粒转染果蝇S2细胞及稳转细胞株筛选

S2细胞生长所需完全培养基为：Schneider’s Insect Medium加10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。将S2细胞于28℃，无CO₂培养箱中培养至细胞状态良好。对状态良好的S2细胞用血球计数板计数，将细胞以1×10⁶个/ml的密度接种至6孔板，每孔接板体积为2ml细胞稀释液，培养24h.

使用脂质体lipo 2000将构建好的CYP2J2，OR和CYB5A重组表达质粒与筛选质粒pCoBlast按2μg:1μg:1μg:0.2μg质量比共转染S2细胞，或将上述重组表达质粒与pCoBlast按4μg:0.2μg质量比单独转染S2细胞。培养6h后换新鲜的完全培养基培养3天。之后加入含杀稻瘟菌素(blasticidin，终浓度为25μg/ml)的新鲜完全培养基筛选稳转细胞株，筛选两周，每3天更换一次新鲜培养基但不更换培养皿。筛选结束后，细胞仍用含杀稻瘟菌素的培养基培养，每次传代均使用新的培养皿。

实施例3稳转细胞株蛋白表达条件优化

因本发明使用的表达载体启动子为重金属离子诱导型启动子，且CYP2J2和CYB5A为含亚铁血红素蛋白，因此，本发明对蛋白表达诱导剂和血晶素添加量进行了优化。1、诱导剂：本发明取OR单转细胞株加至24孔板中，每孔1ml(含1×10⁷个细胞)，分别用500μM CuSO₄、750μM CuSO₄、10μM CdCl₂和20μM CdCl₂诱导表达蛋白，诱导时间为3天。诱导后，1710×g收集细胞沉淀，以RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)裂解细胞沉淀，以BCA法测定蛋白浓度，配制相应蛋白上样液，100℃煮10min后，通过Western blot法检测蛋白表达情况，上样量为50μg。结果如图3A所示，20μM CdCl₂诱导效果最佳。2、血晶素：本发明取OR、CYP2J2、CYB5A单转细胞株和OR/CYP2J2/CYB5A共转细胞株加至24孔板中，每孔1ml(含1×10⁷个细胞)，分别添加1，2，4μg/ml血晶素并添加20μM CdCl₂诱导蛋白表达。同样用Westernblot检测蛋白表达，上样量为50μg。结果如图3B和图4所示，OR大小约75KD，CYP2J2约为58KD，CYB5A约为17KD。综合考虑，OR单转细胞株诱导蛋白时，不添加血晶素；其他细胞株诱导蛋白表达时添加1μg/ml的血晶素。

实施例4稳转细胞的大规模培养及微粒体制备

选择CYP2J2/OR/CYB5A共表达细胞株和各单转细胞株进行大规模培养，具体过程如下：(1)将稳转细胞株复苏，用完全培养基在培养皿中培养至100ml。(2)将含细胞的培养液190×g，离心5min，弃去原有培养基，用200ml Express Five培养基重悬后，转移至新的培养皿中，置于28℃，无CO₂培养箱继续培养2-3天。(3)取少量细胞液进行细胞计数，当细胞密度达到1×10⁷个/ml时，加入终浓度20μM的CdCl₂以及1μg/ml的血晶素(OR单转细胞株不加血晶素)诱导蛋白表达，诱导时间为3天。

1690×g，离心5min收集诱导过的细胞，弃去上清，按25g细胞/100ml缓冲液的比例用Tris-蔗糖缓冲液(含50mM Tris，3mM MgCl₂和200mM蔗糖，pH 7.4)重悬细胞沉淀，并置于冰上。用超声破碎法将细胞置于冰上破碎：6mm探头，功率60％，超声2s，间隔3s，循环30次。超声结束后，4℃，10600×g，离心20min。将上清转移到超速离心管中，4℃，105000×g，离心60min。弃去上清，将沉淀转移，加入适量Tris-蔗糖缓冲液重悬沉淀，即得到人源CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体溶液，OR，CYP2J2和CYB5A重组酶微粒体溶液。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，保存至-150℃备用。

实施例5人源CYP2J2重组酶微粒体对探针底物阿司咪唑酶动力学参数测定

阿司咪唑属于抗组胺类药物，在研究中常作为CYP2J2的底物，其特征性代谢产物为O-去甲基阿司咪唑。本实施例中，使用实施例4制备的人源CYP2J2重组酶微粒体研究其对不同浓度阿司咪唑的代谢作用。通过体外共孵育底物阿司咪唑与重组酶微粒体，建立LC-MS/MS分析方法同时检测阿司咪唑与O-去甲基阿司咪唑浓度。利用分析软件Prism 5.0拟合动力学曲线，并计算酶动力学参数米氏常数K_m值与最大反应速率V_max值。

具体实验如下：反应孵育体系包含终浓度100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)，1.3mMNADP⁺，3.3mM G6P，0.4U/ml G6PDH，0.5mg/ml人源CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体或0.5mg/ml混合微粒体(OR，CYP2J2及CYB5A微粒体含量比例为1:1:1)，阿司咪唑(0.2，0.5，1，2，5，10μM)，总体积200μl。37℃预孵5min后，加入NADP⁺启动反应，37℃孵育10min。加入等体积冰乙腈终止反应，并加入20μl内标溶液(200ng/ml甲苯咪唑)涡旋3min，4℃，16900×g离心15min，吸取100μl上清用于LC-MS/MS分析。

结果如图5所示，CYP2J2/OR/CYB5A共表达微粒体对阿司咪唑代谢的酶动力学参数如下：米氏常数K_m＝1.65μM，最大反应速率V_max＝0.6630nmol/min/mg protein，代谢清除率CL_int(V_max/K_m)＝401.8ml/min/gprotein。K_m值与文献报道接近，V_max和CL_int显示人源CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体具有较高代谢活性。而OR+CYP2J2+CYB5A混合微粒体(OR，CYP2J2及CYB5A微粒体混合所得)代谢活性非常低，表明与分别表达再混合的方法相比，通过共表达方法获得的人源CYP2J2重组酶具有更强的代谢能力。

实施例6CYP2J2/OR/CYB5A共表达微粒体在药物相互作用研究中的应用

本实施例以氟桂利嗪作为CYP2J2阳性抑制剂，研究不同浓度氟桂利嗪对CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体代谢阿司咪唑的抑制作用。

具体实验如下：配制200μl孵育体系，包含100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)，1.3mMNADP⁺，3.3mM G6P，0.4U/ml G6PDH，0.5mg/ml人源CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体，0.5μM阿司咪唑，不同浓度氟桂利嗪(0.2，0.5，1，2，5，10μM)。37℃预孵5min后，加入NADP⁺启动反应。37℃孵育10min，加入200μl冰乙腈终止反应，并加入20μl内标溶液(200ng/ml甲苯咪唑)涡旋3min，4℃离心15min，吸取100μl上清至进样瓶中用LC-MS/MS分析。

结果如图6A所示，代谢产物O-去甲基阿司咪唑浓度随氟桂利嗪浓度上升而下降。对图6A做非线性分析，得到图6B，横坐标为抑制剂浓度的对数值，纵坐标为相对酶活，用以计算氟桂利嗪对人源CYP2J2共表达重组酶微粒体活性的半抑制浓度IC₅₀值。结果显示，阿司咪唑代谢产物O-去甲基阿司咪唑生成量随氟桂利嗪浓度增加呈浓度依赖性降低；在阿司咪唑浓度为0.5μM时，氟桂利嗪对人源CYP2J2共表达重组酶代谢阿司咪唑活性的IC₅₀为5.96μM。

<110> 华东师范大学

<120> 一种高效表达人源CYP2J2重组酶的方法和应用

<160> 9

<210> 1

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

1 ATGCT CGCGGCGATG GGCTCTCTGG CGGCTGCCCT CTGGGCAGTG GTCCATCCTC

56 GGACTCTCCT ACTGGGCACT GTCGCCTTTC TGCTCGCTGC TGACTTTCTC AAAAGACGGC

116 GCCCAAAGAA CTACCCGCCG GGGCCCTGGC GCCTGCCCTT CCTTGGCAAC TTCTTCCTTG

176 TGGACTTCGA GCAGTCGCAC CTGGAGGTTC AGCTGTTTGT GAAGAAATAT GGGAACCTTT

236 TTAGCTTGGA GCTTGGTGAC ATATCTGCAG TTCTTATTAC TGGCTTGCCC TTAATCAAAG

296 AAGCCCTTAT CCACATGGAC CAAAACTTTG GGAACCGCCC CGTGACCCCT ATGCGAGAAC

356 ATATCTTTAA GAAAAATGGA TTGATTATGT CAAGTGGCCA GGCATGGAAG GAGCAAAGAA

416 GGTTCACTCT GACAGCACTA AGGAACTTTG GTTTAGGAAA GAAGAGCTTA GAGGAACGCA

476 TTCAGGAGGA GGCCCAACAC CTCACTGAAG CAATAAAAGA GGAGAACGGA CAGCCTTTTG

536 ACCCTCATTT CAAGATCAAC AATGCAGTTT CCAATATCAT TTGCTCCATC ACCTTCGGAG

596 AACGCTTTGA GTACCAGGAT AGTTGGTTTC AGCAGCTGCT GAAGTTACTA GATGAAGTCA

656 CATACTTGGA GGCTTCAAAG ACATGCCAGC TCTACAATGT CTTTCCATGG ATAATGAAAT

716 TCCTGCCTGG ACCCCACCAA ACTCTCTTCA GCAACTGGAA AAAACTGAAA TTGTTTGTTT

776 CTCATATGAT TGACAAACAC AGAAAGGATT GGAATCCTGC AGAAACAAGA GACTTTATTG

836 ATGCTTACCT TAAAGAAATG TCAAAGCACA CAGGCAATCC TACTTCAAGT TTCCATGAAG

896 AAAACCTCAT CTGCAGCACC CTGGACCTCT TCTTTGCCGG AACCGAGACA ACTTCCACAA

956 CTCTGCGATG GGCTCTGCTT TATATGGCCC TCTACCCAGA AATCCAAGAA AAAGTACAAG

1016 TTGAGATTGA CAGAGTGATT GGCCAGGGGC AGCAGCCGAG CACAGCCGCC CGGGAGTCCA

1076 TGCCCTACAC CAATGCTGTC ATCCATGAGG TGCAGAGAAT GGGCAACATC ATCCCCCTGA

1136 ACGTTCCCAG GGAAGTGACA GTTGATACCA CTTTGGCTGG GTACCACCTG CCCAAGGGTA

1196 CCATGATCCT GACCAATTTG ACGGCGCTGC ACAGGGACCC CACAGAGTGG GCCACCCCTG

1256 ACACATTCAA TCCGGACCAT TTTCTGGAGA ATGGACAGTT TAAGAAAAGG GAAGCCTTTA

1316 TGCCTTTCTC AATAGGAAAG CGGGCATGCC TCGGAGAACA GTTGGCCAGG ACTGAGCTGT

1376 TTATTTTCTT CACTTCCCTT ATGCAAAAAT TTACCTTCAG GCCCCCAAAC AATGAGAAGC

1436 TGAGCCTGAA GTTTAGAATG GGTATCACCA TTTCCCCAGT CAGTCACCGC CTCTGCGCTG

1496 TTCCTCAGGT GTAA

<210> 2

<211> 2043

<212> DNA

<213> 人源

<400> 2

1 ATGATCAACA TGGGAGACTC CCACGTGGAC ACCAGCTCCA CCGTGTCCGA GGCGGTGGCC

61 GAAGAAGTAT CTCTTTTCAG CATGACGGAC ATGATTCTGT TTTCGCTCAT CGTGGGTCTC

121 CTAACCTACT GGTTCCTCTT CAGAAAGAAA AAAGAAGAAG TCCCCGAGTT CACCAAAATT

181 CAGACATTGA CCTCCTCTGT CAGAGAGAGC AGCTTTGTGG AAAAGATGAA GAAAACGGGG

241 AGGAACATCA TCGTGTTCTA CGGCTCCCAG ACGGGGACTG CAGAGGAGTT TGCCAACCGC

301 CTGTCCAAGG ACGCCCACCG CTACGGGATG CGAGGCATGT CAGCGGACCC TGAGGAGTAT

361 GACCTGGCCG ACCTGAGCAG CCTGCCAGAG ATCGACAACG CCCTGGTGGT TTTCTGCATG

421 GCCACCTACG GTGAGGGAGA CCCCACCGAC AATGCCCAGG ACTTCTACGA CTGGCTGCAG

481 GAGACAGACG TGGATCTCTC TGGGGTCAAG TTCGCGGTGT TTGGTCTTGG GAACAAGACC

541 TACGAGCACT TCAATGCCAT GGGCAAGTAC GTGGACAAGC GGCTGGAGCA GCTCGGCGCC

601 CAGCGCATCT TTGAGCTGGG GTTGGGCGAC GACGATGGGA ACTTGGAGGA GGACTTCATC

661 ACCTGGCGAG AGCAGTTCTG GCCGGCCGTG TGTGAACACT TTGGGGTGGA AGCCACTGGC

721 GAGGAGTCCA GCATTCGCCA GTACGAGCTT GTGGTCCACA CCGACATAGA TGCGGCCAAG

781 GTGTACATGG GGGAGATGGG CCGGCTGAAG AGCTACGAGA ACCAGAAGCC CCCCTTTGAT

841 GCCAAGAATC CGTTCCTGGC TGCAGTCACC ACCAACCGGA AGCTGAACCA GGGAACCGAG

901 CGCCACCTCA TGCACCTGGA ATTGGACATC TCGGACTCCA AAATCAGGTA TGAATCTGGG

961 GACCACGTGG CTGTGTACCC AGCCAACGAC TCTGCTCTCG TCAACCAGTT GGGCAAAATC

1021 CTGGGTGCCG ACCTGGACGT CGTCATGTCC CTGAACAACC TGGATGAGGA GTCCAACAAG

1081 AAGCACCCAT TCCCGTGCCC TACGTCCTAC CGCACGGCCC TCACCTACTA CCTGGACATC

1141 ACCAACCCGC CGCGTACCAA CGTGCTGTAC GAGCTGGCGC AGTACGCCTC GGAGCCCTCG

1201 GAGCAGGAGC TGCTGCGCAA GATGGCCTCC TCCTCCGGCG AGGGCAAGGA GCTGTACCTG

1261 AGCTGGGTGG TGGAGGCCCG GAGGCACATC CTGGCCATCC TGCAGGACTG CCCGTCCCTG

1321 CGGCCCCCCA TCGACCACCT GTGTGAGCTG CTGCCGCGCC TGCAGGCCCG CTACTACTCC

1381 ATCGCCTCAT CCTCCAAGGT CCACCCCAAC TCTGTGCACA TCTGTGCGGT GGTTGTGGAG

1441 TACGAGACCA AGGCTGGCCG CATCAACAAG GGCGTGGCCA CCAACTGGCT GCGGGCCAAG

1501 GAGCCTGCCG GGGAGAACGG CGGCCGTGCG CTGGTGCCCA TGTTCGTGCG CAAGTCCCAG

1561 TTCCGCCTGC CCTTCAAGGC CACCACGCCT GTCATCATGG TGGGCCCCGG CACCGGGGTG

1621 GCACCCTTCA TAGGCTTCAT CCAGGAGCGG GCCTGGCTGC GACAGCAGGG CAAGGAGGTG

1681 GGGGAGACGC TGCTGTACTA CGGCTGCCGC CGCTCGGATG AGGACTACCT GTACCGGGAG

1741 GAGCTGGCGC AGTTCCACAG GGACGGTGCG CTCACCCAGC TCAACGTGGC CTTCTCCCGG

1801 GAGCAGTCCC ACAAGGTCTA CGTCCAGCAC CTGCTAAAGC AAGACCGAGA GCACCTGTGG

1861 AAGTTGATCG AAGGCGGTGC CCACATCTAC GTCTGTGGGG ATGCACGGAA CATGGCCAGG

1921 GATGTGCAGA ACACCTTCTA CGACATCGTG GCTGAGCTCG GGGCCATGGA GCACGCGCAG

1981 GCGGTGGACT ACATCAAGAA ACTGATGACC AAGGGCCGCT ACTCCCTGGA CGTGTGGAGC

2041 TAG

<210> 3

<211> 405

<212> DNA

<213> 人源

<400> 3

1 ATGGCAGAGC AGTCGGACGA GGCCGTGAAG TACTACACCC TAGAGGAGAT TCAGAAGCAC

61 AACCACAGCA AGAGCACCTG GCTGATCCTG CACCACAAGG TGTACGATTT GACCAAATTT

121 CTGGAAGAGC ATCCTGGTGG GGAAGAAGTT TTAAGGGAAC AAGCTGGAGG TGACGCTACT

181 GAGAACTTTG AGGATGTCGG GCACTCTACA GATGCCAGGG AAATGTCCAA AACATTCATC

241 ATTGGGGAGC TCCATCCAGA TGACAGACCA AAGTTAAACA AGCCTCCGGA AACTCTTATC

301 ACTACTATTG ATTCTAGTTC CAGTTGGTGG ACCAACTGGG TGATCCCTGC CATCTCTGCA

361 GTGGCCGTCG CCTTGATGTA TCGCCTATAC ATGGCAGAGG ACTGA

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

1 GGAGATCTCTCGCGGCGATGGGCTCTCT

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

1 GCTCTAGACACCTGAGGAACAGCGCAGA

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

1 CGGCTCGAGATCAACATGGGAGACTCCCA

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

1 CCGTCTAGAGCTCCACACGTCCAGGGAGT

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

1 GGAACTAGTGCAGAGCAGTCGGACGAG

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人源

<400> 9

1 CCGTCTAGAGTCCTCTGCCATGTATA

Claims

1.一种人源CYP2J2/OR/CYB5A重组表达质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)引物设计及目的基因扩增

设计CYP2J2引物，F：5’-GGAGATCTCTCGCGGCGATGGGCTCTCT-3’，R：5’-GCTCTAGACACCTGAGGAACAGCGCAGA-3’；

设计OR引物F：5’-CGGCTCGAGATCAACATGGGAGACTCCCA-3’，R：5’-CCGTCTAGAGCTCCACACGTCCAGGGAGT-3’；

设计CYB5A引物F：5’-GGAACTAGTGCAGAGCAGTCGGACGAG-3’，R：5’-CCGTCTAGAGTCCTCTGCCATGTATA-3’；

分别以GV227-CYP2J2，pMD18-T simple-OR和pENTR223.1-CYB5A质粒为模板经PCR扩增、琼脂糖凝胶回收，分别得到CYP2J2，OR和CYB5A的cDNA；其中，所述CYP2J2的cDNA如SEQID NO.1所示；所述OR的cDNA如SEQ ID NO.2所示；所述CYB5A的cDNA如SEQ ID NO.3所示；

(2)重组表达质粒的构建

将得到的CYP2J2，OR和CYB5A的cDNA与pMT/BiP/V5-HisA表达载体分别用相应的内切酶进行双酶切，CYP2J2用Bgl II/Xba I双酶切，OR用Xho I/Xba I双酶切，CYB5A用Spe I/XbaI双酶切；将处理过的cDNA片段与相应的酶切后的表达载体采用T4连接酶连接，水浴过夜，可得到CYP2J2/OR/CYB5A重组表达质粒，或2J2-pMT、OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述双酶切的条件为：各cDNA片段量为1-2μg，表达载体量为1-2μg，各对应内切酶使用量为15U-20U。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述采用T4连接酶连接时的水浴温度为12-18℃；连接体系含cDNA酶切产物1μg，表达载体酶切产物100ng。

4.一种由上述构建方法构建得到的CYP2J2/OR/CYB5A重组表达质粒或2J2-pMT，OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒。

5.一种重组表达质粒转染果蝇S2细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：使用脂质体将构建好的CYP2J2/OR/CYB5A重组表达质粒与筛选质粒pCoBlast共转染S2细胞，得到CYP2J2/OR/CYB5A共表达细胞株；或将上述2J2-pMT，OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒分别与pCoBlast单独转染S2细胞，得到各单转细胞株。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述2J2-pMT，OR-pMT和CYB5A-pMT重组表达质粒与筛选质粒pCoBlast的质量比为0.5-2：0.5-2：0.5-2：0.2；

或，所述重组表达质粒与筛选质粒pCoBlast分别单独转染S2细胞，所述2J2-pMT重组表达质粒与筛选质粒pCoBlast的质量比为1-4：0.05-0.2；所述OR-pMT重组表达质粒与筛选质粒pCoBlast的质量比为1-4：0.05-0.2；所述CYB5A-pMT重组表达质粒与筛选质粒pCoBlast的质量比为1-4：0.05-0.2。

7.一种蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括：向CYP2J2/OR/CYB5A共表达细胞培养液或CYP2J2、CYB5A单转细胞培养液中加入CdCl₂和血晶素诱导蛋白表达；或向OR单转细胞培养液中加入CdCl₂诱导蛋白表达。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CdCl₂的终浓度为5-30μM；所述血晶素的终浓度为1-4μg/ml。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述诱导的时间为2-5天。

10.一种重组酶微粒体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：离心收集权利要求7中经诱导后的细胞，用Tris-蔗糖缓冲液重悬细胞沉淀，并置于冰上，用超声破碎法将细胞置于冰上破碎，超声结束后，离心，将上清转移到超速离心管中，离心，沉淀即为CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体，或OR，CYP2J2和CYB5A重组酶微粒体。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，用Tris-蔗糖缓冲液重悬后即得微粒体悬液，所述Tris-蔗糖缓冲液的组成为50mM Tris，3mM MgCl₂和200mM蔗糖，pH 7.4。

12.一种由权利要求10所述方法得到的CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体，其特征在于，所述CYP2J2/OR/CYB5A共表达重组酶微粒体对阿司咪唑代谢的酶动力学参数如下：米氏常数K_m＝1.65μM，最大反应速率V_max＝0.6630nmol/min/mg protein，代谢清除率CL_int(V_max/K_m)＝401.8ml/min/g蛋白。