CN104561093A - 一种重组人源CYP3A4/CPR/cyt b5蛋白共转染共表达的方法 - Google Patents

一种重组人源CYP3A4/CPR/cyt b5蛋白共转染共表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组人源CYP3A4/CPR/cyt?b5蛋白共转染共表达的方法,将分别带有CYP3A4、CPR、cyt?b5cDNA片段的表达载体和筛选质粒共同转染进果蝇S2细胞中,表达载体整合入果蝇细胞基因组中,用杀稻瘟菌素筛选得到稳转单克隆细胞株,稳转单克隆细胞株经扩大培养,诱导表达CYP3A4,CPR,cyt?b5三种蛋白。本发明中,重组载体易构建且稳定性高,可同时表达三种蛋白,具有高表达量高活性等优点。本发明可广泛应用于体外药物代谢和药物筛选开发及应用等研究。

Description

一种重组人源CYP3A4/CPR/cyt b5蛋白共转染共表达的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种重组人源CYP3A4蛋白、CPR蛋白和cyt b5蛋白共转染共表达的方法。
背景技术
在新药研发的过程中,药物代谢路径的确定及主要代谢产物的鉴定,以及候选药物对药物代谢酶的影响是新药研发早期药物安全性评价的重要组成部分。在新药研发的早期就利用各种体外模型开展药物代谢与药物-药物相互作用的研究,以便确定候选药物是否有继续开发的价值。而利用基因工程和细胞工程表达的重组人源药物代谢酶作为一种重要的体外代谢研究模型,在新药研发过程中主要用于确定参与药物代谢的酶的亚型以及代谢性药物-药物相互作用的研究。
药物代谢研究中最重要的一类一相药物代谢细胞色素P450酶,简称CYP酶,是一类含有血红素的蛋白酶超家族。CYP酶对外源性和内源性物质的代谢至关重要,因此CYP酶也是药物代谢研究中涉及最多的药物代谢酶。CYP3A4是在人体肝脏和小肠中表达最丰富的P450酶亚型,代谢市面上近50%的药物,并且有研究表明,在众多CYP3A4的底物中,大部分都只有唯一的代谢产物。因此CYP3A4在人体药物代谢中占有重要的地位。CYP3A4酶是位于细胞内质网内膜上的膜结合蛋白,分子量约55KD,其发挥活性需要辅酶CPR和cyt b5的辅助。到目前为止,大肠杆菌(Escherichia coli),酵母(Saccharomyces cerevisiae,Schizoasaccharomyces pombe,Pichia pastoris),昆虫细胞,哺乳动物细胞等表达系统均已被用于CYP3A4酶的表达。大肠杆菌表达系统表达得到的蛋白多以包涵体形式存在,并且大肠杆菌的翻译后蛋白加工机制与真核细胞有较大差异,使得CYP3A4活性偏低;在酵母表达系统中,由于酵母体内有CPR的表达,并且表达的蛋白不会形成包涵体,不易水解,因此其在CYP酶表达上有一定优势,并且经过对该系统的改造,将人源CPR与CYP3A4共表达,活性也有较大提升,但酵母系统表达CYP时有密码子的偏爱性,且酵母细胞难破裂,表达载体不易获得;以昆虫Sf9和Sf21细胞作为宿主细胞的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是一种高效的真核表达系统,近年来得到广泛应用,具有表达水平高,翻译后蛋白修饰机制完整等特点,CYP3A4,CPR与cyt b5共表达得到的蛋白复合体活性有所提高,但是在使用过程中需添加血红素,且需控制血红素用量,除此之外,由于重组杆状病毒的感染导致宿主的死亡裂解,每一轮外源蛋白的表达必须重新感染新鲜培养的细胞,所以无法进行连续培养,导致每次表 达的蛋白在产量和活性上都无法统一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述缺点,提供一种简单稳定高效的方法表达人源CYP3A4酶。本发明旨在用一种新的表达系统-果蝇细胞表达系统简单高效稳定地表达具有代谢活性的CYP3A4酶,从而用于药物体外代谢和药物筛选开发及应用的研究。本发明提出了一种采用一步法即可制得三种蛋白包括CYP3A4蛋白、CPR蛋白和cyt b5蛋白的共转染共表达方法。
本发明提出了一种CYP3A4蛋白、CPR蛋白和cyt b5蛋白共转染共表达的方法,所述方法包括:
(1)构建重组表达质粒:通过PCR扩增方法分别得到CYP3A4、CPR、cyt b5的除去起始密码子和终止密码子的cDNA片段;分别在所述cDNA两端引入酶切位点,经连接反应将所述cDNA插入至载体pMTBip/V5-HisA,分别得到CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒;
(2)将前述得到的CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒、以及筛选质粒同时转染入果蝇S2细胞中,细胞培养后用抗生素杀稻瘟菌素进行筛选;
(3)筛选得到稳转细胞株,经CuSO4诱导,同时表达CYP3A4蛋白、CPR蛋白、cytb5蛋白。
其中,所述蛋白完整cDNA序列(CDS区),即,未除去起始密码子和终止密码子的CYP3A4的cDNA序列如SEQ ID NO.1,1512bp;未除去起始密码子和终止密码子的所述CPR片段的cDNA序列如SEQ ID NO.2,2043bp;未除去起始密码子和终止密码子的所述cyt b5片段的cDNA序列如SEQ ID NO.3,405bp。
其中,所述CYP3A4蛋白包括人源CYP3A4蛋白。
其中,所述酶切位点包括:CYP3A4酶切位点为Xba I/Xho I。CPR酶切位点为Spe I/Xho I。cyt b5酶切位点为Bgl II/Xho I。
其中,在同时转染入果蝇S2细胞时,所述CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒、筛选质粒的比例为:按质量比5~8∶5~8∶5~8∶1。优选地,所述比例为6~8∶6~8∶6~8∶1。
共转染步骤中,所述筛选质粒为抗性质粒pCoblast、或携带潮霉素抗性基因pCoHygro。优选地,所述筛选质粒为抗性质粒pCoblast。共转染步骤中,除用抗生素杀稻瘟菌素进行筛选之外,本发明还可以利用抗生素潮霉素进行筛选。
其中,采用有限稀释法筛选稳转细胞株。
其中,所述步骤(3)得到CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体,其含有的CYP3A4蛋白、CPR蛋白、cyt b5蛋白的表达量及比例关系可以是不确定的,例如,可分别为0.01~99.9%,其表达量及比例因每一种质粒分别进入细胞的具体情况不同而异。
本发明还提出了一种可用于在果蝇细胞中表达人源CYP3A4酶的表达载体。所述表达人源CYP3A4酶的表达载体包括载体pMTBip/V5-HisA、和CYP3A4的除去起始密码子和终止密码子的cDNA序列;其中,载体两端连接位点为Xba I和Xho I。
本发明还提出了一种可用于在果蝇细胞中表达CPR酶的表达载体。所述表达CPR的表达载体含有载体pMTBip/V5-HisA、和CPR的除去起始密码子和终止密码子的cDNA序列;其中,载体两端连接位点为Spe I和Xho I。
本发明还提出了一种可用于在果蝇细胞中表达cyt b5酶的表达载体。所述表达cyt b5的表达载体含有载体pMTBip/V5-HisA、和cyt b5的除去起始密码子和终止密码子的cDNA序列;其中,载体两端连接位点为Bgl II和Xho I。
上述三种蛋白表达载体的构建是本发明创新构建的,目前为目标尚未见有公开报道。其中,使用的载体为pMTBip/V5-HisA,为商品化产品。
本发明中,在一个具体实施方案中,使用pMTBip/V5-HisA作为表达载体,该表达载体是昆虫表达系统中常用的表达载体,大小3642bp,含有严紧调控的强启动子MT启动子(Metallothionein promoter),用硫酸铜或氯化镉可以调控目的蛋白的表达。此外,该表达载体还有多个克隆位点,C端V5抗原和His融合标签,Amp抗性基因以及在大肠杆菌中复制所必须的组分。本发明中,除pMTBip/V5-HisA之外,还可以用pMTBip/V5-HisB,pMTBip/V5-HisC,pMT/V5-His,pAc5.1/V5-His,pMT/BioEase-DEST等载体。
本发明方法中采用表达人源CYP3A4酶的异源表达系统即果蝇表达系统,所述果蝇表达系统(DES)用S2果蝇细胞为表达宿主,可以进行重组蛋白的胞内或分泌表达。S2细胞耐受性好,在培养瓶或培养皿中以半贴壁状态生长,同时也可以用摇瓶和发酵罐进行大规模悬浮培养,细胞培养密度大。用果蝇表达系统可以根据不同的需要选择不同的表达载体。S2细胞还具有复杂的蛋白翻译后修饰,重组蛋白表达量高,易保持酶生物活性等优点。利用质粒转染可以获得稳定的转染细胞株,可以长期保存。并且通过大规模发酵培养可以得到大量重组酶,能快速高效地提供高通量药物代谢研究所需要的重组酶。S2细胞本身不具有CYP本底表达,适合用作CYP3A4的表达系统。
由于CYP3A4酶发挥催化功能需要有传递电子的辅酶CPR与cyt b5,而果蝇S2细胞本身没有这两种辅酶的表达,因此,利用该果蝇细胞表达系统单独表达的CYP3A4酶几乎是没 有活性。另一方面,将CYP3A4、CPR、cyt b5 cDNA构建在同一个载体上会导致表达载体过大,在PCR复制过程中容易造成碱基突变,从而影响转染及表达效率。本发明提出了一种创新的发明构思:分别构建CYP3A4、CPR、cyt b5的表达载体,然后共转染入S2细胞中。这样既保证转染效率,又使三种蛋白在同一细胞中共同表达,能够自发形成有催化活性的三种蛋白聚合物即含有所述三种蛋白的微粒体,有利于模拟天然催化环境,从而保证本发明方法表达的CYP3A4酶具有活性,且活性显著提高。
本发明还提出一种稳转细胞株,所述细胞株中同时含有CYP3A4蛋白的表达载体、CPR蛋白的表达载体、cyt b5蛋白的表达载体、以及筛选质粒。本发明还提出所述高拷贝的稳转细胞株的制备方法,通过PCR扩增方法分别得到CYP3A4、CPR、cyt b5的除去起始密码子和终止密码子的cDNA片段;分别在所述cDNA两端引入酶切位点,经连接反应将所述cDNA插入至载体pMTBip/V5-HisA,分别得到CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒;将前述得到的CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒、以及筛选质粒同时转染入果蝇S2细胞中,细胞培养后用抗生素进行筛选,得到所述稳转细胞株。
考虑到表达载体pMTBip/V5-HisA本身没有果蝇细胞的筛选标记,必须将带有筛选标记的外源质粒与表达载体共转染,根据宿主细胞的耐药性选出高拷贝的细胞株。在一个具体实施方案中,将CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒、与带筛选标记的外源质粒pCoblast或pCoHygro同时转染入果蝇S2细胞中。随后还需要通过western blot的方法从高拷贝细胞株中筛选出三种蛋白都表达量较高的细胞株。
通过本发明方法得到高拷贝的稳转S2细胞株,该细胞株中同时含有CYP3A4,CPR及cyt b5三种蛋白的表达载体,并含有抗性质粒pCoblast。该细胞株经过CuSO4诱导,可同时表达CYP3A4、CPR和cyt b5三种蛋白。将细胞超声破碎,差速离心得到包含三种蛋白CYP3A4、CPR、cyt b5的微粒体,即可应用于药物筛选、药物代谢等方面的研究。在辅酶CPR和cyt b5的协助下,CYP3A4可最大程度地发挥催化功能。该稳转细胞株扩大培养之后,加10%DMSO,分装,冻存于-80℃可长期保存,需要时即可复苏,培养,诱导,很快就可以得到同样的稳转株细胞,简单方便。
本发明中,首先通过PCR的方法分别得到CYP3A4、CPR以及cyt b5的除去起始密码子和终止密码子的cDNA片段,并在各自cDNA两端引入酶切位点。用T4连接酶经连接反应将cDNA插入有相应双酶切位点的载体pMTBip/V5-HisA上,分别得到三个蛋白的重组表达质粒。将得到的重组表达质粒和筛选质粒pCoblast以一定比例同时转染进S2细胞中,培养几天(如,2-3天)后用抗生素杀稻瘟菌素进行筛选,待细胞恢复生长后,用有限稀释法筛选出 稳转细胞株,再用CuSO4诱导蛋白表达,即可得到高表达稳转细胞。该细胞经超声破胞,差速离心得到微粒体系统即包含三种蛋白CYP3A4、CPR、cyt b5的微粒体,其可用于CYP3A4酶代谢相关研究。
微粒体是指所述高表达稳转细胞在匀浆破碎后,通过差速离心的方法得到的由破碎的内质网自我融合形成的囊泡状结构,主要包含内质网膜和核糖体两种基本组分。所述微粒体中包含了细胞色素P450酶系统,用于药物代谢的体外研究。CYP3A4,CPR及cytb5三种蛋白均定位于内质网内膜,因此将表达有三种蛋白的细胞制备成微粒体用于CYP3A4酶相关的药物代谢和药物筛选开发及应用等研究。
本发明方法中,所述引物分为正向引物和反向引物,正向引物序列为目的cDNA序列启动密码子后20bp加上限制性内切酶切位点6bp和相应保护碱基3bp,反向引物为终止密码子前20bp的反向互补序列加上限制性内切酶切位点6bp加上相应保护碱基3bp。其中上述限制性酶切位点在表达载体pMTBip/V5-HisA上也有相应酶切位点并且是在目的蛋白cDNA序列上没有的酶切位点,这样就可以避免在限制性内切酶对目的cDNA序列的切割。
本发明提出了一种CYP3A4 cDNA引物,如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.11所示,包括:
F(SEQ ID NO.4):CTAGTCTAGAACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGCCATGGAAACCTGGCT;
R(SEQ ID NO.5):CCGCTCGAGGGCTCCACTTACGGTGCCATCCCTTGACTCAACCT;
P1(SEQ ID NO.6):CTAGTCTAGAACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC;
P2(SEQ ID NO.7):AAATCTGAGGCGGGAAGCAGCTGCTTCCCGCCTCAGATTTCTCAC;
P3(SEQ ID NO.8):CTGCTTCCCGCCTCAGATTTCTCACAAATCTGAGGCGGGAAGCAG;
P4(SEQ ID NO.9):CCACCTATGATACTGTGCTATAGCACAGTATCATAGGTGG;
P5(SEQ ID NO.10):TAGCACAGTATCATAGGTGGCCACCTATGATACTGTGCTA;
P6(SEQ ID NO.11):CCGCTCGAGGGCTCCACTTACGGTGCCATCCCTT。
本发明还提出了一种CPR cDNA引物,如SEQ ID NO.12~SEQ ID NO.13,为:
F(SEQ ID NO.12):CGGACTAGTATCAACATGGGAGACTCCCA;
R(SEQ ID NO.13):CCGCTCGAG GCTCCACACGTCCAGGGAGT。
本发明还提出了一种cyt b5 cDNA引物,如SEQ ID NO.14~SEQ ID NO.15,为:
F(SEQ ID NO.14):GGAAGATCTGCAGAGCAGTCGGACGAG;
R(SEQ ID NO.15):CCGCTCGAGGTCCTCTGCCATGTATA。
本发明优点及有益效果包括以下:
本发明采用的表达系统比较容易构建。表达载体pMTBip/V5-HisA质粒很小(3.6K),简单,易于操作,含有多个单克隆酶切位点,不需要任何改造,只需双酶切,将目的基因插入 即可。重组载体容易构建,稳定性高。该重组载体比较容易转染进宿主细胞,在细胞内拷贝较多,因此蛋白表达量高。
本发明采用的表达系统经过几周(如,4周左右)的筛选可得到稳定的转染细胞株。此细胞株可按普通细胞冻存方法进行冻存,需要表达蛋白时取出细胞复苏,培养诱导即可,不用重新转染筛选,因此不同批次的蛋白在表达量和活性上都具有统一性。重组表达载体进入宿主细胞后,可整合到宿主基因组中,不容易丢失,稳定性较高,因此,采用所述表达系统共表达CYP3A4/CPR/cyt b5得到的稳转株细胞所制备的微粒体用于药物代谢相关研究,其研究结果具有可重复性。
本发明采用的果蝇表达系统具有翻译后修饰的功能,例如,蛋白质的正确折叠、二硫键形成、糖基化、酰化、磷酸化、羧甲基化等,很多修饰过程与哺乳动物相似。因此,用所述果蝇表达系统表达的CYP3A4酶和天然人源CYP3A4酶在功能上更相似,并且通过将CYP3A4、CPR、cyt b5表达载体共转染、共表达,使三种蛋白自然形成催化复合物即微粒体,使其中的CYP3A4酶活性得到较高提升。因此,通过本发明方法得到的包含三种蛋白CYP3A4、CPR、cyt b5的微粒体用于药物代谢研究所获得的研究结果更为稳定可靠。
本发明方法所选用的宿主S2细胞,其生长条件简单,S2细胞的生长不需要CO2,可方便转换为高密度悬浮培养模式,密度可达到每毫升109个细胞,从而用于大规模蛋白表达以适应高通量筛选的需要。
综上所述,本发明成功构建了一种用于体外代谢与药物-药物相互作用评估的药物代谢酶CYP3A4的制备方法,即果蝇表达系统制备CYP3A4。本发明所述三种蛋白CYP3A4/CPR/cyt b5共转染共表达的方法中,分别构建CYP3A4、CPR、cyt b5 cDNA重组表达载体,并利用果蝇表达系统成功筛选得到表达量高、长势良好的稳转细胞株,经CuSO4诱导,同时表达CYP3A4、CPR、cyt b5三种蛋白,得到包含CYP3A4蛋白、CPR蛋白、cyt b5蛋白的微粒体。
在具体实施方案中,通过酶代谢动力学分析检测证明了本发明方法获得的微粒体中的人源CYP3A4酶的特异性及活性。研究结果表明,本发明方法获得的人源CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体对睾酮代谢米氏常数Km值为82.2μM,最大反应速率Vmax为0.686nmol/min/mg protein,代谢清除率CLint(Vmax/Km)为8.35ml/(min.g protein),显著优于现有技术。
通过本发明方法,稳转细胞经超声破胞、差速离心得到的共表达CYP3A4、CPR、cyt b5的微粒体(microsomes)系统为目的表达系统,可以成功应用于体外药物代谢及药物相互作用研究。在一个具体实施方案中,研究表明,随着CYP3A4抑制剂酮康唑的浓度增加,本发明方法制得的CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体中的CYP3A4活性受抑制而下降,其代谢睾酮的能力明显下降,睾酮的CYP3A4代谢产物6β-羟基睾酮生成量也呈现明显下降。
缩写:
CYP3A4:cytochrome P450 3A4细胞色素P450 3A4酶
CPR:cytochrome P450 oxidoreductase细胞色素P450氧化还原酶
cyt b5:cytochrome b5细胞色素b5
NADP:Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
G6P:glucose 6-phosphate葡萄糖6-磷酸
G6PDH:glucose 6-phosphate dehydrogenase葡萄糖6-磷酸脱氢酶
FBS:Fetal bovine serum胎牛血清
DES:Drosophila Expression System果蝇表达系统
Bip SS:Bip signal sequence Bip信号定位序列
附图说明
图1为表达载体pMTBip/V5-HisA的质粒图谱。
图2为融合PCR技术得到的CYP3A4的3个子片段电泳鉴定结果。其中,泳道1,2,3分别表示融合PCR得到的三个子片段S1,S2,S3。图2表明3个片段大小与预期相同,条带单一。
图3为PCR扩增得到CYP3A4 cDNA全长电泳鉴定结果,CYP3A4 cDNA大小为1512bp。
图4为重组质粒双酶切鉴定结果,其中,1为cyt b5重组质粒酶切结果,2为CPR重组质粒酶切结果,3为CYP3A4重组质粒酶切结果。
图5为经杀稻瘟菌素blasticidin筛选得到的36个共表达CYP3A4/CPR/cyt b5单克隆稳转细胞株经诱导表达目标蛋白的western blot鉴定结果。
图6为筛选得到的单克隆稳转细胞株经培养,诱导表达得到的CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体对睾酮代谢动力学分析,其中,A图表示的是共表达微粒体对CYP3A4特征性底物睾酮代谢的动力学曲线;B图是由动力学曲线进行线性转化分析得到;横坐标为睾酮浓度的倒数,纵坐标为反应速率的倒数。
图7为酮康唑对CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体抑制作用分析,其中,图7A表示的是不同浓度酮康唑(横坐标)对CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体对睾酮代谢能力(6β-羟基睾酮生成量)的影响;图7B是由图7A数值进行非线性回归分析得到,横坐标为酮康唑浓度的对数值,纵坐标为相对酶活,由此得出酮康唑抑制共表达微粒体CYP3A4酶的半抑制浓度(IC50)值。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限 于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
实施例中所用材料如下:
1.细胞来源
果蝇S2细胞购自invitrogen公司。
2.表达载体来源 
即pMTBip/V5-HisA购自invitrogen公司。
3.质粒来源
pMD18-T simple/CYPOR购自sino Biological公司,pENTR223.1/CYB5A购自CUABIO Biotech公司;抗性质粒pCoblast购自invitrogen公司。
4.主要试剂
CuSO4,Blasticidin,Schnerder’s insect medium,NADP,G6P,G6PDH,氨苄青霉素均购自sigma公司;睾酮,6β-羟基睾酮,酮康唑均购自安耐吉公司;皮质甾酮购自TCI公司;胎牛血清购自Gibco公司;KOD DNA聚合酶,T4连接酶及相应缓冲液购自NEB公司;质粒小抽试剂盒及无内毒素大抽试剂盒购自天根生物公司;BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司;色谱级乙腈购自Fisher Scientific公司。
实施例1 CYP3A4,CPR和cyt b5 cDNA的扩增和重组质粒的构建
未除去起始密码子和终止密码子的CYP3A4、CPR、cyt b5 cDNA片段的序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。
1.1 CYP3A4 cDNA的扩增
先设计以下CYP3A4 cDNA引物,SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.11所示,包括以下:
F:CTAGTCTAGAACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGCCATGGAAACCTGGCT(SEQ ID NO.4) 
R:CCGCTCGAGGGCTCCACTTACGGTGCCATCCCTTGACTCAACCT(SEQ ID NO.5)
P1:CTAGTCTAGAACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC(SEQ ID NO.6)
P2:AAATCTGAGGCGGGAAGCAGCTGCTTCCCGCCTCAGATTTCTCAC(SEQ ID NO.7)
P3:CTGCTTCCCGCCTCAGATTTCTCACAAATCTGAGGCGGGAAGCAG(SEQ ID NO.8)
P4:CCACCTATGATACTGTGCTATAGCACAGTATCATAGGTGG(SEQ ID NO.9)
P5:TAGCACAGTATCATAGGTGGCCACCTATGATACTGTGCTA(SEQ ID NO.10)
P6:CCGCTCGAGGGCTCCACTTACGGTGCCATCCCTT(SEQ ID NO.11)
利用融合PCR技术,以F,R,P1,P2,P3,P4,P5,P6为引物先扩增出三段子片段,如图2所示的电泳鉴定结果,其中,泳道1,2,3分别表示融合PCR得到的三个子片段S1,S2,S3。图2表明3个片段大小与预期相同,条带单一。
再以P1,P6为引物将得到的三个子片段连接以得到CYP3A4片段全长,其中,5’端酶切位点Xba I,3’端酶切位点Xho I。PCR扩增得到CYP3A4 cDNA全长电泳鉴定结果如图3所示,CYP3A4 cDNA大小为1512bp。
1.2.CPR和cyt b5 cDNA的扩增
设计CPR PCR引物,如SEQ ID NO.12~SEQ ID NO.13:
F:CGGACTAGTATCAACATGGGAGACTCCCA(SEQ ID NO.12);
R:CCGCTCGAG GCTCCACACGTCCAGGGAGT(SEQ ID NO.13);
5’端引入酶切位点Spe I,3’端引入酶切位点Xho I。
设计cyt b5 PCR引物,如SEQ ID NO.14~SEQ ID NO.15:
F:GGAAGATCTGCAGAGCAGTCGGACGAG(SEQ ID NO.14);
R:CCGCTCGAGGTCCTCTGCCATGTATA(SEQ ID NO.15);
5’端引入酶切位点Bgl II,3’端引入酶切位点Xho I。
分别以含有CPR和cyt b5 cDNA的质粒pMD18-T simple和pENTR223.1为模板,经PCR得到CPR与cyt b5 cDNA。
1.3分别构建CYP3A4,CPR,cyt b5重组质粒
将CYP3A4,CPR,cyt b5的PCR产物回收,用T4连接酶将其与相应双酶切的表达载体pMTBip/V5-HisA(CYP3A4-Xba I/Xho I,CPR-Spe I/Xho I,cyt b5-Bgl II/Xho I,如图1所示)于16℃连接过夜,得到重组表达质粒。
重组质粒双酶切鉴定结果如图4所示,其中,1为cyt b5重组质粒酶切结果,2为CPR重组质粒酶切结果,3为CYP3A4重组质粒酶切结果。
1.4将重组表达质粒导入大肠杆菌感受态细胞DH5α中,用氨苄青霉素Amp筛选重组质粒。挑取几个单克隆菌落,分别用5ml有氨苄青霉素的LB液体培养基37度振荡培养过夜。用质粒小抽试剂盒提取质粒,用相应的限制性内切酶双酶切质粒,将凝胶电泳鉴定为阳性克隆的质粒测序,选择测序结果正确的克隆扩大培养。
1.5用三角培养瓶将上述测序正确的质粒大规模培养(200ml),用无内毒素质粒大抽试 剂盒提取质粒,测定浓度,-20℃保存备用。
实施例2重组表达质粒转染果蝇S2细胞并筛选得到稳转单克隆细胞株。
复苏果蝇S2细胞,完全培养基(Schneider’s Insect Medium加10%FBS)28℃,无CO2培养箱中培养数天。待细胞长势良好,铺6孔板,每孔3*106个细胞,总体积3ml,培养1天。
磷酸钙转染法将分别插入CYP3A4,CPR,cyt b5 cDNA的重组表达载体和筛选质粒pCoblast以一定比例即质量比6μg∶6μg∶6μg∶1μg共转染进S2细胞。培养24小时后,换上新鲜的完全培养基培养2天。在其他实施例中,重组表达载体CYP3A4∶CPR∶cyt b5 cDNA∶筛选质粒之间的比例可以是5-8∶5-8∶5-8∶1范围内的任一具体数值。
用含有杀稻瘟菌素(Blasticidin)的完全培养基进行筛选,杀稻瘟菌素终浓度为25μg/ml。培养4天后,用有限稀释法筛选得到单克隆转染子:根据转染效率,将上述筛选后的细胞稀释成100个细胞/ml,与正常S2细胞混合,接入96孔板。每个孔总体积200μl,转染细胞平均每孔1~2个细胞。抗生素杀稻瘟菌素终浓度25μg/ml。培养10天左右,将96孔板中的单克隆细胞株转移出来,逐步扩大培养。最后,共得到36个稳转细胞株。
在其他实施例中,筛选质粒可以是pCoHygro;筛选可以用含有潮霉素的培养基。
将筛选出的单克隆转染子分别用终浓度为750μM的CuSO4诱导4天,western blot检测CYP3A4表达量。由于外源基因是随机整合入宿主基因组中,因此目的蛋白的表达受插入位点的影响,并且还可能改变宿主细胞的生长特性。所以我们需要筛选出生长速度快,长势优良,并且CYP3A4表达量高的细胞株。将36个稳转细胞株都扩大培养,各从中取出1ml于24孔板中培养,经CuSO4诱导表达蛋白。4天后,3000rpm将细胞沉淀。然后沉淀的细胞用RIPA裂解(含蛋白酶抑制剂和PMSF),BCA法测定蛋白浓度,加相应上样缓冲液,100℃水浴锅中处理10min,western blot检测蛋白表达情况。每孔蛋白上样量均为10μg。如图5所示,CPR大小约为75KD,CYP3A4大小约为55KD,cyt b5大小约为17KD,M为蛋白marker。实验结果表明大部分单克隆细胞株三种蛋白都有较高表达。
实施例3制备共表达CYP3A4/CPR/cyt b5单克隆稳转细胞微粒体
大规模培养CYP3A4/CPR/cyt b5单克隆稳转细胞株G3,并用CuSO4(终浓度750μM)诱导4天。
3000rmp离心5min收集细胞,以25%的比例加入蔗糖/Tris缓冲液(Tris 50mM;MgCl2 3mM;蔗糖200mM,PH7.4),超声破碎,功率100W,超声5s,间隔10s,10个循环。超声结束后4℃,10500g离心25min。将上清转移到超速离心管中,置于超速离心机中,4℃,105000g离心1h,小心弃去上清。
沉淀用0.1M磷酸钾缓冲液(PH 7.4)重悬即为CYP3A4/CPR/cyt b5微粒体溶液,BCA法测定蛋白浓度,-80℃保存备用。
实施例4重组微粒体CYP3A4酶对特征性底物睾酮的代谢动力学研究
睾酮属于内源性甾类化合物,在体外代谢研究中是最常用的CYP3A4的底物。本实施例中,用实施例3制备得到的重组微粒体在体外对不同浓度的睾酮进行代谢。通过建立睾酮及其代谢产物6β-羟基睾酮的LC-MS/MS分析方法将上述样品进行分析,并用软件进行动力学曲线的拟合,得到底物睾酮的代谢动力学参数米氏常数Km值以及最大反应速率Vmax值。
其中,孵育体系(总体积200μl,缓冲体系0.1M磷酸钾缓冲液,PH7.4)包含:G6P 5mM,G6PDH 0.4U/ml,微粒体蛋白1mg/ml,睾酮(10,25,50,100,200,400μM)。37℃预孵5min后,加入NADP(终浓度1mM)启动反应后37℃孵育15min。200μl冰乙腈(含1μg/ml内标皮质甾酮)终止反应,涡旋20s,14000rpm离心20min,上清用0.45μm滤头过滤后用于LC-MS/MS分析。如图6所示,其中,图6A图表示的是共表达微粒体对CYP3A4特征性底物睾酮代谢的动力学曲线,随着睾酮浓度的增加(横坐标),反应速率(纵坐标)随之增加并在高浓度时有饱和趋势。图6B图是由动力学曲线进行线性转化分析得到,横坐标为睾酮浓度的倒数,纵坐标为反应速率的倒数,由此得出微粒体CYP3A4酶对睾酮代谢的米氏常数Km值和最大反应速率Vmax
通过分析得出该人源CYP3A4/CPR/cyt b5蛋白共表达微粒体对睾酮代谢米氏常数Km值为82.2μM,最大反应速率Vmax为0.686nmol/min/mg protein,代谢清除率GLint(Vmax/Km)为8.35ml/(min.g protein)。并且,所得Km值与美国食品药品监督局(FDA)报道的CYP3A4酶代谢睾酮Km值一致,处于52-94μM范围内,同时Vmax和GLint也明显优于现有报道的数值,从而说明了本发明表达方法的正确性以及所得的CYP3A4酶可用来开展药物代谢和药物相互作用的研究。
前述提及的美国FDA报道内容参见:Drug Development and Drug Interactions:Table of Substrates,Inhibitors and Inducers;美国FDA指导原则;相关网页链接为: http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractions  Labeling/ucm093664.htm
实施例5 CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体在药物相互作用研究中的应用
当两种或两种以上的药物同时用药时,有可能发生代谢相关的药物相互作用,药物相互作用能引起严重的副反应,对机体造成伤害,严重者可造成死亡。而CYP酶的抑制被认为是引起药物相互作用的主要原因。因此,在新药研发的过程中,了解候选化合物在CYP酶介导的药物相互作用的潜在可能性非常重要。由于CYP3A4在药酶占有的重要地位,对CYP3A4 相关的代谢和抑制研究是新药研发过程中的重要部分。
在药物代谢研究中,酮康唑常被用作CYP3A4的阳性抑制剂。本实施例研究了不同浓度的酮康唑对CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体代谢睾酮的抑制作用。
在200μl孵育体系中,包含5mM G6P,0.4U/ml G6PDH,微粒体蛋白(实施例3制得的CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体)1mg/ml,睾酮100μM,以及不同浓度的酮康唑(0.025,0.05,0.1,0.25,0.5μM),以不加酮康唑的孵育体系为对照。37℃预孵5min后,加入NADP(终浓度1mM)启动反应,孵育15min后,加含有200μl的乙腈(含有内标化合物皮质甾酮1μg/ml)终止反应并沉淀蛋白,经14000rpm离心20min,上清过滤后用LC-MS/MS分析。
如图7所示,图7A表示的是不同浓度酮康唑(横坐标)对CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体对睾酮代谢能力的影响,随着酮康唑浓度的增加,睾酮的代谢产物6β-羟基睾酮生成量呈现浓度梯度依赖性减少。图7B是由A图数值进行非线性回归分析得到,横坐标为酮康唑浓度的对数值,纵坐标为相对酶活,由此得出酮康唑抑制共表达微粒体CYP3A4酶的半抑制浓度IC50值。
结果表明,随着酮康唑浓度的增加,睾酮的代谢产物6β-羟基睾酮生成量呈现明显的浓度依赖性的降低。即,随着酮康唑浓度的增加,所述CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体所包含的CYP3A4酶活性随之下降。通过数据转换,非线性回归分析可得知睾酮浓度为100μM时,酮康唑抑制CYP3A4/CPR/cyt b5共表达微粒体所包含的CYP3A4酶活性,半抑制浓度IC50值为0.07μM。

Claims (10)

1.一种重组人源CYP3A4/CPR/cyt b5蛋白共转染共表达的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)构建重组表达质粒:通过PCR扩增方法分别得到CYP3A4、CPR、cyt b5的除去起始密码子和终止密码子的cDNA片段;分别在所述cDNA两端引入酶切位点,经连接反应将所述cDNA插入至载体pMTBip/V5-HisA,分别得到CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒;
(2)将前述得到的CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒、以及筛选质粒同时转染入果蝇S2细胞中,细胞培养后用抗生素进行筛选;
(3)筛选得到稳转细胞株,经CuSO4诱导,同时表达CYP3A4蛋白、CPR蛋白、cyt b5蛋白。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述CYP3A4蛋白是人源蛋白。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述筛选质粒包括质粒pCoblast、pCoHygro。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述抗生素包括杀稻瘟菌素、潮霉素。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒、筛选质粒按质量比5-8∶5-8∶5-8∶1的比例进行转染。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述稳转细胞株的筛选方法包括有限稀释法。
7.一种可用于在果蝇细胞中表达人源CYP3A4蛋白的表达载体,其特征在于,所述表达载体含有载体pMTBip/V5-HisA、和CYP3A4的除去起始密码子和终止密码子的cDNA序列;所述载体两端连接位点为Xba I和Xho I。
8.一种稳转细胞株,其特征在于,所述细胞株中同时含有CYP3A4蛋白的表达载体、CPR蛋白的表达载体、cyt b5蛋白的表达载体、以及筛选质粒。
9.一种稳转细胞株的制备方法,其特征在于,通过PCR扩增方法分别得到CYP3A4、CPR、cyt b5的除去起始密码子和终止密码子的cDNA片段;分别在所述cDNA两端引入酶切位点,经连接反应将所述cDNA插入至载体pMTBip/V5-HisA,分别得到CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒;将前述得到的CYP3A4蛋白的重组表达质粒、CPR蛋白的重组表达质粒、cyt b5蛋白的重组表达质粒、以及筛选质粒同时转染入果蝇S2细胞中,细胞培养后用抗生素进行筛选,筛选得到如权利要求8所述的稳转细胞株。
10.一种CYP3A4 cDNA引物,其特征在于,所述引物如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.11所示,包括:
F(SEQ ID NO.4):CTAGTCTAGAACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGCCATGGAAACCTGGCT;
R(SEQ ID NO.5):CCGCTCGAGGGCTCCACTTACGGTGCCATCCCTTGACTCAACCT;
P1(SEQ ID NO.6):CTAGTCTAGAACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGC;
P2(SEQ ID NO.7):AAATCTGAGGCGGGAAGCAGCTGCTTCCCGCCTCAGATTTCTCAC;
P3(SEQ ID NO.8):CTGCTTCCCGCCTCAGATTTCTCACAAATCTGAGGCGGGAAGCAG;
P4(SEQ ID NO.9):CCACCTATGATACTGTGCTATAGCACAGTATCATAGGTGG;
P5(SEQ ID NO.10):TAGCACAGTATCATAGGTGGCCACCTATGATACTGTGCTA;
P6(SEQ ID NO.11):CCGCTCGAGGGCTCCACTTACGGTGCCATCCCTT。
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