KR20230050004A

KR20230050004A - 마이크로-스케일 아데노부속바이러스 벡터 정제 방법

Info

Publication number: KR20230050004A
Application number: KR1020210133194A
Authority: KR
Inventors: 박인아; 김경진; 최한경
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2021-10-07
Filing date: 2021-10-07
Publication date: 2023-04-14
Also published as: KR102529962B1

Abstract

본 발명은 아데노부속바이러스 벡터를 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 아데노부속바이러스 벡터의 생산 스케일을 현저히 축소시킬 수 있는 세포 용해 방법 및 정제 조건을 규명하였다. 본 발명의 개선된 아데노부속바이러스 벡터 정제 기법은 생산 기간을 단축시키고, 정제 효율을 높임으로써 높은 역가의 벡터를 수득할 수 있으며, 동시에 제작비용 절감의 효과를 얻을 수 있다.

Description

마이크로-스케일 아데노부속바이러스 벡터 정제 방법 {Micro-scale purification method of adeno-associated virus vector}

본 발명은 아데노부속바이러스 벡터를 정제하는 방법에 관한 것으로, 종래의 정제 기술과 비교하여 아데노부속바이러스 벡터의 정제 단계를 간소화하고 수득 효율을 극대화한 정제 기법에 관한 것이다.

최근 유전자 요법으로 특정 유전자를 체내 세포로 전달하기 위해 여러가지 바이러스성 유전자 운반체가 사용되고 있다. 그 중, 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV)는 비교적 낮은 역가의 바이러스 벡터만으로도 특정 유전자를 세포 내로 전달이 가능하며, 유전자 발현까지 유도할 수 있다. 또한, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 렌티바이러스 등과 같은 다른 바이러스성 유전자 운반체들에 비하여 낮은 면역 반응을 일으키며, 패키징(packaging)시 선택하는 혈청형(serotype)에 따라 조직 특이적인 감염성의 차이를 유도하여 보다 효율적인 유전자 전달이 가능하다. 이러한 기술은 현재 기초 과학 분야에서 빈번히 활용되고 있으며, 최근에는 아데노부속바이러스 벡터를 활용한 유전자 치료제로써의 가능성이 제시되면서 유전자 가위의 도입과 같은 치료 목적 등에 대한 활용 가능성에 관심이 고조되고 있다.

한편, 세포주에서 아데노부속바이러스를 수득하기 위해서는 세포 파쇄의 단계를 거쳐야 하는데, 크게 두 가지의 방법이 사용된다. 물리적 파쇄로써 초음파 세포 파쇄기를 이용하는 방법과, 산성 의존적 세포 용해법으로써 pH 2.0~4.2의 높은 산성 조건에서 세포막을 파쇄하는 방법이다. 초음파 세포 파쇄 기법의 경우, 바이러스를 정제하기 위하여 1종 당 30분 이상의 파쇄 시간이 소요되며, 고가의 초음파 세포 파쇄기가 필수적이고, 실험자의 파쇄기 작동 숙련도에 따라 최종 바이러스 정제 순도에 큰 영향을 미친다는 문제가 있다. 또한, pH 5.0 이하의 산성 시약을 사용하여 아데노부속바이러스를 정제하는 경우, 바이러스를 감싸는 캡시드(capsid) 단백질의 불안정화가 가속화되고, 특히 상온에서의 아데노바이러스 안정도가 급격히 낮아져 정제 효율에 영향을 미칠 수 있다 (Lins-Austin et al., 2020, Viruses).

또한, 아데노부속바이러스 벡터의 경우 다른 바이러스성 유전자 운반체에 비하여 그 제작 과정이 복잡하고, 제작 기간 또한 오래 소요되는 문제점이 있다. 특히, 아데노부속바이러스 벡터의 제작에 필요한 대량의 DNA 공여체를 수득하는데 제작 기간의 상당 부분이 소요되며, 제작 시 투자 기간 대비 아데노부속바이러스 벡터의 수득율이 낮다는 단점이 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 아데노부속바이러스 벡터의 정제 단계를 간소화하면서도 정제 효율을 더욱 높이기 위해 예의 노력한 결과, 아데노부속바이러스 벡터의 생산 스케일을 현저히 축소시킬 수 있는 세포 용해 방법 및 정제 조건을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 종래 기법에 비하여 적은 양의 AAV 생산세포주만을 활용하여 AAV 벡터를 생산할 수 있도록, (a) 형질전환된 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 생산세포주에 pH 7.5-8.5의 NaOH 용액을 처리하여 세포를 용해하는 단계; (b) 원심분리하고, DNase를 처리하여 AAV 벡터를 분리하는 단계; 및 (c) 아이오딕사놀(iodixanol)을 이용한 밀도구배 원심분리하여 AAV 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계;를 포함하는, 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 정제 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 종래 기법에 비하여 적은 양의 AAV 생산세포주만을 활용하여 AAV 벡터를 생산할 수 있도록, (a) 형질전환된 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 생산세포주에 pH 7.5-8.5의 NaOH 용액을 처리하여 세포를 용해하는 단계; (b) 원심분리하고, DNase를 처리하여 AAV 벡터를 분리하는 단계; 및 (c) 아이오딕사놀(iodixanol)을 이용한 밀도구배 원심분리하여 AAV 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계;를 포함하는, 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 정제 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터"는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 렌티바이러스 등과 같은 다른 바이러스성 유전자 운반체들에 비하여 낮은 면역 반응을 나타내며, 접종 후에 인위적으로 삽입한 유전자가 지속적으로 표현되고 다양한 조직에 유전자를 운반하는 능력을 갖는 바, 유전자 치료에 활용될 수 있다. 본 발명의 용어 "아데노부속바이러스"는 "아데노연관바이러스"와 혼용 가능하다.

본 발명에서 아데노부속바이러스 벡터의 생산세포주는 HEK293 또는 HEK293T 세포일 수 있다.

본 발명에서 아데노부속바이러스 벡터 생산세포주의 양은 12 x 10⁷이다. 아데노부속바이러스 벡터 생산의 기본 실험 기법을 제공하는 Addgene에 의하면, 아데노부속바이러스 벡터의 생산을 위하여 150mm²dish 기준 최소 20장(60 x 10⁷)의 생산세포주가 필요하며, 이는 현재까지 개발된 AAV 벡터 생산 기법 중 가장 적은 용량으로 알려져 있다. 본 발명에서는, 종래의 정제 기술 대비 약 20%의 생산세포주만으로도 높은 아데노부속바이러스 벡터의 수득율이 보장되는 정제 조건을 규명하였다.

본 발명 아데노부속바이러스 벡터 생산세포주의 형질전환 방법은 당업계의 통상적인 형질전환 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 아데노부속바이러스 생산세포주에 트랜스퍼(transfer), 캡시드(capsid), 및 헬퍼 플라스미드(helper plasmid) 3종을 도입하여 아데노부속바이러스 벡터를 발현하는 생산세포주를 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

형질전환된 상기 생산세포주에서 아데노부속바이러스 벡터를 수득하기 위해서는 세포 파쇄의 단계를 거쳐야 한다. 본 발명에서는, 약염기성 시약을 이용하여 생산세포주를 용해하였으며, 구체적으로, pH 8.0의 3.5μM NaOH 용액을 세포에 처리하였다.

초음파 세포 파쇄와 같은 물리적 파쇄 기법을 사용하는 경우, 아데노부속바이러스 벡터의 파괴가 불가피하나, 상기 약염기성 시약 처리를 통한 세포 용해는 아데노부속바이러스 벡터의 보존 및 수득율을 극대화할 수 있다. 또한, 산성 시약을 활용한 세포 용해법을 이용하는 경우, 아데노부속바이러스 캡시드의 안정성에 영향을 미치나, 본 발명의 약염기성 시약은 pH 7.5-8.5 수준으로 아데노부속바이러스 캡시드의 안정성에 문제를 야기하지 않는다. 아울러, 본 발명의 약염기성 세포 용해 방법은 세포 용해 시 시료간 교차 오염의 가능성이 없으며, 실험 시간의 단축 및 실험자의 자유도를 확보할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서는, 초음파 파쇄 기법으로 생산세포주를 용해한 비교예 2와, 본 발명의 약염기성 시약을 이용하여 생산세포주를 용해한 실시예 1의 AAV 벡터 수득량을 비교한 결과, 실시예 1의 방법으로 AAV 벡터를 정제한 경우에 AAV 벡터 수득량이 현저히 높은 것을 확인하였다 (평가예 1). 즉, 본 발명의 축소된 스케일의 AAV 벡터 정제 기법에 있어서, 약염기성 시약을 이용한 세포 용해 단계는 필수적임을 알 수 있다.

또 다른 선행 연구의 AAV 정제 기법에 있어서, 생산세포주의 용해에 약염기성인 lysis buffer (pH 8.0)를 이용하였으나 (J Virol Methods. 183(2): 139-146, 2012), 상기 약염기성 lysis buffer의 처리는 그 이후에 3번의 반복적인 freeze/thaw cycle이 필수적이라는 점에서 본 발명과는 차이가 있다.

아데노부속바이러스 벡터의 생산세포주를 파쇄한 이후, 원심분리를 통하여 아데노부속바이러스 벡터와 세포주의 잔해를 분리하였다. 이어서, DNase 처리를 통해 아데노부속바이러스 벡터를 제외한 DNA 오염 물질을 제거한다.

다음으로, 아데노부속바이러스 벡터의 정제를 위하여, 아이오딕사놀(iodixanol)의 밀도차를 이용하는 초원심분리(ultracentrifuge)를 진행한다. 종래의 정제 기법은 15%(v/v) 아이오딕사놀 8ml, 25%(v/v) 6ml, 40%(v/v) 5ml, 60%(v/v) 5ml의 농도 구배를 이용하는 것이 가장 적은 용량으로 알려져 있다.

본 발명에서는 생산세포주의 양을 축소하면서, 축소된 시료에 최적화된 아이오딕사놀 용액의 농도 구배 조건을 규명하였다. 구체적으로, 아이오딕사놀 15%(v/v) 960μL, 25%(v/v) 720μL, 40%(v/v) 600μL, 및 60%(v/v) 600μL의 농도 구배로 첨가하는 것이다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서는, 약염기 시약을 이용하여 세포를 용해하고 아이오딕사놀 구배 비율을 축소한 실시예 1의 정제 기법이, 종래의 정제 기법인 비교예 1에 비하여 약 20% 정도의 시료만으로도 약 130배 가량 높은 AAV 벡터 수득율을 나타내는 것을 확인하였다 (평가예 1). 따라서, 본 발명의 아데노부속바이러스 벡터의 정제 방법은, 핸들링되는 시료를 scale-down 시킴으로써 정제 단계는 간소화하고, AAV 벡터의 수득율은 높일 수 있는 효율적인 정제 기법이다.

본 발명은 아데노부속바이러스 벡터의 생산 스케일을 현저히 축소시킬 수 있는 세포 용해 방법 및 정제 조건을 규명하였다. 본 발명의 개선된 아데노부속바이러스 벡터 정제 기법은 생산 기간을 단축시키고, 정제 효율을 높임으로써 높은 역가의 벡터를 수득할 수 있으며, 동시에 제작비용 절감의 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 종래의 AAV 벡터 정제 프로토콜과 본 발명의 micro-scale 정제 프로토콜을 도식화한 도이다.
도 2는 종래의 AAV 벡터 정제 프로토콜과 본 발명의 micro-scale 정제 프로토콜에 따라 정제된 AAV 벡터의 유전자 전달 효과를 조직화학염색법을 통해 비교한 도이다.
도 3은 본 발명의 micro-scale 정제 프로토콜에 따라 정제된 AAV 벡터의 유전자 전달 효과를 활동성 측정을 통해 확인한 도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예. 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 정제

실시예 1. Micro-scale 정제 기법

150mm² dish 4장의 AAV 생산 세포주(12 x 10⁷cell)와 배지를 얻어 50mL tube에 옮긴 후, 2,000 g에 3분 동안 원심분리를 진행하였다. 침전된 세포를 3.5μM NaOH (pH 8.0) 4 mL에 용해시킴으로써 세포를 파쇄한 후, 4℃에서 80rpm에 1.5시간 동안 원심분리를 진행하였다.

이후 10x PBS 440μL, 0.01% Pluronic F68 440μL, 5M NaCl 16μL를 각각 추가해준 후 vortex 및 10,000rpm에 1분 동안 원심분리를 진행하였다. 추가로 4℃에서 30초 동안 sonication을 진행한 후 10,000rpm에서 1분 동안 원심분리를 진행하였다. 상층액을 얻어 새로운 마이크로튜브에 옮긴 후, benzonase nuclease 200 unit을 추가하여 37℃에서 45분 동안 반응시켰다. 추가로 4℃에서 2415rpm에 10분 동안 원심분리를 진행하였다.

다음으로, 상층액 2mL을 얻어 축소된 구배(gradient) 비율인 아이오딕사놀(iodixanol) 15%(v/v) 960μL, 25%(v/v) 720μL, 40%(v/v) 600μL, 및 60%(v/v) 600μL의 비율로 상층액에 추가한 후, 10℃에서 268,200 g에 2시간 동안 초원심분리를 진행하였다. 동시에 Amicon ultra tube (0.5ml, 100 K)에 0.001% pluronic F68 PBS 용액을 넣어준 후 4℃에서 12,000rpm에 20분 동안 원심분리하여 활성화 및 세척을 진행하여 준비하였다. 초원심분리를 진행한 용액 중 60% iodixanol gradient층을 2mL 주사기로 얻어 준비된 Amicon ultra tube에 옮긴 후 spin down을 진행하였다. 투과된 용액은 버린 후 걸러진 AAV를 NaCl이 제거된 0.001% Pluronic F68 용액으로 원심분리를 통해 세척하였다. 그 후 세척된 AAV를 40μL로 용출하였다.

비교예 1. Standard protocol

AAV 생산의 기본 실험 기법(standard protocol)을 제공하는 Addgene의 AAV 정제법에 따라, 150mm² dish 20장 (60 x 10⁷cell)의 세포를 준비하였다. 세포 파쇄 시에는 pH 8.0의 NaOH 시약을 사용한 실시예 1과는 달리, 초음파 세포 파쇄기를 사용하여 세포를 파쇄하였다. 이후, gradient iodixanol의 비율 또한 상기 기본 실험 기법에 따라 아이오딕사놀 15%(v/v) 8ml, 25%(v/v) 6ml, 40%(v/v) 5ml, 60%(v/v) 5ml의 비율로 추가하여 AAV를 정제하였다.

비교예 2. 아이오딕사놀 구배 비율의 축소

실시예 1과 동일하게 진행하되, 세포 파쇄 시 pH 8.0의 NaOH 시약을 사용한 것이 아닌, 초음파 세포 파쇄기를 사용하여 세포를 파쇄하였다.

평가예 1. AAV 벡터의 수득량 확인

종래 기술은 AAV를 수득하기 위해 많은 양의 세포가 필요하며 그에 따라 수득에 필요한 용액들 또한 많은 양이 사용된다. 이에, 종래 기술과 비교하여 AAV 수득의 효율을 높이기 위해 먼저 사용되는 아이오딕사놀 용액의 구배를 최소화시켜 보았고 (비교예 2), 추가적으로 수득 시 필요한 세포양 축소 및 세포 용해 과정을 변경하여 수득양을 확인해보았다 (실시예 1).

	비교예 1	비교예 2	실시예 1
시료(150mm² dish)	20장	20장	4장
1	3.10E+13	1.20E+11	2.43E+13
2	1.10E+13	2.28E+11	2.31E+14
3	6.60E+12	4.99E+09	1.03E+15
4	1.80E+13	1.26E+10	1.05E+15
5	3.70E+13	n/a	3.54E+14
정제 효율 평균	2.07E+13 (100μL)	9.14E+10 (30μL)	5.38E+14 (20μL)
20μl 기준	4.15E+12	6.09E+10	5.38E+14
총 정제량(GC/ml)	2.07E+14	3.05E+12	2.69E+16

AAV 수득양을 확인한 결과 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 시료가 많이 필요한 기존의 정제 기법을 이용한 비교예 1의 경우, 총 정제량이 2.07 x 10¹⁴GC/ml이었다. 시료 및 아이오딕사놀 구배 비율을 축소하고, 세포 용해에 초음파 파쇄를 시행한 비교예 2의 경우 3.05 x 10¹² GC/ml로 종래 기법에 비하여 오히려 정제 효율이 떨어지는 것을 확인하였다.

그에 반해, 약염기 시약을 이용하여 세포를 용해하고 아이오딕사놀 구배 비율을 축소한 실시예 1의 경우, 총 정제량이 2.69 x 10¹⁶ GC/ml로, 비교예 1 대비 약 130배 정도 높아지는 것을 확인하였다.

즉, 본 발명은 종래의 정제 기술과 비교하여 약 20% 정도의 시료만으로도 높은 AAV 벡터 수득율이 보장될 수 있는 세포 용해 조건 및 아이오딕사놀 구배 비율 조건을 최적화하였다.

평가예 2. AAV 벡터의 효율 평가

Gene X를 표적하는 CRISPR/Cas9(유전자가위) AAV 벡터는 Gene X의 결실을 유도하는 유전자를 전달할 수 있다. 이에, 비교예 1 및 실시예 1 정제 기법으로 AAV 벡터를 생산하여 Cas9을 발현하는 실험 동물 생쥐의 뇌에 주입하였고, Gene X의 발현을 면역조직화학염색법을 통해 확인하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, micro-scale 정제 기법이 적용된 실시예 1의 AAV 벡터는 종래 정제 기법인 비교예 1 AAV 벡터와 비교하여, 유전자 결실을 유도하는 유전자를 전달하는 기능에 있어서 차이가 없는 것을 확인하였다.

나아가, Gene Y를 표적하는 AAV 벡터를 실시예 1 정제 기법으로 생산하고, 해당 AAV 벡터가 주입된 실험 동물 생쥐의 활동성(locomotor activity)을 측정하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 실험군(Gene Y 결실)에서 내재 생체리듬의 변화가 야기된 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에서 제시하는 micro-scale AAV 벡터 정제기법으로 생산한 AAV 벡터가 일주기적인 활동 패턴에 효과적으로 교란하였음을 입증하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 형질전환된 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 생산세포주에 pH 7.5-8.5의 NaOH 용액을 처리하여 세포를 용해하는 단계;
(b) 원심분리하고, DNase를 처리하여 AAV 벡터를 분리하는 단계; 및
(c) 아이오딕사놀(iodixanol)을 이용한 밀도구배 원심분리하여 AAV 벡터를 함유한 분획을 수득하는 단계;
를 포함하는, 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 아데노부속바이러스 벡터의 생산세포주는 HEK293 또는 HEK293T 세포인, 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 아데노부속바이러스 벡터 생산세포주의 양은 12 x 10⁷인, 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 아이오딕사놀은 15%(v/v) 960μl, 25%(v/v) 720μl, 40%(v/v) 600μl, 및 60%(v/v) 600μl의 구배로 첨가하는 것인, 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 정제 방법.