CN116042544A - 一种血清型13型重组腺相关病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种血清型13型重组腺相关病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清型13型重组腺相关病毒及其制备方法和应用，通过构建包含AAV2野生病毒的Rep基因和AAV13野生病毒的Cap基因的重组腺相关病毒血清型包装质粒，并基于三质粒转染系统制备，能够高效快速获得高滴度的重组腺相关病毒rAAV2/13。本发明重组腺相关病毒可作为基因转移载体，将目的基因转导至神经细胞中，其具有高效的表达能力且扩散范围比rAAV2更小，基于此rAAV2/13载体可以携带目的基因用于精准标记大脑小核团用于神经科学研究中的环路标记与操纵，也可以作为基因治疗的载体。

Description

一种血清型13型重组腺相关病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种血清型13型重组腺相关病毒及其制备方法和应用。
背景技术
大脑主要包括左、右大脑半球，是中枢神经中最大和最复杂的结构，是调节机体功能的器官，也是意识、精神、语言、学习、记忆和智能等高级神经活动的物质基础。从结构上看，大脑分为额叶、颞叶、顶叶、枕叶和脑岛等部分，1909年，德国解剖学家布鲁德曼(Brodmann)曾根据皮层细胞的类型以及纤维的疏密对大脑进行分区。将大脑分为52个区，并用数字予以表示。随着技术的进步，对不同脑区的划分越来越精细。不同脑区、不同类型神经元之间的连接编码出了生物的意识和行为，因此，绘制脑联结图谱、揭示神经元连接的结构是解码大脑功能奥秘的基础。
基于病毒载体的标记示踪成为解析神经元结构连接的重要方法之一，通过病毒载体携载荧光标记基因转导神经元，可标记出完整的神经元结构或神经网络结构。其中重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associatedvirus，rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因转移载体。由于具有安全性高、种类多、嗜性广和介导外源基因长期稳定表达等优点，已成为神经科学和基因治疗领域最受欢迎的基因转移载体之一(Bedbrooket.al,Annual Review ofNeuroscience,2018；Wang et al，Nature Reviews DrugDiscovery，2019)。AAV有不同的血清型，不同血清型的衣壳蛋白各不相同，衣壳蛋白的差异决定了其大部分转导特性。在这些不同的血清型中，常用作基因转移载体的有1，2，5，6，8，9等血清型，它们对神经细胞的转导能力强。然而，它们的感染扩散范围仍然较大，容易引起非目标脑区或细胞的感染，因此，需要进一步开发感染扩散范围更小的适用于小核团标记的载体。
目前，已经公布了自然界中存在的AAV共有AAV1～AAV13等13种血清型，不同血清型有不同的靶向性和应用，各血清型AAV的制备方法和产量也有差异。关于AAV13的应用鲜见报道。因此，需要开发高效的制备方法以满足它的功能和应用的研究。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种血清型13型重组腺相关病毒及其制备方法和应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种血清型13型重组腺相关病毒，由包含2型腺相关病毒的Rep基因和13型腺相关病毒的Cap基因的包装质粒包装获得。
进一步地，所述血清型13型重组腺相关病毒的基因组中包含外源基因；
优选地，所述所述外源基因包括荧光标记基因和/或其他外源基因。
本发明还提供所述血清型13型重组腺相关病毒的制备方法，包括：将重组腺相关病毒包装质粒、腺相关病毒核心质粒和腺病毒元件辅助质粒共转染包装细胞系，之后进行病毒收获、纯化和浓缩，即得；
所述重组腺相关病毒包装质粒携带2型腺相关病毒的Rep基因和13型腺相关病毒的Cap基因；
所述腺相关病毒核心质粒携带腺相关病毒的ITR序列。
进一步地，所述腺病毒元件辅助质粒为pAd-Helper；
所述包装细胞系为HEK-293T细胞；
所述重组腺相关病毒包装质粒、腺相关病毒核心质粒和腺病毒元件辅助质粒的质粒分子数为1：1：1。
进一步地，所述重组腺相关病毒包装质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步地，所述重组腺相关病毒核心质粒在ITR中间依次插入启动子、外源基因、转录调节元件和转录终止序列。
进一步地，所述启动子为CMV启动子或EF1α启动子；
所述外源基因包括荧光标记基因和/或其他外源基因；
所述转录调节元件为WPRE；
所述转录终止序列为SV40 polyA或hGH polyA。
本发明还提供所述血清型13型重组腺相关病毒作为基因转移载体的应用。
本发明还提供所述血清型13型重组腺相关病毒在制备小核团的标记载体中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明构建了重组腺相关病毒rAAV2/13的包装质粒，其包含AAV2野生病毒的Rep基因和AAV13野生病毒的Cap基因，并基于三质粒转染系统生产重组腺相关病毒，能够高效快速获得高滴度的重组腺相关病毒rAAV2/13，为重组腺相关病毒rAAV2/13的特性研究和推广应用提供了技术支持。
2、本发明首次验证了rAAV2/13在神经系统局限性感染的标记特性，rAAV2/13载体携载绿色荧光蛋白基因(EGFP)感染VTA和S1脑区，均可见非常局限的小范围扩散。进一步地，将rAAV2/13与现有的普遍用于小范围标记的rAAV2载体对比，证明了rAAV2/13比rAAV2扩散范围更小。这些结果均表明rAAV2/13的局限性标记特性，更适合小核团的精准标记，为神经科学研究、疾病模型建立和基因治疗等提供了更好的工具和技术支撑，具有广泛的应用价值和市场前景。
3、本发明重组腺相关病毒rAAV2/13可作为基因转移载体，将目的基因转导至神经细胞中，其具有高效的表达能力且扩散范围比rAAV2更小，基于此rAAV2/13载体可以携带目的基因用于精准标记大脑小核团用于神经科学研究中的环路标记与操纵，也可以作为基因治疗的载体。
附图说明
图1为重组腺相关病毒血清型包装质粒pAAV-RC2/13表达载体图谱。
图2为rAAV2/13银染结果图。
图3为rAAV2/13在HEK293T细胞上感染活性图。
图4为血清型13型重组腺相关病毒感染初级体感皮层(S1)的信号。其中，蓝色荧光为DAPI对细胞核进行染色；红色荧光分别为对神经元标志物NeuN(上排一行)和星形胶质细胞标志物GFAP(底侧一行)进行染色后的信号；绿色荧光为rAAV2/13-CMV-EGFP-WPRE-SV40polyA标记的细胞信号。
图5为血清型13型重组腺相关病毒感染中脑腹侧被盖区(VTA)的信号。其中，蓝色荧光为DAPI对细胞核进行染色；红色荧光分别为对神经元标志物NeuN(上排一行)和星形胶质细胞标志物GFAP(底侧一行)进行染色后的信号；绿色荧光为rAAV2/13-CMV-EGFP-WPRE-SV40 polyA标记的细胞信号。
图6为rAAV2/13-EFGFP与rAAV2-mCherry混合注射感染初级体感皮层(S1)的信号。其中，蓝色荧光为DAPI对细胞核进行染色；红色荧光为rAAV2感染神经元的信号；绿色荧光为rAAV2/13感染神经元的信号。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
一、重组腺相关病毒血清型包装质粒的构建
根据AAV13基因组序列(GenBank:EU285562)，合成AAV13 Cap基因序列，作为模板，使用TakaraPrimerstar Polymerase(Takara公司)扩增AAV13 Cap基因片段，正向引物Cap13-F的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物Cap13-R的序列如SEQ ID NO.2所示；PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer 10μl，10mM dNTPs 1μl，10μM正向引物2.5μl，10μM反向引物2.5μl，模板DNA0.5μl，DNAPolymerase 0.5μl，ddH2O 33μl。扩增条件为：98℃3min，98℃20s，60℃20s，72℃2min，72℃10min，16℃30min，30个循环；用胶回收试剂盒(Omega公司)回收扩增出的DNA片段。
使用SwaI和AgeI(New England Biolabs)限制性内切酶分别酶切pAAV-RC2/1载体(购自Addgene,编号：112862)和AAV13 Cap基因片段，然后采用T4连接酶将AAV13 Cap基因片段插入到pAAV-RC2/1，将连接产物转化感受态Stbl3，菌落PCR鉴定为阳性的克隆接种到15毫升LB液体培养基中进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pAAV-RC2/13，获得质粒能够编码AAV13衣壳蛋白VP1。构建获得的重组腺相关病毒血清型包装质粒pAAV-RC2/13表达载体的图谱如图1所示，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所有PCR使用引物、基因合成和测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
二、重组腺相关病毒的制备
利用重组腺相关病毒血清型包装质粒pAAV-RC2/13表达载体包装重组腺相关病毒，将装载核心元件的质粒pAAV-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA与pAAV-RC2/13血清型AAV衣壳质粒、腺病毒元件辅助质粒pAd-Helper按质粒分子数1：1：1共转染HEK-293T细胞，转染72小时后分别收集上清和细胞沉淀并分别处理：含有AAV病毒粒子的HEK-293T细胞沉淀经裂解液(15皿细胞量加9mL)重悬，于液氮和37℃水浴反复冻融后加入Benzonase核酸酶(Sigma，E1014-25KU)37℃消化1小时，后加终浓度150mM NaCl 37℃摇床处理30min；细胞上清液经核酸酶处理后，加入PEG8000(索莱宝，214B0310)和0.5mol/L的NaCl溶液混匀后于4℃放置16h聚沉蛋白。次日将处理过的上清液4℃10000g离心弃上清，然后将细胞样品与上清液沉淀样品合并，3000g离心10min，弃细胞碎片沉淀，得到病毒浓缩液。于贝克曼超速离心管中配制依次为15％、25％、40％、58％的碘克沙醇溶液密度梯度，后加入10mL病毒浓缩液，最后用PBS补满离心管并封口。配平后置于Ti70转子经贝克曼超速离心机在18℃条件下64000rpm离心2小时。离心结束后用注射器吸取以回收40％与58％碘克沙醇分离层的溶液。将吸取的含rAAV的碘克沙醇层溶液置于透析袋中，4℃条件下在PBS缓冲液里透析16h；透析后的病毒液用0.22μm的滤膜过滤除菌后加至超滤管(Minipore，UFC910024)中，离心脱盐浓缩至体积200μL左右，然后加入终浓度为0.001％的Pluronic F68(Thermo FisherScientific，24040032)，分装后储存于-80℃冰箱中。最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV2/13-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA病毒的滴度为1.0×1013VG/mL，通过银染鉴定衣壳蛋白组装效果，银染结果如图2所示。以上结果表明腺相关病毒血清型包装质粒pAAV-RC2/13可以制备高滴度的rAAV2/13。
三、重组腺相关病毒的活性检验
为了验证制备的重组腺相关病毒rAAV2/13的感染活性，将重组腺相关病毒以MOI为2.5×105感染贴壁的HEK293T细胞，通过观察携载的报告基因EGFP的表达水平，可以鉴定出重组腺相关病毒rAAV2/13的感染活性，如图3所示，病毒感染细胞48小时后可以观察到高丰度的绿色荧光蛋白表达。结果表明，重组腺相关病毒rAAV2/13对体外培养细胞具有较高的感染活性。
实施例2
(1)采用实施例1所述方法制备重组腺相关病毒rAAV2/13-CMV-EGFP-WPRE-SV40polyA。将制备的rAAV2/13-CMV-EGFP-WPRE-SV40 polyA(200nL/只)病毒通过脑立体定位方式注射于8-10周龄C57BL/6小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)的初级体感皮层脑区(primary somatosensory cortex，S1)和中脑腹侧被盖区(Ventral tegmentalarea,VTA)，3周后灌流取脑，小鼠脑组织经DEPC处理过的PFA溶液固定4小时后再用DEPC处理过的30％蔗糖-PBS溶液脱水48小时，将脱水后的脑组织用组织包埋剂充分包埋并用冰冻切片机切成40μm厚度的脑片。将包含S1及VTA的脑片利用GFAP抗体、NeuN抗体进行免疫组化染色，之后贴片并使用玻片扫描仪显微镜对其进行成像。活体检测结果可以看出(图4和图5)，rAAV2/13-CMV-EGFP-WPRE-SV40 polyA感染中枢神经系统后具有非常局限的标记范围，并且绝大多数转导绿色荧光信号与神经元共标。
(2)采用实施例1所述方法制备重组腺相关病毒rAAV2/13-EF1α-EGFP-WPRE-SV40polyA，与实施例1区别在于装载核心元件的质粒。将携载绿色荧光蛋白基因的的rAAV2/13-EF1α-EGFP-WPRE-SV40 polyA与携载红色荧光蛋白基因的rAAV2-EF1α-mCherry-WPRE-SV40 polyA按1：1比例混合(200nL/只)，通过脑立体定位方式注射于8-10周龄C57BL/6小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)的初级体感皮层脑区(primarysomatosensory cortex，S1)，3周后灌流取脑，小鼠脑组织经DEPC处理过的PFA溶液固定4小时后再用DEPC处理过的30％蔗糖-PBS溶液脱水48小时，将脱水后的脑组织用组织包埋剂充分包埋并用冰冻切片机切成40μm厚度的脑片。活体检测结果可以看出(图6)，rAAV2/13-EF1α-EGFP-WPRE-SV40 polyA感染中枢神经系统后相较于rAAV2-EF1α-mCherry-WPRE-SV40polyA具有更小的标记范围。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种血清型13型重组腺相关病毒，其特征在于，所述血清型13型重组腺相关病毒由包含2型腺相关病毒的Rep基因和13型腺相关病毒的Cap基因的包装质粒包装获得。
2.根据权利要求1所述的血清型13型重组腺相关病毒，其特征在于，所述血清型13型重组腺相关病毒的基因组中包含外源基因；
优选地，所述所述外源基因包括荧光标记基因和/或其他外源基因。
3.权利要求1所述血清型13型重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，包括：将重组腺相关病毒包装质粒、腺相关病毒核心质粒和腺病毒元件辅助质粒共转染包装细胞系，之后进行病毒收获、纯化和浓缩，即得；
所述重组腺相关病毒包装质粒携带2型腺相关病毒的Rep基因和13型腺相关病毒的Cap基因；
所述腺相关病毒核心质粒携带腺相关病毒的ITR序列。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述腺病毒元件辅助质粒为pAd-Helper；
所述包装细胞系为HEK-293T细胞；
所述重组腺相关病毒包装质粒、腺相关病毒核心质粒和腺病毒元件辅助质粒的质粒分子数为1：1：1。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒包装质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒核心质粒在ITR中间依次插入启动子、外源基因、转录调节元件和转录终止序列。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述启动子为CMV启动子或EF1α启动子；
所述外源基因包括荧光标记基因和/或其他外源基因；
所述转录调节元件为WPRE；
所述转录终止序列为SV40 polyA或hGH polyA。
8.权利要求1或2所述血清型13型重组腺相关病毒作为基因转移载体的应用。
9.权利要求1或2所述血清型13型重组腺相关病毒在制备小核团的标记载体中的应用。
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